ES2549728T3 - Formulaciones de lipoplexo para la administración específica al endotelio vascular - Google Patents

Abstract

Una composición de lípidos contenida en y/o que contiene un vehículo que comprende a) 50 moles% del ácido ß-arginil-2,3-diamino-propiónico-N-palmitil-N-oleil-amida trihidrocloruro, preferiblemente el ácido (ß-(L-arginil)-2,3-L-diaminopropiónico-N-palmitil-N-oleil-amida trihidrocloruro) b) de 48 a 49 moles% de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPhyPE), y c) de 1 a 2 moles% de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-polietilen-glicol, preferiblemente la sal sódica de N-(carbonil-metoxipolietilenglicol-2000)-1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina en donde el vehículo que contiene la composición de lípidos tiene una osmolaridad de aproximadamente 50 a 600 mosmoles/kg, preferiblemente de aproximadamente 250 a 350 mosmoles/kg, y más preferiblemente de aproximadamente 280 a 320 mosmoles/kg, y/o en donde los liposomas formados por el primer componente lípido y/o uno o ambos de los lípidos auxiliares y el compuesto protector en el vehículo tienen un tamaño de partícula de aproximadamente 30 a 100 nm, y más preferiblemente de aproximadamente 40 a 80 nm.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E07724432

08-10-2015

de la célula después de la absorción endocitótica por las células endoteliales. Esto último es crucial en la medida en que solamente después de la liberación de los agentes funcionalmente activos, tales como un ácido nucleico funcional y, en particular, un ARNsi, puede dicho agente funcionalmente activo ejercer sus efectos a nivel celular.

En vista de esto, la composición de lípidos y el lipoplexo como se describe en este documento, particularmente si se usa como una formulación farmacéutica para la administración de un ácido nucleico funcional, incluyendo, pero no limitado a, ARNsi, pueden ser utilizados para el tratamiento y prevención, respectivamente, de diversas enfermedades, incluyendo, pero no limitado a, la leucemia y cánceres sólidos dependientes de la neo-angeogénesis, incluyendo pero no limitado a las categorías de carcinoma, sarcoma y linfoma y otras neoplasias tales como cualquier tipo de cáncer y tumores, respectivamente, de, por ejemplo, hueso, mama, próstata, sistema digestivo, colorrectal, hígado, pulmón, riñón, urogenital, páncreas, hipófisis, testicular, orbital, cabeza y cuello, sistema nervioso central, y respiratorio. Otras enfermedades para las que se pueden utilizar dicho medicamento y formulación farmacéutica son los accidentes cerebrovasculares, úlceras, aterosclerosis y artritis reumatoide, todas las cuales se caracterizan por una angiogénesis ya sea excesiva o insuficiente. En otras palabras, la composición de lípidos y el lipoplexo, respectivamente, de la presente invención pueden ser utilizados para terapias tanto pro-como anti-angiogénicas y por lo tanto para la fabricación de un medicamento para mejorar o aumentar la angiogénesis, o un medicamento para disminuir la angiogénesis.

Además, este tipo de medicamento y la formulación farmacéutica, respectivamente, podrían ser utilizados en combinación con otros tratamientos, tales como la quimioterapia, crioterapia, hipertermia, terapia de anticuerpos tales como la terapia de anticuerpos monoclonales y la terapia de anticuerpos VEGF-monoclonales, en particular, la terapia de radiación, y similares.

Enfermedades específicas adicionales que, en principio, pueden ser tratadas mediante este tipo de formulación farmacéutica y el medicamento que comprende dicha composición de lípidos y lipoplexo, respectivamente, se pueden tomar de la siguiente lista: leucemia linfoblástica aguda (Adultos), leucemia linfoblástica aguda (Infancia), leucemia mieloide aguda (Adultos), leucemia mieloide aguda (Infancia), carcinoma adrenocortical, carcinoma adrenocortical (Infancia), los cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, el cáncer anal, astrocitoma (Infancia), astrocitoma cerebral (Infancia), cáncer del conducto biliar, extrahepático, cáncer de vejiga, cáncer de vejiga (Infancia), cáncer de hueso, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico (Infancia), tumor cerebral (Adultos), tumor cerebral, glioma del tallo cerebral (Infancia), tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso (Infancia), tumor cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno (Infancia), tumor cerebral, ependimoma (Infancia), tumor cerebral, meduloblastoma (Infancia), tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales (Infancia), tumor cerebral, glioma de las vías ópticas y del hipotálamo (Infancia), tumor cerebral (Infancia), cáncer de mama, cáncer de mama (Infancia), cáncer de mama, Hombre, adenomas/carcinoides bronquiales (Infancia), linfoma de Burkitt, tumor carcinoide (Infancia), tumor carcinoide, gastrointestinal, carcinoma primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, primario, astrocitoma cerebeloso (Infancia), astrocitoma cerebral/glioma maligno (Infancia), cáncer cervical, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal (Infancia), linfoma de células T cutáneas, cáncer endometrial, ependimoma (Infancia), cáncer de esófago, cáncer de esófago (Infancia), familia de tumores de Ewing, tumores de células germinales extracraneales (Infancia), tumores de células germinales extragonadales, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de ojo, melanoma intraocular, Cáncer de ojo, retinoblastoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), cáncer gástrico (de estómago) (Infancia), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor de células germinales, extracraneal, (Infancia), tumores de células germinales, extragonadales, tumor de células germinales, de ovario, tumor trofoblástico gestacional, glioma (Adultos), glioma (Infancia) tallo cerebral, glioma (Infancia) astrocitoma cerebral, glioma (Infancia) de las vías ópticas y del hipotálamo, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado) (Adultos) (primario), cáncer hepatocelular (hígado) (Infancia) (primario), linfoma de Hodgkin (Adultos), linfoma de Hodgkin (Infancia), cáncer de la hipofaringe, hipotalámica y glioma de las vías visuales (Infancia), melanoma intraocular, carcinoma de células Islet (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (células renales), cáncer de riñón (Infancia), cáncer de laringe, cáncer de laringe (Infancia), leucemia linfoblástica aguda, (Adultos), leucemia linfoblástica aguda (Infancia), leucemia mieloide aguda (Adultos), leucemia mieloide aguda (Infancia), leucemia, leucemia linfocítica crónica, mielógena crónica, leucemia, células pilosas, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de hígado (Adultos) (primario), cáncer de hígado (Infancia) (primario), cáncer de pulmón de células grandes, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma, relacionado con el SIDA, linfoma, de Burkitt, linfoma, de células T cutáneas, linfoma, de Hodgkin (Adultos), linfoma, de Hodgkin (Infancia), linfoma, no Hodgkin (Adultos), linfoma, no Hodgkin (Infancia), linfoma, sistema nervioso central primario, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno de Waldenstrom de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma (Infancia), melanoma, melanoma, intraocular (ojo), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma (Adultos) maligno, mesotelioma (Infancia), cáncer del cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto, síndrome de neoplasia endocrina múltiple (Infancia), mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, crónica, leucemia mieloide (Adultos) aguda, leucemia mieloide (Infancia) aguda, mieloma, múltiple, trastornos mieloproliferativos, crónicos, cáncer de la cavidad nasal y seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, cáncer nasofaríngeo (Infancia), neuroblastoma, linfoma no Hodgkin (Adultos), linfoma no Hodgkin (Infancia), cáncer de pulmón de células grandes, cáncer oral (Infancia), cáncer oral de la cavidad, de labios y de la orofaringe, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de los huesos, cáncer de ovario, (Infancia), cáncer ovárico epitelial, tumor

15

25

35

45

55

E07724432

08-10-2015

de células germinales del ovario, tumor de bajo potencial maligno del ovario, cáncer pancreático, cáncer pancreático (Infancia), cáncer pancreático, células de los islotes, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, pineoblastoma y Tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales (Infancia), tumor de la hipófisis, Neoplasia/mieloma múltiple de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, embarazo y cáncer de mama, embarazo y linfoma de Hodgkin, embarazo y linfoma no-Hodgkin, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer del recto, cáncer de células renales (riñón), cáncer de células renales (riñón) (Infancia , pelvis renal y del uréter, cáncer de células de transición, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, (Infancia), cáncer de glándula salival, cáncer de glándula salival, (Infancia), sarcoma, de Ewing, sarcoma, de Kaposi, sarcoma, tejido blando (Adultos), sarcoma, tejido blando (Infancia), sarcoma, uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (Infancia), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel, de células de Merkel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, (Adultos), sarcoma de tejidos blandos, (Infancia), carcinoma de células escamosas, cáncer del cuello escamoso con tumor primario oculto, cáncer de estómago metastásico (gástrico), cáncer de estómago (gástrico) (Infancia), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales (Infancia), linfoma de células T, cutáneas, cáncer testicular, timoma (Infancia), timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides (Infancia), cáncer de células de transición de la pelvis renal y del uréter, tumor trofoblástico, gestacional, uréter y pelvis renal, cáncer de células de transición, cáncer de la uretra, cáncer uterino, sarcoma uterino, endometrial, cáncer vaginal, glioma de las vías ópticas y del hipotálamo, (Infancia), cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, y tumor de Wilms.

