ES2549209A2

ES2549209A2 - Partículas víricas VSV-VIH que carecen de la funcionalidad transcriptasa inversa y aplicaciones terapéuticas de las mismas

Info

Publication number: ES2549209A2
Application number: ES201590017A
Authority: ES
Inventors: Sonsoles SÁNCHEZ-PALOMINO; Carmen ÁLVAREZ FERNÁNDEZ
Original assignee: IrsiCaixa Institut de Recerca de la Sida; Laboratorios del Dr Esteve SA
Current assignee: IrsiCaixa Institut de Recerca de la Sida; Esteve Pharmaceuticals SA
Priority date: 2012-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2015-10-26
Anticipated expiration: 2033-09-04
Also published as: ES2549209R1; EP2703482A1; ES2549209B1; WO2014037409A1

Abstract

Partículas víricas VSV-VIH que carecen de la funcionalidad transcriptasa inversa y aplicaciones terapéuticas de las mismas. La presente invención se refiere al desarrollo de viriones no replicativos que tienen una mutación en la secuencia que codifica la proteína RT y que comprenden un genoma de un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y vehiculizados por la proteína G de un virus de la estomatitis vesicular (VSV). Dichos viriones son útiles en medicina, concretamente para su uso en la generación de vacunas y más concretamente para el tratamiento del SIDA. Además la presente invención se refiere a un método para obtener una vacuna personalizada.

Description

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Figura 10. Comparación de los resultados obtenidos utilizando el modelo de cocultivo con CD-DM y el modelo ex vivo establecido con PBMC. CD-DM, células dendríticas derivadas de monocitos; PBMC, células mononucleares periféricas.

Figura 11. Visualización mediante microscopía electrónica de viriones NL4-3 purificados obtenidos por transfección de células 293T en ausencia (A) o en presencia (B) de Amprenavir (inhibidor de la proteasa).

Figura 12. A. Representación esquemática de del genoma de VIH pNL4-3/ΔRT/Δ1136env.

Figura 13. Visualización mediante microscopía electrónica de transmisión de las células 293T productoras de viriones NL4-3 (A) y NL4-3 ΔRT (B). También se muestran los viriones purificados de dichas células. También se muestran células 293T productoras de viriones ΔRT/Δ1136en/VSV así como pseudoviriones de células 293T transfectadas con pΔRT/Δ113env

+ pVSV-G (C).

Figura 14. Infección de células THP-1 con viriones NL4-3, NL4-3/ΔRT y NL4-3/ΔRT-VSV. Se marcaron los lisosomas de las células THP-1 con un marcador liso-seguidor. Los viriones se marcaron con Gag-GFP. Los núcleos se marcaron con DAPI. La entrada en las células era independiente de lisosomas en viriones NL4-3 y NL4-3/ΔRT mientras que en el caso de NL4-3/ΔRT-VSV es dependiente de la ruta lisosomal mostrado por la colocalización de gag-GFP y el colorante lisosomal.

Figura 15. Perfil proteico de los viriones NL4-3, NL4-3/ΔRT y NL4-3/ΔRT/Δ1136env. Los viriones purificados por ultracentrifugación se usaron para extraer proteínas y separarlas en un gel de Tris-Glicina en gradiente del 4-12%. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-p24 para estudiar el perfil de procesamiento de Gag en viriones NL4-3/ΔRT, NL4-3/ΔRT-VSV y NL4-3. Hay un procesamiento de Gag más débil en viriones NL4-3/ΔRT y NL4-3/ΔRT-VSV representado por un aumento en las formas p55gag y MA-CA p41 en detrimento de CA p24. En el mismo, también se muestra un aumento de las formas intermedias en viriones NL4-3/ΔRT.

Figura 16. A. Frecuencia de respuestas positivas de IFN-γ-ELISPOT y magnitud obtenida frente a los inmunógenos indicados. Las barras blancas muestran el porcentaje de respuestas positivas (%) mientras que cada símbolo representa la media de CFM (células formadoras de mancha/106 células) ± EEM contadas por pocillo después de la resta del fondo basal. B. Se ensayaron veintiún PBMC crioconservadas de individuos positivos para VIH por ELISPOT para

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detectar la producción IFN-γ. Las PBMC se pulsaron con 200 ng/ml de equivalentes de p24 en todos los casos. La magnitud de la respuesta fue significativamente menor contra viriones inactivados WT (WT+AT-2) que contra WT+APV+AT-2 (*p<0,05). Los valores promediados de pocillos duplicados normalizados a CFM/106 PBMC se muestran para las condiciones de

5 estimulación indicadas. Los gráficos representan media ± error estándar de la medio (EEM). Se definió el umbral de positividad para cada construcción o antígeno como al menos 50 CFM/106 PBMC y al menos dos veces la del medio control.

Figura 17. Evaluación de la respuesta celular de células CD-DM frente a diferentes

10 inmunógenos: NL4-3, WT+AT-2, NL4-3 ΔRT/VSV, NL4-3 ΔRT y p24 recombinante, y diferentes concentraciones (0,5, 1 y 5 µg/ml de p24). La prueba se realizó con 9 pacientes respondedores y frente al mismo lote de inmunógenos. Se cuantifica el índice de proliferación en CD8+.

Descripción detallada de la invención

15 La presente invención se refiere a viriones no replicativos que comprenden un genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que carecen de una proteína transcriptasa inversa funcional y dirigidos por la glicoproteína G de la envuelta de un virus de la estomatitis vesicular (VSV) para el fin de obtener vacunas autólogas y heterólogas, tanto preventivas como

20 terapéuticas, contra la infección por VIH/SIDA.

Al vectorizar estos inmunógenos con VSV, el riesgo de reversión vírica de VIH disminuye y su respuesta inmune aumenta, proporcionando así una solución más adecuada para su aplicación clínica. Las partículas víricas de la invención son capaces de inducir una respuesta inmune

25 mayor que la respuesta inmune generada por otras partículas no vectorizadas por la glicoproteína G de VSV. Véase la figura 16.

Los inmunógenos de la invención tienen ventajas adicionales, ya que son más seguros que otros inmunógenos de VIH conocidos debido al hecho de que los viriones de la invención son 30 incapaces de replicarse.

a) Definiciones de términos y expresiones generales

El término “célula inmune activada”, como se usa en el presente documento, se refiere a una 35 célula inmune que, tras ser tratada con factores inmunogénicos, es capaz de generar una

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respuesta inmune frente a dichos inmunógenos. Dichas células inmunes pueden ser, entre otras, linfocitos o células dendríticas (CD).

