ES2546663T3

ES2546663T3 - Vector dual para la inhibición del virus de la inmunodeficiencia humana

Info

Publication number: ES2546663T3
Application number: ES10720980.1T
Authority: ES
Inventors: Louis Randall Breton; Irvin Chen; Dong Sung An; Geoffrey P. Symonds; Maureen Boyd; Michelle Millington
Original assignee: Calimmune Inc
Current assignee: CSL Behring Gene Therapy Inc
Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2015-09-25
Anticipated expiration: 2030-05-26
Also published as: EP3329772B1; AU2010274031B2; JP2016013128A; JP2012533299A; JP6840189B2; RU2562868C2; US20220016176A1; EP2453735A2; AU2010274031A1; DK3329772T3; HK1168509A1; EP2453735B1; RU2012105281A; US20120201794A1; US20160243169A1; ES2770627T3; ES2657737T3; EP2949208B1; JP2019122413A; EP3659435A1

Abstract

Un vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH, donde el ácido nucleico inhibidor es un ARN pequeño de interferencia (ARNpi) o un ARN de horquilla corta (ARNhc) que tienen una región bicatenaria, donde la región bicatenaria comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica y complementaria a una secuencia de dicho correceptor de VIH, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

E10720980

03-09-2015

profiláctica para un paciente que es negativo a VIH o para tratar a un paciente que es positivo a VIH.

Los vectores de expresión de las composiciones pueden modificarse de tal forma que se localicen específicamente en tipos celulares particulares, tales como células inmunes. A modo de ejemplo, el vector de expresión puede combinarse 5 con un vehículo de direccionamiento génico mediado por receptor, en el que dicho vehículo comprende un ligando específico de receptor celular y un agente de unión a ADN. Como alternativa, puede unirse un ligando específico de receptor a un liposoma que comprende el vector de expresión. Los ligandos específicos de receptor pueden seleccionarse dependiendo de los tipos celulares de interés. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el vector de expresión puede localizarse en células CD34+ empleando un ligando que se une al marcador de la superficie celular CD34. Un experto en la técnica puede seleccionar ligandos adecuados para dirigirse a tipos celulares específicos, tales como células inmunitarias (por ejemplo, un monocito/macrófago, una célula mononuclear de sangre periférica, un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+, o una célula dendrítica). En determinadas realizaciones en las que el vector de expresión es un vector viral, el vector viral puede empaquetarse en partículas virales que tienen un tropismo particular por determinados tipos celulares. Por ejemplo, en una realización, el vector viral se empaqueta en partículas 15 retrovirales de VIH, permitiendo de este modo que el retrovirus recombinante infecte a linfocitos T CD4+ y macrófagos.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden ser para su administración a un paciente a través de cualquier ruta convencional siempre que el tejido diana esté disponible a través de esa ruta. Esto incluye oral, nasal, o bucal. Como alternativa, la administración puede ser mediante inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. En una realización, la composición farmacéutica puede ser para administración por vía rectal (por ejemplo, con un supositorio). Tras la formulación, las soluciones se administran preferentemente de un modo compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones pueden administrarse fácilmente en diversas formas de administración, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares. Para administración parenteral en 25 una solución acuosa, por ejemplo, la solución se tampona generalmente de manera adecuada y el diluyente líquido se hace primeramente isotónico, por ejemplo, con suficiente suero salino o glucosa. Dichas soluciones acuosas pueden usarse, por ejemplo, para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Preferentemente, se emplean medios acuosos estériles como se conoce por los expertos en la técnica, particularmente a la luz de la presente divulgación. A modo ilustrativo, puede disolverse una sola dosis en 1 ml de solución isotónica de NaCl y bien añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington’s Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Puede haber cierta variación en la dosificación dependiendo del estadío de la infección por VIH en el paciente que se esté tratando. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis adecuada para el paciente individual. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir estándares de esterilidad,

35 pirogenicidad, seguridad general y pureza, tal como requiere la Agencia de Estándares biológicos de la FDA.