La composición de lípidos y lipoplexo que muestran este tipo de especificidad se caracterizan a continuación.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que se puede lograr una administración muy eficaz en aplicaciones in vivo de ácidos nucleicos, en particular de los ácidos nucleicos pequeños tales como ARNi, ARNsi y ANsi, mediante el uso de una composición de lípidos que comprende al menos un primer componente lípido, al menos un primer lípido auxiliar y un compuesto protector. Preferiblemente, el primero de los lípidos es un lípido auxiliar neutral, es decir, de carga neutra o libre de carga. Tal composición de lípidos suelen encontrarse en un vehículo, sin embargo, también puede estar presente en una forma liofilizada. La composición de lípidos contenida en un vehículo suele formar una dispersión. Más preferiblemente, el vehículo es un medio acuoso o una solución acuosa como también se caracteriza adicionalmente en este documento. La composición de lípidos forma típicamente un liposoma en el vehículo, por lo que dicho liposoma contiene también preferiblemente el vehículo dentro.

La composición de lípidos contenida en el vehículo y el vehículo, respectivamente, preferiblemente tienen una osmolaridad de aproximadamente 50 a 600 mosmoles/kg, preferiblemente de aproximadamente 250 a 350 mosmoles/kg, y más preferiblemente de aproximadamente 280 a 320 mosmoles/kg.

Los liposomas formados preferiblemente por el primer componente lípido y opcionalmente también por el primer auxiliar lípido, preferiblemente en combinación con el primer componente lípido, presentan preferentemente un tamaño de partícula de aproximadamente 20 a 200 nm, preferiblemente de aproximadamente 30 a 100 nm, y más preferiblemente de aproximadamente 40 a 80 nm.

Además, se reconocerá que el tamaño de partícula sigue una cierta distribución. Una distribución de tamaño de partícula en la medida representativa se representa en la Fig. 1c que como tal es, en principio, aplicable también a otros tamaños promedio de partículas, es decir, liposomas y lipoplexos, respectivamente.

Una característica opcional adicional de la composición de lípidos según la presente invención es que el pH del vehículo es preferiblemente de aproximadamente 4,0 a 6,0. Sin embargo, también otros intervalos de pH tales como de 4,5 a 8,0, preferiblemente de aproximadamente 5,5 a 7,5 y más preferiblemente de aproximadamente 6,0 a 7,0 están dentro de la presente invención.

Para la realización de estas características particulares pueden tomarse diversas medidas como, como tales, conocidas por la persona experta en la técnica. Para ajustar la osmolaridad, por ejemplo, un azúcar o una combinación de azúcares es particularmente útil. En la medida, la composición de lípidos de la presente invención puede comprender uno o varios de los siguientes azúcares: sacarosa, trehalosa, glucosa, galactosa, manosa, maltosa, lactulosa, rafinosa, e inulina en donde la sacarosa, trehalosa, inulina y rafinosa son particularmente preferidas. En una forma de realización particularmente preferida, la osmolaridad principalmente ajustada con la adición de azúcar es de aproximadamente 300 mosmoles/kg lo que corresponde a una solución de sacarosa 270 mM o a una solución de glucosa 280 mM. Preferiblemente, el vehículo es isotónico con el fluido corporal en el que dicha composición de lípidos se va a administrar. Tal como se utiliza en este documento, el término que la osmolaridad se ajusta sobre todo con la adición de azúcar significa que al menos aproximadamente 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 90% de la osmolaridad es proporcionada por dicho azúcar o una combinación de dichos azúcares.

Si se ajusta el pH de la composición de lípidos de la presente invención, esto se hace mediante el uso de sustancias tampón que, como tales, son básicamente conocidas por el experto en la técnica. Preferentemente, se utilizan sustancias básicas que son adecuadas para compensar las características básicas de los lípidos catiónicos y más específicamente del grupo de amonio del grupo de cabeza catiónico. Cuando se añaden sustancias básicas, tales

imagen8

imagen9

imagen10

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E07724432

08-10-2015

preferentemente fluoruros, cloruros, yoduros y bromuros. Los más preferidos son los cloruros. Al asociarse con el lípido catiónico y el compuesto biológicamente activo que se transfiere a una célula, el anión haluro es reemplazado por el compuesto biológicamente activo que presenta preferiblemente una o varias cargas negativas, aunque hay que reconocer que la carga global del compuesto biológicamente activo no es necesariamente negativa.

Es necesario reconocer que cualquier compuesto según la fórmula (I) comprende al menos dos átomos de C asimétricos. Está dentro de la presente invención que cualquier posible enantiómero de dicho compuesto se describe en el presente documento, es decir, en particular, los enantiómeros RR; SS; RS y SR.

Los compuestos según la presente invención pueden formar una composición o ser parte de una composición, en donde dicha composición comprende un vehículo. En tal composición, que también se denomina en la presente memoria como composición de lípidos los compuestos según la presente invención también se conocen como el(los) componente(s) lípido(s). Dicho vehículo es preferiblemente un vehículo líquido. Vehículos líquidos preferidos son vehículos acuosos y vehículos no acuosos. Vehículos acuosos preferidos son el agua, y sistemas de tampón acuosos, más preferiblemente sistemas de tampón que tienen una resistencia de tampón fisiológica y concentración(es) de sal fisiológica(s). Los vehículos no acuosos preferidos son disolventes, preferentemente disolventes orgánicos tales como etanol, y terc-butanol. Sin desear estar ligado por ninguna teoría, cualquier disolvente orgánico miscible en agua puede, en principio, ser utilizado. Es necesario reconocer que la composición, más particularmente la composición de lípidos puede pues estar presente como o formar liposomas. Está dentro de la presente invención que la osmolaridad y el pH tal como se especifica en relación con la composición de lípidos de la presente invención, así como la concentración del lipoplexo se refiere a un sistema que comprende la composición de lípidos y el lipoplexo, respectivamente, y dicho vehículo.

La composición según la presente invención puede comprender uno o más lípidos auxiliares a los que también se hace referencia en esta memoria como componentes lípidos auxiliares. Los componentes lípidos auxiliares se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende fosfolípidos y esteroides. Los fosfolípidos son preferentemente di-y monoésteres del ácido fosfórico. Los miembros preferidos de los fosfolípidos son fosfoglicéridos y esfingolípidos. Los esteroides, como se usa en este documento, son de origen natural y compuestos sintéticos basados en el ciclopenta[a]fenantreno parcialmente hidrogenado. Preferiblemente, los esteroides contienen de 21 a 30 átomos de C. Un esteroide particularmente preferido es el colesterol.

Lípidos auxiliares particularmente preferidos son 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPhyPE) y 1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

Las composiciones particularmente preferidas según la presente invención comprenden cualquiera del ácido βarginil-2,3-diamino-propiónico-N-palmitil-N-oleil-amida trihidrocloruro [# 6], ácido β-arginil-2,3-diamino-propiónico-Nlauril-N-miristil-amida trihidrocloruro [# 11] o ε-arginil-lisina-N-lauril-N-miristil-amida trihidrocloruro [# 15] en combinación con DPhyPE, con lo que el contenido de DPhyPE es de aproximadamente 90 a 20 moles%, preferiblemente 80 moles%, 65 moles%, 50 moles% y 35 moles%, por lo que el término moles% se refiere al porcentaje del contenido total de lípidos de la composición, es decir, el contenido de lípidos de la composición que incluye el lípido catiónico según la presente invención y cualquier lípido adicional, incluyendo, pero no limitado a, cualquier lípido auxiliar.