El término “adyuvante”, como se usa en el presente documento, se refiere a un agente inmunológico que modifica el efecto de un inmunógeno, mientras que tiene pocos, si alguno, efectos directos cuando se administra por sí mismo. Con frecuencia se incluye en vacunas para aumentar la respuesta inmune del receptor al antígeno suministrado, al tiempo que mantiene el material exógeno inyectado a un mínimo. Los adyuvantes se añaden a las vacunas para estimular la respuesta del sistema inmune al antígeno diana, pero no confieren inmunidad por sí mismos. Ejemplos no limitantes de adyuvantes útiles incluyen sales minerales, polinucleótidos, poliargininas, ISCOM, saponinas, monofosforil lípido A, imiquimod, inhibidores de CCR5, toxinas, polifosfacenos, citoquinas, proteínas inmunorreguladoras, proteínas de fusión inmunoestimuladoras, moléculas coestimuladoras y combinaciones de los mismos. Las sales minerales incluyen, pero no están limitadas a, AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), sílice, alumbre, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, caolín o carbono. Los polinucleótidos inmunoestimuladores útiles incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos de CpG con o sin complejos inmunoestimuladores (ISCOM), oligonucleótidos de CpG con o sin poliarginina, ácidos poli IC o poli AU. Las toxinas incluyen toxina del cólera. Las saponinas incluyen, pero no están limitadas a, QS21, QS17 o QS7. Un ejemplo de una proteína de fusión inmunoestimuladora útil es la proteína de fusión de IL-2 con el fragmento Fc de inmunoglobulina. Las moléculas inmunorreguladoras útiles incluyen, pero no están limitadas a, CD40L y ligando CD1a. Las citoquinas útiles como adyuvantes incluyen, pero no están limitadas a, IL-1, IL-2, IL-4, GMCSF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-α, IFN-β e interferón gamma. Además, ejemplos de adyuvantes son muramil dipéptidos, tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominado nor-MDP), Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina (CGP 19835A, también denominado MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión al 2% de escualeno/TWEEN® 80, lipopolisacáridos y sus varios derivados, incluyendo lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund, Adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU), cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella, Titermax, Quil A, ALUN, derivados de lípido A, derivados de la toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, derivados de MPL, matrices de péptidos sintéticos o GMDP, Montanide ISA-51 y QS-21, oligonucleótido CpG, poli I:C y GMCSF. Véase, Osol A., Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.,

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capaz de complementar el mutante G sensible a temperatura de VSV tsO45 a una temperatura no permisiva y que tiene una identidad mínima en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de la glicoproteína G de VSV. Véase, Lefkowitz E, et al., Virology 1990; 178(2):373

383. Las variantes funcionalmente equivalentes de la glicoproteína G de VSV incluyen polipéptidos que muestran al menos el 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de similitud o identidad con las variantes naturales diferentes de la glicoproteína G mencionada anteriormente. Las variantes de la glicoproteína G de VSV pueden ser tanto naturales como artificiales. La expresión “variante natural” se refiere a todas esas variantes de la glicoproteína G de VSV definida anteriormente que se producen de forma natural en otras cepas. La expresión “variante artificial” se refiere a un polipéptido recombinante

o sintético. El término “proteína gp160” se refiere al producto del gen env y es un precursor de las proteínas de la envuelta gp120 y gp41.

El término “genoma de VIH” o “genoma vírico de VIH”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ARN de aproximadamente 9749 nucleótidos de longitud encerrada por la cápside de VIH y que codifica los genes gag, pol, env, tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, vpx y, opcionalmente, tev. La secuencia del genoma de VIH subyace una alta variabilidad, por esta razón, el genoma de VIH al que hace referencia la invención no se limita a ninguna secuencia específica. Las secuencias preferidas son las de los tipos y subtipos de VIH recitados en el presente documento.

La expresión “sujeto infectado por VIH-1”, como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto humano infectado por VIH-1. Los sujetos infectados por VIH-1 se identifican mediante afecciones clínicas asociadas con la infección por VIH y recuentos de linfocitos T CD4+. Desde un punto de vista práctico, el médico ve la infección por VIH-1 como un espectro de trastornos que varían desde infección primaria con o sin el síndrome agudo de VIH hasta el estado de infección sintomática de enfermedad avanzada. El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en Atlanta, Georgia, ha establecido una definición autorizada para el diagnóstico de SIDA, que informa al experto en la materia de si se ha producido el inicio del SIDA: en un sujeto infectado por VIH, el recuento de células T CD4+ debe estar por debajo de 200 células por mm cúbico de sangre, o debe haber aparición clínica de una infección oportunista inicial que define SIDA, tal como PCP (es decir, neumonía por Pneumocystis carinii), candidiasis oral, tuberculosis pulmonar o carcinoma cervical invasivo. Los métodos de determinar el recuento de células T CD4+ de un sujeto se conocen en la técnica.

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La expresión “carece de una proteína gp160 funcional”, como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que la proteína gp160 o sus productos gp120 o gp41 son incapaces de unirse a la superficie de la célula diana. Particularmente, un virión puede carecer de una proteína gp160 funcional cuando: (i) la proteína gp120 es incapaz de unirse al receptor CD4 de una célula diana; (ii) la proteína gp120 es capaz de unirse al receptor CD4 de una célula diana pero incapaz de unirse a los correceptores CCR5 o CXCR4; (iii) la proteína gp120 es incapaz de unirse a los tres receptores CD4, CCR5 y CXCR4; (iv) la proteína gp41 es incapaz de ayudar en la fusión de la partícula vírica con la célula diana, o (v) una combinación de cualquiera de las anteriores (i) a (iv). La expresión “carece de una proteína gp160 funcional” también se refiere a viriones que tienen una proteína gp160 que no se procesa en sus productos gp120 y gp41 y, por tanto, es incapaz de producir proteínas funcionales gp120 o gp41.

El término “gen marcador” o “gen indicador”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica un producto que da lugar a una señal que puede ser fácilmente medida o detectada. Los genes marcadores incluyen, pero no se limitan a, el gen GFP (proteína fluorescente verde), el gen LacZ que codifica la proteína β-galactosidasa, el gen de la luciferasa de renilla o luciérnaga que codifican la proteína luciferasa.

El término “mutación”, como se usa en el presente documento, se refiere a un cambio en una secuencia de ácido nucleico. Dicha mutación incluye, pero no está limitada a, sustitución (es decir, intercambio de uno o más nucleótidos por otros), inversión (es decir, un segmento de ADN del interior de un gen se invierte, para ello son necesarias dos rotaciones de 180º, una para invertir la secuencia y la otra para mantener la polaridad del ADN), translocación (es decir, un segmento de un gen cambia de posición para estar en otro lugar distinto del mismo gen o en otro lugar del genoma), e inserciones o deleciones de nucleótidos (es decir, la adición de uno o más nucleótidos (inserciones o adiciones) o la pérdida de uno o más nucleótidos (deleciones) que tienen como consecuencia cambios en el marco de lectura, produciéndose un error de lectura durante la traducción que conlleva desde la formación de proteínas no funcionales hasta la ausencia de dicha proteína).

El término “nef”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la proteína Nef que controla negativamente moléculas CD4 y HLA de la célula infectada y desempeña un papel en la patogenicidad del virus.