En otra realización, la presente solicitud describe un método para tratar o prevenir la infección por VIH en un paciente administrando al paciente células hematopoyéticas resistentes al VIH producidas transduciendo las células con un vector de expresión de la invención. Por ejemplo, en un aspecto, el método comprende transducir células hematopoyéticas ex vivo con un vector de expresión descrito en el presente documento, e infundir las células transducidas al paciente. Puede administrarse una o más infusiones de las células transducidas al paciente. En algunos aspectos, el paciente recibe múltiples infusiones de las células transducidas a lo largo de un intervalo periódico, tal como semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, trimestralmente o anualmente. En un aspecto, el paciente recibe una infusión de las células transducidas cada dos semanas. Las células hematopoyéticas adecuadas 45 para su uso en el método incluyen, pero sin limitación, células progenitoras/madre hematopoyéticas (HPSC), monocitos, macrófagos, células mononucleares de sangre periférica, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, y células dendríticas. En un aspecto, las células hematopoyéticas usadas en el método son linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+,

o monocitos/macrófagos. En un aspecto preferido, las células hematopoyéticas usadas en el método son HPSC. Tal como se usa en el presente documento, las células hematopoyéticas transducidas incluyen las células transducidas en sí así como células derivadas de las células transducidas (por ejemplo, células generadas a partir de HPSC transducidas).

Por lo tanto, en un aspecto particular, la presente solicitud describe un método para tratar o prevenir la infección por VIH en un paciente reconstituyendo el sistema inmune con células resistentes al VIH generadas a partir de HPSC

55 transducidas. Por ejemplo, en un aspecto, el método comprende transducir HPSC con un vector de expresión, tal como se describe en el presente documento, y trasplantar dichas HPSC transducidas al paciente, en el que dichas células trasplantadas generan granulocitos, monocitos/macrófagos, y linfocitos que son resistentes a la infección por VIH. Los granulocitos, monocitos/macrófagos, y linfocitos son resistentes a la infección por las cepas trópicas R5 y X4 de VIH. En algunos aspectos, los granulocitos, monocitos/macrófagos, y linfocitos son resistentes a la infección por cepas de VIH que son resistentes a la HAART. El paciente puede ser negativo a VIH o positivo a VIH. En un aspecto, el paciente humano no se ha expuesto previamente a terapia antirretroviral elevadamente activa (HAART). En otro aspecto, el paciente está recibiendo un régimen de HAART. En otro aspecto más, el paciente está fracasando o ha fracasado en un régimen HAART.

65 Las células hematopoyéticas (por ejemplo, HPSC, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, y/o monocitos/macrófagos) que se van a transducir con un vector de expresión de la invención pueden ser alogénicas o autólogas. "Células

15

E10720980

03-09-2015

alogénicas" se refieren a células obtenidas a partir de individuos diferentes de la misma especie. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "células autólogas" se refiere a células aisladas a partir de un paciente que posteriormente se reimplantan o inyectan en el mismo paciente. Por lo tanto, un trasplante autólogo es uno en el que el donante y receptor son el mismo paciente. En determinadas realizaciones, las células hematopoyéticas son HPSC 5 autólogas. Los HPSC son preferentemente positivos a CD34 y pueden aislarse a partir de la médula ósea o la sangre periférica del paciente. Los métodos para dicha purificación se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº: 4.965.204, 4.714.680, 5.061.620, 5.643.741, 5.677.136, 5.716.827, 5.750.397, y 5.759.793). Por ejemplo, un método para purificar dichas células madre positivas a CD34 implica centrifugación de muestras de sangre periférica para separar células mononucleadas y granulocitos, seguido de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para seleccionar células CD34+. En una realización, las células se enriquecen respecto de células CD34+ mediante una tecnología de separación magnética, tal como aquella disponible de Miltenyi Biotec, y que se ha descrito previamente (Kogler et al., (1998) Bone Marrow Transplant., Vol. 21:233-241; Pasino et al. (2000) Br. J. Haematol., Vol. 108: 793-800). Las células positivas a CD34 pueden movilizarse desde la médula hacia la sangre antes de la recolección inyectando al paciente una o más citocinas conocidas que movilizan las células madre

15 hematopoyéticas, tale como factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de granulocitos y macrófagos, y factor de células madre.

