ES2550364T3

ES2550364T3 - Plantas que tienen incrementada la tolerancia al estrés térmico

Info

Publication number: ES2550364T3
Application number: ES08828226.4T
Authority: ES
Inventors: Yafan Huang; Jiangxin Wan; Monika Kuzma
Original assignee: Performance Plants Inc
Current assignee: Performance Plants Inc
Priority date: 2007-04-18
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2015-11-06
Anticipated expiration: 2028-04-18
Also published as: CN106119279A; US11130958B2; ZA200907261B; AR067433A1; EP2140012B1; AU2008291827B2; BRPI0810248A2; WO2009027824A2; CN101981192A; US20170145435A1; US20220213498A1; US12173300B2; WO2009027824A3; US20090158466A1; AU2008291827A1; EP2140012A4; CN106119279B; CN101981192B; CA2684417A1; WO2009027824A8

Abstract

Un método para producir una planta tolerante al estrés térmico, que comprende: a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de MYB del subgrupo 14 seleccionado del grupo que consiste en MYB36, MYB37, MYB38, MYB68, MYB84 y MYB87; b) introducir dicho ácido nucleico en un vector; c) transformar una planta, un cultivo de tejido, o una célula vegetal, con dicho vector para obtener una planta, cultivo de tejido o célula vegetal transformados con incremento de la expresión de dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14; d) hacer crecer dicha planta transformada o regenerar una planta a partir de dicho cultivo de tejido o célula vegetal transformados, en donde se produce una planta tolerante al estrés térmico que tiene incrementada la tolerancia al estrés térmico en comparación con una planta de tipo silvestre.

Description

Plantas que tienen incrementada la tolerancia al estrés térmico

Campo de la invención

La invención se encuentra en el campo de la biología molecular vegetal y se refiere a plantas transgénicas que tienen fenotipos nuevos, métodos para producir tales plantas, y polinucleótidos y polipéptidos útiles en tales métodos. 5 Más específicamente, la invención se refiere al uso de polinucleótidos de MYB y plantas transgénicas que expresan estos polinucleótidos y polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Las agresiones medioambientales son responsables de la reducción significativa de la cosecha de semillas de los cultivos agrícolas. Además de los muchos informes publicados con anterioridad, en los últimos años se ha estudiado 10 la relación entre la variabilidad climática y la producción de maíz y soja por todo Estados Unidos durante el periodo de 1982 a 1998 (Lobell y Asner, 2003). Los cambios de temperatura graduales han tenido un impacto medible sobre el rendimiento de los cultivos. En el maíz y la soja se ha estimado que el rendimiento se reduce un 17% por grado de temperatura de crecimiento por encima de la temperatura óptima de la estación. Al predecirse un incremento de temperatura de 1,4 ºC a 5,8 ºC entre los años 1990 y 2010 (IPCC Working Group I, 2001), mejora las plantas de 15 cultivo con respecto a la tolerancia a las temperaturas altas se ha convertido en uno de los principales focos del desarrollo de la biotecnología agrícola.

Tanto las monocotiledóneas como las dicotiledóneas son particularmente sensibles al estrés térmico durante la floración y desarrollo de las semillas y, por lo tanto, el estrés térmico tiene un impacto significativo sobre la cosecha de semillas (Young et al., 2004; Sato et al., 2002; Angadi et al., 2000; Carlson, 1990; Wahid, A., Gelani, S., Ashraf, M. 20 y Foolad, M. R. (2007)). Se ha sugerido que las plantas poseen una capacidad inherente para la termotolerancia basal y adquirida, y que están presentes en diversas especies vegetales unos mecanismos comunes de respuesta al calor (Kapoor et al., 1990; Vierling, 1991; Flahaut et al., 1996; Burke et al., 2000; Hong y Vieling, 2000; Massie et al., 2003; Larkindale et al., 2005). La termotolerancia basal permite que las plantas sobrevivan a la exposición a una temperatura por encima de la temperatura óptima para el crecimiento, mientras que la termotolerancia adquirida se 25 induce mediante un periodo de aclimatación corto con un estrés térmico subletal que permite que la planta sobreviva a un estrés térmico posterior que de otra forma sería letal. Se han realizado una serie de estudios para identificar y caracterizar los genes y vías que están implicados en la termotolerancia vegetal. Por ejemplo, se ha prestado mucha atención a los factores de transcripción del choque térmico (HSF, por su nombre en inglés) y a las proteínas de choque térmico (HSP, por su nombre en inglés) para descubrir la función y el efecto de estos genes en respuesta al 30 estrés térmico, al igual que lo tienen las hormonas de crecimiento vegetales, tales como el ácido abscísico y el etileno.

Los factores de transcripción son proteínas de fijación al ADN que interaccionan con un promotor o secuencias potenciadoras específicos, y que alteran la expresión génica del gen asociado. Cuando la secuencia específica que reconoce el factor de transcripción está asociada a una serie de genes, se pueden regular vías completas de 35 manera coordinada formadas por diferentes genes que están simultáneamente inducidos o reprimidos. Los factores de transcripción pueden alterar de manera coordinada una serie de genes en respuesta a un estímulo, tal como una agresión medioambiental, el estado nutricional o el ataque de patógenos, por ejemplo, o pueden formar parte de una vía de señalización, tal como la vía de señalización de las hormonas, por ejemplo. Los factores de transcripción poseen una estructura modular y se clasifican principalmente en función del dominio de fijación al ADN. 40

La familia de los factores de transcripción MYB está compuesta por al menos 198 genes (Yanhui et al, 2006) y se ha propuesto que tienen funcionen reguladoras en un amplio abanico de métodos, que van desde el crecimiento y el desarrollo hasta las respuestas de defensa. Las proteínas de los MYB vegetales se clasifican en función de la presencia y número de repeticiones MYB imperfectas, que está compuesta cada una de unos 52 aminoácidos. El dominio MYB forma una conformación de hélice-giro-hélice y representa el dominio de fijación al ADN. Tres grupos 45 importantes de proteínas MYB se han clasificado como R1R2R3-MYB, R2R3-MYB y proteínas relacionadas con MYB.

La familia de proteínas R2R3-MYB en Arabidopsis consiste en 125 proteínas y se caracteriza por tener un dominio de fijación al ADN R2R3 en su extremo amino (Kranz et al., 1998 y Stracke et al, 2001). Estos genes están implicados en una serie de procesos biológicos que incluyen la mediación de la acción de las hormonas, el 50 metabolismo secundario (Paz-Ares et al., 1987), el control de la morfogénesis celular (Oppenheimer et al., 1991), el desarrollo del meristemo, de la flor y de las semillas (Kirik et al., 1998, Schmitz et al., 2002) y respuesta a distintos factores ambientales (Kranz et al., 1998; Jin y Martin, 1999; Meissner et al., 1999).

Las secuencias de los MYB se han clasificado adicionalmente en una serie de subgrupos según su secuencia (Kranz et al., 1998, Stracke et al., 2001). El MYB68 cae dentro del subgrupo 14 al igual que el MYB36 y el MYB84, 55 según se identificó en Kranz et al., 1998. No obstante, Stracke et al., 2001, incluyeron también el MYB37, el MYB38 y el MYB87 en el subgrupo 14. Stracke además observa que hay varias casos de conservación funcional de genes que se agrupan juntos en el dendrograma.

La clasificación de la familia R2R3-MYB ha identificado 125 proteínas MYB en Arabidopsis thaliana (At.). Un gen de MYB R2R3 se caracteriza por un dominio MYB que contiene dos repeticiones imperfectas de 53 aa (R2 y R3). Cada repetición contiene tres estructuras de hélice-giro-hélice. Los dominios R2 y R3 se ubican cerca del extremo amino de las proteínas. Las últimas dos hélices de cada repetición con un bucle entre ellas forman una estructura de motivo de fijación al ADN similar al de las proteínas HLH. La tercera hélice se fija directamente al ADN, y la primera y 5 la segunda hélices contribuyen a la conformación del motivo HLH que es importante para el reconocimiento de una diana génica específica (Ogata et al., 1994; William y Grotewold, 1997; Jia et al., 2004). Las proteínas R2R3-MYB se caracterizan adicionalmente en 22 subgrupos de acuerdo con su relación filogenética basada en al menos uno de los motivos aminoacídicos que comparten, además del dominio MYB (Kranz et al., 1998). AtMYB68, AtMYB84 y AtMYB36 se clasificaron en el subgrupo 14 basándose en dos motivos compartidos: S1: SEQ ID 10 n.º 266 y S2: SEQ ID n.º 267, en el extremo carboxilo de las proteínas. La homología en estos motivos era escasa, por ejemplo, el MYB36 de Arabidopsis tiene sólo una identidad del 20%. Posteriormente, AtMYB87, AtMYB37 y AtMYB38 también se incluyeron en el subgrupo 14, basándose en la conservación de la secuencia en el dominio de fijación al ADN de MYB: las repeticiones hélice-giro-hélice de R2 y R3 (Stracke et al., 2001). 15

Los dominios R2R3 podrían ser indicativos de la fijación específica del ADN que exhibe la secuencia de aminoácidos única de la tercera hélice del dominio R3 y los cambios conformacionales menores asociados a la interacción estructural entre las primeras dos hélices. Esto sugiere que los miembros del subgrupo 14 pueden ser ortólogos funcionalmente redundantes. Por ejemplo, el inicio del meristemo lateral en Arabidopsis se estudió con respecto al subgrupo 14 de MYB (Muller et al., 2006). Todos los miembros de los MYB del subgrupo 14 mostraron una alta 20 similitud con el gen Blind (Bl) del tomate, un regulador de los meristemos axilares. Los transcritos de cuatro miembros: AtMYB37, AtMYB38, AtMYB84 y AtMYB87 se detectaron por RT-PCR en los tejidos que incluyen el ápice caulinar, internódulo, hoja, capullo, flor abierta y raíz, mientras que AtMYB36 y AtMYB68 se expresaban en el tejido de la raíz. El análisis fenotípico de las genosupresiones de AtMYB37, AtMYB38 y AtMYB84 indicaron que estos miembros los MYB del subgrupo 14 eran al menos parcialmente redundantes para regular la formación de capullos 25 axilares.

MYB68 es un gen de MYB del tipo R2R3, y un miembro los MYB del subgrupo 14, que se ha identificado en un estudio del atrapamiento génico en transposones (Feng et al., 2004). La expresión de este gen se ha demostrado que es específica de las células del periciclo de la raíz. En el mutante nulo (null) no se detectó ningún ARNm de MYB68; sin embargo, no apareció ningún fenotipo mutante cuando las plantas crecieron en las condiciones 30 estándares. Al evaluar el MYB68 en una serie de condiciones de crecimiento, el único fenotipo discernido fue la reducción de la superficie foliar de la planta cuando las plantas se hicieron crecer en las condiciones de invernadero con calor (30-40 ºC). Este fenotipo fue rescatado con la transformación del genotipo mutante myb68 con un gen de MYB68 de tipo silvestre. El examen del tejido radicular del mutante myb68 crecido en los cultivos de raíces indicó un incremento de la cantidad de biomasa y de lignina. Los autores concluyen que MYB68 está implicado en el 35 desarrollo radicular (Feng et al., 2004).

La activación transcripcional está mediada principalmente por factores de transcripción que interaccionan con elementos potenciadores y promotores. La fijación de los factores de transcripción a tales elementos del ADN constituye una etapa crucial para el inicio de la transcripción. Cada factor de transcripción se fija a su secuencia de fijación específica en un promotor y activa la expresión de la región codificante unida a través de interacciones con 40 coactivadores y/o proteínas que forman parte del complejo de transcripción.

Compendio de la invención

Esta invención se refiere a un método para reforzar la tolerancia de las plantas al estrés térmico por medio del incremento de la expresión de un polipéptido de MYB del subgrupo 14. La mayor tolerancia al estrés térmico incluye un refuerzo del cuajado de semillas durante y después de las condiciones de estrés térmico. El refuerzo del cuajado 45 de semillas da lugar a un incremento del rendimiento. Un polipéptido de MYB del grupo 14 incluye, por ejemplo, un polipéptido de MYB68, uno de MYB36, uno de MYB84, uno de MYB37, uno de MYB38 o uno de MYB87. Preferiblemente, el polipéptido de MYB del subgrupo 14 es un polipéptido de MYB68, uno de MYB36 o uno de MYB84. La expresión del polipéptido de MYB del subgrupo 14 es ectópica o constitutiva. Como alternativa, la expresión del polipéptido de MYB del subgrupo 14 ocurre en su lugar típico de expresión, p. ej., tejido de la raíz. 50

Se genera una planta tolerante al estrés térmico con el suministro de una construcción de ácido nucleico que incrementa la expresión de un polipéptido de Myb del subgrupo 14, la inserción de la construcción nucleica en un vector, la transformación de una planta, cultivo de tejido, o una célula vegetal, con el vector para obtener una planta, cultivo de tejido o una célula vegetal que tenga incrementada la expresión del polipéptido de Myb del subgrupo 14, y el crecimiento de dicha planta o la regeneración de una planta a partir del cultivo de tejidos o de células vegetales. 55 Una construcción de ácido nucleico que incrementa la expresión de un polipéptido de Myb del subgrupo 14 incluye, por ejemplo, un elemento potenciador. Un potenciador es una secuencia que se encuentra en los eucariotas y algunos virus eucariotas que incrementa la transcripción de un gen cuando se localiza, en cualquier orientación, hasta a varias kilobases del gen afectado. Estas secuencias actúan como potenciadores cuando se encuentran en el lado 5' (secuencia arriba) del gen en cuestión. Sin embargo, algunos potenciadores son activos cuando se colocan 60

en el lado 3' (secuencia abajo) del gen. Los elementos potenciadores pueden activar la transcripción de un gen y alterar el patrón de expresión normal del gen endógeno. Los expertos en la técnica conocen los elementos potenciadores. Por ejemplo, el elemento potenciador es un elemento potenciador 35S.

Adicionalmente, una construcción de ácido nucleico que incrementa la expresión de un polipéptido de Myb del subgrupo 14 incluye, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de Myb del subgrupo 14. Los 5 polipéptidos y ácidos nucleicos de MYB de ejemplo incluyen los de las SEQ ID n.os 1 a 265. El ácido nucleico que codifica un polipéptido de Myb del subgrupo 14 está unido operativamente a un promotor. El promotor es un promotor heterólogo o un promotor homólogo. Adicionalmente, el promotor es un promotor constitutivo o un promotor inducible.

Con incrementar la expresión de un polipéptido de MYB del subgrupo 14 se quiere decir que la cantidad producida 10 por la célula transformada con la construcción de ácido nucleico es mayor que la de una célula, p. ej., célula de control, que no está transformada con la construcción de ácido nucleico. Una célula de control incluye, por ejemplo, una célula que expresa de forma endógena un polipéptido de MYB del subgrupo 14, tal como una célula de la raíz de una planta, como alternativa una célula de control es una célula sin transformar del mismo tipo celular que la célula transformada, bien sea una célula de la hoja, una célula del meristemo o una célula de la flor o de la semilla. 15 Un incremento es un incremento de 1 vez, 2 veces, 3 veces o mayor. Un incremento de la expresión también se pretende que incluya la expresión de un polipéptido de MYB del subgrupo 14 en una célula que típicamente no lo produce.

También se incluye en la descripción un método para identificar una planta tolerante al estrés térmico. Las plantas identificadas por estos métodos tienen menos abortos florales y un mayor rendimiento en comparación con una 20 planta de control. Las plantas tolerantes al estrés térmico se identifican al exponer una población de plantas en floración a un tratamiento con estrés térmico y seleccionar una planta de la población de plantas que tiene menos abortos florales. El tratamiento con estrés térmico incluye, por ejemplo, exponer la planta a una temperatura que es suficientemente caliente durante una cantidad de tiempo suficiente, de tal manera que da lugar al daño de las funciones o el desarrollo de la planta. Con reducción de los abortos florales se quiere hacer referencia a que una 25 planta no pierde tantas flores debido a los abortos florales, o a que tiene una cosecha de semillas mayor en comparación con otra planta que se expone a un nivel similar de estrés térmico. Las plantas con menos abortos florales tienen un incremento del 5, 10, 20, 25, 30% o más en la cosecha de semillas en comparación con un planta de control.

La invención incluye además las plantas producidas por los métodos de la invención y las semillas producidas por 30 las plantas que producen una planta que tiene una mayor tolerancia al estrés térmico.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que conoce habitualmente el experto en la técnica al cual pertenece la invención. Aunque se pueden utilizar materiales y métodos parecidos o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o en las comprobaciones de la presente invención, a continuación se describen los materiales y métodos 35 idóneos. En caso de conflicto, quedará controlado por la presente especificación, que incluye las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Descripción detallada 40

La invención se basa en el sorprendente descubrimiento de plantas que toleran mejor el estrés térmico, lo que da lugar a un incremento de la cosecha de semillas con respecto a un control de tipo silvestre. Más específicamente, la invención se basa en el descubrimiento de que el incremento de la expresión de un polipéptido de MYB del subgrupo 14 (p. ej., MYB68) da lugar a una planta más resistente al estrés térmico.

La expresión de un polipéptido de MYB del subgrupo 14 se puede llevar a cabo, por ejemplo, incrementando la 45 expresión de un polipéptido endógeno de MYB del subgrupo 14 (p. ej., inserción de etiqueta de activación) o mediante la expresión de una construcción exógena de gen que codifica un polipéptido de MYB del subgrupo 14. El gen que codifica el polipéptido de MYB del subgrupo 14 puede ser endógeno o exógeno a las especies transformadas. Tal y como se muestra en los ejemplos, las plantas que son más resistentes al estrés térmico se produjeron no sólo por transformación de una planta con su polipéptido nativo del MYB del subgrupo 14, sino 50 también con un polipéptido de MYB del subgrupo 14 de otra especie vegetal.

De acuerdo con esto, la descripción da a conocer métodos para reforzar (p. ej., incrementar) la tolerancia al estrés térmico de las plantas mediante el incremento de la expresión de un polipéptido de MYB del subgrupo 14. También se incluye en la descripción un método para identificar una planta tolerante al estrés térmico. Las plantas identificadas mediante estos métodos tienen menos abortos florales y más rendimiento que una planta de control. 55 Las plantas tolerantes al estrés térmico se identifican al exponer la población de las plantas en floración a un tratamiento de estrés térmico y seleccionar una planta de la población de plantas que tenga menos abortos florales. La invención también incluye las plantas transgénicas producidas por los métodos de la invención y las semillas

producidas por las plantas transgénicas que producen una planta tolerante al estrés térmico.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que conocen todos los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar materiales y métodos parecidos o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o en las comprobaciones de la presente invención, los materiales y métodos idóneos se describen a 5 continuación. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente memoria se incorporan mediante referencia en su totalidad. En caso de conflicto, hará de control la presente especificación, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Por comodidad, antes de describir más la presente invención, se definen en la presente memoria algunos términos 10 empleados en la especificación, en los ejemplos y en las reivindicaciones anejas. Estas definiciones se deben leer a modo de recordatorio de la descripción y tal y como entiende el experto en la técnica.

La terminología «expresión constitutiva» significa la expresión de un gen en cualquier célula en una cantidad constante de una manera no regulada.

Los términos «cMYB» y «MYB» se refieren a un clon de ADNc de MYB y se utilizan indistintamente. Cuando se ha 15 utilizado o mencionado una secuencia genómica, se identifica y diferencia con la terminología «gMYB» o «MYB genómico», con lo que se hace referencia a una secuencia genómica de MYB.

La terminología «expresión ectópica» significa la expresión de un gen en un lugar anormal en un organismo respecto a la expresión del gen endógeno. La expresión ectópica puede incluir genes expresados constitutivamente según los patrones de expresión nativa de un gen dado. 20

La terminología «casete de expresión» significa una construcción de vector en donde se transcribe un gen. Adicionalmente, el ARNm expresado se puede traducir en un polipéptido.

Los términos «expresión» o «sobreexpresión» se utilizan indistintamente y significan la expresión de un gen de tal manera que se expresa el transgén. El nivel total de expresión en una célula puede ser mayor que en una célula de tipo silvestre. 25

«Aborto floral» significa que una flor no llega a desarrollarse y producir un fruto o semilla. Además de la senescencia prematura de una flor, el aborto floral puede hacer referencia a la pérdida de la producción del polen, a la alteración de la polinización, o de la fertilización y el posterior desarrollo de la semilla. La alteración del crecimiento y del desarrollo del tejido del meristemo, de un meristemo de la flor en particular, está también incluido en del significado de aborto floral. 30

El término «termotolerancia» se define como un fenotipo en donde una primera planta, o línea vegetal, tiene más capacidad para soportar una temperatura elevada y producir una cosecha de semillas que es mayor que la de una segunda planta o línea vegetal, en donde la segunda línea vegetal es una planta de control, tal como una línea vegetal de control de tipo silvestre.