Está dentro de la presente invención que la composición según la presente invención comprende preferiblemente el compuesto según la presente invención y/o uno o varios de los lípido(s) auxiliar(es) como se describe en el presente documento, por lo que o bien el compuesto según la presente invención, es decir, el lípido catiónico, y/o el componente lípido auxiliar están presentes como una dispersión en un medio acuoso. Alternativamente, el compuesto según la presente invención, es decir, el lípido catiónico, y/o el componente lípido auxiliar es/están presentes como una solución en un disolvente miscible en agua. Como un medio acuoso, preferiblemente se usa cualquiera de los vehículos acuosos que se han descrito en el presente documento. Disolventes miscibles en agua preferidos son cualquier disolvente que forma una fase homogénea con el agua en cualquier proporción. Los disolventes preferidos son etanol y terc-butanol. Es necesario reconocer que la composición, más particularmente la composición de lípidos puede pues estar presente como o formar liposomas.

Es necesario reconocer que la composición según la presente invención en sus diversas formas de realización es y puede por lo tanto también ser usada como una composición farmacéutica. En este último caso, la composición farmacéutica comprende un compuesto farmacéuticamente activo y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo farmacéuticamente aceptable puede, preferiblemente, seleccionarse de entre el grupo de vehículos tal como se define en el presente documento en relación con la composición según la presente invención. Se entenderá por los expertos en la técnica que cualquier composición tal como se describe en el presente documento puede, en principio, ser utilizada también como una composición farmacéutica a condición de que sus ingredientes y cualquier combinación de los mismos sean farmacéuticamente aceptables. Una composición farmacéutica comprende un compuesto farmacéuticamente activo. Tal compuesto farmacéuticamente activo puede ser el mismo que el constituyente ulterior de la composición según la presente invención, que es preferiblemente cualquier compuesto biológicamente activo, más preferiblemente cualquier compuesto biológicamente activo como se describe en el presente documento. El constituyente ulterior, compuesto farmacéuticamente activo y/o compuesto

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E07724432

08-10-2015

biológicamente activo se selecciona preferiblemente del grupo que comprende péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos y ácidos nucleicos.

Preferiblemente, cualquier dicho compuesto biológicamente activo es una molécula cargada negativamente. El término molécula cargada negativamente significa que se incluyen moléculas que tienen al menos un grupo con carga negativa que puede formar un par iónico con el grupo cargado positivamente del lípido catiónico según la presente invención, aunque el presente inventor no desea estar ligado por ninguna teoría. En principio, la carga positiva en el resto conector también podría tener algún efecto sobre la estructura general de cualquiera de los lípidos, como tal, o cualquier complejo formado entre el lípido catiónico y la molécula cargada negativamente, es decir, el compuesto biológicamente activo. Aparte de eso, la carga positiva adicional introducida en el lípido según la presente invención en comparación con los lípidos catiónicos descritos en el documento de patente de Estados Unidos US 6.395.713, debería contribuir a un aumento de la toxicidad de este lípido según lo enseñado por Xu Y, Szoka FC Jr.; Biochemistry; 1996 07 de mayo, 35 (18): 5616-23. En contraste con lo que los expertos en la materia habrían esperado de este documento de la técnica anterior, los compuestos según la presente invención son particularmente adecuados para los diversos fines descritos en este documento y, en particular, carecen de ninguna toxicidad o de cualquier aumento de la toxicidad.

Un péptido tal como se usa preferiblemente en este documento es cualquier polímero que consta de al menos dos aminoácidos que están unidos covalentemente entre sí, preferiblemente a través de un enlace peptídico. Más preferiblemente, un péptido consiste en de dos a diez aminoácidos. Una forma de realización particularmente preferida del péptido es un oligopéptido que comprende incluso más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 aminoácidos. Las proteínas como preferiblemente se usan en este documento son polímeros que consisten en una pluralidad de aminoácidos que están unidos covalentemente entre sí. Preferiblemente, tales proteínas comprenden al menos aproximadamente 100 aminoácidos o residuos de aminoácidos.

Una proteína preferida que puede ser utilizada en conexión con el lípido catiónico y la composición según la presente invención, es cualquier anticuerpo, preferiblemente cualquier anticuerpo monoclonal.

Compuestos biológicamente activos particularmente preferidos, es decir, compuestos farmacéuticamente activos y dicho constituyente ulterior tal como se utiliza en relación con la composición según la presente invención son los ácidos nucleicos. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN, APN o cualquier mezcla de los mismos. Más preferiblemente, el ácido nucleico es un ácido nucleico funcional. Un ácido nucleico funcional, como preferiblemente se usa en este documento, es un ácido nucleico que no es un ácido nucleico que codifica un péptido y proteína, respectivamente. Ácidos nucleicos funcionales preferidos son ARNsi, ANsi, ARNi, ácidos nucleicos antisentido, ribozimas, aptámeros y espiegélmeros que son todos conocidos en la técnica.

ARNsi son pequeños ARN de interferencia como, por ejemplo, se describe en el documento de patente internacional PCT/EP03/08666. Estas moléculas suelen consistir en una estructura de doble cadena de ARN que comprende entre 15 a 25, preferiblemente 18 a 23 pares de nucleótidos que hacen apareamiento de bases entre sí, es decir, son esencialmente complementarios entre sí, típicamente mediado por un apareamiento de bases de Watson-Crick. Una hebra de esta molécula de doble cadena de ARN es esencialmente complementaria a un ácido nucleico diana, preferiblemente un ARNm, mientras que la segunda hebra de dicha molécula de ARN bicatenaria es esencialmente idéntica a un tramo de dicho ácido nucleico diana. La molécula de ARNsi puede estar flanqueada en cada lado y cada tramo, respectivamente, por una serie de oligonucleótidos adicionales que, sin embargo, no tienen necesariamente que estar apareados entre sí.

ARNi tiene esencialmente el mismo diseño que ARNsi, sin embargo, las moléculas son significativamente más largas en comparación con ARNsi. Las moléculas de ARNi comprenden típicamente 50 o más nucleótidos y pares de bases, respectivamente.

Una clase adicional de ácidos nucleicos funcionales que son activos basado en el mismo modo de acción de ARNsi y ARNi es ANsi. ANsi se describe, por ejemplo, en el documento de patente internacional PCT/EP03/074654. Más particularmente, ANsi se corresponde con ARNsi, por lo que la molécula de ANsi no comprende ningún ribonucleótido.

Los ácidos nucleicos antisentido, tal como se utiliza preferentemente en el presente documento, son oligonucleótidos que hibridan basados en la complementariedad de base con un ARN diana, preferiblemente ARNm, activando así la RNasaH. La RNasaH es activada por ambos, ADN acoplado con fosfodiéster y ADN acoplado con fosfotioato. El ADN acoplado con fosfodiéster, sin embargo, es degradado rápidamente por nucleasas celulares con la excepción del ADN acoplado a fosfotioato. Los polinucleótidos antisentido son por lo tanto eficaces sólo como complejos de ADN-ARN híbridos. Las longitudes preferidas de los ácidos nucleicos antisentido están en el intervalo de 16 a 23 nucleótidos. Ejemplos de este tipo de oligonucleótidos antisentido se describen, entre otros, en el documento de patente de Estados Unidos 5.849.902 y el documento de patente de Estados Unidos 5.989.912.

Un grupo adicional de ácidos nucleicos funcionales son las ribozimas que son ácidos nucleicos catalíticamente activos preferiblemente que consisten en ARN que comprenden básicamente dos restos. El primer resto muestra una actividad catalítica, mientras que el segundo resto es responsable de una interacción específica con el ácido

imagen11

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E07724432

08-10-2015

de la masa de lípido total a la masa de ARNsi es típicamente de 2:1 a 1000:1 (m/m), en donde se prefiere una proporción de 5:1 a 15:1 (m/m) y una relación de 6:1 a 9:1 (m/m) es aún más preferida.