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El término “proteína RT no funcional”, como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que la proteína RT no tenga función transcriptasa inversa (es decir, no sea capaz de sintetizar ADN bicatenario utilizando como molde ARN monocatenario). Se pueden usar diferentes métodos del estado de la técnica para analizar la función de dicha proteína; dichos métodos dependerán de la función de la proteína. Así, por ejemplo, para determinar si la proteína RT es funcional pueden realizarse diversos ensayos, entre otros, reacciones de transcripción inversa de una secuencia de ARN, o analizar la ausencia de replicación de un virus como consecuencia de poseer una proteína RT no funcional determinando colorimétrica o fluorimétricamente la presencia de un gen marcador del genoma vírico en células infectadas con un virión que comprende la secuencia que codifica la proteína RT que se quiere analizar.

El término “deleción parcial”, como se usa en el presente documento, se refiere a la pérdida de al menos el 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 99% de los nucleótidos que forman una secuencia de nucleótidos de un gen.

La expresión “soporte farmacéuticamente aceptable”, como se usa en el presente documento, se refiere a un vehículo o excipiente que está implicado en llevar o transportar un producto de interés de un tejido, órgano o parte del cuerpo a otro tejido, órgano o parte del cuerpo, y que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que es generalmente segura y no tóxica.

El término “pol”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica las enzimas víricas necesarias para el proceso de replicación vírica: proteasa (PRO), transcriptasa inversa (RT) e integrasa (INT).

El término “polinucleótido”, como se usa en el presente documento, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y formada por ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. El término incluye polinucleótidos tanto mono como bicatenarios, así como polinucleótidos modificados (metilados, protegidos y similares). Los términos “prevenir” y “prevención”, como se usan en el presente documento, se refieren a inhibir el origen o disminuir la aparición de una enfermedad en un sujeto. La prevención puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de células patológicas en un sujeto). La prevención también puede ser parcial, de modo que, por ejemplo, la aparición de células patológicas en un sujeto es menor de la que hubiera producido sin la presente invención. Prevención también se refiere a la susceptibilidad reducida a un estado clínico.

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El término “proteasa”, como se usa en el presente documento, se refiere a la aspartil proteasa retrovírica codificada por el gen pol que corta poliproteínas recién sintetizadas en los sitios apropiados para crear los componentes proteicos maduros de un virión VIH infeccioso. Sin la proteasa eficaz, los viriones VIH permanecen no infecciosos. Por tanto, la mutación del sitio activo de la proteasa de VIH o la inhibición de su actividad altera la capacidad de VIH de replicarse e infectar células adicionales.

El término “pseudotipado”, como se usa en el presente documento, se refiere a proporcionar a la envuelta vírica que tiene proteínas codificadas por el genoma, parcial o como un todo, de una especie de virus a otra especie.

El término “pseudoviriones”, como se usa en el presente documento, se refiere a viriones que tienen una envuelta vírica con proteínas codificadas por el genoma, bien parcial o como un todo, de una especie de virus a otra especie.

La expresión “virión VIH recombinante”, como se usa en el presente documento, se refiere a un virión obtenido por técnicas recombinantes y que tiene el genoma VIH de la invención dentro de la cápside y la glicoproteína G de VSV en la envuelta.

El término “rev”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la proteína Rev responsable de procesar el ARN mensajero y transportarlo al citoplasma.

El término “transcriptasa inversa” o “RT”, como se usa en el presente documento, se refiere a la ADN polimerasa dependiente de ARN que transcribe el genoma de ARN monocatenario de un virus a ADN monocatenario, que después se integra en el genoma del huésped y se replica junto al mismo. El término “transcriptasa inversa”, como se usa en el presente documento, está codificada por el gen pol de un virus, particularmente del virus VIH-1. El término transcriptasa inversa de VIH-1 también se usa para referirse a la transcriptasa inversa de VIH-1 de otras cepas o aislados del virus. La secuencia de ácido nucleico y aminoácidos de un gran número de transcriptasas inversas de VIH-1 están fácilmente disponibles al público. Véase, la base de datos de secuencias de VIH, http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html, agosto, 2012; Base de datos y compendio de VIH de Los Alamos, http://www.hiv.lanl.gov/, agosto, 2012.

El término “tat”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la proteína Tat, un transactivador y elongador del ARN mensajero vírico.

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en una célula huésped, contiene regiones operativamente unidas al genoma de la invención y que son capaces de potenciar la expresión de productos del genoma según la invención. Los vectores de la invención se pueden obtener por medio de métodos ampliamente conocidos en la técnica. Véase, Brown T, “Gene Cloning” (Chapman & Hall, Londres, GB, 1995); Watson R, et al., “Recombinant DNA”, 2ª Ed. (Scientific American Books, Nueva York, NY, EE UU, 1992); Alberts B, et al., “Molecular Biology of the Cell” (Garland Publishing Inc., Nueva York, NY, EE UU, 2008); Innis M, et al., Eds., “PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications” (Academic Press Inc., San Diego, CA, EE UU, 1990); Erlich H, Ed., “PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification” (Stockton Press, Nueva York, NY, EE UU, 1989); Sambrook J, et al., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE UU, 1989); Bishop T, et al., “Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach” (IRL Press, Oxford, GB, 1987); Reznikoff W, Ed., “Maximizing Gene Expression” (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, EE UU, 1987); Davis L, et al., “Basic Methods in Molecular Biology” (Elsevier Science Publishing Co., Nueva York, NY, EE UU, 1986), Schleef M, Ed., “Plasmid for Therapy and Vaccination” (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, DE, 2001).

El término “vif”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la proteína Vif asociada con la infectividad de viriones extracelulares.

El término “virión”, como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula vírica infecciosa deficiente en replicación que comprende el genoma vírico de VIH empaquetado en una cápside y, opcionalmente, en una envuelta lipídica que rodea la cápside, en donde la envuelta de la partícula vírica comprende una glicoproteína G de un virus de la estomatitis vesicular (VSV). Como se usa en el presente documento, “virión no replicativo”, se refiere a un virión que carece de la capacidad de multiplicar su material genético y por tanto no se pueden formar nuevas copias de dicho virión. Para determinar si un virión es no replicativo se pueden usar los mismos ensayos que para determinar si una proteína RT es funcional. Los ensayos específicos se divulgan en las secciones 2.1 y 2.2 de los procedimientos generales de la presente descripción.

El término “vpr”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la proteína Vpr que actúa como un acelerador para el ciclo de replicación a diferentes niveles.

El término “vpu”, como se usa en el presente documento, se refiere al gen que codifica la proteína Vpu implicada en la liberación de viriones.

