ES2546543T3 - Anticuerpos monoclonales humanos contra los virus Hendra y Nipah - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano que se une selectivamente al epítopo de la glucoproteína G de Hendra y Nipah, en el que dicho anticuerpo incluye una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en el que la cadena ligera variable tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 313 y en el que el anticuerpo se puede obtener mediante maduración por afinidad con respecto a un anticuerpo m102 que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 17 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 25.

Description

Anticuerpos monoclonales humanos contra los virus Hendra y Nipah

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la inmunología y, específicamente, a los anticuerpos monoclonales que se unen o neutralizan los virus Hendra y Nipah.

Antecedentes de la invención

El virus Nipah (NiV) y el virus Hendra (HeV) son paramixovirus emergentes estrechamente relacionados, que comprenden el género Henipavirus (Anónimo 1999 MMWR Morb Mortal Wkly Rep Ward, J. W. ed. 48:335-337; Chew, M. H. et al. 2000 J Infect Dis 181:1760-1763; Chua, K. B. et al, 2000 Ann Neurol 48:802-805; Eaton, B. T. 15 2001 Microbes Infect 3:277-278; Goh, K. J. et al. 2000 N Engl J Med 342:1229-1235; Lee, K. E. et al 1999 Ann Neurol 46:428-432; Lim, C. C. et al. 2000 Am J Neuroradiol 21:455-461; Murray, K. et al. 1995 Science 268:94-97). Los paramixovirus son virus con cubierta que contienen ARN de sentido negativo y contienen dos glucoproteínas principales de la cubierta ancladas a la membrana que son necesarias para la infección de una célula huésped receptora. Todos los miembros contienen una glucoproteína F que participa en la fusión de membranas independiente del pH entre el virus y su célula huésped, mientras que la segunda glucoproteína de unión puede ser una proteína hemaglutinina-neuraminidasa (HN), una proteína hemaglutinina (H) o una proteína G, dependiendo del virus particular (revisado en Lamb, R. A. y Kolakofsky, D. 2001 in Fields Virology, eds. Knippe, D. M. & Howley, P. M., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, págs. 1305-1340). Al igual que con todos los paramixovirus, estas glucoproteínas son también los antígenos principales a los que se dirigen prácticamente todos los anticuerpos

25 neutralizantes.

Los amplios tropismos de la especie y la capacidad para provocar una enfermedad mortal tanto en animales como en seres humanos distinguen a HeV y NiV de todos los otros paramixovirus conocidos (revisado en Eaton, B. T. 2001 Microbes Infect 3:277-278). Son patógenos de Nivel 4 de Seguridad Biológica (BSL-4) y están en la agenda de investigación para la biodefensa del NIAID como patógenos prioritarios de categoría C emergentes zoonóticos que se podrían usar como agentes de bioterrorismo. Los henipavirus se pueden amplificar y provocar enfermedad en animales grandes, y se pueden transmitir mediante aerosoles a seres humanos, en los que la enfermedad puede ser una enfermedad respiratoria grave y encefalitis febril. Pueden crecer fácilmente en cultivo celular o en huevos de pollo embrionario, producen títulos no concentrados elevados (DICT50/ml ~108; Crameri, G. et al. 2002 J Virol

35 Methods 99:41-51) y son muy infecciosos (Field, H. et al. 2001 Microbes Infect 3:307-314; Hooper, P. et al. 2001 Microbes Infect 3:315-322).

NiV ha reaparecido recientemente en Bangladesh. Se han confirmado dos brotes de NiV en 2004 e incluso se ha producido otro en enero de 2005 (Anónimo 2005 Communicable Disease Report Weekly (CDR Weeldy) Vol. 15 No. 16). En estos brotes más recientes se han realizado varias observaciones importantes, incluyendo una mayor incidencia de síndrome de dificultad respiratoria aguda, transmisión de persona a persona y tasas de mortalidad de casos significativamente mayores (60-75 %) que en Malasia (aproximadamente del 40 %), donde se descubrió o se sospechó que se había originado el virus (Anónimo 2004 Wkldy Epidemiol Rec 79:168-171; Anonymous 2004 Health and Science Bulletin (ICDDRB) 2:5-9; Butler, D. 2004 Nature 429:7; Enserink, M. 2004 Science 303:1121; Hsu, V. P. 45 et al. 2004 Emerg Infect Dis 10:2082-2087). Actualmente, no hay ningún tratamiento para individuos infectados por NiV o HeV y no existe ninguna vacuna para la prevención de la enfermedad en poblaciones humanas o de ganado. Aunque se detectaron respuestas de anticuerpos en infecciones provocadas por estos virus, no se han identificado anticuerpos monoclonales humanos (hmAb) frente a ninguno de los virus. Un número de estudios ha demostrado la importancia de los anticuerpos neutralizantes en la recuperación y protección frente a infecciones víricas (Dimitrov,

D. S. 2004 Nat Rev Microbiol 2:109-122). Por lo tanto, el desarrollo de hmAb neutralizantes frente a NiV y HeV podría tener implicaciones importantes para la profilaxis e inmunoterapia pasiva. Además, la caracterización de los epítopos de los anticuerpos neutralizantes podría proporcionar información útil para el desarrollo de vacunas y fármacos candidatos. Finalmente, tales anticuerpos se podrían usar para el diagnóstico y como agentes de investigación.

J. Virol. 78(2):834-840 (2004) divulga el uso de glucoproteínas G y F del virus Nipah para vacunar hámsteres. Virology 296:190-200 (2002) divulga que las glucoproteínas G y F del virus Nipah inducen una respuesta de anticuerpos neutralizantes en ratones. Virology 271:334-349 (2000) divulga que las proteínas de los virus Nipah y Hendra comparten grados variables de homología de aminoácidos.

Transición a la invención

En el presente documento, los inventores notifican la identificación de hmAb neutralizantes potentes dirigidos a la glucoproteína G de cubierta vírica, usando como antígeno una glucoproteína G de HeV soluble (sG) oligomérica, 65 muy purificada, para la detección selectiva en una gran biblioteca de presentación en fagos humana sin exposición previa. Uno de estos anticuerpos mostró una potencia excepcional frente a HeV infeccioso y otro neutralizó tanto a

HeV como a NiV. Debido a que estos anticuerpos son anticuerpos completamente humanos, sirven como base para la profilaxis y tratamiento de seres humanos infectados con HeV o NiV.

Sumario de la invención

5 La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a o neutralizan los virus Hendra o Nipah. La invención proporciona anticuerpos humanos que retienen la capacidad para unirse a los virus Hendra o Nipah y composiciones farmacéuticas que incluyen tales anticuerpos. La invención proporciona además ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos de la invención y células huéspedes transformadas con ellos. Adicionalmente, la invención proporciona métodos profilácticos, terapéuticos y de diagnóstico que emplean los anticuerpos de la invención.

Breve descripción de las figuras

15 Figura 1: Actividad inhibidora significativamente mayor de IgG1 m101 que Fab m101 en la fusión celular mediada por Env de HeV. Células HeLa-USU se infectaron con recombinantes del virus vacunal que codifican las glucoproteínas F y G de HeV y con un recombinante del virus vacunal que codifica la ARN polimerasa de T7 (células efectoras). Cada tipo de célula diana designado se infectó con el virus vacunal indicador vCB21R, que codifica lacZ de E. coli. IgG1 m101 y Fab m101 se preincubaron con células efectoras y después se mezclaron con células diana. El ensayo de fusión celular se llevó a cabo durante 2, 5 horas a 37 ºC. La fusión se midió como se describe en el Ejemplo 1. En A se muestra la inhibición de la fusión mediada por Env de HeV por IgG1 m101 y Fab m101 en las células HeLa-ATCC y en B se muestra la de las células PCI-13. El porcentaje de fusión se muestra como función de la concentración de anticuerpos. Las curvas representan el mejor ajuste de los datos experimentales a partir del cual se calcularon las CI50 usando el software Prism GraphPad.

25 Figura 2: Inhibición mediante m101 de la formación de sincitios mediada por Env de HeV. Las células efectoras, preparadas como se describe en la leyenda de la Figura 1, se preincubaron con IgG1 m101, Fab m101 o el anticuerpo control irrelevante (X5 específico del VIH (Moulard, M. et al. 2002 Proc Natl Acad Sci USA 99:69136918)) durante 20 minutos a temperatura ambiente; después, 2 x 105 células en 200 µl se superpusieron sobre monocapas de células PCI-13 confluentes al 80 % colocadas en una placa de 48 pocillos y se incubaron durante 3 horas a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada. Se tomaron fotografías usando microscopio de contraste de fases, con un objetivo de 10 aumentos. Se muestran porciones ilustrativas de las fotografías originales que, por claridad, se amplifican electrónicamente. Las fotos superior e inferior del panel izquierdo muestran la formación de sincitios en ausencia de anticuerpo o en presencia de un anticuerpo control; se contaron 17 o 20 células fusionadas gigantes (sincitios) por vista fotográfica completa, respectivamente. Las

35 fotos superior e inferior del panel derecho muestran la inhibición completa de la formación de sincitios mediante IgG1 m101 o la reducción a 10 µg/ml mediante Fab m101 en el número de sincitios; había 0 o 9 sincitios por vista completa, respectivamente. Figura 3. Inmunoprecipitación de glucoproteínas G de HeV y NiV mediante los Fab anti-glucoproteína G. Se infectaron células HeLa con WR, un virus vacunal control o un virus vacunal recombinante que expresa la glucoproteína G de HeV o la glucoproteína G de NiV marcada con myc, y, comenzando 6 horas de después de la infección, se marcaron con [35S] metionina-cisteína a 37 ºC durante la noche. Los lisados se obtuvieron en tampón que contiene Triton X-100 y se incubaron con diversos Fab o con 9E10 de ratón anti-myc durante al menos 1 hora a 4 ºC y después se precipitaron con proteína G Sepharose. Las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron mediante SDS-PAGE al 10 %, seguido de autorradiografía. WR representa un control, en el que las

45 células se infectaron con el virus vacunal de tipo salvaje; X5 es un anticuerpo control específico de gp 120 del VIH, y 9E10 es un anticuerpo anti-c-Myc que sirve como control positivo. También se muestran los geles para m108 y m109. Las flechas al lado de G representan la posición de las bandas correspondientes a la G monomérica. Figura 4. Competición entre anticuerpos anti-G y efrina-B2 por la unión a la glucoproteína G de Hendra. Fab m101, IgG1 m101 y Fab m106, diluidos en serie, se mezclaron con G de Hendra y se añadieron al receptor vírico efrina-B2 revestido sobre el fondo de una placa de 96 pocillos y la cantidad de G unida se midió como se describe en el Ejemplo 1. Como control, se usó un Fab específico de la proteína S de SARS-CoV. Figura 5. Unión de m101 y m102 a mutantes de alanina de la proteína G de HeV. Células HeLa transfectadas con G de HeV de tipo salvaje, diversos mutantes de alanina de G de HeV o pMC02 (vector vacío), se infectaron

55 con el virus vacunal WR para llevar a cabo la expresión, se radiomarcaron con [35S] metionina-cisteína toda la noche, se lisaron en tampón que contiene Triton X-100 y se sometieron a inmunoprecipitación mediante m101, m102, o antisueros contra G policlonales de conejo. Los lisados se precipitaron después con proteína G Sepharose y se analizaron mediante SDS-PAGE al 10 %, seguido de autorradiografía. Figura 6. Comparación de la actividad inhibidora de m101, m102.4 Fab e IgG1, y m102 Fab en la fusión celular mediada por Env de HeV. Células HeLa-USU se infectaron con recombinantes del virus vacunal que codifican las glucoproteínas F y G de HeV y con un recombinante del virus vacunal que codifica la ARN polimerasa de T7 (células efectoras). La célula diana U373 se infectó con el virus vacunal indicador vCB21R, que codifica lacZ de

E. coli. Los anticuerpos diluidos en serie se preincubaron con las células efectoras durante 0,5 horas y después se mezclaron con células diana. El ensayo de fusión celular se llevó a cabo durante 2,5 horas a 37 ºC. La fusión

65 se midió como se describe en el Ejemplo 1. Las concentraciones de anticuerpos se representaron gráficamente frente al ensayo de Beta-Gal, leyendo a 595 nm.

Figura 7. Actividad inhibidora de m102.4 Fab e IgG1 significativamente mayor que la de m102 Fab en la fusión celular mediada por NiV-Env. Células HeLa-USU se infectaron con recombinantes del virus vacunal que codifican las glucoproteínas F y G de NiV y con un recombinante del virus vacunal que codifica la ARN polimerasa de T7 (células efectoras). La célula diana U373 se infectó con el virus vacunal indicador vCB21R, que codifica lacZ de

E. coli. Los anticuerpos se preincubaron con las células efectoras durante 0,5 horas y después se mezclaron con células diana. El ensayo de fusión celular se llevó a cabo durante 2,5 horas a 37 ºC. La fusión se midió como se describe en el Ejemplo 1. Las concentraciones de anticuerpos se representaron gráficamente frente al ensayo de Beta-Gal, leyendo a 595 nm. Figura 8. CDR1-3 y FR1-4 para mutantes m101-117 y m102.

