ES2546271T3 - Microorganismo y procedimiento para producir decahidro-2-hidroxi-2,5,5,8a-tetrametilnaftalenetanol y/o esclareólido (decahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furan-2(1H)-ona) usando el mismo - Google Patents

Microorganismo y procedimiento para producir decahidro-2-hidroxi-2,5,5,8a-tetrametilnaftalenetanol y/o esclareólido (decahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furan-2(1H)-ona) usando el mismo Download PDF

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ES2546271T3 ES06835082.6T ES06835082T ES2546271T3 ES 2546271 T3 ES2546271 T3 ES 2546271T3 ES 06835082 T ES06835082 T ES 06835082T ES 2546271 T3 ES2546271 T3 ES 2546271T3
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Shuichi Takizawa
Norihiko Higaki
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Abstract

Un microorganismo que pertenece a Ascomycetes y que tiene 28S ADNr que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de un 95 % o mayor con la secuencia de nucleótidos como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 3 o 18S ADNr que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de un 95 % o mayor con la secuencia de nucleótidos como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 6, y que tiene la capacidad de producir decahidro-2-hidroxi-2,5,5,8a-tetrametilnaftalenetanol y/o esclareólido (decahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furan-2(1H)-ona) como intermedio durante una etapa de síntesis de dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano usando esclareol como sustrato.

Description

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28-08-2015
Ascomycetes que tienen dicha capacidad representan hallazgos novedosos, y dichos microorganismos pueden ser útiles para producir dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano y un intermedio del mismo. En lo que respecta a microorganismos novedosos que se habían aislado e identificado por los presentes inventores, se identificaron las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican 28S ARNr (a continuación en el presente documento
5 denominado "28S ADNr"). Dichas secuencias de nucleótidos son como se muestran en la SEQ ID NO: 1 a 3. Con respecto a los microorganismos novedosos, se identificaron las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican 18S ARNr (a continuación en el presente documento denominado "18S ADNr"). Dichas secuencias de nucleótidos son como se muestran en la SEQ ID NO: 4 a 6. Además, se descubrió que los microorganismos novedosos tienen propiedades micológicas mostradas en la tabla 1.
10 Tabla 1
Prueba de asimilabilidad de fuente de carbono
KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
D-glucosa
+ + +
D-galactosa
+ + +
L-sorbosa
+ + w
D-ribosa
w w w
D-xilosa
+ + +
L-arabinosa
+ + +
D-arabinosa
+ w w
L-ramnosa
+ + +
Sacarosa
+ + +
Maltosa
+ + +
α,α-trehalosa
+ +
Me α-D-glucósido
+ + w
D-celobiosa
+ + +
Salicina
- w w
Melibiosa
+ + +
Lactosa
+ + w
D-rafinosa
+ + +
Melezitosa
+ + +
Inulina
- w -
Almidón soluble
w + +
Glicerol
+ + w
meso-eritritol
+ + w
Ribitol
w - w
D-sorbitol
+ + w
D-mamitol
+ + w
D-galactitol
- - -
mio-inositol
+ w w
Glucono-1,5-lactona
w w -
Ca ácido 2-ceto-glucónico
- - w
Ca ácido 5-ceto-glucónico
- - w
DL-lactato
+ + w
Succinato
+ + +
Citrato
- w w
Metanol
- - -
Prueba de fermentabilidad de azúcar
KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
D-glucosa
- - -
Prueba de asimilabilidad de fuente de nitrógeno
KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
Nitrato de potasio
+ + +
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debido a la gemación. Como resultado de una prueba de propiedad bioquímica, se obtuvieron los resultados mostrados en la tabla 2. Además, KSM-J3571 creció a 25 ºC, creció débilmente a 30 ºC, pero no creció a 35 ºC o mayor.
5 Se identificaron las propiedades micológicas de KSM-JL4651 de la siguiente manera. Se observó una colonia húmeda y de color rojo pálido en medio de placa de agar YM (Becton Dickinson) y la forma de la porción periférica de la colonia era relativamente lisa. Se observaron características microscópicas de la misma. Como resultado, se observó la formación de trofocitos de conformación elíptica a ovalada y cilíndrica, y se descubrió que los trofocitos proliferaban debido a la gemación. Como resultado de una prueba de propiedad bioquímica, se obtuvieron los resultados
10 mostrados en la tabla 2. Además, KSM-JL4651 creció a 30 ºC pero no creció a 35 ºC o mayor.