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En otra forma de realización preferida, el genoma de VIH del virión contiene los siguientes grupos de genes en forma funcional: env, gag, nef y tat; env, gag, nef y rev; env, gag, nef y vif; env, gag, nef y vpu; env, gag, nef y vpr; env, gag, tat y rev; env, gag, tat y vif, env, gag, tat y vpu, env, gag, tat y vpr; env, gag, rev y vif; env, gag, rev y vpu; env, gag, tat y vpr; env, gag, vif y vpu; env, gag, vif y vpr; env, gag, vpu y vpr; env, nef, tat y rev; env, nef, tat y vif; env, nef, tat y vpu; env, nef, tat y vpr; env, nef, rev y vif; env, nef, rev y vpu; env, nef, rev y vpr; env, nef, vif y vpu; env, nef, vif y vpr; env, nef, vpu y vpr; env, tat, rev y vif; env, tat, rev y vpu; env, tat, rev y vpr; env, tat, vif y vpu; env, tat, vif y vpr; env, tat, vpu y vpr; env, rev, vif y vpu; env, rev, vif y vpr; env, rev, vpu y vpr; env, vif, vpu y vpr; gag, nef, tat y rev; gag, nef, tat y vif; gag, nef, tat y vpu; gag, nef, tat y vpr; gag, nef, rev y vif; gag, nef, rev y vpu; gag, nef, rev y vpr; gag, nef, vif y vpu; gag, nef, vif y vpr; gag, nef, vpu y vpr; gag, tat, rev y vif; gag, tat, rev y vpu; gag, tat, rev y vpr; gag, tat, vif y vpu; gag, tat, vif y vpr; gag, tat, vpu y vpr; gag, rev, vif y vpu; gag, rev, vif y vpr; gag, rev, vpu y vpr; gag, vif, vpu y vpr; nef, tat, rev y vif; nef, tat, rev y vpu; nef, tat, rev y vpr; nef, tat, vif y vpu; nef, tat, vif y vpr; nef, tat, vpu y vpr; nef, tat, vif y vpu; nef, tat, vif y vpr; nef, tat, vpu y vpr; nef, rev, vif y vpu; nef, rev, vif y vpr; nef, rev, vpu y vpr; nef, vif, vpu y vpr; tat, rev, vif y vpu; tat, rev, vif y vpr; tat, rev, vpu y vpr; tat, vif, vpu y vpr; rev, vif, vpu y vpr.

En una forma de realización preferida, el virión no replicativo según la invención comprende un genoma de VIH que tiene los siguientes elementos en la dirección 5’ a 3’:

a) La LTR 5’ (repeticiones terminales largas) o secuencias terminalmente redundantes que

contienen varias secuencias consenso para factores de transcripción que regulan la

expresión vírica;

b) gag, el gen que codifica la proteína p55 de la cápside formada por 3 subunidades

proteicas (MA, CA y NC);

c) el gen pol mutado, que codifica las enzimas víricas necesarias para el proceso de

replicación vírica: proteasa (PRO), transcriptasa inversa (RT) e integrasa (INT) que

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En una forma de realización preferida, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en el gen env, en donde dicha mutación causa que el virus producido de dicho genoma carezca de una proteína gp160 funcional.

En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión que comprende una mutación en el gen env, en donde dicha mutación causa que el virus producido de dicho genoma carezca de una proteína gp160 funcional, contiene genes funcionales gag, nef, tat, rev, vif, vpu o vpr.

En una forma de realización particular, la mutación en el gen env comprende la deleción completa o parcial de dicho gen. En una forma de realización particular, la secuencia de la proteína gp160 Env es SEQ ID NO: 3.

En una forma de realización particular, la deleción completa o parcial en el gen env corresponde a la deleción en el gen env en la construcción pNL4-3 ΔRT/Δ1136env depositada con en número de acceso DSM25923.

En otra forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag, nef, tat, rev, vif, vpu y vpr o en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol, en donde dicha mutación comprende la deleción completa o parcial de dicho gen. En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag, nef, tat, rev, vif, vpu y vpr o en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol, en donde dicha mutación comprende la deleción completa o parcial de dicho gen. En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende una mutación en solo un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag, nef, tat, rev, vif, vpu y vpr o en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol, en donde dicha mutación comprende la deleción completa o parcial de dicho gen. En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en el gen gag, En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en el gen nef. En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en el gen tat. En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en el gen rev. En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en el gen vif. En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en el gen vpu. En una forma de realización particular, el

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genoma de VIH del virión comprende además una mutación en el gen vpr. En una forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una mutación en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol. En una forma de realización preferida, la mutación es un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag y nef. En otra forma de realización preferida, la mutación es en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol. En otra forma de realización preferida, la mutación es en al menos dos genes, preferiblemente en el gen gag y en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol. En otra forma de realización particular, la secuencia de la proteína p55 Gag es SEQ ID NO: 4. En otra forma de realización, la secuencia de la proteína Nef es SEQ ID NO: 5. En otra forma de realización particular, la secuencia de la proteína Rev es SEQ ID NO: 7. En otra forma de realización particular, la secuencia de la proteína Vif es SEQ ID NO: 8. En otra forma de realización particular, la secuencia de la proteína Vpu es SEQ ID NO: 9. En otra forma de realización particular, la secuencia de la proteína Vpr es SEQ ID NO: 10.

En otra forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además un gen marcador, en donde dicho gen marcador se localiza en el sitio ocupado por la región delecionada mediante la mutación en al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag, nef, tat, rev, vif, vpu y vpr o en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol.

En otra forma de realización particular, el genoma de VIH del virión comprende además una secuencia homóloga a la de la región delecionada mediante la mutación en al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag, nef, tat, rev, vif, vpu y vpr o en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol, que se origina de un segundo genoma de VIH, en donde el genoma de dicho segundo VIH es diferente del genoma de VIH que contiene la región delecionada.

En una forma de realización preferida, la secuencia homóloga es diferente a la secuencia de la región delecionada, preferiblemente tiene el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% de identidad o menos con la secuencia delecionada.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias indica la proporción de aminoácidos idénticos que comparten las dos secuencias que se comparan. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se calcula comparando dos secuencias alineadas en una región particular, determinando el número de posiciones en donde hay aminoácidos idénticos en ambas secuencias para obtener el número total de posiciones en el segmento que se compara

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y multiplicando el resultado por 100. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina usando algoritmos implementados en un ordenador y métodos que se conocen ampliamente en la técnica. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP. Véase, Altschul S, et al., “BLAST Manual” (NCBI NLM NIH,

5 Bethesda, MD, EE UU, 1996) y Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410. En otra forma de realización preferida, dicho segundo VIH se origina de un sujeto infectado por VIH. En una forma de realización particular, el sujeto infectado por VIH es un sujeto para el que se va a obtener una vacuna contra VIH personalizada.

10 Las secuencias homólogas procedentes del genoma del VIH de un sujeto pueden obtenerse mediante distintos métodos conocidos en el estado de la técnica, entre otros, a partir de células sanguíneas del paciente infectado con VIH mediante el kit de ADN de sangre QIAmp (Qiagen NV, Venlo, NL) y, a partir del plasma de un paciente infectado con VIH, puede obtenerse el ARN viral mediante el kit QIAmp (Qiagen NV, Venlo, NL). Dicho ARN de VIH extraído se

15 emplea como molde para obtener el ADNc, empleando métodos conocidos en la técnica.

En otro aspecto, la invención se refiere a un genoma vírico de VIH que contiene una primera mutación en el en el gen pol, en donde dicha primera mutación causa que el virus producido solamente de dicho genoma vírico sea un virus no replicativo; en donde dicho genoma contiene

20 además una segunda mutación en al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag, nef, tat, rev, vif, vpu y vpr o en la secuencia que codifica la proteína proteasa en el gen pol, en donde dicha segunda mutación comprende la deleción completa o parcial de dicho gen.