Descripción detallada de la forma de realización preferida

El virus Hendra (HeV) y el virus Nipah (NiV) son virus emergentes estrechamente relacionados, que comprenden el género Henipavirus de los Paramyxoviridae. Cada uno tiene un amplio tropismo de especie y puede provocar una 5 elevada mortalidad en huéspedes tanto animales como humanos. Estos virus infectan células mediante un suceso de fusión de membranas independiente del pH, mediado por sus proteínas de cubierta (Env) de unión (G) y de fusión (F). Se seleccionaron siete Fab, m101-7, en busca de su unión significativa a una forma soluble de G de Hendra (sG), que se usó como el antígeno para producir una gran biblioteca de anticuerpos humanos sin exposición previa. Los Fab seleccionados inhibieron en diversos grados la fusión celular mediada por las Env de HeV o de NiV 10 y la infección vírica. La conversión del neutralizante más potente de HeV infeccioso, Fab m101, en IgG1 aumentó significativamente su actividad inhibidora de la fusión celular – la CI50 disminuyó más de 10 veces hasta aproximadamente 1 µg/ml. La IgG1 m101 también fue excepcionalmente potente neutralizando el HeV infeccioso; la neutralización total (100 %) se logró con 12,5 µg/ml, y la neutralización del 98 % sólo necesitó 1,6 µg/ml. La inhibición de la fusión y la infección se correlacionó con la unión de los Fab a glucoproteína G de longitud completa, 15 según se mide mediante inmunoprecipitación, y se correlacionó menos con la unión a sG, según se mide mediante ELISA y Biacore. M101 y m102 compitieron con la efrina-B2, que se identificó recientemente como un receptor funcional para HeV y NiV, lo que indica un posible mecanismo de neutralización mediante estos anticuerpos. Los anticuerpos m101, m102 y m103 compitieron entre sí, lo que indica que se unen a epítopos solapantes que son distintos de los epítopos de m106 y m107. En un intento inicial por localizar los epítopos de m101 y m102, se midió 20 su unión a un panel de 10 mutantes de barrido de alanina de G y se identificó un resto, G183, que disminuye la unión tanto de m101 como de m102 a G; está localizado en la base de la cabeza globular de la proteína G, según una estructura modelo, y podría ser parte del epítopo del anticuerpo que no solapa en G con el sitio de unión al receptor. Estos resultados indican que m101-7 son específicos de HeV o NiV, o de ambos, y muestran diversa actividad neutralizante; son los primeros anticuerpos monoclonales humanos identificados frente a estos virus, y se

25 contemplan para su uso en el tratamiento, profilaxis y diagnóstico, y como reactivos de investigación y sirven como base para vacunas.

Definiciones

30 A menos que se defina otra cosa, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la técnica a la que esta invención pertenece entiende habitualmente. Véase, por ejemplo, Singleton P y Sainsbury D., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3ª ed., J. Wiley & Sons, Chichester, New York, 2001, y Fields Virology 4ª ed., Knipe D.M. y Howley P.M. eds, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia 2001

35 Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” significa una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de una molécula de inmunoglobulina, que tiene la capacidad para unirse específicamente a un antígeno particular. Los anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la materia de inmunología. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” significa no solo moléculas de anticuerpos de longitud completa, sino

40 también fragmentos de moléculas de anticuerpos que retienen la capacidad de unirse al antígeno. Tales fragmentos también son bien conocidos en la técnica y se emplean de forma habitual tanto in vitro como in vivo. En particular, como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” significa no solo moléculas de inmunoglobulina de longitud completa sino también fragmentos activos de unión a antígeno, tales como los fragmentos activos bien conocidos F(ab')2, Fab, Fv y Fd.

45 Como se usan en el presente documento las expresiones “enfermedad del virus Hendra” y “enfermedad del virus Nipah” se refieren a enfermedades provocadas, directa o indirectamente, por la infección con virus Hendra o Nipah. Los amplios tropismos de la especie y la capacidad para provocar una enfermedad mortal tanto en animales como en seres humanos distinguen a los virus Hendra (HeV) y Nipah (NiV) de todos los otros paramixovirus conocidos

50 (Eaton, B. T. 2001 Microbes Infect 3:277-278). Estos virus se pueden amplificar y provocar enfermedad en animales grandes, y se pueden transmitir a seres humanos, en los que la enfermedad se manifiesta como una enfermedad respiratoria grave y encefalitis febril.

Como se usa en el presente documento con respecto a los polipéptidos, la expresión “sustancialmente puro”

55 significa que los polipéptidos están esencialmente libres de otras sustancias con las que se pueden encontrar en la naturaleza o sistemas in vivo en un grado práctico y apropiado para su uso previsto. En particular, los polipéptidos son suficientemente puros y están suficientemente libres de otros constituyentes biológicos de sus células huéspedes para ser útiles en, por ejemplo, la generación de anticuerpos, la secuenciación, o la producción de preparaciones farmacéuticas. Mediante técnicas bien conocidas en la materia, los polipéptidos sustancialmente

60 puros se pueden producir a la luz de las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos descritas en el presente documento. Debido a que un polipéptido sustancialmente purificado de la invención se puede mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el polipéptido puede comprender solo un cierto porcentaje en peso de la preparación. No obstante, el polipéptido es sustancialmente puro, en cuanto a que se ha separado sustancialmente de las sustancias con las que puede estar asociado en los sistemas vivos.

Como se usa en el presente documento con respecto a los ácidos nucleicos, el término “aislado” significa: (i) amplificado in vitro mediante, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) producido recombinantemente mediante clonación; (iii) purificado, mediante escisión o separación en gel; o (iv) sintetizado, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es aquel que es fácilmente manipulable mediante

5 técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia. De este modo, una secuencia nucleotídica contenida en un vector en el que se conocen los sitios de restricción de 5' y 3', o para el que se han divulgado las secuencias de los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se considera aislada, pero una secuencia de ácidos nucleicos que existe en su estado nativo en su huésped natural no lo está. Un ácido nucleico aislado puede estar sustancialmente purificado, pero no necesita estarlo. Por ejemplo, un ácido nucleico que está aislado dentro de un vector de clonación o de expresión no es puro en cuanto a que puede comprender solo un pequeño porcentaje del material en la célula en la que reside. Sin embargo, tal ácido nucleico está aislado, ya que el término se usa en el presente documento debido a que es fácilmente manipulable mediante técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia.

15 Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia de codificación y las secuencias reguladoras están “unidas operablemente” cuando están enlazadas covalentemente de tal manera que se coloca la expresión o transfección de la secuencia de codificación bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias de codificación sean traducidas en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas operablemente si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras de 5' da como resultado la transcripción de la secuencia de codificación y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento del marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias de codificación, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente para ser traducido en una proteína. De este modo, una región promotora estaría unida operablemente a una secuencia de codificación si la región promotora fuese capaz de efectuar la

25 transcripción de esa secuencia de ADN de tal manera que el transcrito resultante puede ser traducido en la proteína

o polipéptido deseado.

La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre especies o tipos celulares, pero en general debe incluir, según sea necesario, las secuencias que no se transcriben en 5' y las secuencias que no se traducen en 5' implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción respectivamente, tales como una caja TATA, una secuencia de protección, una secuencia CAAT. Especialmente, tales secuencias reguladoras que no se transcriben en 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido operablemente. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en dirección 5', según se desee.

35 Como se usa en el presente documento, un “vector” puede ser cualquiera de un número de ácidos nucleicos en el que se puede insertar una secuencia deseada mediante restricción y ligación para transporte entre diferentes entornos genéticos o para la expresión en una célula huésped. Los vectores están compuestos típicamente por ADN, aunque también existen vectores de ARN. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos y fagémidos. Un vector de clonación es aquel que es capaz de replicarse en una célula huésped y que se caracteriza además por uno o más sitios de restricción de endonucleasas, en los que el vector se puede cortar de una manera determinable, y en los que se puede ligar una secuencia de ADN deseada de tal manera que el nuevo vector recombinante retiene su capacidad para replicarse en la célula huésped. En el caso de plásmidos, la replicación de la secuencia deseada puede producirse muchas veces a medida que el aumenta el número de copias del plásmido dentro de la bacteria

45 huésped o solo una única vez por huésped antes de que el huésped se reproduzca por mitosis. En el caso del fago, la replicación se puede producir activamente durante una fase lítica o pasivamente durante una fase lisogénica. Un vector de expresión es aquel en el que se puede insertar una secuencia de ADN deseada mediante restricción y ligación, de manera que está unida operablemente a secuencias reguladoras y se puede expresar como un transcrito de ARN. Los vectores pueden contener además una o más secuencias marcadoras adecuadas para su uso en la identificación y la selección de células que se han transformado o transfectado con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas e incrementan o disminuyen la resistencia o sensibilidad a los antibióticos o a otros compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades son detectables mediante ensayos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, β-galactosidasa o fosfatasa alcalina) y genes que afectan visiblemente al fenotipo de las células, huéspedes, colonias o placas transformados o transfectados. Los

55 vectores preferidos son aquellos capaces de realizar una replicación y una expresión autónomas de los productos génicos estructurales presentes en los segmentos de ADN a los que están unidos operablemente.

Nuevos anticuerpos monoclonales anti-glucoproteína G de HeV y de NiV

La presente invención deriva, en parte, del aislamiento y la caracterización de nuevos anticuerpos monoclonales completamente humanos que se unen selectivamente a los virus Hendra y Nipah y los neutralizan. Como se describe de forma más completa más adelante, se ha demostrado que estos anticuerpos monoclonales se unen a la glucoproteína G y neutralizan los virus Hendra y Nipah. El paratopo de los fragmentos Fab anti-HeV y NiV asociados con el epítopo de neutralización en la glucoproteína G de HeV y NiV se define mediante las secuencias de

65 aminoácidos (aa) de las regiones V de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina descritas en las Tablas A y B y en la SEC ID Nº 1 ala SEC ID Nº: 416.

En un conjunto de formas de realización, la presente invención proporciona los anticuerpos monoclonales completamente humanos y de longitud completa frente a Hendra y Nipah, en forma aislada y en preparaciones farmacéuticas. De forma similar, como se describe más adelante, la presente invención proporciona ácidos nucleicos

5 aislados, células huéspedes transformadas con ácidos nucleicos y preparaciones farmacéuticas, incluidos ácidos nucleicos aislados, que codifican los anticuerpos monoclonales completamente humanos y de longitud completa frente a Hendra y Nipah. Por último, la presente invención proporciona métodos, como se describe de forma más completa más adelante, que emplean estos anticuerpos en el diagnóstico in vitro e in vivo, la prevención y el tratamiento de la enfermedad por el virus Hendra o de la enfermedad por el virus Nipah.

De forma significativa, como es bien conocido en la técnica, solo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epítopo (véanse, en general, Clark, W.R. 1986 en The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. 1991 en Essential Immunology, 7ª Ed., Blackwell Scientific-Publications, Oxford). Por ejemplo, las regiones pFc' y Fc son

15 efectoras de la cascada del complemento, pero no están implicadas en la unión al antígeno. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc' o que se ha producido sin la región pFc', denominado un fragmento F(ab')2 retiene ambos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo de longitud completa. De un modo similar, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región Fc o que se ha producido sin la región Fc, denominado un fragmento Fab retiene ambos sitios de unión al antígeno de un anticuerpo de longitud completa. Continuando más allá, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una porción de la cadena pesada del anticuerpo denominada Fd. Los fragmentos Fd son el determinante principal de la especificidad del anticuerpo (un único fragmento Fd puede estar asociado con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd retienen la capacidad de unión al epítopo en aislamiento.

25 Dentro de la porción de un anticuerpo que se une al antígeno, como es bien conocido en la técnica, hay regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que interaccionan directamente con el epítopo del antígeno, y regiones de armazón estructural (FR), que mantienen la estructura terciaria del paratopo (véanse, en general, Clark, 1986, citado anteriormente; Roitt, 1991, citado anteriormente). En el fragmento Fd tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG hay cuatro regiones de armazón estructural (FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3). Las CDR, y en particular las regiones CDR3, y más particularmente la CDR3 de cadena pesada, son principalmente responsables de la especificidad del anticuerpo.

35 En el presente documento se divulgan las secuencias de aminoácidos completas de las porciones Fab de unión al antígeno de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah, así como las regiones FR y CDR relevantes. Las SEC ID Nº 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129.145.161.177.193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385 y 401 divulgan las secuencias de aminoácidos del fragmento Fd de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah. Las secuencias de aminoácidos de las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 de la cadena pesada se divulgan como (FR1, SEC ID Nº 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, y 402); (CDR1, SEC ID Nº 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 387, y 403); (FR2, SEC ID Nº 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, y 404); (CDR2, SEC ID Nº 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357,

45 373, 389, y 405); (FR3, SEC ID Nº 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, y 406); (CDR3, SEC ID Nº 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 391, y 407); y (FR4, SEC ID Nº 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392 y 408). Las SEQ ID Nº: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 393 y 409 divulgan las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah. Las secuencias de aminoácidos de las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 de la cadena ligera se divulgan como (FR1, SEC ID Nº 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, y 410); (CDR1, SEC ID Nº 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, y 411); (FR2, SEC ID Nº 12, 28, 44,

55 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, y 412); (CDR2, SEC ID Nº 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 397, y 413); (FR3, SEC ID Nº 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, y 414); (CDR3, SEC ID Nº 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 399, y 415); (FR4, SEC ID Nº 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384.400 y 416).

Ahora está bien establecido en la técnica que las regiones no CDR de un anticuerpo de mamífero se pueden sustituir por regiones similares de anticuerpos conespecíficos o heteroespecíficos, al tiempo que retienen la especificidad epitópica del anticuerpo original. Esto se manifiesta más claramente en el desarrollo y uso de 65 anticuerpos “humanizados”, en los que las CDR no humanas se unen covalentemente a las regiones FR y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional. De este modo, por ejemplo, la publicación internacional PCT

número WO 92/04381 enseña la producción y uso de anticuerpos anti-RSV murinos humanizados, en los que al menos una porción de las regiones FR murinas han sido sustituidas por regiones FR de origen humano. Tales anticuerpos, incluyendo los fragmentos de anticuerpos de longitud completa con capacidad para unirse al antígeno, se denominan a menudo anticuerpos “quiméricos”.