Las HPSC positivas a CD34 (y/o otra célula hematopoyética descrita en el presente documento) se transducen preferentemente con un vector de expresión de la invención. Por ejemplo, en una realización, el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de ARNpi o ARNhc de un correceptor de VIH y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH a una célula diana, opcionalmente en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un primer promotor y dicha segunda secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un segundo promotor. En otra realización, el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de

25 ARNpi o ARNhc de un correceptor de VIH, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión, y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación del VIH, opcionalmente en el que dichas primera, segunda y tercera secuencia de ácido nucleico están unidas operativamente a un primer, segundo y tercer promotor. En otra realización adicional más, el vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un primer inhibidor de ARNpi o ARNhc de un correceptor de VIH, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo inhibidor de ARNpi o ARNhc de un correceptor de VIH, y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la fusión viral del VIH a una célula diana, opcionalmente en el que dichas primera, segunda y tercera secuencia de ácido nucleico están unidas operativamente a un primer, segundo y tercer promotor.

35 En una realización, la primera secuencia de ácido nucleico (o segunda secuencia de acido nucleico en realizaciones en las que el vector de expresión comprende tres secuencias de ácido nucleico) codifica un ARNpi o ARNhc que tiene una región bicatenaria, en el que la región bicatenaria comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica y complementaria a una secuencia de CCR5. En otra realización, la primera secuencia de ácido nucleico codifica un ARNhc que se dirige a CCR5 que tiene una secuencia de SEC ID Nº: 1. En otra realización, la primera secuencia de ácido nucleico codifica un ARNpi o ARNhc que tiene una región bicatenaria, en el que la región bicatenaria comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica y complementaria a una secuencia de CXCR4. En realizaciones particulares, las células hematopoyéticas transducidas (por ejemplo, HPSC, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, y/o monocitos/macrófagos) o células generadas a partir de estas expresan niveles reducidos de una proteína correceptora de VIH (por ejemplo, CCR5 o CXCR4) en comparación con células hematopoyéticas no traducidas. Por ejemplo, la

45 célula o células hematopoyéticas transducidas generadas a partir de estas pueden expresar un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % menos de proteína correceptora de VIH en comparación con células hematopoyéticas no transducidas. En otras realizaciones, las células hematopoyéticas se transducen con un vector de expresión de la invención en el que la tercera secuencia de ácido nucleico codifica una proteína TRIM5α o un derivado

o fusión de la misma, tal como TRIM5α humana, TRIM5α de mono rhesus, TRIM5α quimérica, o una proteína de fusión de TRIM5-ciclofilina humana. En otras realizaciones adicionales, las células hematopoyéticas se transducen con un vector de expresión de la invención en el que la segunda secuencia de ácido nucleico (o tercera secuencia de ácido nucleico en realizaciones en las que el vector de expresión comprende dos secuencias de ácido nucleico que codifican dos inhibidores de ARNpi o ARNhc de un correceptor de VIH) codifica una proteína C46. En dichas realizaciones, la célula o células hematopoyéticas transducidas generadas a partir de estas expresan niveles aumentados de la

55 proteína (por ejemplo, C46 o TRIM5α o un derivado o fusión de las mismas) en comparación con células hematopoyéticas no transducidas, es decir, un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, o más de un 200 % más de la proteína codificada en comparación con células hematopoyéticas no transducidas.

Después de la transducción de las células hematopoyéticas (por ejemplo, HPSC, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, o monocitos/macrófagos) con un vector de expresión de la invención, las células transducidas se reintroducen o trasplantan de nuevo al paciente. Las células transducidas pueden inyectarse por vía parenteral al paciente, o reintroducirse mediante cualquier otra ruta conocida en la técnica. En una realización, las células hematopoyéticas transducidas se formulan para su inyección por vía intravenosa al paciente. Preferentemente, se administrará al paciente una dosis eficaz de células hematopoyéticas transducidas. Una "dosis eficaz" es una cantidad suficiente para 65 producir un resultado clínico beneficioso o deseado y puede depender del tipo de célula hematopoyética usada. En una realización, la célula hematopoyética es una HPSC y una dosis eficaz es una cantidad que es suficiente para

16

imagen14

imagen15

imagen16

E10720980

03-09-2015

Ejemplo 2. Transducción de líneas de células T diana humanas mediante vector dual sh5/C46

Los diversos vectores lentivirales descritos en el Ejemplo 1 se usaron para infectar células CEM.NKR.CCR5 y Molt4/CCR5 (NIH AIDS Reagent Program). Se resuspendieron 2 x 105 en 1 ml de medio que contenía virus (VCM) no

5 concentrado con FBS al 10 % y 8 mg/ml de polibreno. Los cultivos se incubaron a 37 °C durante 1,5 horas y se añadió 1 ml adicional de medio de crecimiento (RPMI + FBS al 10 %). Las células se analizaron mediante análisis FACS a los 4 días después de la transducción para la expresión de C46 (mediante tinción de anticuerpo de 2F5), knockdown de CCR5 (mediante tinción de anticuerpo CD195), y expresión de GFP. Las células se mantuvieron en cultivo continuo durante hasta 8 semanas pasándolas dos veces a la semana.

