ES2545793T3 - Métodos para la detección e identificación de beta lactamasas de espectro extendido - Google Patents

Abstract

Un método para la detección y/o identificación de la presencia de microbios con una ß-lactamasa de espectro extendido de CTX-M en un espécimen, que comprende: obtener una muestra del espécimen para ser analizada para la presencia de una ß-Lactamasa de espectro extendido de CTX-M; poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores de amplificación en condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácidos nucleicos basados en la polimerasa, en donde el conjunto de cebadores de amplificación comprende al menos un par de cebadores que comprende un primer y segundo cebador, dichos cebadores primero y segundo que comprenden al menos 12 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en: sec. con núms. de ident.; 1 y 2 ; sec. con núms. de ident.; 3 y 4; sec. con núms. de ident.; 6 y 7; sec. con núms. de ident.; 8 y 9; sec. con núms. de ident.; 27 y 28; y sec. con núms. de ident.; 29 y 30; o las complementarias de estas, en donde dicho conjunto de cebadores comprende uno o más cebadores con una base universal, en donde dicho conjunto de cebadores de amplificación se hibridan conjuntamente, y producen productos de amplificación diana en la presencia de isoformas de CTX-M 1-82; proporcionar reactivos y condiciones para la extensión de los cebadores para generar los productos de amplificación diana; y determinar la presencia y/o cantidad de los productos de amplificación diana, en donde la presencia del producto de amplificación diana indica la presencia de dicha ß-lactamasa de espectro extendido de CTX-M.

Description

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

Descripción

Métodos para la detección e identificación de beta lactamasas de espectro extendido

Referencia a la lista de secuencias

La presente solicitud se presenta junto con una lista de secuencias en formato electrónico. La lista de secuencia se proporciona como un archivo denominadoGENOM.097VPC.txt, creado el 18 de febrero de 2010 que es de 15.2 KB en tamaño. La información en formato electrónico de la lista de secuencias se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

Las modalidades descritas en la presente descripción se relacionan con el diagnóstico molecular, y, particularmente, el diagnóstico que se usa para detectar e identificar microbios que portan beta lactamasas de espectro extendido (ESBLs), y particularmente genes CTX-M.

Descripción de la técnica relacionada

Las β-lactamasas confieren resistencia contra fármacos de β-lactámicos. Estas enzimas destruyen el anillo β-lactámico de los antibióticos β-lactámicos, tales como penicilina, cefalosporinas, cefamicinas, y carbapenemos (ertapenemo). Estos antibióicos tienen un elemento común en su estructura molecular: un anillo de cuatro átomos conocido como un beta-lactámico. La enzima lactamasa rompe ese anillo libre, lo que desactiva las propiedades antibacteriales de la molécula.

Las β-lactamasas de espectro extendido (ESBLs) son cada vez más responsables de infecciones nosocomiales que se elevan por todo el mundo, y de forma alarmante, por emergencia comunitaria también (Rossolini y otros 2008, CMI). Las ESBLs son beta-lactamasas que hidrolizan cefalosporina de espectro extendido con una cadena lateral de oxiimino. Estas cefalosporinas incluyen cefotaxima, ceftriaxona, y ceftazidima, así como el aztreonam oxiimino monobactam . Así las ESBLs confieren resistencia a estos antibióticos y a beta lactámicos oxiimino relacionados. Las ESBLs más conocidas se derivan de los genes TEM-1, TEM-2, o SHV-1, e incluyen mutaciones que alteran la configuración de aminoácidos alrededor del sitio activo de estas β-lactamasas. Esto extiende el espectro de antibióticos β-lactámicos susceptibles a la hidrólisis por estas enzimas.

Las variantes clásicas TEM y SHV, tal como genes TEM y SHV, en realidad se están extendiendo rápidamente por todo los Estados Unidos de América, después de haber afectado a la mayor parte de Europa, mientras que un nuevo tipo de ESBL, CTX-M, es predominante en América del Sur, el Mediterráneo y los países de Europa del Este (Govinden y otros 2007, AJB). La última, que debe su nombre a su alta actividad frente a cefotaxima, se observó en los finales de 1980 en Japón, Europa y Argentina, más específicamente en Alemania en 1989 (Naas y otros 2008, CMI). Se considera que es el grupo más exitoso de todos (Rasmussen & Hoiby 2004, CJM). Su aspecto podría ser una consecuencia del uso incrementado de ceftriaxona y/o cefotaxima para tratar infecciones bacterianas, y su origen es conocido por ser de genes cromosómicos residentes en los miembros del género Kluyvera. Hasta hoy día, más de 85 derivados de CTX-M, que se clasifican en 5 grupos filogenéticos (CTX-M-1, 2, 8, 9 y 25), se han documentado de acuerdo con el sitio web de la Clínica Lahey, accesible en la dirección web lahey.org/Studieso.

Los genes de resistencia CTX-M se encuentran en Enterobacteriaceae y se pueden transmitir fácilmente a través de plásmidos entre especies. Las especies de Enterobacterias que incluyen Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, y similares que poseen los genes CTX-M se consideran que sean la principal causa de infección del tracto urinario. Otras Enterobacteriaceae, tal comoEnterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Salmonella enterica, Enterobacter aerogenes, así como también Klebsiella oxytoca, pueden además albergar genes CTX-M. La detección de cepas resistentes a CTX-M es especialmente crucial, ya que requiere el aislamiento de otros pacientes en hospitales, y dejaría sólo los carbapenémicos como el principal tratamiento para las infecciones.

Hasta hace poco, la única manera de saber la resistencia de una cepa fue realizar una prueba manual de susceptibilidad antimicrobiana. Las pruebas de susceptibilidad sufren de muchos inconvenientes, que incluyen la cantidad de tiempo para obtener un resultado, es decir, entre 48 a 96 horas. En primer lugar, el operador necesita para aislar la cepa bacteriana de las muestras, lo que podría tomar hasta 48 horas; después proceder con la identificación bioquímica, que son otras 18 a 24 horas, y luego con la prueba manual de susceptibilidad antimicrobiana, que además podría tardar hasta 24 horas. Adicionalmente a la demora en la obtención de resultados, los métodos de pruebas manuales también sufren de otros problemas, como la falta de reproducibilidad debido a un almacenamiento

E10744408

20-08-2015

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

inadecuado de los discos de antibióticos, la difusión indebida de algunos discos de antibióticos, y la falta en la estandarización del proceso.

La especificidad y exactitud de la detección de ESBLs es crucial, ya que los resultados falsos negativos pueden llevar a los médicos a diseñar un régimen inadecuado de antibióticos, por ejemplo, el tratamiento de un individuo con una infección de ESBL con cefalosporinas de tercera generación o con aztreonam. Esto plantea riesgos innecesarios para el individuo tratado, y además aumenta las probabilidades de contaminación cruzada dentro de un ambiente clínico, por ejemplo, un hospital. Como algunas cepas que producen ESBL no se mostrarán en la resistencia in vitro a todas las cefalosporinas de tercera o cuarta generación mediante el uso de los puntos de parada sugeridos, el Instituto Estándar Clínico y de Laboratorio, (CLSI), recomienda informar las Enterobacteriaceae que producen ESBL como resistentes a penicilinas, cefalosporinas y aztreonam, ya que podrían terminar siendo clínicamente resistentes (CLSI, M100-S18). La capacidad de los organismos que albergan genes de resistencia CTX-M para hidrolizar las cefalosporinas más nuevas y aztreonam hace su detección aún más difícil. Las directrices de CLSI plantean la amenaza de diagnosticar mal la presencia de cepas que producen CTX-M, en dependencia de los fármacos usados tanto en la selección inicial como en pruebas de confirmación.

Las modalidades descritas en la presente descripción proporcionan ventajas sobre otros métodos usados para detectar e identificar bacterias que tienen ESBLs, por ejemplo, genes de resistencia CTX-M, que incluyen la mejora de la especificidad, la disponibilidad de los resultados en un período de tiempo más corto, y elimina la necesidad de realizar etapas adicionales, tales como electroforesis en gel de agarosa, para detectar ESBLs. (Lartigue y otros 2004, FEMS ML; Pitout y otros 2004, JCM; Pitout y otros2007, CMI). Además, las modalidades descritas en la presente descripción ofrecen ventajas sobre otros métodos informados para la detección de ESBLs, que incluyen CTX-M, en que los métodos y composiciones descritos en la presente descripción están diseñados específicamente para la detección e identificación de isoformas recientemente descubiertas del gen CTX-M, que no eran conocidas por la época del desarrollo de los ensayos descritos, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. US20070248954. Los métodos descritos en US20070248954 usan cebadores que no son totalmente complementarios a las secuencias de las isoformas de CTX-M recientemente descubiertas, lo que podría comprometer la especificidad, o incluso dar lugar a resultados falsos negativos.

Resumen de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método como se define por las reivindicaciones para detectar y/o identificar la presencia de microbios con una β-lactamasa de espectro extendido CTX-M en una muestra.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un estuche como se define por las reivindicaciones para la detección y/o identificación de la presencia de microbios con una β-lactamasa de espectro extendido CTX-M en una muestra.

La presente invención se relaciona además con el uso de cebadores y sondas de acuerdo con las modalidades descritas en la presente descripción, en donde los cebadores o sondas tienen las secuencias de acuerdo con cualquiera de las secuencias como se definen en las sec. con núms. de ident.; 1-24.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un árbol filogenético de todos los genes CTX-M agrupados en 4 grupos, con Klebsiella oxytoca como un grupo externo. La figura 2 es un alineamiento de secuencias, que muestra la ubicación de los cebadores descritos en la presente descripción para detectar el grupo CTX-M-1 (ctxm1-616F/sec. con núm. de ident.:1)(ctxm1-740R/sec. con núm. de ident.:2)(ctxml/2-657B/sec. con núm. de ident.:5). También se muestran los cebadores de amplificación descritos anteriormente (CTXM1-F3/sec. con núm. de ident.:40)(CTXM1-R2/sec. con núm. de ident.:41). La secuencia de referencia que se muestra es una secuencia consenso de un alineamiento de todas las secuencias CTX-M-1. Las secuencia consenso mostrada corresponde a la sec. con núm. de ident.: 48. La figura 3 es un alineamiento de secuencia, que muestra la ubicación de los cebadores descritos en la presente descripción para detectar el grupo CTX-M-2 (ctxm2-609F/sec. con núm. de ident.:3)(ctxm2-776R/sec. con núm. de ident.:4)(ctxml/2-657B/sec. con núm. de ident.:5). Además se muestran los cebadores de amplificación descritos anteriormente (TOHO1-2F/sec. con núm. de ident.:42)(TOHO 1-1R/sec. con núm. de ident.:43). La secuencia de referencia que se muestra es una secuencia consenso de un alineamiento de todas las secuencias CTX-M-2. La secuencia consenso mostrada corresponde a la sec. con núm. de ident.: 49. La figura 4 es un alineamiento de secuencia, que muestra la ubicación de los cebadores descritos en la presente descripción para detectar el grupo CTX-M-8 (ctxm8-119R/sec. con núm. de ident.:7)(ctxm8-7F/sec. con núm. de ident.:6)(ctxm8/9-42B/sec. con núm. de ident.:10). Además se muestran los cebadores de amplificación descritos previamente (CTXM825F/sec. con núm. de ident.:44)(CTXM825/sec. con núm. de

E10744408

20-08-2015

ident.:45). La secuencia de referencia mostrada es una secuencia consenso de un alineamiento de todas las secuencias CTX-M-8. La secuencia consenso mostrada corresponde a la sec. con núm. de ident.: 50. La figura 5 es un alineamiento de secuencia, que muestra la ubicación de los cebadores descritos en la presente descripción para detectar el grupo CTX-M-9 (ctxm9-7F/sec. con núm. de ident.:8)(ctxm9-117R/sec.