5 De este modo, como se pondrá de manifiesto para el experto en la materia, en el presente documento se describen fragmentos F(ab')2, Fab, Fv y Fd de anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah; anticuerpos quiméricos en los que las regiones Fc, y/o FR, y/o CDR1, y/o CDR2, y/o CDR3 de la cadena ligera de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas; anticuerpos de fragmentos F(ab')2 quiméricos en los que las regiones FR, y/o CDR1, y/o CDR2, y/o CDR3 de la cadena ligera, de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah se han sustituido por secuencias humanas

o no humanas homólogas; anticuerpos de fragmentos Fab quiméricos en los que las regiones FR, y/o CDR1, y/o CDR2, y/o CDR3 de la cadena ligera se han sustituido por secuencias humanas o no humanas homólogas; y anticuerpos de fragmentos Fd quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han sustituido por

15 secuencias humanas o no humanas homólogas. De este modo, los expertos en la materia pueden alterar los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah mediante la construcción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos quiméricos o injertados con CDR que contienen todas, o parte, de las secuencias de aminoácidos de CDR de la región V de las cadenas pesada y ligera divulgadas (Jones, P.T. et al. 1986 Nature 321:522-525; Verhoeyen, M. et al. 1988 Science 39:1534-1536; y Tempest, P.R. et al. 1991 Biotechnology 9:266-271), sin destruir la especificidad de los anticuerpos por el epítopo de la glucoproteína G. Tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos quiméricos o injertados con CDR pueden ser eficaces en la prevención y tratamiento de la infección por los virus Hendra o Nipah en animales (por ejemplo, caballos) y en el ser humano.

En formas de realización preferidas, los anticuerpos quiméricos de la invención son anticuerpos monoclonales

25 completamente humanos que incluyen al menos la región CDR3 de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah. Como se señala anteriormente, se pueden producir tales anticuerpos quiméricos en los que algunas o todas las regiones FR de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah se han sustituido por otras regiones FR humanas homólogas. Además, las porciones Fc se pueden sustituir a fin de producir anticuerpos IgA o IgM, así como IgG, que poseen algunas o todas las CDR de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah. De particular importancia es la inclusión de la región CDR3 de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah, y, en menor grado, las otras CDR de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah. Tales anticuerpos completamente humanos o quiméricos tendrán utilidad particular en cuanto a que no provocan una respuesta inmunitaria frente al propio anticuerpo.

35 También es posible, como se describe en el presente documento, producir anticuerpos quiméricos que incluyen secuencias no humanas. De este modo, se pueden usar, por ejemplo, secuencias Fc o FR murinas, ovinas, equinas, bovinas, o de otros mamíferos, para sustituir algunas o todas las regiones Fc o FR de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah. Asimismo, se pueden sustituir algunas de las CDR. De nuevo, sin embargo, se prefiere que al menos la CDR3 de la cadena pesada de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah se incluyan en tales anticuerpos quiméricos, y, en menor medida, también se prefiere incluir algunas o todas las demás CDR de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah. Tales anticuerpos quiméricos portadores de secuencias de inmunoglobulinas no humanas mezcladas con las CDR de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah no son preferidos para su uso en seres humanos, y particularmente no se prefieren para un uso amplio debido a que pueden provocar una respuesta inmunitaria frente a las secuencias no humanas. Por supuesto, se pueden usar

45 durante breves períodos o en individuos inmunodeprimidos, pero, de nuevo, se prefieren los anticuerpos monoclonales completamente humanos. Sin embargo, debido a que los virus Hendra y Nipah también infectan a animales, y debido a que tales anticuerpos se pueden usar durante breves períodos o en sujetos inmunodeprimidos, en el presente documento se describen los anticuerpos quiméricos que poseen secuencias de Fc y FR de mamíferos no humanos, pero que incluyen al menos la CDR3 de la cadena pesada de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah.

Para usos profilácticos o de inoculación, los anticuerpos de la presente invención son preferentemente moléculas de anticuerpos de longitud completa que incluyen la región Fc. Tales anticuerpos de longitud completa tendrán semividas más largas que los anticuerpos de fragmentos más pequeños (por ejemplo, Fab) y son más adecuados

55 para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutánea, o transdérmica.

En algunas formas de realización, se prefieren fragmentos Fab, incluyendo fragmentos Fab quiméricos. Los Fab ofrecen varias ventajas con respecto a F(ab')2 y moléculas de inmunoglobulina completas para esta modalidad terapéutica. En primer lugar, debido a que los Fab tienen solo un sitio de unión para su antígeno afín, se evita la formación de complejos inmunitarios, mientras que tales complejos se pueden generar cuando los F(ab')2 bivalentes y las moléculas de inmunoglobulina completas encuentran su antígeno diana. Esto es de suma importancia debido a que la deposición de complejos inmunitarios en los tejidos puede producir reacciones inflamatorias adversas. En segundo lugar, debido a que los Fab carecen de una región Fc, no pueden desencadenar reacciones inflamatorias adversas activadas por Fc, tales como la activación de la cascada del complemento. En tercer lugar, es probable 65 que la penetración en los tejidos de la molécula pequeña Fab sea mucho mejor que la del anticuerpo completo más grande. En cuarto lugar, los Fab se pueden producir fácilmente y de forma barata en bacterias, tales como E. coli,

mientras que las moléculas de anticuerpos de tipo inmunoglobulina completos requieren células de mamíferos para su producción en cantidades útiles. Esto último supone la transfección de secuencias de inmunoglobulina en células de mamíferos, con la transformación resultante. Después, la amplificación de estas secuencias se debe lograr mediante procedimientos selectivos rigurosos y los transformantes estables se deben identificar y mantener. Las

5 moléculas de inmunoglobulina completas se deben de producir en células de mamíferos de alta expresión transformadas de forma estable en cultivo, con los problemas concomitantes del medio de cultivo que contiene suero. Por el contrario, la producción de los Fab en E. coli elimina estas dificultades y hace posible producir estos fragmentos de anticuerpos en grandes fermentadores, que son más baratos que los productos derivados del cultivo.

Además de los Fab, también se contemplan en la presente invención fragmentos de anticuerpos más pequeños y péptidos de unión al epítopo que tienen una especificidad de unión por los epítopos definidos por los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah, y también se pueden usar para unirse al virus o neutralizarlo. Por ejemplo, los anticuerpos monocatenarios se pueden construir de acuerdo con método de la patente de EE.UU. nº 4.946.778, de Ladner et al. Los anticuerpos monocatenarios comprenden las regiones variables de las cadenas ligera y pesada,

15 unidas mediante un resto enlazador flexible. Aún más pequeño es el fragmento de anticuerpo conocido como el anticuerpo de un solo dominio o Fd, que comprende un dominio único de VH aislado. Las técnicas para obtener un anticuerpo de un solo dominio con al menos algo de la especificidad de unión del anticuerpo de longitud completa del que deriva se conocen en la materia.

Es posible determinar, sin experimentación innecesaria, si un anticuerpo alterado o quimérico tiene la misma especificidad que los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah averiguando si el primero bloquea a estos últimos en la unión a glucoproteína G. Si el anticuerpo monoclonal que se está analizando compite con el anticuerpo monoclonal frente a Hendra o Nipah según se muestra mediante una disminución en la unión del anticuerpo monoclonal frente a Hendra o Nipah, es probable que los dos anticuerpos monoclonales se unan al mismo epítopo,

25 o a un epítopo situado muy próximo. Todavía otra manera para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah es preincubar el anticuerpo monoclonal frente a Hendra o Nipah con la glucoproteína G con la que normalmente es reactivo y después añadir el anticuerpo monoclonal que se está analizando, para determinar si se inhibe la capacidad para unirse a la glucoproteína G del anticuerpo monoclonal que se está analizado. Si el anticuerpo monoclonal que se está analizando es inhibido, con toda probabilidad tiene el mismo epítopo y especificidad, o un equivalente funcionalmente, que los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah de la invención. La detección selectiva de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah también se puede llevar a cabo utilizando los virus Hendra o Nipah, y determinando si el mAb neutraliza los virus.

35 Usando los anticuerpos de la invención, ahora es posible producir anticuerpos antiidiotípicos que se pueden usar para identificar otros anticuerpos monoclonales para saber si el anticuerpo tiene la misma especificidad de unión que un anticuerpo de la invención. Además, tales anticuerpos antiidiotípicos se pueden usar para la inmunización activa (Herlyn, D. et al. 1986 Science 2,32:100-102). Tales anticuerpos antiidiotípicos se pueden producir usando técnicas de hibridomas bien conocidas (Kohler, G. y Milstein, C. 1975 Nature 256:495-497). Un anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos presentes en el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de interés. Estos determinantes están situados en la región hipervariable del anticuerpo. Es esta región la que se une a un epítopo dado y, de este modo, es responsable de la especificidad del anticuerpo. Un anticuerpo antiidiotípico se puede preparar inmunizando a un animal con el anticuerpo monoclonal de interés. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante y producirá un

45 anticuerpo contra estos determinantes idiotípicos. Usando los anticuerpos antiidiotípicos del animal inmunizado, que son específicos de los anticuerpos monoclonales de la invención, es posible identificar otros clones con el mismo idiotipo que el anticuerpo del hibridoma usado para la inmunización. La identidad idiotípica entre anticuerpos monoclonales de dos líneas celulares demuestra que los dos anticuerpos monoclonales son los mismos con respecto a su reconocimiento del mismo determinante epitópico. De este modo, usando anticuerpos antiidiotípicos es posible identificar otros hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales que tienen la misma especificidad epitópica.

También es posible usar la tecnología de antiidiotipos para producir anticuerpos monoclonales que imitan a un epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal antiidiotípico obtenido frente a un primer anticuerpo monoclonal

55 tendrá un dominio de unión en la región hipervariable que es la imagen del epítopo unido por el primer anticuerpo monoclonal. De este modo, el anticuerpo monoclonal antiidiotípico se puede usar para la inmunización, puesto que el dominio de unión del anticuerpo monoclonal antiidiotípico actúa eficazmente como un antígeno.

Ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-glucoproteína G de HeV y NiV

Dada la presente divulgación de las secuencias de aminoácidos de los dominios Fd de la cadena pesada y variable de la cadena ligera de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah, el experto en la materia es ahora capaz de producir ácidos nucleicos que codifican este anticuerpo o que codifican los diversos fragmentos de anticuerpos o anticuerpos quiméricos descritos anteriormente. Se contempla que tales ácidos nucleicos estarán 65 unidos operablemente a otros ácidos nucleicos que forman un vector recombinante para la clonación o para la expresión de los anticuerpos de la invención. La presente invención incluye cualquier vector recombinante que

contenga las secuencias de codificación, o parte de ellas, ya sea para la transformación, transfección procariotas o eucariotas, o para la terapia génica. Tales vectores se pueden preparar usando técnicas de biología molecular convencionales, conocidas por los expertos en la materia, y comprenderían secuencias de codificación de ADN para las regiones V de inmunoglobulina de los anticuerpos monoclonales frente a Hendra y Nipah, incluyendo el armazón

5 estructural y las CDR o sus partes, y un promotor adecuado con (Whittle, N. et al. 1987 Protein Eng 1:499-505 y Burton, D.R. et al. 1994 Science 266:1024-1027) o sin (Marasco, W.A. et al, 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:78897893 y Duan, L. et al 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91:5075-5079) una secuencia señal para la exportación o secreción. Tales vectores se pueden transformar o transfectar en células procariotas (Huse, W.D. et al. 1989 Science 246:12755-1281; Ward, S. et al. 1989 Nature 341:544-546; Marks, J.D. et al. 1991 J Mol Biol 222:581-597; y Barbas, C.F, et al. 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982) o eucariotas (Whittle, N. et al. 1987 Protein Eng 1:499-505 y Burton, D.R. et al. 1994 Science 266:1024-1027) o se pueden usar para terapia génica (Marasco, W.A. et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:7889-7893 y Duan, L. et al. 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91:5075-5079) mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

15 Los vectores de expresión de la presente invención incluyen secuencias reguladoras unidas operablemente a una secuencia nucleotídica que codifica uno de los anticuerpos de la invención. Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencias reguladoras” significa secuencias nucleotídicas que son necesarias para, o que conducen a, la transcripción de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido deseado, y/o que son necesarias para,

o que conducen a, la traducción del transcrito resultante en el péptido deseado. Las secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, secuencias en 5', tales como operadores, promotores y secuencias de unión al ribosoma, y secuencias en 3', tales como señales de poliadenilación. Los vectores de la invención pueden incluir opcionalmente secuencias líder o señal en 5', secuencias en 5' o 3' que codifican productos de fusión para ayudar a la purificación de proteínas y diversos marcadores que ayudan a identificar o seleccionar los transformantes. La elección y diseño de un vector apropiado está dentro de la capacidad y discreción de un experto en la materia. La

25 purificación posterior de los anticuerpos se puede lograr mediante cualquiera de diversos medios estándar conocidos en la técnica.

Un vector preferido para identificar anticuerpos monoclonales, pero no necesariamente preferido para la producción en masa de los anticuerpos de la invención, es una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia nucleotídica que codifica y que es capaz de expresar un polipéptido de fusión que contiene, en la dirección desde el extremo amino al extremo carboxi, (1) un dominio de señal de la secreción procariota, (2) un polipéptido de la invención, y, opcionalmente, (3) un dominio de proteína de fusión. El vector incluye secuencias reguladoras de ADN para expresar el polipéptido de fusión, preferentemente secuencias reguladoras procariotas. Los expertos en la materia pueden construir dichos vectores y se han descrito en Smith, G.P et al. (1985 Science 228:13151317);

35 Clackson, T. et al. (1991 Nature 352:624-628); Kang et al (1991 en Methods: A Companion to Methods in Enzymology, vol. 2, R. A. Lerner y D.R. Burton, ed. Academic Press, NY, págs. 111-118); Barbas, C.F. et al. (1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982); Roberts, B. L. et al. (1992 Proc Natl Acad Sci USA 89:2429-2433).

Un polipéptido de fusión puede ser útil para la purificación de los anticuerpos de la invención. El dominio de fusión puede incluir, por ejemplo, una cola de poli-His que permite la purificación en columnas de Ni+ o la proteína de unión a maltosa del vector pMAL disponible comercialmente (New England BioLabs, Beverly, MA). Un dominio de fusión actualmente preferido, pero de ningún modo necesario, es un anclaje de membrana de fago filamentoso. Este dominio es particularmente útil para identificar bibliotecas de presentación en fagos de anticuerpos monoclonales, pero puede ser de menor utilidad para la producción en masa de anticuerpos. El anclaje de membrana de fago

45 filamentoso es, preferentemente, un dominio de la proteína de recubrimiento cpIII o cpVIII capaz de asociarse con la matriz de una partícula de fago filamentoso, de modo que incorpora el polipéptido de fusión sobre la superficie del fago, para permitir la unión en fase sólida a antígenos o epítopos específicos y permitir, de ese modo, el enriquecimiento y la selección de los anticuerpos o fragmentos específicos codificados por el vector fagémido.