10 La expresión simultánea de ARNhc (detectado mediante knockdown de CCR5) y C46 en células CEM.NKR.CCR5 y Molt4/CCR5 transducidas se muestra en la Figura 6 y en la Figura 7, respectivamente. Se observó expresión de GFP para las construcciones que contenían EGFP (paneles 1, 3 de izquierda a derecha); se observó una reducción en la expresión de CCR5 (por ejemplo, modulación negativa de CCR5 que muestra expresión de ARNhc) para las

15 construcciones que contenían sh5 (paneles 2, 3, 5, de izquierda a derecha), y se observó expresión de C46 (medida mediante anticuerpo de 2F5) para las construcciones que contenían C46 (paneles 4, 5, de izquierda a derecha). El porcentaje de células positivas se muestra en cada cuadrante de citometría de flujo (Q1-Q4) para cada grupo de células transducidas con los vectores lentivirales indicados a las 4 y 8 semanas en cultivo. Se observaron niveles de expresión similares en las semanas 4 y 8. Los valores de intensidad media de fluorescencia (MFI) para la Figura 6 se

20 muestran en la Tabla 3 a continuación, mientras que los valores de MFI para la Figura 7 se muestran en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 3. Valores de intensidad media de fluorescencia para células CEM.NKR.CCR5 que expresan varias construcciones

Control de GFP: sh5 Sh5/EGFP C46 Sh5/C46

4 semanas: 70,2 33,8 10,5 78,2 11,5

8 semanas: 153,6 64,6 18,6 129,1 22,6

Tabla 4. Valores de intensidad media de fluorescencia para células Molt4/CCR5 que expresan varias construcciones

Control de GFP: sh5 Sh5/EGFP C46 Sh5/C46

4 semanas: 34,4 7,3 5,0 24,1 5,9

8 semanas: 80,9 25,3 18,2 69,5 51,5

Para determinar si los transgenes causaron alguna diferencia en los parámetros de crecimiento de las células, las

30 células CEM.NKR.CCR5, que mostraron cada una un 100 % de expresión de la construcción transgénica, se sembraron a 2 x 104 células/ml, cultivadas durante 4 días y se contaron. Las células se sembraron a partir de esta población en cuatro ocasiones separadas durante un periodo de 3 semanas a 1 o 2 x 105/ml y se contaron 4-7 días después. No se observaron diferencias en las velocidades de crecimiento de las células trasnducidas con las diferentes construcciones (Figura 8).

35 Los resultados de estos experimentos demuestran que tanto el ARNhc que se dirige a CCR5 como la proteína C46 pueden expresarse de manera suficiente a partir del mismo vector en líneas de células T humanas, y la expresión de ARNhc de CCR5 y de C46 no tiene efecto en la velocidad de crecimiento de las células.

40 Ejemplo 3. Transducción de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante vector dual de sh45/C46

Los diversos vectores descritos en el Ejemplo 1 se usaron para infectar células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC) obtenidas del Servicio de Transfusión de Sangre de la Cruz Roja Australiana. Se aislaron los PBMC 45 a partir de capas leucocitarias usando Ficoll-plaque PLUS (GE Healthcare) seguido de eliminación de CD8 usando microperlas de CD8+ (Miltenyi Biotec) y una unidad magnética VarioMACS. Los PBMC desprovistos de CD8+ se cultivaron durante 48 horas en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 20 % y 5 mg/ml de fitohemaglutinina (PHA) (Sigma) a 2 x 106 células/ml. Después de 2 días de estimulación con PHA, se recogieron las células en suspensión, se centrifugaron a 200 g durante 5 minutos y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml de RPMI + FBS al 20 % + 10 U/ml de

50 interleucina 2 humana recombinante (rhTL-2, Roche) durante 5 horas antes de la transducción.

