ES2546186T3 - Procedimiento de fabricación de vacunas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de fabricación de una composición inmunogénica que comprende una etapa de conjugación de conjugación de un sacárido a un vehículo proteico para producir un conjugado de proteína-sacárido usando química de condensación de carbodiimida, en el que el sacárido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repetición) o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y / o carboxilo, y en el que el vehículo proteico comprende, o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y / o carboxilo, que comprende las etapas de I) - si el vehículo proteico comprende grupos tanto amino como carboxilo y el sacárido comprende grupos amino o carboxilo: a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de vehículo proteico necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade en la primera mitad del periodo y al menos un cuarto de la alícuota en la segunda mitad del periodo; II) - si el sacárido comprende grupos tanto amino como carboxilo y el vehículo proteico comprende grupos amino o carboxilo: a) mezclar el vehículo proteico y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de sacárido necesaria para durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período, y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período; III) - si el sacárido comprende grupos tanto amino como carboxilo y el vehículo proteico comprende grupos tanto amino como carboxilo: a) mezclar el vehículo proteico y el sacárido; y b) añadir la alícuota de carbodiimida necesaria para realizar la conjugación durante un periodo de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade durante la primera mitad del periodo y al menos un cuarto de la alícuota durante la segunda mitad del período; y en el que: la alícuota de carbodiimida es de de 0,01 a 3 mg de carbodiimida/mg de sacárido; el sacárido está presente a una concentración final de 0,5-50 mg / ml en la etapa b); el vehículo proteico está presente a una concentración final de 1-50 mg / ml en la etapa b); la relación inicial entre el vehículo proteico y el sacárido es de 5:1 a 1:5 (p/p); la concentración de sal presente en la etapa b) es 0-2M; el pH de la reacción en la etapa b) es pH 4,5 - 6,5, pH 4,5 - 7,5 o si un compuesto está presente en la etapa b) que mantiene el intermedio de reacción estable; y la temperatura de la reacción en la etapa b) es 4-37 grados C, y una etapa adicional de mezclar el conjugado de proteína-sacárido con un antígeno estafilocócico.

Description

Procedimiento de fabricación de vacunas

La presente invención se refiere a procedimientos mejorados de fabricación de composiciones inmunogénicas a través de reacciones de condensación de carbodiimida. En particular, se refiere a la conjugación de sacáridos (en

5 particular sacáridos estafilocócicos) y proteínas usando condensación de carbodiimida. También se refiere a composiciones inmunogénicas que pueden fabricarse de forma que comprendan los conjugados sacárido-proteína de la invención.

El uso de polisacáridos capsulares bacterianos ha sido ampliamente utilizado en inmunología durante muchos años para la prevención de la enfermedad bacteriana. Un problema con tal uso, sin embargo, es la naturaleza T

10 independiente de la respuesta inmunitaria. Por tanto, estos antígenos son poco inmunogénicos en niños pequeños. Este problema se ha superado mediante la conjugación de los antígenos polisacáridos a un vehículo proteico (una fuente de epítopos de linfocitos T colaboradores) que después se pueden usar para provocar una respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T, incluso en el primer año de vida.

En la técnica se conocen varias técnicas de conjugación. Los conjugados se pueden preparar por procedimientos de

15 aminación reductora directa como se describe en el documento US 4365170 (Jennings) y el documento US 4673574 (Anderson). Otros procedimientos se describen en los documentos EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477.508. El procedimiento de conjugación puede depender alternativamente en la activación de los grupos hidroxilo del sacárido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. El sacárido activado puede así acoplarse directamente o a través de un grupo espaciador (enlazador) a un grupo amino sobre la

20 proteína vehículo. Por ejemplo, el éster de cianato se puede acoplar con hexanodiamina o dihidrazida de ácido adípico (ADH o AH) y el sacárido derivado de amino se conjuga con la proteína vehículo usando química de carbodiimida (por ejemplo, EDAC o EDC) a través de un grupo carboxilo en la proteína vehículo. Tales conjugados se describen en la solicitud de PCT publicada WO 93/15760 Uniformed Services University y los documentos WO 95/08348 y WO 96/29094. Véase también Chu C. y col., Infect. Immunity, 1983 245 256.

25 El documento WO 99/18121 divulga la preparación de conjugados sacárido / proteína vehículo para el propósito de vacuna usando química de condensación de carbodiimida.

En general, los siguientes tipos de grupos químicos en una proteína vehículo se pueden utilizar para el acoplamiento / conjugación:

A) Carboxilo (por ejemplo, a través de ácido aspártico o ácido glutámico), que puede conjugarse con grupos 30 amino naturales o derivados en restos sacáridos utilizando química de la carbodiimida;

B) Grupo amino (por ejemplo a través de lisina) que puede conjugarse con grupos carboxilo naturales o derivados en restos sacáridos usando química de carbodiimida;

C) Sulfhidrilo (por ejemplo, a través de cisteína;

D) Grupo hidroxilo (por ejemplo, a través de tirosina);

35 E) Grupo Imidazolilo (por ejemplo, a través de histidina);

F) Grupo guanidilo (por ejemplo a través de arginina); y

G) Grupo indolilol (por ejemplo a través de triptófano).

En un sacárido, en general pueden usarse los siguientes grupos para un acoplamiento: OH, COOH o NH2. Los sacáridos estafilocócicos, por ejemplo sacáridos capsulares de S. aureus (tales como los de los serotipos 5 y / o 8)

40 contienen grupos OH y COOH. Los grupos aldehído pueden generarse después de diferentes tratamientos conocidos en la técnica tales como: peryodato, hidrólisis ácida, peróxido de hidrógeno, etc.

Enfoques de acoplamiento directo:

Sacárido-OH + CNBr o CDAP> éster de cianato + NH2-Prot -> conjugado

Sacárido-aldehído + NH2-Prot ----> base de Schiff + NaCNBH3 ----> conjugado

45 Sacárido-COOH + NH2-Prot + EDAC ----> conjugado

Sacárido-NH2 + COOH-Prot + EDAC ----> conjugado

Enfoques de acoplamiento indirecto a través de espaciador (enlazador):

Sacárido-OH + CNBr o CDAP> éster de cianato + NH2----NH2 ----> sacárido----NH2 + COOHProt

+ EDAC -----> conjugado

Sacárido-OH + CNBr o CDAP ----> éster de cianato + NH2-----SH -----> sacárido----SH + SH-Prot (proteína nativa con una cisteína expuesta u obtenida después de la modificación de los grupos amino de la proteína mediante SPDP, por ejemplo)> sacárido-SS-Prot

Sacárido-OH + CNBr o CDAP> éster de cianato + NH2--------SH -------> sacárido----SH + maleimida-Prot (modificación de los grupos amino) -> conjugado

Sacárido-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> sacárido------NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> conjugado

Sacárido-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> sacárido SH + SH-Prot (proteína nativa con una cisteína expuesta u obtenida después de la modificación de los grupos amino de la proteína mediante SPDP, por ejemplo)> sacárido-SS-Prot

Sacárido--COOH + EDAC+ NH2----SH -----> sacárido----SH + maleimida-Prot (modificación de los grupos amino) -> conjugado

Sacárido-aldehído + NH2-----NH2 ---> sacárido------NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> conjugado

Como se puede observar, la química de carbodiimida (por ejemplo, usando EDAC) es muy conveniente para las reacciones de conjugación, ya que hace uso de grupos en el sacárido y / o la proteína que puede estar presente de forma natural o insertarse fácilmente mediante derivación. También une convenientemente restos a través de un enlace peptídico.

Las carbodiimidas (RN = C = NR ') son compuestos insaturados con una estructura aleno (Nakajima e Ikada 1995 Bioconjugate Chem. 6 :123-130; Hoare y Koshland 1967 JBC 242:2447-2453). El producto químico es relativamente inestable al pH de su reacción (4,5 a 6,5) y, por lo tanto, todos los componentes de la reacción de conjugación del sacárido / proteína /carbodiimida tienden a añadirse juntos en la técnica.

Los presentes inventores han encontrado que dependiendo de la naturaleza del sacárido y la proteína que se van a conjugar, se pueden conseguir mejores características del conjugado final para su uso en vacunas mediante la adición lentamente a la mezcla de un cierto componente de la reacción. Al hacerlo se pueden obtener uno o más beneficios / mejoras, tales como: rendimiento de sacárido en el conjugado, capacidad para esterilizar por filtración del conjugado, un mejor control de la conjugación, reproducibilidad más fácil y / o prevención de las reticulaciones dentro de los restos.

Por consiguiente, en una realización, se proporciona un procedimiento de fabricación de una composición inmunogénica como se define en la reivindicación 1.

Descripción de las figuras

Figura 1 – Secuencias polipeptídicas de proteínas preferidas. La Tabla 2 proporciona información sobre qué proteína está representada por cada SEC ID.

Figura 2 – Secuencias nucleotídicas que codifican proteínas preferidas. La Tabla 2 proporciona información sobre qué proteína está codificada por cada SEC ID.

Descripción detallada

Se puede usar cualquier carbodiimida adecuada en la etapa de conjugación, siempre que sea capaz de conjugar sacáridos y proteínas en un medio acuoso. En una realización, la carbodiimida puede ser EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) [también conocida como EDC] o puede ser una carbodiimida distinta de EDAC.

El término “sacárido” a lo largo de la presente memoria descriptiva puede indicar un polisacárido o un oligosacárido e incluye a ambos. Puede indicar un lipopolisacárido (LPS) o un lipooligosacárido (LOS). Antes de USAR polisacáridos (tales como polisacáridos bacterianos) se pueden aislar de una cepa de origen (por ejemplo, de bacterias) o aislar de la cepa de origen y dimensionar en cierto grado mediante procedimientos conocidos (véase por ejemplo, los documentos EP497524 y EP497525; Shousun Chen Szu y col., -Carbohydrate Research Vol 152 p7-20 (1986)) por ejemplo mediante microfluidización. Los polisacáridos pueden ser de un tamaño con el fin de reducir la viscosidad en las muestras de polisacáridos y / o para mejorar la filtrabilidad de los productos conjugados. Los oligosacáridos tienen un bajo número de unidades de repetición (típicamente 5-30 unidades de repetición) y normalmente son polisacáridos hidrolizados.

Con la expresión "vehículo proteico" se pretende cubrir los pequeños péptidos y los polipéptidos grandes (> 10 kDa). Claramente, es más probable que los polipéptidos grandes contengan grupos reactivos tanto amino como carboxilo sin ninguna modificación.

Para los objetos de la invención, "polisacárido nativo" se refiere a un sacárido que no se ha sometido a un proceso, cuyo propósito es reducir el tamaño del sacárido. Un polisacárido puede quedar reducido ligeramente de tamaño

durante los procedimientos normales de purificación. Un sacárido tal es todavía nativo. Sólo si el polisacárido ha sido sometido a técnicas de dimensionamiento no se consideraría el polisacárido nativo.

Para los objetos de la invención, "de tamaño por un factor de hasta x2" significa que el sacárido se somete a un proceso destinado a reducir el tamaño del sacárido, pero conservando un tamaño de más de la mitad del tamaño del polisacárido nativo. X3, x4 etc. se han de interpretar de la misma manera, es decir, el sacárido se somete a un proceso destinado a reducir el tamaño del polisacárido, pero conservando un tamaño de más de un tercio, un cuarto, etc. del tamaño del polisacárido nativo.

Por "una etapa adicional de mezclar el conjugado de sacárido-proteína con un antígeno estafilocócico" se quiere decir que el conjugado de sacárido-proteína (que puede contener en sí mismo un sacárido estafilocócico y / o una proteína estafilocócica) se mezcla con un antígeno estafilocócico adicional que es no está presente en el conjugado de sacárido-proteína.

El período de tiempo de 1 minuto a 6 horas en la etapa b) del procedimiento para la adición de la alícuota completa del componente final puede ser de 1 minuto a 4 horas, de 2 minutos a 3 horas, de 3 minutos a 2 horas, de 4 a 60 minutos, de 5 a 50 minutos, de 6 a 40 minutos, de 7 a 30 minutos o de 8 a 20 minutos. Puede ser de 1 minuto a 5 horas, de 10 minutos a 4 horas, de 20 minutos y 3 horas, de 30 minutos a 2 horas, de 40 a 90 minutos, o de 50 a 70 minutos. Este tiempo puede ajustarse de acuerdo con el sacárido y la proteína precisos que se están conjugando.

En la presente invención, la alícuota del componente final de la etapa de conjugación (por ejemplo, de carbodiimida, sacárido o proteína) se añade en etapas durante el período de tiempo. Esto se hace de tal manera que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período, y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período. La cantidad total de la alícuota como se ha medido, por ejemplo, en ml o mg, se puede añadir en 4-100 etapas ('s') durante todo el período. En una realización, las etapas están dispuestas de tal manera que una cantidad uniforme (a / s) se introduce en todas las etapas. En una realización, las etapas están espaciadas uniformemente a lo largo del período 'p' (en segundos). Así, si una etapa se lleva a cabo en el momento cero del período 'p', cada etapa posterior podría tener lugar en un momento en que es p / (s-1). El volumen de la alícuota del componente final añadido en la etapa b) se puede ajustar en términos de facilidad de adición de la alícuota de la reacción dentro del período de tiempo deseado. La carbodiimida se puede añadir como una solución acuosa (típicamente tamponada a pH 7,5 antes de añadirse a la reacción) o como polvo sólido (EDAC, por ejemplo, es altamente soluble en medio acuoso). Por supuesto, si la carbodiimida es el último componente añadido a la reacción (situación III, etapa b)), se puede usar una carbodiimida de disolución lenta de tal manera que toda la alícuota de polvo se añade a la reacción de una vez, pero que se disuelve a una velocidad consistente con el período deseado sobre el cual la alícuota tiene que estar disponible para la reacción.

Si la proteína y / o sacárido no tiene grupos amino o carboxilo (o sólo tiene uno de estos), puede derivarse para darle una (o darle la otra que todavía no tiene). Por ejemplo, para un sacárido que solo comprende grupos hidroxilo reactivos (por ejemplo, sacárido capsular meningocócico de serogrupo A), un grupo de este tipo debe usarse para derivar en los grupos amino o carboxilo de manera que se pueda llevar a cabo la condensación de EDAC. Esto puede tener lugar dentro de una subunidad de repetición o puede ser un grupo que sólo está presente en el extremo de la molécula de sacárido.