La señal de secreción es un dominio de péptido líder de una proteína que dirige la proteína hacia la membrana de la célula huésped, tal como la membrana periplásmica de bacterias gramnegativas. Una señal de secreción preferida para E. coli es una señal de secreción de pelB. La secuencia líder de la proteína pelB se ha usado previamente como una señal de secreción para proteínas de fusión (Better, M. et al. 1988 Science 240:1041-1043; Sastry, L. et al. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:5728-5732; y Mullinax, R.L. et al., 1990 Proc Natl Acad Sci USA 87:8095-8099).

55 Se pueden encontrar secuencias de restos de aminoácidos para otros dominios polipeptídicos de señales de secreción procedentes de E. coli útiles en la presente invención en Neidhard, F.C. (ed), 1987 en Escherichia coli and Salmonella Typhimurium: Typhimurium Cellular and Molecular Biology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.

Para lograr niveles elevados de expresión génica en E. coli es necesario usar no solo promotores potentes para generar grandes cantidades de ARNm, sino también sitios de unión al ribosoma, para asegurarse de que el ARNm se traduce eficientemente. En E. coli, el sitio de unión al ribosoma incluye un codón de iniciación (AUG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud situada 3-11 nucleótidos en dirección 5' del codón de iniciación (Shine J. y Dalgamo L. 1975 Nature 254:34-38). La secuencia, que se denomina secuencia de Shine-Dalgarno (SD) es 65 complementaria del extremo 3' del ARNr 16S de E. coli. La unión del ribosoma al ARNm y a la secuencia en el extremo 3' del ARNm se puede ver afectada por varios factores: el grado de complementariedad entre la secuencia

de SD y el extremo 3' del ARNr 16S; el espaciamiento que existe entre la secuencia de SD y el AUG; y la secuencia nucleotídica después del AUG, que afecta a la unión del ribosoma. Las secuencias reguladoras de 3' definen al menos un codón de terminación (parada) en marco con y unido operablemente al polipéptido de fusión heterólogo.

5 En formas de realización preferidas con un huésped de expresión procariota, el vector utilizado incluye un origen de replicación o replicón procariota, es decir, una secuencia de ADN que tiene la capacidad para dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extracromosómicamente en una célula huésped procariota, tal como una célula huésped bacteriana, transformada con ella. Tales orígenes de replicación son bien conocidos en la técnica. Los orígenes de replicación preferidos son aquellos que son eficientes en el organismo huésped. Una célula huésped preferida es E. coli. Para uso de un vector en E. coli, un origen de replicación preferido es ColEl, encontrado en pBR322 y otros diversos plásmidos habituales. También se prefiere el origen de replicación p15A, encontrado en pACYC y sus derivados. Los replicones ColEl y p15A se han utilizado ampliamente en biología molecular, están disponibles en diversos plásmidos, y están descritos por Sambrook et al., 1989, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

15 Además, las formas de realización que incluyen un replicón procariota también incluyen preferentemente un gen cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como resistencia a fármacos, a un huésped bacteriano transformado con él. Los genes bacterianos de resistencia a fármacos típicos son aquellos que confieren resistencia a ampicilina, tetraciclina, neomicina/kanamicina o cloranfenicol. Los vectores también contienen típicamente sitios de restricción convenientes para la inserción de secuencias de ADN traducibles. Los ejemplos de vectores son los plásmidos pUC18 y pUC19 y vectores derivados, tales como aquellos comercialmente disponibles de proveedores tales como Invitrogen (San Diego, CA).

Cuando los anticuerpos como se describen en el presente documento incluyen secuencias tanto de la cadena

25 pesada como de la cadena ligera, estas secuencias se pueden codificar en vectores separados, o, de forma más conveniente, pueden estar expresadas por un único vector. Las cadenas pesada y ligera pueden formar, después de la traducción o después de la secreción, la estructura heterodimérica de las moléculas de anticuerpos naturales. Tal anticuerpo heterodímero puede estar estabilizado o no por enlaces disulfuro entre las cadenas pesada y ligera.

Un vector para la expresión de anticuerpos heterodímeros, tal como los anticuerpos de longitud completa de la invención, o los fragmentos de anticuerpos F(ab')2, Fab o Fv de la invención, es una molécula de ADN recombinante adaptada para recibir y expresar la primea y la segunda secuencias de ADN traducibles. Es decir, un vector de expresión de ADN para expresar un anticuerpo heterodímero proporciona un sistema para clonar (insertar) independientemente las dos secuencias de ADN traducibles en dos casetes separados presentes en el vector, para

35 formar dos cistrones separados para expresar los polipéptidos primero y segundo de un anticuerpo heterodimérico. El vector de expresión de ADN para expresar dos cistrones se denomina vector de expresión dicistrónico.

Preferentemente, el vector comprende un primer casete que incluye en dirección 5' y en dirección 3' secuencias reguladoras de ADN unidas operablemente a través de una secuencia de nucleótidos adaptada para la ligación direccional en un ADN de inserto. La secuencia traducible en dirección 5' codifica preferentemente la señal de secreción como se ha descrito en lo que antecede. El casete incluye secuencias reguladoras de ADN para expresar el primer polipéptido del anticuerpo que se produce cuando una secuencia de ADN traducible de inserto (ADN de inserto) se inserta direccionalmente en el casete a través de la secuencia de nucleótidos adaptada para la ligación direccional.

45 El vector de expresión dicistrónico también contiene un segundo casete para expresar el segundo polipéptido del anticuerpo. El segundo casete incluye una segunda secuencia de ADN traducible que codifica preferentemente una señal de secreción, como se ha descrito anteriormente, unida operablemente en su término 3' a través de una secuencia de nucleótidos adaptada para la ligación direccional a una secuencia de ADN en dirección 3' del vector que define típicamente al menos un codón de terminación en el marco de lectura del casete. La segunda secuencia de ADN traducible está unida operablemente en su extremo 5' a secuencias reguladoras de ADN que forman los elementos de 5'. El segundo casete es capaz, con la inserción de una secuencia de ADN traducible (ADN de inserto), de expresar el segundo polipéptido de fusión que comprende una señal de secreción con un polipéptido codificado por el ADN de inserto.

55 Por supuesto, los anticuerpos de la presente invención se pueden producir adicionalmente en células eucariotas, tales como células CHO, hibridomas humanos o de ratón, células linfoblastoides B inmortalizadas. En este caso, se construye un vector en el que las secuencias reguladoras eucariotas están unidas operablemente a las secuencias nucleotídicas que codifican el polipéptido o polipéptidos del anticuerpo. El diseño y selección de un vector eucariota apropiado está dentro de la capacidad y discreción de un experto en la materia. La purificación posterior de los anticuerpos se puede lograr mediante cualquiera de diversos medios estándar conocidos en la técnica.

Por supuesto, los anticuerpos de la presente invención pueden producirse además en plantas. En 1989, Hiatt A. et al. 1989 Nature 342:76-78 demostraron por primera vez que se podían producir anticuerpos funcionales en plantas

65 transgénicas. Desde entonces, se ha invertido una cantidad considerable de esfuerzo en desarrollar plantas para la producción de anticuerpos (o “planticuerpos”) (véanse revisiones en Giddings, G. et al. 2000 Nat Biotechnol 18:1151

1155; Fischer, R. y Emans, N. 2000 Transgenic Res 9:279-299). Los anticuerpos recombinantes pueden dirigirse a semillas, tubérculos o frutas, lo que la administración de anticuerpos en tales tejidos vegetales sea ventajosa para programas de inmunización en países en desarrollo y a nivel mundial.

5 En otra forma de realización, la presente invención proporciona células huéspedes, tanto procariotas como eucariotas, transformadas o transfectadas con, y por lo tanto que incluyen, los vectores de la presente invención. Diagnóstico y preparaciones farmacéuticas de anticuerpos frente a la glucoproteína G de HeV y NiV

Preparaciones

En el presente documento se describe un método para preparar composiciones de diagnóstico o farmacéuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales de la invención o secuencias polinucleotídicas que codifican los anticuerpos de la invención o partes de los mismos, usándose las composiciones farmacéuticas para inmunoprofilaxis o inmunoterapia de la enfermedad del virus Hendra o de la enfermedad del virus Nipah. La

15 preparación farmacéutica incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos, como se usan en el presente documento, significan un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. La expresión “fisiológicamente aceptable” se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo. Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. Los vehículos fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes, y otros materiales que son bien conocidos en la técnica.

En el presente documento se describen anticuerpos monoclonales cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 7 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la 25 SEC ID Nº 15; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 23 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 31; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 39 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 47; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 55 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 63; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 71 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 79; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 87 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 95; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 103 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 111; cuyas cadenas pesadas 35 comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 119 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 127; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 135 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 143; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 151 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 159; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 167 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 175; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 183 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 191; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 199 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 207; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la 45 SEC ID Nº 215 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 223; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 231 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 239; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 247 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 255; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 263 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 271; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 279 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 287; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 295 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 303; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 311 y/o cuyas cadenas ligeras 55 comprenden en CDR2 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 319; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 327 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 335; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 343 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 351; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 359 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 367; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 375 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 383; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 391 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 399; cuyas cadenas pesadas comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 407 y/o cuyas cadenas ligeras comprenden en CDR3 el polipéptido que tiene la 65 SEC ID Nº 415; y variaciones conservadoras de estos péptidos. La expresión “variación conservativa” como se usa en el presente documento representa la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto biológicamente similar.

Ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro o la sustitución de un residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina. La expresión “variación conservadora” también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos que

5 tengan el polipéptido sustituido también se unan a los virus Hendra o Nipah o los neutralicen. Análogamente, otra realización preferida de la invención se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos de cadena pesada señalados anteriormente y a secuencias polinucleotídicas que son complementarias de estas secuencias polinucleotídicas. Las secuencias polinucleotídicas complementarias incluyen aquellas secuencias que se hibridan con las secuencias polinucleotídicas de la invención en condiciones de hibridación restrictivas.

Los anticuerpos anti-Hendra y Nipah de la invención se pueden marcar mediante diversos medios para su uso en aplicaciones de diagnóstico y/o farmacéuticas. Existen muchos marcadores y procedimientos de marcaje diferentes conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden usar en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos

15 quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Los expertos en la materia conocerán otros marcadores adecuados para la unión a los anticuerpos monoclonales de la invención, o serán capaces de determinarlos usando experimentación normal. Además, la unión de estos marcadores a los anticuerpos monoclonales de la invención se puede realizar usando técnicas estándar, habituales para los expertos en la materia.

Otra técnica de marcaje que puede dar como resultado una mayor sensibilidad consiste en acoplar los anticuerpos a haptenos de peso molecular bajo. Estos haptenos se pueden alterar después específicamente por medio de una segunda reacción. Por ejemplo, es habitual usar haptenos, tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenol, piridoxal, o fluoresceína, que pueden reaccionar con anticuerpos específicos anti-haptenos.

25 Los materiales para su uso en el ensayo descrito en el presente documento son idealmente adecuados para la preparación de un kit. Tal kit puede comprender un vehículo que se compartimentaliza para recibir en estrecho confinamiento uno o más recipientes, tales como viales, tubos, comprendiendo cada uno de los recipientes uno de los elementos separados que se van a usar en el método. Por ejemplo, uno de los recipientes puede comprender un anticuerpo monoclonal de la invención que está, o puede estar, marcado de forma detectable. El kit también puede tener recipientes que contienen uno o más tampones, y/o un recipiente que comprende un medio indicador, tal como una proteína de unión a biotina, tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula indicadora, tal como un marcador enzimático o fluorescente.

Detección y diagnóstico in vitro

35 Los anticuerpos monoclonales de la invención son adecuados para su uso in vitro en, por ejemplo, inmunoensayos en los que se pueden usar en fase líquida o unidos a un vehículo en fase sólida. Además, los anticuerpos monoclonales en estos inmunoensayos se pueden marcar de forma detectable de diversas maneras. Los ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar los anticuerpos monoclonales de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto. Los ejemplos de tales inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo (inmunométrico) de tipo sándwich. La detección de antígenos usando los anticuerpos monoclonales de la invención se puede realizar utilizando inmunoensayos que se llevan a cabo de las formas directa, inversa o simultánea, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos sobre muestras fisiológicas. Los expertos en la materia conocerán, o pueden discernir fácilmente, otros formatos de inmunoensayos sin

45 experimentación excesiva.

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden unir a muchos vehículos diferentes y se pueden usar para detectar la presencia de los virus Hendra o Nipah. Los ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasa, celulosa natural y modificada, poliacrilamida, agarosa y magnetita. Para los fines de la invención, la naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble. Los expertos en la materia conocerán otros vehículos adecuados para unir anticuerpos monoclonales o serán capaces de averiguarlos usando experimentación habitual.

Para los fines de la invención, los virus Hendra o Nipah se pueden detectar mediante los anticuerpos monoclonales

55 de la invención cuando están presentes en fluidos biológicos y tejidos. Se puede usar cualquier muestra que contenga una cantidad detectable de virus Hendra o Nipah. Una muestra puede ser un líquido, tal como orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, o similar; un sólido o semisólido, tal como tejidos, heces, o similares; o, como alternativa, un tejido sólido, tales como los usados habitualmente en el diagnóstico histológico.

Detección in vivo de los virus Hendra o Nipah

Al usar los anticuerpos monoclonales de la invención para la detección in vivo de antígeno, el anticuerpo monoclonal marcado detectablemente se da en una dosis que es eficaz desde el punto de vista del diagnóstico. La expresión “eficaz desde el punto de vista del diagnóstico” significa que la cantidad de anticuerpo monoclonal marcado

65 detectablemente se administra en una cantidad suficiente para permitir la detección del sitio que tiene el antígeno del virus Hendra o Nipah para el cual son específicos los anticuerpos monoclonales.