Está dentro de la presente invención que la composición y más particularmente la composición farmacéutica puede comprender uno o más de los compuestos biológicamente activos antes mencionados que pueden estar contenidos en una composición según la presente invención como compuesto farmacéuticamente activo y como constituyente adicional, respectivamente. Será reconocido por los expertos en la técnica que cualquiera de estos compuestos puede, en principio, ser utilizado como un compuesto farmacéuticamente activo. Tal compuesto farmacéuticamente activo está típicamente dirigido contra una molécula diana que está implicada en el mecanismo patógeno de una enfermedad. Debido al principio de diseño general y modo de acción que subyace a los diversos compuestos biológicamente activos y por lo tanto los compuestos farmacéuticamente activos tal como se utiliza en conexión con cualquier aspecto de la presente invención, se pueden dirigir prácticamente a cualquier diana. Por consiguiente, el compuesto según la presente invención y las respectivas composiciones que contienen el mismo se pueden utilizar para el tratamiento o prevención de cualquier enfermedad o condición de enfermedad que se pueda tratar, prevenir y/o tratar usando este tipo de compuestos biológicamente activos. Es preciso reconocer que aparte de estos compuestos biológicamente activos cualquier otro compuesto biológicamente activo también puede ser parte de una composición según cualquier forma de realización de la presente invención. Preferiblemente, dicho otro compuesto biológicamente activo comprende al menos una carga negativa, preferiblemente bajo condiciones en las que el dicho otro compuesto biológicamente activo está interactuando o formando un complejo con el compuesto según la presente invención, más preferiblemente el compuesto según la presente invención que está presente como un lípido catiónico.

Tal como se usa en el presente documento, un compuesto biológicamente activo es, preferiblemente, cualquier compuesto que sea biológicamente activo, preferiblemente que exhibe cualquier efecto biológico, químico y/o físico en un sistema biológico. Tal sistema biológico es preferiblemente cualquier reacción bioquímica, cualquier célula, preferiblemente cualquier célula animal, más preferiblemente cualquier célula de vertebrado y más preferiblemente cualquier célula de mamífero, incluyendo, pero no limitado a, cualquier célula humana, cualquier tejido, cualquier órgano y cualquier organismo. Dicho cualquier organismo se selecciona preferiblemente del grupo que comprende ratones, ratas, cobayas, conejos, gatos, perros, ovejas, cerdos, cabras, vacas, caballos, aves de corral, monos y seres humanos.

Está también dentro de la presente invención que cualquiera de las composiciones según la presente invención, más particularmente cualquier composición farmacéutica según la presente invención puede comprender cualquier compuesto(s) farmacéuticamente activo(s) adicional(es).

La composición, en particular la composición farmacéutica según la presente invención se puede utilizar para diversas formas de administración, en donde se prefieren particularmente la administración local y la administración sistémica. Incluso más preferida es una vía de administración que se selecciona del grupo que comprende la administración intramuscular, percutánea, subcutánea, intravenosa y pulmonar. Tal como se usa preferiblemente en el presente documento, la administración local significa que la composición respectiva se administra en estrecha relación espacial a la célula, tejido y órgano, respectivamente, a la que la composición y el compuesto biológicamente activo, respectivamente, se tienen que administrar. Tal como se usa en el presente documento, la administración sistémica significa una administración que es diferente de una administración local y más preferiblemente es la administración en un fluido corporal tal como la sangre y el fluido, respectivamente, mediante la cual el líquido corporal transporta la composición a la célula, tejido y órgano, respectivamente, a los que la composición y el compuesto biológicamente activo, respectivamente, van a ser entregados. Sin embargo, una administración ex vivo tal como en el caso de trasplante de órganos, también está comprendida en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, la célula a través de cuya membrana celular se va a transferir un compuesto biológicamente activo por medio del compuesto y composición según la presente invención, respectivamente, es preferiblemente una célula eucariota, más preferiblemente una célula de vertebrado e incluso más preferiblemente una célula de mamífero. Lo más preferiblemente, la célula es una célula humana. En cualquier caso, dicha célula es una célula endotelial.

Cualquier medicamento que puede ser fabricado utilizando el compuesto y la composición según la presente invención, respectivamente, es para el tratamiento y la prevención de una enfermedad en un paciente. Preferiblemente dicho paciente es un vertebrado, más preferiblemente un mamífero y aún más preferiblemente dicho mamífero se selecciona del grupo que comprende ratones, ratas, perros, gatos, cobayas, conejos, ovejas, cerdos, cabras, vacas, caballos, monos, aves de corral y seres humanos. En un aspecto adicional el compuesto y composición según la presente invención se pueden utilizar como un agente de transferencia, más preferiblemente como un agente de transfección.

Tal como se utiliza preferiblemente en el presente documento un agente de transferencia es cualquier agente que es adecuado para transferir un compuesto, más preferiblemente un compuesto biológicamente activo tal como un compuesto farmacéuticamente activo a través de una membrana, preferiblemente una membrana celular y más preferiblemente transferir tal compuesto a una célula como se describió anteriormente en el presente documento.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

E07724432

08-10-2015

Incluso más preferiblemente, dicha transferencia comprende también la liberación desde cualquier endosoma y/o lisosoma. En una forma de realización preferida el término membrana celular comprenderá también membranas dentro de la célula, tales como la membrana vesicular, membranas de endosoma y de lisosoma.

En todavía un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método para transferir, más particularmente transfectar, una célula con un compuesto biológicamente activo. En una primera etapa, en donde la secuencia de pasos no está necesariamente limitada y, en particular, no se limita a la secuencia de pasos descritos a continuación, se proporcionan la célula y la membrana y célula, respectivamente. En una segunda etapa, se proporciona un compuesto o composición según la presente invención, así como un compuesto biológicamente activo tal como un compuesto farmacéuticamente activo. Esta reacción se puede poner en contacto con la célula y la membrana, respectivamente, y debido a las características biofísicas del compuesto y la composición según la presente invención, el compuesto biológicamente activo se transferirá de un lado de la membrana al otro, o en caso de que la membrana forme una célula, desde fuera de la célula a dentro de la célula. Está dentro de la presente invención que, antes de poner en contacto la célula y la membrana, respectivamente, el compuesto biológicamente activo y el compuesto o composición según la presente invención, se ponen en contacto, con lo cual preferiblemente se forma un complejo y dicho complejo se pone en contacto con la célula y la membrana, respectivamente.

En un aspecto adicional de la presente invención el método para la transferencia de un compuesto biológicamente activo y un compuesto farmacéuticamente activo, respectivamente, comprende las etapas de proporcionar la célula y la membrana, respectivamente, proporcionar una composición según la presente invención y poner en contacto tanto la composición como la célula y la membrana, respectivamente. Está dentro de la presente invención que la composición se puede formar antes o durante el contacto con la célula y la membrana, respectivamente.

En una forma de realización de cualquier método para transferir un compuesto biológicamente activo como se describe en este documento, el método puede comprender etapas adicionales, preferiblemente la etapa de detectar si el compuesto biológicamente activo se ha transferido. Dicha reacción de detección depende fuertemente de la clase de compuestos biológicamente activos transferidos según el método y será fácilmente evidente para los expertos en la técnica. Está dentro de la presente invención que tal método se realiza en cualquier célula, tejido, órgano y organismo tal como se describe en este documento.

Es preciso reconocer que en una forma de realización adicional el agente protector está unido, como se describe en el presente documento, al componente lípido de la composición de lípidos según la presente invención, preferiblemente al lípido catiónico.

Como se usa en este documento, el término tratamiento de una enfermedad también comprende la prevención de dicha enfermedad.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos de los que pueden tomarse otras características, formas de realización y ventajas.

La figura 1a muestra las estructuras de los constituyentes de la composición de lípidos según la presente invención.