Cabe señalar que, cuando la derivatización se lleva a cabo, puede ser beneficioso para derivatizar solamente parcialmente el resto. Para los sacáridos con subunidades de repetición, el epítopo diana puede estar presente en cada repetición. Por lo tanto, si la derivación parcial se lleva a cabo (por esto se entiende 0,5-20, 1-15, 3-12 o 5-10 % del grupo reactivo diana que realmente se ha derivatizado), esto puede tener el beneficio de conservar la mayoría de los epítopos y prevenir el exceso de reticulación.

Si un sacárido o proteína ya tiene grupos amino o carboxilo solamente (por ejemplo, sacárido Vi de Salmonella typhi, que de forma natural tiene grupos carboxilo pero no amino), la derivación puede tener lugar para darle otro tipo de grupo (es decir, grupos amino para Vi). Cabe señalar, sin embargo, que ya que la derivatización puede ser parcial esta acción puede cambiar la reacción preferida de la invención de un tipo I a un tipo III. Por ejemplo, si el sacárido Vi se conjuga con un vehículo proteico que comprende grupos tanto amino como carboxilo, la situación I añade las alícuota de proteína lentamente en la etapa b). Si el grupo carboxilo del sacárido Vi está parcialmente derivatizado con grupos amino, tendrá grupos tanto carboxilo como amino, por lo tanto la situación III que añade la alícuota de carbodiimida lentamente en la etapa b) se convierte en más relevante.

La derivatización se puede producir a través de la adición de un enlazador hetero-u homo-bifuncional. Puede tener lugar con una química similar a la descrita anteriormente para la etapa de conjugación de sacárido-proteínas (por ejemplo, CDAP o química de carbodiimida). El enlazador puede tener entre 4 y 20, 4 y 12, o 5 y 10 átomos de carbono. Puede tener dos grupos amino reactivos, dos grupos carboxilo reactivos, o uno de cada uno (por ejemplo, hexano diamina, ácido 6-aminocaproico, o dihidrazida de ácido adípico). Típicamente, la derivatización tiene lugar mediante la reacción de un gran exceso del enlazador con el sacárido y / o vehículo proteico a derivatizar. Esto permite que tenga lugar la derivatización con una reticulación intra-restos mínima (que, de otra manera, podría ser posible si, por ejemplo, se estuviera derivatizando un grupo carboxilo en un sacárido con grupos amino utilizando la

condensación de carbodiimida). El exceso de enlazador se elimina fácilmente usando técnicas tales como diafiltración.

En una realización, el sacárido comprende un grupo reactivo hidroxilo como parte de su unidad de repetición que está parcialmente derivatizado a través de un grupo amino en el enlazador (por ejemplo, con química de CDAP). En otra realización, el sacárido comprende un grupo reactivo amino como parte de su unidad de repetición que está parcialmente derivatizado a través de un grupo carboxilo en el enlazador (por ejemplo, con química de carbodiimida). En una realización adicional, el sacárido comprende un grupo reactivo carboxilo como parte de su unidad de repetición que está parcialmente derivatizado a través de un grupo amino en el enlazador (por ejemplo, con química de carbodiimida).

La alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación (esté presente en la etapa a) o b) de la reacción de la invención) es de 0,01 a 3, de 0,05 a 2, o de 0,09 a 1 mg de carbodiimida / mg de sacárido. Aunque estos números se calculan siendo EDAC la carbodiimida, estos números pueden ajustarse si cualquier otra carbodiimida se usa mediante multiplicación de los números en el rango por: peso molecular de otra carbodiimida) / (peso molecular de EDAC).

En general, el sacárido está presente en los procedimientos de la invención a una concentración final de 0,5 a 50 mg / ml en la etapa b). Esto dependerá del tamaño y la naturaleza del sacárido, y la extensión de cualquier derivatización. Por ejemplo, para los oligosacáridos se requiere una concentración más grande, pero para polisacáridos grandes una concentración mucho más pequeña será más adecuada. Si es hacia el extremo superior de parcialmente derivatizado con grupos amino o carboxilo, puede ser adecuada una concentración más pequeña para reducir la posibilidad de cualquier reticulación. El vehículo proteico puede estar presente a una concentración final de 1-50 mg / ml en la etapa b).

La relación inicial del vehículo proteico y el sacárido en los procedimientos de la invención es de 5:1 a 1:5, de 4:1 a 1:1, o de 3:1 a 2:(p / p). De nuevo, esto dependerá del tamaño y la naturaleza del sacárido, y la extensión de cualquier derivatización.

Las condiciones de sal (por ejemplo, NaCl) también se pueden variar según la naturaleza del sacárido / proteína. Por lo general, puede estar presente aproximadamente 0,2 M de NaCl en la etapa b) de los procedimientos de la invención, pero puede ser 0-2, 0,1-1 0,2-0,5 M.

En términos de pH en la etapa b) de los procedimientos de la invención, el pH de la reacción es un pH en el que se activa la carbodiimida, que es pH de 4,5-6,5, 4,7-6,0, o 5-5,5. Este pH se mantiene típicamente durante toda la reacción mediante la adición de ácido / base según sea necesario.

La temperatura de reacción durante la etapa b) de los procedimientos de la invención puede ser 4-37, 10-32, 17-30 o 22-27 º C, y típicamente se mantiene durante toda la reacción.

En los procedimientos de la invención, una vez que se ha añadido toda la alícuota en la etapa b) la reacción se mantiene típicamente durante otros 10 minutos a 72 horas, 20 minutos a 48 horas, 30 minutos a 24 horas, 40 minutos a 12 horas, 50 minutos a 6 horas, o 1-3 horas. Una vez que la reacción se ha completado, se ajusta el pH a 7,5-9 (hacia el extremo superior de este si hay N-hidroxisuccinimida presente) para volver al intervalo de pH estable de carbodiimida.

Una vez conjugado, el conjugado de sacárido-proteína se puede purificar a partir de: componentes que no han reaccionado, sacárido libre, etc mediante la inyección en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (por ejemplo: Sephacryl S400HR, Pharmacia). Esto se lleva a cabo típicamente a 2-8 ºC. El conjugado puede esterilizarse mediante filtración, después se almacena. En última instancia, una dosis eficaz (por ejemplo 1 a 20, 215 o 3-10 µg de sacárido / dosis) del conjugado de sacárido-proteína se puede formular con un excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una sal o adyuvante) para la fabricación de una composición inmunogénica o vacuna.

En términos de los sacáridos de la invención, cualquier sacárido de fuente viral, fúngica, bacteriana o eucariota pueden conjugarse mediante la etapa de la conjugación de los procedimientos de la invención. Puede ser el sacárido Vi de Salmonella typhi, o un sacárido distinto de Vi. Puede ser el sacárido capsular Hib de H. influenzae de tipo b, o puede ser un sacárido distinto de Hib. En una realización, el sacárido es un sacárido capsular bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: serogrupo A (MenA), B (MenB), C (MenC), W135 (MenW) o Y (MenY) de de N. meningitidis, serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F de Streptococcus pneumoniae, estreptococos del grupo B, grupo Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, o VII, Staphylococcus aureus de tipo 5, Staphylococcus aureus de tipo 8, Salmonella typhi (sacárido Vi), Vibrio cholerae, o H. influenzae de tipo b.

El peso molecular promedio en peso del sacárido puede ser 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000400000, 75000-300000, o 100000-200000. El peso molecular o peso molecular promedio de un sacárido en el presente documento se refiere al peso molecular promedio en peso (Mw) del sacárido medido antes de la conjugación y se mide mediante MALLS. La técnica MALLS es bien conocida en la materia y se lleva a cabo

típicamente como se describe en el ejemplo 2. Para el análisis MALLS de sacáridos, se pueden usar dos columnas (TSKG6000 y 5000PWxI) en combinación y los sacáridos se eluyen en agua. Los sacáridos se detectan usando un detector de dispersión de luz (por ejemplo, Wyatt Dawn DSP equipado con un láser de argón de 10 mW 1 a 488 nm) y un refractómetro inferométrico (por ejemplo, Wyatt Otilab DSP equipado con una célula P100 y un filtro rojo a

5 498nm). En una forma de realización, la polidispersidad del sacárido es 1-1.5, 1-1.3, 1-1.2, 1-1,1 o 1 a 1,05 y después de la conjugación a una proteína vehículo, la polidispersidad del conjugado es 1,0-2,5, 1,0-2,0. 1,0-1,5, 1,01,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 o 1,5-2,0. Todas las medidas de polidispersidad son mediante MALLS.

El sacárido puede ser un polisacárido nativo o puede haberse dimensionado por un factor de no más de 2, 4, 6, 8, 10 o 20 veces (por ejemplo, mediante microfluidización [por ejemplo, mediante el aparato Emulsiflex C-50] u otra

10 técnica conocida [por ejemplo, calor, productos químicos, oxidación, procedimientos de sonicación]). Los oligosacáridos pueden haberse dimensionado sustancialmente más [por ejemplo, por procedimientos conocidos de químicos o de oxidación]

Las estructuras de la mayoría de estos sacáridos son conocidas (y por lo tanto tienen de forma natural cualquier grupo amino o carboxilo para la química de carbodiimida o cualquier otro grupo reactivo que puede derivatizarse con

15 grupos amino o carboxilo (véase la tabla 1 dada a continuación).

Tabla 1 5

Grupo NH2 natural

Grupo COOH natural Otro grupo reactivo

S. aureus

PS5

No Sí OH

PS8

No Sí OH

N. meningitidis

MenA

No No OH

MenC

No Sí OH

MenW135

No Sí OH

MenY

No Sí OH

MenB

No (se puede generar si des-N-acetila) Sí OH / N-propilo

Estreptococos del grupo B

Ia, Ib

No Sí OH

II

No Sí OH

III

No Sí OH

IV

No Sí OH

V

No Sí OH

VI

No Sí OH

VII

No Sí OH

S. typhi

Vi

No Sí No

S. pneumoniae

PS1

Sí Sí OH

PS3, 4, 5, 8, 9, 12F

No Sí OH

Vibrio cholerae

Capsular saccharide

Sí No OH

H. influenzae B Hib

No No OH

LOS

Nmen/ Mcat/ Hi

Sí en PEA Sí en KDO OH

El vehículo proteico puede ser cualquier péptido o proteína. En una realización, es una proteína estafilocócica, opcionalmente seleccionada de las proteínas estafilocócicas que se enumeran a continuación. Puede comprender uno o más epítopos de linfocitos T colaboradores. En una realización de la invención, el vehículo proteico se selecciona del grupo que consiste en: TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, proteína D de H. influenzae, PhtD neumocócico y neumolisina neumocócica. La proteína vehículo puede ser el toxoide tetánico (TT), el fragmento C del toxoide tetánico, los mutantes no tóxicos de la toxina del tétanos [obsérvese que todas esas variantes de TT se considera que son el mismo tipo de proteína vehículo para los fines de esta invención], toxoide de la difteria (DT), CRM197, otros mutantes no tóxicos de la toxina de la difteria [tales como CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida y col., J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 y CRM107 otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleción o mutación de Glu-148 to Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 a Gly y otras mutaciones divulgadas en los documentos US 4709017 o US 4950740; mutación de al menos uno o más residuos Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones divulgadas en los documentos US 5917017 o US 6455673; o fragmento divulgado en el documento US 5843711] (obsérvese que todas estas variantes de DT se considera que son el mismo tipo de proteína transportadora para los fines de esta invención), neumolisina neumocócica (Kuo y col., (1995) Infect Immun 63; 2706-13), OMPC (proteína meningocócica de la membrana externa, generalmente extraída de N. meningitidis serogrupo B -EP0372501), péptidos sintéticos (documentos EP0378881, EP0427347), proteínas del choque térmico (documentos WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas de pertussis (documentos WO 98/58668, EP0471177), citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (documento WO 91/01146), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de linfocitos T CD4+ humanos de varios antígenos derivados de patógenos (Falugi y col., (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) tal como la proteína N19 (Baraldoi y col., (2004) Infect Immun 72; 4884-7) proteína de superficie neumocócica PspA (documento WO 02/091998), proteínas de absorción de hierro (documento WO 01/72337), toxina A o B de C. difficile (documento WO 00/61761), proteína D de H. influenzae (documentos EP594610 y WO 00/56360), PhtA neumocócica (documento WO 98/18930, también denominado Sp36), PhtD neumocócica (divulgada en el documento WO 00/37105, y también denominada Sp036D), PhtB neumocócica (divulgada en el documento WO 00/37105, y también denominada Sp036B), o PhtE (divulgada en el documento WO00/30299 y también denominada BVH-3).

El procedimiento de la invención incluye una etapa adicional de mezclar el conjugado de sacárido-proteína con un antígeno, por ejemplo un antígeno estafilocócico. Un antígeno estafilocócico puede elegirse de los antígenos que se describen a continuación, aunque esta lista no es exclusiva de otros antígenos derivados de estafilococos. En una realización, el antígeno estafilocócico es un sacárido, ácido teicoico o ácido lipoteicoico (LTA), cualquiera de los cuales está / están opcionalmente conjugado(s), opcionalmente utilizando un procedimiento de conjugación descrito en el presente documento. En una realización, el antígeno estafilocócico es una proteína, opcionalmente como se describe en el presente documento.

Sacáridos capsulares de S. aureus

En una realización, el procedimiento de la invención comprende la etapa de mezclar el conjugado de proteínasacárido de la invención con sacáridos capsulares de S. aureus (por ejemplo, los sacáridos capsulares de S. aureus de tipo 5 y / o de tipo 8). En una realización adicional, el procedimiento de la invención conjuga un sacárido capsular de S. aureus (por ejemplo, sacáridos capsulares de S. aureus de tipo 5 y / o de tipo 8) a una proteína para hacer un conjugado sacárido-proteína de acuerdo con la invención.