Tabla 2
Prueba de asimilabilidad de fuente de carbono
KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
D-glucosa
+ + +
D-galactosa
+ + +
L-sorbosa
+ + w
D-ribosa
w w w
D-xilosa
+ + +
L-arabinosa
+ + +
D-arabinosa
+ w w
L-ramnosa
+ + +
Sacarosa
+ + +
Maltosa
+ + +
α,α-trehalosa
+ + +
Me α-D-glucósido
+ + w
D-celobiosa
+ + +
Salicina
- w w
Melibiosa
+ + +
Lactosa
+ + w
D-rafinosa
+ + +
Melezitosa
+ + +
Inulina
- w -
Almidón soluble
w + +
Glicerol
+ + w
meso-eritritol
+ + w
Ribitol
w - w
D-sorbitol
+ + w
D-Manitol
+ + w
D-galactitol
- - -
mio-inositol
+ w w
Glucono-1,5-lactona
w w -
Ca ácido 2-ceto-glucónico
- - w
Ca ácido 5-ceto-glucónico
- - w
DL-lactato
+ + w
Succinato
+ + +
Citrato
- w w
Metanol
- - -
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25
30
35
40
45
50
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Prueba de fermentabilidad de azúcar
KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
D-glucosa
- - -
Prueba de asimilabilidad de fuente de nitrógeno
KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
Nitrato de potasio
+ + +
Posteriormente, se analizaron los ADNr de KSM-JL2842, KSM-J3571 y KSM-JL4651 de la siguiente manera. Específicamente, se analizaron la región D1/D2 de 28S ADNr y de 18S ADNr de acuerdo con el procedimiento de O'Donnell (O’Donnell, K. 1993, Fusarium and its near relatives, en Reynolds, D. R. y Taylor, J. W. (Eds) The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB International, Wallingford) para deducir sus grupos taxonómicos. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de la región D1/D2 de 28S ARNr, y los resultados se muestran en las SEQ ID NO: de 1 a 3. Además, se determinaron las secuencias de nucleótidos de 18S ADNr y los resultados se muestran en las SEQ ID NO: 4 a 6. Se llevó a cabo la búsqueda de homología por BLAST.
La secuencia de nucleótidos de la región D1/D2 de 28S ADNr obtenido a partir de KSM-JL2842 presentó una homología de un 94,9 % con la secuencia de nucleótidos de Pseudourotium zonatum (AF096198), que es una cepa de Ascomycetes, y una homología de un 94,6 % con la secuencia de nucleótidos de Crinula caliciiformis (AY544680). Además, la secuencia de nucleótidos de 18S ADNr presentó una homología alta; es decir, una homología deun 98,8 % con la secuencia de nucleótidos de Bulgaria inquinans (AJ224362), que es una cepa de Ascomycetes, una homología de un 98,9 % para Ascomycete sp. BBA71218 (AJ301960), y una homología de un 98,9 % con la secuencia de nucleótidos de Cryptosporiopsis radicicola (DQ002903). Sin embargo, fue difícil deducir el grupo taxonómico de KSM-JL2842 en una clasificación más pequeña que el nivel de "clase". Por tanto, se llegó a la conclusión de que la cepa de interés era una cepa de levaduras de un género novedoso de Ascomycetes, que se clasifica en la clase Ascomycetes. Los resultados de este ejemplo permitieron la identificación de la cepa de interés como Ascomicete sp. KSM-JL2842.