5 con núm. de ident.:9)(ctxm8/9-42B/sec. con núm. de ident.:10).Además se muestran los cebadores de amplificación descritos previamente (CTXM914F/sec. con núm. de ident.:46)(CTXM914R/sec. con núm. de ident.:47). La secuencia de referencia que se muestra es una secuencia consenso de un alineamiento de todas las secuencias CTX-M-9. La secuencia de consenso mostrada corresponde a la sec. con núm. de ident.: 51.

10 Descripción detallada de la modalidad preferida

Las modalidades descritas en la presente descripción se refieren a composiciones y métodos para la eficiente y específica detección y/o identificación de microbios que tienen β-lactamasas de espectro extendido, o expandido (ESBLs).

15 Como se usa en la presente descripción, el término "β-lactamasas de espectro expandido" o "ESBLs", se refiere a βlactamasas aquellas lactamasas capaces de conferir resistencia bacteriana a las penicilinas, las cefalosporinas de primera, segunda, y tercera generación, y aztreonam (pero no a las cefamicinas o carbapenemos) por hidrólisis de estos antibióticos, y que se inhiben por inhibidores de β-lactamasa como el ácido clavulánico. El experto en la materia

20 apreciará que el término "ESBL" abarca todas las β-lactamasas de espectro expandido ahora conocidas o descubiertas en el futuro, que incluyen pero sin limitarse a todas las ESBLs enumeradas en el sitio web de la Clínica Lahey, en la dirección web lahey.org/Studies. En consecuencia, el término ESBL abarca ESBLs del tipo SHV, o sulfhidrilo variable, tipo TEM, TOHO y tipo CTX-M.

25 En algunas modalidades, las composiciones y ensayos se usan para detectar e identificar beta-lactamasas CTX-M. Las enzimas CTX-M han sido reseñadas previamente en detalle (Bonnet, R., y otros (2004), Growing group of extendedspectrum beta-lactamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob. Agents Chemother. 48:1-14.). Algunas características ilustrativas, no limitantes de beta lactamasas CTX-M son como sigue: MICs de cefotaxima en el intervalo de resistencia (>64 µg/ml), mientras que las MICs de ceftazidima están usualmente en el intervalo aparentemente susceptible (2 a 8

30 µg/ml). Sin embargo, algunas ESBL de tipo CTX-M realmente pueden hidrolizar ceftazidima y conferir resistencia a esta cefalosporina (MICs tan altas como 256 µg/ml). Las MICs de aztreonam son variables. Las β-lactamasas de tipo CTX-M hidrolizan cefepime, y las MICs de cefepime son superiores que las observadas en bacterias que producen otros tipos de ESBL. Tazobactam exhibe una actividad inhibidora casi 10 veces mayor que el ácido clavulánico contra βlactamasas de tipo CTX-M. Algunas bacterias pueden albergar ESBLs tanto de tipo CTX-M como de tipo SHV o ESBLs

35 de tipo CTX-M y β-lactamasas de tipo AmpC, que pueden alterar el fenotipo de resistencia a los antibióticos.

Las modalidades descritas en la presente son capaces de una rápida detección y/o identificación de β-lactamasas CTX-M, que incluyen una o más β-lactamasas CTX-M identificada como CTX-M-1 hasta CTX-M-82, que incluyen algunas o todas las β-lactamasas tipo CTX-M que se encuentran en las cepas bacterianas enumeradas en la Tabla 1.

40

Tabla 1

45

50

55

Grupo

Enzima Posición del Nucleótido en el grupo de alineamiento Cambio de base Acceso al Banco de Genes núm. Especies

imagen1

CTX-M-1 imagen2 imagen3 X92506 Escherichia coli

imagen4

CTX-M-3 imagen5 imagen6 Y10278 Citrobacler freundii

imagen7

CTX-M-10 R 4 A → G AF255298 Escherichia coli

imagen8

imagen9 B 6 C → T imagen10 imagen11

imagen12

CTX-M-11 F 2 T → C AY005110 Klebsiella pneumoniae

imagen13

CTX-M-12 imagen14 imagen15 AF305837 Klebsiella pneumoniae

imagen16

CTX-M-15 imagen17 imagen18 AY044436 Escherichia coli

E10744408

20-08-2015

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

imagen19

CTX-M-22 imagen20 imagen21 AY080894 Klebsiella pneumoniae

imagen22

CTX-M-23 imagen23 imagen24 AF488377 Escherichia coli

imagen25

CTX-M-28 imagen26 imagen27 AJ549244 Escherichia coli

imagen28

CTX-M-29 imagen29 imagen30 AY267213 Escherichia coli

imagen31

CTX-M-30 imagen32 imagen33 AY292654 Citrobacter freundii

imagen34

CTX-M-32 imagen35 imagen36 AJ557142 Escherichia coli

imagen37

imagen38 imagen39 AY421962 Klebsiella pneumoniae

imagen40

CTX-M-34 R 4 A → G AY515297 Escherichia coli

imagen41

imagen42 B 6 C → T imagen43 imagen44

imagen45

CTX-M-36 imagen46 imagen47 AB 177384 Escherichia coli

imagen48

CTX-M-37 R4 A → G AY649755 Enterobacter cloacae

CTX-M-1

imagen49 B 6 C → T imagen50 imagen51

imagen52

CTX-M-42 imagen53 imagen54 DQ061159 Escherichia coli

imagen55

CTX-M-52 imagen56 imagen57 DQ223685 Klebsiella pneumoniae

imagen58

CTX-M-53 R4 A → G DQ268764 Salmonella enterica

imagen59

imagen60 B6 C → T imagen61 imagen62

imagen63

CTX-M-54 imagen64 imagen65 DQ303459 Klebsiella pneumoniae

imagen66

CTX-M-55 imagen67 imagen68 DQ885477 Escherichia coli

imagen69

CTX-M-57 imagen70 imagen71 DQ810789 Salmonella enterica

imagen72

imagen73 imagen74 EU086736 Shigella sonnei

imagen75

CTX-M-58 imagen76 imagen77 EF210159 Escherichia coli

imagen78

CTX-M-60 imagen79 imagen80 AM411407 Klebsiella pneumoniae

imagen81

CTX-M-61 imagen82 imagen83 EF219142 Salmonella typhimurium

imagen84

CTX-M-62 imagen85 imagen86 EF219134 Klebsiella pneumoniae

imagen87

CTX-M-66 imagen88 imagen89 EF576988 Proteus mirabilis

imagen90

CTX-M-68 B 6 C → T EU177100 Klebsiella sp.

imagen91

CTX-M-69 imagen92 imagen93 EU402393 Escherichia coli

imagen94

CTX-M-79 imagen95 imagen96 EF426798 Escherichia coli

imagen97

CTX-M-82 imagen98 imagen99 DQ256091 Escherichia coli

CTX-M-2

CTX-M-2

imagen100 imagen101 X92507 Salmonella typhimurium

imagen102

imagen103 imagen104 imagen105 AB176535 Acinetobacter baumannii

imagen106

imagen107 imagen108 imagen109 AJ416343 Proteus mirabilis

imagen110

CTX-M-4 F 4 C → A Y14156 Salmonella typhimurium

imagen111

CTX-M-5 R 12 T → C U95364 Salmonella typhimurium

imagen112

CTX-M-6 F 14 C → G AJ005044 Salmonella typhimurium

imagen113

imagen114 F 15 A → T imagen115 imagen116

imagen117

imagen118 R 12 T → C imagen119 imagen120

imagen121

CTX-M-7 R 12 T → C AJ005045 Salmonella typhimurium

imagen122

CTX-M-20 R 12 T → A AJ416344 Proteus mirabilis

E10744408

20-08-2015

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

imagen123

CTX-M-31 imagen124 imagen125 AJ567481 Providencia sp.

imagen126

AJ567482 Escherichia coli

imagen127

CTX-M-35 imagen128 imagen129 AB 176532 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-43

imagen130 imagen131 DQ102702 Acinetobacter baumannii

CTX-M-44

imagen132 imagen133 D37830 Escherichia coli

CTX-M-56

imagen134 imagen135 EF374097 Escherichia coli

CTX-M-59

imagen136 imagen137 DQ408762 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-76

R 12 T → C AM982520 Kluyvera ascorbata

CTX-M-77

R 12 T → C AM982521 Kluyvera ascorbata

CTX-M-8

CTX-M-8

F 4 G → A AF189721 Citrobacter amalonaticus

imagen138

F 8 C → G imagen139

imagen140

R 15 C → T imagen141

CTX-M-25

imagen142 imagen143 AF518567 Escherichia coli

CTX-M-26

imagen144 imagen145 AY157676 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-39

imagen146 imagen147 AY954516 Escherichia coli

CTX-M-40

F 4 G → A AY750914 Escherichia coli

imagen148

F 8 C → G imagen149

imagen150

R 15 C → T imagen151

CTX-M-41

imagen152 imagen153 DQ023162 Proteus mirabilis

CTX-M-63

F 4 G → A AB205197 Klebsiella pneumoniae

F 8

C → G EU660216 Morganella morganii

imagen154

R 15 C → T imagen155

CTX-M-78

F4 G → A AM982522 Kluyvera ascorbata

imagen156

F 11 G → A imagen157

CTX-M-9

CTX-M-9

imagen158 imagen159 AF174129 Escherichia coli

CTX-M-13

imagen160 imagen161 AF252623 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-14

imagen162 imagen163 AF252622 Escherichia coli

CTX-M-16

imagen164 imagen165 AY029068 Escherichia coli

CTX-M-17

imagen166 imagen167 AY033516 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-18

imagen168 imagen169 AF325133 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-19

imagen170 imagen171 AF325134 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-21