25 Todas las formas de realización divulgadas para el virión no replicativo de la invención también son aplicables al genoma vírico de VIH de la invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector que comprende un genoma vírico de VIH de la invención.

30 c) Células activadas de la invención

Los viriones no replicativos de la invención se pueden usar para activar células inmunes. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para obtener una célula inmune

35 activada que comprende las etapas:

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a) poner en contacto una célula inmune con un virión no replicativo de la invención,

b) mantener la mezcla obtenida en la etapa a) en condiciones adecuadas para la infección de dichas células inmunes por el virión y para que se procesen los antígenos procedentes del virión no replicativo, y

5 c) opcionalmente, recuperar las células inmunes activadas.

Las condiciones adecuadas para la infección de las células inmunes con el virión de la invención y el procesamiento de antígenos son conocidas en la técnica. A modo ilustrativo, puede llevarse a cabo por ejemplo manteniendo en contacto 5x106 células dendríticas

10 derivadas de monocitos (CD-DM) inmaduras con 1x109 viriones durante 3 horas a 37ºC.

La recuperación de las células inmunes activadas de la invención, puede llevarse a cabo mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la recuperación de dichas células puede realizarse mediante desprendimiento de las células adheridas en la placa de

15 cultivo usando tripsina-EDTA (0,25% y 0,02%, respectivamente) y posterior centrifugación a 650 g durante 4 minutos a temperatura ambiente.

En una forma de realización, la célula inmune se selecciona de un linfocito, una célula mononuclear de sangre periférica y una célula dendrítica derivada de monocitos.

20 En otro aspecto, la invención se refiere a la célula obtenible según el método de la invención para activar células inmunes.

d) Composiciones inmunes y de vacuna de la invención

25 En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la obtención de una vacuna frente a VIH personalizada para un sujeto infectado con VIH, en donde dicha vacuna comprende células inmunes activadas, que comprende:

30 a) poner en contacto células inmunes que se originan de dicho sujeto infectado por VIH in vitro con un virión no replicativo como en las reivindicaciones 12 a 15 como se presenta en donde el genoma de dicho segundo VIH se origina de un VIH de dicho sujeto infectado por VIH;

b) mantener la mezcla obtenida en la etapa a) en condiciones adecuadas para infectar 35 dichas células inmunes con el virión y para procesar los antígenos que se originan del virión no replicativo; y

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d) comparar la activación de dichas células inmunes activadas según las etapas a) y b) con la activación de células inmunes control, e) seleccionar los viriones que provocan una activación de las células inmunes activadas según las etapas a) y b) mayor que la activación de las células inmunes control, 5 f) infectar células inmunes de dicho sujeto infectado con VIH con los viriones no replicativos seleccionados en la etapa e), y g) recuperar las células inmunes activadas según la etapa f).

Los diferentes pasos comprendidos en el método in vitro para obtener una vacuna contra VIH

10 personalizada para un sujeto infectado con VIH se conocen en la técnica. El método comprende primero poner en contacto células inmunes in vitro con un virión no replicativo de la invención. En una forma de realización particular, dichas células inmunes son linfocitos, células mononucleares de sangre periférica o células dendríticas derivadas de monocitos. Las células inmunes y los viriones no replicativos de la invención se deben mantener en condiciones

15 adecuadas de modo que dichas células sean infectadas por el virión y de modo que los antígenos originarios del virión no replicativo de la invención se procesen. En una forma de realización particular, dichas condiciones son 37ºC durante 7 días.

Es necesario después comparar la activación de dichas células inmunes con la activación de

20 células inmunes control. Se conocen diferentes métodos en el estado de la técnica para analizar la activación de células inmunes. Ejemplos ilustrativos, no limitantes son, entre otros, la detección de la producción de citoquinas, la detección del número de células productoras de IFNγ e IL-2, o el análisis de la frecuencia de células CD4 y CD8 específicas de antígeno que se dividen mediante análisis de citometría de flujo. Seguidamente, se seleccionan los viriones que

25 provocan una activación de las células inmunes activadas mayor que la activación de las células inmunes control, y se emplean dichos viriones no replicativos para infectar células inmunes de dicho sujeto infectado con un VIH. Por último, el método comprende recuperar dichas células inmunes activadas.

30 En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la obtención de una vacuna frente a VIH personalizada para un sujeto infectado con VIH, en donde dicha vacuna comprende células inmunes activadas, que comprende:

a) poner en contacto in vitro células inmunes procedentes de dicho sujeto infectado con 35 VIH con un virión no replicativo de la invención, en donde el genoma de VIH comprendido en dicho virión comprende además una mutación en al menos un gen

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una célula, un genoma vírico de VIH de la invención, un vector de la invención o una composición inmunogénica o vacuna de la invención.

La cantidad de viriones de la invención y de células inmunes activadas de la invención, así como el tiempo de administración se pueden determinar según protocolos conocidos en la técnica. De hecho, la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de viriones de la invención y de células inmunes activadas de la invención se pueda alcanzar mediante una única administración, tal como por ejemplo, una única inyección de un número suficiente de viriones o células para proporcionar un beneficio terapéutico al paciente que se somete a tal tratamiento. De forma alternativa, en algunas circunstancias, puede ser deseable proporcionar administraciones múltiples o sucesivas, bien durante un periodo de tiempo relativamente corto

: o relativamente prolongado, que puede determinar el médico que supervisa la administración de tales composiciones. De hecho, en ciertas formas de realización, puede ser deseable administrar dos o más composiciones de diferentes viriones o células de la invención, bien solas o en combinación con uno o más fármacos para alcanzar los efectos deseados de la pauta terapéutica particular.

Las vacunas de la invención se administrarán en una cantidad farmacológicamente eficaz que produce una mejora de uno o más síntomas de un trastorno vírico o previene el avance de una enfermedad vírica o produce la regresión de la enfermedad o disminuye la transmisión vírica. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz preferiblemente se refiere a la cantidad de un agente terapéutico que disminuye el índice de transmisión, disminuye la carga vírica de VIH

: o disminuye el número de células infectadas, en al menos el 5%, preferiblemente al menos el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más. Una cantidad terapéuticamente eficaz, con referencia a VIH, también se refiere a la cantidad de un agente terapéutico que aumenta el recuento de células CD4+, aumenta el tiempo de evolución a SIDA o aumenta el tiempo de supervivencia en al menos el 5 %, preferiblemente al menos el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más.

La administración de los viriones de la invención o de las células inmunes de la invención puede realizarse junto a un vehículo o soporte farmacéuticamente aceptable. En algunas ocasiones dicho vehículo o soporte farmacéuticamente aceptable es un adyuvante; una sal de aluminio o una emulsión de aceite en agua; un agente emulsionante y un aceite metabolizable;

: o un agente inmunoestimulador, y la composición se administra al sujeto mediante inyección.