Para determinar el método de transcripción preferido, se transdujeron los PBMC con la construcción lentiviral sh5/EGFP usando diversas condiciones: transducción 1x con VCM, transducción 2x con VCM, transducción 1x con precarga de VCM (Precarga 1), transducción 2x con precarga de VCM (Precarga 2), VCM concentrado 55 aproximadamente 20 veces (concentrado) (véase el Ejemplo 1, sección B). Tal como se muestra en la Figura 9, la

20

imagen17

E10720980

03-09-2015

Ejemplo 4. Transducción de células madre/hematopoyéticas humanas (HPSC) mediante vector dual sh5/C46

El vector lentiviral sh5/C46 (LV) se usó para transducir células madre/progenitoras hematopoyéticas CD34+ (HPSC) obtenidas de células mononucleares de sangre periférica de donante en bruto. Se inyectó a los donantes con factor 5 estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) para movilizar los HPSC y las células mononucleares de sangre periférica. Después de la inyección de G-CSF, las células se recogieron mediante aféresis y se congeló la población de células mononucleares que contenía HPSC movilizadas. La muestra de células mononucleares usada en este ejemplo se obtuvo a partir de estas reservas concentradas. Una bolsa de recogida de células madre de 50 ml en la que se estimó que contenía en el momento de la congelación 3,7 x 107 HPSC CD34+, se descongeló. Durante la

10 descongelación, se descubrió que contenía un total de 33,6 x 108 células viables (viabilidad del 73 %) y el número resultante de HPSC CD34+ aislado usando MACS (separación de células con anticuerpo magnético) se encontró dentro de las expectativas a ~ 3,3 x 107, es decir, ~1 % del número total de células mononucleares, con un 98 % positivo a CD34 (véanse los análisis pre y post-separación en el panel superior de la Figura 14).

15 Estas células se usaron entonces en el siguiente protocolo experimental:

1.: Se pre-estimularon 6 x 106 durante 24 en medio sin suero X-vivo que contenía factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO) y ligando FIt3 (FIt3L) (cada uno a 50 ng/ml).

2.: Entonces se transfirieron alícuotas de 4 x 105 células a una placa de 12 pocillos precargada durante 6 horas con

20 medio que contiene virus (VCM). Las células se transdujeron durante toda la noche (con control de GFP, sh5, sh5/EGFP, C46, o sh5/C46), o se dejaron sin transducir, y después se transfirieron a medio reciente durante 72 horas.

3. El análisis FACS efectuado a las 72 horas después de la transducción demostró una transducción del 25-30 % mediante GFP (Figura 14, panel inferior). En este ejemplo, C46 no fue detectable mediante tinción de 2F5,

25 aparentemente debido a la carencia de sensibilidad de la citometría de flujo con estas células. Las células restantes se pusieron en cultivos de metilcelulosa CAMEO-4 (Hemogenix), se emplacaron a 100 células/pocillo en duplicado. Cuando se marcaron para colonias, no se observaron diferencias significativas entre los cultivos en el día 11 (Tabla 8).

30 Tabla 8. Porcentajes de colonias de HPSC CD34+ transducidas con diversas construcciones lentivirales

CFU-E: BFU-E CFU-GM

Control (no transducido): 30,5 9,9 59,6

Control de GFP: 15,6 28,9 55,6

Control de GFP: 18,5 9,3 72,2

sh5: 41,2 11,8 47,1

sh5/EGFP: 26,0 30,0 44,0

sh5/EGFP: 10,4 4,5 85,1

C46: 10,2 28,6 61,2

C46: 21,4 17,9 60,7

sh5-C46: 17,6 35,3 47,1

sh5/C46: 15,4 38,5 46,2

Promedio: 20,7 21,5 57,9

Desv. Est.: 9,6 12,2 13,1

Ejemplo 5. Las líneas de células T transducidas con vector dual sh5/C46 inhiben la replicación del VIH

Se expusieron líneas de células T (Molt4/CCR5) con la construcción lentiviral dual sh5/C46 (véase la descripción del