La figura 1b muestra una representación esquemática de un liposoma formado por la composición de lípidos según la presente invención y el lipoplexo de ARNsi según la presente invención formado por la composición de lípidos junto a moléculas de ARNsi que indican que las moléculas de ARNsi están formando un complejo predominantemente con la superficie exterior del liposoma en lugar de estar contenidas en el liposoma, con lo que los ARNsis cargados negativamente se complejan por interacción electrostática con las cargas positivas de los lípidos catiónicos.

La figura 1c muestra un diagrama que representa el tamaño de un liposoma formado por la composición de lípidos según la presente invención y el lipoplexo de ARNsi según la presente invención.

La figura 1d muestra un diagrama que representa el potencial zeta de un liposoma formado por la composición de lípidos según la presente invención y el lipoplexo de ARNsi según la presente invención.

La figura 2a muestra el resultado de un análisis de transferencia Western de la inhibición dependiente de la concentración de la expresión de la proteína PKN3 con ARNsi lipoplexado y ARNsi desnudo, respectivamente, en células HeLa, mediante el cual PTEN sirve como control de carga.

La figura 2b muestra las imágenes tomadas por microscopía confocal de células HeLa tratadas con ARNsis marcados con Cy3 y administrados ya sea desnudos o como un lipoplexo según la presente invención.

La figura 3a muestra el resultado de un análisis de transferencia de Western usando formulaciones liposómicas que contienen diferentes moles% de PEG.

La figura 3b muestra imágenes de microscopía confocal de la captación celular de lipoplexos de ARNsi-Cy3 con 0, 1, 2 y 5 moles% de PEG; Células EOMA fueron transfectadas con lipoplexos de ARNsi de etiqueta fluorescente; nota: con 5 moles% de PEG, la mayor parte del lipoplexo decora la superficie de la célula (flechas).

10

15

20

25

30

35

40

45

50

E07724432

08-10-2015

La figura 3c muestra el resultado de un análisis de transferencia Western y más específicamente de inmunotransferencia con extractos de células HUVEC transfectadas con diferentes cantidades de lipoplexos de ARNsiPKN3 PEGilado (1 mol%) y no PEGilado (panel superior) y lipoplexo de ARNsiPTEN PEGilado (1 mol%) y no PEGilado (panel inferior); la concentración final de ARNsi se indica (1-20 nM; ut: no tratado); las inmunotransferencias se sondaron con anti-PTEN y anti-PKN3.

La figura 3d muestra varios diagramas que indican el desarrollo del peso corporal de ratones desnudos tratados con diferentes formulaciones durante un período de cinco días, por lo cual se trataron los ratones (inyecciones iv individuales en días 1-5) con lipoplexos de ARNsiLuc, ARNsiPKN3, ARNsiCD31 y ARNsiPTEN PEGilados (triángulo) o no PEGilados (cuadrados) durante un período de 5 días; se muestran los cambios relativos en el peso corporal como media ± s.e.m. de 7 ratones por grupo de tratamiento.

La figura 3e muestra un diagrama que indica el resultado de un ELISA de IL-12 de muestras de sangre de los ratones C57/BL6 (2 ratones por grupo) después de un solo tratamiento con poli (I:C) o los lipoplexos de siARN indicados para 2 (gris oscuro) o 24 (gris claro) horas.

La figura 4a muestra imágenes de microscopía de epifluorescencia de secciones embebidas en parafina que visualizan la distribución de ARNsi-Cy3 desnudo (fila central) o lipoplexado (fila inferior) (1,88 mg/kg) en diferentes tejidos 20 minutos después de la inyección en la vena de la cola.

La figura 4b muestra imágenes de microscopía de epifluorescencia de corazón, pulmón, bazo e hígado analizadas en diferentes puntos de tiempo después de la administración iv sistémica única del lipoplexo de ARNsi-Cy3; muestras de tejido se registraron en configuración del microscopio idéntica (para cada órgano); tamaño de las barras: 100 μm; en el caso del hígado y el bazo: 200 μm.

La figura 4c muestra imágenes de microscopía confocal de la distribución de las células endoteliales en el corazón como se revelado por IHC usando un anticuerpo anti-CD31 (imagen de la izquierda) que decoran secciones transversales y longitudinales de los capilares (flecha); tinción de fluorescencia de Cy-3 de las células endoteliales de los vasos (imagen de la derecha, flecha).

La figura 4d muestra imágenes de microscopía confocal que ilustran la distribución de células endoteliales en el pulmón como se revela por IHC usando un anticuerpo anti-CD31 (imagen de la izquierda) que decoran los capilares pulmonares en el pulmón (flecha, vaso; doble flecha, macrófagos alveolares); tinción de fluorescencia Cy3 de las células endoteliales de los vasos (imagen de la derecha, flecha); los macrófagos alveolares también muestran fluorescencia fuerte (imagen de la derecha, las pequeñas flechas).

La figura 5a muestra un diagrama que ilustra la caída de los niveles de ARNm para Tie2 (diagrama de la derecha) o CD31 (diagrama de la izquierda) en el tejido de pulmón, el tejido del corazón y el tejido del hígado de animales tratados diariamente en cuatro días consecutivos con sacarosa, lipoplexos de ARNsiCD31, lipoplexos de ARNsiPETEN ,

o lipoplexos de ARNsiTie2 como se cuantificó por TaqMan RT-PCR; los niveles de ARNm indicados se muestran con respecto al grupo de sacarosa y se normaliza para el nivel de ARNm de CD34; los valores son medias ± s.e.m. de las proporciones de todos los animales por grupo.

La figura 5b muestra inmunotransferencias de extractos de proteína de pulmón, corazón, e hígado de 6-7 ratones individuales tratados con lipoplexo de ARNsiCD31 o con lipoplexo de ARNsiTie2 que se sondearon con anti-Tie2, o anti-CD31 y anti-PTEN (control de carga); nota: los niveles de expresión de la proteína cambian sólo para Tie-2 o CD31 según el lipoplexo aplicado, mientras que no se produjeron cambios en los niveles de expresión de PTEN.

La figura 5c muestra un diagrama que ilustra s-Tie2 como una función de diversas formulaciones y más específicamente la disminución de Tie2 soluble (s-Tie2) después de cuatro tratamientos diarios con lipoplexos de ARNsiTιe2 (día 5, diagrama de la derecha), pero no con lipoplexos de control (ARNsiPTEN, ARNsiCD31) y sacarosa; los niveles de s-Tie2 medidos de ratones individuales por grupo de tratamiento se indican como rombos; niveles de Tie2 soluble de los ratones antes del tratamiento (día 0) se muestran en el diagrama de la izquierda, después del tratamiento en el diagrama de la derecha; el valor medio de s-Tie2 para cada grupo de tratamiento se muestra como líneas.

La figura 6 muestra un diagrama que indica la distribución del tamaño de los liposomas que tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 85 nm adecuado para la preparación de lipoplexos que tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 120 nm.

La figura 7 muestra un diagrama que indica la distribución del tamaño de lipoplexos que tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 120 nm.

La figura 8 muestra un diagrama que indica la distribución del tamaño de varios lotes de liposomas que tienen un tamaño de partícula medio de aproximadamente 30 nm adecuado para la preparación de lipoplexos que tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 60 nm.

imagen12

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E07724432

08-10-2015

EmulsiFlex C3 (Avestin, Inc., Ottawa, Canadá). Para generar los lipoplexos de ARNsi (AtuPLEX) la dispersión liposómica obtenida se mezcló con un volumen igual de una solución de 0,5625 mg/ml de ARNsi en sacarosa 300 mM, dando como resultado una relación de carga calculada de fosfatos de cadena principal de ácido nucleico para átomos de nitrógeno de lípidos catiónicos de aproximadamente 1 a 4. El tamaño del liposoma y de la dispersión de lipoplex se determinó por dispersión de la luz cuasi elástica (Quasi Elastic Light Scattering) (QELS) (N5 Submicron Particle Size Analyzer, Beckman Coulter, Inc., Miami, FL) y el potencial zeta se midió utilizando un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido).