La mayoría de las cepas de S. aureus que causan infección en el ser humano contienen polisacáridos de tipo 5 o de tipo 8. Aproximadamente el 60 % de las cepas humanas son de tipo 8 y aproximadamente el 30 % son de tipo 5. Las estructuras de los antígenos polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 se describen en Moreau y col., Carbohydrate Res. 201; 285 (1990) y Fournier y col., Infect. Immun. 45; 87 (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad de repetición, así como ManNAcA, que se pueden usar para introducir un grupo sulfhidrilo.

Recientemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097 --1106 (2005)), la espectroscopia RMN revisó las estructuras de los polisacáridos capsulares a:

Tipo 5

→4)-â-D-ManNAcA’-(1 →4)-á-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-â-D-FucNAc-(1 →

Tipo 8

→3)-β-D-ManNAcA(40Ac)-(1 →3)-α-L-FucNAc(1 →3)-α-D-FucNAc(1 →

Los sacáridos se pueden extraer de la cepa adecuada de S. aureus usando un procedimiento bien conocido para el experto, por ejemplo como se describe en el documento US6294177. Por ejemplo, ATCC 12902 es una cepa de S. aureus de tipo 5 y ATCC 12605 es una cepa de S. aureus de tipo 8.

Los sacáridos son del tamaño nativo o, como alternativa, pueden dimensionarse mediante, por ejemplo, microfluidificacion, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. La invención también cubre los oligosacáridos derivados de los polisacáridos de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus.

El peso molecular promedio en peso del sacárido puede ser 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000400000, 75000-300000, o 100000-200000. El peso molecular o peso molecular promedio de un sacárido en el presente documento se refiere al peso molecular promedio en peso (Mw) del sacárido medido antes de la conjugación y se mide mediante MALLS. La técnica MALLS es bien conocida en la materia y se lleva a cabo típicamente como se describe en el ejemplo 2. Para el análisis MALLS de sacáridos, se pueden usar dos columnas (TSKG6000 y 5000PWxI) en combinación y los sacáridos se eluyen en agua. Los sacáridos se detectan usando un detector de dispersión de luz (por ejemplo, Wyatt amanecer DSP equipado con un láser de argón de 10 mW 1 a 488 nm) y un refractómetro inferométrico (por ejemplo, Wyatt Otilab DSP equipado con una célula P100 y un filtro rojo a 498nm). En una forma de realización, la polidispersidad del sacárido es 1-1.5, 1-1.3, 1-1.2, 1-1,1 o 1 a 1,05 y después de la conjugación a una proteína vehículo, la polidispersidad del conjugado es 1,0-2,5, 1,0-2,0. 1,0-1,5, 1,01,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 o 1,5-2,0. Todas las medidas de polidispersidad son mediante MALLS.

Los polisacáridos u oligosacáridos capsulares de tipo 5 y/o de tipo 8 incluidos en el proceso o la composición inmunógena de la invención están opcionalmente O-acetilados. En una realización, el grado de O-acetilación del polisacárido u oligosacárido capsular de tipo 5 es 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40-100 %, 50-100 %, 60-100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % u 80-90 %. En una realización, el grado de Oacetilación del polisacárido u oligosacárido capsular de tipo 8 es 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40-100 %, 50-100 %, 60-100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % u 80-90 %. En una realización, el grado de O-acetilación de los polisacáridos u oligosacáridos de tipo 5 y de tipo 8 es 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40100 %, 50-100 %, 60-100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % u 80-90 %. En una realización, los sacáridos capsulares de tipo 5 y / u 8 están O-acetilados.

El grado de O-acetilación del polisacárido u oligosacárido puede determinarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante RMN de protones (Lemercinier y Jones 1996, Carbohydrate Resarch 296; 8396, documentos WO 05/033148 o WO 00/56357).

Los grupos O-acetilo pueden eliminarse mediante hidrólisis, por ejemplo mediante el tratamiento con una base tal como hidrazina anhidra (Konadu y col., 1994; Infect. Immun. 62; 5048-5054) o tratamiento con NaOH 0,1 N durante 1-8 horas. Con el fin de mantener altos niveles de O-acetilación sobre el polisacárido u oligosacárido de tipo 5 y/u 8, los tratamientos que conducirían a la hidrólisis de los grupos O-acetilo se reducen al mínimo. Por ejemplo, el tratamiento en los extremos de pH se reduce al mínimo.

En una realización, los sacáridos estafilocócicos O-acetilados como se ha descrito anteriormente se conjugan usando la etapa de conjugación del procedimiento de la invención y se mezcla con un antígeno estafilocócico más en el procedimiento de la invención.

Poliglucosamina N-acetilada (PNAG)

En una realización, el procedimiento de la invención comprende la etapa de mezclar el conjugado de proteínasacárido de la invención con antígeno de poliglucosamina N-acetilada antígeno (PNAG).

PNAG es una adhesina polisacárida intercelular y está compuesta por un polímero de glucosamina unida por â-(1

→6) opcionalmente sustituida por constituyentes N-acetilo y O-succinilo. Este polisacárido está presente tanto en S. aureus como en S. epidermidis y se puede aislar de cualquier fuente (Joyce y col., 2003, Carbohydrate Research

338; 903; Maira-Litran y col., 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por ejemplo, PNAG se puede aislar de la cepa de S. aureus MN8m (documento WO 04/43407).

Recientemente se ha mostrado que el polisacárido conocido anteriormente como poli-N-succinil-â-(1 → 6)glucosamina (PNSG) no tiene la estructura prevista, ya que la identificación de la N-succinilación era incorrecta (Maira-Litran y col., 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por tanto, el polisacárido oficialmente conocido como PNSG y que actualmente se ha descubierto que es PNAG también entra dentro del término PNAG.

PNAG puede tener diferentes tamaños que varían desde más de 400 kDa a entre 75 y 400 kDa a entre 10 y 75 kDa a oligosacáridos compuestos por hasta 30 unidades de repetición (de glucosamina unida por sustituida opcionalmente por constituyentes de N-acetilo o de O-succinilo). Cualquier tamaño de polisacárido u oligosacáridos PNAG puede ser útil en una composición inmunogénica de la invención, por ejemplo un tamaño de más de 40 kDa. El tamaño se puede alcanzar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo mediante microfluidificación, irradiación ultrasónica o mediante escisión química (documentos WO 03/53462, EP497524, EP497525).

Los intervalos de tamaño de PNAG son, por ejemplo, 40-400kDa, 50-350kDa, 40-300kDa, 60-300kDa, 50-250kDa y 60-200kDa.

PNAG puede tener un grado de acetilación diferente debido a la sustitución sobre los grupos de amino con acetato. PNAG producida in vitro está casi completamente sustituida en los grupos amino (95 --100 %). Alternativamente, se puede utilizar una PNAG desacetilada que tiene menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % o 5 % `de N-acetilación. El uso de una PNAG desacetilada permite la destrucción opsónica de las bacterias Grampositivas, preferiblemente S. aureus y / o S. epidermidis (documento WO 04/43405). En una realización, la PNAG tiene un tamaño de entre 40 kDa y 300 kDa y está desacetilada de manera que menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % o 5 % de los grupos amino están N acetiladas.

En una realización, la PNAG no está O succinilada o está O-succinilada con menos de 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 o 0,1 % de los residuos.

El término PNAG desacetilada (dPNAG) hace referencia a un polisacárido u oligosacárido PNAG en el que menos del 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % o 5 % de los grupos amino están acetilados.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término PNAG engloba las formas tanto acetiladas y desacetiladas del sacárido.

En una realización, la PNAG se desacetila para formar dPNAG tratando químicamente el polisacárido nativo. Por ejemplo, la PNAG nativa se trata con una solución básica de modo que el pH aumenta por encima de 10. Por ejemplo, el PNAH e trata con NaOH , KOH o NH4OH 0,1 -5 M, 0,2 -4 M, 0,3 -3 M, 0,5 -2 M, 0,75 -1 -1,5 M o 1 M. El tratamiento se realiza durante al menos 10 o 30 minutos o 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 horas a una temperatura de 20100, 25-80, 30-60 o 30-50 o 35-45 °C. La dPNAG se puede preparar como se ha descrito en el documento WO 04/43405.

En una realización, el o los polisacáridos incluidos en el proceso de la invención están conjugados a una proteína vehículo como se describe más adelante o, como alternativa, no están conjugados.

Antígeno 336 de S. aureus

En una realización, el procedimiento de la invención comprende la etapa de mezclar el conjugado de proteínasacárido de la invención con el antígeno 336 de S. aureus (como se describe en el documento US6294177).

El antígeno 336 comprende hexosamina unida con â, no contiene grupos O-acetilo y específicamente se une a los anticuerpos a tipo 336 de S. aureus depositado en la ATCC con el número 55804.

En una realización, el antígeno 336 es un polisacárido que es de tamaño nativo o, como alternativa, pueden dimensionarse mediante, por ejemplo, microfluidificación, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. La invención también cubre los oligosacáridos derivados del antígeno 336.

El antígeno 336, cuando está incluido en el proceso de la invención están, preferentemente, conjugados a una proteína transportadora como se describe más adelante o, como alternativa, no están conjugados.

Las cepas ATCC-31432, SE-360 y SE-10 de S. epidermidis son características de tres tipos capsulares diferentes, I, II y III, respectivamente (Ichiman y Yoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229). Los polisacáridos capsulares extraídos de cada serotipo de S. epidermidis constituyen los polisacáridos de tipo I, II y III. Los polisacáridos se pueden extraer mediante varios procedimientos, incluyendo el procedimiento descrito en el documento US4197290 o como se describe en Ichiman y col., 1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176.

En una realización de la invención, el proceso comprende mezclar el conjugado sacárido-proteína con los polisacáridos u oligosacáridos de tipo I y/o II y/o III de S. epidermidis.

Los polisacáridos son del tamaño nativo o, como alternativa, pueden dimensionarse mediante, por ejemplo, microfluidificacion, irradiación ultrasónica o mediante escisión química. La invención también cubre los oligosacáridos extraídos de cepas de S. epidermidis.

Estos polisacáridos no están conjugados o, preferentemente, están conjugados como se describe en el presente documento.

Conjugación de polisacáridos

Entre los problemas asociados con el uso de polisacáridos en vacunación se encuentra el hecho de que los polisacáridos per se son malos inmunógenos. Estrategias que se han diseñado para superar esta falta de inmunogeneicidad incluyen la unión del polisacárido a vehículos proteicos grandes, que proporcionan ayuda por los linfocitos T inespecíficos. Se prefiere que los polisacáridos utilizados en la invención estén ligados a un vehículo proteico que proporcione ayuda por los linfocitos T inespecíficos. Ejemplos de tales vehículos que pueden usarse para acoplarse a inmunógenos polisacáridos u oligosacáridos incluyen los toxoides de la difteria y el tétanos (DT, DT Cm197 y TT), hemocianina de lapa californiana (KLH) y el derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD), la proteína D de Haemophilus influenzae, neumolisina o fragmentos de cualquiera de los anteriores. Fragmentos adecuados para usar incluyen fragmentos que abarcan los epítopos de linfocitos T colaboradores. En concreto, el fragmento de proteína D contiene, preferentemente, el 1/3 en el extremo N de la proteína. La proteína D es una proteína de unión a IgD de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610 B1).

Una proteína vehículo alternativa para utilizar en los procesos de la invención es una sola proteína estafilocócica o fragmento de la misma o una proteína de fusión que comprende al menos o exactamente 1, 2, 3 o 4 o más de las proteínas de estafilococos o fragmentos de las mismas citadas en la sección más adelante.

Una nueva proteína vehículo que sería particularmente ventajosa para usar en el contexto de una vacuna de estafilococos es el alfa toxoide de estafilococos. La forma nativa puede estar conjugada a un polisacárido, ya que el proceso de conjugación reduce la toxicidad. Preferentemente, una toxina alfa genéticamente destoxificada tal como las variantes His35Leu o His 35 Arg se usan como vehículos, ya que la toxicidad residual es menor. Como alternativa, la toxina alfa se destoxifica químicamente mediante tratamiento con un reactivo de reticulación, formaldehído o glutaraldehído. Una toxina alfa destoxificada genéticamente se destoxifica químicamente, preferentemente mediante tratamiento con un reactivo de reticulación, formaldehído o glutaraldehído, para reducir aún más la toxicidad.

Proteínas

El procedimiento de la invención comprende opcionalmente una etapa de mezclar el conjugado de proteína-sacárido de la invención con una proteína estafilocócica, por ejemplo una proteína de conjugado de S de la invención con una proteína estafilocócica, por ejemplo una proteína de S. aureus o S. epidermidis. Algunas realizaciones de la invención contienen proteínas tanto de S. aureus como de S. epidermidis.

En una realización independiente del procedimiento de la invención, una proteína estafilocócica se utiliza como el vehículo proteico al que el sacárido se conjuga en el procedimiento de la invención.

Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento de conjugación de un sacárido a un vehículo proteico estafilocócica usando el procedimiento de la reivindicación 1.

En una realización, los procedimientos de la invención usan una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, preferentemente identidad de al menos un 90 %, más preferentemente una identidad de al menos un 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos un 97 --99 % o exacta, con cualquier secuencia de la figura 1.

Cuando una proteína se menciona específicamente en el presente documento, opcionalmente es una referencia a una proteína de longitud completa, nativa o recombinante, u, opcionalmente, una proteína madura en la que se ha eliminado toda secuencia señal. La proteína se puede aislar directamente de la cepa de estafilococos o producirse mediante técnicas de ADN recombinante. Los fragmentos inmunogénicos de la proteína se pueden incorporar en la composición inmunogénica de la invención. Estos son fragmentos que comprenden al menos 10 aminoácidos, preferentemente 20 aminoácidos, más preferentemente 30 aminoácidos, más preferentemente 40 aminoácidos o 50 aminoácidos, lo más preferentemente 100 aminoácidos, tomados contiguos a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, dichos fragmentos inmunogénicos normalmente son inmunológicamente reactivos con los anticuerpos generados contra las proteínas de estafilococos o con los anticuerpos generados mediante la infección de un huésped mamífero con estafilococos o contienen epítopos de linfocitos T. Los fragmentos inmunogénicos también incluyen fragmentos que, cuando se administran a una dosis eficaz (solos o como un hapteno unido a un vehículo), producen una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por estafilococos, opcionalmente es protectora contra la infección por S. aureus y/o S. epidermidis. Dicho fragmento inmunógeno puede incluir, por ejemplo, la proteína que carece de una secuencia líder en N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje en C-terminal. En una realización, el fragmento inmunogénico de acuerdo con la invención comprende

sustancialmente todo el dominio extracelular de una proteína que tiene al menos 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad, con la de una secuencia seleccionada de la Figura 1 sobre toda la longitud de la secuencia de fragmento.