La concentración de anticuerpo monoclonal marcado detectablemente que se administra debería de ser suficiente de manera que la unión al virus Hendra o Nipah sea detectable en comparación con el valor básico. Además, es deseable que el anticuerpo monoclonal marcado detectablemente se aclare rápidamente del sistema circulatorio a

5 fin de dar la mejor relación de señal diana – fondo.

Como regla, la dosificación del anticuerpo monoclonal marcado detectablemente para el diagnóstico in vivo variará dependiendo de factores tales como la edad, el sexo, y el grado de enfermedad del individuo. La dosis de anticuerpo monoclonal puede variar desde aproximadamente 0, 01 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, preferentemente de 0, 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, lo más preferentemente de aproximadamente 0, 1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg. Tales dosis pueden variar, por ejemplo, dependiendo de si se administran múltiples inyecciones, del tejido que se esté evaluando y de otros factores conocidos por los expertos en la materia.

Para la formación de imágenes de diagnóstico in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor

15 importante a la hora de seleccionar un radioisótopo apropiado. El radioisótopo seleccionado debe tener un tipo de deterioro que sea detectable para el tipo dado de instrumento. Todavía otro factor importante a la hora de seleccionar un radioisótopo para el diagnóstico in vivo es que la semivida del radioisótopo sea suficientemente larga de manera que todavía sea detectable en el momento de máxima captación por la diana, pero lo suficientemente corto de manera que la radiación perjudicial con respecto al huésped sea aceptable. De forma ideal, un radioisótopo usado para la formación de imágenes in vivo carecerá de emisión de partículas, pero producirá un gran número de fotones en el intervalo de 140-250 keV, que pueden ser fácilmente detectados por las cámaras gamma convencionales.

Para el diagnóstico in vivo, los radioisótopos se pueden unir a las inmunoglobulinas bien directamente o

25 indirectamente usando un grupo funcional intermedio. Los grupos funcionales intermedios que se usan a menudo para unir radioisótopos que existen como iones metálicos son los agentes quelantes bifuncionales, tales como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), y moléculas similares. Los ejemplos típicos de iones metálicos que se pueden unir a los anticuerpos monoclonales de la invención son 111In, 97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr y 201Tl.

Los anticuerpos monoclonales de la invención también se pueden marcar con un isótopo paramagnético con fines de diagnóstico in vivo, como en la formación de imágenes por resonancia magnética (RM) o resonancia de espín electrónico (ESR). En general, se puede utilizar cualquier método convencional para visualizar las imágenes de diagnóstico. Habitualmente, los radioisótopos que emiten radiación gamma y positrones se usan para la formación

35 de imágenes mediante cámaras y los isótopos paramagnéticos se usan para la RM. Los elementos que son particularmente útiles en tales técnicas incluyen 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr y 56Fe.

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden usar in vitro e in vivo para monitorizar el curso de la terapia contra la enfermedad del virus Hendra o contra la enfermedad del virus Nipah. De este modo, por ejemplo, midiendo el incremento o disminución del número de células infectadas con los virus Hendra o Nipah, o los cambios en la concentración de virus Hendra o Nipah presente en el cuerpo o en diversos fluidos corporales, sería posible determinar si un régimen terapéutico particular dirigido a mejorar la enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah es eficaz.

45 Profilaxis y terapia de la enfermedad por el virus Hendra y la enfermedad por el virus Nipah

Los anticuerpos monoclonales también se pueden usar en la profilaxis y como terapia para la enfermedad por el virus Hendra y la enfermedad por el virus Nipah, tanto en seres humanos como en otros animales. Los términos “profilaxis” y “terapia”, como se usan en el presente documento junto con los anticuerpos monoclonales de la invención, representan la administración tanto profiláctica como terapéutica, e inmunización pasiva con productos polipeptídicos sustancialmente puros, así como terapia génica mediante transferencia de secuencias polinucleotídicas que codifican el producto o parte del mismo. De este modo, los anticuerpos monoclonales se pueden administrar a sujetos con riesgo elevado a fin de reducir la probabilidad y/o la gravedad de la enfermedad por el virus Hendra y de la enfermedad por el virus Nipah, o se pueden administrar a sujetos que ya presentan

55 signos de infección activa por el virus Hendra o Nipah. En la presente invención, los fragmentos Fab también se unen a los virus Hendra o Nipah o los neutralizan y, por lo tanto, se pueden usar para tratar la infección, pero, por lo demás, se prefieren moléculas de anticuerpos de longitud completa.

Como se usa en el presente documento, una “cantidad profilácticamente eficaz” de los anticuerpos monoclonales de la invención es una dosis suficientemente grande como para producir el efecto deseado en la protección de individuos frente a la infección por los virus Hendra o Nipah durante un período de tiempo razonable, tal como uno o dos meses o más tras la administración. Sin embargo, una cantidad profilácticamente eficaz no es una dosis tan grande como para provocar efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardíaca congestiva. Generalmente, una cantidad profilácticamente eficaz puede variar con 65 la edad, estado y sexo del sujeto, así como con el la extensión de la enfermedad en el sujeto, y la puede determinar un experto en la técnica. La dosis de la cantidad profilácticamente eficaz la puede ajustar el médico o veterinario

individual en el caso de cualquier complicación. Una cantidad profilácticamente eficaz puede variar desde aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, lo más preferentemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, en una o más administraciones (sensibilización y refuerzo).

5 Como se usa en el presente documento, una “cantidad terapéuticamente eficaz” de los anticuerpos monoclonales de la invención es una dosis suficientemente grande para producir el efecto deseado en el que los síntomas de la enfermedad por el virus Hendra o de la enfermedad por el virus Nipah mejoran, o se reduce la probabilidad de infección. Sin embargo, una cantidad terapéuticamente eficaz no es una dosis tan grande como para provocar

10 efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardíaca congestiva. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar con la edad, estado y sexo del sujeto, así como con el la extensión de la enfermedad en el sujeto, y la puede determinar un experto en la técnica. La dosis de la cantidad terapéuticamente eficaz la puede ajustar el médico o veterinario individual en el caso de cualquier complicación. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar desde aproximadamente 0,01 mg/kg a

15 aproximadamente 50 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, lo más preferentemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias durante uno o varios días. Se prefiere la administración del anticuerpo durante de 2 a 5 o más días consecutivos, a fin de evitar que se produzca el “rebote” de la replicación vírica.

20 Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden administrar mediante inyección o mediante infusión gradual a lo largo del tiempo. La administración de los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutánea, o transdérmica. Las técnicas para preparar sistemas de administración inyectables o infundibles que contengan anticuerpos son bien conocidas para los expertos en la materia. Generalmente, tales sistemas deberán usar componentes que no alteren

25 significativamente las propiedades biológicas de los anticuerpos, tal como la capacidad de unión del paratopo (véase, por ejemplo, Rermington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, 1990, Mack Publishing). Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente los diversos parámetros y condiciones para producir preparaciones inyectables o infundibles de anticuerpos sin recurrir a experimentación innecesaria.

30 Para la administración parenteral, las preparaciones incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, todas incluyendo medios salinos y tamponados. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, cloruro sódico y dextrosa, Ringer

35 lactato o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y de nutrientes y reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes.

40 Neutralización potente de los virus Hendra y Nipah mediante anticuerpos monoclonales humanos

Selección de los Fab (m101-7) presentados en fagos específicos de la glucoproteína G soluble (sG) del virus Hendra

Los esfuerzos iniciales de los inventores para desarrollar anticuerpos monoclonales humanos (hmAb) específicos de

45 la glucoproteína G usando bibliotecas de anticuerpos anti-glucoproteína G y sintéticos asociadas a células, así como una biblioteca inmunitaria construida a partir de linfocitos congelados de un superviviente de la infección por Nipah, no han tenido éxito. Para desarrollar hmAb frente a la glucoproteína G de la cubierta de HeV y NiV se usó una gran biblioteca de Fab humanos sin exposición previa que contiene aproximadamente 1010 Fab diferentes presentados en fagos que los inventores han desarrollado recientemente. En el presente documento, los inventores usaron una

50 forma única soluble y secretada la glucoproteína de unión (G) de HeV (sG) que los inventores han producido y caracterizado recientemente (Bossart, K. N. et al. 2005 J Virol 79:6690-6702), Esta proteína se usó como un antígeno para la detección selectiva de la biblioteca anticuerpos. Después de cuatro rondas de selección mediante conjugación, se realizó la detección selectiva de 380 clones de fagos individuales en ELISA de fagos con sG, como se describe en el Ejemplo 1. De ellos, se secuenciaron 71 clones que mostraron una unión significativa a sG.

55 Diecisiete Fab tenían secuencias únicas (Tabla 1). Se expresaron en bacterias, se purificaron y se estudiaron para determinar la actividad de unión. Siete Fab, denominados m101 a m107, mostraron una unión significativa (A450 > 0, 5) a sG en el ELISA (Tabla 1). De forma notable, de media, las CDR3 de la cadena pesada (H3) de los ligantes (m101-7) fueron significativamente más largas que las de los Fab que se unen de forma más débil (m108-17) (Tabla 1). De forma interesante, las cadenas pesadas de m101 y m102 (los neutralizantes de HeV y NiV más potentes,

60 véase más adelante) fueron las más divergentes con respecto a las cadenas pesadas de la línea germinal, lo que indica un cierto nivel de maduración aunque son específicas de IgM. Las cadenas ligeras fueron todas de las clases Ig y muestran una mayor variación en comparación con las cadenas ligeras de la línea germinal (Tabla 2).

Inhibición de la fusión mediada por Env de HeV mediante los Fab seleccionados 65

Para analizar actividad neutralizante de los anticuerpos, los inventores midieron en primer lugar su capacidad para inhibir la fusión mediada por células que expresan la glucoproteína de la cubierta (Env) de HeV, con células que se habían identificado previamente como competentes para la fusión. La fusión se midió mediante dos ensayos, un ensayo de gen indicador y un ensayo de formación de sincitios. Los siete Fab que se unieron fuertemente a sG

5 (Tabla 1) también mostraron actividad inhibidora mesurable en el ensayo de gen indicador (Tabla 3) y se seleccionaron para una caracterización posterior. También inhibieron la formación de sincitios hasta diversos grados, en correlación general con la actividad inhibidora medida por el ensayo de gen indicador. De forma interesante, seis de los siete Fab también inhibieron en diversos grados la fusión mediada por Env de Niv (Tabla 3). Un anticuerpo, m101, fue el más activo frente a la fusión mediada por Env de HeV, mientras que otro, m102, mostró la actividad inhibidora cruzada más elevada frente a la fusión mediada tanto por Env de HeV como Env de Niv.

Neutralización de HeV y NiV por los Fab

La actividad inhibidora de estos Fab se analizó adicionalmente usando HeV y NiV infecciosos en un ensayo de

15 neutralización como se describe en el Ejemplo 1. Cuando se ensaya a concentraciones por encima de 80 µg/ml, el Fab m101 mostró actividad neutralizante frente a HeV, pero no frente a NiV, y el Fab m102 mostró una actividad neutralizante más débil frente a HeV en comparación con m101. De forma interesante, como en el ensayo de fusión celular, m102 mostró actividad neutralizante cruzada tanto para HeV como para NiV. Los otros Fab analizados no mostraron actividad neutralizante mensurable cuando se analizaron a concentraciones de hasta 100 µg/ml. Estos resultados indicaron que dos de los Fab seleccionados podrían neutralizar los HeV y NiV infecciosos.

Actividad inhibidora potente de IgG1 m101 frente a la fusión mediada por Env de HeV y frente al virus vivo

En la mayoría de los casos, pero no siempre, los anticuerpos completos son mejores neutralizantes que los Fab. De

25 este modo, el Fab más potente inhibidor de la fusión mediada por HeV, m101, se convirtió a un formato de anticuerpo completo (IgG1) y se estudió en un ensayo de fusión celular. La actividad inhibidora de IgG1 m101 fue mucho mayor que la actividad del Fab m101 (Figs. 1 y 2). La conversión de Fab m101 en IgG1 disminuyó drásticamente sus CI50. Para células HeLa-ATCC que muestran menores tasas de fusión, la CI50 disminuyó desde 4,2 µg/ml hasta 0, 5 µg/ml (Figura 1A). Para las células PCI-13 altamente fusogénicas, la CI50 disminuyó desde 38 µg/ml hasta 1, 2 µg/ml (Figura 1B). En otro experimento, el IgG1 m101 inhibió el 95 % de la fusión a 3 µg/ml. IgG1 m101 también inhibió potentemente la formación de sincitios en correlación con su actividad inhibidora medida mediante el ensayo de gen indicador. En la Figura 2 se muestra un ejemplo que usa las células PCI-13 altamente fusogénicas. Aquí, IgG1 m101 inhibió completamente la formación de sincitios a 10 µg/ml, mientras que, a la misma concentración, Fab m101 inhibió aproximadamente el 50 % de la formación de sincitios.

35 IgG1 m101 también fue excepcionalmente potente neutralizando el HeV infeccioso. La neutralización completa (100 %) se logró a 12,5 µg/ml, más del 99 % a 6 µg/ml y 98 % a 1,6 µg/ml (Tabla 4). Estos resultados demuestran que IgG1 m101 es un neutralizante muy potente del HeV infeccioso.

Mecanismo de inhibición de la entrada de virus por los anticuerpos: correlación con la unión a glucoproteína G nativa

Para comenzar a elucidar los mecanismos de la actividad inhibidora de los anticuerpos seleccionados se midieron sus constantes de velocidad de unión y sus afinidades por sG en un ensayo de Biacore. Los anticuerpos unidos con alta afinidad (intervalo de 1 a 103 nM) a sG se midieron mediante Biacore (Tabla 5). Las constantes de velocidad de

45 asociación variaron significativamente, pero no hubo variación significativa en las constantes de velocidad de disociación, excepto la constante de velocidad de disociación muy baja de m102. Los mejores inhibidores de la fusión mediada por la glucoproteína G de HeV y de la infección, m101 y m102, mostraron la afinidad más elevada. En este contexto, se observó una correlación entre la unión a sG y la inhibición de la fusión por grupos de anticuerpos divididos en neutralizantes buenos (m101 y m102) y malos (el resto), aunque no se encontró una correlación directa calculada matemáticamente entre la afinidad medida mediante Biacore de cada anticuerpo por sG y la actividad inhibidora de la fusión.