Para el marcaje doble del lipoplexo de ARNsi, se generaron liposomas marcados con fluorescencia mediante la adición del lípido trazador de etiquetado fluorescente TexasRed®-1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de trietilamonio (TexasRed®-DHPE; Molecular Probes) en la siguiente proporción: 50 moles% de lípido catiónico (AtuFECT01)/44 moles% de lípido auxiliar DPhyPE/1 mol% de DSPE-PEG/5 moles% de TexasRed®-DHPE. Los liposomas fueron procesados por medio de 51 ciclos de extrusión a través de una membrana de policarbonato de 400 nm antes de la mezcla lo que originó una concentración final de 2,17 mg/ml total para los lípidos y 0,28 mg/ml de ARNsi (una inyección de 200 μl en un ratón de 30 g representa una dosis de 1,88 mg/kg de ARNsi y 14,5 mg/kg de lípidos).

Transfección in vitro e inmunotransferencia

Líneas de células EOMA murinas y HeLa humanas se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron de acuerdo con la recomendación de la ATCC. Las líneas celulares fueron transfectadas con ARNsi utilizando los liposomas catiónicos descritos anteriormente. Brevemente, se añadieron aproximadamente 12 horas después de la siembra de células, diferentes cantidades de solución de lipoplexos de ARNsi diluidos en un medio que contenía 10% de suero a las células para alcanzar concentraciones de transfección en un intervalo de 1-50 nM de ARNsi. Después de la transfección (48 horas) las células se lisaron y se sometieron a inmunotransferencia tal como se describe (Klippel et al., 1998). Para la extracción de proteínas totales, los tejidos fueron disecados e inmediatamente congelados de golpe en nitrógeno líquido. Se homogeneizaron 20 mg de tejido en un molino mezclador MM 301 (Retsch GmbH, Haan, Alemania) usando perlas de carburo de tungsteno (Qiagen) y las proteínas se extrajeron en tampón de lisis NP40. La concentración de proteína se determinó con un ensayo de proteína DC (BioRad) y cantidades iguales se cargaron para el análisis de immunotransferencia usando los siguientes anticuerpos: anti-PTEN de conejo (Ab-2, Neomarkers), monoclonal p110α (Klippel et al, 1994), anti-PKN3 de conejo (Leenders et al., 2004), anti-CD31 de cabra (Santa Cruz de Biotecnology), anti Tie-2 de conejo (Cell Signaling Technology).

Experimentos de captación de ARNsi-Cy3 en cultivo celular y en ratones

Para los estudios de captación de moléculas de ARNsi-Cy3 no formuladas en cultivo celular, las células se incubaron con cantidades definidas de solución de ARNsi durante la noche en un medio que contenía suero. La captación de si ARN-Cy3 lipoplexado se llevó a cabo mediante la transfección durante la noche como se mencionó anteriormente. Las células tratadas fueron lavadas con PBS enfriado con hielo y se fijaron en solución de 4% formaldehído/PBS durante 15 minutos antes de la microscopía. El experimento de entrega in vivo utilizando ARNsi-Cy3 marcado con etiquetado de fluorescencia se llevó a cabo mediante la administración de ARNsi formulado y desnudo por vía intravenosa. Los ratones fueron tratados con una sola inyección iv de 200 μl en una dosis final de 1,88 mg/kg de ARNsi-Cy3 y 14,5 mg/kg de lípidos y fueron sacrificados en puntos de tiempo definidos y la captación de fluorescencia examinada por microscopía en secciones de tejido congelado o fijados con formalina, embebidos en parafina o montados OCT.

Análisis histológico y microscopía

Después de que los ratones fueron sacrificados, los tejidos se fijaron inmediatamente en 4,5% de formalina tamponada durante 16 horas y, consecuentemente, se procesaron para la inclusión en parafina. Se cortaron secciones de 4 µm, y se colocaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones de tejido fueron teñidas con anticuerpo policlonal de cabra anti-CD31/PECAM-1 (Santa Cruz Biotechnology) (alternativamente para criosecciones de rata CD31, Pharmingen) para visualizar las células endoteliales en secciones de parafina. La inmunohistoquímica y la tinción hematoxilina/eosina (H+E) en secciones de tejido en parafina se realizaron según protocolos estándar. Para los estudios in vivo de captación de ARNsis marcados con fluorescencia, las secciones de parafina fueron examinadas directamente por epifluorescencia con un microscopio Zeiss Axioplan. Las imágenes fueron grabadas y procesadas con el software de imágenes Zeiss LSM5. Se realizó un análisis microscópico de la captación de ARNsi con un microscopio confocal Zeiss LSM510 Meta. Para ello, las secciones se desparafinaron con xileno, rehidrataron a través de lavados de etanol graduado, se tiñeron a contracorriente con Sytox tinte verde (Molecular Probes 100 nM), se enjuagaron y se montaron finalmente en Fluorsave (Calbiochem) para microscopia.

Cuantificación del ARNm mediante RT-PCR (TaqMan)

Los tejidos fueron disecados e inmediatamente congelados de golpe en nitrógeno líquido. Aproximadamente 20 mg de tejido se homogeneizó en un molino mezclador MM 301 (Retsch GmbH, Haan, Alemania) usando cuentas de carburo de tungsteno (Qiagen) y el ARN total fue preparado con el Invisorb spin Tissue ARN Mini Kit (Invitek, Berlín,

imagen13

15

25

35

45

55

E07724432

08-10-2015

El análisis por inmunotransferencia realizado para la entrega in vitro demostró que ningún silenciamiento de genes se produjo cuando se aplicó ARNsi desnudo incluso en concentraciones micromolares en comparación con las concentraciones nanomolares utilizadas para los lipoplexos de ARNsi como puede ser observado en la Figura 2a. Para analizar si la falta de silenciamiento génico era el resultado de una captación celular ineficiente debido a los efectos de repulsión entre los ARNsis aniónicos y la membrana de la célula de carga negativa, se emplearon 3 ARNsis con fluorescencia (Cy3) marcada en 3´ para estudiar su absorción por microscopía confocal. Nosotros, y otros han demostrado previamente que el etiquetado de fluorescencia en el 3'-terminal de la molécula antisentido no perjudica la actividad de silenciamiento del ARN cuando es transfectado con vehículos de entrega (Chiu y Rana, 2002; Czauderna et al., 2003). Sorprendentemente, se observó una absorción significativa de ARNsis marcados con fluorescencia en ausencia de reactivos de transfección cuando se aplicaron concentraciones altas (10 μM) de las moléculas de ARNsi-Cy3, tal como se representa en la Fig. 2b. Por el contrario, se logró una captación equivalente de ARNsi-Cy3 cuando se transfectaron con AtuFECT01 a una concentración de mil veces menor de ARNsi-Cy3 (10 nM). Estos resultados indican que los lipoplexos de ARNsi proporcionan dos efectos beneficiosos para la entrega funcional de ARNsis: una captación celular mejorada y más importante, el escape de la vía endocítica/endosómica en el citoplasma (Zelphati y Szoka, 1996), donde se lleva a cabo mediada por ARNi la degradación del ARNm.

Ejemplo 3: Los lipoplexos de ARNsi PEGilados son funcionales in vitro y adecuados para su aplicación in vivo

Se ha sugerido que las partículas liposómicas catiónicas pueden interactuar con las proteínas del suero con carga negativa o unirse a otros componentes del suero. Estas interacciones no específicas podrían influir negativamente en las propiedades de distribución y entrega de las formulaciones de liposomas in vivo. Para superar este problema, muchos portadores de liposomas están recubiertos con el polímero de poli(etilenglicol), PEG, para evitar el aclaramiento del portador por las proteínas de suero o el sistema del complemento y mejorar el tiempo de circulación. Además, la incorporación de PEG puede ayudar a estabilizar los liposomas mediante el blindaje y reducir el aclaramiento de macrófagos (Allen et al., 1995; Feigner et al, 1987).