En una realización, los procedimientos de la invención pueden utilizar proteínas de fusión de proteínas estafilocócicas, o fragmentos de proteínas estafilocócicas. Dichas proteínas de fusión se pueden preparar de forma 5 recombinante y pueden comprender una porción de al menos 2, 3, 4, 5 o 6 proteínas de estafilococos. Como alternativa, una proteína de fusión puede comprender múltiples porciones de al menos 2, 3, 4 o 5 proteínas de estafilococos. Estas pueden combinar diferentes proteínas de estafilococos o fragmentos de las mismas en la misma proteína. Como alternativa, la invención también incluye proteínas de fusión individuales de proteínas de estafilococos o fragmentos de las mismas, como una proteína de fusión con secuencias heterólogas, tales como un 10 proveedor de epítopos de linfocitos T o marcadores de purificación, por ejemplo. â-galactosidasa, glutatión-Stransferasa, proteínas fluorescentes verdes (GFP), marcadores de epítopos tales como FLAG, myc tag, poli histidina

o proteínas de la superficie viral, tales como la hemaglutinina del virus de la gripe, o proteínas bacterianas, tales como el toxoide del tétanos, el toxoide diftérico, CRM197.

Proteínas

15 En una realización, los procedimientos de la invención usan una o más de las proteínas mencionadas a continuación. Muchas de las proteínas se dividen en las categorías de proteínas de unión de componente extracelular, proteínas vehículo o toxinas y los reguladores de la virulencia. Los procedimientos de la invención utilizan opcionalmente una proteína de unión de componente extracelular estafilocócico o una proteína transportadora estafilocócica o una toxina estafilocócica o regulador de la virulencia. Los procedimientos de la

20 invención utilizan opcionalmente al menos o exactamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 proteínas estafilocócicas.

En la tabla siguiente (tabla 2) se exponen los números de SEC ID de las secuencias proteicas y las secuencias de ADN que se encuentran en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente. SA indica una secuencia de S. aureus y SE indica una secuencia de S. epidermidis.

Tabla 2

Nombre

Secuencia de proteínas Secuencia de ADN

Transportador de ABC inmunodominante SA SE

SEC ID 1

SEC ID 34

SEC ID 2

SEC ID 35

Receptor de laminina SA SE

SEC ID 3

SEC ID 36

SEC ID 4

SEC ID 37

Antígeno secretor A SsaA SA 1 SA 2 SE

SEC ID 5

SEC ID 38

SEC ID 6

SEC ID 39

SEC ID 7

SEC ID 40

SitC SA

SEC ID 8

SEC ID 41

SE

SEC ID 9 SEC ID 42

saA / PisA (IssA) SA SE

SEC ID 10

SEC ID 43

SEC ID 11

SEC ID 44

EbhA / B SA EbhA SA EbhB SE EbhA SE EbhB

SEC ID 12

SEC ID 45

SEC ID 13

SEC ID 46

SEC ID 14

SEC ID 47

SEC ID 15

SEC ID 48

Por Aap asociado con acumulación SA SE

SEC ID 16

SEC ID 49

SEC ID 17

SEC ID 50

Proteína de activación de ARN III RAP SA SE

SEC ID 18

SEC ID 51

SEC ID 19

SEC ID 52

FIG / SdrG SA SE

SEC ID 20

SEC ID 53

SEC ID 21

SEC ID 54

Proteína de unión a elastina EbpS SA SE

SEC ID 22

SEC ID 55

SEC ID 23

SEC ID 56

Proteína extracelular EFB SA

SEC ID 24 SEC ID 57

Toxina alfa SA

SEC ID 25 SEC ID 58

SBI SA

SEC ID 26 SEC ID 59

IsdA SA

SEC ID 27 SEC ID 60

IsdB SA

SEC ID 28 SEC ID 61

SdrC SA

SEC ID 29 SEC ID 62

CIfA SA

SEC ID 30 SEC ID 63

FnbA SA

SEC ID 31 SEC ID 64

ClfB SA

SEC ID 32 SEC ID 65

Coagulasa SA

SEC ID 33 SEC ID 66

FnbB SA

SEC ID 67 SEC ID 77

MAP SA

SEC ID 68 SEQ ID 78

HarA SA

SEC ID 69 SEC ID 79

Autolisina glucosaminidasa SA

SEC ID 70 SEC ID 80

Autolisina amidasa SA

SEC ID 71 SEC ID 81

Fragmento Ebh SA

SEC ID 72 SEC ID 82

Autolisina Ant SA

SEC ID 73 SEC ID 83

SdrC SA

SEC ID 74 SEC ID 84

MRPII SA

SEC ID 75 SEC ID 85

SdrG SA

SEC ID 76 SEC ID 86

Proteínas de unión al componente extracelular

Las proteínas de unión al componente extracelular son proteínas que se unen a los componentes extracelulares del huésped. El término incluye, entre otros, adhesinas.

Ejemplos de proteínas de unión al componente extracelular incluyen el receptor de laminina (Naidu y col., J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177), la proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5801234, Wiltshire y Foster Infec. Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams y col., Infect. Immun. 2002, 70; 6805), EbhB, proteína de unión a la elastina (EbpS) (Park y col., 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347), SBI (Zhang y col., FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211), proteína A (pct/ep2006/069944), autolisina (Rupp y col., 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), ClfA (documento US6008341, McDevitt y col., Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC (documento WO 99/27109), SdrG (McCrea y col., Microbiology 2000, 146: 1535), SdrH (McCrea y col., Microbiology 2000, 146: 1535), Lipasa GehD (docment US2002/0169288). SasA (documento WO 06/121664, Mazmanian etal Molecular Microbiology 40 ; 1049, 2001 y documento WO 06/121664), FnbA (Flock y col., Mol Microbiol. 1994, 12; 599, documento US6054572), FnbB (documento WO 97/14799, Booth y col., 2001 Infec. Immun. 69; 345), proteína de unión al colágeno Cna (Visai y col., 2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng y col., 1988 J. Gen Microbiol.134; 75), Npase (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA (Lonenz y col., FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang y col., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain y Hermann symposium on Staph Denmark 14 – 17ª 2000), SasH Robertson y col., Antimicrobial agents and chemotherapy 47; 3926, 2003), SSP-1 (Veenstra y col., 1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP2 (Veenstra y col., 1996, J. Bacteriol. 178; 537), proteína de unión a la heparina de 17 kDa HBP (Fallgren y col., 2001, J. Med. Microbiol. 50; 547), proteína de unión a la vitronectina (Li y col., 2001, Curr. Microbiol. 42; 361), proteína de unión al fibrinógeno, coagulasa, Fig (documento WO 97/48727) y MAP (documento US5648240).

Proteína de unión a Sitc/MntC/saliva

Esta es una proteína transportadora de ABC que es un homólogo de la adhesina PsaA en S. pneumoniae. Es una lipoproteína de 32 kDa altamente inmunogénica que está distribuida por la pared celular bacteriana (Cockayne y col., Infect. Immun. 1998 66; 3767). Se expresa en S. aureus y S. epidermidis como lipoproteína de 32 kDa y está presente un homólogo de 40 kDa en S. hominis. En S. epidermidis, es un componente de un operón regulado por hierro. Muestra una homología considerable con ambas adhesinas, incluyendo FimA de Streptococcus parasanguis, y con lipoproteínas de una familia de transportadores de ABC con funciones de transporte de hierro metálico probado o putativo. Por tanto, SitC está incluido como una proteína de unión extracelular y como transportador de iones metálicos.

La proteína de unión a saliva divulgada en el documento US5.801.234 también es una forma de SitC y se puede incluir en una composición inmunogénica de la invención.

ClfA y ClfB

Estas dos proteínas tienen actividad de unión a fibrinógeno y desencadena que S. aureus forme grumos en presencia de plasma. Contienen un motivo LPXTG a las proteínas asociadas con la pared.

ClfA se describe en el documento US6008341 y ClfB se describe en el documento WO 99/27109.

Coagulasa (FbpA)

Esta es una proteína de unión al fibrinógeno que desencadena que S. aureus forme grumos en presencia de plasma. Se describe en las referencias relacionadas con la coagulasa: Phonimdaeng y col., (J. Gen. Microbio. 1988,

134:75 --83), Phonimdaeng y col., (Mol Microbiol 1990; 4:393 --404), Cheung y col., (Infect Immun 1995: 63:19141920) y Shopsin y col., (J. CLin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456).

Fragmentos preferidos para la inclusión en la composición inmunogénica de la invención incluyen la proteína madura en la que el péptido señal se ha eliminado (los aminoácidos 27 al extremo C).

La coagulasa tiene tres dominios distintos. Los aminoácidos 59 – -297, que es una región de hélice superenrollada, los aminoácidos 326 – -505, que es una región rica en prolina y glicina, y el domino en el extremo C desde el aminoácido 506 al 645, que tiene una conformación en lámina beta. Cada uno de estos dominios es un fragmento que se puede incorporar en la composición inmunogénica de la invención.

SdrG

Esta proteína se describe en el documento WO 00/12689. SdrG se encuentra en los estafilococos negativos a la coagulasa y es una proteína asociada a la pared celular que contiene una secuencia LPXTG.

SdrG contiene un péptido señal (aminoácidos 1 --51), una región que contiene sitios de unión a fibrinógeno y sitios de unión a colágeno (aminoácidos 627 --698 y 738 --809), una región de repetición SD (aminoácidos825 --1000) y un dominio de anclaje (aminoácidos 1009 --1056).

Los fragmentos preferidos de SdrG incluyen los polipéptidos en los que el péptido señal y/o las repeticiones SD y el dominio de anclaje se han eliminado. Estos incluyen polipéptidos que comprenden o consisten en los aminoácidos 50 --825, los aminoácidos 50 --633, los aminoácidos 50 – -597 (SEC ID Nº 2 del documento WO 03/76470), los aminoácidos 273 --597 (SEC ID Nº 4 del documento WO 03/76470), los aminoácidos 273 --577 (SEC ID Nº 6 del documento WO 03/76470), los aminoácidos 1 --549, los aminoácidos 219 --549, los aminoácidos 225 --549, los aminoácidos 219 --528, los aminoácidos 225 --528 de SEC ID Nº 70 o 20 o 21.

Preferentemente, un polipéptido SdrG que tiene una secuencia con una homología de al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la secuencia SEC ID Nº 70, 20 o 21 se incorpora en la composición inmunogénica de la invención.

Las composiciones de la invención comprenden, opcionalmente, un fragmento de los polipéptidos SdrG descritos anteriormente.

En una realización, los fragmentos preferidos tienen el péptido señal y/o el dominio de repetición SD y/o el dominio de anclaje delecionado. Por ejemplo, las secuencias correspondientes a los aminoácidos 1-713, 1-549, 225-549, 225-529, 24-717, 1-707, 1-690, 1-680, 1-670, 1-660, 1-650, 1-640, 1-630, 1-620, 1-610, 1-600, 34-707, 44-697, 36689 de SEC ID 70 o secuencias que tienen una identidad del 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la SEC ID 70 o 20 o 21.

En una realización, los fragmentos con el péptido señal delecionado tienen un residuo de metionina en el extremo N del fragmento para garantizar la traducción correcta.

En una realización, el fragmento tiene la secuencia siguiente:

EbhA y EbhB

EbhA y EbhB son proteínas que se expresan en S. aureus y S. epidermidis (Clarke y Foster Infect. Immun. 2002, 70; 6680 , Williams y col., Infect. Immun. 2002, 20; 6805) y que se unen a la fibronectina. Dado que la fibronectina es un componente importante de la matriz extracelular, EbhA y EbhB tienen una función importante en la adhesión de los estafilococos a la matriz extracelular del huésped.

Las proteínas Ebh son grandes y tienen un peso molecular de 1,1 megadalton. Supone una ventaja usar un fragmento de la proteína Ebh en lugar de la secuencia completa debido a la facilidad de producción y formulación. La región central de la proteína contiene repeticiones imperfectas que contienen sitios de unión a la fibronectina. Los fragmentos que contienen uno o más de los dominios de repetición descritos más adelante son fragmentos preferidos para incorporar en la composición inmunogénica de la invención.

Las proteínas Ebh contienen unidades de repetición imperfectas de 127 aminoácidos de longitud que se caracterizan porque contienen la secuencia consenso:

L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A o .{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A.{12} o

Donde '.' significa cualquier aminoácido y '.{10}' significa 10 aminoácidos cualesquiera y I/V indica elecciones alternativas de aminoácidos.

Mediante referencia a la secuencia divulgada en Kuroda y col., (2001) Lancet 357; 1225 --1240, y la Tabla 3, las secuencias de repetición dentro de las proteínas Ebh se deducen fácilmente.

10 En una realización, los fragmentos a incluir en la composición inmunogénica de la invención incluyen proteínas que contienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de 10 de las 127 unidades de repetición de aminoácidos. Dichos fragmentos pueden consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones de la región de repetición de 127 aminoácidos o puede consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones con residuos de aminoácidos adicionales presentes en cualquiera o ambos extremos del fragmentos. Opcionalmente, el fragmento

15 adicional es el polipéptido H2 de aproximadamente 44kDa que abarcan tres repeticiones (3202 – -3595 aminoácidos) como se describe en Clarke y col., Infection and Immunity 70, 6680 --6687, 2002. Dichos fragmentos podrán, preferentemente, unirse a fibronectina y/o provocar anticuerpos que son reactivos contra la proteína Ebh entera.