B 12 G → A AJ416346 Escherichia coli

CTX-M-24

imagen172 imagen173 AY143430 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-27

imagen174 imagen175 AY156923 Escherichia coli

CTX-M-38

imagen176 imagen177 AY822595 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-45

imagen178 imagen179 D89862 Escherichia coli

E10744408

20-08-2015

5

10

15

imagen180

CTX-M-46 F 16 G → A AY847147 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-47

imagen181 imagen182 AY847143 Escherichia coli

CTX-M-48

F 16 G → A AY847144 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-49

imagen183 imagen184 AY847145 Klebsiella pneumoniae

CTX-M-50

imagen185 imagen186 AY847146 Klebsiella pneumonia

CTX-M-51

imagen187 imagen188 DQ211987 Escherichia coli

CTX-M-65

imagen189 imagen190 EF418608 Escherichia coli

EF394372

Citrobacter freundii

CTX-M-67

imagen191 imagen192 EF581888 Escherichia coli

CTX-M-81

imagen193 imagen194 EU136031 Klebsiella pneumoniae

20 Especímenes y Muestras

Las modalidades descritas en la presente descripción pueden usarse para detectar y/o identificar ESBL en un espécimen. Como se usa en la presente descripción, el término "espécimen" puede referirse a un espécimen clínico o muestra de uno o cualquier número de fuentes, que incluyen, pero sin limitarse a, fluidos corporales (que incluyen, pero 25 sin limitarse a, sangre, orina, suero, linfa, saliva, secreciones anales y vaginales, transpiración, fluido peritoneal, fluido pleural, efusiones, ascitis, y secreciones purulentas, fluidos de lavado, fluidos drenados, especímenes de citología por cepillado, tejido de biopsia, dispositivos médicos explantados, catéteres infectados, pus, biopelículas y semen) de prácticamente cualquier organismo, con muestras de mamíferos, particularmente muestras de humanos, y muestras medioambientales (que incluyen, pero sin limitarse a, muestras de aire, agrícola, agua y suelo) que encuentran uso en la 30 invención. Adicionalmente, las muestras pueden ser tomadas de procesamiento de alimentos, que puede incluir tanto muestras de entrada (por ejemplo, granos, leche o cadáveres de animales), muestras en etapas intermedias de procesamiento, así como alimentos terminados listos para el consumidor. En algunas modalidades, los métodos y ensayos descritos en la presente descripción pueden realizarse directamente en una muestra o espécimen clínico, sin manipulación adicional del espécimen. En algunas modalidades, el espécimen se manipula, por ejemplo, se cultiva,

35 procesa para extraer ácidos nucleicos, o purifica, expande, o de otro modo se manipula.

Cebadores y sondas

En algunas modalidades, el espécimen o muestra puede ponerse en contacto con un conjunto de cebadores de

40 amplificación. En algunas modalidades, el espécimen o muestra puede ponerse en contacto con una sonda. Como se usa en la presente descripción, los términos "cebador" y "sonda" incluyen, pero sin limitarse a oligonucleótidos o ácidos nucleicos. Los términos "cebador" y "sonda" abarcan moléculas que son análogos de nucleótidos, así como nucleótidos. Los nucleótidos y polinucleótidos, como se usa en la presente serán genéricos para polideoxirribonucleótidos (que contienen 2-deoxi-D-ribosa), para polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), para cualquier otro tipo de

45 polinucleótido que sea un N-o C-glicósido de una base de purina o de pirimidina, y para otros polímeros que contienen cadenas principales no nucleotídicas, por ejemplo, poliamida (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAS)) y polimorfolino (disponibles comercialmente de Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oreg., como polímeros NEUGENE™), y otros polímeros sintéticos de ácidos nucleicos específicos de secuencia siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permite el apareamiento de bases y el apilamiento de bases, tal como se encuentra en el ADN y

50 ARN.

En algunas modalidades, los "cebadores" o "sondas" descritos en la presente descripción pueden contener ácidos nucleicos cerrados (LNA). Los "ácidos nucleicos cerrados" (LNAs) son ribonucleótidos que contienen un puente metileno que une el oxígeno 2' de la ribosa con el carbono 4' (ver FIG. 27). Braasch D. A. y Corey, D. R. (2001), Locked nucleic

55 acids (LNA); fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem. Biol. 8, 1-7, proporcionan una panorámica general de los LNAs. LNAs están disponibles comercialmente, por ejemplo, de la compañía Proligo, Boulder, Colo., Estados Unidos. Los fosforotioatos también son conocidos por los expertos en la técnica y se pueden encargar, por ejemplo, de MWG-Biotech AG, Ebersberg, Alemania. En consecuencia, en algunas modalidades, los "cebadores" o "sondas" descritos en la presente descripción pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más LNAs.

60 Los términos nucleótido y polinucleótido incluyen, por ejemplo, 3'-deoxí--2',5'-ADN, fosforamidatos N3'→P5' de oligodeoxirribonucleótidos, ARN 2'-O-alquilsustituido, ADN de doble o simple cadena, así como también ARN de doble y simple cadena, híbridos ADN:ARN, e híbridos entre PNAs y ADN o ARN. Los términos también incluyen tipos conocidos

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la técnica, "caperuzas," sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), con enlaces cargados negativamente (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), y con enlaces cargados positivamente (por ejemplo, aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres, etc.), aquellos que contienen porciones colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (que incluyen nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas sin modificar del polinucleótido u oligonucleótido.

Se apreciará que, como se usa en la presente descripción, los términos "nucleósido" y "nucleótido" incluirán aquellas porciones que contienen no sólo las bases conocidas purina y pirimidina, sino también otras bases heterocíclicas que han sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros heterociclos. Los nucleósidos o nucleótidos modificados incluirán además modificaciones en la porción de azúcar, por ejemplo, en donde uno o más de los grupos hidroxilo se sustituyen con un halógeno, un grupo alifático, o están funcionalizados como éteres, aminas, o similares. Otras modificaciones a nucleótidos o polinucleótidos implican reconfigurar, adjuntar, sustituir, o de cualquier otra forma alterar grupos funcionales en la base de purina o pirimidina que forman enlaces de hidrógeno con una respectiva pirimidina o purina complementaria. El nucleótido o polinucleótido modificado resultante puede formar un par de bases con otras tales unidades nucleotídicas modificadas, pero no con A, T, C, G o U. Por ejemplo, guanosina (2-amino-6-oxi-9-beta-D-ribofuranosil-purina) puede modificarse para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-beta-D-ribofuranosil-purina). Tal modificación resulta en una base de nucleósido que ya no formará efectivamente un par de bases estándar con citosina. Sin embargo, la modificación de citosina (1-beta-Dribofuranosil-2-oxi-4-amino-pirimidina) para formar isocitosina (1-β-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxi-pirimidina) resulta en un nucleótido modificado que no se aparea efectivamente con guanosina sino que formará un par de bases con isoguanosina. La isocitosina está disponible de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); la isocitidina se puede preparar por el método descrito por Switzer y otros (1993) Biochemistry 32:10489-10496y las referencias citadas en el mismo; 2'deoxí--5-metil-isocitidina puede prepararse mediante el método de Tor y otros (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 y referencias citadas en el mismo; y nucleótidos isoguanina pueden prepararse usando el método descrito por Switzer y otros (1993), supra, y Mantsch y otros (1993) Biochem. 14:5593-5601, o por el método descrito Patente de Estados Unidos núm. 5,780,610 otorgada a Collins y otros The non-natural base pairs referred to as κ and π., puede ser sintetizada por el método descrito en Piccirilli y otros (1990) Nature 343:33-37 para la síntesis de 2,6-diaminopirimidina y su complemento (1-metilpirazolo[4,3]-pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona. Otras unidades nucleotídicas modificadas tales que forman pares de bases únicos se han descrito en Leach y otros (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 y Switzer y otros, supra, o serán evidentes para los expertos en la técnica.

Preferentemente, el conjunto de cebadores de amplificación comprende al menos uno, dos, tres, o cuatro, o más cebadores y/o sondas que contienen una base universal. Como se usa en la presente descripción, el término "base universal" se refiere a un análogo de nucleótido que puede hibridarse con más de un nucleótido seleccionado entre A, T, C, y G. En algunas modalidades, la base universal puede ser seleccionada del grupo que consiste en deoxiinosina, 3ntiropirrol, 4-nitroindol, 6-nitroindol, 5-nitroindol. Preferentemente, la base universal es desoxiinosina. En algunas modalidades, el conjunto de cebadores de amplificación, y sondas descritos en la presente descripción incluyen al menos un cebador y/o sonda que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o más bases universales.

Los cebadores y/o sondas son preferentemente de entre 10 y 45 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los cebadores y/o sondas pueden ser al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, o más nucleótidos de longitud. Los cebadores y/o sondas se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada, incluidos unidos a un soporte sólido, líquido, y liofilizado, por ejemplo. En algunas modalidades, los cebadores y/o sondas incluyen oligonucleótidos que hibridan con una secuencia de ácido nucleico diana a lo largo de la longitud completa de la secuencia de oligonucleótidos. Tales secuencias pueden ser referidas como "totalmente complementaria" con respecto a la otra. Cuando se haga referencia a un oligonucleótido como "sustancialmente complementario" con respecto a una secuencia de ácido nucleico en la presente descripción, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias, o pueden formar apareamientos erróneos tras la hibridación, pero conservan la capacidad de hibridarse en condiciones rigurosas o condiciones estándar de PCR como se discute a continuación.Como se usa en la presente descripción, el término "condiciones PCR estándar" incluyen, por ejemplo, cualquiera de las condiciones PCR descritas en la presente descripción, o conocidas en la técnica, como se describe en, por ejemplo, PCR 1: A Practical Approach, M. J. McPherson, P. Quirke, y G. R. Taylor, Ed., (c) 2001, Oxford University Press, Oxford, Engl, y PCR Protocols: Current Methods and Applications, B. White, Ed., (c) 1993, Humana Press, Totowa, NJ.

Como se usa en la presente descripción, el término "sustancialmente complementario" se refiere a la complementariedad entre dos ácidos nucleicos, por ejemplo, la región complementaria de la sonda de captura y la

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

secuencia diana, y/o entre la secuencia conectora de la sonda de captura y la región complementaria del ácido nucleico competidor. La complementariedad no necesita ser perfecta; puede haber cualquier número de apareamientos erróneos de pares de bases que entre los dos ácidos nucleicos. Sin embargo, si el número de mutaciones es tan grande que no puede ocurrir la hibridación incluso bajo las condiciones de hibridación menos estrictas, la secuencia no es una secuencia sustancialmente complementaria. Cuando dos secuencias se refieren como "sustancialmente complementarias" en la presente descripción, se entiende que las secuencias son suficientemente complementarias una a la otra para hibridar bajo las condiciones de reacción seleccionadas. La relación de complementariedad de ácido nucleico y la rigurosidad de la hibridación suficientes para lograr especificidad es bien conocido en la técnica y se describe más adelante en referencia a la identidad de secuencia, temperatura de fusión y las condiciones de hibridación. Por lo tanto, las secuencias sustancialmente complementarias pueden ser usadas en cualquiera de los métodos de detección descritos en la presente descripción. Tales sondas pueden ser, por ejemplo, perfectamente complementarias

o pueden contener de 1 a muchos apareamientos erróneos siempre que las condiciones de hibridación sean suficientes para permitir, por ejemplo discriminación entre una secuencia diana y una secuencia no diana. Por consiguiente, las secuencias sustancialmente complementarias pueden referirse a secuencias que varían en el porcentaje de identidad de 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 85, 80, 75 o menos, o cualquier número en el medio, en comparación con la secuencia de referencia.