Una «secuencia promotora» o «promotor» hace referencia a una secuencia de ácido nucleico capaz de inducir la 35 transcripción de una secuencia génica operativamente unida en una célula vegetal.

La terminología «cuajado de semillas» es la formación de semillas como resultado de la polinización de las flores por la fertilización de las células del óvulo y el desarrollo del cigoto. Las reducciones del cuajado de semillas que se pueden producir debido a la interrupción en cualquiera de los procesos anteriores producirán una reducción neta del número de semillas producidas. 40

La terminología «sustancialmente similar» se refiere a ácidos nucleicos en donde un cambio en uno o más nucleótidos no altera las propiedades funcionales del ácido nucleico ni del polipéptido codificado. Debido a la degeneración del código genético, un cambio de par de bases puede dar lugar a que no cambie la secuencia de aminoácidos codificados. Por ejemplo, los codones ACT, ACC, ACA y ACG codifican todos ellos el aminoácido treonina. Como alternativa, uno o más cambios de pares de bases pueden alterar el aminoácido codificado, aunque 45 si el aminoácido sustituido tiene propiedades químicas parecidas, es probable que no se vea afectada la funcionalidad de la proteína codificada. Por ejemplo, los codones de treonina ACT y ACC cuando se cambian a AGT o AGC, respectivamente, codifican la serina, un aminoácido parecido desde los puntos de vista biológico y químico. Adicionalmente, determinados aminoácidos de un polipéptido no son esenciales y se pueden hacer alteraciones en estas localizaciones que no tengan efecto sobre la funcionalidad del polipéptido. Sustancialmente similar también 50 hace referencia a las secuencias que tienen cambios en una o más bases nucleotídicas, en donde los cambios no afectan a la capacidad de la secuencia para alterar la expresión génica mediante diferentes metodologías de silenciamiento génico, tales como antisentido, RNAi o cosupresión. La terminología «sustancialmente similar» se refiere a los polipéptidos en los que un cambio de uno o más aminoácidos no altera las propiedades funcionales del polipéptido, tal y como se explica más arriba. 55

La terminología «rendimiento» se refiere a un número de semillas, peso de las semillas, tamaño de las semillas, biomasa vegetal total, incremento de la biomasa de un órgano de la planta, tales como los troncos o las hojas o las raíces, producción de frutos y producción de flores.

El término «protección del rendimiento» se define como la diferencia positiva, expresada como un valor en %, entre el rendimiento del transgénico o del mutante y el control, en donde el rendimiento se expresa como un % de lo 5 óptimo, tras la imposición de una agresión. El cálculo se hace por comparación del rendimiento óptimo con el obtenido después del tratamiento con la agresión (rendimiento en estrés/rendimiento óptimo × 100).

La familia de genes MYB se clasifica en función de la homología de secuencia y la presencia de dominios y motivos definidos, tal como un dominio R2R3. La clasificación en todos los casos no es absoluta y varía según los criterios seleccionados para el análisis (Krantz et al., 1998, Stracke et al., 2001). 10

En la presente memoria, definimos que los MYB del subgrupo 14 incluyen al menos los siguientes miembros, MYB68, MYB36, MYB84, MYB37, MYB38 y MYB87. Las secuencias de MYB68, MYB36, MYB84, MYB37, MYB38 y MYB87 de Arabidopsis se utilizan para identificar homólogos en otras especies de acuerdo con los métodos de la presente memoria, de los que se incluyen ejemplos en la tabla 1.

La terminología «secuencia de MYB» se refiere a una secuencia polinucleotídica o una secuencia polipeptídica 15 según sea adecuado en el contexto.

Secuencias

Las siguientes secuencias de la familia de MYB del subgrupo 14 y los correspondientes identificadores de secuencia se emplean a lo largo de la especificación, ejemplos y reivindicaciones anexas:

Tabla 1

SEQ ID n.º: ESPECIE Número de acceso de referencia Identificación del MYB

Determinación de la homología entre dos o más secuencias

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias aminoacídicas o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con el propósito de hacer una comparación óptima (p. ej., se pueden introducir huecos en cualquiera de las secuencias que se comparan para el alineamiento óptimo entre las secuencias). A continuación se 5 comparan los restos de aminoácidos o de nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoacídico o nucleótido que la correspondiente posición de la segunda secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esa posición (es decir, tal y como se usa en la presente memoria, «homología» de aminoácidos o de ácido nucleico es equivalente a «identidad» de aminoácidos o de ácido nucleico). 10

La homología de secuencia de ácido nucleico se puede determinar como el grado de identidad entre dos secuencias. La homología se puede determinar con programas informáticos conocidos en la técnica, tal como el programa informático GAP que viene con el paquete de programas GCG. Véase Needleman y Wunsh 1970 J Mol Biol 48: 443-453. Se usó el programa informático GAP de GCG con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos: penalización por creación de huecos de 5,0 y penalización por extensión de huecos de 0,3, la 15 región codificante de las secuencias de ácido nucleico análogas citadas anteriormente muestra un grado de identidad preferiblemente de al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% con la parte (codificante) de la secuencia codificante de la secuencia de ADN mostrada en la tabla 1.

La terminología «identidad de secuencia» se refiere al grado al cual dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas son idénticas si las miramos resto a resto a lo largo de una región concreta de la comparación. El término 20 «porcentaje de identidad de secuencia» se calcula con la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de la región de comparación, la determinación del número de posiciones en las que aparece la misma base de acido nucleico (p. ej., A, T, C, G, U o I en el caso de los ácidos nucleicos) en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones de la región de comparación (a saber, el tamaño de la ventana), y la multiplicación del resultado por 25 100 para producir el porcentaje de la identidad de secuencia. La terminología «identidad sustancial», tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a una característica de una secuencia polinucleotídica, en donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos una identidad de secuencia del 80%, preferiblemente una identidad de al menos el 85% y a menudo una identidad de secuencia del 90 al 95%, más usualmente una identidad de secuencia de al menos el 99%, en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una 30 región de comparación. El término «porcentaje de restos positivos» se calcula con la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de esa región de comparación, la determinación del número de posiciones en la que aparecen sustituciones de aminoácidos idénticos y conservativos, tal y como se define más arriba, en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, la división del número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones de la región de comparación (a saber, el tamaño de la 35 ventana), y la multiplicación del resultado por 100 para producir el porcentaje de restos positivos.

Células hospedadoras y vectores de expresión recombinantes

Otro aspecto de la descripción está relacionado con los vectores, por ejemplo, vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína de MYB del subgrupo 14, gen, análogos o homólogos de los mismos. La secuencia que codifica un polipéptido de MYB del subgrupo 14 puede ser una secuencia genómica o una secuencia 40 de ADNc. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término vector de expresión incluye vectores que están diseñados para proporcionar la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. El ácido nucleico transcrito se puede traducir en un producto polipeptídico o proteico. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «vector» se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un «plásmido», que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar otros 45 segmentos de ADN. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la que han sido introducidos (p. ej., los vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano). Otros vectores se integran en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y, gracias a esto, se replican junto al genoma del hospedador. Además, determinados vectores son 50 capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están unidos operativamente. Tales vectores se denominan en la presente memoria «vectores de expresión». En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente especificación, «plásmido» y «vector» se pueden utilizar indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector que se usa con más frecuencia. Sin embargo, la descripción está pensada para que incluya otras formas de vectores de expresión, tales como vectores 55

víricos o vectores de transformación de plantas, binarios o de otro tipo, que sirven para funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o varias secuencias reguladoras, seleccionadas en función de las células hospedadoras a utilizar para la expresión, que están operativamente unidas a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de 5 un vector de expresión recombinante, «operativamente unido» está previsto que se refiera a que la secuencia nucleotídica de interés está unida a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector está introducido en la célula hospedadora).

El término «secuencia reguladora» pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de 10 expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, «Gene Expression Technology»: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células hospedadoras (p. ej., secuencias reguladoras específicas del tejido) o promotores inducibles (p. 15 ej., inducidos en respuesta a factores abióticos, tales como condiciones medioambientales, calor, sequía, estado de los nutrientes o estado fisiológico o biótico de la célula, tal como en respuesta a un patógeno). Los ejemplos de promotores idóneos incluyen, por ejemplo, promotores constitutivos, promotores inducibles por ABA, promotores específicos del tejido y promotores inducibles por abióticos o bióticos. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a 20 transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, así como el momento y la localización de la expresión, etc. Los vectores de expresión se pueden introducir en las células hospedadoras para así producir proteínas o péptidos, que incluyen proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos tal y como se describe en la presente memoria (p. ej., proteínas MYB del subgrupo 14, tales como proteínas MYB68, formas mutantes de las proteínas MYB68, proteínas de fusión, etc.). 25

Los vectores de expresión recombinantes se pueden diseñar para la expresión de un gen de los MYB del subgrupo 14 o una proteína MYB del subgrupo 14 en las células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, un gen de los MYB del subgrupo 14 o una proteína MYB del subgrupo 14 se pueden expresar en células bacterianas tales como Escherichia coli, en células de insectos (con vectores de expresión baculovíricos), en las células de levadura, en células vegetales o en células de mamíferos. Las células hospedadoras idóneas se explican con más detalle en 30 Goeddel, «Gene Expression Technology»: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, gracias a las secuencias reguladoras del promotor de T7 y la polimerasa de T7.

Un ácido nucleico se expresa en las células vegetales mediante un vector de expresión de plantas. Los ejemplos de sistemas de vectores de expresión de plantas incluyen el plásmido inductor de tumores (Ti) o una porción del mismo 35 hallado en Agrobacterium, ADN del virus del mosaico de la coliflor (CAMV) y vectores tales como pBI121, un vector de la serie pCAMBA, o uno que prefiera elegir el experto en la técnica.

Para la expresión en las plantas, el casete de expresión recombinante contendrá, además de un polinucleótido de los MYB del subgrupo 14, una región promotora funcional en un célula vegetal, un sitio de iniciación de la transcripción (si la secuencia codificante a transcribir carece de una) y una secuencia de terminación de la 40 transcripción/poliadenilación. La región de terminación/poliadenilación se puede obtener del mismo gen que la secuencia promotora o se puede obtener de diferentes genes. Se incluyen típicamente sitios únicos de las enzimas de restricción en los extremos 5' y 3' del casete para garantizar la inserción fácil en un vector ya existente.

Los ejemplos de promotores idóneos que se pueden expresar en las plantas incluyen promotores de virus vegetales tales como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell et al., Nature, 313: 810-812 (1985)), 45 promotores de genes tales como la actina del arroz (McElroy et al., Plant Cell, 163-171 (1990), ubicuitina (Christensen et al., Plant. Mol. Biol. 12: 619-632 (1992); y Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689 (1992)), pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81: 581-588 (1991)), MAS (Velten et al., EMBO J., 3: 2723-2730 (1984)), histona H3 del maíz (Lepetit et al. Mol. Gen. Genet. 231: 276-285 (1992); y Atanassvoa et al., Plant Journal, 2(3): 291-300 (1992)), el promotor 5' o 3' procedente del ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, el promotor de Smas, el 50 promotor de la alcohol cinamílico deshidrogenasa (patente de los EE. UU. n.º 5.683.439), el promotor de Nos, el promotor de la rubisco, el promotor de GRP1-8, el promotor de ALS (solicitud de patente internacional WO 96/30530), un promotor sintético, tal como los promotores Rsyn7, SCP y UCP, ribulosa-1,3-difosfato carboxilasa, promotores específicos del fruto, promotores de choque térmico, promotores específicos de semilla y otras regiones de iniciación de la transcripción de diferentes genes vegetales, por ejemplo, entre ellos, diferentes regiones de 55 iniciación de la opina, tales como, por ejemplo, octopina, manopina y nopalina. Los promotores útiles también incluyen los promotores inducibles por el calor, tales como los promotores HSP18.2 o HSP81.1 (Takahashi et al., 1992, Plant J., 2, 751-761; Yoshida et al., 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 466-472; Ueda et al., 1996, Mol. Gen. Genet. 250, 533-539). Los promotores crípticos son también útiles para construcciones quiméricas de utilidad en la invención. Los elementos reguladores de los genes crípticos son inactivos en su localización nativa en el genoma, 60 pero son completamente funcionales cuando se colocan adyacentes a los genes en las plantas transgénicas.

Además de las construcciones quiméricas de promotor y gen, se contempla el uso de un promotor nativo de un MYB del subgrupo 14. Las características de expresión de un promotor nativo se pueden modificar mediante la inclusión de elementos reguladores de tal forma que los niveles de expresión sean elevados y/o se expresen ectópicamente y/o constitutivamente. Por ejemplo, se puede incluir una secuencia potenciadora por cuadruplicado de 35S (Wiegel et al., 2000) en una construcción para reforzar la expresión. Como alternativa, se puede producir una población de 5 plantas mediante la transformación con una construcción que tiene una secuencia potenciadora cuadruplicada de 35S, tal como un vector pSKI15 según Wiegel et al., 2000. Se puede escrutar la población transformada en busca de plantas que tengan incrementada la expresión de una secuencia de MYB del subgrupo 14, o se puede escrutar en busca de plantas que tengan incrementada la termotolerancia y menos abortos florales, o una combinación de tales escrutinios, para identificar una planta de interés. 10

Los elementos reguladores adicionales que se pueden conectar a una secuencia de ácido nucleico que codifica el MYB del subgrupo 14 para su expresión en las células vegetales incluyen terminadores, secuencias de poliadenilación y secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos señal que permiten la localización dentro de una célula vegetal o la secreción de la proteína desde la célula. Se conocen tales elementos reguladores y métodos para añadir o intercambiar estos elementos con los elementos reguladores de un gen de MYB del subgrupo 14 e 15 incluyen, pero sin limitarse a ellos, regiones de terminación y/o poliadenilación en 3' tales como las del gen de la nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., Nucl. Acids Res., 12: 369-385 (1983)); el gen del inhibidor II de la proteinasa de la patata (PINII) (Keil et al., Nucl. Acids Res., 14: 5641-5650 (1986) y que se incorpora a la presente memoria mediante referencia); y An et al., Plant Cell, 1: 115-122 (1989)); y el gen 19S del CaMV (Mogen et al., Plant Cell, 2: 1261-1272 (1990)). 20

Son útiles en la invención las secuencias señal vegetales, que incluyen, pero sin limitarse a ellas, las secuencias de ADN/ARN que codifican el péptido señal que dirige las proteínas a la matriz extracelular de la célula vegetal (Dratewka-Kos et al., J. Biol. Chem., 264: 4896-4900 (1989)) y el gen de extensión de Nicotiana plumbaginifolia (DeLoose et al., Gene, 99: 95-100 (1991)) o péptidos señal que dirigen las proteínas a la vacuola, como el gen de la esporamina de la batata (Matsuka et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA), 88: 834 (1991)) y el gen de la lectina de la 25 cebada (Wilkins et al., Plant. Cell, 2: 301-313 (1990)) o señales que provocan la secreción de proteínas tales como PRIb (Lind et al., Plant. Mol. Biol., 18: 47-53 (1992)) o las que dirigen las proteínas a los plástidos, tales como la enoíl-ACP reductasa de la semilla de la colza (Verwaert et al., Plant. Mol. Biol., 26: 189-202 (1994)).

El vector de expresión recombinante puede ser capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferiblemente en un tipo de célula concreto (p. ej., los elementos reguladores específicos de tejido se utilizan para expresar el ácido 30 nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido se conocen en la técnica. Son especialmente útiles, junto con los ácidos nucleicos, los sistemas de expresión que son funcionales en las plantas. Estos incluyen sistemas que están bajo el control de un promotor específico de tejido, así como los que implican promotores que son funcionales en todos los tejidos vegetales.

También se conocen bien los promotores específicos de órgano. Por ejemplo, el gen de la chalcona sintasa A (van 35 der Meer et al., 1990, Plant Molecular Biology 15(1): 95-109) o el promotor de la dihidroflavonol-4-reductasa (dfr) (Elomaa et al., The Plant Journal, 16(1) 93-99) dirigen la expresión en tejidos florales concretos. También está disponible el promotor de la patatina de clase I que está transcripcionalmente activado sólo en el tubérculo de la patata y se puede utilizar para dirigir la expresión en el tubérculo (Bevan, M, 1986, Nucleic Acids Research 14: 4625-4636). Otro promotor específico de la patata es el promotor de la sintasa del almidón fijado al gránulo (GBSS, por su 40 nombre en inglés) (Visser, R. G. R. et al., 1991, Plant Molecular Biology 17: 691-699).

Mediante los métodos conocidos se pueden aislar otros promotores específicos de órgano apropiados para un envío al órgano deseado. Estas secuencias de control están asociadas por lo general a genes que solo se expresan en el órgano deseado. En una planta superior típica, cada órgano tiene miles de ARNm que están ausentes de otros sistemas de órganos (revisado en Goldberg, P., 1986, Trans. R. Soc. London B314:343). 45

El sistema o casete de expresión resultante se liga, o si no se construye para que esté incluido, en un vector recombinante que es apropiado para la transformación de la planta. El vector puede también contener un gen marcador de selección mediante el cual se pueden identificar las células vegetales transformadas en el cultivo. El gen marcador puede codificar una resistencia a antibiótico. Estos marcadores incluyen la resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina y gentamicina. Como alternativa, el gen marcador puede codificar un gen de 50 tolerancia a herbicida que proporciona tolerancia a los herbicidas de tipo glufosinato o glifosato. Después de transformar las células vegetales, las células que tienen el vector se identificarán por su capacidad para crecer en un medio que contiene el antibiótico o herbicida concreto. Las secuencias de replicación, de origen bacteriano o vírico, también están incluidas por lo general para permitir que el vector se pueda clonar en un hospedador bacteriano o de fago, preferiblemente se incluye un origen de replicación procariótico de amplio margen de hospedadores. También 55 se debe incluir un marcador de selección de bacterias para permitir la selección de las células bacterianas que llevan la construcción deseada. Los marcadores de selección procariotas idóneos también incluyen la resistencia a antibióticos tales como la kanamicina o la tetraciclina.

Otras secuencias de ADN que codifican otras funciones también pueden estar presentes en el vector, tal y como se conoce en la técnica. Por ejemplo, en el caso de las transformaciones de Agrobacterium, las secuencias de ADN-T 60

también se incluirán para la posterior transferencia a los cromosomas vegetales.

Otro aspecto de la descripción se refiere a células hospedadoras en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. La terminología «célula hospedadora» y «célula hospedadora recombinante» se utilizan indistintamente en la presente memoria. Se debe saber que tales términos se refieren no sólo a la célula particular del sujeto, sino también a la progenie o a la posible progenie de tal célula. Ya que se 5 pueden producir determinadas modificaciones en las generaciones posteriores debido a su mutación o las influencias del entorno, tal progenie podría no ser, de hecho, idéntica a la célula madre, pero siguen estando incluidas dentro del alcance de la terminología según se utiliza en la presente memoria.

El ADN del vector se puede introducir en las células procariotas o eucariotas mediante la transformación convencional o las técnicas de transfección. Tal y como se utiliza en la presente memoria, con la terminología 10 «transformación» y «transfección» se pretende hacer referencia a una serie de métodos reconocidos en la técnica para introducir el ácido nucleico extraño (p. ej., ADN) en una célula hospedadora.

Una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en un cultivo, se puede utilizar para producir (a saber, expresar) un polipéptido codificado en un marco abierto de lectura de un polinucleótido. Por consiguiente, la descripción además proporciona métodos para producir un polipéptido con el uso de las células 15 hospedadoras de la invención. El método comprende cultivar la célula hospedadora en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido en un medio adecuado, de tal manera que se produce el polipéptido. El método puede además comprender el aislamiento del polipéptido desde el medio o desde la célula hospedadora.

Una serie de tipos de células puede actuar como célula hospedadora idónea de un polipéptido codificado por un 20 marco abierto de lectura en un polinucleótido. Las células hospedadoras vegetales incluyen, por ejemplo, células vegetales que podrían funcionar como hospedadores idóneos para la expresión de un polinucleótido, que incluyen células epidérmicas, mesófilo y otros tejidos fundamentales, y tejidos vasculares de hojas, tallos, órganos florales y raíces de una amplia gama de especies vegetales, por ejemplo, Arabidopsis, Brassica, Oryza, Zea, Sorghum, Gossypium, Triticum, Glycine, Pissum, Phaseolus, Lycopersicon, Trifolium, Cannabis, Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, 25 Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Lolium, Avena, Hordeum, Secale, Picea, Caco y Populus.