La secuencia de nucleótidos de la región D1/D2 de 28S ADNr obtenido a partir de KSM-J3571 presentó una homología de un 94,9 % con la secuencia de nucleótidos de Pseudourotium zonatum (AF096198), que es una cepa de Ascomycetes, una homología de un 94,8 % con la secuencia de nucleótidos de Leuconeurospora pulcherrima (AF096193), y una homología de un 94,6 % con la secuencia de nucleótidos de Crinula caliciiformis (AY544680). La secuencia de nucleótidos de 18S ADNr presentó una homología de un 99,0 % con la secuencia de nucleótidos de ascomycete sp. BBA71218 (AJ301960), que es una cepa de Ascomycetes, y una homología de un 98,8 % con la secuencia de nucleótidos de Bulgaria inquinans (AJ224362). Sin embargo, fue difícil deducir el grupo taxonómico de KSM-J3571 en una clasificación más pequeña que el nivel de "clase". Por tanto, se llegó a la conclusión de que la cepa de interés era una cepa de levaduras de un género novedoso de Ascomycetes, que se clasifica en la clase Ascomycetes. Los resultados de este ejemplo permitieron la identificación de la cepa de interés como Ascomicete sp. KSM-J3571.
La secuencia de nucleótidos de la región D1/D2 de 28S ADNr obtenido a partir de KSM-JL4651 presentó una homología de un 94,6 % con la secuencia de nucleótidos de Pseudourotium zonatum (AF096198), que es una cepa de Ascomycetes, y una homología de un 94,4 % con la secuencia de nucleótidos de Leuconeurospora pulcherrima (AF096193). La secuencia de nucleótidos de 18S ADNr presentó una homología de un 99,0 % con la secuencia de nucleótidos de ascomycete sp. BBA71218 (AJ301960), que es una cepa de Ascomycetes, y una homología de un 98,8 % con la secuencia de nucleótidos de Bulgaria inquinans (AJ224362). Sin embargo, fue difícil deducir el grupo taxonómico de KSM-JL4651 en una clasificación más pequeña que el nivel de "clase". Por tanto, se llegó a la conclusión de que la cepa de interés era una cepa de levaduras de un género novedoso de Ascomycetes, que se clasifica en la clase Ascomycetes. Los resultados de este ejemplo permitieron la identificación de la cepa de interés como Ascomicete sp. KSM-JL4651.
Ascomiceto sp. KSM-JL2842 y KSM-J3571 se depositaron el 12 de enero de 2006, con los números de acceso FERM BP-10713 y FERM BP-10712 y Ascomiceto sp. KSM-JL4651 se depositó el 13 de julio de 2006, con el número de acceso FERM BP-10714 en el Organismo depositario de patentes internacionales del Instituto Nacional de Tecnología y Ciencia industrial avanzada (IPOD: Tsukuba central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japón).
[Ejemplo 3] Examen de la capacidad de producción del intermedio dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano
En este ejemplo, se examinó la capacidad de Ascomiceto sp. KSM-JL2842 para producir un intermedio de dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano. Al inicio, se inoculó un asa de platino de Ascomiceto sp. KSM-JL2842 en caldo YM al 2,1 % (Becton Dickinson), se llevó a cabo el cultivo con agitación a 25 ºC durante 2 días, y se designaron las resultantes como cepas iniciadoras. Posteriormente, se inocularon las cepas iniciadoras en un medio que contenía caldo YM al 2,1 %, sulfato de magnesio heptahidratado al 0,1 %, Tween 80 al 1 %, y esclareol al 2 % a una concentración de un 2 %, y se llevó a cabo el cultivo con agitación a 25 ºC. La solución de cultivo se sometió a extracción y análisis CG por medio del procedimiento del ejemplo 1, y se determinaron las cantidades de los
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intermedios de dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano que se van a producir. Los resultados se muestran en la tabla 3. Las unidades para los valores numéricos mostrados en la tabla 3, son "g/l".
Tabla 3
4 días
7 días 10 días
Esclareólido Decahidro-2-hidroxi-2,5,5,8a-tetrametilnaftalenetanol Éter cíclico
0,3 12,0 0,5 0,4 15,7 0,4 0,2 14,5 0,8
5 Los resultados mostrados en la tabla 3 demuestran que Ascomiceto sp. KSM-JL2842 puede producir principalmente decahidro-2-hidroxi-2,5,5,8a-tetrametilnaftalenetanol, de entre los intermedios de dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano.