35 vector en el Ejemplo 1) con varias cepas de VIH: VIHBaI (CCR5 trópica), VIHHIB (CXCR4 trópica), y VIHSF2 (CCR5 y CXCR4 trópica). Para los ensayos de exposición, se añadieron 1 x 106 células Molt4/CCR5 transducidas a tubos de 15 ml y se centrifugaron. Se descartó el sobrenadante. El medio que contenía virus del VIH (VCM) se añadió a una concentración final por tubo a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,2-0,002. Entonces se añadió polibreno a una concentración final de 8 µg/ml y se golpeó levemente cada tubo. Las células y virus se incubaron durante 2 horas a 37

40 °C con agitación suave cada 30 minutos. Después de la incubación de 2 horas, las células se lavaron en medio (RPMI

+ FBS al 10 %) y se resuspendieron en 3-4 ml de medio en matraces T25. Las células se muestrearon y alimentaron cada 3-4 días hasta el día 11. Se retiraron 150 µl de sobrenadante por duplicado y se almacenaron a 4 °C. Se ensayaron los niveles de proteína P24 (una medida de la infección por VIH) según el protocolo del fabricante usando generalmente una dilución 1/105 a 1/106 para asegurarse de que los valores se encontraban en la curva patrón.

22

E10720980

03-09-2015

La Figura 15 muestra los niveles de proteína de células no transducidas o células transducidas con la construcción lentiviral dual sh5/C46 13 días después de la exposición con cepa SF2 de VIH trópica dual (CCR5 y CXCR4 trópica). Los resultados demuestran que las células transducidas con la construcción sh5/C46 mostraron una inhibición de aproximadamente 2 log en todas las tres MOI (0,2, 0,02, 0.002) en cada uno de los 2 muestreos independientes, en comparación con células no transducidas. La Figura 16 muestra los niveles de proteína p24 de células no transducidas

o células transducidas bien con la construcción lentiviral sh5/C46 o C46 11 días después de la exposición a cepa SF2 de VIH trópica. Los datos muestran aproximadamente una inhibición 2 log mediante la construcción sh5/C46 en cada uno de los dos muestreos independientes y una inhibición 3 log mediante C46 (aparentemente debido a una mayor expresión de C46 en esta construcción particular) a los dos MOI ensayados. El panel inferior de la Figura 16 muestra la expresión mediante citometría de flujo. Los valores de intensidad de fluorescencia media se muestran en la Tabla 9 a continuación.

Tabla 9. Valores de intensidad media de fluorescencia para células Molt4/CCR5 que expresan construcciones lentivirales C46 o sh5/C46

No transducidas: C46 Sh5/C46

CCR5 MFI: 1478,8 1811,0 1.44.9

2F5 MFI: 344,6 1454,4 1171,8

15 En un experimento separado, las células Molt4/CCR5 bien no se transdujeron o se transdujeron con construcciones lentivirales de C46 (Gen 2) o sh5/C46 (G2R5) y posteriormente se expusieron a virus VHI-SF2 trópico dual (CCR5 y CXCR4), Bal (CCR5 trópica) o NL4-3 (CXCR4 trópica) a un MOI de 0,2. Los niveles de proteína P24 se evaluaron 11 días después de la exposición viral como medida de la infección por VIH. Tal como se muestra en la Figura 17, las células que expresaban ambas construcciones lentivirales fueron eficaces para reducir la infección con todas las tres cepas de VIH. La Figura 18 muestra los niveles de proteína p24 a partir de células no transducidas (Molt4) o células transducidas con una de cuatro construcciones lentivirales [(1) sh5 (R5); (2) C46 (G2); (3) sh5/C46 (R5-G2); (4) sh5/EGFP (R5-GFP)] 7 y 10 días después de la exposición a la cepa trópica Bal de VIH CCR5 a un MOI de 0,2. El grupo "mixto" es una mezcla de no transducidas, sh5, C46, sh5/C46 todas mezcladas por igual (es decir, un 25 % de

25 cada). Los resultados demuestran que las células que expresan el ARNhc contra CCR5 y el gen C46 a partir de una sola construcción lentiviral (construcción dual) proporcionan protección potenciada contra la infección con una cepa trópica de VIH CCR5 tanto a los 7 como a los 10 días después de la exposición viral.

Los resultados de esta serie de experimentos demuestran que las células T transducidas con la construcción lentiviral dual sh5/C46 proporcionan protección contra la infección con cepas trópicas CCR5, CXCR4, y trópicas duales CCR5 y CXCR4 de VIH.