Para encontrar otras posibles correlaciones entre la unión y la inhibición, los inventores midieron la unión a la glucoproteína G nativa, que se inmunoprecipitó a partir de lisados de células infectadas con virus vacunales

55 recombinantes. La extensión de la inmunoprecipitación, que es proporcional a la afinidad de unión del anticuerpo a la glucoproteína G de longitud completa nativa, fue el más elevado para m101 que se une a glucoproteína G de HeV (Fig. 3). Dos de estos anticuerpos, m102 y m106, demostraron una reactividad cruzada significativa con la glucoproteína G tanto de HeV como de NiV (Fig. 3). Los niveles de inmunoprecipitación se correlacionaron con la fusión celular (Tabla 3), lo que indica que la unión a la glucoproteína G nativa es un mejor correlato de la actividad inhibidora de la fusión que la unión a la glucoproteína G soluble.

Mejora competitiva con respecto a la efrina-B2 receptora como mecanismo de inhibición de la entrada del virus mediante m101 y m102

65 Para definir adicionalmente el mecanismo de inhibición de la entrada de virus por el neutralizante más potente m101, los inventores midieron su competición con el receptor recientemente identificado para los virus Hendra y Nipah

efrina-B2 (Bonaparte M.I. et al. 2005 Proc Natl Acad Sci USA 102:10652-10657). M101 compitió con efrina-B2 por la unión a sG; IgG m101 fue un competidor mucho mejor que Fab m101 (Fig. 4), que se correlaciona con su actividad inhibidora, probablemente debido a la naturaleza multivalente de su interacción. Se obtuvieron resultados similares con m102 y mediante el uso de Biacore (Fig. 2 suplementaria en Bonaparte M.I. et al. 2005 Proc Natl Acad Sci USA

5 102:10652-10657). Estos datos indican que m101 y m102 inhiben la entrada del virus Hendra y probablemente del virus Nipah evitando el acceso de estos virus a su receptor. También indican que los epítopos de m101 y m102 solapan con el sitio de unión al receptor en la glucoproteína G. De forma interesante, m106 compitió con efrina-B2 de forma mucho más débil que m101 y solo a concentraciones muy elevadas (Fig. 4).

10 Caracterización adicional de los epítopos de los anticuerpos anti-glucoproteína G seleccionados

Para caracterizar adicionalmente los epítopos de los anticuerpos recientemente identificados, los inventores midieron la competición m101, m102, m103, m106 y m107 entre sí mediante ELISA (actualmente no hay anticuerpos frente a la glucoproteína G de Hendra con epítopos conocidos). Los anticuerpos m101, m102 y m103 compitieron

15 entre sí, lo que indica que se unen a epítopos solapantes que son distintos de los epítopos de m106 y m107. De forma interesante, parece que m103 es sinérgico con m106, lo que produce un aumento de la unión de uno en presencia del otro. Estos resultados indican que m101-3 pueden neutralizar el virus mediante un mecanismo diferente de m106 y m107, pero son necesarios estudios adicionales de competición con efrina para elucidar definitivamente el mecanismo de su actividad neutralizante.

20 En un intento inicial de localizar los epítopos de m101 y m102, los inventores midieron su unión a un panel de 10 mutantes de barrido de alanina de la glucoproteína G, seleccionados para representar diferentes porciones de la proteína: G183A, L184A, P185A, (Q191, K192A), S195A, D289A, K324A, (I385, H386A), L517A, N570A, en las que los dos mutantes dobles están entre paréntesis. De estos mutantes, solo uno, G183A, disminuye la unión tanto de

25 m101 como de m102 a la glucoproteína G; este mutante se unió fuertemente a anticuerpos policlonales de conejo anti-glucoproteína G y a la efrina-B2 receptora. (Fig. 5). El resto G183 está localizado en la base de la cabeza globular de la proteína G según una estructura modelo (Yu M. et al. 1998 Virology 251:227-233), y podría ser una parte del epítopo del anticuerpo que no solapa con el sitio de unión al receptor en la glucoproteína G. Parece que otro resto, N570, disminuye la unión de m102 a la glucoproteína G, pero no la unión de m101 ni la del receptor (Fig.

30 5). Este resto podría ser una parte del epítopo de m102 que no solapa con el epítopo de m101 ni con el sitio de unión al receptor en la glucoproteína G.

Tabla 1: Selección de clones de fagos con secuencias únicas que muestran unión significativa a sG

Fab

Secuencia H3 A450

m101

D P GG Y S Y G P Y Y YY Y GM D V 1,0

m102

G W G R E Q L A P H P S Q Y Y Y Y Y Y G M D V 1,4

m103

D S R Y H D A F D I 0,8

m104

E S S W L D A F D I 0,7

m105

V G G I T G T A D A F D I 0,9

m106

D Q L A G Y Y Y D S S G Y H Y Y Y Y G M D V 1,6

m107

D H V H G P D A F D I 0,6

m108

V G G A F D I 0,5

m109

G W F R D W Y F D L 0,0

m110

E G L P E T D D A F D I 0,0

m111

E G A D Y 0,0

m112

D G A D Y 0,4

m113

Y K L Q S D A F D I 0,1

m114

A G P V G A T T G T F D Y 0,0

m115

G S Q S Y D H Y Y Y Y 0,4

m116

D S A G L G A 0,3

m117

R E S G P E F F Q H 0,0

La detección selectiva de 380 clones de fagos individuales se llevó a cabo en ELISA de fagos con sG, como se describe en el Ejemplo 1. Se muestran las secuencias de las CDR3 de HC (las H3) de los Fab presentados en fagos que mostraron unión significativa a sG en ELISA de fagos, según se identifican de acuerdo con la base de datos de IMGT (http://imgt.cines.fr). Los Fab solubles se expresaron, se purificaron y se analizaron mediante ELISA para determinar la unión a sG. La absorbancia de la disolución a 450 nm (A450) se muestra como una medida de la fortaleza de la unión.

Tabla 2: Familias de genes V y número de aminoácidos cambiados en comparación con la línea germinal

Anticuerpo

Familia de VH Familia de VL Cambios en VH Cambios en VL

m101

VH1 Vk1 2 6

m102

VH1 Vk3 5 8

m103

VH3 Vk2 0 0

m104

VH1 Vk2 0 13

m105

VH3 Vk1 0 0

m106

VH1 Vk1 0 0

m107

VH1 Vλ1 1 3

Se muestran las familias de genes para los genes de VH, que son específicos de IgM, y para los genes de VL, que son todos de las clases de Ig, y sus variaciones en comparación con las secuencias de la línea germinal.

Tabla 3: Inhibición de la fusión celular mediada por Env de HeV mediante los Fab seleccionados

Fab

HeV NiV

M101

+++ +

m102

++ ++

m103

+ 0

m104

+ +

m105

0 +

m106

+ ++

m107

0 +

m108-17

0 0

X5

0 0

Los Fab anti-glucoproteína G de HeV se usaron para la inhibición de la fusión como se describe en el Ejemplo 1. Se muestra un resumen de cuatro experimentos diferentes, en los que cada + es una medida del aumento de la actividad inhibidora y 0 significa actividad de fusión no mensurable en comparación con el valor de fondo. Fab X5 es un anticuerpo de control específico de la gp120 de VIH-1 (Moulard, M. et al. 2002 Proc Natl Acad Sci USA 99:6913-6918).

Tabla 4: Neutralización de HeV infeccioso mediante IgG1 m101

Concentración del anticuerpo (µg/ml)

Número de focos por pocillo en cada réplica Número promedio de focos (% de neutralización)

25

0 0 0 0 0 (100)

12,5

0 0 0 0 0 (100)

6,2

0 0 1 0 0,25 (99)

3,1

1 0 1 0 0,5 (98)

1,6

1 1 0 0 0,5 (98)

0,8

5 2 2 2 2,75 (91)

0

30 37 34 30 33 (0)

IgG1 m101 se incubó con HeV infeccioso y la mezcla se añadió a células Vero cultivadas en placas. Después de la incubación durante 30 minutos, las mezclas de anticuerpo-virus se eliminaron, las células se lavaron y se añadió a las células EMEM-10 recién preparado que contiene anticuerpo recién producido y se incubó toda la noche. El número promedio de focos en ausencia de anticuerpo fue 33. El porcentaje de neutralización mostrado más adelante entre paréntesis se calculó restando al número de focos en los pocillos con anticuerpos el número de focos sin anticuerpos, y dividiendo el número resultante entre el número de focos sin anticuerpos, y multiplicando por 100.

Tabla 5: Constantes de velocidad de unión y afinidades de los Fab seleccionados

Anticuerpo

ka (x104) M-1 s -1 kd (x10-3) s-1 Kd, nM

m101

13 3,5 28

m102

57 0,068 1,2

m103

* * 1800

m104

0,3 1,6 600

m105

7,4 5,1 69

m106

6,2 3,3 54

m107

30 2,2 78

La interacción entre diversos Fab y sG se analizó a 25 ºC mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial. Se inyectaron Fab a diferentes concentraciones a un caudal de 30 µl/min y los datos de las fases de asociación y de disociación se ajustaron simultáneamente a un modelo global de Langmuir 1:1 usando el programa de análisis de datos no lineal BIAevaluation 3.2. La constante de velocidad de asociación, ka, la constante de velocidad de disociación, kd, y la constante de disociación en el equilibrio, Kd, individuales se obtuvieron a partir de al menos tres experimentos distintos. La desviación estándar fue, de media, alrededor del 20 %. * indica que solo se calculó la afinidad en estado estacionario, debido a la cinética rápida.

Discusión

5 El hallazgo principal de este estudio es la identificación de un anticuerpo, m101, con potencia excepcional frente al virus HeV infeccioso. También se identificaron otros seis anticuerpos que son específicos de la glucoproteína G de HeV y dos de ellos reaccionaron significativamente de forma cruzada con la glucoproteína G de NiV. Según el conocimiento de los inventores, estos anticuerpos son los primeros anticuerpos monoclonales humanos (hmAb) identificados frente a HeV y NiV. De forma interesante, el único anticuerpo monoclonal, Synagis (Pollack, P. y

10 Groothuis, J. R. 2002 J Infect Chemother 8:201-206) (palivizumab, MEDI-493), aprobado por la FDA para uso clínico frente a una enfermedad vírica (Dimitrov, D. S. 2004 Nat Rev Microbiol 2:109-122), es también específico de un paramixovirus, el virus sincitial respiratorio (VSR) ; es una versión humanizada de un anticuerpo de ratón y se usa para la prevención de infecciones por VSR en neonatos y en individuos inmunodeprimidos. Synagis inhibe in vitro de forma muy potente la entrada del virus y la fusión celular; parece que su eficacia in vivo se correlaciona con su

15 potencia in vitro y se ha propuesto que su actividad inhibidora de la fusión podría ser un determinante importante de su potencia in vivo (Johnson, S. et al. 1999 J Infect Dis 180:35-40). Debido a que el VSR y los henipavirus entran en las células mediante la misma ruta, la fusión de la superficie celular, y no a través de endocitosis, como lo hacen la mayoría de otros virus con cubierta (Dimitrov, D. S. 2004 Nat Rev Microbiol 2:109-122), y son miembros de la misma familia vírica, los inventores predicen que m101 puede ser igualmente, si no más, eficaz frente a HeV que lo es

20 palivizumab frente al VSR.

Cada uno de los Fab recién identificados se examinó en ensayos de fusión celular mediada por HeV y NiV para evaluar su potencial a la hora de bloquear la unión y/o el proceso de fusión de membrana posterior. El Fab m101 demostró la actividad inhibidora más potente de la fusión celular y m102 mostró actividad de reacción cruzada frente 25 a tanto HeV como NiV. El mecanismo mediante el cual m101 y m102 inhiben la fusión e infección de HeV es bloqueando la interacción de la glucoproteína G con efrina-B2, que se ha identificado recientemente como un receptor funcional para HeV y NiV (Bonaparte et al. 2005 Proc Natl Acad Sci USA 102:10652-10657) (la función receptora de efrina-B2 para NiV también se identificó independientemente usando un enfoque diferente (Negrete

O.A et al. 2005 Nature 436:401-405)). Sin embargo, una posibilidad alternativa es que estos anticuerpos se unen a

30 la glucoproteína G y también pueden evitar su interacción requerida con la glucoproteína F para poner en marcha el proceso de fusión. Hubo una correlación general entre su actividad inhibidora y la afinidad de unión de los Fab a la glucoproteína G, especialmente a la proteína asociada a la membrana nativa, según se mide mediante inmunoprecipitación.

35 La conversión de Fab m101 en IgG1 condujo a una neutralización potente del HeV infeccioso, que neutralizó más del 90 % a una concentración menor que 1 µg/ml. Se podría teorizar que esto puede deberse al aumento de estabilidad y la avidez del anticuerpo, y/o a su capacidad para reticular la glucoproteína G oligomérica sobre las superficies de los virus y las células infectadas. No obstante, la potencia extrema de IgG1 m101 en ensayos de neutralización de HeV infeccioso sugiere que puede ser importante convertir otros Fab en IgG1 para la evaluación

40 como hmAb neutralizantes potentes.