10 [Ejemplo 4] Examen de la capacidad de producción del intermedio dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano
En este ejemplo, se examinaron las capacidades de Ascomiceto sp. KSM-JL2842, KSM-J3571 y KSM-JL4651 para producir intermedios de dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano. Al inicio, se inoculó un asa de platino de estas cepas en un medio que contenía extracto de levaduras al 0,2 % (Becton Dickinson), nitrato de amonio al 0,2 %,
15 fosfato de monopotasio al 0,1 %, sulfato de magnesio heptahidratado al 0,05 % y glucosa al 1,0 %, se llevó a cabo el cultivo con agitación a 25 ºC durante 2 días, y se designaron las resultantes como cepas iniciadoras. Posteriormente, se inocularon las cepas iniciadoras en un medio que contenía extracto de levaduras al 0,2 % (Becton Dickinson), nitrato de amonio al 0,2 %, fosfato de monopotasio al 0,1 %, sulfato de magnesio heptahidratado al 0,05 %, glucosa al 1,0 %, Tween 80 al 0,5 %, y esclareol al 1,0 % a una concentración de un 1 %, y se llevó a cabo el cultivo con agitación
20 a 25 ºC durante 6 días. La solución de cultivo se sometió a extracción y análisis CG por medio del procedimiento del ejemplo 1, y se determinaron las cantidades de los intermedios de dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano que se van a producir. Los resultados se muestran en la tabla 4. Las unidades para los valores numéricos mostrados en la tabla 4, son "g/l".
Tabla 4
KSM-JL2842
KSM-J3571 KSM-JL4651
Esclareólido
0,4 3,1 0,4
Decahidro-2-hidroxi-2,5,5,8a-tetrametilnaftalenetanol
2,0 0,2 0,7
Éter cíclico
Traza 0,1 Traza
Los resultados mostrados en la tabla 4 demuestran que Ascomiceto sp. KSM-JL2842, KSM-J3571, y KSM-JL4651 producen intermedios de dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano.
10

Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un microorganismo que pertenece a Ascomycetes y que tiene 28S ADNr que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de un 95 % o mayor con la secuencia de nucleótidos como se muestra en
    5 una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 3 o 18S ADNr que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de un 95 % o mayor con la secuencia de nucleótidos como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 6, y que tiene la capacidad de producir decahidro-2-hidroxi-2,5,5,8a-tetrametilnaftalenetanol y/o esclareólido (decahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furan-2(1H)-ona) como intermedio durante una etapa de síntesis de dodecahidro-3a,6,6,9a-tetrametilnafto[2,1-b]furano usando esclareol como sustrato.
    10
  2. 2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene propiedades micológicas mostradas en la tabla 1
    a continuación. Tabla 1
    Prueba de asimilabilidad de carbono
    KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
    D-glucosa
    + + +
    D-galactosa
    + + +
    L-sorbosa
    + + w
    D-ribosa
    w w w
    D-xilosa
    + + +
    L-arabinosa
    + + +
    D-arabinosa
    + w w
    L-ramnosa
    + + +
    Sacarosa
    + + +
    Maltosa
    + + +
    α,α-trehalosa
    + + +
    Me α-D-glucósido
    + + w
    D-celobiosa
    + + +
    Salicina
    - w w
    Melibiosa
    + + +
    Lactosa
    + + w
    D-rafinosa
    + + +
    Melezitosa
    + + +
    Inulina
    - w -
    Almidón soluble
    w + +
    Glicerol
    + + w
    meso-eritritol
    + + w
    Ribitol
    w - w
    D-sorbitol
    + + w
    D-Manitol
    + + w
    D-galactitol
    - - -
    mio-inositol
    + w w
    Glucono-1,5-lactona
    w w -
    Ca ácido 2-ceto-glucónico
    - - w
    Ca ácido 5-ceto-glucónico
    - - w
    DL-lactato
    + + w
    Succinato
    + + +
    Citrato
    - w w
    Metanol
    - - -
    Prueba de fermentabilidad de azúcar
    KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
    D-Glucosa
    - - -
    Prueba de asimilabilidad de nitrógeno
    KSM-JL2842 KSM-J3571 KSM-JL4651
    Nitrato de potasio
    + + +
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