Mutaciones conservativas 30

Además de las variantes alélicas que se producen de forma natural en la secuencia de los MYB del subgrupo 14 o de MYB68 que pueden existir en la población, el experto en la técnica apreciará además que se pueden introducir cambios mediante mutación de la secuencia nucleotídica de las SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 127, 35 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265, con lo que se producen cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el MYB del subgrupo 14 o MYB68, sin alterar la capacidad funcional de la proteína MYB del subgrupo 14 o una 40 proteína MYB68. Por ejemplo, las sustituciones nucleotídicas que conducen a las sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos «no esenciales» se pueden hacer en la secuencia de las SEQ ID n.os 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 89, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 131, 133, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 45 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 212, 215, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 y 264. Un resto de aminoácido «no esencial» es un resto que se puede alterar de la secuencia de tipo silvestre de un MYB del subgrupo 14 o una MYB68 sin alterar la actividad biológica, mientras que para la actividad biológica se necesita un resto de aminoácido «esencial». Por ejemplo, los restos aminoacídicos que se conservan entre las proteínas MYB del subgrupo 14 o MYB68 de la 50 presente invención se predicen que son malos candidatos para la alteración. Los alineamientos y la identificación de las regiones conservadas se describen en la presente memoria y proporcionan una guía adicional con respecto a la identificación de los aminoácidos esenciales y de los aminoácidos conservados.

Otro aspecto de la descripción hace referencia a las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína MYB del subgrupo 14 o una proteína MYB68 que contiene cambios en los restos aminoacídicos que no son esenciales 55 para la actividad. Tales proteínas MYB del subgrupo 14 o MYB68 difieren de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID n.os 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 89, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 131, 133, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 212, 215, 219, 221, 60

223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 y 264, y todavía conservan la actividad biológica. La molécula de ácido nucleico aislada puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia aminoacídica homóloga al menos aproximadamente al 75% a la secuencia aminoacídica de las SEQ ID n.os 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 5 89, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 131, 133, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 212, 215, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 y 264. Preferiblemente, la proteína codificada por el ácido nucleico es homóloga al menos aproximadamente al 80% a las SEQ ID n.os 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 10 26, 28, 30, 32, 34, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 89, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 131, 133, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 212, 215, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 y 264, más preferiblemente al menos aproximadamente al 90%, 15 95%, 98% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente al 99% homóloga a las SEQ ID n.os 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 89, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 131, 133, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 212, 215, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 20 235, 237, 239, 241, 243, 245, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 y 264.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína MYB del subgrupo 14 o una proteína MYB68 homóloga a la proteína de las SEQ ID n.os 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 89, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 126, 128, 131, 133, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 157, 159, 25 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 212, 215, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262 y 264 se puede crear mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia nucleotídica de las SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 30 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265, de tal manera que se introducen una o varias sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína 35 codificada.

Las mutaciones se pueden introducir en la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 40 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265 mediante técnicas estándares, tal como mutagénesis dirigida específica de sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones aminoacídicas conservativas en uno o varios restos de aminoácidos que se ha predicho que no son esenciales. Una «sustitución aminoacídica 45 conservativa» es una en la que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral parecida. Se han definido en la técnica las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales parecidas. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (p. ej., alanina, 50 valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en β (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así pues, un resto de aminoácido que se ha predicho que no es esencial en MYB68 se reemplaza por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, en otra realización se pueden introducir mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de un MYB del subgrupo 14 o de MYB68, 55 tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden escrutar por su actividad biológica para identificar los mutantes que conservan la actividad y los fenotipos deseados. Después de la mutagénesis de las SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 60 145, 147, 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265, la proteína codificada se puede expresar mediante cualquier tecnología recombinante conocida en la técnica y se puede determinar la

actividad de la proteína.

Células vegetales transformadas y plantas transgénicas

La invención incluye un protoplasto, células vegetales, tejido vegetal y planta (p. ej., monocotiledóneas o dicotiledóneas) transformadas con el ácido nucleico de un MYB del subgrupo 14, un vector que contiene el ácido nucleico de un MYB del subgrupo 14 o un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de un MYB del 5 subgrupo 14. Tal y como se emplea en la presente memoria, «planta» pretende incluir no sólo una planta entera, sino también una porción de la misma (a saber, células y tejidos entre ellos, por ejemplo, hojas, tallos, brotes, raíces, flores, frutos y semillas).

La planta puede ser cualquier tipo de planta que incluye, por ejemplo, especies de los géneros Arabidopsis, Brassica, Oryza, Zea, Sorghum, Gossypium, Triticum, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lycopersicon, Trifolium, Cannabis, 10 Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapsis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Lolium, Avena, Hordeum, Secale, Picea, Caco y Populus. 15

La invención también incluye células, tejidos, entre ellos, por ejemplo, hojas, tallos, brotes, raíces, flores, frutos y semillas, y la progenie derivada de la planta transformada.

Se conocen numerosos métodos para introducir genes foráneos en plantas y se pueden utilizar para insertar un gen en una planta hospedadora, entre ellos los protocolos de transformación vegetal biológica y física (véase, por ejemplo, Miki et al., (1993) «Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants» en Methods in Plant Molecular 20 Biology and Biotechnology, Glick y Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-68; y Andrew Bent en, Clough SJ y Bent AF, (1998) «Floral dipping: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana»). Los métodos elegidos varían con la planta hospedadora e incluyen métodos de transfección química, tales como fosfato de calcio, transformación con polietilenglicol (PEG), transferencia génica mediada por microorganismos, tales como Agrobacterium (Horsch et al., Science, 227: 1229-31 (1985)), electroporación, 25 transformación con protoplastos, microinyección, inmersión de las flores y bombardeo biolístico.

Transformación mediada por Agrobacterium

El método utilizado más ampliamente para introducir un vector de expresión en las plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium tumefaciens y A. rhizogenes, que son bacterias patógenas de las plantas que transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, 30 respectivamente, llevan genes responsables de la transformación genética de las plantas (véase, por ejemplo, Kado, Crit. Rev. Plant. Sci. 10: 1-32 (1991)). Las descripciones de los sistemas del vector de Agrobacterium y los métodos para la transferencia génica mediada por Agrobacterium se dan a conocer en Gruber et al., véase más arriba; y en Moloney et al., Plant Cell Reports, 8: 238-242 (1989).

Las plantas transgénicas de Arabidopsis se pueden producir con facilidad mediante el método de inmersión de las 35 plantas en floración en un cultivo de Agrobacterium, basado en el método de Andrew Bent en, Clough SJ y Bent AF, 1998, «Floral dipping: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana». Las plantas de tipo silvestre se hacen crecer hasta que la planta tiene tanto flores en desarrollo como flores abiertas. Las plantas se invierten durante 1 minuto en una solución del cultivo de Agrobacterium que lleva la construcción génica adecuada. A continuación, las plantas se dejan en posición horizontal en una bandeja y se cubren durante dos días 40 para mantener la humedad y a continuación se enderezan y se protegen con una bolsa para que continúe el crecimiento y el desarrollo de las semillas. Las semillas maduras se recogen en masa.

Transferencia génica directa

Un método de transformación vegetal aplicable de forma general es la transformación mediada por microproyectiles, en donde el ADN es transportado en la superficie de microproyectiles que miden aproximadamente de 1 a 4 µm. El 45 vector de expresión se introduce en tejidos vegetales con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/s, que es suficiente para atravesar las paredes y las membranas de las células vegetales (Sanford et al., Part. Sci. Tecnol. 5: 27-37 (1987); Sanford, Trends Biotech, 6: 299-302 (1988); Sanford, Physiol. Plant., 79: 206-209 (1990); Klein et al., Biotechnology, 10: 286-291 (1992)).

La transformación de plantas también se puede conseguir mediante el método de inyector de haces en aerosol (ABI, 50 por su nombre en inglés) descrito en las patentes de los EE. UU. n.os 5.240.842 y 6.809.232. La tecnología de haces en aerosol se utiliza para acelerar las partículas húmedas o secas a una velocidad que permite que la partículas penetren en las células vivas. La tecnología de haces en aerosol emplea la expansión en chorro de un gas inerte a medida que pasa de una región de presión gaseosa más alta a una región de presión gaseosa más baja a través de un orificio pequeño. El gas en expansión acelera las gotitas de aerosol, que contienen moléculas de ácido nucleico 55 que se introducirán en una célula o tejido. Las partículas aceleradas se colocan para que choquen contra una diana preferida, por ejemplo, una célula vegetal. Las partículas se construyen como gotitas de un tamaño suficientemente

pequeño para que la célula sobreviva a la penetración. La célula o tejido transformado se hace crecer para producir una planta mediante las técnicas estándares conocidas por los expertos en la técnica aplicable.

Regeneración de los transformantes

El desarrollo o la regeneración de las plantas desde protoplastos vegetales aislados o bien desde diferentes explantes se conoce bien en la técnica (Weissbach y Weissbach, 1988). Este método de regeneración y crecimiento 5 incluye típicamente las etapas de selección de las células transformadas, cultivo de las células individualizadas a través de etapas usuales del desarrollo embrionario a través de una etapa de plántula enraizada. Los embriones transgénicos y las semillas se regeneran de forma parecida. Después, los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan en un medio de crecimiento vegetal adecuado, tal como suelo.

El desarrollo o la regeneración de las plantas que contienen el gen exógeno foráneo que codifica un polipéptido de 10 interés introducido mediante Agrobacterium desde explantes de hojas se puede conseguir mediante los métodos bien conocidos en la técnica, tales como los descritos (Horsch et al., 1985). En este método, los transformantes se cultivan en presencia de un agente de selección en un medio que induce la regeneración de los brotes de la cepa vegetal que se transforma tal y como está descrito (Fraley et al., 1983). En particular, la patente de los EE. UU. n.º 5.349.124 detalla la creación de células de lechuga genéticamente transformadas, y las plantas que resultan de ellas, 15 que expresan proteínas cristalinas híbridas que confieren actividad insecticida a tales plantas contra las larvas de los lepidópteros.

Este método produce típicamente brotes en dos a cuatro meses y, a continuación, dichos brotes se transfieren a un medio inductor de raíces adecuado que contiene el agente selectivo y un antibiótico para impedir el crecimiento bacteriano. Los brotes que se enraizaron en presencia del agente selectivo para formar plántulas se trasplantan a 20 continuación al suelo o a otro medio para permitir la producción de las raíces. Estos métodos varían según la cepa vegetal particular empleada, y tales variaciones se conocen bien en la técnica.

Las plantas regeneradas se pueden autopolinizar para proporcionar plantas transgénicas homocigotas, o el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza para inseminar o hacer crecer plantas de líneas preferiblemente consanguíneas que son importantes desde el punto de vista agronómico. Y al contrario, el polen de las plantas de 25 esas líneas importantes se utiliza para polinizar las plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva con los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Una planta transgénica preferida es una que segrega de manera independiente y que puede transmitir el gen de MYB68 y su actividad a su progenie. Una planta transgénica más preferida es homocigota para el gen y transmite 30 dicho gen a toda la descendencia en el apareamiento sexual. La semilla de una planta transgénica se puede hacer crecer en el campo o en invernadero, y las plantas transgénicas sexualmente maduras resultantes se autopolinizan para generar plantas consanguíneas verdaderas. La progenie de estas plantas se convierte en líneas consanguíneas verdaderas que se evalúan por el incremento de la expresión del transgén de MYB68.

Método para producir plantas transgénicas 35

Se incluyen en la invención los métodos para producir una planta transgénica. El método incluye la introducción en una o varias células vegetales un compuesto que altera la expresión o la actividad de un MYB del subgrupo 14 en la planta para generar una célula vegetal transgénica y regenerar una planta transgénica a partir de la célula transgénica. El compuesto incrementa la expresión o la actividad del MYB del subgrupo 14. El incremento de la expresión y/o actividad se puede dirigir adicionalmente para que ocurra ectópica o constitutivamente, o de una 40 manera específica del tejido. El compuesto puede ser, p. ej., (i) un polipéptido de MYB del subgrupo 14; (ii) un ácido nucleico de los MYB del subgrupo 14 y análogos y homólogos de los mismos; (iii) un ácido nucleico que incrementa la expresión del ácido nucleico de un MYB del subgrupo 14. Un ácido nucleico que incrementa la expresión del ácido nucleico de un MYB del subgrupo 14 puede incluir promotores o elementos potenciadores. El promotor es un promotor heterólogo o un promotor homólogo. Adicionalmente, el promotor es un promotor constitutivo o inducible. 45 Los promotores incluyen, por ejemplo, el promotor específico de órgano o el promotor específico de tejido. Los promotores idóneos para dirigir la expresión génica se conocen en la técnica y se describen en la presente memoria. Los elementos potenciadores son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el elemento potenciador es un elemento potenciador 35S.

Con incrementar la expresión de un polipéptido de MYB del subgrupo 14 se quiere hacer referencia a que la 50 cantidad producida por la célula transformada con la construcción de ácido nucleico es mayor que la de una célula, p. ej., célula de control, que no está transformada con la construcción de ácido nucleico. Una célula de control incluye, por ejemplo, una célula que expresa de forma endógena un polipéptido de MYB del subgrupo 14, tal como una célula de raíz de planta, como alternativa una célula de control es una célula sin transformar del mismo tipo celular que la célula transformada, bien sea una célula de hoja, una célula de meristemo, o una célula de flor o de semilla. 55 Un incremento es un incremento de 1 vez, 2 veces, 3 veces o más. Un incremento de expresión también significa que incluye la expresión de un polipéptido de MYB del subgrupo 14 en una célula que típicamente no expresa un polipéptido de MYB del subgrupo 14.

El ácido nucleico puede ser tanto endógeno como exógeno. Preferiblemente, el compuesto es un polipéptido del MYB del subgrupo 14 o un ácido nucleico de los MYB del subgrupo 14 que codifica un polipéptido de MYB del subgrupo 14. Por ejemplo, el compuesto comprende la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 5 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265. Preferiblemente, el compuesto es una secuencia de ácido nucleico de los MYB del subgrupo 14 de una fuente endógena a la especie que se transforma. Como alternativa, el compuesto 10 es una secuencia de ácido nucleico de los MYB del subgrupo 14 de una fuente exógena a la especie que se transforma.

También se incluyen en la invención los métodos para producir una planta transgénica. El método incluye introducir en una o varias células vegetales un compuesto que altera en la planta la expresión o actividad del ácido nucleico de un MYB del subgrupo 14, para generar una célula vegetal transgénica y regenerar una planta transgénica a partir de 15 la célula transgénica. El compuesto incrementa la expresión o actividad de una secuencia de MYB del subgrupo 14. El compuesto puede ser, p. ej., un ácido nucleico de MYB del subgrupo 14. El ácido nucleico puede ser endógeno o bien exógeno. Por ejemplo, el compuesto comprende la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 20 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265. Preferiblemente, el compuesto es una secuencia de ácido nucleico de MYB del subgrupo 14 que es endógena a la especie a transformar. Como alternativa, el compuesto es una 25 secuencia de ácido nucleico de MYB del subgrupo 14 que es exógena a la especie a transformar.

Una secuencia exógena de MYB del subgrupo 14 expresada en una especie hospedadora no tiene que ser idéntica a la secuencia endógena de MYB del subgrupo 14. Por ejemplo, las secuencias de los tres genes de tipo GAMYB de Arabidopsis se obtuvieron sobre la base de la similitud de secuencia con los genes de GAMYB de cebada, arroz y L. temulentum. Estos tres genes de Arabidopsis se determinó que codificaban factores de transcripción (AtMYB33, 30 AtMYB65 y AtMYB101) y podrían ser sustituidos por la expresión del GAMYB de cebada y de la α-amilasa de control (Gocal et al (2001) Plant Physiol. 127: 1682-1693).

Los factores de transcripción MYB de maíz, petunia y Arabidopsis que regulan la biosíntesis de los flavonoides son muy similares desde el punto de vista genético y afectan al mismo rasgo en sus especies nativas, con lo que la secuencia y la función de estos factores de transcripción MYB están correlacionadas entre sí en estas diferentes 35 especies (Borevitz et al. (2000) Plant Cell 12: 2383-2394).

Por lo tanto, un MYB del subgrupo 14 que se expresa solo necesita ser funcionalmente reconocido en la célula hospedadora. La expresión de los ácidos nucleicos que codifican el MYB del subgrupo 14 en Arabidopsis proporciona la base de un ensayo de equivalencia funcional. Por ejemplo, la expresión de un MYB del subgrupo 14 originario de Brassica, soja, algodón y maíz en Arabidopsis y la valoración de la termotolerancia muestra una 40 equivalencia funcional y proporciona una base sólida para la predicción de que la secuencia exógena es un gen de MYB del subgrupo 14 y que funciona consecuentemente.

Se describe en la presente memoria una descripción de la expresión de secuencias de los MYB del subgrupo 14 de Arabidopsis, Brassica y soja que se ha demostrado que son funcionales en Arabidopsis en el sentido de que las plantas resultantes han incrementado la termotolerancia, tal y como queda indicado por la reducción de abortos 45 florales y el incremento del cuajado de semillas en condiciones de estrés térmico durante la floración.

En diferentes aspectos, la planta transgénica tiene un fenotipo alterado en comparación con una planta de tipo silvestre (a saber, sin transformar). Por fenotipo alterado se quiere decir que la planta tiene una o varias características que son diferentes de las de la planta de tipo silvestre. Por ejemplo, cuando la planta transgénica se ha puesto en contacto con un compuesto que incrementa la expresión o la actividad de un ácido nucleico de MYB 50 del subgrupo 14, la planta tiene un fenotipo tal como incremento de la termotolerancia en comparación con una planta de tipo silvestre, y manifiesta este rasgo en fenotipos tales como la disminución de los abortos florales, incremento del cuajado de semillas y su desarrollo, incremento de la protección del rendimiento y protección del desarrollo del polen y protección de los meristemos, en particular los meristemos de las flores, del daño por calor, tolerancia a la sequía y tolerancia a la sal, por ejemplo. Las plantas con una reducción de abortos florales tienen un 55 incremento del 5, 10, 20, 25, 30% o más en la cosecha de semillas en comparación con una planta de control.

La planta puede ser cualquier tipo de planta entre ellas, por ejemplo, las especies de los géneros Arabidopsis, Brassica, Oryza, Zea, Sorghum, Gossypium, Triticum, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lycopersicon, Trifolium, Cannabis, Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Solanum, Petunia, 60

Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Lolium, Avena, Hordeum, Secale, Picea, Caco y Populus.

Método para identificar una planta tolerante al estrés térmico

También se describe un método para identificar una planta tolerante al estrés térmico. Las plantas descritas que se 5 identificaron mediante estos métodos tienen una reducción de los abortos florales y un incremento del rendimiento en comparación con una planta de control. Las plantas tolerantes al estrés térmico se identifican al exponer una población de plantas florecientes a un tratamiento con estrés térmico y seleccionar una planta de la población de plantas que tiene una reducción de los abortos florales. El tratamiento con estrés térmico incluye, por ejemplo, exponer la planta a una temperatura que no es suficientemente caliente durante una cantidad suficiente de tiempo, 10 de tal manera que da lugar al daño de las funciones o al desarrollo de la planta. Por reducción de los abortos florales se quiere decir que una planta no pierde tantas flores, debido al aborto floral, o que tiene una cosecha de semillas más grande en comparación con otra planta que está expuesta a un nivel similar de estrés térmico. Las plantas con una reducción de los abortos florales tienen un incremento del 5, 10, 20, 25, 30% o más de la cosecha de semillas en comparación con una planta de control. 15

Ejemplos

La invención se ilustrará además con los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: identificación del mutante termotolerante

Arabidopsis thaliana var. Columbia se transformó con el vector pSKI15 que contiene una secuencia potenciadora por cuadruplicado de 35S (Wiegel et al., 2000). Se obtuvo una población T3 de semillas de Arabidopsis de ABRC y se 20 utilizó para producir una generación T4 que se utilizó en los experimentos de detección genética selectiva. El mutante de Arabidopsis h138 se identificó por tener menos, o ninguno, abortos florales respecto a un control de tipo silvestre, cuando se exponía a un estrés térmico durante la floración de aproximadamente 45 ºC durante aproximadamente 30 a 60 minutos. Los aislados iniciales se volvieron a analizar sometiendo las plantas florecientes a un aumento de temperatura en rampa de 1 hora desde los 22 ºC a los 45 ºC seguido de un estrés térmico de 2 25 horas a 45 ºC, se vigilaron la producción de flores, el cuajado de semillas y el desarrollo de semillas, y se seleccionaron las líneas tolerantes al calor.