Las "condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se define en la presente descripción, se pueden identificar por aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura de lavado, por ejemplo cloruro de sodio

0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/ 0.1% de dodecilsulfato de sodio a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0.1% de albúmina de suero bovino/0.1% Ficoll/ 0.1% de polivinilpirrolidona/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplean 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50µg/ml), 0.1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55°C, seguido por un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55°C.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook y otros, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de la sonda y similares.

Pares Cebadores

En algunas modalidades, el conjunto de cebadores de amplificación incluyen uno o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más pares de cebadores. Como se usa en la presente descripción, el término "par de cebadores" puede referirse a dos cebadores que hibridan de forma individual a las cadenas opuestas de un ácido nucleico diana, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica ESBL, por ejemplo, un gen CTX-M o fragmento de este, o similar, en donde cada cebador puede extenderse en su extremo 3' para formar un producto de amplificación diana, por ejemplo, en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los pares cebadores pueden incluir cebadores directos e inversos.

En algunas modalidades, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción incluyen un par de cebadores que comprenden al menos un conjunto de cebadores de amplificación que hibridan con un gen CTX-M. Por ejemplo, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para detectar y/o identificar beta-lactamasas CTX-M de una bacteria enumerada en la Tabla 1. En algunas modalidades, las composiciones y métodos incluyen una pluralidad de cebadores de amplificación, que en conjunto permiten la detección e identificación de beta lactamasas CTX-M de todas las bacterias enumeradas en la Tabla 1. En algunas modalidades, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción incluyen pares de cebadores que hibridan conjuntamente con y amplifican los ácidos nucleicos de ácidos nucleicos CTX-M de al menos dos grupos CTX-M seleccionados de CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 y CTX-M-25. Los cebadores útiles para la detección e identificación de CTX-M1 incluyen, por ejemplo, los oligonucleótidos que tienen al menos 10 nucleótidos consecutivos de las sec. con núms. de ident.; 1, 2, 5, 11, 12, 13, 14, 32, y 33 o las complementarias de estas, o que son sustancialmente complementarias a, y/o se hibridan en condiciones rigurosas con las sec. con núms. de ident.;1, 2, 5, 11, 12, 13, 14, 32, y 33, o las complementarias de estas.

Los cebadores útiles para la detección e identificación de CTX-M-2 incluyen oligonucleótidos que tienen al menos 10

E10744408

20-08-2015

ácidos nucleicos consecutivos de las sec. con núms. de ident.; 3, 4, 5, 15, 16, 17 18, 32 y 33, o las complementarias de estas, o que son sustancialmente complementarias a, y/o se hibridan en condiciones rigurosas con las sec. con núms. de ident.; 3, 4, 5, 15, 16, 17 18, 32 y 33, o las complementarias de estas. Los cebadores útiles para la detección e identificación de CTX-M-8 incluyen oligonucleótidos que tienen al menos 10 ácidos nucleicos consecutivos de las sec. 5 con núms. de ident.; 6, 7, 10, 19, 20, 21, 22, 27, 28, y 31, o las complementarias de estas, o que son sustancialmente complementarias a, y/o se hibridan en condiciones rigurosas con las sec. con núms. de ident.; 3, 4, 5, 15, 16, 17 18, 32 y 33, o las complementarias de estas. Los cebadores útiles para la detección e identificación de CTX-M-9 incluyen oligonucleótidos que tienen al menos 10 ácidos nucleicos consecutivos de las sec. con núms. de ident.; 8, 9, 10, 23, 24, 25, 26, 29, 30, y 31, o las complementarias de estas, o que son sustancialmente complementarias a, y/o se hibridan en 10 condiciones rigurosas con las sec. con núms. de ident.; 8, 9, 10, 23, 24, 25, 26, 29, 30, y 31, o las complementarias de estas. El experto en la materia apreciará que algunas modalidades incluyen cualquier combinación de los pares de cebadores descritos en la presente descripción, por ejemplo, cualquier combinación de pares de cebadores de las sec. con núms. de ident.; 1 y 2, sec. con núms. de ident.; 3 y 4, sec. con núms. de ident.; 6 y 7, sec. con núms. de ident.; 8 y 9, sec. con núms. de ident.; 27 y 28, y sec. con núms. de ident.; 29 y 30. En algunas modalidades, las composiciones y 15 métodos incluyen cebadores y sondas que consisten en, que consisten esencialmente en, o que comprenden sec. con núms. de ident.; 1-10, o que tienen al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más, nucleótidos consecutivos de las sec. con núms. de ident.; 1-10, o que son sustancialmente complementarias a, y se hibridan en condiciones rigurosas con las sec. con núms. de ident.; 1-10 o la complementaria de estas. En algunas modalidades, las composiciones y métodos incluyen cebadores y sondas que consisten en, que consisten esencialmente en, o que comprenden las sec. con núms.

20 de ident.; 1-5 y 27-31, o que tienen al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más, nucleótidos consecutivos de las sec. con núms. de ident.; 1-5 y 27-31, o que son sustancialmente complementarias a, y se hibridan en condiciones rigurosas con las sec. con núms. de ident.; 1-5 y 27-31 o la complementaria de estas.

En algunas modalidades, las composiciones y métodos incluyen cebadores y/o sondas para la detección y/o

25 identificación de secuencias adicionales, que incluyen, por ejemplo, para la detección de un gen de carbapenemasa, por ejemplo, como se describe en la Publicación PCT núm. WO 08/124670. En algunas modalidades, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción incluyen cebadores que tienen al menos diez nucleótidos consecutivos de las sec. con núms. de ident.; 34 y 35, o las complementarias de estas, en algunas modalidades, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción incluyen cebadores que tienen al menos diez nucleótidos consecutivos de

30 las sec. con núms. de ident.; 37 y 38, o las complementarias de estas. En algunas modalidades, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción incluyen cebadores que son sustancialmente complementarios a, y/o que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de sec. con núms. de ident.; 34 y 35 o las complementarias de estas. En algunas modalidades, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción incluyen cebadores que son sustancialmente complementarios a, y/o que se hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de sec.

35 con núms. de ident.; 37 y 38 o las complementarias de estas.

En algunas modalidades descritas en la presente descripción, las composiciones y/o métodos pueden incluir uno o más cebadores, en donde los cebadores incluyen al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,

o más ácidos nucleicos consecutivos de las secuencias de secs. con núm. de ident.:1-22, o las complementarias de 40 estas.

TABLA 2: CEBADORES/SONDAS

45

50

55

60

sec. con núm. de ident.:

Nombre del iniciador Secuencia.