Ejemplo 6. Los PBMC transducidos con vector dual sh5/C46 inhiben la replicación del VIH

35 Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) estimuladas con fitohemaglutinina (PHA)/IL2 se transdujeron con vectores lentivirales, tal como se describe en el Ejemplo 3. En la Figura 19A se muestra un esquema de la construcción dual que expresa ARNhc contra CCR5 y proteína C46 (LVsh5C46). Cuatro días después de la transducción, se tiñeron las células con el anticuerpo monoclonal adecuado (por ejemplo, anticuerpo de CD195 o 2F5) y CCR5, C46, y se analizó la expresión de GFP mediante citometría de flujo (Figura 19B). Los PBMC transducidos de manera lentiviral (LV) se expusieron con cepas trópicas R5 o X4 de VIH 16 días después de la transducción con LV. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron cuatro días después de la infección por VIH y se ensayaron respecto de la proteína p24 mediante ELISA (Figura 19C).

Tal como se muestra en la Figura 19C, los PBMC transducidos con vector lentiviral sh5/C46 muestran infección por

45 VIH inducida mediante cepas trópicas tanto R5 como X4, según se evalúa mediante niveles de proteína p24. Los PBMC transducidos con una construcción sh5/C46 son resistentes a la infección inducida por VIH trópico R5 pero no X4. Estos resultados indican que el vector dual sh5/C46 es capaz de proteger contra la infección por VIH inducida por cepas trópicas de R5 o X4.

Ejemplo 7. El vector sh5 regula negativamente la expresión de CCR5 en órganos linfoides y efectúa supervivencia preferencial de linfocitos T CD4+ transducidos ex vivo (ejemplo no ilustrativo).

Se implantaron células madre/hematopoyéticas CD34+ (HPSC) solidificadas con Matrigel en combinación con un segmento de timo bajo la cápsula renal de un modelo de ratón de médula ósea/hígado/timo (BLT) humanizado (véase

55 Mclkus et al. (2006) Nat Med. Vol. 12:1316-1322; Shimizu et al. (2010) Blood, Vol. 115:1534-1544). El ratón humanizado NOD/SCID-hu BLT permite examinar la diferenciación de HPSC humanas transducidas en el organoide similar al timo (thy/liv), y la migración de linfocitos T diferenciados en órganos linfoides sistémicos, incluyendo tejido linfoide asociado a los intestinos, el sitio principal de replicación del VIH.

Para examinar a sh1005 (ARNhc que se dirige a CCR5) en este modelo humanizado de ratón, las células CD34+ derivadas con hígado fetal transducidas con vector y las células CD34-solidificadas con matrigel y un segmento de

23

imagen18

E10720980

03-09-2015

Las células de control (mCherry+) y sh5/C46 activas (EGFP+) transducidas se comparan a lo largo del tiempo usando citometría de flujo y RT-PCR. Las comparaciones se efectúan entre células sh5/C46 transducidas y células transducidas con uno de los vectores individuales (sh5 o C46). La susceptibilidad a la infección por VIH se examina inyectando una cepa de VIH trópica de R5, X4, o dual por vía intravenosa en animales reconstituidos después del

5 trasplante de HPSC. El porcentaje de linfocitos T CD4+ y las relaciones de linfocitos T CD4/CD8 en cada una de las poblaciones transducidas con vector se evalúa para determinar la efectividad del silenciamiento de CCR5 y la expresión de C46 en la supervivencia de linfocitos T CD4+.

Ejemplo 9. Uso de construcciones duales en pacientes con VIH humanos

Una construcción lentiviral dual, que incluye al vector dual sh5/C46, se introduce en células humanas autólogas y posteriormente se administran al paciente. La construcción lentiviral dual se introduce en una o más células HPSC CD34+, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, monocitos/macrófagos aislados del paciente al que se reimplantarán (por ejemplo, células autólogas). Como alternativa, se usan células de otro individuo (alogénicas). Como alternativa, se usa

15 un vector triple, tal como se ha descrito en el presente documento.

Con respecto al tropismo de VIH, muchos pacientes tendrán un virus de R5, una proporción menor tendrá virus de X4, y un número intermedio tendrá una población mixta. Las construcciones duales descritas en el presente documento tienen la agilidad para dirigirse a virus tanto de R5 como de X4 y pueden ser beneficiosas para pacientes con una población celular mixta y también pueden prevenir la resistencia en aquellos con una sola población. Las construcciones también pueden ser beneficiosas en pacientes con virus resistente a HAART.