Ejemplo 2: identificación del gen de MYB68 termotolerante

El paseo genómico para localizar la inserción de la etiqueta de activación del ADN-T se realizó como se describe a continuación. El ADN genómico se purificó por extracción con fenol:cloroformo a partir de plántulas de 10 días del 30 mutante h138. El ADN aislado se digirió posteriormente con enzimas de restricción, tales como EcoRV, PvuII, NruI o StuI, para generar fragmentos de ADN con extremos romos. Los fragmentos resultantes de cada digestión se ligaron a un adaptador que se formó por la hibridación de dos oligonucleótidos: adaptador 1 y adaptador 2. La adición del adaptador a los fragmentos de ADN permite la amplificación por PCR con los cebadores específicos del adaptador y un sitio de inserción del ADN-T. 35

Se utilizaron dos rondas de PCR para generar los fragmentos de ADN que se analizarán después por secuenciación. El cebador HeatL1 (SEQ) que es específico del borde izquierdo del ADN-T y el cebador CAP1 (SEQ) que es específico del adaptador se utilizaron para la primera PCR. Los productos resultantes de la PCR se diluyeron 50 veces para servir de plantilla para la segunda PCR. A continuación, un fragmento de ADN confirmado se amplificó mediante dos cebadores anidados HeatL2 (SEQ) y CAP2 (SEQ). Los programas de PCR TOUCH1 (6 ciclos de 94 40 ºC, 25 segundos; 72 ºC, 7 minutos; 32 ciclos de 94 ºC, 25 segundos; 67 ºC, 7 minutos y 1 ciclo de 67 ºC, 10 minutos) y TOUCH2 (4 ciclos de 94 ºC, 25 segundos; 72 ºC, 7 minutos; 20 ciclos de 94 ºC, 25 segundos; 67 ºC, 7 minutos y 1 ciclo de 67 ºC, 10 minutos) se utilizaron para las dos rondas de la PCR. Todas las PCR se realizaron con la ADN polimerasa Ex-Taq y un termociclador Biometra®. Se secuenciaron los productos de la PCR y se identificaron las secuencias genómicas flanqueantes. Los potenciadores con el 35S cuadruplicado se insertaron en una región 45 intergénica que está a 5 kb secuencia abajo del extremo 3' del AtMYB68 genómico (AT5G65790) en el cromosoma 5. El análisis de tipo Northern y la PCR en tiempo real mostraron que la expresión de MYB68 en h138 estaba inducida a más del doble con respecto al tipo silvestre.

Ejemplo 3: Caracterización fisiológica del mutante h138 (myb68)

Se valoraron las plantas por su termotolerancia durante la floración y se puntuaron basándose en el número de 50 flores o vainas abortadas y la cosecha de semillas final. Las plantas se hicieron crecer en cámaras con un ambiente controlado, donde las condiciones de crecimiento óptimas eran 16 h de luz 200 µE y 8 horas de oscuridad, 22 ºC y una humedad relativa del 70%. Se utilizaron tres grupos de plantas en el diseño experimental; 1) un grupo de control hecho crecer en condiciones óptimas; 2) grupo de tratamiento con calor durante 3 horas; y 4) un grupo de tratamiento con calor durante 4 horas. El tratamiento con calor se realizó 6 días después de que se abriera la 55 primera flor y la temperatura se incrementó desde 22 ºC a 44 ºC durante un periodo de 1 hora. Cada grupo de plantas contenía el mutante myb68 y su control de tipo silvestre (myb68-null) con 10 macetas de replicados por

entrada y por tratamiento, en donde cada maceta contiene 5 plantas. Se valoró el aborto floral de las plantas una semana después de los tratamientos de estrés térmico, y luego se dejaron crecer en las condiciones óptimas hasta la madurez. La cosecha de semillas final por maceta se determinó para los 3 grupos de plantas.

Después del estrés térmico, la cosecha de semillas de myb68 era más baja que la del control myb68-null tanto en los tratamientos de estrés de 3 horas (25%) como de 4 horas (17%), aunque la diferencia fue solo estadísticamente 5 significativa para el tratamiento de 3 horas. El tratamiento de 3 horas dio lugar a un 32% menos de macetas abortadas respecto a myb68-null y la cosecha de semillas final se incrementó un 16% con respecto a las plantas myb68 que se hicieron crecer en las condiciones óptimas. El tratamiento de 4 horas también dio lugar a un incremento de la cosecha de semillas del 16% con respecto a las plantas myb68 que se hicieron crecer en las condiciones óptimas. En cambio, la myb68-null mostró reducciones del 15% y el 23% de la cosecha de semillas con 10 respecto a las plantas que se hicieron crecer en las condiciones óptimas. La protección del rendimiento global que proporcionaba la mutación myb68 era del 31% y del 39%, respecto al tipo silvestre. Otros experimentos han mostrado resultados de protección del rendimiento que oscilan del 5% al 44%, según las condiciones experimentales.

Ejemplo 4: Construcciones útiles para la expresión de las secuencias de los MYB del subgrupo 14 que incluyen MYB68 15

De acuerdo con los métodos descritos a continuación, las construcciones de los vectores de expresión se pueden producir con los promotores adecuados y un gen MYB. Por ejemplo, cualquiera de las secuencias génicas descritas por las SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 20 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265. Tales construcciones de vectores son útiles para producir un gen de MYB68 operativamente unido a una secuencia que funciona como un promotor en una célula vegetal y expresar operativamente dicho gen y proteína codificada por el gen. 25

Se pueden construir vectores que sobreexpresan el MYB68 bajo el control regulador de los promotores condicionales o constitutivos, como se describe a continuación. La secuencia que codifica un marco abierto de lectura de MYB68 se ha unido operativamente a las secuencias promotoras del promotor constitutivo de CaMV 35S, los promotores inducibles por el calor P18.2 o P81.1 y su promotor endógeno de PMYB68. Adicionalmente, la secuencia genómica de MYB68 se ha clonado detrás del promotor constitutivo de CaMV 35S en un esqueleto del 30 vector pEGAD.

35S-AtMYB68 genómico (en el vector pEGAD (35S-gAtMYB68)

Se amplificaron por PCR 1,4 kb del ADN genómico de MYB68 que incluye 83 pb de la UTR en 3' mediante los cebadores de PCR: MYB68FW-BamH3 (5'--3') (SEQ ID n.º 300) y MYB68RV-BamH4 (5'--3') (SEQ ID n.º 301) y 35 posteriormente se digirió con BamHI. El fragmento de ADN resultante se ligó al pBluescript II SK (+/-) y a continuación se subclonó en el pEGAD en el mismo sitio para obtener el 35S-AtMYB68 genómico (35S-gAtMYB68) en el pEGAD.

35S-AtMYB68, 35S-AtMYB84, 35S-AtMYB36, 35S-AtMYB37, 35S-AtMYB38, 35S-AtMYB87

AtMYB84 (At3g49690), AtMYB36 (At5g57620), AtMYB37 (At5g23000), AtMYB38 (At2g36890) y AtMYB87 40 (At4g37780) se clasifican como miembros de la familia de los MYB del subgrupo 14 junto con AtMYB68 (Stracke et al., 2001), con lo que es posible que sus funciones sean redundantes. Estos genes de los MYB se sobreexpresan en Arabidopsis para analizar su funcionalidad como un ortólogo de AtMYB68 respecto a la termotolerancia. Las secuencias de ADNc se amplifican por RT-PCR y se clonan en pBI121 sin GUS para generar construcciones de 35S-AtMYB84, 35S-AtMYB36, 35S-AtMYB37, 35S-AtMYB38 y 35S-AtMYB87. 45

Se produjo por RT-PCR 1,1 kb del ADNc de AtMYB68 con los cebadores HG2F (5'--3') (SEQ ID n.º 302) y HG2R (5'--3') (SEQ ID n.º 303) y se digirió con XbaI y BamHI. El fragmento de ADN resultante se clonó en el pBluescript II SK (+/-) y a continuación en el pBI121 sin GUS para generar el 35S-MYB68. El pBI121 sin GUS se obtuvo mediante la doble digestión con SmaI y EcolcR1, y a 50 continuación mediante la autoligación del vector restante.

La secuencia codificante de AtMYB84 (933 pb, AtMYB84, At3g49690) se amplificó por RT-PCR con el cebador directo 690M84-Xba-FW que contiene un sitio XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 273) y el cebador inverso 690M84-Bam-Re que contiene un sitio BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 274). El producto de la 55 PCR se clonó en los sitios XbaI-BamHI de pBI121, lo que generó la construcción de 35S-AtMYB84.

La secuencia codificante de AtMYB36 (1.002 pb, AtMYB36, At5g57620) se amplificó por RT-PCR con el cebador directo M36-Xb-FW que contiene un sitio XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 304) y el cebador inverso M36-Bm-Re que contiene un sitio BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 305). El producto de la PCR se clonó en los sitios XbaI-BamHI de pBI121, lo que generó la construcción de 35S-AtMYB36. 5

La secuencia codificante de AtMYB37 (990 pb, AtMYB37, At5g23000) se amplificó por RT-PCR con el cebador directo AM37-Xb-FW que contiene un sitio XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 306) y el cebador inverso AM37-Bm-Re que contiene un sitio BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 307). El producto de la PCR se clonó en los sitios XbaI-BamHI de pBI121, lo que generó la construcción de 35S-AtMYB37. 10

La secuencia codificante de AtMYB38 (897 pb, AtMYB38, At2g36890) se amplificó por RT-PCR con el cebador directo AM38-Xb-FW que contiene un sitio XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 308) y el cebador inverso AM38-Bm-Re que contiene un sitio BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 309). El producto de la PCR se clonó en los sitios XbaI-BamHI de pBI121, lo que generó la construcción de 35S-AtMYB38. 15

La secuencia codificante de AtMYB87 (918 pb, AtMYB87, At4g37780) se amplificará por RT-PCR con el cebador directo M87-Xb-FW que contiene un sitio XbaI (5'--5') (SEQ ID n.º 310) y el cebador inverso M87-Bg-Re que contiene un sitio de Bgl2 (5'--3') (SEQ ID n.º 311). El producto de la PCR se clonará en los sitios XbaI-BamHI de pBI121, lo que generará la construcción de 35S-AtMYB87. 20

P18.2-MYB68 y P81.1-MYB68

La construcción implicó 4 etapas; 1) 869 pb del promotor Hsp18.2 y 406 pb del promotor Hsp81.1 se amplificaron por PCR con los conjuntos de cebadores: HP1F (SEQ ID n.º 277) y HP1R (SEQ ID n.º 278), y HP2F (SEQ ID n.º 279) y HP2R (SEQ ID n.º 280), respectivamente, y se digirieron con SalI y XbaI. Los fragmentos de ADN resultantes se clonaron en el pBI101 en los mismos sitios para generar los nuevos vectores: P18.2pBI101 y P81.1pBI101; 2) un 25 MCS2-oligo (que incluye los sitios de restricción de XbaI, HpaI, AgeI, KpnI, XhoI, ScaI, SpeI, SalI, BamHI y SmaI) se clonó en los nuevos vectores en los sitios XbaI y SmaI. Los vectores resultantes se nombraron P18.2pBI101MCS y P81.1pBI101MCS; 3) el gen GUS se retiró mediante la doble digestión de SmaI y EcolcR1 y le siguió la autoligación del vector restante para dar los vectores p18.2pBI101MCS sin GUS y P81.1pBI101MCS sin GUS; 4) 1,1 kb del fragmento de ADNc de MYB68 se ligó en los dos recientes vectores en los sitios de XbaI y BamHI para completar la 30 construcción de P18.2pBI101MCS sin GUS para P18.2-MYB68 y P81.1MCSpBI121 sin GUS para P81.1-MYB68.

pHSP81.1-AtMYB68

La secuencia codificante de AtMYB68 se aisló mediante la digestión de restricción con XbaI y BamHI del plásmido pHSP18.2-AtMYB68 y se clonó en los sitios XbaI-BamHI de pHSP81.1.

pHPR-AtMYB68 35

La secuencia promotora (de –1 a –506 pb, respecto al codón de inicio ATG) del gen de la hidroxipiruvato reductasa de Arabidopsis (HPR, At1g68010) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de Arabidopsis con un cebador directo que contiene un sitio SalI (HPR-Sal-FW, ) (SEQ ID n.º 312) y un cebador inverso que contiene un sitio XbaI (HPR-Xb-R2, ) (SEQ ID n.º 313). El fragmento digerido se clonó en el 40 vector pHSP81.1-AtMYB68 que se había digerido previamente con SalI y XbaI para retirar el promotor HSP81.1. Esto genera un plásmido recombinante con el promotor HPR colocado delante de AtMYB68.

PMYB68-AtMYB68

El promotor de AtMYB68 (desde –1 ta –1034 respecto al codón de inicio ATG de MYB68) se amplificó por PCR con los cebadores: Pm68-H3-FW (SEQ ID n.º 275) y Pm68-Av-Xh-Re (SEQ ID n.º 276), y se digirió con enzimas de 45 restricción: HindIII y XhoI. El fragmento del promotor resultante se clonó en el P81.1MCSpBI121 sin GUS en los mismos sitios, con lo que se reemplazó el promotor Hsp81.1. A este vector se le denomina entonces PMYB68pBI121 y se utilizó para clonar después el ADNc de AtMYB68 (1,1 kb) entre los sitios AvrII y BamHI para obtener el PMYB68-AtMYB68. El fragmento AvrII-BamHI del ADNc de MYB se recuperó del plásmido 18.2.-MYB68.

pM68-AtMYB84 50

La secuencia codificante de AtMYB84 (933 pb, AtMYB84, At3g49690) se amplificó por RT-PCR con el cebador

directo 690M84-Xba-FW que contiene un sitio XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 273) y el cebador inverso 690mM84-Bam-Re que contiene un sitio BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 274). El producto de la PCR se clonó entre los sitios AvRII-BamHI de pB-Pm68, lo que generó la construcción de AtMYB84 bajo el control del promotor de AtMYB68. 5

pM68-AtMYB36

La secuencia codificante de AtMYB36 (1.002 pb, At5g57620) se amplificó a partir del ARN aislado de plántulas jóvenes de Arabidopsis (hojas y raíces) por RT-PCR con el cebador directo M36-Xb-FW que contiene un sitio XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 305) y el cebador inverso M36-Bm-Re que contiene un sitio BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 10 306). El producto de la PCR se clonó entre los sitios AvrII y BamHI de pBI-Pm68 descrito más arriba. Esto generó una construcción de AtMYB36 bajo el control del promotor de AtMYB68.

35S-OsMYB36

ADNc homólogo de MYB36 en el arroz: La secuencia codificante (966 pb) de un gen de MYB36 de arroz (SEQ ID n.º 9) que codifica una proteína identificada como SEQ ID n.º 10 se amplificó por RT-PCR a partir del ARN de la raíz del 15 arroz con el cebador directo rM-Xb-FW2 que contiene un sitio de XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 314) y el cebador inverso rM-Bm-Re2 que contiene un sitio de BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 315). El producto de la PCR se clonó entre los sitios XbaI-BamHI de pBI121, lo que generó la construcción 35S-Os MYB36. 20

35S-gOsMYB36

Clon genómico homólogo de MYB del arroz: Con los mismos cebadores descritos más arriba, el cebador directo rM-Xb-FW2 (SEQ ID n.º 314) y el cebador inverso rM-Bm-Re2 (SEQ ID n.º 315), se amplificó (1.259 pb) la secuencia genómica del gen de MYB36 del arroz (SEQ ID n.º 265). El producto de la PCR se clonó entre los sitios XbaI-BamHI de pBI121, lo que generó la construcción 35S-gOsMYB36. 25

35S-GmMYB84

El MYB161 de soja es un homólogo del MYB84 de Arabidopsis. En la presente memoria, la terminología «MYB84 de soja» se utiliza indistintamente con MYB161 de soja. La secuencia codificante de 1.068 pb de un MYB161 de soja se clonó por RT-PCR a partir del ARN de la raíz de soja con el cebador directo soybM-Xba-FW2 que contiene un sitio XbaI (5'-T-3') (SEQ ID n.º 316) y el cebador inverso soybM-30 Bm-Re que contiene un sitio BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 317). El producto de la PCR se clonó entre los sitios XbaI-BamHI de pBI121, lo que genera la construcción 35S-GmMYB84.

35S-ZmMYB36

El ADNc de MYB36 del maíz (SEQ ID n.º 261) se amplificó por PCR con los cebadores: ZmMYBFW-XbaI (5'-35 -3') (SEQ ID n.º 318) y ZmMYBRV-BamHI2 (5'--3') (SEQ ID n.º 319). El fragmento de ADN se digirió con XbaI y BamHI y posteriormente se ligó en los mismos sitios en pBluescript II SK (+) y a continuación se subclonó en los mismos sitios de pBI121, con lo que se reemplazó a GUS.

35S-GhMYB68 o 35SS-CotMYB68 40

El ADNc de MYB68 de algodón se amplificó por PCR con los cebadores: CotM-Xb-Fw (5'--3') (SEQ ID n.º 320) y CotM-Bm-Re (5'--3') (SEQ ID n.º 321). El fragmento de ADN se digirió con XbaI y BamHI. Se ligó a los mismos sitios en pBluescript II SK (+) y a continuación se subclonó en los mismos sitios de pBI121, lo que reemplazó a GUS. 45

35S-BnMYB68r

El ADNc de MYB de la raíz de la colza se amplificó por PCR con los cebadores: Bn68root-FW-XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 322) y Bn68root-RV-BamHI (5'--3') (SEQ ID n.º 323). El fragmento de ADN

se digirió con XbaI y BamHI. Se ligó a los mismos sitios en pBluescript II SK (+). A continuación, el mismo fragmento se subclonó en los mismos sitios de pBI121, lo que reemplazó a GUS.

35S-BnMYB68b

El ADNc de MYB de capullo de colza se amplificó por PCR con los cebadores: Bn68Bud-FW-XbaI (5'--3') (SEQ ID n.º 324) y Bn68Bud-RV-BamHI (5'-5 -3') (SEQ ID n.º 325). El fragmento de ADN se digirió con XbaI y BamHI. Se ligó a los mismos sitios en pBluescript II SK (+). A continuación, el mismo fragmento se subclonó en los mismos sitios de pBI121, lo que reemplazó a GUS.

La tabla 2 que viene a continuación describe los cebadores oligonucleotídicos utilizados para hacer las construcciones de vectores descritas más arriba y otros cebadores útiles para clonar los homólogos de AtMYB. 10

Tabla 2: Cebadores oligonucleotídicos sintetizados para la clonación de homólogos de AtMYB68

SEQ ID n.º: Nombre del cebador Sitio de restricción Secuencia (5'-3') Observación

: 790M68-Xba-FW XbaI AtMYB68 (at5g65790)

: 790M68-Bam-Re BamHI AtMYB68 (at5g65790)

: 690M84-Xba-FW XbaI AtMYB84 (at3g49690)

: 690M84-Bam-Re BamHI AtMYB84 (at3g49690)

: Pm68-H3-FW HindIII AtMYB68 Promotor

: Pm68-Av-Re AvrII y XhoI AtMYB68 Promotor

: HP1f

: HP1R

: HP2F

: HP2R

: BnMYB68FW2 MYB68 de colza (AC189266.1)

: BnMYB68RV2 MYB68 de colza (AC189266.1)

: rM-Xb-FW XbaI MYB de arroz (AAT85046)

: rM-Bm-Re BamHI MYB de arroz (AAT85046)

: cotM-Xb-FW XbaI MYB de algodón (TC34239)

: cotM-Bm-Re BamHI

: soybM-Xba-FW2 XbaI MYB de soja (ABH02906)

: cornM-Xba-FW2 XbaI MYB de maíz (TC370133)

: wheatM-Xba-FW XbaI MYB de trigo (BQ483726)

: MedtM-Xba-FW XbaI MYB de M. truncatula (TC97441)

: sorgM-Xb-FW XbaI MYB de sorgo (AAL84760)

: toM-Xb-FW XbaI Blind de Tomate (AAL69334)

: toM-Bm-Re BamHI

: popM-Xb-FW XbaI MYB de chopo (TC54478)

: popM-Bm-Re BamHI MYB de chopo (TC54478)

: HSP18.2 HP1F

: HSP18.2 HP1R

: HSP81.1 HP2F

: HSP81.1 HP2R

Nota:

1. FW: cebador directo que contiene la secuencia específica del gen desde el codón iniciador ATG.

2. Re: cebador reverso que contiene la secuencia específica del gen hasta el codón de parada.

3. Los sitios de restricción en el extremo 5' están subrayados.

Las construcciones del vector de expresión se pueden introducir en Arabidopsis, la planta de origen o cualquier 5 especie de elección. Por ejemplo, un gen de MYB de Arabidopsis se puede sobreexpresar en una especie de Brassica o como alternativa en una especie de soja, maíz, arroz o algodón.