1

ctxm1-616F CYGCTTCCTGGGTTGTGG

2

ctxm1-740R TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG

3

ctxm2-609F GGTMTGCCGAAATSWTGG

4

ctxm2-776R CGCAGCCAGAAHATCCCGAC

5

ctxm1/2-657B ccagcgTATGGYACCACCAACGATATCGCGGcgctgg

6

ctxm8-7F TGTRTGCSCAGGCGAACG

7

ctxm8-119R GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG

8

ctxm9-7F TTTATGCGCAGACGAGTG

9

ctxm9-117R AAAGCACCTGCGTATTATCT

10

ctxm8/9-42B cgaggcGCGGCGCTGGARAAAAGCAGgcctcg

E10744408

20-08-2015

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55 10

11

ctxm1-599F GYATTCAGGCWGGACTGCC

12

ctxm1-633F GGGGGATAAAACCGGCAG

13

ctxm1-756R GCTTTCTGCCTTAGGTTGRG

14

ctxm1-723R ARTGACCAGAATCAGCGGC

15

ctxm2-590F TAGCGCGAGCATTCRGGC

16

ctxm2-624F TGGGKAGTGGGCGATAAA

17

ctxm2-791 R TACGATTTTCGCCGCCGCAG

18

ctxm2-759R GACGGYTTTCCGCCTTCT

19

ctxm8-1F YGCCGCTGTRTGCSCAGGC

20

ctxm8-22F ACGAYGTTCARCAAAAGC

21

ctxm8-131R CTCRTCGGCGCGGTAGAGC

22

ctxm8-102R TATCGGCGGTGTYAATCARCG

23

ctxm9-1F CRMCGCTTTATGCGCAGAC

24

ctxm9-21F ARTGCGGKGCARCAAAAG

25

ctxm9-102R TATCTKYGGTATCGATGAGC

26

ctxm9-132R GTTCATCACCGCGATAAAGC

27

ctxm8-146F CAGCACCAGTAARGTGATG

28

ctxm8-256R TTGTAGTTAAYCARGTCYGARG

29

ctxm9-122F CGGTGATGAACGCTTTCC

30

ctxm9-242R ATCGGCAGGCTTGATCTC

31

ctxm8/9-183B cggcgatAAGCARAGTGAAACGCAAAAGatcgccg

32

ctxm1/2-664T-LNA cCaCcaAcgaTatcgCg

33

ctxm1/2-659T TGGYACCACCAACGATATCGCGGT

34

KPC-2F AACTGACACTGGGCTCTG

35

KPC-2R ATACMCTCCGCAGGTTCC

36

KPC-2B cgcgatcACACGACCGGCAACCACCGCAgatcgcg

37

KPC-3F GATRGATACCGGCTCAGG

38

KPC-3R GTAACGGATGGGTGTGTC

39

KPC-3B cgcgatcGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGgatcgcg

40

CTXMI-F3 GACGATGTCACTGGCTGAGC

41

CTXM1-R2 AGCCGCCGACGCTAATACA

42

TOHO1-2F GCGACCTGGTTAACTACAATCC

43

THOH1-1R CGGTAGTATTGCCCTTAAGCC

44

CTXM825F CGCTTTGCCATGTGCAGCACC

45

CTXM825R GCTCAGTACGATCGAGCC

46

CTXM914F GCTGGAGAAAAGCAGCGGAG

47

CTXM914R GTAAGCTGACGCAACGTCTG

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

Sondas

En algunas modalidades, la sonda puede incluir un marcador detectable. Los marcadores de interés incluyen marcadores radiactivos o no radiactivos directamente detectables e indirectamente detectables tales como colorantes fluorescentes. Los marcadores directamente detectables son esos marcadores que proporcionan una señal detectable directamente sin interacción con uno o más agentes químicos. Ejemplos de marcadores directamente detectables incluyen marcadores fluorescentes. Los marcadores indirectamente detectables son esos marcadores que interactúan con uno o más miembros para proporcionar una señal detectable. En esta última modalidad, el marcador es un miembro de un sistema productor de señal que incluye dos o más agentes químicos que trabajan juntos para proporcionar la señal detectable. . Ejemplos de marcadores indirectamente detectables incluyen biotina o digoxigenina, que pueden ser detectados por un anticuerpo apropiado acoplado a un fluorocromo o una enzima, tal como fosfatasa alcalina. En muchas modalidades preferidas, el marcador es un marcador directamente detectable. Los marcadores directamente detectables de interés particular incluyen marcadores fluorescentes. Los marcadores fluorescentes que encuentran uso en las modalidades descritas en la presente descripción incluyen una porción de fluoróforo. Los colorantes fluorescentes específicos de interés incluyen: colorantes de xanteno, por ejemplo, colorantes de fluoresceína y rodamina, tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), monoclorhidrato de 2-[etilamino)-3-(etilimino)-2-7-dimetil-3H-xanten-9-il]ácido benzoico etil éster (R6G)(emite una radiación respuesta en la longitud de onda que varía desde aproximadamente 500 a 560 nm), yoduro de 1,1,3,3,3',3'-Hexametilindodicarbocianina (HIDC) (emite una radiación respuesta en la longitud de onda que varía desde aproximadamente 600 a 660 nm), 6-carboxifluoresceína (comúnmente conocido por las abreviaturas FAM y F), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'dimetoxifluoresceína (JOE o J), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA o T), 6-carboxi-X-rodamina (ROX o R), 5-carboxirodamina-6G (R6G5 o G5), 6-carboxirodamina-6G (R6G6 o G6), y rodamina 110; colorantes de cianina, por ejemplo Cy3, Cy5 y Cy7; cumarinas, por ejemplo, umbeliferona; colorantes bencimida, por ejemplo, Hoechst 33258; colorantes de fenantridina, por ejemplo, Texas Red; colorantes de etidio; colorantes de acridina; colorantes de carbazol; colorantes de fenoxazina; colorantes de porfirina; colorantes de polimetina, por ejemplo, colorantes de cianina tales como Cy3 (emite una radiación respuesta en la longitud de onda que varía desde aproximadamente 540 a 580 nm), Cy5 (emite una radiación respuesta en la longitud de onda que varía desde aproximadamente 640 a 680 nm), etc; colorantes BODIPY y colorantes de quinolina. Los fluoróforos específicos de interés incluyen: pireno, cumarina, dietilaminocumarina, FAM, clorotriazinil fluoresceína, fluoresceína, R110, eosina, JOE, R6G, HIDC, tetrametilrodamina, TAMRA, Lissamina, ROX, Naftofluoresceína, Texas Red, Naftofluoresceína, verde SYBR, Cy3, y Cy5, y similares.

En modalidades preferidas, las composiciones y métodos descritos en este documento incluyen una sonda de baliza molecular, una sonda TAQMAN™, o una sonda SCORPION™. Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones y métodos descritos en la presente descripción incluyen una o más sondas de baliza molecular, en donde las sondas comprenden la secuencia de secs. con núm. de ident.:5, 10, 31, 32, ó 33, por ejemplo, una sonda como se muestra en una cualquiera de las secs. con núm. de ident.:25, 26, 27, 28, 32, y/o 33:

ccagcgTATGGYACCACCAACGATATCGCGGcgctgg (sec. con núm. de ident.:5) cgaggcGCGGCGCTGGARAAAAGCAGgcctcg (sec. con núm. de ident.:10) cgcgatcACACGACCGGCAACCACCGCAgatcgcg (sec. con núm. de ident.:36) cgcgatcGCTGCCGCTGTGCTGGCTCGgatcgcg (sec. con núm. de ident.:39) cggcgatAAGCARAGTGAAACGCAAAAGatcgccg (sec. con núm. de ident.:31) cCaCcaAcgaTatcgCg (sec. con núm. de ident.:32) TGGYACCACCAACGATATCGCGGT (sec. con núm. de ident.:33)

En algunas modalidades, las sondas, por ejemplo las sec. con núms. de ident.; 25-28 y 32-33, se marcan mediante el uso de una molécula silenciadora de fluoróforo FAM y un silenciador de DABCYL . En algunas modalidades, las sondas son sondas TAQMAN™, sondas de baliza molecular, o sondas SCORPION™. En algunas modalidades, el uno o más de los cebadores de amplificación pueden ser marcados, por ejemplo, con una porción fluorescente, tal como verde SYBR, o similares.

Las secuencias de cebadores y sondas descritos en la presente descripción pueden ser modificadas para incluir nucleótidos adicionales en el extremo 5' o 3' terminal. Del mismo modo, en algunas modalidades, las secuencias de cebadores y sondas pueden ser modificadas para tener nucleótidos sustituidos dentro de la secuencia. Se reconoce que las secuencias de cebadores y sondas deben contener suficiente complementariedad para hibridar específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana respectiva. De esta manera, al menos 1, 2, 3, 4, o hasta aproximadamente 5 nucleótidos pueden ser sustituidos.

Las sec. con núms. de ident. 32 y 33 son las dos específicas para los grupos 1 y 2 de CTX-M En algunas modalidades, la sonda de sec. con núm. de ident. 32 puede contener cinco ácidos nucleicos cerrados (LNA). En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident.:33 es una sonda TAQMAN™. En algunas modalidades, la sec. con núm. de ident. 33 contiene una o más bases redundantes, y específicamente hibrida (por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas y/o condiciones estándar de PCR) tanto con CTX-M 1 como con CTX-M 2.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

Los métodos de síntesis química que pueden ser usados para hacer los cebadores de las modalidades descritas en la presente descripción, incluyen, pero sin limitarse a, el método del fosfotriéster descrito por Narang y otros (1979) Methods in Enzymology 68:90, el método del fosfodiéster descrito por Brown y otros (1979) Methods in Enzymology 68:109, el método del dietilfosforamidato descrito por Beaucage y otros (1981) Tetrahedron Letters 22:1859, y el método de soporte sólido descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 4,458,066.

Se contempla además el uso de un sintetizador automático de oligonucleótidos para preparar cebadores de oligonucleótidos sintéticos de las modalidades descritas en la presente descripción.

Hibridación y Unión Específica

En algunas modalidades, la unión o apareamiento de los cebadores y/o sondas a secuencias diana de ácidos nucleicos se lleva a cabo a través de la hibridación. Un experto en la técnica apreciará que la hibridación específica se logra mediante la selección de secuencias que son al menos sustancialmente complementarias a la diana o a la secuencia de referencia de ácido nucleico. Esto incluye el apareamiento de bases de la secuencia de oligonucleótidos del ácido nucleico diana por toda la longitud de la secuencia de oligonucleótidos. Tales secuencias pueden ser referidas como "totalmente complementaria" con respecto a la otra. Cuando se haga referencia a un oligonucleótido como "sustancialmente complementario" con respecto a una secuencia de ácido nucleico en la presente descripción, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias, o pueden formar apareamientos erróneos tras la hibridación, pero conservan la capacidad de hibridarse en condiciones rigurosas o condiciones estándar de PCR como se discute más abajo.

En algunas modalidades, la muestra o espécimen se pone en contacto con un conjunto de cebadores de amplificación y una sonda. Preferentemente, los cebadores de amplificación y sondas hibridan con ácidos nucleicos diana bajo un solo conjunto de condiciones, es decir, condiciones rigurosas, que incluyen condiciones estándar de PCR discutidas a continuación. Como se usa en la presente descripción, el término "condiciones rigurosas" condiciones rigurosas de hibridación pueden variar ( por ejemplo a partir de las concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1 M, más usualmente menos de aproximadamente 500 mM y preferentemente menos de aproximadamente 200 mM) y las temperaturas de hibridación pueden variar (por ejemplo, desde tan bajas como 0°C hasta mayores que 22°C, mayor que aproximadamente 30°C y (más frecuentemente) en exceso de aproximadamente 37°C en dependencia de las longitudes y/o la composición de ácido nucleico de las sondas. Los fragmentos más largos pueden requerir temperaturas de hibridación mayores para la hibridación específica. Como varios factores afectan la rigurosidad de la hibridación, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de un solo factor. Por consiguiente, a modo de ejemplo, el término "condiciones de hibridación rigurosas" puede referirse a cualquiera o ambos de lo siguiente: a) 6 x SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0.2 x SSC, 0.1% SDS a 65°C, y b) NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6.4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C durante 12-16 horas, seguido de lavado. En algunas modalidades, el término "condiciones rigurosas" puede referirse a condiciones estándar de PCR.

En algunas modalidades, la muestra o espécimen se pone en contacto con un conjunto de cebadores de amplificación en condiciones estándar de PCR. Para una revisión de la tecnología de PCR, que incluyen condiciones estándar de PCR, aplicada a la microbiología clínica, ver DNA Methods in Clinical Microbiology, Singleton P., publicado por Dordrecht; Boston: Kluwer Academic, (2000) Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B.A. Ed. en Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997) y "PCR Methods and Applications", from 1991 to 1995 (Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los ejemplos no limitantes de "condiciones de PCR" incluyen las condiciones descritas en las referencias citadas en la presente descripción, tales como, por ejemplo, KCl 50 mM, Tris-HCl (pH 9.0) 10 mM, 0.1% de Triton X-100, MgCl22.5 mM, con una temperatura de hibridación de 72°C; o 4mM MgCl2, Tris 100mM, pH 8.3, KCl 10mM, (NH4)2SO4 5mM, 0.15mg de BSA, 4% de trehalosa, con una temperatura de hibridación de 59°C, o KCl 50 mM, Tris-HCl (pH 9.0) 10 mM, 0.1% de Triton X-100, MgCl22.5 mM, con una temperatura de hibridación de 55°C,

o similar.

En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción comprenden una PCR, por ejemplo, QPCR, basado en el método de amplificación y detección de ESBL, tales como ácidos nucleicos CTX-M, mediante el uso de los cebadores y sondas descritos en la presente descripción. En varias modalidades, los métodos descritos en la presente descripción son capaces de detectar la presencia de ESBL, tales como CTX-Ms a una concentración de bacterias que está dentro de los intervalos fisiológicos (es decir, la concentración de bacterias en una muestra obtenida de un sujeto infectado con las bacterias). Así, una muestra se puede seleccionar directamente sin la necesidad de aislar, concentrar,

o expandir (por ejemplo, cultivar) la población bacteriana con el fin de detectar la presencia de una ESBL, por ejemplo, una CTX-M. En varias modalidades, los métodos descritos en la presente descripción son capaces de detectar la presencia de un ESBL a partir de una muestra que tiene una concentración de bacterias de aproximadamente 1x 103 CFU/ml, aproximadamente1 x 104 CFU/ml, aproximadamente 1x 105 CFU/ml, o aproximadamente 1x 106 CFU/ml.

Numerosos protocolos diferentes de PCR o QPCR se conocen en la técnica y se ejemplifican en la presente descripción

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

más abajo y se pueden aplicar directamente o adaptarse para usar con el empleo de las composiciones actualmente descritas para la detección de ESBL, que incluyen CTX-Ms en una muestra.