A fin de demostrar la ventaja de la PEGilación en el caso de los lipoplexos de ARNsi hemos realizado experimentos con y sin lípidos PEGilados. En los siguientes experimentos utilizamos lipoplexos de ARNsi que comprendían liposomas cargados positivamente (lípido catiónico Atufect01, lípido neutro/auxiliar DPhyPE, y diferentes cantidades de DSPE-PEG-2000) en combinación con diferentes moléculas de ARNsi de diana específica. En primer lugar, se determinó el efecto de diferentes cantidades de PEGilación sobre la actividad de interferencia de ARN in vitro. Se eliminó completamente el silenciamiento del gen mediado por ARNsi en presencia de 5 moles% de DSPE-PEG2000, pero se mantuvo en presencia de 1-2 moles% en la formulación. Los resultados se representan en la Fig. 3a, que muestra el resultado de un análisis de transferencia Western que prueba las formulaciones de ARNsiPTEN liposómicas con diferentes moles% de PEG por transfección de células HeLa (concentración de ARNsi; 20 nM (panel izquierdo) o 5 nM (panel derecho); ut: no tratado); por el que los extractos de proteínas se probaron con anti anti-PTEN y anti-p110α. La distribución intracelular de lipoplexos de ARNsi marcados con fluorescencia cambió con 1-2% de PEGilación de grandes vesículas perinucleares interconectadas a pequeñas vesículas uniformes como se muestra en la figura 3b. En contraste, a 5 moles% de PEGilación, cuando no se observó ARNi (Fig. 3a), la captación celular parecía estar bloqueada, ya que el ARNsi-Cy3 lipoflexado se unió principalmente a la superficie de la célula como puede verse en la figura 3b, panel derecho. Cuando el ARNsi complementario a la secuencia diana del gen PTEN o PKN3 se formuló en presencia o ausencia de 1 mol% de DSPE-PEG-2000, se observó una caída específica de proteínas mediada por ARNsi independientemente de la pegilación como puede verse en la figura 3c. Sin embargo los lipoplexos de ARNsi no pegilados dieron lugar a una destrucción de proteínas ligeramente más eficiente a concentraciones más bajas cuando se comparan con las variantes pegiladas (Figura 3c, comparando concentraciones 1 nM de ARNsi), pero también mostraron efectos de destrucción inespecíficos (véase el control de carga de PTEN para lipoplexos de ARNsiPKN3) cuando se aplicaron en dosis más altas (20 nM, Figura 3c). Esta inhibición no específica de un nivel de proteína no diana es probablemente debido a un efecto tóxico más pronunciado del lipoplexo no PEGilado in vitro.

Para analizar si la PEGilación de los lipoplexos de ARNsi también pueden reducir la toxicidad in vivo se aplicó dosis idénticas de lipoplexos de ARNsi pegilados (1 mol% DSPE-PEG-2000) y no pegilados por inyección en la vena de la cola en ratones. Tratamientos diarios consecutivos (día 1 a 5) de lipoplexos de ARNsi no pegilados (se utilizaron cuatro secuencias diferentes de ARNsiLuc, ARNsiPKN3, ARNsiCD31 y ARNsiPETEN) de administración sistémica (iv) causó pérdida de peso corporal con el tiempo, mientras que los ratones tratados con las mismas dosis diarias de variantes PEGilados (1 mol% DSPE-PEG-2000) no parecieron afectados como se puede ver en la Fig. 3d.

Para dilucidar las diferencias en la pérdida de peso corporal después del tratamiento con lipoplexos de ARNsi pegilado y no pegilado, se analizó una reacción inmunológica posible debido al tratamiento con lipoplexo. Por esta razón, se analizó el nivel de interleucina-12 (IL-12) (Alexopoulou et al, 2001; Liu et al, 2003) en ratones competentes inmunes después de una inyección única bolo iv del PoIy(I:C) no complejado (control positivo) o lipoplexos de ARNsi pegilados y no pegilados (ARNsiPTEN, ARNsiLuc). El análisis de ELISA reveló que no hubo aumento de la IL-12 tras el tratamiento de lipoplexo de ARNsi independientemente de la PEGilación como puede verse en la figura 3e. Por lo tanto, parece poco probable que una respuesta de citocinas inespecífica causara la reducción de peso corporal observada tras el tratamiento de lipoplexo de ARNsi no pegilado. Tomados en conjunto estos datos muestran que 1 mol% de DSPE-PEG-2000 en las formulaciones de lipoplexo de ARNsi es suficiente para reducir los efectos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E07724432

08-10-2015

secundarios tóxicos no específicos in vivo sin una severa pérdida de la eficacia de ARNi in vitro. En consecuencia, un grado definido de PEGilación parece ser un requisito previo importante para una segura y eficiente aplicación in vivo de los lipoplexos de ARNsi caracterizados en este documento.

Ejemplo 4: Captación específica de ARNsi lipoplexado en el endotelio vascular y excreción renal de ARNsi desnudo

En un siguiente paso nos propusimos investigar la biodistribución y la cinética de los lipoplexos de ARNsi en comparación con ARNsi no formulado después del tratamiento sistémico en ratones. Para este propósito, se inyectó una dosis única de ARNsi marcado con fluorescencia de Cy3 ya sea complejado con lípidos (inyección iv 200 μl en una dosis final de 1,88 mg/kg de ARNsi-Cy3 y 14,5 mg/kg de lípidos) o no formulado (ARNsi-Cy3: 0,188 mg/ml igual a 15 μM) en ratones inmunocompetentes, y se diseccionaron seis órganos distintos en nueve puntos de tiempo (de 5 minutos a 48 horas) para su examen por epifluoresecencia y miscroscopia confocal. Un análisis microscópico inicial reveló que se detectó fluorescencia en todos los tejidos analizados de los animales 20 minutos después del tratamiento con lipoplexo deARNsi-Cy3 como se muestra en la figura 4a, paneles inferiores. La fluorescencia Cy3 apareció en un patrón de tinción distintivo para cada órgano. Este patrón de tinción Cy3 específico para cada órgano recuerda la distribución del tejido endotelial. En contraste, el ARNsi desnudo se encontró predominantemente en el riñón 20 minutos después de la inyección, sin señales detectables en otros órganos, lo que sugiere una rápida excreción renal de moléculas de ARNsi no formuladas (Figura 4a, fila superior). Además, el ARNsi-Cy3 desnudo aplicado se acumula en el polo y el lumen de los túbulos proximales y en la orina 5 minutos después de la inyección, lo que no se observó con el ARNsi-Cy3 lipoplexado. En conclusión, los ARNsis no formulados no fueron dirigidos a ningún tipo de célula de los tejidos analizados in vivo después de la administración sistémica, esto se debe más probablemente a su excreción renal instantánea. Para los lipoplexos de ARNsi-Cy3, los datos de fluorescencia microscópicos sugieren, sin embargo, que las moléculas de ARNsi fueron captadas por el endotelio vascular en diferentes órganos con una tasa de aclaramiento profundamente retrasada. Para analizar la farmacocinética de los lipoplexos de ARNsi-Cy3 con más detalle se comparó la captación de lipoplexos de ARNsi-Cy3 más estrechamente en diferentes puntos de tiempo. Se seleccionaron los cuatro órganos (pulmón, corazón, hígado y bazo) con la mayor cantidad de fluorescencia Cy3 a los 20 minutos después de la inyección (200 μl de inyección iv a una dosis final de 1,88 mg/kg de ARNsi-Cy3 y 14,5 mg/kg de lípidos) para este análisis. La fluorescencia Cy3 se comparó mediante el examen microscópico utilizando parámetros de grabación idénticos. Cantidades importantes de ARNsi-Cy3 lipoplexado se acumularon en todos estos órganos a partir de cinco minutos después de la inyección como se puede ver en la Figura 4b. Este nivel de fluorescencia disminuyó gradualmente en el siguiente período de 2 horas en el corazón y el tejido pulmonar. En contraste, se detectó la mayor parte de la fluorescencia en el bazo 20 minutos después de la administración del lipoplexo de ARNsi Cy3, y se mantuvo hasta 20 horas en este tejido. En el hígado, el lipoplexo de ARNsi-Cy3 acumulado con el tiempo dio lugar a la mayor cantidad de fluorescencia Cy3 a las 2 horas después de la inyección, antes de disminuir durante el próximo período de tiempo de 4-20 horas. Sorprendentemente, el patrón de tinción de fluorescencia distintivo del lipoplexo de ARNsi-Cy3 en cada tejido no cambió con el tiempo lo que sugiere que las moléculas de ARNsi no se difunden por todo el tejido entero. No se observó fluorescencia Cy3 a las 48 horas después de la administración única de lipoplexos de ARNsi-Cy3 en ninguna de las muestras analizadas por este ensayo microscópico. Estos resultados indican que las moléculas de ARNsi formuladas en lipoplexos logran una mejor captación de órganos en comparación con los administrados como ARNsis desnudos.