Ejemplo 5: Análisis de la secuencia de aminoácidos de MYB68

Las tablas que vienen a continuación proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de la familia de genes de MYB a través de diferentes especies de plantas, con diferentes ajustes para los alineamientos de 10 múltiples secuencias y el análisis de las secuencias de aminoácidos. Nota: se utilizan diferentes sistemas de numeración y denominación de los MYB en la bibliografía y en las bases de datos para diferentes especies de plantas.

En las tablas que vienen a continuación, (*) indica que la secuencia del ORF predicho del ADN genómico se editó de acuerdo con los alineamientos de secuencias peptídicas para generar una posible secuencia codificante. La 15 designación (P) indica una secuencia parcial. La homología de secuencia y los alineamientos de múltiples secuencias se compararon mediante ClustalW en
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ .

Tabla 3:

Especie: Nombre Archivo de secuencia Tamaño de la proteína (a.a.) Puntuaciones de los alineamientos múltiples para las AtMYB (%, Clustal)




: MYB68 MYB84 MYB36

: AtMYB68

: AtMYB84 At3g49690 SEQ ID n.º 4

: AtMYB36 At5g57650 SEQ ID n.º 6

Colza: AC189266 SEQ ID n.º 8 364 (*)

Arroz: MYB de arroz s8137

: MYB de arroz s3656 AAT85046 SEQ ID n.º 10

Soja: MYB84 de soja ABH02831

: MYB84 de soja ABH02839

: MYB161 de soja ABH02906 SEQ ID n.º 14 198 (P)

: MYB71 de soja ABH02912 209 (P)

Maíz: TC32080


: TC32080

: ZmMYB-IP30 AF099429 43 (P)

: ZmMYB-IP30 TC370133 SEQ ID n.º 18 131 (P)

: ZmMYB-HX43 AF099383 43 (P)

: MYB8 de maíz CAJ42201

: MYB31 de maíz CAJ42202

: MYB38 de maíz P20025

Algodón: MYB de algodón TC34239 SEQ ID n.º 12

: GHMYB25 de algodón AAK19616

: GHMYB9 de algodón AAK19619

: GHMYB30 de algodón AAZ83352

Sorgo: MYB68 de sorgo AAL90639 87(P)

: MYB86 de sorgo AAQ54875 157(P)

: MYB20 de sorgo AAL84760 SEQ ID n.º 20 157(P)

: MYB34 de sorgo AAL84761


: Sbi_042749

Medicago truncatula: ABE78637


: ABE90877


: TC97441 SEQ ID n.º 26 178 (P)

Tomate: Blind AAL69334 SEQ ID n.º 28


: EST467561 SEQ ID n.º 30


: TC182203 185 (P)


: AAL69334


: EST467561

Trigo: BQ483726 SEQ ID n.º 22 175 (P)

Chopo: TC54478 SEQ ID n.º 24

Tabla 4: Homólogos de ATMYB68 de diferentes cultivos/especies

Nombre: Archivo de secuencia Tamaño de la proteína (a.a.) Puntuaciones de alineamientos para varias AtMYB (%, ClustalW)



: AtMYB68 AtMYB84 AtMYB36

AtMYB68: At5g65790 SEQ ID n.º 2

AtMYB84: At3g49690

AtMYB36: At5g57620

Colza: AC189266 364((*))

Soja: ABH02906 198 (P)

Algodón: TC34239

Tomate: Blind AAL69334

Medicago truncatula: TC97441 178 (P)

Arroz: AAT85046

Maíz: TC370133 131 (P)

Trigo: BQ483726 175 (P)

Sorgo: AAL84760 157 (P)

Chopo: TC54478

En la tabla 4 anterior, la homología de secuencias y el alineamiento de múltiples secuencias se compararon mediante ClustalW en
http://w
ww.ebi.ac.uk/clustalw/ con los siguientes ajustes por defecto: 5

Matriz: Gonnet 250

APERTURA DE HUECO: 10,0

HUECOS EN LOS EXTREMOS: –1

EXTENSIÓN DEL HUECO: 0,2

DISTANCIA ENTRE LOS HUECOS: 4 10

Tabla 5: Homólogos de ATMYB68 de diferentes cultivos/especies

Especie: Archivo de secuencia Tamaño de la proteína (a.a.) Homología de secuencia (%) con AtMYB68



: Proteína ADN

AtMYB68: At5g65790 SEQ ID n.º 2

AtMYB84: At3g49690

AtMYB36: At5g57620

Colza: AC189266 364 ((*))

Soja: ABH02906 198 (P)

Algodón: TC34239

Tomate: Blind (AAL69334)

Medicago truncatula: TC97441 178 (P)

Arroz: AAT85046

Maíz: TC370133 131 (P)

Trigo: BQ483726 175 (P)

Sorgo: AAL84760 157 (P)

Chopo: TC54478

En la tabla 5 anterior, la homología de secuencias y el alineamiento de múltiples secuencias se compararon mediante ClustalW en
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ con los siguientes ajustes por defecto:

Matriz de proteínas: Gonnet 250 5

APERTURA DE HUECOS: ADN: 15,0 Proteína: 10,0

HUECOS EN LOS EXTREMOS: –1

EXTENSIÓN DEL HUECO: ADN: 6,66 Proteína: 0,2

DISTANCIA ENTRE LOS HUECOS: 4

Ejemplo 6: Caracterización fisiológica de las líneas de expresión de 35S-MYB68 10

Dentro de una población de líneas transgénicas, existirá una gradación de los niveles de expresión y de la respuesta fisiológica. En parte, la gradación de la variación es resultado del sitio de integración de la construcción génica y del entorno local para la expresión génica en ese locus. Por lo tanto, se deben escrutar las líneas y evaluarlas para seleccionar las líneas que funcionen mejor. Este método es cotidiano para el experto en la técnica.

Las líneas homocigotas que expresan una construcción de expresión de 35S-MYB68 se han evaluado en un 15 experimento de calentamiento y abortos florales. La configuración experimental incluía 8 plantas replicadas por línea con una 1 planta por maceta de 3'' y hechas crecer en las condiciones óptimas en una cámara con un ambiente controlado (18 h de luz a 200 µE, 6 h de oscuridad, 22 ºC, humedad relativa del 70%). Tres días después de la aparición de la primera flor, las plantas se expusieron a un choque térmico de 1 hora a 42 ºC y se devolvieron a las condiciones óptimas durante 7 días más. A las plantas se les contaron los abortos florales en el tallo principal. Se 20 identificaron líneas que mostraron una reducción de la tasa de abortos florales del 34% al 60% respecto a los controles de tipo silvestre.

Las cosechas de semillas y la protección del rendimiento, expresadas como un porcentaje respecto al tipo silvestre, se determinaron para nueve líneas transgénicas independientes de 35S-MYB68. La configuración experimental incluía 3 plantas por maceta de 3'' que se hicieron crecer como más arriba con 22 replicados por línea. Tres días 25 después de la aparición de la primera flor, 12 replicados por línea se expusieron a un estrés térmico de 3 horas a 45 ºC con una rampa de 1 hora desde 22 ºC. Tres días después, se aplicó de nuevo el estrés térmico. Con los 10 replicados restantes, las plantas por línea se mantuvieron en las condiciones óptimas a lo largo de su ciclo de vida. La cosecha final de semillas se determinó para todas las plantas. Las plantas de tipo silvestre mostraron una reducción del 40% del rendimiento debido al estrés térmico aplicado, mientras que las líneas transgénicas, aunque 30 tuvieran también un menor rendimiento debido al estrés térmico, la reducción fue menos intensa, lo que dio lugar a

una protección del rendimiento del 10% al 12%.

Las líneas seleccionadas se volvieron a evaluar y sometieron a estrés como sigue. Las plantas se expusieron a una rampa de 1 hora desde 22 ºC a 45 ºC y se mantuvo un estrés térmico de 45 ºC durante 1,5 a 1,8 horas. El estrés térmico se aplicó diariamente durante cinco días consecutivos seguido por un periodo de recuperación de cinco días y a continuación un sexto tratamiento con calor. El tratamiento con calor dio lugar a una reducción del 11% del 5 rendimiento de las plantas de tipo silvestre y, en cuatro de las líneas transgénicas, se observó un incremento del rendimiento que oscilaba del 2% al 17%. Tal y como se muestra en la tabla 6, seis líneas transgénicas (68, 80, 93, 73, 83, 30) mostraron una protección del rendimiento respecto al tipo silvestre después del estrés térmico. Esta protección osciló del 3 al 31%. Dos de estas líneas transgénicas (30 y 73) se ha demostrado que tenían protegido el rendimiento en el experimento anterior, y dos líneas (93 y 83) mostraron una reducción de los abortos florales. 10

Tabla 6:

Línea: Cosecha de semillas con calor Protección del rendimiento con respecto al tipo silvestre

: 0,816 31%

: 0,714 26%

: 0,781 17%

: 0,820 14%

: 0,719 5%

: 0,801 3%

Tipo silvestre

0,784

-

myb68: 0,577 15%

Tipo silvestre (myb68-null)

0,779

-

Caracterización de las líneas de Arabidopsis que expresan la construcción PMYB68-AtMYB68

Se evaluaron 14 líneas transgénicas T3 homocigotas en un experimento de abortos florales. Las plantas (14 replicas por entrada) se hicieron crecer en las condiciones óptimas (18 h de luz, 200 µE, 22 ºC, humedad relativa del 60%) 15 en macetas de 2,25'' hasta tres días tras la apertura de la primera flor. En ese momento, las plantas se expusieron al tratamiento de 1 hora a 43 ºC. Después del tratamiento con calor, las plantas se devolvieron a las condiciones óptimas durante 7 días más. El impacto del tratamiento con calor en la formación de las vainas se valoró en este punto con el recuento de las vainas abortadas y dañadas (cortas) en la región que se expuso al estrés térmico. Seis líneas transgénicas mostraron una reducción del número total de vainas dañadas en comparación con los controles 20 (tipo silvestre-Columbia y el null-n11-8) (véase la tabla 7 que viene a continuación). La mejor línea mostró sólo un 70% del daño por calor respecto al control. Dos de las líneas transgénicas examinadas aquí también mostraron una reducción del aborto floral en la etapa T2 del escrutinio. El mutante myb68, incluido como un control positivo, también mostró una reducción del número total de vainas dañadas en comparación con su control nulo de segregación (myb68-null). 25

Tabla 7:

: N.º de vainas dañadas Total de vainas dañadas

Entrada: Media Error estándar Como % de Col

15-8: 2,3 0,4 70%

3-3: 2,4 0,4 72%

4-4: 2,9 0,4 87%

8-1: 2,9 0,4 89%

27-1: 3,1 0,4 93%

20-4: 3,2 0,4 98%

n-11-8: 4,1 0,4 126%

Col: 3,3 0,4 100%

myb68: 1,9 0,5 60%

myb68-null: 3,2 0,4 100%

Ejemplo 7: Valoración fisiológica de las plantas transgénicas que expresan MYB68

El mutante myb68 de Arabidopsis muestra tolerancia a la sequía

Cinco plantas por maceta de 3'' con 6 replicas por entrada se hicieron crecer en las condiciones óptimas de 16 h de luz (180 µE), 22 ºC, humedad relativa del 70% en una cámara de crecimiento hasta la apertura de la primera flor. Se 5 comenzó un tratamiento de sequía igualando la cantidad de agua en todas las macetas y el cese del riego. La pérdida de agua se midió diariamente pesando las macetas. Se calculó el contenido del agua del suelo (CAS) como un porcentaje del inicial. Se recogieron las plantas en los días 0, 2 y 4 del tratamiento de sequía. Se calculó la pérdida de agua respecto a la biomasa seca de los brotes de las plantas. Las plantas myb68 tienden a un CAS mayor que el del control a lo largo del tratamiento de sequía. La biomasa de los brotes no era diferente ni 10 ligeramente más grande que la del control. La proporción de agua perdida en 2 días frente al peso seco de los brotes el día 2 fue más baja para el mutante myb68 que para el control, lo que indica una tendencia a la tolerancia a la sequía.

Tabla 8: Contenido de agua del suelo (% del inicial) en los días del tratamiento de sequía y pérdida de agua en 2 días respecto al peso seco de los brotes el día 2. 15

: CAS-d2 (% del inicial) CAS-d4 (% del inicial) Pérdida de agua en 2d/peso seco del brote el d2

Entrada: Media Error estándar Media Error estándar Media Error estándar

myb68: 36,3 1,0 9,1 0,2 161,6 4,9

Tipo silvestre: 32,3 0,8 8,5 0,2 185,3 8,6

El mutante myb68 y las líneas transgénicas de Arabidopsis 35S-gMYB68 y 35S-MYB68 muestran una tolerancia a la sal en la etapa de plántula

Las semillas se esterilizaron y se colocaron en placas de agar con medio de crecimiento MS 1/2 que contiene sal (NaCl a 200 nM) o sin sal (placas óptimas) con 6 placas por entrada y 30 semillas por placa. Después de 3 días a 4 20 ºC, las placas se colocaron en la cámara de crecimiento a 22 ºC y con 18 horas de luz (100 µE) durante 16 días. Después de 7 días, las placas se puntuaron según la germinación y después de 9 días mas, las plántulas se puntuaron según la decoloración (% de plántula blanca, indicativo de estrés). No se encontraron diferencias entre los controles y las líneas transgénicas o el mutante con respecto a la germinación en las placas óptimas y las placas con sal. Pero al cabo de 16 días de exposición a la sal, las plántulas mostraron signos de estrés al ir decolorándose. 25 Los resultados indicaban que el mutante myb68 y las líneas transgénicas que expresan 35S-Myb68 tenían menos plántulas decoloradas, lo que era indicativo de la menor sensibilidad al estrés salino.

Tabla 9: Plántulas decoloradas (% de plántula blanca) puntuadas después de 16 días en placas de MS ½ y agar que contienen NaCl a 200 mM


: % de plántulas blancas

Construcción: Entrada Media Error estándar

myb68 (mutante): myb68 51,3 6,5

: myb68-null 60,1 7,0

35S-gMYB68: 29,3 5,0

: 29,8 4,7

: Control 41,6 4,6

35S-MYB68: 104-3* 56,7 4,9

: 22-7 62,1 5,4

: Control 75,6 5,6

La expresión constitutiva de MYB68 en Arabidopsis da lugar a la protección del rendimiento después de someterse a estrés térmico

Las plantas de Arabidopsis 35S-Myb68 se hicieron crecer en macetas de 3'' con 3 plantas por maceta y 10 replicas por tratamiento óptimo y 12 replicas por tratamiento con calor. Todas las plantas se hicieron crecer en las condiciones óptimas hasta los 2 días en floración. En ese momento, las plantas óptimas permanecieron en las condiciones óptimas (22 ºC, 18 horas de luz de 200 µE, humedad relativa al 70%) y el grupo problema tuvo un tratamiento con calor diario que se aplica mediante el incremento de la temperatura desde 22 ºC a 45 ºC durante un 5 periodo de rampa de 1 hora y el mantenimiento de la temperatura durante 1,5 a 2,5 horas durante cinco días consecutivos. Las plantas se recuperaron durante un periodo de dos días sin aplicar estrés tras lo cual se aplicó de nuevo el estrés durante tres días más (en total, ocho días de tratamiento con calor). Después de los tratamientos con calor, las plantas se mantuvieron en las condiciones óptimas hasta la madurez junto con el grupo óptimo y se determinó la cosecha de semillas final de ambos grupos. Los resultados indican que cuatro líneas transgénicas de 10 35S-Myb68 (22-7, 20-11, 35-1 y 8-6) mostraban una protección del rendimiento después de los tratamientos con estrés térmico que oscilaba del 8 al 21% respecto a los controles.

Tabla 10: Cosecha de semillas por maceta de plantas hechas crecer en las condiciones óptimas y en estrés térmico, tal y como se describe más arriba. La protección del rendimiento se calculó como la diferencia entre la cosecha de semillas después del estrés térmico y se expresó como el porcentaje de lo óptimo en las líneas transgénicas y Col. 15

: óptimo calor


: Cosecha de semillas (g) Cosecha de semillas (g) Rendimiento

Entrada: n Media Error estándar n Media Error estándar % de lo óptimo Protección respecto a Col

22-7: 0,449 0,034 0,470 0,018 105% 21%

20-11: 0,194 0,025 0,201 0,014 104% 20%

35-1: 0,500 0,033 0,465 0,023 93% 10%

8-6: 0,517 0,028 0,473 0,011 91% 8%

28-12: 0,572 0,025 0,503 0,012 88% 4%

33-3: 0,155 0,016 0,133 0,012 86% 2%

25-6: 0,395 0,027 0,335 0,013 85% 1%

20-7(null): 0,571 0,021 0,484 0,010 85%

33-10(null): 0,546 0,018 0,456 0,016 84%

Col: 0,548 0,029 0,457 0,020 83%

Ejemplo 8: Confirmación funcional de que las secuencias de los MYB del subgrupo 14 de Arabidopsis y de los homólogos de otras especies producen los fenotipos deseados, tales como la termotolerancia.

La expresión constitutiva de BnMYB68 en Arabidopsis da lugar a la reducción de los abortos florales después del estrés térmico: 20

Se identificaron en Brassica dos secuencias de Myb68 muy relacionadas. Sus patrones de expresión difieren en que uno se expresa predominantemente en las raíces (SEQ ID n.º 54) y el otro en los capullos de las flores (SEQ ID n.º 56). Se produjeron y se evaluaron las plantas que tienen construcciones que expresan cualquiera de los BnMyb68. Las plantas se hicieron crecer en macetas de 2,25'' (1/maceta) en las condiciones óptimas (22 ºC, humedad relativa del 50%, 17 h de luz de 200 µE) hasta 3 días después de la apertura de la primera flor. Las plantas se transfirieron 25 de 22 ºC a 43 ºC durante 2 a 2,5 horas (véanse las tablas que vienen a continuación). Después de esto, las plantas con estrés térmico se devolvieron a las condiciones óptimas a 22 ºC durante una semana. Una semana después del estrés térmico, se contó el número de abortos florales. Las líneas transgénicas de la construcción 35S-BnMyb68(raíz) mostraron menos vainas abortadas que su control (null). Dos líneas transgénicas de 35S-BnMyb68(capullo) mostraron una reducción de los abortos florales después del estrés térmico respecto a su control (línea null). 30

Tabla 11: Número de abortos florales después del estrés térmico de 2 h a 43 ºC – 35S-BnMYB68(raíz)


: N.º de vainas abortadas

Entrada: N.º de réplicas Media Error estándar % de null

36-1: 6,6 0,9 79%

49-1: 6,6 0,9 79%

61-4: 6,8 0,7 82%

70-2: 7,5 1,1 89%

73-3: 7,5 0,7 90%

75-7: 5,9 1,0 71%

78-8: 6,5 0,9 77%

80-8: 6,5 0,9 78%

null 75-5: 8,4 0,9

Tabla 12: Número de abortos florales después del estrés térmico de 2,5 h a 43 ºC – 35S-BnMYB68 (capullo)


: N.º de vainas abortadas

Entrada: N.º de réplicas Media Error estándar % de null

11-6: 4,6 0,4 73%

61-12: 5,8 0,8 92%

null 97-1: 6,3 0,6

La expresión constitutiva de MYB84 de soja o de MYB84 de Arabidopsis o de MYB36 de Arabidopsis en Arabidopsis da lugar a una reducción de los abortos florales después del estrés térmico 5

La sobreexpresión de las construcciones de Myb84 de soja (GmMyb84) o de Myb84 de Arabidopsis (AtMyb84) o de Myb36 de Arabidopsis (AtMyb36) que se hicieron y se transformaron en las plantas de Arabidopsis confirman desde el punto de vista funcional que los homólogos de Myb del subgrupo 14 dan lugar a termotolerancia tal y como se demostró por la reducción de los abortos florales con el estrés térmico. Se produjeron plantas transgénicas y se utilizó la generación T2 para un escrutinio inicial de termotolerancia. Posteriormente, las plantas transgénicas 10 homocigotas T3 se utilizan para la valoración fisiológica detallada y la confirmación de los resultados iniciales.