Las proteínas Ebh son capaces de unirse a la fibronectina. Los fragmentos preferidos de estas secuencias

20 polipeptídicas conservan la capacidad para unirse a la fibronectina. La unión a la fibronectina se puede evaluar mediante ELISA, como describen Clarke y col., (Infection and Immunity 70; 6680 --6687 2002).

En una realización, el fragmento es uno que comprende un epítopo para linfocitos B o linfocitos T, por ejemplo los fragmentos/péptidos descritos en las Tablas 4 y 5.

TABLA 3. Secuencias de repetición en la secuencia de longitud completa de Ebh.

25 La secuencia completa de Ebh se divulga en Kuroda y col., (2001) Lancet 357; 1225 --1240. La siguiente tabla muestra los residuos de aminoácidos en los que las repeticiones de 127 aminoácidos comienzan y terminan dentro de la secuencia de longitud completa.

Tabla 4. Predicción del epítopo de los linfocitos B para una repetición de 127 aminoácidos:

Comienzo

Fin

1

3204 3330

2

3331 3457

3

3457 3583

4

3583 3709

5

3709 3835

6

3835 3961

7

3961 4087

8

4200 4326

9

4326 4452

10

4452 4578

11

4578 4704

12

4704 4830

13

4830 4956

14

4956 5082

15

5082 5208

16

5208 5334

17

5334 5460

18

5460 5586

19

5585 5711

20

5711 5837

21

5837 5963

22

5963 6089

23

6089 6215

24

6215 6341

25

6341 6467

26

6467 6593

27

6593 6719

28

6719 6845

29

6845 6971

30

6971 7097

31

7097 7223

32

7223 7349

33

7349 7475

34

7475 7601

35

7601 7727

36

7727 7853

37

7852 7978

38

7978 8104

39

8104 8230

40

8230 8356

41

8356 8482

42

8482 8608

43

8604 8730

44

8858 8984

La secuencia de longitud completa se divulga en Kuroda y col., (2001) Lancet 357; 1225 --1240. Una de estas repeticiones, codificada por los aminoácidos 3204 -3331 de la secuencia de longitud completa se eligió para llevar a cabo una predicción de epítopo:

Tabla 5-Predicción de epítopos de linfocitos T colaboradores en Ebh:

Comienzo

Fin Secuencia del epítopo Inicio Terminación

5

10 TVNQKA 3208 3213

14

19 KSTKDA 3217 3222

21

33 DGQQNLQRAKTEA 3224 3236

42

51 DLNQAQKNAL 3245 3254

66

74 DIKQTTQSL 3269 3277

100

112 ADTNKKNDYNNAY 3303 3315

117

123 DIINGNA 3320 3326

Las columnas “Comienzo" y "Fin" presentan la posición de los epítopos de linfocitos B predichos en la repetición de 127 aminoácidos Las columnas “Inicio" y "Terminación" presentan la posición de los epítopos de linfocitos B predichos en la secuencia de longitud completa de Ebh

La secuencia de longitud completa se divulga en la base de datos TrEMBL, referencia de la secuencia Q8NWQ6. Una de estas repeticiones, codificada por los aminoácidos 3204 --3331 de la secuencia de longitud completa se eligió para llevar a cabo una predicción del epítopo:

Posición de la repetición

Secuencia del epítopo Posición de la secuencia

1

MDVNTVNQK 3204

3

VNTVNQKAA 3206

6

VNQKAASVK 3209

26

LQRAKTEAT 3229

37

ITHASDLNQ 3240

43

LNQAQKNAL 3246

51

LTQQVNSAQ 3254

55

VNSAQNVHA 3258

61

VHAVNDIKQ 3264

64

VNDIKQTTQ 3267

67

IKQTTQSLN 3270

74

LNTAMTGLK 3277

78

MTGLKRGVA 3281

81

LKRGVANHN 3284

85

VANHNQVVQ 3288

91

WQSDNYVN 3294

92

VQSDNYVNA 3295

97

YVNADTNKK 3301

98

VNADTNKKN 3302

108

YNNAYNHAN 3311

112

YNHANDIIN 3315

118

IINGNAQHP 3321

119

INGNAQHPV 3322

-La columna “Posición de la repetición" presenta la posición de los epítopos de linfocitos T predichos en la repetición La columna “Posición de la secuencia" presenta la posición de los epítopos de linfocitos T predichos en la secuencia de longitud completa de Ebh

Los fragmentos de las proteínas de la invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis peptídica; por tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermedios para la producción de las proteínas de longitud completa de la invención.

5 En una realización se usan variantes en las que varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 o 1 aminoácidos se sustituyen, eliminan, o añaden en cualquier combinación.

Proteína de unión a elastina (EbpS)

EbpS es una proteína que contiene 486 aminoácidos con un peso molecular de 83 kDa. Se asocia con la membrana citoplásmica de S. aureus y tiene tres regiones hidrófobas que mantienen a la proteína en la membrana (Downer y

10 col., 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Park y col., 1996, J. Biol. Chem. 271; 15803).

Dos regiones entre los aminoácidos 1 --205 y 343 --486 se exponen en la superficie en la cara externa de la membrana citoplasmática. El dominio de unión al ligando de EbpS se localiza entre los residuos 14 --34 en el extremo N (Park y col., 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845).

En una realización, el fragmento a incorporar en la composición inmunogénica de la invención es el fragmento

15 expuesto en la membrana que contiene la región de unión a elastina (aminoácidos 1 --205). Opcionalmente, los fragmentos no contienen el bucle entero expuesto pero deberían contener la región de unión a elastina (aminoácidos 14 --34). Un fragmento alternativo que podría usarse consiste en aminoácidos que forman el segundo bucle expuesto en la superficie (aminoácidos 343 --486). Los fragmentos alternativos que contienen hasta 1, 2, 5, 10, 20, 50 aminoácidos menos en uno o los dos extremos también son posibles.

20 Receptores de laminina

El receptor de laminina de S. aureus desempeña un importante papel en la patogeneicidad. Un rasgo característico de la infección es la invasión de la corriente sanguínea que permite la extendida formación de abscesos metastásicos. La invasión de la corriente sanguínea requiere la capacidad para extravasarse a través de la membrana basal vascular. Esto se consigue mediante la unión a la laminina a través del receptor de la laminina

25 (Lopes y col., Science 1985, 229; 275).

Los receptores de laminina se exponen en la superficie y están presentes en muchas cepas de estafilococos, incluidos S. aureus y S. epidermidis.

SBI

Sbi es una segunda proteína de unión a IgG, además de la proteína A, y se expresa en la mayoría de las cepas de

S. aureus (Zhang y col., 1998, Microbiology 144; 985).

El extremo N de la secuencia de Sbi tiene una secuencia señal típica con un sitio de escisión tras el aminoácido 29. Por tanto, un fragmento de Sbi que pudiera usarse en una composición inmunogénica de la invención comienza en el residuo de aminoácidos 30, 31, 32 o 33 y sigue al extremo C de Sbi, por ejemplo de SEC ID Nº 26.

El dominio de unión a IgG de Sbi se ha identificado como una región hacia el extremo N de la proteína desde lis aminoácidos 41 --92. Este dominio es homólogo a los dominios de unión a IgG de la proteína A.

El dominio de unión a IgG de Sbi contiene la secuencia siguiente:

* -indica los aminoácidos que son similares entre dominios de unión a IgG

En una realización, un fragmento de Sbi a incluir en la composición inmunogénica de la invención contiene un dominio de unión a IgG. Este fragmento contiene la secuencia consenso para un dominio de unión a IgG como se designa con *, como se muestra en la secuencia anterior. Opcionalmente, el fragmento contiene o consiste en la secuencia completa mostrada anteriormente. Opcionalmente, el fragmento contiene o consiste en los aminoácidos 30-92, 33-92, 30-94, 33-94, 30-146, 33-146, 30-150, 33-150, 30-160, 33-160, 33-170, 33-180, 33-190, 33-200, 33205 o 33-210 de Sbi, por ejemplo de SEC ID Nº 26.

Un fragmento puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones de aminoácidos de las secuencias indicadas.

Fragmentos pueden contener múltiples repeticiones (2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 o 10) del dominio de unión a IgG.

EFB -FIB

Fib es una proteína de unión a fibrinógeno de 19kDa que S. aureus secreta al medio extracelular. Es producida por todos los aislados de S. aureus analizados (Wastfelt y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347).

S. aureus se agrupa en presencia de fibrinógeno y se une a las superficies recubiertas con fibrinógeno. Esta capacidad facilita la colonización por estafilococos de los catéteres y células endoteliales.

Fib contiene una secuencia señal en el extremo N de la proteína con un supuesto sitio de escisión aproximadamente en el aminoácido 30. En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende o consiste en la secuencia de la proteína madura (desde aproximadamente el aminoácido 30 al extremo C de la proteína).

Fbe -EfB/FIG

Fbe es una proteína de unión a fibrinógeno que se encuentra en muchos aislados de S. epidermidis y tiene un peso molecular deducido de 119 kDa (Nilsson y col., 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Su secuencia está relacionada con la del factor de agrupamiento de S. aureus (ClfA). Los anticuerpos contra Fbe pueden bloquear la unión de S. epidermidis a placas revestidas con fibrinógeno y a catéteres (Pei y Flock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52).

Fbe tiene una secuencia señal putativa con un sitio de escisión entre los aminoácidos 51 y 52. Por tanto, un fragmento preferido de Fbe contiene la forma madura de Fbe que se extiende desde el aminoácido 52 al extremo C (aminoácido 1.092).

El dominio de Fbe desde el aminoácido 52 al aminoácido 825 es responsable de la unión al fibrinógeno. En una realización, el fragmento de Fbe consiste en o contiene los aminoácidos 52 -825.

La región entre los aminoácidos 373 y 516 de Feb muestra la mayor conservación entre Fbe y ClfA. En una realización, el fragmento contiene los aminoácidos 373 -516 de Fbe.

Los aminoácidos 825 1041 de Fbe contienen una región altamente repetitiva compuesta por residuos de ácido aspártico y serina repetidos en tándem.

IsaA/PisA

IsaA es una proteína de 29 kDa, también conocida como PisA, que se ha demostrado que es una proteína estafilocócica inmunodominante durante la sepsis en pacientes hospitalizados (Lorenz y col., 2000, FEMS Immunol. Med. Microb. 29; 145).

Se piensa que los primeros 29 aminoácidos de la secuencia de IsaA son una secuencia señal. En una realización, el fragmento de IsaA que se va a incluir en una composición inmunogénica de la invención contiene los residuos de aminoácidos desde el 30 hacia adelante, hasta el final de la secuencia codificada.

Proteína de unión a fibronectina

La proteína A de unión a fibronectina contiene varios dominios que están implicados en la unión a fibronectina (documento WO 94/18327). Estos se denominan D1, D2, D3 y D4. En una realización, los fragmentos de la proteína A o B de unión a fibronectina comprenden o consisten en D1, D2, D3, D4, D1-D2, D2-D3, D3-D4, D1-D3, D2-D4 o D1-D4.

La proteína de unión a fibronectina contiene una secuencia señal de 36 aminoácidos. Por ejemplo:

VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA

Opcionalmente, la proteína madura sin esta secuencia señal está incluida en la composición inmunogénica de la invención.

Proteínas transportadoras

La pared celular de las bacterias grampositivas actúa como barrera que previene la difusión libre de metabolitos al interior de la bacteria. Una familia de proteínas orquesta el paso de nutrientes esenciales a la bacteria y, por tanto, son esenciales para la viabilidad de la bacteria. La expresión proteína transportadora cubre las proteínas implicadas en la etapa inicial de unión a metabolitos, tales como hierro, así como los implicados en el transporte real del metabolito al interior de la bacteria.

El hierro molecular es un cofactor esencial para el crecimiento bacteriano. Se secretan sideróforos que se unen al hierro libre y después son capturados por receptores de la superficie bacteriana que liberan hierro para su transporte a través de la membrana citoplasmática. La adquisición de hierro es crítica para el establecimiento de infecciones humanas, de modo que la generación de una respuesta inmunitaria contra esta clase de proteínas conduce a una pérdida de la viabilidad de los estafilococos.

Ejemplos de proteínas transportadoras incluyen el transportador de ABC inmunodominante (Burnie y col., 2000 Infect. Imun. 68; 3200), IsdA (Mazmanian y col., 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian y col., 2002 PNAS 99; 2293, documento WO 05/09378), IsdC (WO 06/59247),-IsdH/HarA (Pilpa y col., 2006, J. Mol. Biol. 360; 435; documento WO 05/09379), transportador de Mg2+, SitC (Wiltshire y Foster 2001 Infect. Immun. 69; 5198) y transportador de Ni ABC.

Transportador de ABC inmunodominante

El transportador de ABC inmunodominante es una proteína bien conservada que puede ser capaz de generar una respuesta inmunitaria que ofrece protección cruzada contra diferentes cepas de estafilococos (Mei y col., 1997, Mol. Microbiol. 26; 399). Los anticuerpos contra esta proteína se han hallado en pacientes con septicemia (Burnie y col., 2000, Infect. Immun. 68; 3200).

Los fragmentos opcionales del transportador de ABC inmunodominante incluirán los péptidos DRHFLN, GNYD, RRYPF, KTTLLK, GVTTSLS, VDWLR, RGFL, más preferentemente KIKVYVGNYDFWYQS, TVIVVSHDRHFLYNNV y/o TETFLRGFLGRMLFS, ya que estas secuencias contienen epítopos que son reconocidos por el sistema inmunológico humano.

IsdA-IsdB

Los genes isd (determinante de la superficie regulador por hierro) de S. aureus codifican proteínas responsables de la unión a hemoglobina y el paso del hierro hemo al citoplasma, donde actúa como nutriente esencial. IsdA e IsdB se localizan en la pared celular de los estafilococos. Parece que IsdA está expuesta sobre la superficie de la bacteria, ya que es susceptible a la digestión con proteinasa K. ISDb se digirió parcialmente, lo que sugiere que está parcialmente expuesta sobre la superficie de la bacteria (Mazmanian y col., 2003 Science 299; 906).