Existe una considerable homología de aminoácidos entre las Env F y G de NeV y NiV (Harcourt, B. H. et al. 2000 Virology 271:334-349; Wang, L. et al. 2001 Microbes Infect 3:279-287). Estudios previos han demostrado que los antisueros de HeV y NiV no neutralizan de forma cruzada, siendo cada suero ligeramente menos eficaz frente al 45 virus heterotípico (Crameri, G. et al. 2002 J Virol Methods 99:41-51; Tamin, A. 2002 Virology 296:190-200). Además, las glucoproteínas de HeV y NiV se pueden complementar funcionalmente entre sí a la hora de mediar la fusión de

membranas con eficiencia de tipo salvaje (Bossart, K. N. y Broder, C. C. 2004 Methods Mol Biol 269:309-332; Bossart, K. N. et al. 2002 J Virol 76:11186-11198). De este modo, los inventores han anticipado que si se identificasen anticuerpos usando sG de HeV, algunos deberían presentar unión reactiva cruzada a epítopos compartidos entre HeV y NiV. De hecho, dos de los siete Fab fueron capaces de reaccionar igualmente bien en la

5 inmunoprecipitación de la glucoproteína G de HeV y NiV asociada a la membrana recombinante. Además, m102 fue capaz de inhibir la fusión mediada por HeV y por NiV y puede reflejar un epítopo conservado entre estos virus que podría ser importante no solo para la neutralización sino también para el mecanismo de entrada. Con la conversión en una IgG1, m102 puede ser capaz de neutralizar de forma potente tanto a HeV como a NiV.

Los ensayos de competición de unión de anticuerpos revelaron que el panel de los Fab desarrollado aquí comprende dos grupos distintos y los Fab en cada grupo poseen epítopos que solapan. El análisis de los FAb antiglucoproteína G mediante transferencia de tipo Western no reveló reactividad con la glucoproteína G, lo que indica que los epítopos reconocidos por estos Fab dependen probablemente de la conformación. Los neutralizantes más potentes, m101 y m102, se unieron a la mayoría de los mutantes de alanina analizados, excepto uno, que parece

15 que está localizado en la base de la cabeza globular de la glucoproteína G según un modelo de su estructura (Yu M. et al 1998 Virology 251:227-233). Para localizar de forma precisa sus epítopos son necesarios estudios adicionales.

Tomados en conjunto, los resultados demuestran nuevos inmunotratamientos frente a HeV y NiV. También es de esperar que estos anticuerpos humanos sean útiles para el diagnóstico, como reactivos de investigación, y que sirvan como base para vacunas.

Ejemplo 1

Células y condiciones de cultivo

25 Las células HeLa-USU las proporcionaron Anthony Maurelli, Uniformed Services University (USU). HeLa-ATCC se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC nº CCL 2). Las células Vero las proporcionó Alison O'Brien, USU. La línea celular de glioblastoma humano U373-MG la proporcionó Adam P Geballe, Fred Hutchinson Cancer Research Center (Harrington R.D. 1993 J Virol 67:5939-5947). La línea celular PCI 13 de carcinoma de cabeza y cuello humano fue un regalo de Ernest Smith, Vaccinex, Inc. Las células HeLa-USU, HeLa-ATCC y U373 se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD.) suplementado con 10 % de suero de ternera cósmico (CCS) (HyClone, Logan, UT) y 2 mM de L-glutamina (DMEM-10). Las células PCI 13 se mantuvieron en DMEM-10 suplementado con HEPES 1mM (Quality Bio.). Las células Vero se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (Quality Bio.) suplementado con 10 % de suero de ternera cósmico (CCS)

35 (HyClone) y 2 mM de L-glutamina (EMEM-10). Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37 ºC en una atmósfera húmeda con 5 % de CO2.

Mutantes de alanina de glucoproteína G

Las mutaciones de alanina se realizaron en restos específicos en la glucoproteína G de HeV marcada con myc usando mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene). Todos los mutantes se secuenciaron y se analizaron para determinar la expresión. Los plásmidos que contienen Gmyc de HeV mutante o de tipo salvaje se transfectaron en monocapas de HeLa USU usando Fugene (Roche) y se incubaron durante toda la noche. La inmunoprecipitación de la glucoproteína G mutante se llevó a cabo como se describe más adelante en la sección Inmunoprecipitación,

45 excepto que se incubaron 3,0 µg de m101 o m102, o 5 µl de antisuero policlonal de conejo anti-glucoproteína G de α-sHeV, con 80 µl de lisados durante la noche a 4 ºC, seguido de precipitación a temperatura ambiente con 100 µl de Proteína G al 20 % en Sepharose, durante 45 minutos.

Selección de Fab presentados en fagos específicos de glucoproteína G

Se usó una biblioteca de expresión e fagos de Fab humanos no expuestos anteriormente (un total de aproximadamente 1010 miembros) construida con linfocitos B de sangre periférica de 10 donantes sanos para la selección de los Fab frente a glucoproteína G de HeV soluble y oligomérica purificada (sG) (Bossart, K. N. et al. 2005 J Virol 79:6690-6702), conjugada a perlas magnéticas (Dynabeads M-270 Epoxy, DYNAL Inc., New Hyde Park, 55 New York). Las bibliotecas amplificadas de 1012 Fab presentados en fagos se incubaron con 5, 3, 3 y 1 µg de sG en un volumen de 500 µl durante 2 horas a temperatura ambiente durante las rondas 1ª, 2ª, 3ª y 4ª de la bioselección, respectivamente. Después de cada ronda de incubación, las perlas se lavaron 5 veces para la primera ronda y 15 veces para las rondas posteriores con PBST (PBS que contiene 0,05 % de Tween-20) para eliminar el fago unido de forma inespecíficamente, los fagos unidos a las perlas se mezclaron con células TG1 durante una hora a 37 ºC, el fago se amplificó a partir de las células infectadas y se usó en la siguiente ronda de bioselección. Después de la 4ª ronda de bioselección, se escogieron al azar 380 clones de las células TG1 infectadas, y cada uno de ellos se inoculó en 150 µl de medio 2YT que contiene 100 µg/ml de carbenicilina y 0,2 % de glucosa en placas de 96 pocillos usando el sistema de recogida de colonias automatizado BioRobotics BioPick (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI). Después de que los cultivos bacterianos alcanzaron una densidad óptica (DO) de 0,5 a 600 nm, se añadió al medio 65 el fago auxiliar M13K07 a una MOI de 10 y kanamicina a 50 µg/ml de concentración final y las placas se incubaron adicionalmente a 30 ºC toda la noche en un agitador a 250 rpm. Los sobrenadantes de los fagos se mezclaron con

leche desnatada al 3 % en PBS a una relación de volumen 4:1, y se usaron para el ELISA para identificar clones de los Fab que poseen afinidad de unión elevada por sG y que se presentan en fagos. Los sobrenadantes se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con proteína sG revestida a 50 ng por pocillo en placas de 96 pocillos y se lavaron 5 veces con PBST. (sG se revistió en 50 µl de tampón de revestimiento (NaHCO3 50mM a pH 9,6) ; después

5 de la incubación durante toda la noche a 40 ºC se bloqueó con leche desnatada al 3 % en PBS, y se lavó 3 veces con PBS que contiene 0,05 % de Tween-20). Los fagos unidos a glucoproteína G soluble se detectaron usando anticuerpo de cabra anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano. Tras la incubación con el anticuerpo, el anticuerpo unido no específicamente se lavó, se añadió el sustrato TMB y se midió la absorbancia de la disolución a 450 nm (A450). Los clones que se unieron a sG con A450 > 1,0 se seleccionaron para su caracterización posterior.

Expresión y purificación de los Fab solubles seleccionados

Las VH y VL de los clones seleccionados se secuenciaron y los Fab codificados por clones con secuencias únicas se expresaron y purificaron como se describe más adelante. Los plásmidos extraídos de estos clones se usaron para la

15 transformación de células HB2151. Se recogió una única colonia de la placa que contiene células recientemente transformadas, se inoculó en 200 ml de medio 2YT que contiene 100 µg/ml de ampicilina y 0,2 % de glucosa y se incubó a 37 ºC con agitación a 250 rpm. Cuando la DO del cultivo a 600 nm alcanzó 0,90 se añadió IPTG a una concentración final de 0,5 mM y el cultivo se incubó adicionalmente toda la noche a 30 ºC. El sedimento bacteriano se recogió después de la centrifugación a 8.000 g durante 20 minutos y se resuspendió en tampón de PBS que contiene 0,5 mU de polImixina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Después de incubar durante 30 minutos con rotación a 50 rpm a temperatura ambiente, se centrifugó a 25.000 g durante 25 minutos a 4 ºC y el sobrenadante se usó para la purificación de los Fab con columna de proteína G (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Conversión de Fab en IgG1 y expresión y purificación de IgG1

25 Las cadenas pesada y ligera de Fab se amplificaron y se volvieron a clonar en el vector PDR12 (proporcionado porD. Burton, the Scripps Research Institute, La Jolla, CA) para la expresión de IgG1 completa. La construcción resultante se transfectó y la IgG1 se expresó usando el kit de expresión FreeStyle™ 293 Expression Kit siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). La IgG1 se purificó del medio de cultivo con una columna de proteína G (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Determinación de la afinidad mediante resonancia de plasmón superficial

Las interacciones entre los diversos Fab y la glucoproteína G se analizaron mediante tecnología de resonancia de

35 plasmón superficial usando un instrumento BIACORE 1000 (Biacore, Pharmacia, Piscataway, NJ). La sG se inmovilizó covalentemente sobre un chip sensor (CM5) usando química de acoplamiento con carbodiimida. Para la unión no específica y los cambios del índice de refracción se preparó una superficie de referencia de control. Para el análisis de la cinética de las interacciones, se inyectaron concentraciones variables de los Fab (300, 100, 33, 11 y 3, 7 nM) a un caudal de 30 µ/min., usando un tampón de carrera que contiene NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y 0,005 % de P-20 (pH 7,4). Los datos de las fases de asociación y de disociación se ajustaron simultáneamente a un modelo global de Langmuir 1:1 usando el programa de análisis de datos no lineal BIAevaluation 3.2. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 ºC.

ELISA de competición

45 Los Fab m101, m102, m103, m106 y m107 se revistieron a 150, 50, 300, 300 y 100 ng por pocillo, respectivamente, en 50 µl de tampón de revestimiento como se ha descrito anteriormente para sG, se bloquearon con leche desnatada y se lavaron. A cada uno de los pocillos revestidos con los Fab se añadió sG marcada con c-Myc mezclada con cada uno de los Fab en tampón de bloqueo a una concentración final de 5 µg/ml y 20 µg/ml, respectivamente; como control positivo, a cada uno de los Fab revestidos se añadió sG (5 µg/ml) sin anticuerpo. La proteína sG marcada con c-myc unida se detectó mediante un anticuerpo anti-c-myc conjugado con HRP (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN); se añadió el sustrato TMB (Sigma-Aldiich, St. Louis, MO) y se midió la A450.

55 Inmunoprecipitación

Monocapas de HeLa-USU se infectaron con glucoproteína G de HeV o glucoproteína G de NiV marcada con myc que expresa el virus vacunal de tipo salvaje (WR) o el virus vacunal recombinante a una MOI de 10 durante 6 horas, después se lavaron dos veces y se incubaron durante la noche en medio esencial sin metionina y cisteína más 2,5 % de suero bovino fetal dializado (Invitrogen) y 100 µCi de [35S] ProMix/ml (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Las células se lisaron en Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM y 1 % de Triton X-100. Los lisados se incubaron con cada Fab a una concentración de 1 ug por 100 ul de lisado durante al menos una hora a 4 ºC, seguido de la precipitación a temperatura ambiente con 100 ul de Proteína G al 20 %-Sepharose (Amersham) durante 45 minutos. El anticuerpo anti-myc 9E10 (Roche Molecular Biochemicals) se usó a una concentración de 2

65 ug por 100 ul de lisado. Las muestras se lavaron dos veces con tampón de lisis, seguido de un lavado con tampón DOC que contiene Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, 0,1 % de desoxicolato de sodio y 0,1 % de SDS. Las

muestras se llevaron ebullición en tampón de muestra de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) con 2-mercaptoetanol y se analizaron mediante SDS-PAGE y autorradiografía.

Ensayos de fusión celular

5 La fusión entre las células que expresan la glucoproteína de la cubierta F y G de HeV y NiV (células efectoras) y las células diana se midió mediante dos ensayos: en primer lugar, un ensayo de gen indicador, en el que el citoplasma de una población celular contenía ARN polimerasa de T7 codificada por el virus vacunal y el citoplasma de la otra contenía el gen lacZ de E. coli ligado al promotor de T7; la β-galactosidasa (β-Gal) solo se sintetiza en células fusionadas (Bossart, K. N. y Broder, C. C. 2004 Methods Mol Biol 269:309-332; Nussbaum, O. et al. 1994 J Virol 68:5411-5422), y en segundo lugar, un ensayo de sincitios. Típicamente, la expresión de las glucoproteína F y G de HeV y de NiV se lleva a cabo en un derivado de la línea celular HeLa negativo a la fusión e infección por HeV y NiV (HeLa-USU). El análisis citogenético ha confirmado que la línea celular HeLa-USU resistente a la fusión de membrana mediada por NiV y HeV y a la infección por el virus vivo deriva de la línea celular HeLa de ATCC (CCL2).

15 Las proteínas codificadas por el virus vacunal (Bossart, K. N. et al. 2001 Virology 290:121-135) se produjeron infectando células a una MOI de 10 e incubando las células infectadas a 31 ºC durante la noche. Las reacciones de fusión celular se llevaron a cabo con las diversas mezclas celulares en placas de 96 pocillos a 37 ºC. Típicamente, la relación entre células que expresan la glucoproteína de la cubierta y células diana fue de 1:1 (2 x 105 células totales por pocillo, volumen total de 0,2-ml). Se añadió arabinósido de citosina (40 µg/ml) a la mezcla de la reacción de fusión, para reducir la producción no específica de β-Gal. Para análisis cuantitativos, se añadió Nonidet P-40 (0,5 % final) a 2,5 horas y se evaluaron alícuotas de los lisados para determinar β-Gal a temperatura ambiente con el sustrato D-galactopiranósido de rojo de clorofenol (CPRG; Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, IN). Para la inhibición mediante anticuerpos se realizaron diluciones en serie de anticuerpos y se añadieron a poblaciones de células efectoras 30 minutos antes de la adición de las poblaciones de células diana. Todos los ensayos se llevaron

25 a cabo por duplicado y los datos de fusión se calcularon y se expresaron como tasas de actividad de β-Gal (cambio en la DO a 570 nm por minuto x 1.000) (Nussbaum, O. et al 1994 J Virol 68:5411-5422). Se normalizaron con respecto a la fusión celular en ausencia de anticuerpos y se representaron gráficamente como función de la concentración de anticuerpos.