Las semillas T2 se sembraron en placas de agar de MS a 0,5× con vitaminas (1 placa/piso). Cada grupo problema incluía un control positivo, el mutante myb68 termotolerante original y un tipo silvestre correspondiente. Las plántulas se trasplantaron al suelo el día 10 después de la germinación. A principios de la etapa de floración, las plantas se colocaron en una cámara calefactora a 45 ºC y humedad al 65% durante 24-30 minutos. A continuación, las plantas 15 se devolvieron a la cámara de crecimiento en las condiciones de crecimiento normales (17 h de luz/7h de oscuridad, 200 µE, 22 ºC, humedad al 70%). Las plantas se examinaron el día 32 y se puntuaron según las silicuas abortadas, las silicuas parcialmente abortadas, los meristemos muertos o las silicuas normales. Un estrés térmico se consideraba eficaz si una mayoría de plantas de tipo silvestre tenía un número de abortos florales significativo. Las líneas transgénicas se valoraron según la expresión génica por RT-PCR y mostraron tener un alto nivel de expresión. 20

Se producen construcciones y plantas transgénicas con los homólogos de las secuencias de los MYB del subgrupo 14 de las especies de cultivo deseadas, por ejemplo, arroz, maíz, trigo, soja y algodón, y se les evaluó su termotolerancia.

Tabla 13:

Construcción: Abortos florales como % del control

35S-BnMYB68-capullo

35S-Bn-MYB68-raíz

35S-GmMYB84

35S-AtMYB84

35S-AtMYB36

Este ejemplo demuestra que se puede utilizar Arabidopsis como un sistema modelo para valorar y confirmar que la secuencia de un Myb del subgrupo 14 puede proporcionar termotolerancia y que las secuencias identificadas de otras especies vegetales son funcionales en Arabidopsis.

Caracterización de líneas de Arabidopsis que expresan una construcción de 35S-AtMYB36

Se evaluaron 15 líneas transgénicas homocigotas T3 en un experimento de abortos florales. Las plantas (14 replicas 30

por entrada) se hicieron crecer en las condiciones óptimas (18 h de luz, 200 µE, 22 ºC, humedad relativa del 60%) en macetas de 2,25'' hasta cuatro días después de la primera apertura floral. En ese momento, las plantas se expusieron a un tratamiento de 1 h a 43 ºC. Después del tratamiento con calor, las plantas se devolvieron a las condiciones óptimas durante 7 días más. El impacto del tratamiento con calor sobre la formación de las vainas se valoró en ese momento mediante el recuento de las vainas abortadas y dañadas (cortas) en la región que se expuso 5 al estrés térmico. Nueve líneas transgénicas mostraron una reducción del número total de vainas dañadas en comparación con los controles (Columbia de tipo silvestre y null-n-77-4) (véase la tabla que viene a continuación). Tres de las líneas examinadas aquí también mostraron una reducción de los abortos florales en la etapa T2 del escrutinio. El mutante myb68, incluido como un control positivo, también mostró una reducción del número total de vainas dañadas en comparación con su control nulo de segregación (myb68-null). 10

Tabla 14:

: n.º total de vainas dañadas Total de vainas dañadas

Entrada: Media Error estándar Como % de Col.

108-2: 3,2 0,6 65%

14-3: 3,7 0,5 76%

36-2: 3,8 0,4 78%

103-7: 3,8 0,4 78%

43-6: 3,8 0,4 78%

23-4: 3,9 0,4 81%

67-7: 4,0 0,4 82%

82-7: 4,4 0,4 90%

40-4: 4,5 0,6 93%

n77-4: 4,1 0,5 85%

Col: 4,9 0,6 100%

myb68: 3,1 0,4 72%

myb68-null: 4,3 0,5 100%

La expresión constitutiva o inducible en Brassica napus de un MYB68 de Arabidopsis muestra una reducción de los abortos florales después del estrés térmico

Se evaluó la tolerancia al estrés térmico, en las condiciones de las cámaras de crecimiento, de 5 líneas transgénicas 15 que tienen una secuencia del gen de Mbyb68 de Arabidopsis bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible por calor. Estas líneas se encontraban en la etapa T2 y eran heterocigotas, con la excepción de la línea 01-105G-1-E. El análisis de las líneas heterocigotas produce típicamente una variación mayor que el mismo análisis realizado en las líneas homocigotas. Sin embargo, el análisis precoz permite el escrutinio y el posterior análisis de las líneas homocigotas derivadas. Los nulos (null) de segregación y la DH12075 madre se incluyeron 20 como controles. El experimento se dispuso en un diseño de gráfico dividido con la temperatura como factor principal y la línea transgénica como subfactor. Las plantas se hicieron crecer en macetas de plástico de 15 cm rellenadas con «Sunshine Mix n.º 3» bajo una radiación fotosintéticamente activa de aproximadamente 500 µmol m-2 s-1 en la parte superior del dosel del cultivo. Se realizó el análisis molecular para confirmar la presencia del transgén. Se incluyeron dos grupos de plantas en el análisis; un grupo se hizo crecer en las condiciones óptimas (temperatura de 25 día/noche de 22/18 ºC, fotoperiodo de 16 h) a lo largo del periodo de crecimiento, mientras que el segundo grupo se sometió a estrés térmico a 31 ºC durante 5 h al día (en rampa ascendente desde 18 a 31 ºC, y luego descendente a 18 ºC). Las condiciones de estrés térmico se iniciaron al tercer día de la apertura de la primera flor y durante siete días más. A continuación, las plantas sometidas a estrés térmico se devolvieron a las condiciones óptimas hasta que alcanzaron la madurez. Todos los racimos de flores en las plantas sometidas a estrés se marcaron al comienzo y al 30 final del periodo de estrés térmico para indicar qué flores se habían sometido al estrés térmico. Se contaron las vainas viables y abortadas sobre los racimos marcados, y se calculó la tasa de abortos de las vainas como la proporción de vainas abortadas por vainas abortadas más viables en las condiciones de estrés térmico, expresado como porcentaje. La cosecha de semillas se determinó después de la recogida.

Había diferencias significativas en el número de abortos florales entre las diferentes líneas, de las que dos líneas de 35 35S-Myb68 mostraban una reducción significativa de la tasa de abortos por estrés térmico en comparación con la línea parental. La línea 02-104G-4-A tenía una tasa de abortos significativamente más baja (33%) que su nulo de segregación (48%) y DH12075 (61%). La tasa de abortos para la línea 02-104G-3-K (47%) fue significativamente

más baja que la del nulo de segregación (66%) y DH12075. La línea homocigota (01-105G-1-E) tenía una tasa de abortos ligeramente más baja (53%) que su nulo de segregación (58%) y que el control parental. Dentro de una población de líneas transgénicas existirá una gradación de los niveles de expresión y de la respuesta fisiológica. En parte, la gradación de la variación es un resultado del sitio de integración de la construcción génica y del entorno local para la expresión génica en ese locus. Se espera que ocurra esta gradación y, por lo tanto, se deben escrutar y 5 evaluar las líneas para seleccionar las líneas que funcionen mejor. Este método le resultará cotidiano al experto en la técnica.

La cosecha de semillas difería entre las líneas analizadas. El rendimiento de tres líneas transgénicas, 02-104G-3-K, 02-104G-4-A y 01-105G-1-E era similar al de la linea parental, pero en comparación con su propio nulo, las tres líneas mostraron un incremento de la cosecha de semillas de entre el 10% y el 22%. Dos líneas transgénicas (02-10 33H-1-V y 01-105G-3-G) parecían funcionar peor que la DH12075 madre, pero en comparación con los nulos apropiados, una línea resultó ser significativamente más baja. Debido a la cigosidad de estas líneas, no se espera tal variabilidad.

Se encontró una tendencia similar para el número de semillas por racimo en las condiciones de estrés térmico. Las líneas 02-104G-3-K, 02-104G-4-A y 01-105G-1-E tenían un número de semillas ligeramente más alto por racimo, 15 pero las otras líneas transgénicas (02-33H-1-V y 01-105G-3-G) tenían un número de semillas por racimo ligeramente más bajo que la línea madre. No había diferencias significativas en el peso de 100 semillas entre las líneas analizadas.

En general, dos líneas transgénicas que expresan el gen de Myb68 de Arabidopsis mostraron una protección significativa ante los abortos florales durante el estrés térmico impuesto en la floración. Adicionalmente, tres líneas 20 transgénicas indicaban una tendencia a incrementar la cosecha de semillas.

Tabla 15:

Construcción: Línea Tasa de abortos (%) E. E. Ab como % de nulo Rendimiento E. E. Rendimiento como % de nulo

35S-MYB68: 02-104G-3-K 4,8 0,71 0,188

: 02-104G-3-G nulo 3,7 0,58 0,091

: 02-104G-4-A 7,6 0,75 0,153

: 02-104G-4-F nulo 2,8 0,68 0,090

: 02-33H-1-V 1,9 0,31 0,159

: 02-33H-1-F nulo 4,3 0,71 0,090

P18.2-MYB68: 01-105G-1-E 4,1 0,73 0,097

: 01-105G-1-B nulo 3,0 0,63 0,090

: 01-105G-3-G 4,9 0,31 0,099

: 01-105G-3-J nulo 3,6 0,32 0,097

Control: DH12075 madre 2,4 0,62 0,106

Ejemplo 9: Identificación de secuencias de los MYB del subgrupo 14 y homólogos

Los métodos para la identificación de secuencias de los MYB de Arabidopsis, la clasificación de las secuencias de 25 los MYB en los subgrupos designados y la identificación de las secuencias de los MYB del subgrupo 14 se describen con más detalle en Stracke et al., 2001 y Kranz et al., 1998. Las secuencias de los MYB del subgrupo 14 se han definido como una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que comprende una secuencia de Arabidopsis, cuyas características se describen en la presente memoria. El MYB del subgrupo 14 es una secuencia de MYB R2R3 que comprende adicionalmente un motivo o motivos conservados como se describe mediante los patrones que vienen a 30 continuación.

El patrón general (SEQ ID n.º 266) da a conocer una secuencia que se puede utilizar para identificar una secuencia candidata a MYB del subgrupo 14. En algunas posiciones se permiten varios restos aminoacídicos en una localización determinada. Cuando se permiten varios aminoácidos, los restos optativos se indican entre corchetes. Cuando una secuencia de proteína de MYB R2R3 encaja en el patrón general, es probable que sea una secuencia 35 de MYB del subgrupo 14. Una secuencia de MYB del subgrupo 14 puede no llegar as ser idéntica al patrón general, por ejemplo, puede ser idéntica al 90%, 95% o 99%.

Si una secuencia candidata a MYB del subgrupo 14 que coincide con el patrón general incluye además una

coincidencia con el patrón exclusivo (SEQ ID n.º 267), entonces la secuencia es un firme candidato para la inclusión como una secuencia de MYB del subgrupo 14. La secuencia exclusiva (SEQ ID n.º 267) define el patrón de los aminoácidos que están presentes en las secuencias de los MYB del subgrupo 14, pero pueden diferir en otras proteínas MYB R2R3. La presencia del patrón exclusivo dentro de una proteína MYB es un potente indicador de que el MYB es un miembro de la familia de MYB del subgrupo 14. 5

Si una secuencia candidata a MYB del subgrupo 14 que coincide con el patrón general incluye además una coincidencia con el patrón absoluto (SEQ ID n.º 268), entonces la secuencia es un firme candidato para la inclusión como una secuencia de MYB del subgrupo 14. El patrón absoluto (SEQ ID n.º 268) representa restos de secuencia presentes en todas las secuencias de los MYB del subgrupo 14 analizadas hasta la fecha.

En los patrones general, exclusivo y absoluto (SEQ ID n.os 266-268) que se recogen a continuación, «X» hace 10 referencia a cualquier aminoácido, «X(N)», en donde N es cualquier número, hace referencia a una cadena del número indicado de «X», (a saber, (X(23) hace referencia a una cadena de 23 «X»), en donde X es cualquier aminoácido. En algunas posiciones se permite que haya muchos restos de aminoácidos en una localización determinada. Cuando se permiten muchos aminoácidos, los restos opcionales se indican entre corchetes.

Patrón general (SEQ ID n.º 266) 15

Patrón exclusivo (SEQ ID n.º 267)

Patrón absoluto (SEQ ID n.º 268)

20

Las secuencias de los MYB del subgrupo 14 se pueden definir mediante la secuencia consenso de la SEQ ID n.º 266. Se han identificado posiciones en las que los restos de aminoácidos se encuentran exclusiva o predominantemente en las secuencias de los MYB del subgrupo 14. En la siguiente descripción, todos los números de las posiciones se refieren a la proteína MYB68 de Arabidopsis (SEQ ID n.º 2), que está correlacionada con la secuencia consenso general de más arriba, SEQ ID n.º 266. 25

Dentro del dominio R2, en la posición 26, se conserva un resto cargado positivamente (K o R) en el MYB del subgrupo 14. Aunque este aminoácido no es exclusivo de este subgrupo en esta posición, la tendencia para el resto de las proteínas MYB de Arabidopsis es para un resto hidrófobo, puesto que más del 50% de las proteínas MYB tienen un resto hidrófobo de isoleucina o valina (Stracke et al., 2001).

En la posición 36, todos los miembros del subgrupo 14 contienen una inserción, que da lugar a un resto 30 aminoacídico extra. Esto es exclusivo de los MYB del subgrupo 14. La glicina (G), un resto hidrófobo pequeño, es el resto extra en todos los casos, salvo en MYB87 (SEQ ID n.º32), que contiene un resto de asparagina en esta posición, y un homólogo del arroz (SEQ ID n.º 194) que contiene una arginina en esta posición.

En la posición 39, los miembros de los MYB del subgrupo 14 contienen predominantemente un resto hidrófobo de isoleucina. Una excepción a esto es un homólogo del arroz identificado como SEQ ID n.º 191, que posee una 35 glutamina en esta posición. Aunque otros restos hidrófobos se encuentran por lo general en las proteínas MYB en esta posición, la isoleucina es exclusiva de los MYB del subgrupo 14. Adicionalmente, los restos cargados positivamente (39% de R) y los restos polares (23% de N) son los más prevalentes en esta posición.

Dentro del dominio R3, en la posición 68, todos los miembros de los MYB del subgrupo 14 contienen el resto de histidina cargado positivamente. Un resto cargado positivamente aparece en esta posición en todas las proteínas 40 MYB; sin embargo, a diferencia de los MYB del subgrupo 14, en las otras proteínas MYB, el 73% contiene una arginina (R) y el 17% contiene un resto de lisina.

En la posición 83, la mayoría de los miembros de los MYB del subgrupo 14 contienen un resto hidrófobo aromático (tirosina Y o fenilalanina F). La aparición de un resto hidrófobo aromático en esta posición parece ser exclusiva de

los MYB del subgrupo 14. La mayoría de las proteínas MYB tienen un resto de histidina (87%). Se ha sugerido que esta histidina es un resto crucial del núcleo hidrófobo de la hélice (Ogata et al., 1992). A través del análisis por RMN, parece estar en contacto con dos de los restos de triptófano críticos. La ausencia de una histidina en la posición 83 no lo excluye necesariamente como miembro de los MYB del subgrupo 14, ya que se han identificado miembros que poseen un resto de histidina, por ejemplo, SEQ ID n.º 169 y SEQ ID n.º 225. 5

En la posición 88, los miembros de los MYB del subgrupo 14 contienen el resto polar de serina, mientras que casi todas las demás proteínas MYB (91%) contienen el resto polar de asparagina. Un resto de serina es exclusivo de este subgrupo. La ausencia de una serina en la posición 88 no lo excluye necesariamente como miembro de los MYB del subgrupo 14, ya que se ha identificado que al menos un miembro de los MYB del subgrupo 14 posee un resto fenilalanina en la posición 88, por ejemplo, la SEQ ID n.º 256. 10

En la posición 112, los miembros de los MYB del subgrupo 14 contienen un resto de arginina o lisina cargado positivamente. La mayoría de las proteínas MYB también contienen restos cargados positivamente en esta posición, aunque la histidina (48%) es el resto hallado con más prevalencia. La ausencia de una arginina en la posición 112 no lo excluye necesariamente como un miembro de los MYB del subgrupo 14, ya que se ha identificado que al menos un miembro de los MYB del subgrupo 14 posee un resto de ácido glutámico en la posición 112, por ejemplo, 15 la SEQ ID n.º 68 contiene un resto de ácido glutámico y la SEQ ID n.º 191 contiene una treonina.

La variación dentro de un dominio R2R3 es permisible, tal y como se muestra en las secuencias consenso identificadas. Un dominio R2R3 de una secuencia de los MYB del subgrupo 14 puede ser homóloga al 90%, preferiblemente homóloga al 95%, o más preferiblemente homóloga al 99%, a la secuencia consenso presentada.

La adición de los motivos S1 y S2 20

Dentro de los MYB del subgrupo 14, las secuencias de MYB68 y MYB84 contienen dos motivos más conservados que se identifican como S1 (SEQ ID n.º 269) y S2 (SEQ ID n.º 270). Estos motivos se hallan en las secuencias de MYB68, MYB36 y MYB84 de Arabidopsis y de Brassica, y muestran al menos una homología del 70% en su secuencia de aminoácidos. Adicionalmente, se halló que existe homología con los motivos S1 y S2 en los ortólogos de Brassica napus (colza), Brassica rapa (repollo), Brassica oleracea, 25 Raphanus raphanistrum (rábano) y una homología con la región de S2 de Poncirus trifoliate (naranja), y homología débil con un homólogo de Medicago trunculata y un homólogo de Vitis vinifera (uva) dentro de la región S2. Para la inclusión como un motivo S1 o S2, las secuencias diana presentarán una homología de al menos el 70%, más preferiblemente del 80%, y lo más preferiblemente del 95%.

Las secuencias de MYB68 y MYB84 de especies que no sean Arabidopsis y Brassica podrían no contener un motivo 30 S1 y S2, pero todavía se podrían clasificar como una secuencia de MYB del subgrupo 14 basándose en el análisis de secuencias y la inclusión de otros criterios.

Identificación de homólogos de los miembros de los MYB del subgrupo 14, incluido MYB68

Se pueden hallar homólogos de una secuencia de los MYB del subgrupo 14 de Arabidopsis (tabla 1) o un MYB68 deseado (SEQ ID n.º 1, SEQ ID n.º 2) con el uso de una serie de programas informáticos públicos o comerciales que 35 conocen los expertos en la técnica. Se pueden realizar alineamientos con BLAST e identificar las posibles secuencias. Se pueden realizar búsquedas como se esboza en la presente memoria. Los homólogos mejores se determinan con programas tales como tblastn, tblastp, búsquedas en las bases de datos disponibles en el NCBI, tales como EST, GSS, HTG y bases de datos cromosómicas, así como otras bases de datos genómicas, tales como la base de datos de unigenes del TIGR, base de datos genómicas de cucurbitáceas (
http://
www.icugi.org/ ), girasol y 40 lechuga (
http://compgenomics.ucdavis.edu/compositae_index.php ), Medicago truncatula (International Medicago Genome Annotation Group), SGN (
http://www.sgn.cornell.edu/ ) y naranja (
http://harvest.ucr.edu/ ). En los casos en los que las especies eran mucho más divergentes, los parámetros de alineamiento, tales como los costes de los huecos y los valores de la matriz, se pueden cambiar adecuadamente.

Para confirmar el mejor acierto de AtMYB68 en cada especie es, de hecho, un homólogo de MYB68, se puede 45 realizar un BLAST recíproco, en el que el homólogo se compara con BLAST frente a todas las proteínas de Arabidopsis. En muchos casos, el acierto de Arabidopsis más cercano del homólogo es uno de los miembros de la familia del gen de MYB68 (un MYB del subgrupo 14) en vez del propio MYB68. En los casos en los que el homólogo está más próximo a una proteína de Arabidopsis fuera de la familia del gen de MYB68, se valora que el homólogo no será un miembro de los MYB del subgrupo 14. 50

Se pueden determinar marcos abiertos de lectura con programas informáticos, tales como «getorf» del programa EMBOSS, o ESTScan.

En Strackle et al., 2001 y en Kranz et al., 1998 se describen con detalle los métodos para identificar las secuencias de MYB, clasificar las secuencias de los MYB en los subgrupos designados, e identificar las secuencias de los MYB del subgrupo 14. 55

Los homólogos poco conservados entre especies muy divergentes a menudo no aparecen con los métodos de

BLAST tradicionales. En tales casos, existirán motivos, dominios y huellas genéticas conservados entre los homólogos, y son buenos predictores de la homología funcional. Existen muchos programas muy competentes a la hora de encontrar dominios conservados entre las especies mediante el uso de modelos ocultos de Markov, matrices de puntuación específicas de la posición y patrones.