Las células para su transducción se obtienen del paciente inyectando una o más citocinas que movilizan a HPSC y a otras células, y las poblaciones celulares relevantes se separan para transducción lentiviral. Las células transducidas

25 se introducen por vía intravenosa en el mismo paciente o en otro paciente para tratar o prevenir la infección por VIH. Se usan una o más dosis o infusiones de las células, tal como se describen en el presente documento.

El ensayo clínico se diseña basándose en consideraciones que incluyen el estado clínico del paciente, el tratamiento previo y/o la resistencia al tratamiento. Se incluyen en el ensayo diferentes grupos de pacientes. Por ejemplo, un subconjunto de pacientes no ha recibido aún terapia antirretroviral altamente activa (es decir, no han estado expuestos previamente a HAART). En general, estos pacientes están bastante sanos (independientemente de su historial de infección por VIH) y los criterios de selección para recibir células hematopoyéticas transducidas con vector lentiviral dual pueden incluir aquellos pacientes que tienen un historial de disminución de CD4 relativamente rápido, elevada carga viral, y/o síntomas tempranos. La Figura 21 muestra una respuesta esperada en dicho grupo de pacientes. Las

35 células transducidas con vector lentiviral dual se introducen en un paciente en un momento 0. Las Figuras 21A y 21B muestran predicciones de carga viral y recuento de CD4 en pacientes tratados con una infusión de células transducidas (estrella) frente a pacientes que no reciben células transducidas con vector lentiviral dual (triángulo). Se espera que los pacientes no tratados mantengan una elevada carga viral y una disminución continuada en el recuento de CD4 a lo largo del tiempo. Por el contrario, aquellos tratados con las células transducidas con el vector lentiviral dual se espera que muestren una disminución en la carga viral a lo largo del tiempo y un aumento en el recuento de CD4 (después de una potencial disminución inicial debido a la aféresis). Por lo tanto, el tratamiento puede retrasar la necesidad de HAART y/o reducir su necesidad una vez que se ha iniciado la HAART.

Un segundo subconjunto de pacientes es positivo a VIH y actualmente bien controlado en HAART. La Figura 22 detalla

45 una respuesta esperada a una sola infusión de células transducidas con vector lentiviral dual en dicho grupo de pacientes. Se muestra la carga viral predicha para un paciente tratado con una dosis de células transducidas (estrella) frente a un paciente no tratado (triángulo). Las células transducidas con vector lentiviral dual se introducen en un paciente en un momento 0. Se efectúan dos interrupciones del tratamiento HAART en varios instantes (ATI), por ejemplo, en las semanas 24-28 y 40-48, continuando los pacientes sin HAART si la carga viral permanece por debajo de un límite de seguridad establecido previamente (por ejemplo, 100K copias/ml). Las interrupciones de HAART son para proporcionar un periodo en el que puede haber supervivencia preferencial inducida por VIH de aquellas células protegidas por la construcción lentiviral dual y una disminución resultante en la carga viral. El punto final principal es a la semana 48, pero también se puede medir el área bajo la curva de la carga viral entre las semanas 40-48 y 40-100. La carga viral predicha disminuye a largo plazo para pacientes tratados y no tratados (aunque más lentamente para

55 pacientes que no reciben infusiones de células transducidas con vector lentiviral dual) a medida que los pacientes retoman la HAART (según sea necesario). El tratamiento puede reducir la necesidad de HAART y sus complicaciones asociadas.

Un tercer grupo de pacientes comprende individuos que está fracasando con la HAART debido a resistencia a los fármacos de la HAART, al no cumplimiento, o a alguna otra razón. La Figura 23 ilustra la carga viral predicha (Figura 23A) y el recuento de CD4 predicho (Figura 23B) esperados en dicho paciente. Después de la infusión de células transducidas con vector lentiviral dual en el día 0, se espera que la carga viral disminuya y el recuento de CD4 aumente (estrella) en comparación con un paciente no tratado, donde se espera que la carga viral permanezca igual o aumento y se espera que el recuento de CD4 disminuya a lo largo del tiempo (triángulo).

65 Los puntos finales en todos los grupos de pacientes incluyen carga viral, recuentos de CD4, tiempo para retomar/iniciar

25

Claims

imagen1

imagen2