IsdA e IsdB son ambas proteínas de 29 kDa que se unen al grupo hemo. Su expresión está regulada por la disponibilidad del hierro a través del represor Fur. Su expresión será alta durante la infección en un huésped n el que la concentración será baja.

También se conocen como FrpA yFrpB (Morrissey y col., 2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA y FrpB son las proteínas de superficie principales con una carga elevada. Se ha demostrado que proporcionan una contribución fundamental a la adhesión a plástico.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende un fragmento de IsdA y/o IsdB que se describe en el documento WO 01/98499 o el documento WO 03/11899.

HarA

HarA es otra proteína regulada por hierro. Contiene un péptido señal de los aminoácidos 1-40. Opcionalmente, la presente Hara en las composiciones inmunogénicas de la invención omite el péptido señal.

HarA contiene tres dominios NEAT desde el aminoácido 101-232, desde el aminoácido 341-471 y desde el aminoácido 539 a 664. Por ejemplo, un fragmento de HarA comprende o consiste en los aminoácidos 101-232, 101471, 101-664, 341-471. 341-664 o 539-664, , opcionalmente de la secuencia de SEC ID Nº 69.

Hara contiene un dominio de anclaje Gram plus: desde aa 853 a aa 892. Opcionalmente, un fragmento de Hara omite este dominio.

longitud del péptido de señal: 40 aminoácidos, subrayados en la primera fila de la secuencia de dominios NEAT, tres regiones internas subrayadas.

Gram + dominio de anclaje – región subrayada región en la línea inferior de la secuencia.

Toxinas y reguladores de la virulencia

Los miembros de esta familia de proteínas incluyen toxinas, tales como la toxina alfa, hemolisina, enterotoxina B, Panton Valentine Leucocidin (VPL) (Morinaga y col., Microbiol. Immunol. 47; 81-90, 2003) y TSST-1, así como las proteínas que regulan la producción de toxinas, tales como RAP.

Toxina alfa (Hla)

La toxina alfa es un determinante importante de la virulencia producida por la mayoría de las cepas de S. aureus. Es una toxina formadora de poros con actividad hemolítica. Se ha demostrado que los anticuerpos contra la toxina alfa neutralizan los efectos perjudiciales y letales de la toxina alfa en modelos animales (Adlam y col., 1977 Infect. Immun. 17; 250). Las plaquetas humanas, las células endoteliales y las células mononucleares son susceptibles a los efectos de la toxina alfa.

La elevada toxicidad de la toxina alfa requiere que se destoxifique antes de usar como inmunógeno. Esto se puede conseguir mediante tratamiento químico, por ejemplo tratando con formaldehído, glutaraldehído de otros reactivos de reticulación o mediante conjugación química a los polisacáridos bacterianos, como se describe más adelante.

Un modo adicional de eliminar la toxicidad es introducir mutaciones puntuales que eliminen la toxicidad al tiempo que conservan la antigeneicidad de la toxina. La introducción de una mutación puntual en el aminoácido 35 de la toxina alfa, en la que se sustituye un residuo de histidina por un residuo de leucina, tiene como resultado la eliminación de la toxicidad al tiempo que se conserva la inmunogeneicidad (Menzies y Kernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). La histidina 35 parece ser crítica para la adecuada oligomerización requerida para la formación de poros y la mutación de este residuo conduce a pérdida de toxicidad.

Cuando se incorpora en las composiciones inmunogénicas de la invención, la toxina alfa está opcionalmente destoxificadas por mutación de His 35, por ejemplo mediante la sustitución de His 35 por Leu o Arg. En una realización alternativa, la toxina alfa se destoxifica mediante conjugación a otros componentes de la composición inmunogénica, por ejemplo polisacáridos capsulares o PNAG, lo más preferiblemente al polisacárido de tipo 5 de S. aureus y/o el polisacárido y / o PNAG de S. aureus de tipo 8

Proteína de activación de ARN III (RAP)

La RAP no es en sí misma una toxina, sino un regulador de la expresión de factores de virulencia. La RAP es producida y secretada por estafilococos. Activa el sistema regulador de agr de otros estafilococos y activa la expresión y la posterior liberación de factores de virulencia, tales como hemolisina, enterotoxina B y TSST-1.

Otras proteínas inmunodominantes

Proteína asociada con la acumulación (Aap)

La Aap es una proteína de 140 kDa que es esencial para la acumulación de cepas de S. epidermidis sobre las superficies (Hussain y col., Infect. Immun. 1997, 65; 519). Las cepas que expresan esta proteína produjeron cantidades significativamente más grandes de biopelículas y la Aap parece estar implicada en la formación de biopelículas. Los anticuerpos contra la Aap son capaces de inhibir la formación de biopelículas y de inhibir la acumulación de S. epidermidis. Las secuencias que se podrían añadir a una vacuna se divulgan en el documento WO 05/86663.

Antígeno secretor estafilocócico SsaA

El SsaA es una proteína fuertemente inmunogénica de 30 kDa hallada tanto en S. aureus como en S. epidermidis (Lang y col., 2000 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29; 213). Su expresión durante la endocarditis sugirió un papel de virulencia específico de la patogenia de la enfermedad infecciosa.

SsaA contiene una secuencia líder en el extremo N y un sitio de escisión para la peptidasa señal. Al péptido líder le sigue una región hidrofílica de aproximadamente 100 aminoácidos, desde el residuo 30 al residuo 130.

Un fragmento opcional de SsaA a incorporar en la composición inmunogénica de la invención está formado por la proteína madura (los aminoácidos 27 al extremo C o los aminoácidos 30 al extremo C).

Fragmentos opcionales adicionales contienen el área hidrofílica de SsaA desde el aminoácido 30 al aminoácido 130. Otras secuencias y fragmentos opcionales se divulgan en el documento WO 05/115113.

Proteína de unión a penicilina 4

Proteína de unión a penicilina 4 se describe en Henze y col., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38: 2415, 1995 y el documento WO 06/33918.

Combinaciones preferidas

Las infecciones por estafilococos progresan por diferentes estadios. Por ejemplo, el ciclo de vida de los estafilococos implica colonización de comensales, inicio de infección mediante el acceso a los tejidos adyacentes o la circulación sanguínea, multiplicación anaerobia en la sangre, interacción entre los determinantes de la virulencia de S. aureus y los mecanismos de defensa del huésped e inducción de complicaciones, incluyendo endocarditis, formación de abscesos metastásicos y síndrome séptico. Diferentes moléculas sobre la superficie de las bacterias estarán implicadas en diferentes etapas del ciclo de infección. Al dirigir la respuesta inmunitaria contra una cantidad eficaz una combinación de antígenos concretos implicados en diferentes procesos de infección por estafilococos, afecta a varios aspectos de la función estafilocócica, lo que puede dar lugar a una buena eficacia de la vacuna.

En particular, combinaciones de determinados antígenos de diferentes clases, algunos de los cuales están implicados en la adhesión a células huésped, algunas de las cuales están implicadas en la adquisición de hierro u otras funciones de transporte, algunas de las cuales son toxinas o reguladores de la virulencia y antígenos inmunodominantes pueden producir una respuesta inmunitaria que proteja contra múltiples estadios de infección.

Algunas combinaciones de antígenos son particularmente eficaces en la inducción de una respuesta inmunitaria. Se puede medir en ensayos de modelos animales como se ha descrito en los ejemplos y/o el uso de un ensayo opsonofagocítico como se describe en los ejemplos. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que tales combinaciones eficaces de antígenos sean activado por una serie de características de la respuesta inmunitaria a la combinación antigénica. Los antígenos mismos generalmente están expuestos en la superficie de las células estafilocócicas, tienden a ser conservados, y también tienden a no estar presentes en cantidad suficiente en la superficie celular para una respuesta bactericida óptima a tener lugar utilizando anticuerpos generados contra el antígeno solo. La combinación de los antígenos de la invención puede dar lugar a una formulación que provocar una combinación ventajosa de anticuerpos que interaccionan con la célula estafilocócica más allá de un umbral crítico. A este nivel crítico, anticuerpos suficientes de suficiente calidad se unen a la superficie de la bacteria para permitir ya sea una destrucción eficiente por el complemento o al neutralización de la bacteria. Esto se puede medir en un modelo de exposición animal o un ensayo de opsonización como se describe en los ejemplos.

En una realización, los procesos de la invención mezclan una pluralidad de proteínas seleccionadas de al menos dos categorías diferentes de proteínas que tienen diferentes funciones en los estafilococos. Ejemplos de dichas categorías de proteínas son las proteínas de unión extracelular, proteínas transportadoras tales como proteínas de adquisición de Fe, toxinas o reguladores de la virulencia y otras proteínas inmunodominantes, de modo que se prepara una composición inmunogénica de la invención.

En una realización, el proceso o la composición inmunogénica de la invención comprende/usa adicionalmente una serie de proteínas igual o más de 2, 3, 4, 5 o 6 seleccionadas de 2 o 3 de los diferentes grupos siguientes:

• Grupo a) proteínas de unión al componente extracelular;

•

grupo b) proteínas transportadoras;

•

grupo c) toxinas o reguladores de la virulencia.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende además una serie de proteínas igual o más de 2, 3, 4, 5 o 6 seleccionadas de 2 o 3 de los grupos siguientes:

•

Grupo a) al menos una proteína de unión al componente extracelular de estafilococos o fragmento inmunogénico del mismo, seleccionada del grupo que consiste en el receptor de laminina, la proteína de unión a SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteínas de unión a elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, ClfA, SdrC, sDECE, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, SasH, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de unión a vitronectina, proteína de unión a fibrinógeno, coagulasa, Fig y MAP;

•

Grupo b) al menos una proteína transportadora de estafilococos o fragmento del mismo seleccionada del grupo que consiste en el transportadores de ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportador de Mg2+ de de IsdH/HarA , SitC y transportador de Ni ABC;

•

Grupo c) al menos un regulador estafilocócico de la virulencia, toxina o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste en la toxina alfa (Hia), mutante H35R de toxina alfa, proteína activadora de ARN III (RAP).

•

Grupo d) -al menos una proteína estructural estafilocócica o un fragmento inmunogénico de la misma seleccionados del grupo que consiste en MRPII y autolisina.

Estas composiciones inmunogénicas particulares pueden incluir al menos un sacárido por estafilococos y / o proteína como parte del conjugado de proteína-sacárido de la invención y al menos un antígeno de estafilococo que no forma parte del conjugado de proteína-sacárido de la invención con el fin de completar la combinación.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención contiene al menos una proteína seleccionada del grupo a) y una proteína adicional seleccionada del grupo b) y/o del grupo c).

En una realización adicional, la composición inmunogénica de la invención contiene al menos un antígeno seleccionado del grupo b) y una proteína adicional seleccionada del grupo c) y/o del grupo a).

En una realización adicional, la composición inmunogénica de la invención contiene al menos un antígeno seleccionado del grupo c) y una proteína adicional seleccionada del grupo a) y/o del grupo b).

En una realización adicional, el proceso de la invención implica la adición de cualquiera de las proteínas estafilocócicas enumeradas en los documentos WO 02/59148, WO 05/09378, WO 05/09379, WO 05/86663, WO 05/115113, WO 06/33918, WO 06/78680, WO 06/121664, WO 07/01361, WO 02/94868, US6380370, WO 04/87746, WO 01/98499 o WO 03/11899.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende una dosis de cada conjugado de sacárido entre 0,1 y 20 microgramos, 2 y 10 g, 2 y 6 g o 4 y 7g de sacárido por dosis administrada. En una realización, el procedimiento de la invención se mezcla entre 0,1 y 20 microgramos, 2 y 10 μg, 2 y 6 μg o 4 y 7 μg de cada sacárido.

“Alrededor de” o “aproximadamente” se definen con dentro de un 10 % más o menos de la cifra dada para los fines de la invención.

En una realización, la composición inmunogénica de la invención se ajusta a o se tampona a, o ajustado a, pH entre 7,0 y 8,0, pH 7,2 y 7,6 o alrededor de o exactamente pH 7,4

La composición inmunogénica o vacunas de la invención están opcionalmente liofilizadas en presencia de un agente estabilizante, por ejemplo, un poliol tal como sacarosa o trehalosa.

Opcionalmente, la composición inmunogénica o vacuna de la invención contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria al inmunógeno. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de la pared celular de micobacterias, monofosforil lípido A, derivados del ácido micótico, tensioactivos copolímeros de bloque no iónicos, Quil A, subunidad B de la toxina del cólera, polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimulantes (ISCOM) tales como los descritos por Takahashi y col., (1990) Nature 344:873-875. Igualmente, el procedimiento de la invención comprende opcionalmente una etapa de adición de al menos uno de los adyuvantes anteriores.

Como con todas las composiciones inmunogénicas o vacunas, las cantidades inmunológicamente eficaces de los inmunógenos deben determinarse empíricamente. Factores que se deben tener en cuenta incluyen la inmunogenicidad, si el inmunógeno forma complejo o no o se une covalentemente o no a un adyuvante o proteína transportadora u otro vehículo, la vía de administración y el número de dosis inmunizantes que se han de administrar.

El agente activo puede estar presente en concentraciones variables en la composición farmacéutica o vacuna de la invención. Típicamente, la concentración mínima de la sustancia es una cantidad necesaria para conseguir su uso previsto, mientras que la concentración máxima es la cantidad máxima que permanecerá en solución o suspendida homogéneamente dentro de la mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad mínima de un agente terapéutico es, opcionalmente, una que proporcionará una dosis única terapéuticamente eficaz. Para sustancias bioactivas, la concentración mínima es una cantidad necesaria para la bioactividad tras la reconstitución y la concentración máxima está en el punto en el que una suspensión homogénea no se puede mantener. En el caso de unidades de una sola dosis, la cantidad es la de una sola aplicación terapéutica. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 1-100 g de antígeno de proteína, opcionalmente 5-50 g o 5-25 g. Por ejemplo, las dosis de sacáridos bacterianos son 10-20 μg, 5-10 µg, o 1-2,5 µg de sacárido en el conjugado.