Generalmente, en la PCR, una secuencia de polinucleótido diana se amplifica por reacción con al menos un cebador de oligonucleótido o un par de cebadores de oligonucleótidos. El cebador (es) se hibridan con una región complementaria del ácido nucleico diana y una ADN polimerasa extiende el cebador (es) para amplificar la secuencia diana. En condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácido nucleico basado en la polimerasa, un fragmento de ácido nucleico de un tamaño domina los productos de reacción (la secuencia de polinucleótido diana que es el producto de amplificación). El ciclo de amplificación se repite para aumentar la concentración de la secuencia única del polinucleótido diana. La reacción se puede realizar en cualquier termociclador usado comúnmente para PCR. Sin embargo, se prefieren los cicladores con capacidades de medición de fluorescencia en tiempo real, por ejemplo, SMARTCYCLER® (Cepheid, Sunnyvale, CA), ABI PRISM 7700® (Applied Biosystems, Foster City, CA), ROTOR-GENE™; (Corbett Research, Sydney, Australia), LIGHTCYCLER® (Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN), ICYCLER® (Biorad Laboratories, Hercules, CA) y MX4000® (Stratagene, La Jolla, CA.

Algunas modalidades proporcionan métodos que incluyen PCR cuantitativa (QPCR) (también conocida como PCR en tiempo real). QPCR puede proporcionar mediciones cuantitativas, y además proporcionar los beneficios de la reducción del tiempo y la contaminación. Como se usa en la presente descripción, "PCR cuantitativa" (o "QPCR de tiempo real") se refiere a la monitorización directa del progreso de una amplificación por PCR mientras está ocurriendo sin la necesidad del muestreo repetido de los productos de reacción. En QPCR, los productos de reacción pueden ser controlados a través de un mecanismo de señalización (por ejemplo, fluorescencia) a medida que se generan y se realiza un seguimiento después que la señal se eleva por encima de un nivel inicial, pero antes que la reacción alcanza una meseta. El número de ciclos requeridos para alcanzar un nivel de fluorescencia detectable o "umbral" (referido en la presente descripción como ciclo umbral o "CT") varía directamente con la concentración de dianas amplificables en el comienzo del proceso de PCR, lo que permite una medida de intensidad de la señal para proporcionar una medida de la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra en tiempo real.

En algunas modalidades, una sonda marcada se puede usar para detectar el producto de extensión generado mediante amplificación por PCR. Cualquier formato de sonda que utiliza una sonda marcada que comprende secuencias descritas en la presente descripción se pueden usar, por ejemplo, sondas SCORPION™, sondas sunrise, sondas TAQMAN™, o sonda de baliza molecular como se conoce en la técnica o descritos en otra parte en la presente descripción. En algunas modalidades, las sondas pueden usarse a una concentración de aproximadamente 0.01 µM, 0.02 µM, 0.03 µM,

0.04 µM, 0.05 µM, 0.06 µM, 0.07 µM, 0.08 µM, 0.09 µM, 0.1 µM, 0.11 µM, 0.12 µM, 0.13 µM, 0.14 µM, 0.15 µM, 0.16 µM, 0.17 µM, 0.18 µM, 0.19 µM, 0.2 µM, 0.21 µM, 0.22 µM, 0.23 µM, 0.24 µM, 0.25 µM, 0.26 µM, 0.27 µM, 0.28 µM,

0.29 µM, 0.3 µM, 0.31 µM, 0.32 µM, 0.33 µM, 0.34 µM, 0.35 µM, 0.36 µM, 0.37 µM, 0.38 µM, 0.39 µM, 0.4 µM, 0.42 µM,

0.46 µM, 0.48 µM, 0.5 µM, o más, o cualquier concentración intermedia. En algunas modalidades, la reacción puede incluir aproximadamente 0.1 µM de la sec. con núm. de ident. 32 y/o aproximadamente 0.3 µM de la sec. con núm. de ident. 33.

Los métodos para montar una reacción de PCR son bien conocidos para los expertos en la técnica. La mezcla de reacción comprende mínimamente ácido nucleico molde (excepto en el caso de un control negativo tal como se describe más abajo y cebadores de oligonucleótidos y/o sondas en combinación con tampones adecuados, sales, y similares, y una concentración apropiada de una polimerasa de ácido nucleico. Como se usa en la presente descripción, "polimerasa de ácido nucleico" se refiere a una enzima que cataliza la polimerización de nucleósidos trifosfato. Generalmente, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador hibridado a la secuencia diana, y procederá en la dirección 5' a lo largo del molde hasta que la síntesis termina. Una concentración apropiada incluye uno que cataliza esta reacción en los métodos descritos actualmente. Las ADN polimerasas conocidas útiles en los métodos descritos en la presente descripción incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa T7, ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus, ADN polimerasa de Thermococcus litoralis, ADN polimerasa deThermus aquaticus (Taq) y ADN polimerasa de Pyrococcusfuriosus (Pfu).

Adicionalmente de los componentes anteriores, la mezcla de reacción de los presentes métodos incluye cebadores, sondas, y desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs).

Usualmente la mezcla de reacción comprenderá además cuatro tipos diferentes de dNTPs correspondientes a las cuatro bases de nucleósidos de origen natural, es decir, dATP, dTTP, dCTP, y dGTP. En algunas de las modalidades descritas en la presente descripción, cada dNTP estará presente típicamente en una cantidad que varía de aproximadamente 10 a 5000 µM, usualmente de aproximadamente 20 a 1000 µM, aproximadamente de 100 a 800 µM, o aproximadamente 300 a 600 µM.

La mezcla de reacción preparada en la primera etapa de los métodos de las modalidades descritas en la presente descripción incluye, además, un medio de tampón acuoso que incluye una fuente de iones monovalentes, una fuente de cationes divalentes, y un agente tampón. Cualquier fuente conveniente de iones monovalentes, tales como cloruro de

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

potasio, acetato de potasio, acetato de amonio, glutamato de potasio, cloruro de amonio, sulfato de amonio, y similares pueden ser empleadas. El catión divalente puede ser magnesio, manganeso, cinc, y similares, donde el catión será típicamente magnesio. Cualquier fuente conveniente de catión magnesio se puede emplear, que incluyen cloruro de magnesio, acetato de magnesio, y similares. La cantidad de magnesio presente en el tampón puede variar de 0.5 a 10 mM, y puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 mM, o aproximadamente de 3 a aproximadamente 5 mM. Los agentes tampón representativos o sales que pueden estar presentes en el tampón incluyen Tris, Tricina, HEPES, MOPS, y similares, donde la cantidad de agente tampón variará típicamente de aproximadamente 5 a 150 mM, usualmente de aproximadamente 10 a 100 mM, y más usualmente de aproximadamente 20 a 50 mM, donde en ciertas modalidades preferidas el agente tampón estará presente en una cantidad suficiente para proporcionar un pH que varía de aproximadamente 6.0 a 9.5, por ejemplo, un pH de aproximadamente pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, ó 9.5. Otros agentes que pueden estar presentes en el medio tampón incluyen agentes quelantes, tales como EDTA, EGTA, y similares. En algunas modalidades, la mezcla de reacción puede incluir BSA, o similares.

En la preparación de la mezcla de reacción, los varios componentes constituyentes se pueden combinar en cualquier orden conveniente. Por ejemplo, el tampón se puede combinar con el cebador, la polimerasa, y después el ácido nucleico molde, o la totalidad de los varios componentes constituyentes se pueden combinar al mismo tiempo para producir la mezcla de reacción.

Alternativamente, los reactivos mezclados previamente disponibles comercialmente pueden ser utilizados en los métodos descritos en la presente descripción de acuerdo con la instrucciones del fabricante, o modificados para mejorar las condiciones de reacción (por ejemplo, modificación de concentración de tampón, concentración de cationes, o la concentración de dNTP, según sea necesario), que incluyen, por ejemplo, TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), OMNIMIX® o SMARTMIX® (Cepheid), IQ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories), LIGHTCYCLER® FastStart (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), o BRILLIANT® QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA).

A continuación de la preparación de la mezcla de reacción, la mezcla de reacción se puede someter a condiciones de reacción de extensión del cebador ("condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácido nucleico basado en la polimerasa"), es decir, condiciones que permiten la extensión del cebador mediada por la polimerasa mediante la adición de nucleótidos al extremo de la molécula de cebador con el uso de la cadena molde como un molde. En muchas modalidades, las condiciones de reacción de extensión del cebador son condiciones de amplificación, que incluyen una pluralidad de ciclos de reacción donde cada ciclo de reacción comprende: (1) una etapa de desnaturalización, (2) una etapa de hibridación, y (3) una etapa de polimerización. El número de ciclos de reacción variará en dependencia de la aplicación que se ejecuta pero usualmente será al menos 15, más usualmente al menos 20, y puede ser tan alto como 60 o superior, donde el número de ciclos diferentes típicamente variará de aproximadamente 20 a 40. Para los métodos donde se realizan más de aproximadamente 25, usualmente más de aproximadamente 30 ciclos, puede ser conveniente o deseable introducir polimerasa adicional en la mezcla de reacción tal que las condiciones adecuadas para la extensión del cebador enzimática se mantengan.

La etapa de desnaturalización comprende calentar la mezcla de reacción a una temperatura elevada y mantener la mezcla a la temperatura elevada durante un período de tiempo suficiente para que cualquier ácido nucleico de doble cadena o hibridado presente en la mezcla de reacción se disocie. Para la desnaturalización, la temperatura de la mezcla de reacción usualmente se elevará, y mantendrá a una temperatura que varía de aproximadamente 85 a 1000°C, usualmente de aproximadamente 90 a 98 °C, y más usualmente de aproximadamente 93 a 96 °C, durante un período de tiempo que oscila de aproximadamente 3 a 120 segundos, usualmente de aproximadamente 3 seg.

A continuación de la desnaturalización, la mezcla de reacción se someterá a condiciones suficientes para la hibridación del cebador al ácido nucleico molde presente en la mezcla (si está presente), y para la polimerización de nucleótidos a los extremos del cebador de una manera tal que el cebador se extienda en una dirección 5' a 3' mediante el uso del ácido nucleico al que se hibrida como un molde, es decir, condiciones suficientes para la producción enzimática del producto de extensión del cebador. En esta modalidad, los procesos de hibridación y extensión se producen en la misma etapa. La temperatura a la que la mezcla de reacción se reduce para lograr estas condiciones usualmente se seleccionará para proporcionar una eficiencia óptima y especificidad, y generalmente variará de aproximadamente 50 a 75 °C, usualmente de aproximadamente 55 a 70°C, y más usualmente de aproximadamente 60 a 68 °C, más particularmente alrededor de 600°C. Las condiciones de hibridación se mantendrán por un período de tiempo que varía de aproximadamente 15 seg a 30 min, usualmente de aproximadamente 20 segundos a 5 min, o aproximadamente de 30 segundos a 1 minuto, o aproximadamente de 30 segundos.

Esta etapa puede comprender, opcionalmente, una de cada una de etapa de hibridación y etapa de extensión con la variación y la optimización de la temperatura y la duración de tiempo para cada etapa. En una extensión e hibridación de dos etapas, la etapa de hibridación se deja proseguir como anteriormente. A continuación de la hibridación del cebador con el ácido nucleico molde, la mezcla de reacción se someterá adicionalmente a condiciones suficientes para proporcionar para la polimerización de nucleótidos a los extremos del cebador como anteriormente. Para lograr

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

condiciones de polimerización, la temperatura de la mezcla de reacción típicamente se elevará a o se mantendrá a una temperatura que varía de aproximadamente 65 a 75°C, usualmente de aproximadamente 67 a 73°C y se mantendrá por un período de tiempo que varía de aproximadamente 15 seg. a 20 min, usualmente de aproximadamente 30 seg a 5 min.