PSI-Blast, PRATT, PHI-Blast y HMMBuild/HMMSearch. 5

PRATT es una herramienta proporcionada por la base de datos PROSITE. Genera patrones conservados de un grupo de proteínas conservadas
http://www.expasy.ch/prosite . Se utilizó PRATT para determinar un patrón conservado entre el MYB68 y sus homólogos más cercanos. ScanProsite y PHI-BLAST se utilizaron luego para buscar el patrón conservado en las bases de datos de proteínas de Swiss-Prot y del NCBI, respectivamente. Los resultados de la búsqueda se limitan a los alineamientos que también contienen el patrón. 10

HMMBuild se utilizó para construir un modelo oculto de Markov con MYB68 y sus homólogos. Se utilizó HMMSearch para barrer la base de datos del NCBI con el modelo oculto de Markov. Se encontraron proteínas parecidas a las obtenidas con búsqueda básica de blastp.

Con los métodos anteriores se encontraron homólogos del MYB68 en aproximadamente 50 especies vegetales diferentes. La homología se limitó en la mayoría de los casos al dominio de MYB del extremo amino para la fijación 15 al ADN. Existía homología en la región del extremo carboxilo menos conservado en los genes hallados en Brassica napus (colza), Brassica rapa (repollo), Brassica oleracea, Raphanus raphanistrum (rábano), Poncirus trifoliate (naranja) y poca homología con los genes encontrados en el homólogo de Medicago truncatula y Vitis vinifera (uva) dentro de la región de S2.

Los genes de Poncirus trifoliate y Brassica rapa se identificaron al descargar aciertos firmes de EST y 20 ensamblándolos con CAP3. Los contigs resultantes no codificaron una proteína completa. La secuencia del contig de naranja codificó una proteína parcial que abarca solo la región de S2 y, en Brassica rapa, se encontró una proteína parcial de 202 aminoácidos que abarcaba de las posiciones 1 a 202 en AtMYB68.

Una serie de programas informáticos han caracterizado el dominio MYB con los perfiles, patrones y modelos ocultos de Markov. Para confirmar la presencia del dominio MYB en una secuencia desconocida, se puede buscar si una 25 secuencia se ajusta a estos perfiles. InterProScan es particularmente útil, ya que proporciona una interfaz para interrogar 13 programas simultáneamente. Las bases de datos incorporadas en InterPro incluyen:

a) ProDom: Una base de datos de familias de dominios de proteínas. Construida por la agrupación de segmentos homólogos de la base de datos Swiss-Prot/TrEMBL, seguido por búsquedas recursivas con PSI-BLAST.

b) HMMTIGR: Familias de proteínas representadas por modelos ocultos de Markov. 30

c) TMHMM: Predicción de hélices transmembranarias en las proteínas.

d) FprintScan: Búsqueda de huellas genéticas en la base de datos PRINTS. Las huellas genéticas son familias de proteínas representadas por varios motivos.

e) ProfileScan: Perfiles de las secuencias relacionadas que forman una familia.

f) HMMPanther: Una base de datos de modelos ocultos de Markov. 35

g) HMMPIR: modelos ocultos de Markov basados en la relación evolutiva de proteínas enteras.

h) ScanRegExp: Barre la base de datos PROSITE que contiene patrones y perfiles.

i) Gene3D: una base de datos de proteínas que contiene información funcional.

j) HMMPfam: Familias de dominios de proteínas representadas por modelos ocultos de Markov.

k) Superfamily: una base de datos de anotaciones estructurales y funcionales de las proteínas para todos los 40 organismos completamente secuenciados.

l) HMMSmart: Permite identificar dominios móviles basados en los modelos ocultos de Markov.

m) SignalIP: Predice la presencia y la localización del sitio de escisión del péptido señal en las secuencias aminoacídicas.

Los bloques son segmentos sin huecos multialineados que corresponden a las regiones más conservadas de las 45 proteínas. El dominio MYB está representado por tres bloques. Como se esperaba, AtMYB68 contenía cada uno de estos tres bloques, así como 1 de los 5 bloques Wos2.

La invención se basa en parte en el descubrimiento de plantas que son tolerantes al estrés térmico. Se ha determinado el gen responsable del fenotipo termotolerante y se ha demostrado que es un gen de MYB68. En la

presente memoria se describen los métodos para producir una planta transgénica termotolerante. Específicamente, la invención identifica una familia génica de factores de transcripción, específicamente la familia de genes de los MYB, y en particular un MYB del subgrupo 14 que cuando se expresa en las plantas da lugar a plantas que son tolerantes al estrés térmico y que incrementan su rendimiento después del estrés térmico, o muestran tolerancia al estrés por sequía o al estrés salino. 5

Ejemplo 10: Identificación de los homólogos de MYB68

Los homólogos de la misma planta, de diferentes especies vegetales o de otros organismos se identificaron con las herramientas de búsqueda de secuencias en las bases de datos, tales como la herramienta de búsqueda de alineamientos locales básicos (BLAST, por su nombre en inglés) (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; y Altschul et al. (1997) Nucl. Acid. Res. 25: 3389-3402). Se emplearon los programas informáticos de análisis de 10 secuencias tblastn o blastn con la matriz de puntuaciones BLOSUM-62 (Henikoff, S. y Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919). La salida de un informe de BLAST da a conocer una puntuación que tiene en cuenta el alineamiento de restos idénticos o similares y de cualquier hueco necesario para alinear las secuencias. La matriz de puntuaciones asigna una puntuación para alinear cualquier posible pareja de secuencias. Los valores de P reflejan cuántas veces se espera ver que una puntuación se produzca por casualidad. Se prefieren las 15 puntuaciones más altas y se prefiere un umbral del valor de P bajo. Estos son los criterios de identidad de las secuencias. El programa del análisis de secuencias tblastn se utilizó para interrogar una secuencia polipeptídica frente a la traducción de las seis fases de cada secuencia en una base de datos de nucleótidos. Los aciertos con una valor de P de menos de –25, preferiblemente menos de –70, y lo más preferiblemente menos de –100, se identificaron como secuencias homólogas (criterios de secuencias seleccionadas de ejemplo). El programa de 20 análisis de secuencias blastn se utilizó para interrogar una base de datos de secuencias de nucleótidos con una secuencia de nucleótidos. En este caso también, se prefirieron puntuaciones más altas y un valor de P de umbral preferido era de menos de –13, preferiblemente de menos de –50 y más preferiblemente de menos de –100.

Como alternativa, un fragmento de una secuencia de las SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 25 88, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265 está radiomarcado con 32P mediante cebado aleatorio (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning. A 30 Laboratory Manual, 2.ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y se utilizan para escrutar una genoteca genómica vegetal (los polinucleótidos problema de ejemplo). Como ejemplo, el ADN vegetal total de Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Lycopersicon pimpinellifolium, Prunus avium, Prunus cerasus, Cucumis sativus u Oryza sativa se aislaron de acuerdo con Stockinger et al. (Stockinger, E. J. et al. (1996) J. Heredity, 87: 214-218). Aproximadamente de 2 a 10 µg de cada muestra de ADN se dirigieren por restricción, se transfieren a una 35 membrana de nilón (Micron Separations, Westboro, Mass.) y se hibridan. Las condiciones de hibridación son: 42 ºC en formamida al 50%, SSC a 5× , tampón de fosfato a 20 mM, Denhardt a 1×, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de arenque a 100 µg/ml. Se realizan cuatro lavados con un rigor bajo a la TA en SSC a 2×, sarcosil de sodio al 0,05% y pirofosfato de sodio al 0,02% antes de los lavados muy rigurosos a 55 ºC en SSC a 0,2×, sarcosil de sodio al 0,05% y pirofosfato de sodio al 0,01%. Se realizan lavados muy rigurosos hasta que no se detectaron 40 cuentas en el lavado de acuerdo con Walling et al. (Walling, L. L. et al. (1988) Nucl. Acids. Res. 16: 10477-10492).

Ejemplo 11: Identificación de las características técnicas de MYB68

Se puede identificar un gen de MYB68 mediante la identificación de genes que tienen una elevada homología con MYB68 de Arabidopsis (SEQ ID n.º 1). Además de por tener una homología de secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, se pueden identificar los genes candidatos que comparten la estructura conformacional de la proteína. 45 Tales motivos estructurales pueden ayudar a la identificación de proteínas relacionadas y su estructura, y las relaciones funcionales.

Ejemplo 12: Confirmación funcional de los homólogos

Los homólogos candidatos se introducen en Arabidopsis y se les valora la termotolerancia. Los genes descritos como SEQ ID n.os 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 50 56, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 134, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263 y 265 se expresan en las plantas de 55 Arabidopsis y se les valora la termotolerancia tal y como se describe en la presente memoria. Facultativamente, la expresión de una secuencia candidata a MYB del subgrupo 14 que coincide con el patrón general incluye además una coincidencia con el patrón exclusivo, entonces la secuencia es un firme candidato para la inclusión como genes de los MYB del subgrupo 14, o se pueden evaluar los genes de MYB68 en cualquier especie transformable, por ejemplo, Brassica, maíz, algodón, soja o arroz. Ejemplos de tales análisis funcionales se han dado a conocer en esta 60

descripción.

Se observa que algunas de las secuencias descritas en la presente memoria están completas. Se pueden obtener secuencias completas mediante los métodos moleculares estándares conocidos por los expertos en la técnica. Las secuencias completas se pueden expresar, entonces, tal y como se describe en la presente memoria.

Lista de secuencias

<110> Performance Plants, Inc.

<120> Plantas que tienen incrementada la tolerancia al estrés térmico 5

<130> 22542-014001WO

<150> 60/925312 <151> 2007-04-18

<150> 60/965582 <151> 2007-08-20

<160> 325

<170> PatentIn version 3.5 15

<210> 1

<211> 1125

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana 20

<400> 1

<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 933

<212> DNA 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

10

<210> 4

<211> 310

<212> PRT 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

10

<210> 5

<211> 1002

<212> DNA 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

10

<210> 6

<211> 333

<212> PRT 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

10

<210> 7

<211> 1092

<212> DNA 5

<213> Brassica rapa

<400> 7

<210> 8

<211> 363

<212> PRT 5

<213> Brassica rapa

<400> 8

10

<210> 9

<211> 966

<212> DNA 5

<213> Oryza sativa

<400> 9

10

<210> 10

<211> 321

<212> PRT

<213> Oryza sativa 15

<400> 10

<210> 11

<211> 1071

<212> DNA 5

<213> Gossypium

<400> 11

10

<210> 12

<211> 356

<212> PRT

<213> Gossypium

<400> 12

<210> 13

<211> 596

<212> DNA 5

<213> Glycine max

<400> 13

10

<210> 14

<211> 198

<212> PRT 5

<213> Glycine max

<400> 14

10

<210> 15

<211> 1463

<212> DNA 5

<213> Glycine max

<400> 15

10

<210> 16

<211> 355

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 16 5

<210> 17

<211> 395

<212> DNA 5

<213> Zea mays

<400> 17

10

<210> 18

<211> 131 15

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 18

<210> 19

<211> 471

<212> DNA 10

<213> Sorghum bicolor

<400> 19

15

<210> 20

<211> 157 20

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor

<400> 20

<210> 21

<211> 525 5

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 21

<210> 22

<211> 175

<212> PRT 15

<213> Triticum aestivum

<400> 22

<210> 23

<211> 1035

<212> DNA 10

<213> Populus

<400> 23

<210> 24

<211> 344

<212> PRT 5

<213> Populus

<400> 24

<210> 25

<211> 537

<212> DNA 5

<213> Medicago truncatula

<400> 25

10

<210> 26

<211> 178

<212> PRT

<213> Medicago truncatula 15

<400> 26

<210> 27

<211> 948

<212> DNA 5

<213> Solanum laciniatum

<400> 27

10

<210> 28

<211> 315

<212> PRT 5

<213> Solanum lycopersicum

<400> 28

10

<210> 29

<211> 714

<212> DNA 5

<213> Solanum lycopersicum

<400> 29

10

<210> 30

<211> 237

<212> PRT 5

<213> Solanum lycopersicum

<400> 30

10

<210> 31

<211> 918

<212> DNA 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 31

10

<210> 32

<211> 305 15

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 32

5

<210> 33

<211> 990

<212> DNA 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 33

10

<210> 34

<211> 329

<212> PRT 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 34

10

<210> 35

<211> 897

<212> DNA 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 35

10

<210> 36

<211> 298

<212> PRT 5

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 36

10

<210> 37

<211> 622

<212> DNA 5

<213> Aegilops speltoides

<400> 37

10

<210> 38

<211> 693

<212> DNA

<213> Antirrhinum majus

<400> 38 5

<210> 39

<211> 231 10

<212> PRT

<213> Antirrhinum majus

<400> 39

<210> 40

<211> 1050

<212> DNA 5

<213> Aquilegia

<400> 40

10

<210> 41

<211> 350

<212> PRT 5

<213> Aquilegia

<400> 41

10

<210> 42

<211> 1005

<212> DNA 5

<213> Aquilegia

<400> 42

<210> 43

<211> 335

<212> PRT 5

<213> Aquilegia

<400> 43

10

<210> 44 5

<211> 435

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (335)..(335) 5

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (340)..(340) 10

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (377)..(377) 15

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (389)..(389) 20

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (414)..(414) 25

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (424)..(424) 30

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (433)..(433) 35

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<400> 44

40

<210> 45

<211> 145 45

<212> PRT

<213> Arachis hypogaea

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA 50

<222> (112)..(112)

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA 55

<222> (114)..(114)

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA 5

<222> (126)..(126)

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA 10

<222> (130)..(130)

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA 15

<222> (138)..(138)

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA 20

<222> (142)..(142)

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA 25

<222> (145)..(145)

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<400> 45

<210> 46

<211> 476

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea

<400> 46

<210> 47 10

<211> 159

<212> PRT

<213> Arachis hypogaea

<400> 47 15

<210> 48

<211> 744

<212> DNA

<213> Arachis stenosperma 5

<400> 48

<210> 49

<211> 248

<212> PRT 15

<213> Arachis stenosperma

<400> 49

<210> 50 5

<211> 477

<212> DNA

<213> Brachypodium distachyon

<400> 50 10

<210> 51

<211> 159

<212> PRT 5

<213> Brachypodium distachyon

<400> 51

10

<210> 52

<211> 717 15

<212> DNA

<213> Brachypodium distachyon

<400> 52

<210> 53

<211> 239

<212> PRT 5

<213> Brachypodium distachyon

<400> 53

<210> 54 5

<211> 1092

<212> DNA

<213> Brassica napus

<400> 54 10

<210> 55

<211> 363

<212> PRT 5

<213> Brassica napus

<400> 55

10

<210> 56

<211> 1116

<212> DNA 5

<213> Brassica napus

<400> 56

10

<210> 57

<211> 371

<212> PRT 5

<213> Brassica napus

<400> 57

10

<210> 58

<211> 1454

<212> DNA 5

<213> Brassica napus

<400> 58

10

<210> 59

<211> 753

<212> DNA 5

<213> Brassica napus

<400> 59

10

<210> 60

<211> 251

<212> PRT 5

<213> Brassica napus

<400> 60

10

<210> 61

<211> 864

<212> DNA 5

<213> Brassica napus

<400> 61

10

<210> 62

<211> 288

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 62 5

<210> 63

<211> 792

<212> DNA 5

<213> Brassica rapa

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (760)..(760) 10

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<400> 63

15

<210> 64

<211> 264 20

<212> PRT

<213> Brassica rapa

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (254)..(254)

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<400> 64 5

<210> 65

<211> 558

<212> DNA 5

<213> Brassica rapa

<400> 65

10

<210> 66

<211> 186

<212> PRT

<213> Brassica rapa 15

<400> 66

<210> 67

<211> 501

<212> DNA 5

<213> Carthamus tinctorius

<400> 67

10

<210> 68

<211> 167

<212> PRT 5

<213> Carthamus tinctorius

<400> 68

10

<210> 69

<211> 749

<212> DNA

<213> Carthamus tinctorius 15

<400> 69

<210> 70

<211> 250

<212> PRT 5

<213> Carthamus tinctorius

<400> 70

10

<210> 71

<211> 648

<212> DNA 5

<213> Centaurea maculosa

<400> 71

10

<210> 72

<211> 216

<212> PRT 5

<213> Centaurea maculosa

<400> 72

10

<210> 73

<211> 693

<212> DNA 5

<213> Centaurea maculosa

<400> 73

10

<210> 74

<211> 231

<212> PRT

<213> Centaurea maculosa 15

<400> 74

<210> 75

<211> 651

<212> DNA 5

<213> Centaurea maculosa

<400> 75

10

<210> 76

<211> 217

<212> PRT 5

<213> Centaurea maculosa

<400> 76

10

<210> 77

<211> 732

<212> DNA 5

<213> Centaurea solstitialis

<400> 77

10

<210> 78

<211> 244

<212> PRT

<213> Centaurea solstitialis 15

<400> 78

<210> 79

<211> 675

<212> DNA 5

<213> Centaurea solstitialis

<400> 79

<210> 80

<211> 225

<212> PRT 5

<213> Centaurea solstitialis

<400> 80

10

<210> 81

<211> 783

<212> DNA 5

<213> Centaurea solstitialis

<400> 81

10

<210> 82

<211> 261

<212> PRT 5

<213> Centaurea solstitialis

<400> 82

10

<210> 83

<211> 768

<212> DNA 5

<213> Cichorium endivia

<400> 83

10

<210> 84

<211> 256

<212> PRT

<213> Cichorium endivia 15

<400> 84

<210> 85 5

<211> 639

<212> DNA

<213> Cichorium intybus

<400> 85 10

<210> 86

<211> 213

<212> PRT 5

<213> Cichorium intybus

<400> 86

10

<210> 87

<211> 832

<212> DNA 5

<213> Cichorium intybus

<400> 87

10

<210> 88

<211> 435

<212> DNA 5

<213> Citrus sinensis

<400> 88

10

<210> 89

<211> 145

<212> PRT

<213> Citrus sinensis 15

<400> 89

<210> 90

<211> 685

<212> DNA 5

<213> Coffea canephora

<400> 90

10

<210> 91

<211> 731

<212> DNA

<213> Coffea canephora 15

<400> 91

<210> 92

<211> 711

<212> DNA 5

<213> Cucumis melo

<400> 92

10

<210> 93

<211> 237

<212> PRT

<213> Cucumis melo 15

<400> 93

<210> 94 5

<211> 831

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 94 10

<210> 95

<211> 277

<212> PRT 5

<213> Cucumis melo

<400> 95

10

<210> 96

<211> 939

<212> DNA 5

<213> Daucus carota

<400> 96

<210> 97

<211> 313

<212> PRT 5

<213> Daucus carota

<400> 97

10

<210> 98

<211> 744

<212> DNA 5

<213> Elaeis guineensis

<400> 98

<210> 99

<211> 248

<212> PRT 5

<213> Elaeis guineensis

<400> 99

10

<210> 100

<211> 369

<212> DNA 5

<213> Elaeis oleífera

<400> 100

10

<210> 101

<211> 123

<212> PRT

<213> Elaeis oleífera 15

<400> 101

<210> 102

<211> 303

<212> DNA 5

<213> Eschscholzia califórnica

<400> 102

10

<210> 103

<211> 101

<212> PRT

<213> Eschscholzia califórnica 15

<400> 103

<210> 104

<211> 332

<212> DNA 5

<213> Euphorbia ésula

<400> 104

10

<210> 105

<211> 111

<212> PRT

<213> Euphorbia ésula 15

<400> 105

<210> 106

<211> 771

<212> DNA 5

<213> Euphorbia esula

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (747)..(747) 10

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (748)..(748) 15

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (749)..(749) 20

<223> n puede ser cualquier nucleótido

<400> 106

25

<210> 107

<211> 257

<212> PRT 5

<213> Euphorbia esula

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (249)..(249) 10

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (250)..(250) 15

<223> X puede ser cualquier aminoácido

<400> 107

20

<210> 108

<211> 649

<212> DNA 5

<213> Euphorbia tirucalli

<400> 108

10

<210> 109

<211> 671 15

<212> DNA

<213> Ginkgo biloba

<400> 109

<210> 110

<211> 1068

<212> DNA 10

<213> Glycine max

<400> 110

15

<210> 111

<211> 355

<212> PRT 5

<213> Glycine max

<400> 111

10

<210> 112

<211> 444

<212> DNA 5

<213> Glycine max

<400> 112

<210> 113

<211> 148

<212> PRT 5

<213> Glycine max

<400> 113

10

<210> 114

<211> 627 15

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 114

<210> 115

<211> 209 5

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 115

<210> 116

<211> 684

<212> DNA 5

<213> Glycine max

<400> 116

10

<210> 117

<211> 228 15

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 117

<210> 118

<211> 1068

<212> DNA 10

<213> Gossypium

<400> 118

<210> 119

<211> 356

<212> PRT 5

<213> Gossypium

<400> 119

<210> 120

<211> 633

<212> DNA 5

<213> Gossypium

<400> 120

10

<210> 121

<211> 211

<212> PRT

<213> Gossypium 15

<400> 121

<210> 122 5

<211> 542

<212> DNA

<213> Hedyotis terminalis

<400> 122 10

<210> 123

<211> 181

<212> PRT 5

<213> Hedyotis terminalis

<400> 123

10

<210> 124

<211> 616

<212> DNA 5

<213> Helianthus annuus

<400> 124

10

<210> 125

<211> 645

<212> DNA

<213> Helianthus argophyllus 15

<400> 125

<210> 126

<211> 215

<212> PRT 5

<213> Helianthus argophyllus

<400> 126

10

<210> 127

<211> 716

<212> DNA 5

<213> Helianthus argophyllus

<400> 127

10

<210> 128

<211> 239

<212> PRT

<213> Helianthus argophyllus 15

<400> 128

<210> 129

<211> 803

<212> DNA 5

<213> Helianthus ciliaris

<400> 129

<210> 130

<211> 684

<212> DNA 5

<213> Helianthus exilis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (631)..(631) 10