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comunes con alta afinidad y para que actúe como un poderoso inmunógeno. Se ha mostrado que el epítopo PADRE HTL aumenta la potencia de vacunas diseñadas para estimular una respuesta inmune celular. Véase, Alexander J, et al., Immunol. Res. 1998; 18:79-92.

La formulación de vacunas según la invención emplea una cantidad eficaz del antígeno de interés. Es decir, incluirá una cantidad de antígeno que, en combinación con el adyuvante, hará que el sujeto produzca una respuesta inmune específica y suficiente, de modo que ofrezca protección al sujeto contra una exposición posterior al VIH. Cuando se usa como una composición inmunogénica, la formulación contendrá una cantidad de antígeno que, en combinación con el adyuvante, causará que el sujeto produzca anticuerpos específicos que se pueden usar para fines diagnósticos o terapéuticos.

Las composiciones de vacuna de la invención pueden ser útiles para la prevención la infección por VIH o para terapia de infección de VIH. Mientras que todos los animales que pueden estar afectados con VIH o sus equivalentes se pueden tratar de esta manera, las vacunas de la invención se dirigen particularmente a sus usos preventivos y terapéuticos en seres humanos. Con frecuencia, se puede requerir más de una administración para producir el efecto profiláctico o terapéutico deseado; el protocolo exacto (dosis y frecuencia) se puede establecer mediante procedimientos clínicos estándar.

Las formulaciones de vacuna contendrán una cantidad eficaz del/de los antígeno(s) seleccionado(s) que cuando se combina(n) con el adyuvante causarán que el sujeto vacunado produzca una respuesta inmune suficiente y especifica al antígeno. Las composiciones de vacuna también se pueden usar terapéuticamente para el tratamiento de sujetos ya infectados con VIH.

En algunas formas de realización, puede ser deseable administrar vacunas de combinación que tienen un componente que provoca una respuesta inmune principalmente contra cepas de VIH con tropismo por el receptor CCR5 y un segundo componente que provoca una respuesta inmune principalmente contra cepas de VIH con tropismo por el receptor CXCR4. También puede ser deseable para uno o ambos componentes estar compuesto de una mezcla de antígenos, como por ejemplo, una mezcla de antígenos cada uno de los cuales provoque una respuesta inmune a una cepa de VIH particular o grupo de cepas de VIH.

e) Composiciones, kits y métodos para obtener los viriones de la invención

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La invención también se refiere a composiciones o kits que contienen los componentes necesarios para generar los viriones VSV-VIH pseudotipados de la invención y a métodos para obtenerlos cotransfectando los polinucleótidos que codifican el genoma vírico de VIH de la invención y la proteína G de VSV en una célula adecuada.

5 Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición o kit que comprende:

(i) un polinucleótido que comprende un genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que contiene una mutación en el gen pol, en donde dicha mutación

10 causa que el virus producido únicamente de dicho genoma sea un virus no replicativo; y

(ii) un polinucleótido que codifica la glicoproteína G de la envuelta de un virus de la estomatitis vesicular (VSV).

15 En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para la generación de un pseudovirión VIH/VSV recombinante que comprende:

(i) cotransfectar una célula receptiva con: a) un polinucleótido que codifica la glicoproteína G de la envuelta de un virus de la 20 estomatitis vesicular (VSV) y

b) un polinucleótido que comprende un genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que contiene una mutación en el gen pol, en donde dicha mutación causa que el virus producido únicamente de dicho genoma sea un virus no replicativo, en donde el genoma de VIH comprende además una

25 deleción en al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag, nef, tat, rev, vif, vpu y vpr o en la secuencia que codifica la proteína proteasa en gen pol, y en donde el genoma del VIH comprende además una secuencia homóloga a la de la región delecionada mediante la mutación en al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en los genes gag, nef, tat,

30 rev, vif, vpu y vpr o en la secuencia que codifica la proteína proteasa en gen pol, originario de un segundo genoma de VIH, en donde el genoma de dicho segundo VIH es diferente del genoma de VIH que contiene la región delecionada,

(ii) mantener las células obtenidas en (i) en condiciones adecuadas para la formación de 35 VIH, y

(iii) recuperar los pseudoviriones de VIH/VSV de la célula.

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Para la producción de los pseudoviriones de la invención, es necesario, en primer lugar incorporar en una célula receptiva tanto: i) un vector que comprende un genoma de VIH que contiene una mutación en el gen pol, en donde dicha mutación causa que el virus producido solamente de dicho genoma sea un virus no replicativo; y ii) un plásmido de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína G de VSV en una célula usando cualquiera de los métodos de cotransfección conocidos en la técnica. Véase, Ausubel, F, et al., Eds, “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley and Sons Inc.; Nueva York, NY, EE UU, 2003). Ejemplos ilustrativos, no limitantes de métodos de transfección incluyen coprecipitación con fosfato cálcico, DEAE-dextrano, polibreno, electroporación, microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección, infección por retrovirus y transfección biolística. En una forma de realización particular, la transfección se lleva a cabo mediante coprecipitación con fosfato cálcico. La célula en la que se incorporan los vectores de la invención debe ser capaz de expresar la información codificada en dichos vectores y empaquetar las proteínas del virus y su material genético para formar las partículas víricas que tienen la proteína G de VSV en su envuelta. Células receptivas adecuadas para la realización de la presente invención incluyen, entre otras, células de la línea celular 293T, una línea celular derivada de la línea celular 293 (derivada de células de riñón embrionario humano), altamente transfectable, a la que se la ha insertado el antígeno T de SV40 (por ejemplo, ATCC). Los pseudoviriones producidos se liberan al medio de cultivo de las células transfectadas con los vectores de la invención. Por tanto, para obtener los viriones de la invención es necesario recoger los sobrenadantes transcurridas unas horas tras la transfección, preferiblemente 24 y 48 horas tras la transfección. Los viriones no replicativos de la invención se pueden almacenar a -80ºC.

Todas las formas de realización divulgadas para el genoma vírico de VIH de la invención también son aplicables a las composiciones o kits de la invención y a los métodos de la invención.

Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento se incorporan al mismo en su totalidad mediante referencia.

Mientras que la invención anterior se ha descrito en algún detalle para fines de claridad y entendimiento, el experto en la materia apreciará a partir de una lectura de esta divulgación que se pueden hacer varios cambios en forma y detalle sin separarse del verdadero ámbito de la invención y reivindicaciones adjuntas.

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A continuación, se eliminó el gen LacZ que codifica la proteína β-galactosidasa (SEQ ID NO: 14) clonado en NcoI/AgeI mediante la digestión con las correspondientes enzimas de restricción y posterior relleno de los extremos cohesivos con el fragmento Klenow de ADN polimerasa I (GE Healthcare) y se religaron, dando lugar al plásmido pNL4-3 ΔRT, NarIllamado en adelante pNL4-3 ΔRT. El tamaño de este plásmido generado es de aproximadamente 13.983 pb. Véase, la figura 1B.