En algunas modalidades, el ciclo puede incluir una desnaturalización inicial de 15 minutos a 95°C, que se realiza sólo una vez, seguido de una etapa de desnaturalización a 95°C durante 1 segundo, y una etapa de hibridación/elongación a 60°C por 25 segundos. Este ciclo de dos etapas se puede repetir varias veces, por ejemplo, aproximadamente 45 veces. En algunas modalidades, una etapa de elongación final se puede añadir a 72°C durante 10 minutos.

En algunas modalidades, el ciclo puede incluir una etapa de desnaturalización inicial de 15 minutos a 95°C, es seguida por múltiples ciclos (por ejemplo, aproximadamente 45 ciclos) de: desnaturalización a 95°C durante 1 segundo, hibridación a 60°C durante 9 segundos y elongación a 72°C durante 9 segundos. Una etapa de elongación final se puede adicionar de 72°C durante 10 minutos.

Los ciclos anteriores de desnaturalización, hibridación, y polimerización se pueden realizar mediante el uso de un dispositivo automatizado, típicamente conocido como un ciclador térmico. Los cicladores térmicos que se pueden emplear se describen en otra parte en la presente descripción, así como en laspatentes de los Estados Unidos núms. 5,612,473; 5,602,756;5,538,871; y 5,475,610.

Los métodos descritos en la presente descripción además pueden usarse en aplicaciones no basadas en PCR para detectar una secuencia de ácido nucleico diana, donde tal diana se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Los métodos de inmovilización de una secuencia de ácido nucleico sobre un soporte sólido se conocen en la técnica y se describen en Ausubel y otros, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing y Wiley-Interscience, NY), y en los protocolos proporcionados por los fabricantes, por ejemplo, para membranas: Pall Corporation, Schleicher & amp; Schuell; para perlas magnéticas: Dynal; para placas de cultivo: Costar, Nalgenunc; para plataformas de arreglos de perlas: Luminex y Becton Dickinson; y, para otros soportes útiles en las modalidades descritas en la presente descripción, CPG, Inc.

El experto en la técnica de amplificación de ácidos nucleicos conoce la existencia de otros procedimientos de amplificación rápidos, tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), los sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS), la replicación auto-sostenida de secuencia (3SR), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y ADN ramificado (bDNA) (Persing y otros (1993) Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (American Society for Microbiology, Washington, DC). El alcance de la modalidades descritas en la presente descripción no se limita al uso de la amplificación por PCR, sino que más bien incluye el uso de cualquiera de los métodos rápidos de amplificación de ácidos nucleicos o cualesquiera de otros procedimientos que pueden ser útiles con las secuencias de las modalidades descritas en la presente descripción para la detección y/o cuantificación de gen(es) de resistencia a los antibióticos ESBL (s), por ejemplo, genes CTX-M.

Además, las variaciones en las cantidades exactas de los diversos reactivos y en las condiciones para la PCR u otro procedimiento de amplificación adecuado (por ejemplo, condiciones de tampón, los tiempos de ciclo, etc.) que conducen a resultados de amplificación o detección/cuantificación similares se conocen por los expertos en la técnica y se consideran equivalentes. En una modalidad, la detección QPCR en cuestión tiene una sensibilidad de detectar menos de 50 copias (preferentemente menos de 25 copias, más preferentemente menos de 15 copias, aún con mayor preferencia menos de 10 copias) de ácido nucleico diana (es decir, ácidos nucleicos de ESBL, que incluyen genes CTX-M) en una muestra. En una modalidad, se realiza una reacción de PCR de arranque en caliente (por ejemplo, mediante el uso de una ADN Taq polimerasa de arranque en caliente) con el fin de mejorar la reacción de PCR por disminución de fondo de la amplificación no específica y para aumentar la amplificación del producto de extensión deseado.

Controles

En algunas modalidades, las reacciones de PCR o QPCR descritas en la presente descripción pueden contener varios controles. Tales controles pueden incluir un control negativo "sin molde", en el que los cebadores, tampón, enzima(s) y otros reactivos necesarios (por ejemplo, cloruro de magnesio, nucleótidos) se someten al ciclo en ausencia de muestra de ensayo añadida. Un control positivo que incluye un ácido nucleico diana conocido también se puede ejecutar en paralelo. En algunas modalidades, tanto un control positivo como un control negativo pueden ser incluidos en la reacción de amplificación. Una sola reacción puede contener un control positivo, un control negativo, o un molde de muestra, o una sola reacción puede contener tanto un molde de muestra como un control positivo.

Adicionalmente a los controles "sin molde", los controles negativos pueden incluir además reacciones de amplificación con ácidos nucleicos diana no específicos incluidos en la reacción, o pueden ser muestras preparadas mediante el uso de cualquiera o todas las etapas de preparación de muestras (desde extracción de ácidos nucleicos hasta la

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E10744408

20-08-2015

preparación de amplificación) sin la adición de una muestra de ensayo (por ejemplo, cada etapa usa lo mismo ninguna muestra de prueba o una muestra conocida que esté libre de ESBL, tal como CTX-M).

Los controles positivos y negativos son útiles para establecer los parámetros dentro de los cuales una muestra de prueba se clasificará como que tiene o no tiene una ESBL.

Por ejemplo, en una reacción de QPCR, el umbral de ciclo en el que una ESBL, por ejemplo, una CTX-M se detecta en una muestra de control positivo se puede usar para establecer el umbral para clasificar una muestra como "positiva", y el umbral de ciclo en el que la ESBL de interés, por ejemplo, CTX-M se detecta en una muestra de control negativo se puede usar para establecer el umbral para clasificar una muestra como "negativa." El CT de una sola reacción puede ser usado para cada control, o se puede usar la mediana o la media de muestras replicadas. En aún otra modalidad, se pueden usar los valores de control históricos. El nivel mínimo de detección para cada uno de los controles negativos y positivos se fija típicamente en el extremo inferior del intervalo de confianza del 95% del CT medio por las múltiples reacciones. Este valor se puede ajustar en dependencia de los requerimientos de la prueba de diagnóstico.

Preferentemente, los controles de PCR se deben realizar al mismo tiempo que la muestra de prueba, mediante el uso de los mismos reactivos, en la misma reacción de amplificación.

Algunas modalidades tienen en cuenta la determinación de la identidad y/o cantidad de productos diana de amplificación. La identidad de la extensión del cebador o producto de amplificación se puede confirmar mediante el uso de técnicas moleculares estándar, que incluyen (por ejemplo) un ensayo de transferencia Southern. En un ensayo de transferencia Southern, los productos de amplificación se separan mediante electroforesis, se transfieren a una membrana (es decir, nitrocelulosa, nailon, etc.), se hacen reaccionar con una sonda de oligonucleótido o cualquier porción de la secuencia de ácido nucleico de interés. La sonda se modifica después para permitir la detección. Los métodos de modificación pueden ser la incorporación de un nucleótido radiomarcado o cualquier número de marcadores no radiactivos (tal como biotina). La sonda de oligonucleótido usada en el ensayo de transferencia Southern se deriva de la secuencia de ácido nucleico y por lo tanto, es específica para ácidos nucleicos de CTX-M, y puede ser una sonda que comprende la secuencia que se expone en las sec. con núms. de ident.;5, 10 31, 32, y 33. La sonda usada en el ensayo de transferencia Southern se puede preparar mediante el uso de métodos estándar, de rutina. Por ejemplo, la sonda se puede aislar, clonar, y restringir mediante el uso de técnicas de rutina conocidas en la técnica o se pueden hacer con el uso de métodos de síntesis química descritos previamente en la presente descripción.

Alternativamente, los productos de amplificación se pueden detectar mediante el uso del análisis de transferencia puntual. El análisis de transferencia puntual implica adherir una sonda de oligonucleótido (tal como la descrita previamente) a una nitrocelulosa o soporte sólido tal como, pero sin limitarse a, una perla (tal como, pero sin limitarse a, perlas de poliestireno, perlas magnéticas, o perlas no magnético, etc.), las paredes de una bandeja de reacción, tiras (tales como, pero sin limitarse a, tiras de nitrocelulosa), un tubo de ensayo. La muestra que contiene el producto de amplificación marcado se adiciona, reacciona, se lava para la muestra no unida eliminada, y un producto amplificado, marcado unido a la sonda se visualiza mediante el uso de técnicas de rutina conocidas en la materia. Una manera más rigurosa para verificar el producto de extensión del cebador o producto de amplificación es a través de técnicas de secuenciación directa mediante el uso de técnicas bien conocidas en la materia.

Estuches

Además se proporcionan en la presente descripción "estuches" que contienen los elementos necesarios para llevar a cabo los métodos descritos en la presente. Tal un estuche puede comprender un portador que está compartimentado para recibir en confinamiento cerrado en el mismo uno o más recipientes, tales como tubos o frascos. Uno de los recipientes puede contener al menos un cebador o sonda no marcada o marcada de forma detectable descritos en la presente descripción. El cebador o cebadores pueden estar presentes en forma liofilizada o en un tampón apropiado según sea necesario. Uno o más recipientes pueden contener una o más enzimas o reactivos para ser utilizados en reacciones de PCR. Estas enzimas pueden estar presentes por sí mismas o en mezclas, en forma liofilizada o en tampones apropiados.

Por último, el estuche puede incluir todos los elementos adicionales necesarios para llevar a cabo los métodos divulgados en la presente descripción, tales como tampones, reactivos de extracción, enzimas, pipetas, placas, ácidos nucleicos, nucleósidos trifosfato, papel de filtro, materiales en gel, materiales de transferencia, suministros de autorradiografía, y similares.

Preferentemente, los estuches incluyen al menos: (a) un oligonucleótido marcado, donde el estuche incluye dos o más oligonucleótidos distinguibles, por ejemplo, que hibridan con una secuencia de nucleótidos que codifica una EMBL, por ejemplo, un gen CTX-M; y ( b) instrucciones para usar el (los) oligonucleótido(s) marcado(s) proporcionado(s) en una amplificación de alta fidelidad, por ejemplo, reacción, PCR, tal como QPCR. En una modalidad los dos oligonucleótidos distinguibles serán seleccionados del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.; 1-24.

E10744408

20-08-2015

En algunas modalidades, los estuches incluyen reactivos adicionales que se requieren para o convenientes y/o deseables para incluir en la mezcla de reacción preparada durante los métodos descritos en la presente descripción, donde dichos reactivos incluyen: uno o más polimerasas; un medio tampón acuoso (ya sea preparado o presente en sus

5 componentes constituyentes, donde uno o más de los componentes se pueden mezclar previamente o todos los componentes pueden estar separados), y similares. Los diversos componentes de reactivos de los estuches pueden estar presentes en recipientes separados, o todos se pueden combinar previamente en una mezcla de reactivos para la combinación con el ácido nucleico molde.