Las preparaciones de vacunas de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero (por ejemplo un paciente humano) susceptible a la infección administrando dicha vacuna por medio de una vía sistémica

o mucosa. Un paciente humano es opcionalmente un lactante (menor de 12 meses), un niño pequeño (12 a 24, 1216 o 12-14 meses), un niño (2-10, 3-8 o 3-5 años) un adolescente (12 -21, 14-20 o 15-19 años) o un adulto. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración mucosa en los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. Se prefiere la administración intranasal de las vacunas para el tratamiento de la neumonía o de la otitis media (ya que el transporte nasofaríngeo de los neumococos se puede prevenir con más eficacia y, de este modo, se atenúa la infección en su estadio más temprano). Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una dosis única, los componentes de la misma también se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o a tiempos diferentes (por ejemplo, si hay sacáridos presentes en una vacuna, estos se podrían administrar por separado, al mismo tiempo o 12 semanas después de la administración de una vacuna de proteína bacteriana para una coordinación óptima de las respuestas inmunitarias unas con respecto de otras). Además de una única vía de administración se pueden usar 2 vías de administración diferentes. Por ejemplo, los antígenos virales se pueden administrar por vía i.d. (intradérmica), mientras que las proteínas bacterianas se pueden administrar por vía i.m. (intramuscular) o i.n. (intranasal). Si hay sacáridos presentes, se pueden administrar por vía intramuscular (o intradérmica, i.d.) y las proteínas bacterianas se pueden administrar por vía intranasal (i.n.) o intradérmica (i.d.). Además, las vacunas de la invención se pueden administrar i.m. para las dosis primeras e i.n. para las dosis de refuerzo.

La preparación de las vacunas está descrita en general en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press Nueva York”). La encapsulación en liposomas la describe Fullerton, en la patente de EE.UU. 4.235.877.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición inmunogénica como se define en la reivindicación 12.

Un uso de la composición inmunogénica o vacuna de la invención en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la enfermedad se divulga en la reivindicación 13.

Los inventores conciben que los términos “que comprende”, “comprenden” y “comprende” en el presente documento puedan opcionalmente sustituirse con las expresiones “que consiste en”, “consisten en" “consiste en”, respectivamente, en cada caso.

La invención se ilustra en los ejemplos adjuntos. Los ejemplos siguientes se llevaron a cabo usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto donde se describa lo contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 -Preparación de conjugados de polisacáridos

Conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-TT de S. aureus:

Derivatización del PS

La activación y el acoplamiento se realizaron a temperatura ambiente con agitación continua. 30 mg de polisacárido nativo se diluyeron para obtener una concentración final del polisacárido 5 mg / ml en agua. La solución se ajustó a pH 5,0 con HCl 0,5 N y después se añadieron 66 µg de ADH (2,2 mg / mg de PS). Después de la disolución completa, se añadieron 60 mg de EDAC (2 mg / mg de PS). Después de 70 minutos se elevó el pH a pH 7,5 con NaOH 1 N para detener la reacción. El ADH libre se eliminó mediante purificación en Sephacryl S100HR (XK 16/40). El caudal se fijó en 60 ml / h usando NaCl 0,2 M como tampón de elución. Una reducción de tamaño se realizó por sonicación de 15 minutos, lo que permite una filtración estéril sobre un filtro Millex (0,22 µm).

Acoplamiento

El toxoide tetánico se añadió a 5 a 10 mg de polisacárido derivatizado en NaCl 0,2 M y el pH se ajustó a pH 5,0 o pH 6,0 mediante la adición de HCl 0,5 N. EDAC se disolvió en tampón Tris 0,1 M a pH 7,5 y después se añadió durante

un período de 10 minutos (1/5 vol cada 2 minutos). De acuerdo con las condiciones utilizadas (véase la Tabla 6), la reacción se detuvo después de entre 30 y 180 minutos mediante la adición de Tris-HCl 1 M a pH 7,5. Antes de la purificación en Sephacryl S400HR, el conjugado se clarificó usando un filtro Minisart de 5 ìm. Alternativamente, el conjugado se clarificó por una etapa de sonicación 5 minutos. Después, el conjugado se inyecta en Sephacryl S400HR (XK50 / 100). El caudal se fijó en 30 ml / h usando NaCl 150 mM como tampón de elución. El conjunto de elución se seleccionó sobre la base de resorcinol y perfiles ìBCA (que miden las dosis del polisacárido y la proteína, respectivamente). El conjugado se filtró en una membrana de esterilización de 0,22 µm (Millipack 20) a 10 ml / min.

Tabla 6: * acoplamiento realizado a pH 6,0

Conjugado

Tiempo de acoplamiento [PS (AH)] (mg/ml) [TT (AH)] (mg/ml) [reactivo EDAC] (mg/mg de PS)

SA08-TT011

40 min 5 10 0,5/1

SA08-TT015*

180 min 2,5 5,0 0,25/1

SA08-TT017

30 min 3,75 7,5 0,25/1

SA08-TT018

50 min 3,75 7,5 0,10/1

10 Los conjugados resultantes tienen las siguientes características mostradas en la Tabla 7: Tabla 7

Conjugado

In. TT/PS proporción (p/p) Proporción In. TT/PS (p/p) Y. PS rec (%) Rendimiento del filtro (%)

SA08-TT011

2/1 2,43/1 48 99

SA08-TT015

2/1 2,40/1 53 104

SA08-TT017

2/1 2,41/1 44 107

SA08-TT018

2/1 2,40/1 42 106

El polisacárido tipo 8 de S. aureus también se trató mediante microfluidización antes de derivatización con ADH

Derivatización del PS

15 La activación y el acoplamiento se realizan a temperatura ambiente con agitación continua. 200 mg de polisacárido dimensionado se diluyen para obtener una concentración final de PS de 10 mg / ml en agua. Después se añadieron 440 mg de ADH (2,2 mg / mg de PS). La solución se ajustó a pH 4,7 con HCl 1 N antes de la adición de 400 mg de EDAC (2 mg / mg de PS). Después de 60 minutos se elevó el pH a pH 7,5 con NaOH 5 M para detener la reacción. La mezcla se concentró en Amicon Ultra (corte de 10.000 de MWCO). Antes de la purificación en Sephacryl S200HR

20 (XK16/100), el conjugado se clarificó usando un filtro Minisart de 5 ìm. El caudal se fijó en 30 ml / h usando NaCl 0,150 M como tampón de elución.

Acoplamiento

Se añadieron 100 mg de TT a 50 mg de polisacárido derivatizado en NaCl 0,15 M. El pH se ajustó a pH 5,0 ± 0,02 mediante la adición de HCl 0,3N. EDAC se disolvió en tampón Tris 0,1 M a pH 7,5 y después se añadió durante un 25 período de 10 minutos (1/10 vol cada minuto). De acuerdo con las condiciones utilizadas (véase la Tabla 8), la reacción se detuvo después de entre 30 y 180 minutos mediante la adición de Tris-HCl 1 M a pH 7,5. Antes de la purificación en Sephacryl S400HR, el conjugado se clarificó usando un filtro Minisart de 5 ìm. Después, el conjugado se inyecta en Sephacryl S400HR (XK50 / 100). El caudal se fijó en 60 ml / h usando NaCl 150 mM como tampón de elución. El conjunto de elución se seleccionó sobre la base de resorcinol y perfiles ìBCA (que miden las dosis del

30 polisacárido y la proteína, respectivamente). Después, el conjugado se filtró en una membrana de esterilización de 0,22 µm (Millipack 20) a 10 ml / min.

Tabla 8

Conjugado

Tiempo de acoplamiento [PS-AH] (mg/ml) [TT] (mg/ml) [EDAC] (mg/mg dePS)

SA08-TT045

65 min 3,75 7,5 0,1

SA08-TT046

45 min 3,75 7,5 0,2

SA08-TT047

30 min 5,0 15,0 0,2

SA08-TT048

120 min 5,0 10,0 0,05

SA08-TT049*

50 min 5,0 10,0 0,1

* EDAC añadido "de una vez"

Tabla 9

Conjugado

In. TT/PS ratio (p/p) Proporción In. TT/PS (p/p) Y. PS rec (%) Rendimiento del filtro (%)

SA08-TT045

2/1 2,20/1 57 101

SA08-TT046

2/1 2,80/1

SA08-TT047

3/1 Gel no purificado - -

SA08-TT048

2/1 3,35 30 101

SA08-TT049

2/1 3,5 24 106

5 Ejemplo 1 a -Preparación del conjugado de polisacárido capsular meningocócico MenA y MenC de acuerdo con la invención

Los conjugados MenC -TT se produjeron utilizando polisacáridos nativos (de más de 150 kDa medida mediante MALLS) o se microfluidizaron ligeramente. Los conjugados MenA-TT se produjeron usando polisacárido nativo, ya sea o polisacárido ligeramente microfluidizado de más de 60 kDa medida mediante el procedimiento MALLS del

10 ejemplo 2. El dimensionamiento se realizó mediante microfluidización usando un aparato homogeneizador Emulsiflex C-50. Después, los polisacáridos se filtraron a través de un filtro de 0,2 µm.

Con el fin de conjugar el polisacárido capsular MenA al toxoide del tétanos a través de un espaciador, se usó el siguiente procedimiento. La unión covalente del polisacárido y el espaciador (ADH) se lleva a cabo por una química de acoplamiento por la que el polisacárido se activa en condiciones controladas mediante un agente de cianilación,

15 tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP). El espaciador reacciona con el PS cianilado a través de sus grupos hidrazino, para formar un enlace isourea estable entre el espaciador y el polisacárido.

Una solución de 10 mg / ml de MenA (pH 6,0) [3,5 g] se trató con una solución recién preparada de 100 mg /ml de CDAP en acetonitrilo / agua (50/50 (p/p)) para obtener una relación CDAP / MenA de 0,75 (p/p). Después de 1,5 minutos, el pH se elevó hasta pH 10,0. Tres minutos más tarde, se añadió ADH para obtener una relación de / ADH

20 MenA de 8,9. El pH de la solución se redujo a 8,75 y la reacción procedió durante 2 horas manteniendo este pH (y la temperatura se mantuvo a 25 ºC).

La solución de PSA AH se concentró hasta un cuarto de su volumen inicial y después se diafiltró con 30 volúmenes de NaCl 0,2 M utilizando una membrana Filtron Omega con un corte de 10 kDa, y el producto retenido se filtró.

Antes de la reacción de conjugación (condensación carbodiimida), la solución de TT purificada y la solución de PSA 25 AH se diluyeron para alcanzar una concentración de 10 mg / ml para PSAAH y 10 mg / ml para TT.

EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida) se añadió a la solución de PS AH solución (2 g de sacárido) con el fin de llegar a una relación final de 0,9 mg de EDAC / mg PSA AH. El pH se ajustó a 5,0. El toxoide del tétanos purificado se añadió con una bomba peristáltica (en 60 minutos) para llegar a 2 mg de TT / mg de PSA AH. La solución resultante se dejó 60 minutos a + 25 ºC con agitación para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120

minutos. La solución se neutralizó mediante la adición de Tris-HCl 1 M a pH 7,5 (1/10 del volumen final) y se dejó 30 minutos a + 25 ºC y luego durante la noche a + 2 ºC y + 8 ºC. El conjugado se clarificó usando un filtro de 10 m y se purificó usando una columna de Sephacryl S400HR (Pharmacia, Suecia). La columna se equilibró en Tris-HCl 10 mM (pH 7,0), NaCl 0,075 M y el conjugado (aprox. 660 ml) se cargó en la columna (+ 2 ºC y + 8 ºC). El conjunto de elución se seleccionó como una función de la densidad óptica a 280 nm. La recogida comenzó cuando la absorbancia aumentó hasta 0,05. La recogida continuó hasta que la Kd alcanzó 0,30. El conjugado se esterilizó por filtración a 20 ºC, después se almacenó a + 2 ºC y + 8 ºC. El conjugado resultante tenía una relación polisacárido: proteína de 1: 2-1: 4 (p / p).

Con el fin de conjugar el polisacárido capsular MenC al toxoide del tétanos a través de un espaciador, se usó el siguiente procedimiento. La unión covalente del polisacárido y el espaciador (ADH) se lleva a cabo por una química de acoplamiento por la que el polisacárido se activa en condiciones controladas mediante un agente de cianilación, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP). El espaciador reacciona con el PS cianilado a través de sus grupos hidrazino, para formar un enlace isourea estable entre el espaciador y el polisacárido.

Una solución de 20mg / ml de Menc (pH 6,0) (3,5 g) se trató con una solución recién preparada de 100 mg /ml de CDAP en acetonitrilo / agua (50/50 (p/p)) para obtener una relación CDAP / MenC de 1,5 (p/p). Después de 1,5 minutos, el pH se elevó hasta pH 10,0. En la activación se añadió NaCl 5 M pH para lograr una concentración final de NaCl 2 M. Tres minutos más tarde, se añadió ADH para obtener una relación de / ADH MenC de 8,9. El pH de la solución se redujo a 8,75 y la reacción procedió durante 2 horas (manteniendo la temperatura a 25 ºC).

La solución de PSC AH se concentró hasta un mínimo de 150 ml y después se diafiltró con 30 volúmenes de NaCl 0,2 M utilizando una membrana Filtron Omega con un corte de 10 kDa, y el producto retenido se filtró.

Antes de la reacción de conjugación, la solución de TT purificada y la solución de PSC AH (2 g, escala) se diluyeron en NaCl 0,2 M hasta alcanzar una concentración de 15 mg / ml para PSCAH y 20mg / ml para TT.

El toxoide del tétanos purificado se añadió a la solución de PSC AH con el fin de alcanzar los 2 mg de TT / mg de PSC AH. El pH se ajustó a 5,0. Se añadió EDAC (16,7 mg / ml en Tris 0,1 M pH 7,5) con una bomba peristáltica (en 10 minutos) para llegar a una relación final de 0,5 mg de EDAC / mg PSC AH. La solución resultante se dejó 110 minutos a + 25 ºC con agitación y regulación del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuación, la solución se neutralizó mediante la adición de Tris-HCl 1 M a pH 9,0 (1/10 del volumen final) y se dejó 30 minutos a + 25 ºC y luego durante la noche a + 2 ºC y + 8 ºC.