A partir de pNL4-3 ΔRT se generó el siguiente vector vírico de pNL4-3 ΔRT:

pNL4-3 ΔRT/Δ1136env: Para generar el vector NL4-3 ΔRT/Δ1136env se usó el vector NL4-3 ΔRT. Se realizó una doble digestión a 37ºC usando las enzimas NcoI y NheI, que cortan en la posición 6113 y 7249 del plásmido, durante 2 horas. Esta doble digestión genera 2 fragmentos de 1136 y 11972 pb cada uno. La digestión se cargó en un gen de agarosa al 1% para separar e identificar ambos fragmentos. Un vez que se identificaron los fragmentos, se realizó una purificación del fragmento de 11972 mediante su extracción del gel. Posteriormente, se hizo una extensión del plásmido para su posterior ligación con la enzima de Klenow. La ligación de este fragmento se realizó añadiendo la enzima ligasa durante 12 horas a 16ºC generando un nuevo plásmido de 11972 pb con un deleción en la envuelta de 1136 pb. Posteriormente, el plásmido se secuenció y transfectó en células 293T para generar y caracterizar los viriones producidos.

1.2 Producción y concentración de viriones

Los viriones se generaron mediante transfección de células 293T (ATCC) con los diferentes vectores víricos en estudio, por el método del fosfato cálcico (Profection Kit; Promega Corp., Madison, WI, EE UU). Se usaron 5 µg del ADN plasmídico de los distintos vectores víricos (Qiagen, NV, Venlo, NL). Se generaron vectores VIH_env pseudotipados con G-VSV mediante cotransfección de células 293T con NL 4-3 ΔRT/Δ1136env, y un plásmido de expresión para la proteína G de VSV. El día anterior a la transfección, se sembraron 1,5x106 células en 10 ml de DMEM-10 (DMEM suplementado suero de bovino fetal al 10% (v/v)) en botellas de cultivo de 75 cm2. A las 24 horas tras la transfección se cambió el medio y a las 48 horas se recogieron los sobrenadantes, se clarificaron y posteriormente se concentraron. Una vez obtenidos los viriones, éstos se almacenaron a –80ºC. En todos los casos, se obtuvo un sobrenadante en las células tratadas del mismo modo pero transfectadas con el “vector vacío” que se utilizó como control negativo. El sobrenadante recogido tras la transfección se centrifugó en tubos de 30 ml de rosca durante 32 minutos a 28.000 rpm en una centrifuga Thermo scientific Sorvall® WX

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clarificaron y posteriormente se concentraron por centrifugación, durante 32 minutos a 28.000 rpm en una centrífuga Thermo Scientific Sorvall® WX Ultra Centrifuge Series 80 (Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, EE UU). Se descartó el sobrenadante y el sedimento obtenido tras la centrifugación, se resuspendió en 500 µl de PBS. Nuevamente, se centrifugó durante 10 minutos a 40.000 rpm. El sedimento se resuspendió en 500 µl de glutaraldehído al 2,5% en PB. Una vez que el sedimento estaba bien resuspendido, se dejó durante 30 minutos a 4ºC con el glutaraldehído y tras ese tiempo el glutaraldehído se cambió por otros 500 µl de glutaraldehído nuevo. Se dejó durante 1 hora a 4ºC, se eliminó el glutaraldehído y se lavó con PB al 1% dos o tres veces y se dejó en PB hasta su utilización en microscopía electrónica. Las muestras se tiñeron y procesaron en parafina como se ha descrito previamente. Véase, López-Iglesias, 1998, anteriormente.

Las partículas víricas NL4-3 estaban perfectamente formadas (flechas) y con su centro bien definido y se observaban también partículas víricas en gemación. Véase la figura 5A. En cambio los viriones NL4-3 ∆RT eran inmaduros y no se podía observar el centro formado (flechas) ni la compactación típica de una partícula vírica WT. Véase la figura 5B.

Se puede observar que las partículas víricas NL4-3 estaban perfectamente formadas en un 90% de los casos. Véase la figura 5C. Se pueden observar partículas víricas purificadas obtenidas de la transfección de las células 293T transfectadas con las construcciones pNL4-3 ∆RT. Véase la figura 5D. El 93% de la población presenta una morfología de partícula vírica inmadura. También se observaron pseudoviriones de células 293T transfectadas con pΔRT/Δ1136env + pVSV-G. Véase la figura 13. Después de la purificación, los pseudoviriones mostraron partículas inmaduras con una envuelta más espesa.

2.5 Análisis de la expresión de la proteína gag de VIH-1 por inmunotransferencia

Para analizar la expresión de la proteína gag del VIH-1 se utilizaron extractos de células 293T y de viriones purificados, obtenidos 48 horas tras la transfección en células 293T con los plásmidos indicados (pNL4-3, pNL4-3 ΔRT o pΔRT/Δ1136env + pVSV-G). Para la preparación de extractos celulares se utilizaron aproximadamente 2 x 106 células 293T por punto experimental recogidas a las 48 horas de la transfección. Las células se lavaron en PBS y en tampón A (Hepes 10 mM pH 8, KCl 10 mM, MgCl2 15 mM y DTT 1 mM), se resuspendieron en 20 μl de tampón C (Hepes 20 mM pH 8, NP-40 al 0,1%, glicerol al 25%, NaCl 420 mM, KCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,2 mM, leupeptina 0,5 μg/ml, pepstatina 0,5 μg/ml, aprotinina 0,5 μg/ml, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 1 mM y DTT

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(ditiotreitol) 1 mM), se dejaron lisar durante 15 minutos a 4ºC y se centrifugaron a 4.062 g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante obtenido se diluyó en tampón D (Hepes 20 mM pH 8, glicerol al 20%, KCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, leupeptina 0,5 μg/ml, pepstatina 0,5 μg/ml, aprotinina 0,5 μg/ml, PMSF 1 mM y DTT 1 mM) en función de la concentración final de proteína deseada. La valoración de la concentración de proteínas, se determinó mediante la reacción de Bradford (Biorad Labs., Inc., Hercules, CA, EE UU). Véase, Bradford M, Anal Biochem 1976; 72:248-54.

Para realizar la inmunotransferencia se hicieron migrar 10 µg de los diferentes extractos en un gel de poliacrilamida-SDS (dodecilsulfato sódico) al 10%. La transferencia de los geles a membranas de polifluoruro de vinilideno (PVDF) (Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, EE UU), previamente incubadas 5 minutos en metanol, se realizó en tampón de transferencia (glicina 20 mM, Tris-base 150 mM y metanol al 20%) utilizando un aparato de electrotransferencia (Pharmacia®, Pfizer, Inc., Nueva York, NY, EE UU). Las membranas se bloquearon por incubación a 37ºC durante 1 hora con leche en polvo al 5% en PBS/Tween-20 al 0,1%. Tras el bloqueo, las membranas se incubaron con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína p24 (clon 491, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE UU) a una dilución 1:1000. Después de tres lavados de 5 minutos con PBS/Tween-20 al 0,1%, se incubaron con anticuerpos anti-inmunoglobulinas de ratón unidos a peroxidasa durante una hora a 37ºC.