La captación de ARNsi mejorada de un órgano, sin embargo, no indica necesariamente una captación intracelular o específica del tipo de célula de estas moléculas, que es un requisito previo para la funcionalidad de los ARNsis entregados. Un análisis más detallado de la captación de ARNsi-Cy3 formulado en el corazón y el pulmón por microscopía confocal reveló que a nivel celular, la tinción de fluorescencia estaba predominantemente presente en los revestimientos de los vasos sanguíneos lo que sugiere la entrega a las células endoteliales. El endotelio vascular en el corazón se visualizó mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-CD31. Los resultados se representan en la Figura 4c. La tinción para las células endoteliales que expresan el CD31 ilustra la presencia de numerosos capilares sanguíneos a lo largo de las células del músculo cardíaco (Figura 4c; flecha: secciones transversales y secciones longitudinales de los capilares). Estas estructuras capilares estaban decoradas en el corazón de los ratones tratados con una sola inyección intravenosa de lipoplexos ARNsi-Cy3 según lo revelado por microscopía confocal (Figura 4c, panel derecho).

La microscopía confocal de secciones de pulmón de ratones tratados con lipoplexos de ARNsi-Cy3 reveló una tinción puntuada de la pared alveolar, pero no del epitelio de los bronquiolos como se puede observar en la figura. 4d. La pared alveolar es atravesada por el endotelio de los capilares alveolares como se visualizó por tinción con anti-CD31 (Figura 4D, panel izquierdo). Por consiguiente, concluimos que los ARNsis lipoplexado usando los liposomas descritos en este documento pueden ser entregados al endotelio capilar del pulmón. Una captación de ARNsi específica de células endoteliales similar se observó para otros órganos incluyendo el hígado, páncreas, riñón, intestino delgado, y estómago. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que las formulaciones de ARNsis basadas en lípidos catiónicos mejoran las propiedades de biodistribución de ARNsis y permite una absorción predominante de ARNsis en células endoteliales en todo el cuerpo.

Ejemplo 5: ARNi mediado por lipoplexos de ARNsi en los vasos del pulmón, corazón e hígado

imagen14

imagen15

10

15

20

25

30

35

40

45

E07724432

08-10-2015

Feigner, P.L., Gadek, T.R., Holm, M., Roman, R., Chan, H.W., Wenz, M., Northrop, J.P., Ringold, G.M. y Danielsen,

M. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci USA, 84, 7413-7417.

Hu-Lieskovan, S., Heidel, J.D., Bartlett, D.W., Davis, M.E. y Triche, T.J. (2005) Sequence-SpecificKnockdown of EWS-FLI1 by Targeted, Nonviral Delivery of Small Interfering RNA InhibitsTumor Growth in a Murine Model of Metastatic Ewing's Sarcoma. Cancer Res, 65, 8984-8992.

Klippel, A., Escobedo, J.A., Hirano, M. y Williams, L.T. (1994) The interaction of small domains between the subunits of phosphatidylinositol 3-kinase determines enzyme activity. MoI Cell Biol, 14, 2675-2685.

Klippel, A., Escobedo, M.A., Wachowicz, M.S., Apell, G., Brown, T. W., Giedlin, M.A., Kavanaugh, W.M. y Williams,

L.T. (1998) Activation of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic of oncogenic transformation. MoI Cell Biol, 18, 5699-5711.

Landen, C.N., Jr., Chavez-Reyes, A., Bucana, C, Schmandt, R., Deavers, M.T., Lopez-Berestein, G. y Sood, A.K. (2005) Therapeutic EphA2 gene targeting in vivo using neutral liposomal small interfering RNA delivery. Cancer Res, 65, 6910-6918.

Leenders, F., Mopert, K., Schmiedeknecht, A., Santel, A., Czauderna, F., Aleku, M., Penschuck, S., Dames, S., Sternberger, M., Rohl, T., Wellmann, A., Arnold, W., Giese, K., Kaufmann, J. y Klippel, A. (2004) PKN3 is required for malignant prostate cell growth downstream of activated PI 3-kinase. Embo J, 23, 3303-3313.

Liu, L., Zhou, X., Shi, J., Xie, X. y Yuan, Z. (2003) Toll-like receptor-9 induced by physical trauma mediates release of cytokines following exposure to CpG motif in mouse skin. Immunology, 1 10, 341-347.

Liu, T.G., Yin, J.Q., Shang, B.Y., Min, Z., He, H. W., Jiang, J.M., Chen, F., Zhen, Y.S. y Shao, R.G. (2004) Silencing of hdm2 oncogene by siRNA inhibits p53-dependent human breast cancer. Cancer Gene Ther, 11, 748-756.

Morrissey, D.V., Lockridge, J.A., Shaw, L., Blanchard, K., Jensen, K., Breen, W., Hartsough, K., Machemer, L., Radka, S., Jadhav, V., Vaish, N., Zinnen, S., Vargeese, C, Bowman, K., Shaffer, C. S., Jeffs, L.B., Judge, A., MacLachlan, I. y Polisky, B. (2005) Potent and persistent in vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs. Nat Biotechnol, 23, 1002-1007.

Muratovska, A. y Eccles, M.R. (2004) Conjugate for efficient delivery of short interfering RNA (siRNA) into mammalian cells. FEBS Lett, 558, 63-68.

Nogawa, M., Yuasa, T., Kimura, S., Tanaka, M., Kuroda, J., Sato, K., Yokota, A., Segawa, H., Toda, Y., Kageyama, S., Yoshiki, T., Okada, Y. y Maekawa, T. (2005) Intravesical administration of small interfering RNA targeting PLK-1 successfully prevents the growth of bladder cancer. J Clin Invest, 115, 978-985.

Richard, J.P., Melikov, K., Vives, E., Ramos, C, Verbeure, B., Gait, M.J., Chernomordik, L.V. y Lebleu, B. (2003) Cellpenetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol Chem, 278, 585-590.

Schiffelers, R.M., Ansari, A., Xu, J., Zhou, Q., Tang, Q., Storm, G., Molema, G., Lu, P.Y., Scaria, P.V. y Woodle, M.C. (2004) Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res, 32, e 149.

Shadidi, M. y Sioud, M. (2003) Identification of novel carrier peptides for the specific delivery of therapeutics into cancer cells. Faseb J, 17, 256-258.

Song, E., Zhu, P., Lee, S.K., Chowdhury, D., Kussman, S., Dykxhoorn, D.M., Feng, Y., Palliser, D., Weiner, D.B., Shankar, P., Marasco, W.A. y Lieberman, J. (2005) Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors. Nat Biotechnol, 23, 709-717.

Soutschek, J., Akinc, A., Bramlage, B., Charisse, K., Constien, R., Donoghue, M., Elbashir, S., Geick, A., Hadwiger, P., Harborth, J., John, M., Kesavan, V., Lavine, G., Pandey, R.K., Racie, T., Rajeev, K.G., Rohl, I., Toudjarska, I., Wang, G., Wuschko, S., Bumcrot, D., Koteliansky, V., Limmer, S., Manoharan, M. y Vornlocher, H.P. (2004) Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature, 432, 173-178.

Takeshita, F., Minakuchi, Y., Nagahara, S., Honma, K., Sasaki, H., Hirai, K., Teratani, T., Namatame, N., Yamamoto, Y., Hanai, K., Kato, T., Sano, A. y Ochiya, T. (2005) Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo. Proc Natl acad Sci USA, 102, 12177-12182.

Thurston, G. (2003) Role of Angiopoietins and Tie receptor tyrosine kinases in angiogenesis and lymphangiogenesis. Cell Tissue Res, 314, 61-68.

imagen16

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3