El conjugado se clarificó usando un filtro de 10 µm y se purificó usando una columna de Sephacryl S400HR (Pharmacia, Suecia). La columna se equilibró en Tris-HCl 10 mM (pH 7,0), NaCl 0,075 M y el conjugado (aprox. 460 ml) se cargó en la columna (+ 2 ºC y + 8 ºC). El conjunto de elución se seleccionó como una función de la densidad óptica a 280 nm. La recogida comenzó cuando la absorbancia aumentó hasta 0,05. La recogida continuó hasta que la Kd alcanzó 0,20. El conjugado se esterilizó por filtración a 20 ºC, después se almacenó a + 2 ºC y + 8 ºC. El conjugado resultante tenía una relación polisacárido: proteína de 1: 2-1: 4 (p / p).

Varios experimentos añadiendo EDAC en 10-45 minutos se llevaron a cabo, en cada caso se obtuvieron conjugados de MenC de buena calidad.. Si, sin embargo el vehículo TT se añadió lentamente a la mezcla MenC-ADH + EDAC, esto condujo a un gel, un conjugado que no podía ser purificado. Los experimentos también se llevaron a cabo añadiendo el EDAC de una vez a la reacción, pero la relación TT/PS final (2,7 / 1) (w / w) del conjugado fue más baja que para el conjugado obtenido a través de la reacción en la que se añadió EDAC durante 10 minutos (3,3 / 1); Además, la antigenicidad αTT y αPS eran tanto menor que el medido en relación con el conjugado preparado por la reacción en la que se añadió EDAC durante 10 minutos.

Nota sobre el % aproximado de derivatización de los polisacáridos

MenCAH: después del tratamiento CDAP con ADH, aproximadamente un 3,4 7 % de los grupos hidroxilo se derivaron con ADH (con una estimación de dos grupos hidroxilo disponibles por subunidad de repetición). Para MenA: Aproximadamente el 11,5 % de los grupos hidroxilo derivaron con ADH (que consideran que solo hay un grupo hidroxilo disponible por unidad de repetición).

Ejemplo 2 Determinación del peso molecular utilizando MALLS

Los detectores se acoplaron a una columna de HPLC de exclusión por tamaños desde la que se eluyeron las muestras. Por un lado, el detector de dispersión de luz láser midió las intensidades de luz dispersada en 16 ángulos por la solución macromolecular y por otra parte, un refractómetro interferométrico situado en línea permitió la determinación de la cantidad de muestra eluida.. A partir de estas intensidades, el tamaño y forma de las macromoléculas en solución se puede determinar

El peso molecular medio en peso (Mw) se define como la suma de los pesos de todas las especies multiplicado por sus respectivos pesos moleculares y dividido por la suma de los pesos de todas las especies.

a) Peso molecular promedio en peso: -Mw

b) Peso molecular promedio en número: -Mn

c) Raíz del radio medio al cuadrado: -Rw-y R2w son el radio al cuadrado, definido por:

(-mi-es la masa de un centro de dispersión i y -ri-es la distancia entre el centro de dispersión i y el centro de gravedad de la macromolécula).

d) La polidispersidad se define como la relación -Mw / Mn.

Los polisacáridos meningocócicas se analizaron mediante MALLS cargando sobre dos columnas de HPLC (TSKG6000 y 5000PWxI) usadas en combinación. Se cargaron 25 µl del polisacárido en la columna y se eluyó con 0,75 ml de agua filtrada. Los polisacáridos se detectan usando un detector de dispersión de luz (Wyatt amanecer DSP equipado con un láser de argón de 10 mW 1 a 488 nm) y un refractómetro inferométrico (Wyatt Otilab DSP equipado con una célula P100 y un filtro rojo a 498nm).

Las polidispersidades de los pesos moleculares y las recuperaciones de todas las muestras se calcularon mediante el procedimiento de Debye usando un ajuste polinómico de orden 1 en el software Astra 4.72.

Ejemplo 3

lnmunogenicidad de PS8-TT de S. aureus y los conjugados dPNAG-TT

A grupos de 30 ratones se les inoculó por vía subcutánea el conjugado PS8-TT de S. aureus a una dosis de sacárido de 3 g, ya sea sin adyuvante o combinado con adyuvante A, los días 0, 14, 28 y 42. El día 0, los ratones recibieron una primera dosis del sacárido incluida entre 0,001 y 0,013 g. Los tres inmunizaciones siguientes se realizaron con una dosis de 0,3 g en solución salina. El día 55 se obtuvo suero de los ratones y cada muestra de suero se analizó mediante ELISA para evaluar la respuesta inmunitaria contra PS8. Grupos de 10 ratones se usaron en los grupos de control y en estos se inoculó solución salina o solución salina que contiene adyuvante A.

La P8 se recubrió a 2 µg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulación de unión alta (Nunc MAXISORP), durante la noche a 4° C. Las placas se bloquearon con PBS-BSA 1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. Los antisueros de los ratones se prediluyeron a 1/100, a continuación se realizaron diluciones al doble en microplacas que se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de lavar, el anticuerpo unido murino se detectó usando IgG anti-ratón de cabra (H+L) affiniPure conjugada con peroxidadas de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115-035-003) diluida a 1:5000 en PBS-tween al 0,05 %. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. El color se desarrolló usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5 µl de H2O2 por 10 ml a pH 4,5, tampón citrato 0,1 M durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 µl de HCl y la densidad óptica se leyó a 490 nm relativa a 650 nm.

Los resultados se expresaron en los títulos de punto medio y el GMT se calculó para las 30 muestras (10) para los controles. Los resultados se muestran en la Tabla 14 que se expone a continuación.

Tabla 14

Conjugado

Título anti-PS8 (GMT) no absorbido Título anti-PS8 (GMT) de adyuvante A

SA08-TT011

4714 2109

SA08-TT015

2806 5631

SA08-TT017

3770 4396

SA08-TT018

5349 4748

A grupos de 30 ratones se les inoculó por vía subcutánea conjugados dPNAG-TT de S. aureus (que contiene dPNAG que estaba entre el 10 % y el 30 % de N-acetilada) a una dosis de sacárido de 0,3 g en NaCl 200 mM, ya sea sin adyuvante o combinado con adyuvante A. Los ratones recibieron tres inoculaciones los días 0, 14 y 28. El día 41 o 42 se obtuvo suero de los ratones y cada muestra de suero se analizó mediante ELISA para evaluar la respuesta inmunitaria contra PNAG. Grupos de 10 ratones se usaron en los grupos de control y en estos se inoculó solución salina o adyuvante solo.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de fabricación de una composición inmunogénica que comprende una etapa de conjugación de conjugación de un sacárido a un vehículo proteico para producir un conjugado de proteína-sacárido usando química de condensación de carbodiimida, en el que el sacárido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repetición) o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y / o carboxilo, y en el que el vehículo proteico comprende, o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y / o carboxilo, que comprende las etapas de

   I) -si el vehículo proteico comprende grupos tanto amino como carboxilo y el sacárido comprende grupos amino o carboxilo:

   a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de vehículo proteico necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade en la primera mitad del periodo y al menos un cuarto de la alícuota en la segunda mitad del periodo;

   II) -si el sacárido comprende grupos tanto amino como carboxilo y el vehículo proteico comprende grupos

   amino o carboxilo: a) mezclar el vehículo proteico y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y

   b) añadir la alícuota de sacárido necesaria para durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período, y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período; III) -si el sacárido comprende grupos tanto amino como carboxilo y el vehículo proteico comprende grupos

   tanto amino como carboxilo: a) mezclar el vehículo proteico y el sacárido; y b) añadir la alícuota de carbodiimida necesaria para realizar la conjugación durante un periodo de 1

   minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade durante la primera mitad del periodo y al menos un cuarto de la alícuota durante la segunda mitad del período; y en el que: la alícuota de carbodiimida es de de 0,01 a 3 mg de carbodiimida/mg de sacárido; el sacárido está presente a una concentración final de 0,5-50 mg / ml en la etapa b); el vehículo proteico está presente a una concentración final de 1-50 mg / ml en la etapa b); la relación inicial entre el vehículo proteico y el sacárido es de 5:1 a 1:5 (p/p);

   la concentración de sal presente en la etapa b) es 0-2M; el pH de la reacción en la etapa b) es pH 4,5 -6,5, pH 4,5 -7,5 o si un compuesto está presente en la etapa b) que mantiene el intermedio de reacción estable; y

   la temperatura de la reacción en la etapa b) es 4-37 grados C, y una etapa adicional de mezclar el conjugado de proteína-sacárido con un antígeno estafilocócico.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la carbodiimida es EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) o una carbodiimida distinta de EDAC.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el sacárido y / o el vehículo proteico se han derivatizado para que comprendan grupos amino o carboxilo.

4. 4.

   El procedimiento de las reivindicaciones 1-3, en el que en la etapa b) la alícuota de carbodiimida, el sacárido o el vehículo proteico se añaden a una velocidad constante usando una bomba.

5. 5.

   El procedimiento de las reivindicaciones 1-3, en el que en la etapa b) la alícuota de carbodiimida, el sacárido o el vehículo proteico se añaden en etapas durante el período.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la alícuota “a” se añade en 4-100 etapas “s”.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 6, en el que a/s de la alícuota se añaden en cada etapa.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que si una etapa tiene lugar a tiempo cero del período 'p', cada etapa posterior tiene lugar a un tiempo que es p / (s-1).

9. 9.

   Un procedimiento de conjugación de un sacárido a un vehículo proteico estafilocócico usando química de

   5 condensación de carbodiimida, en el que el sacárido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repetición) o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y / o carboxilo, y en el que el vehículo proteico comprende, o se ha derivatizado para comprender, grupos amino y / o carboxilo, que comprende las etapas de:

   I) -si el vehículo proteico estafilocócico comprende grupos tanto amino como carboxilo y el sacárido comprende grupos amino o carboxilo:

   10 a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y

   b) añadir la alícuota de vehículo proteico estafilocócico necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade en la primera mitad del periodo y al menos un cuarto de la alícuota en la segunda mitad del periodo;

   II) -si el sacárido comprende grupos tanto amino como carboxilo y el vehículo proteico comprende grupos 15 amino o carboxilo:

   a) mezclar el vehículo proteico estafilocócico y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y

   b) añadir la alícuota de sacárido requerido durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade en la primera mitad del periodo y al menos un cuarto de la

   20 alícuota en la segunda mitad del periodo;

   III) -si el sacárido comprende grupos tanto amino como carboxilo y el vehículo proteico comprende grupos tanto amino como carboxilo:

   a) mezclar el vehículo proteico estafilocócico y el sacárido; y

   b) añadir la alícuota de carbodiimida necesaria para realizar la conjugación durante un periodo de 1

   25 minuto a 6 horas, en el que al menos un cuarto de la alícuota se añade durante la primera mitad del periodo; y al menos un cuarto de la alícuota durante la segunda mitad del período

   y en el que:

   la alícuota de carbodiimida es de 0,01 a 3 mg de carbodiimida/mg de sacárido;

   el sacárido está presente a una concentración final de 0,5-50 mg / ml en la etapa b);

   30 el vehículo proteico está presente a una concentración final de 1-50 mg / ml en la etapa b);

   la relación inicial entre el vehículo proteico y el sacárido es de 5:1 a 1:5 (p/p);

   la concentración de sal presente en la etapa b) es 0-2 M;

   el pH de la reacción en la etapa b) es pH 4,5-6,5, pH 4,5 a 7,5 o si un compuesto está presente en la etapa b) que mantiene el intermedio de reacción estable; y

   35 la temperatura de la reacción en la etapa b) es 4-37 grados C.
10. 10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la proteína estafilocócica se selecciona del grupo que consiste en el receptor de laminina, la proteína de unión a SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de unión a elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, proteína A, autolisina, ClfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, SasH, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de unión a

    40 vitronectina, proteína de unión a fibrinógeno, coagulasa, Fig y MAP; transportador de ABC inmunodominante, , IsdA, IsdB, IsdC, IsdH/HarA, transportador de Mg2+, transportador de SitC y Ni ABC, SasA, MRPII, proteína de unión a penicilina 4, VPL, toxina alfa (HIIa), mutante de alfa toxina H35R y proteína de activación de ARN III (RAP) o fragmentos inmunogénicos o proteínas de fusión de los mismos.
11. 11. Un conjugado sacárido-vehículo proteico obtenible mediante el procedimiento de las reivindicaciones 9-10, en el 45 que se previene las reticulaciones intra-restos.
12. 12. Una composición inmunogénica o vacuna, que comprende un sacárido estafilocócico que se puede obtener mediante el procedimiento de las reivindicaciones 1-8, en el que se previenen las reticulaciones intra-resto.
13. 13. Uso de la composición inmunogénica o vacuna de la reivindicación 12 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedad.

    Figura 1

    SEC ID Nº 1 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 2 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 3 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 4 secuencia polipeptídica

    10 SEC ID Nº 5 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 6 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 7 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 8 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 9 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 10 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 11 secuencia polipeptídica

    10 SEC ID Nº 12 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 13 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 14 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 15 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 16 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 17 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 18 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 19 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 20 secuencia polipeptídica

    10 SEC ID Nº 21 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 22 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 23 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 24 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 25 secuencia polipeptídica

    10 SEC ID Nº 26 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 27 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 28 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 29 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 30 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 31 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 32 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 33 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 67 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 68 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 69 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 70 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 71 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 72 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 73 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 74 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 75 secuencia polipeptídica

    SEC ID Nº 76 secuencia polipeptídica

    Figura 2

    SEC ID Nº 34 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 35 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 36 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 37 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 38 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 39 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 40 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 41 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 42 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 43 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 44 secuencia polinucleotídica

    10 SEC ID Nº 45 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 46 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 47 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 48 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 49 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 50 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 51 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 52 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 53 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 54 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 55 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 56 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 57 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 58 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 59 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 60 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 61 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 62 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 63 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 64 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 65 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 66 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 77 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 78 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 79 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 80 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 81 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 82 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 83 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 84 secuencia polinucleotídica SEC ID Nº 85 secuencia polinucleotídica

    SEC ID Nº 86 secuencia polinucleotídica