Posteriormente, se realizaron 3 lavados de 5 minutos con PBS/Tween-20 al 0,1%. La detección de las interacciones antígeno-anticuerpo se realizó mediante el sistema de quimioluminiscencia SuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate (Pierce®, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, EE UU) y exposición a película fotográfica (Hyperfilm ECL, GE Healthcare, General Electric Co., Faifiels, CT, EE UU). Tanto los viriones NL4-3 como NL4-3 ΔRT (ΔRT) producían la proteína gag. Véase la figura 6. Los viriones NL4-3 procesaban gag completamente, mientras que los viriones NL4-3 ΔRT (ΔRT) y ΔRT/Δ1136env + VSV (VSV) tenían un defecto en el procesamiento de gag, Véase la figura 15.

3. Evaluación de la respuesta inmune celular

Una vez obtenidos y caracterizados los viriones NL4-3 ∆RT y ΔRT/Δ1136env + VSV (VSV), se evaluó la respuesta inmune celular de dos formas. En primer lugar, mediante un modelo ex vivo con células dendríticas derivadas de monocitos (CD-DM) se evaluó la capacidad de producir la respuesta celular anti-VIH específica en células CD4+ y CD8+. También se realizaron ensayos con PBMC para detectar la respuesta celular anti-VIH específica, entre ellos, la detección

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El análisis de la respuesta específica de células T CD8+ se realizó mediante el uso de un ELISPOT específico basado en la determinación de la producción de IFN-γ por las células T CD8+ frente a epítopos dominantes de las proteínas del VIH-1 restringidos para antígenos HLA-clase I. Las células se estimularon con conjuntos de péptidos sintéticos solapantes 15

5 meros de las proteínas gag, pol, env y nef del VIH-1, viriones recombinantes quiméricos.

También se realizaron ensayos con eliminación de subpoblaciones celulares (CD4, B, NK) mediante selección inmunomagnética para analizar su grado de participación en la respuesta obtenida.

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3.3 Tipado de HLA de alta resolución

El tipado de HLA de alta resolución se evaluó mediante PCR-SBT del ADN genómico de células mononucleares o polinucleares de sangre periférica o células de líneas de células B.

15 Empleando cebadores genéricos se amplificaron los exones polimórficos de los genes que codifican para el MHC (principalmente el exón 2 del gen DRB1). Los productos de PCR se secuenciaron usando el método de secuenciación automática fluorescente y las secuencias obtenidas se analizaron mediante el software adecuado (Perkin-Elmer, Inc., Waltham, MA, EE UU).

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3.4 Optimización del ensayo ex vivo para la detección y caracterización de la respuesta inmune frente al VIH-1 utilizando viriones recombinantes defectuosos y no replicativos

25 Se emplearon muestras de aproximadamente 20-30 pacientes VIH+ crónicos asintomáticos, con una cifra elevada de CD4 (>500/mm3). Se ha utilizado fundamentalmente un ensayo de detección intracelular de citoquinas (ICS) con distintas preestimulaciones de las PBMC. Las preestimulaciones probadas fueron: dosis bajas de IL-2 recombinante (20 U/ml) o un cóctel con CD28 y CD49d (1 µg/ml). No se han hallado diferencias entre estos 2 tipos de

30 preestimulaciones, aunque el uso del cóctel de anticuerpos producía mayor reproducibilidad en la secreción de IFNγ e IL-2, por células CD4 y CD8. Los antígenos inmunogénicos ensayados fueron NL4-3 WT inactivado por calor, NL4-3 ΔRT, y BAL y MN (cepas de referencia de aislados de laboratorio, en ocasiones denominadas VIH-BaL y VIH-MN, respectivamente) inactivados por calor o mediante tratamiento con AT2 (aldritiol-2) 1 mM a 4ºC durante toda la

35 noche (dosis correspondiente a 20 µg de p24/ml). Tras una estimulación de las células durante 18 a 24 horas con los estímulos mencionados, los resultados obtenidos fueron heterogéneos,

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de la partícula vírica. Tras evaluar la eficacia con respecto al tropismo de envueltas X4 (NL4-3) frente R5 (BaL y AC10) dentro del ΔRT: no se observaron diferencias significativas. Por último, los viriones pseudotipados VSV-G tenían inmunogenicidad significativamente aumentada (hasta el 90%) (Tabla 2). Para clarificar este punto se han comparado los porcentajes de 5 respuesta positiva entre WT-AT2 y todas las variantes ΔRT. Véase la figura 16A. Se han observado diferencias significativas entre ellos, lo que confirma las ventajas descritas para las construcciones ΔRT: más inmunogénicas con un perfil más seguro. Véase la tabla 2. Además, se ha realizado la evaluación de la respuesta celular de las células CD-DM contra diferentes inmunógenos: NL4-3 WT+AT-2, NL4-3 ΔRT/VSV, NL4-3 ΔRT y p24 recombinante usando

10 diferentes concentraciones (0,5, 1 y 5 μg/ml de p24). La prueba realizada con 9 pacientes que responden y contra una y la misma solución madre de inmunógenos muestra que el índice de proliferación en CD8+ está sustancialmente aumentado (véase la figura 17).

Tabla 2 15 Cribado de respuesta inmune de pacientes positivos para VIH-1. Evaluación de la respuesta inmune después de estimulaciones con diferentes viriones mediante la producción de IFN-γ (ELISPOT)

Pacientes /Viriones: Respuesta CFM media

16 de 69 corresponden a WT-AT2: 23% 269

38 de 69 corresponden a ΔRT (X4): 55% 418

33 de52 corresponden a ΔRT-AT2: 63% 664

21 de 41 corresponden a ΔRT/AC10 (R5): 51% 286

23 de 43 corresponden a ΔRT/BaL (R5): 53% 462

18 de 20 corresponden a VSV-ΔRT: 90% 1181

14 de 21 corresponden a WT/APV-AT2: 67% 1006

Por último, se evaluó la inmunogenicidad de viriones ΔRT, que son inmaduros, comparados al

20 virión WT-AT2 (NL4-3) que se habían tratado previamente en su producción con un inhibidor de la proteasa (Amprenavir, APV 50 µM), WT/APV-AT2. El tratamiento con el inhibidor, traía como consecuencia la producción de viriones inmaduros. Las partículas inmaduras se analizaron mediante microscopía electrónica. Véase la figura 11. Tras evaluar la inmunogenicidad de ΔRT frente al virión WT/APV-AT2 se observó que WT/APV-AT2 producía una respuesta, medida por

25 el número de células productoras de IFN-γ (ELISPOT), mayor que su homólogo sin tratar (obteniéndose un 67% de pacientes que responden en una población de 21 pacientes). Véase la tabla 2 y la figura 16B.

Se evaluaron las quimeras autólogas, como forma de potenciar la respuesta. Tras evaluar la

30 inmunogenicidad de viriones ΔRT/Δgag (“paciente”) en pacientes en los que se disponía de material para su amplificación, bien ADN o ARN, frente a los diferentes viriones no quiméricos

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Claims

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