El ensayo de sincitios se realizó en placas de 48 pocillos. Las células PCI-13 diana se cultivaron en placas hasta alcanzar una confluencia del 80 % en el momento del experimento. Células efectoras, HeLa USU, que no son permisivas a la fusión mediada por Env de HeV y Env de NiV, se infectaron con virus vacunal recombinante para expresar proteínas G y F de HeV. Tres pocillos de una placa de seis pocillos con HeLa-USU confluentes al 80 % se incubaron con ambos virus vacunales recombinantes, que codifican la glucoproteína G de HeV y la glucoproteína F 35 de HeV, MOI de 10 para cada virus, a 37 ºC durante 3 horas en DMEM-10 que contiene 2,5 % de suero cósmico de ternera, 1 ml por pocillo, después se lavaron una vez y se disociaron de las placas usando 0,5 ml por pocillo de tampón de disociación celular a base de PBS libre de enzimas (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Las células se reunieron en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml (Corning Inc., Corning, NY) y se añadieron 20 ml de DMEM-10. La suspensión se incubó 16 horas a 31 ºC en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Antes del experimento, las células se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 minutos y el sedimento se resuspendió en DMEM-10. Las células se contaron, se centrifugaron nuevamente y se resuspendieron a una concentración de 2x106 células/ml. Se añadió arabinósido de citosina, hasta una concentración de 80 µg/ml. Cien microlitros de esta suspensión celular se mezclaron con la misma cantidad de DMEM-10 que contiene el anticuerpo y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas se añadieron a las células diana PCI-13 lavadas recientemente (con DMEM-10)

45 en la placa de 48 pocillos y se incubaron durante 3 horas a 37 ºC en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Se tomaron fotografías usando el modo de contraste de fases de un microscopio Olympus IX81 con una lente objetivo de 10 aumentos y después se amplificaron electrónicamente siempre que fue necesario.

Ensayos de neutralización de HeV y NiV

Todos los experimentos con virus vivos se llevaron a cabo con procedimientos estrictos de biocontención en un laboratorio BSL-4. Se añadieron 2 x 104 células Vero a pocillos en 150 µl de EMEM-10 en una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 ºC durante toda la noche en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Los anticuerpos se diluyeron en EMEM-10 mediante dilución duplicadora y se añadió a cada dilución un volumen igual de HeV o NiV y 55 se incubó a 37 ºC durante 30 minutos. El título de HeV fue 1,0 x 108 DICT50/ml, y el de NiV fue 3,0 x 107 DICT50/ml. Se realizaron diluciones de virus en EMEM-10 y se escogieron para generar 50 placas tras la adsorción de virus durante 30 minutos a 37 ºC a monocapas de células Vero (1,5 x 103 DICT50/ml para HeV y 7,5 x 102 DICT50/ml para NiV). Las mezclas de anticuerpos-virus se añadieron a monocapas de células Vero por cuadruplicado y se incubaron durante 30 minutos a 37 ºC en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Después de incubar durante 30 minutos, las mezclas de anticuerpos-virus se eliminaron y las células se lavaron 3 veces con PBS sin Ca++/Mg++. Se llevaron a cabo dos variaciones diferentes de este ensayo. En la primera, se añadió EMEM-10 a las células Vero después de lavar y se incubaron toda la noche. En la segunda, la misma dilución de anticuerpos, tanto como preincubación como incubación del virus, se añadió a los pocillos respectivos y se incubó durante toda la noche. Para ambos ensayos, el medio de cultivo se desechó al día siguiente y las placas se sumergieron durante 20 65 minutos en metanol absoluto enfriado con hielo antes de secar al aire fuera de la instalación de nivel 4 de peligro biológico. Los portaobjetos de cámara fijos se almacenaron toda la noche a 4 ºC o se inmunomarcaron

inmediatamente con antisuero monoespecífico anti-fosfoproteína (P) (Michalski, W. P. et al. 2000 Virus Res 69:8393). Los pocillos se lavaron en PBS 0,01 M a pH 7, 2, que contiene 1 % de BSA, durante 5 minutos. Se aplicaron 40 µl de antisuero anti-P (1:200 en PBS-BSA) a cada pocillo y se incubó a 37 ºC durante 30 minutos. Los portaobjetos se aclararon con PBS que contiene 0,05 % de Tween 20 (PBS-T) y se lavaron durante 5 minutos en PBS-BSA.

5 Después, a cada pocillo se aplicaron 40 µl de antisuero anti-conejo de cabra marcado con FITC (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, USA) diluido 1:200 en PBS-BSA que contiene DAPI (10 µg/ml) y se incubó a 37 ºC durante 30 minutos. Los pocillos se aclararon nuevamente con PBS que contiene 0,05 % de Tween 20 (PBS-T) y se lavaron durante 5 minutos en PBS-BSA. Los pocillos se taparon con 100 µl de glicerol/PBS (9:1) que contiene DABCO (25 µg/ml) y se almacenaron en oscuridad antes de la obtención de imágenes. La inmunofluorescencia de FITC se visualizó usando un microscopio invertido Olympus IX71 (Olympus Australia, Mt. Waverley, Australia). El porcentaje de neutralización a una concentración dada de anticuerpo se calculó como la relación del número promedio de focos por pocillo debidos al efecto citopático (CPE) y el mismo número para el control positivo, multiplicado por 100.

15 La neutralización de HeV y NiV mediante los Fab se llevó a cabo según lo siguiente. Los Fab se diluyeron en EMEM10 mediante dilución duplicadora y se añadió a cada dilución un volumen igual de EMEM-10 que contiene 200 DICT50/ml DE HeV o NiV y se incubó a 37 ºC durante 30 minutos. El título de HeV fue 1,0 x 108 DICT50/ml, y el de NiV fue 3,0 x 107 DICT50/ml. Se añadieron 2 x 104 células Vero a cada mezcla de Fab-virus en seis pocillos duplicados y se incubaron durante 5 días. La neutralización mediante Fab se determinó por el nivel deL efecto citopático (CPE) en pocillos duplicados a cada concentración de Fab.

Ejemplo 2

Maduración por afinidad de m102

25 Como fuente del repertorio de VL en la biblioteca barajada se usó la biblioteca de presentación en fagos de Fab humana original, a partir de la cual se identificaron los anticuerpos m101-m107. La preparación de fagémidos procedente de la biblioteca original se digirió primero con Nco I y Spe I, seguido de electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos génicos VH y CH1 del vector esqueleto que contiene las cadenas ligeras de los anticuerpos, para suprimir todo el repertorio de VH. El gen que codifica el dominio VH del clon m102 se amplificó mediante el kit PCR propensa a errores, de Stratagene, para introducir mutaciones al azar y después se fusionó con el fragmento génico CH1 mediante SOE PCR. El fragmento fusionado se digirió con NcoI y Spe I y se purificó a partir del gel y seguidamente se ligó en el vector esqueleto purificado para crear el repertorio de Fab de VL barajados.

35 Las células TG1 de E. coli se transformaron con las mezclas de ligación mediante electroporación. Las células TG1 transformadas se cultivaron en placas de agar 2YT que contienen 100 µg/ml de ampicilina y 2 % de glucosa. Tras la incubación durante la noche a 37 ºC, todas las colonias que crecieron en las placas se rasparon en 5 ml de medio 2YTAG, se mezclaron con 1,2 ml de glicerol al 50 % (concentración final 10 %), se repartieron en alícuotas y se almacenaron a -70 ºC como el lote madre de la biblioteca.

El lote madre de la biblioteca (100 µl) se cultivó hasta la fase logarítmica en 20 ml de medio 2YT, se rescató con el fago auxiliar M13K07 y se amplificó durante la noche en medio 2YT (2YT que contiene 100 µg/ml de ampicilina y 50 µg/ml de kanamicina) a 34 ºC. La preparación de fagos se precipitó en 4 % de PEG, NaCl 0,5 M, se resuspendió en

45 1 ml de PBS como el lote madre de biblioteca de fagos. Se llevaron a cabo dos rondas de bioselección en perlas magnéticas conjugadas con glucoproteína G de Hendra, como se describe en la selección de la biblioteca original. Se identificaron 9 clones como anticuerpos madurados por afinidad y se seleccionó m102.4 para una caracterización posterior.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES

55 <120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS CONTRA LOS VIRUS HENDRA Y NIPAH

<130> P031407EPA

<150> US 60/661766

<151>

<150> US 60/678547

<151>

<151>

65 <150> US 60/718902

<160> 416

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

5

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10

<400> 1

15 <210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 2

<210> 3 25 <211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3 30

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 5

10 <210> 6

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 6

<210> 7 20 <211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7 25

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

15

<210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 11

20 25

<210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

30 <210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 13

<210> 14 40 <211> 36

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

5 10

<210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

15

<210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens

20

<400> 16

<210> 17 25 <211> 132

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17 30

<210> 18

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

5 <210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 19

<210> 20 15 <211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20 20

<210> 21

<211> 7 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 38

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<400> 22

40

<210> 23

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

45

<400> 23

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

20

<210> 26

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25

<400> 26

30 <210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 27

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

10 <210> 29

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 29

<210> 30 20 <211> 36

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30 25

<210> 31

<211> 8 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 14

<212> PRT 40 <213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

15 20

<210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

25

<210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens

30

<400> 36

<210> 37 35 <211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37 40

<210> 38

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

20

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25

<400> 40

30 <210> 41

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens z 41

35 <400> 41

<210> 42

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

10

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 43

20 <210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 44

<210> 45 30 <211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45 35

<210> 46

<211> 36 40 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

5

<210> 48

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10

<400> 48

15 <210> 49

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 49

<210> 50 25 <211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50 30

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

5

<210> 58

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10

<400> 58

15 <210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 59

<210> 60 25 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60 30

<210> 61

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 36

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

10 15

<210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63

20

<210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens

25

<400> 64

<210> 65 30 <211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65 35

<210> 66

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

10

<210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 67

15 20

<210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68

25 <210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 69

<210> 70 35 <211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70 40

<210> 71

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

<210> 72

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

<210> 73

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

20

<210> 74

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25

<400> 74

30 <210> 75

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 75

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

10 <210> 77

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 77

<210> 78 20 <211> 36

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78 25

<210> 79

<211> 9 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 14

<212> PRT 40 <213> Homo sapiens

<400> 80

45

<210> 81

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo sapiens

50

<400> 81

<210> 82 5 <211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82 10

<210> 83

<211> 8 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83

<210> 84

<211> 18

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 84

30

<210> 85

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35

<400> 85

<210> 86

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86

10 <210> 87

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 87

<210> 88 20 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88 25

<210> 89

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

<210> 90

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

<210> 91 5 <211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91 10

<210> 92

<211> 17 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 92

25

<210> 93 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 93

30 35

<210> 94 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94

40 <210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

45 <400> 95

<210> 96

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

10 <210> 97

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 97

<210> 98 20 <211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 98 25

<210> 99

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<212> PRT

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10

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20

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<212> PRT

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25

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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10

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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30

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35

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40

<400> 268

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20 25

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20 25

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20 25

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20

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<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

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<212> PRT

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30

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<212> PRT

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<211> 11

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

30

<400> 385

<210> 386

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 386

10

<210> 387 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens

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15 20

<210> 388 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 388

25 <210> 389

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<212> PRT

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30 <400> 389

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 390 40

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<211> 25

<212> PRT

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<210> 392

<211> 11

<212> PRT

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<210> 393

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 393

20

<210> 394

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25

<400> 394

30 <210> 395

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<211> 3

<212> PRT

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<400> 397

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 398

<210> 399

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 399

<210> 400

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 400

<210> 401

<211> 132

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 401

5 <210> 402

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 402

<210> 403 15 <211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 403 20

<210> 404

<211> 18 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 404

<210> 405

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 405

<210> 406

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 406

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<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 407

20

<210> 408

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25

<400> 408

30 <210> 409

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 409 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 410 10

<210> 411

<211> 7 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 411

<210> 412

<211> 17

<212>

PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 412

<210> 414

<211> 36

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 414

<210> 415

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 415

<210> 416

<211> 11

<212>

PRT 20 <213> Homo sapiens

30

<210> 413

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35

<400> 413

<400> 416

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo humano que se une selectivamente al epítopo de la glucoproteína G de Hendra y Nipah, en el que dicho anticuerpo incluye una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, en el que la cadena ligera variable tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 313 y en el que el anticuerpo se puede obtener mediante maduración por afinidad con respecto a un anticuerpo m102 que comprende una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 17 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 25.

2. 2.

   El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende un fragmento Fd.

3. 3.

   El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende un fragmento Fab.

4. 4.

   El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cadena variable comprende una región CD3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 311.

5. 5.

   El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cadena variable comprende una región CD2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 309.

6. 6.

   Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. 7.

   El ácido nucleico aislado de la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico comprende un vector que incluye una secuencia reguladora unida operablemente a dicho ácido nucleico.

8. 8.

   Una célula huésped aislada que produce el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

9. 9.

   Una preparación farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. 10.

    Una preparación diagnóstica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

11. 11.

    Una preparación farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento de la enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah.

12. 12.

    Una preparación farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en la profilaxis de la enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah.

13. 13.

    Una preparación diagnóstica de la reivindicación 10 para su uso en el diagnóstico de la enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah mediante la detección de la unión del anticuerpo como una determinación de la presencia de enfermedad por el virus Hendra o la enfermedad por el virus Nipah.

14. 14.

    Un método de detección de la presencia de virus Hendra o Nipah en una muestra biológica, que comprende poner en contacto dicha muestra con la preparación diagnóstica de acuerdo con la reivindicación 10 y analizar la unión del anticuerpo como una determinación de la presencia de dicho virus Hendra o Nipah.