10 Adicionalmente a los componentes anteriores, en algunas modalidades, los estuches pueden incluir además instrucciones para practicar los métodos descritos en la presente descripción. Estas instrucciones pueden estar presentes en los estuches en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el estuche. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una pieza o piezas de papel en el que la información se imprime, en el embalaje del estuche, en

15 un prospecto, etc. Aún otros medios serían un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, CD, etc., en los que la información ha sido registrada. Aún otros medios que pueden estar presentes es una dirección de sitio web que se puede usar a través de Internet para acceder a la información en un sitio separado. Cualquier medio conveniente pueden estar presentes en los estuches.

20

E10744408

20-08-2015

Referencias

1. Rasmussen y Bush. 1997. Carbapenem-Hydrolyzing β-Lactamases. Antimicrob. Agents Chemother 41 : 223-232.

2. Woodford y otros 2004. Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New Carbapenem-Hydrolyzing Class A β5 Lactamase, KPC-3, in a New York Medical Center. Antimicrob. Agents Chemother 48 : 4793-4799.

3.

Yigit y otros 2001. Novel Carbapenem-Hydrolyzing β-Lactamase, KPC-1, from a Carbapenem-Resistant Strain of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother 45 : 1151-1161.

4.

Manual of Microbiology, 81o. edición. Editado por PR Murray, EJ Baron, JH Jorgensen, MA Pfaller, y RH Yolken. ASM Press, Washington D.C., 2003.

10 5. Clinical and Laboratory Standard Institute. 2008. Performance, Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eighteenth Informational Supplement M100-S18. Clinical and Laboratory Standard Institute, Wayne, Pa.

6.

Dieffenbach & Dveksler. 2003. PCR Primer: A Laboratory Manual. CSHL Press, 520 p.

7.

Devor, E.J. 2005. Locked Nucleic Acids (LNAs). Molecular Genetics and Bioinformatics: Integrated DNA technologies.

15

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   Reivindicaciones

   1.

   Un método para la detección y/o identificación de la presencia de microbios con una β-lactamasa de espectro extendido de CTX-M en un espécimen, que comprende:

   obtener una muestra del espécimen para ser analizada para la presencia de una β-Lactamasa de espectro extendido de CTX-M; poner en contacto la muestra con un conjunto de cebadores de amplificación en condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácidos nucleicos basados en la polimerasa, en donde el conjunto de cebadores de amplificación comprende al menos un par de cebadores que comprende un primer y segundo cebador, dichos cebadores primero y segundo que comprenden al menos 12 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en: sec. con núms. de ident.; 1 y 2 ; sec. con núms. de ident.; 3 y 4; sec. con núms. de ident.; 6 y 7; sec. con núms. de ident.; 8 y 9; sec. con núms. de ident.; 27 y 28; y sec. con núms. de ident.; 29 y 30; o las complementarias de estas, en donde dicho conjunto de cebadores comprende uno o más cebadores con una base universal, en donde dicho conjunto de cebadores de amplificación se hibridan conjuntamente, y producen productos de amplificación diana en la presencia de isoformas de CTX-M 1-82; proporcionar reactivos y condiciones para la extensión de los cebadores para generar los productos de amplificación diana; y determinar la presencia y/o cantidad de los productos de amplificación diana, en donde la presencia del producto de amplificación diana indica la presencia de dicha β-lactamasa de espectro extendido de CTX-M.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, que además comprende poner en contacto dicha muestra con al menos una sonda que hibrida con al menos un producto de amplificación diana.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho conjunto de cebadores de amplificación comprende una pluralidad de pares de cebadores de amplificación, en donde dicha pluralidad de pares de cebadores de amplificación se hibridan conjuntamente con, y producen productos de amplificación diana en la presencia de ácidos nucleicos de CTX-M a partir de cada una de las cepas bacterianas enumeradas en la Tabla 1.

4. 4.

   El método de la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha sonda se selecciona del grupo que consiste en una sonda de baliza molecular, una sonda fluorescente TAQMAN™, y una sonda fluorescente scorpion.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, que además comprende poner en contacto dicha muestra con una o más sondas, en donde dicha una o más sondas hibrida conjuntamente con los productos de amplificación diana de los grupos de CTX-M CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, y CTX-M-25, bajo condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácidos nucleicos basados en la polimerasa.

6. 6.

   El método de la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho conjunto de cebadores de amplificación comprende al menos dos cebadores, en donde cada cebador se selecciona del grupo que consiste en:

   CYGCTTCCTGGGTTGTGG (sec. con núm. de ident.:1); TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG (sec. con núm. de ident.:2); GGTMTGCCGAAATSWTGG (sec. con núm. de ident.:3); CGCAGCCAGAAHATCCCGAC (sec. con núm. de ident.:4); TGTRTGCSCAGGCGAACG (sec. con núm. de ident.:6); GTAGAGCGTCTGTGYGTTAFCG (sec. con núm. de ident.:7); TTTATGCGCAGACGAGTG (sec. con núm. de ident.:8); AAAGCACCTGCGTATTATCT (sec. con núm. de ident.:9); o la complementaria de estas.

7. 7.

   El método de la reivindicación 6, que además comprende poner en contacto dicha muestra con al menos una sonda, en donde dicha al menos una sonda comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en la sec. con núm. de ident.: 5, sec. con núm. de ident.:10, sec. con núm. de ident.:31, sec. con núm. de ident.:32, y sec. con núm. de ident.:33.

   33

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

8. 8.

   El método de la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho conjunto de cebadores de amplificación comprende al menos dos cebadores, en donde cada cebador comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en :

   CYGCTTCCTGGGTTGTGG (sec. con núm. de ident.:1); TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG (sec. con núm. de ident.:2); GGTMTGCCGAAATSWTGG (sec. con núm. de ident.:3); CGCAGCCAGAAHATCCCGAC (sec. con núm. de ident.:4); CAGCACCAGTAARGTGATG (sec. con núm. de ident.:27); TTGTAGTTAAYCARGTCYGARG (sec. con núm. de ident.:28); CGGTGATGAACGCTTTCC (sec. con núm. de ident.:29); ATCGGCAGGCTTGATCTC (sec. con núm. de ident.:30); o la complementaria de estas.

9. 9.

   El método de la reivindicación 8, que además comprende poner en contacto dicha muestra con al menos una sonda, en donde dicha al menos una sonda comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en la sec. con núm. de ident.:5, sec. con núm. de ident.:10, sec. con núm. de ident.:31, sec. con núm. de ident.:32, y sec. con núm. de ident.: 33.

10. 10.

    Un estuche para la detección y/o identificación de la presencia de microbios con β-lactamasas de espectro extendido de CTX-M en un espécimen, que comprende:

    un conjunto de cebadores de amplificación en donde el conjunto de cebadores de amplificación comprende una pluralidad de pares de cebadores, y en donde dicho conjunto de cebadores de amplificación comprende uno o más cebadores con una base universal, en donde dicha pluralidad de pares de cebadores de amplificación se hibridan conjuntamente a, y produce productos de amplificación diana en la presencia de, isoformas 1-82 de CTX-M bajo condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácidos nucleicos basados en la polimerasa, en donde el conjunto de cebadores de amplificación comprende al menos un par de cebadores que comprende un primer y segundo cebador, dichos primero y segundo cebadores que comprenden al menos 12 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en: sec. con núms. de ident.; 1 y 2 sec. con núms. de ident.; 3 y 4; sec. con núms. de ident.; 6 y 7; sec. con núms. de ident.; 8 y 9; sec. con núms. de ident.; 27 y 28; y sec. con núms. de ident.; 29 y 30; o las complementarias de estas.

11. 11.

    El estuche de la reivindicación 10, que además comprende al menos una sonda que se hibrida con al menos una secuencia diana.

12. 12.

    El estuche de la reivindicación 11, caracterizado además porque dicha sonda se selecciona del grupo que consiste en un sonda de baliza molecular, una sonda fluorescente TAQMAN™, y una sonda fluorescente scorpion.

13. 13.

    El estuche de la reivindicación 10, que además comprende al menos una sonda que se puede hibridar con los productos de amplificación diana de al menos dos productos de amplificación diana del grupo CTX-M bajo dichas condiciones suficientes para proporcionar productos de amplificación de ácidos nucleicos basados en la polimerasa.

14. 14.

    El estuche de la reivindicación 10, que además comprende una o más sondas, en donde dichas una o más sondas se pueden hibridar conjuntamente a los productos de amplificación diana de los grupos CTX-M CTX-M1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, y CTX-M-25, bajo condiciones estándar de PCR.

15. 15.

    El estuche de la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho conjunto de cebadores de amplificación comprende al menos dos cebadores, seleccionados del grupo que consiste en:

    CYGCTTCCTGGGTTGTGG (sec. con núm. de ident.:1); TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG (sec. con núm. de ident.:2); GGTMTGCCGAAATSWTGG (sec. con núm. de ident.:3); CGCAGCCAGAAHATCCCGAC (sec. con núm. de ident.:4); TGTRTGCSCAGGCGAACG (sec. con núm. de ident.:6); GTAGAGCGTCTGTGYGTTATCG (sec. con núm. de ident.:7); TTTATGCGCAGACGAGTG (sec. con núm. de ident.:8); AAAGCACCTGCGTATTATCT (sec. con núm. de ident.:9); o la complementaria de estas.

    34
16. 16. El estuche de la reivindicación 15, que además comprende al menos una sonda, en donde dicha al menos una sonda comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en la sec. con

    5 núm. de ident.:5, sec. con núm. de ident.:10, sec. con núm. de ident.:31, sec. con núm. de ident.:32, y sec. con núm. de ident.:33.
17. 17. El estuche de la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho conjunto de cebadores de amplificación comprende al menos dos cebadores, en donde cada cebador se selecciona del grupo que consiste en:

    10 CYGCTTCCTGGGTTGTGG (sec. con núm. de ident.:1); TTGRGGCTGGGTGAAGTAAG (sec. con núm. de ident.:2); GGTMTGCCGAAATSWTGG (sec. con núm. de ident.:3); CGCAGCCAGAAHATCCCGAC (sec. con núm. de ident.:4);

    15 CAGCACCAGTAARGTGATG (sec. con núm. de ident.:27); TTGTAGTTAAYCARGTCYGARG (sec. con núm. de ident.:28); CGGTGATGAACGCTTTCC (sec. con núm. de ident.:29); ATCGGCAGGCTTGATCTC (sec. con núm. de ident.:30); o la complementaria de estas.

    20 18. El estuche de la reivindicación 17, que además comprende al menos una sonda, en donde dicha al menos una sonda comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en la sec. con núm. de ident.:5, sec. con núm. de ident.:10, sec. con núm. de ident.:31, sec. con núm. de ident.:32, y sec. con núm. de ident.:33.

    25 19. El estuche de la reivindicación 10, que además comprende un par de cebadores de amplificación que se hibrida con ácidos nucleicos que flanquean una secuencia diana dentro o que incluyen parte de un gen carbapenamasa.

    35