<223> n es cualquier nucleótido

<400> 130

15

<210> 131

<211> 228 20

<212> PRT

<213> Helianthus exilis

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (211)..(211)

<223> X es cualquier aminoácido 5

<400> 131

<210> 132

<211> 654

<212> DNA

<213> Helianthus exilis

<400> 132 5

<210> 133

<211> 218 10

<212> PRT

<213> Helianthus exilis

<400> 133

<210> 134

<211> 840

<212> DNA 5

<213> Helianthus paradoxus

<400> 134

10

<210> 135

<211> 429

<212> DNA 5

<213> Helianthus petiolaris

<400> 135

10

<210> 136

<211> 143

<212> PRT

<213> Helianthus petiolaris 15

<400> 136

<210> 137

<211> 723

<212> DNA 5

<213> Helianthus petiolaris

<400> 137

10

<210> 138

<211> 241 15

<212> PRT

<213> Helianthus petiolaris

<400> 138

5

<210> 139

<211> 758

<212> DNA

<213> Helianthus tuberosus 10

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (612)..(612)

<223> n es cualquier nucleótido 5

<400> 139

<210> 140

<211> 253

<212> PRT

<213> Helianthus tuberosus

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (204)..(204)

<223> X es cualquier aminoácido

<400> 140

<210> 141 5

<211> 473

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare

<400> 141 10

<210> 142

<211> 158

<212> PRT 5

<213> Hordeum vulgare

<400> 142

10

<210> 143

<211> 792 15

<212> DNA

<213> Humulus lupulus

<400> 143

<210> 144

<211> 264

<212> PRT 5

<213> Humulus lupulus

<400> 144

10

<210> 145 5

<211> 783

<212> DNA

<213> Lactuca perennis

<220> 10

<221> característica_miscelánea

<222> (709)..(709)

<223> n es cualquier nucleótido

<400> 145

<210> 146

<211> 261

<212> PRT 10

<213> Lactuca perennis

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (237)..(237) 15

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (247)..(247) 20

<400> 146

<210> 147 5

<211> 756

<212> DNA

<213> Lactuca saligna

<400> 147

5

<210> 148

<211> 252

<212> PRT

<213> Lactuca saligna 10

<400> 148

<210> 149

<211> 774

<212> DNA 5

<213> Lactuca sativa

<400> 149

10

<210> 150

<211> 258

<212> PRT 5

<213> Lactuca sativa

<400> 150

10

<210> 151

<211> 816

<212> DNA 5

<213> Lactuca sativa

<400> 151

10

<210> 152

<211> 272

<212> PRT 5

<213> Lactuca sativa

<400> 152

10

<210> 153

<211> 750

<212> DNA 5

<213> Lactuca sativa

<400> 153

10

<210> 154

<211> 250

<212> PRT

<213> Lactuca sativa 15

<400> 154

<210> 155 5

<211> 893

<212> DNA

<213> Lactuca serriola

<400> 155 10

<210> 156

<211> 702

<212> DNA 5

<213> Lactuca virosa

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (566)..(566) 10

<223> n es cualquier nucleótido

<400> 156

15

<210> 157

<211> 234 20

<212> PRT

<213> Lactuca virosa

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (189)..(189) 5

<223> X es cualquier aminoácido

<400> 157

10

<210> 158

<211> 867 15

<212> DNA

<213> Lactuca virosa

<400> 158

<210> 159 10

<211> 289

<212> PRT

<213> Lactuca virosa

<400> 159 15

<210> 160

<211> 392

<212> DNA 5

<213> Liriodendron tulipifera

<400> 160

10

<210> 161

<211> 131

<212> PRT

<213> Liriodendron tulipifera 15

<400> 161

<210> 162

<211> 563

<212> DNA 5

<213> Malus domestica

<400> 162

10

<210> 163

<211> 188

<212> PRT

<213> Malus domestica 15

<400> 163

<210> 164

<211> 1044

<212> DNA 5

<213> Malus domestica

<400> 164

<210> 165

<211> 348

<212> PRT 5

<213> Malus domestica

<400> 165

10

<210> 166

<211> 596

<212> DNA

<213> Manihot esculenta

<400> 166

<210> 167 10

<211> 199

<212> PRT

<213> Manihot esculenta

<400> 167 15

<210> 168

<211> 543

<212> DNA 5

<213> Marchantia polymorpha

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (421)..(421) 10

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (436)..(436) 15

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (478)..(478) 20

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (493)..(493) 25

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (505)..(505) 30

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (509)..(509) 35

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (514)..(514) 5

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (522)..(522) 10

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (523)..(523) 15

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (529)..(529) 20

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (529)..(529) 25

<223> n es cualquier nucleótido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (541)..(541) 30

<223> n es cualquier nucleótido

<400> 168

35

<210> 169

<211> 181

<212> PRT

<213> Marchantia polymorpha 40

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (141)..(141)

<223> X es cualquier aminoácido 45

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (146)..(146)

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (160)..(160) 5

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (165)..(165) 10

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (169)..(169) 15

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (170)..(170) 20

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (172)..(172) 25

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (175)..(175) 30

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (177)..(177) 35

<223> X es cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (181)..(181) 40

<223> X es cualquier aminoácido

<400> 169

45

<210> 170

<211> 1050

<212> DNA 5

<213> Medicago truncatula

<400> 170

10

<210> 171

<211> 350

<212> PRT 5

<213> Medicago truncatula

<400> 171

10

<210> 172

<211> 576

<212> DNA 5

<213> Medicago truncatula

<400> 172

<210> 173

<211> 192

<212> PRT 5

<213> Medicago truncatula

<400> 173

10

<210> 174

<211> 596

<212> DNA 5

<213> Nuphar advena

<400> 174

10

<210> 175

<211> 199

<212> PRT

<213> Nuphar advena 15

<400> 175

<210> 176

<211> 795

<212> DNA 5

<213> Oryza sativa

<400> 176

10

<210> 177

<211> 264

<212> PRT 5

<213> Oryza sativa

<400> 177

10

<210> 178

<211> 957

<212> DNA 5

<213> Oryza sativa

<400> 178

10

<210> 179

<211> 318

<212> PRT 5

<213> Oryza sativa

<400> 179

10

<210> 180

<211> 897

<212> DNA 5

<213> Oryza sativa

<400> 180

10

<210> 181

<211> 298

<212> PRT 5

<213> Oryza sativa

<400> 181

10

<210> 182

<211> 1692

<212> DNA 5

<213> Oryza sativa

<400> 182

10

<210> 183

<211> 563

<212> PRT 5

<213> Oryza sativa

<400> 183

10

<210> 184 5

<211> 870

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 184

<210> 185

<211> 289

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 185

<210> 186 5

<211> 951

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 186

<210> 187

<211> 316

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 187

<210> 188

<211> 1134

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 188

<210> 189 10

<211> 377

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 189 15

<210> 190

<211> 885

<212> DNA 5

<213> Oryza sativa

<400> 190

10

<210> 191

<211> 294

<212> PRT 5

<213> Oryza sativa

<400> 191

10

<210> 192

<211> 807

<212> DNA 5

<213> Picea

<400> 192

10

<210> 193

<211> 269

<212> PRT

<213> Picea 5

<400> 193

<210> 194

<211> 495

<212> DNA 5

<213> Picea

<400> 194

10

<210> 195

<211> 165

<212> PRT

<213> Picea 15

<400> 195

<210> 196

<211> 827

<212> DNA 5

<213> Pinus

<400> 196

10

<210> 197

<211> 276

<212> PRT 5

<213> Pinus

<400> 197

10

<210> 198

<211> 1245

<212> DNA 5

<213> Pinus

<400> 198

10

<210> 199

<211> 415

<212> PRT 5

<213> Pinus

<400> 199

10

<210> 200 5

<211> 681

<212> DNA

<213> Poncirus trifoliata

<400> 200

5

<210> 201

<211> 227

<212> PRT

<213> Poncirus trifoliata 10

<400> 201

<210> 202

<211> 423

<212> DNA 5

<213> Populus

<400> 202

10

<210> 203

<211> 345 15

<212> PRT

<213> Populus

<400> 203

5

<210> 204

<211> 572

<212> DNA 5

<213> Populus

<400> 204

10

<210> 205

<211> 191 15

<212> PRT

<213> Populus

<400> 205

5

<210> 206

<211> 999

<212> DNA

<213> Populus 10

<400> 206

<210> 207

<211> 333

<212> PRT 5

<213> Populus

<400> 207

10

<210> 208

<211> 387

<212> DNA

<213> Quercus petraea

<400> 208

<210> 209 10

<211> 129

<212> PRT

<213> Quercus petraea

<400> 209 15

<210> 210

<211> 547

<212> DNA

<213> Quercus suber

<400> 210

<210> 211

<211> 648

<212> DNA 5

<213> Raphanus raphanistrum

<400> 211

10

<210> 212

<211> 216 15

<212> PRT

<213> Raphanus raphanistrum

<400> 212

<210> 213 5

<211> 846

<212> DNA

<213> Raphanus raphanistrum

<400> 213 10

<210> 214

<211> 522

<212> DNA 5

<213> Raphanus raphanistrum

<400> 214

10

<210> 215

<211> 174 15

<212> PRT

<213> Raphanus raphanistrum

<400> 215

<210> 216

<211> 842

<212> DNA 5

<213> Raphanus raphanistrum

<400> 216

<210> 217

<211> 788

<212> DNA 5

<213> Raphanus sativus

<400> 217

10

<210> 218

<211> 731 15

<212> DNA

<213> Rosa hybrida

<400> 218

<210> 219

<211> 244

<212> PRT

<213> Rosa hybrida

<400> 219

<210> 220

<211> 362

<212> DNA 5

<213> Saccharum officinarum

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (207)..(207) 10

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (207)..(207)

<223> n es cualquier nucleótido 15

<400> 220

<210> 221

<211> 121 5

<212> PRT

<213> Saccharum officinarum

<400> 221

<210> 222 15

<211> 393

<212> DNA

<213> Saccharum officinarum

<220> 20

<221> característica_miscelánea

<222> (296)..(296)

<223> n es cualquier nucleótido

<220> 25

<221> característica_miscelánea

<222> (351)..(351)

<223> n es cualquier nucleótido

<400> 222

<210> 223 5

<211> 131

<212> PRT

<213> Saccharum officinarum

<220> 10

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (99)..(99)

<223> X es cualquier aminoácido

<400> 223 15

<210> 224

<211> 726

<212> DNA

<213> Saccharum officinarum

<400> 224

<210> 225

<211> 242 5

<212> PRT

<213> Saccharum officinarum

<400> 225

<210> 226 5

<211> 413

<212> DNA

<213> Secale cereale

<400> 226 10

<210> 227

<211> 138 5

<212> PRT

<213> Secale cereale

<400> 227

<210> 228 15

<211> 555

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 228 20

<210> 229

<211> 185

<212> PRT 5

<213> Solanum lycopersicum

<400> 229

10

<210> 230

<211> 476

<212> DNA 5

<213> Solanum tuberosum

<400> 230

10

<210> 231

<211> 159

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum 15

<400> 231

<210> 232

<211> 471

<212> DNA 5

<213> Sorghum bicolor

<400> 232

10

<210> 233

<211> 157

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor 15

<400> 233

<210> 234

<211> 609

<212> DNA 5

<213> Sorghum bicolor

<400> 234

10

<210> 235

<211> 203

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor

<400> 235 5

<210> 236

<211> 396

<212> DNA

<213> Sorghum propinquum

<400> 236

<210> 237

<211> 132

<212> PRT 5

<213> Sorghum propinquum

<400> 237

10

<210> 238

<211> 803 15

<212> DNA

<213> Taraxacum officinale

<400> 238

<210> 239

<211> 268

<212> PRT 5

<213> Taraxacum officinale

<400> 239

10

<210> 240 5

<211> 632

<212> DNA

<213> Triphysaria pusilla

<400> 240 10

<210> 241

<211> 211

<212> PRT 5

<213> Triphysaria pusilla

<400> 241

10

<210> 242

<211> 651

<212> DNA 5

<213> Triphysaria pusilla

<400> 242

10

<210> 243

<211> 217 15

<212> PRT

<213> Triphysaria pusilla

<400> 243

<210> 244

<211> 636

<212> DNA 10

<213> Triphysaria pusilla

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (609)..(609) 15

<223> n es cualquier nucleótido

<400> 244

<210> 245

<211> 212

<212> PRT 5

<213> Triphysaria pusilla

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (203)..(203) 10

<223> X es cualquier aminoácido

<400> 245

15

<210> 246

<211> 419

<212> DNA 5

<213> Triphysaria versicolor

<400> 246

10

<210> 247

<211> 606

<212> DNA

<213> Triphysaria versicolor

<400> 247 5

<210> 248

<211> 202 10

<212> PRT

<213> Triphysaria versicolor

<400> 248

<210> 249

<211> 903

<212> DNA 5

<213> Tricticum aestivum

<400> 249

10

<210> 250

<211> 300

<212> PRT 5

<213> Tricticum aestivum

<400> 250

10

<210> 251

<211> 648

<212> DNA 5

<213> Vaccinium corymbosum

<400> 251

10

<210> 252

<211> 216 15

<212> PRT

<213> Vaccinium corymbosum

<400> 252

5

<210> 253

<211> 1020

<212> DNA

<213> Vitis vinífera 10

<400> 253

<210> 254

<211> 339

<212> PRT 5

<213> Vitis vinífera

<400> 254

10

<210> 255

<211> 1101

<212> DNA 5

<213> Vitis vinífera

<400> 255

10

<210> 256

<211> 366 15

<212> PRT

<213> Vitis vinífera

<400> 256

<210> 257

<211> 1023

<212> DNA 5

<213> Vitis vinífera

<400> 257

10

<210> 258

<211> 340

<212> PRT 5

<213> Vitis vinífera

<400> 258

10

<210> 259

<211> 510

<212> DNA 5

<213> Vitis vinífera

<400> 259

<210> 260

<211> 170

<212> PRT 5

<213> Vitis vinífera

<400> 260

10

<210> 261

<211> 944 15

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 261

<210> 262

<211> 314

<212> PRT 10

<213> Zea mays

<400> 262

15

<210> 263

<211> 1083

<212> DNA 5

<213> Zea mays

<400> 263

10

<210> 264

<211> 361

<212> PRT

<213> Zea mays 15

<400> 264

<210> 265

<211> 1259

<212> DNA 5

<213> Oryza sativa

<400> 265

10

<210> 266

<211> 116

<212> PRT 5

<213> Arabidopsis Thaliana

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (4)..(4) 10

<223> X en posición 4 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (9)..(9) 15

<223> X en posición 9 puede ser lisina o arginina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (10)..(11) 20

<223> X en posiciones 10 y 11 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (12)..(12) 25

<223> X en posición 12 puede ser metionina o valina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (14)..(14) 30

<223> X en posición 14 puede ser arginina o lisina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (16)..(16) 35

<223> X en posición 16 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (18)..(18) 40

<223> X en posición 18 puede ser serina o alanina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (19)..(19) 45

<223> X en posición 19 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (20).. (20) 5

<223> X en posición 20 puede ser ácido aspártico, glutamina o ácido glutámico

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (23)..(24) 10

<223> X en posiciones 23 y 24 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (25)..(25) 15

<223> X en posición 25 puede ser isoleucina o leucina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (26)..(26) 20

<223> X en posición 26 puede ser arginina o lisina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (27)..(27) 25

<223> X en posición 27 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (28)..(28) 30

<223> X en posición 28 puede ser fenilalanina o tirosina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (29)..(32) 35

<223> X en posiciones 29-32 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (34)..(36) 40

<223> X en posiciones 34-36 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (37)...(37) 45

<223> X en posición 37 puede ser serina o asparagina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (40)..(41) 50

<223> X en posiciones 40-41 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (43)..(43) 55

<223> X en posición 43 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (44)..(44) 60

<223> X en posición 44 puede ser arginina o lisina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (45)..(45) 65

<223> X en posición 45 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (47)..(47)

<223> X en posición 47 puede ser isoleucina o leucina 5

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (48)..(48)

<223> X en posición 48 puede ser cualquier aminoácido 10

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (52)..(52)

<223> X en posición 52 puede ser lisina o arginina 15

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (59)..(59)

<223> X en posición 59 puede ser isoleucina o leucina 20

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (65)..(65)

<223> X en posición 65 puede ser cualquier aminoácido 25

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (66)..(66)

<223> X en posición 66 puede ser isoleucina o leucina 30

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (67)..(67)

<223> X en posición 67 puede ser arginina o lisina 35

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (70)..(70)

<223> X en posición 70 puede ser cualquier aminoácido 40

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (71)..(71)

<223> X en posición 71 puede ser fenilalanina o tirosina 45

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (72)..(72)

<223> X en posición 72 puede ser serina o treonina 50

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (73)..(74)

<223> X en posiciones 73-74 puede ser cualquier aminoácido 55

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (76)..(76)

<223> X en posición 76 puede ser ácido aspártico o ácido glutámico 60

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (77)..(78)

<223> X en posiciones 77-78 puede ser cualquier aminoácido 65

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (79)..(79)

<223> X en posición 79 puede ser isoleucina o valina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (80)..(82)

<223> X en posiciones 80-82 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (83)..(83)

<223> X en posición 83 puede ser fenilalanina o tirosina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (84)..(86)

<223> X en posiciones 84-86 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (89)..(89)

<223> X en posición 89 puede ser lisina o arginina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (92)..(92)

<223> X en posición 92 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (93)..(93)

<223> X en posición 93 puede ser metionina o isoleucina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (95)..(96)

<223> X en posiciones 95-96 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (97)..(97)

<223> X en posición 97 puede ser metionina o leucina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (98)..(99)

<223> X en posiciones 98-99 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (105)..(105)

<223> X en posición 105 puede ser isoleucina, leucina o valina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (108)..(108)

<223> X en posición 108 puede ser histidina o tirosina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (110)..(110)

<223> X en posición 110 puede ser ácido aspártico o asparagina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (111)..(111)

<223> X en posición 111 puede ser serina o treonina

<220> 5

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (112)..(112)

<223> X en posición 112 puede ser arginina o lisina

<220> 10

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (114)..(114)

<223> X en posición 114 puede ser arginina o lisina

<220> 15

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (115)..(115)

<223> X en posición 115 puede ser arginina o lisina

<220> 20

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (116)..(116)

<223> X en posición 116 puede ser arginina o lisina

<400> 266 25

<210> 267

<211> 87

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (1)..(1)

<223> X en posición 1 puede ser arginina o lisina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (2)..(10)

<223> X en posiciones 2-10 puede ser cualquier aminoácido

<220> 5

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (12)..(13)

<223> X en posiciones 12-13 puede ser cualquier aminoácido

<220> 10

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (15)..(42)

<223> X en posiciones 15-42 puede ser cualquier aminoácido

<220> 15

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (44)..(57)

<223> X en posiciones 44-57 puede ser cualquier aminoácido

<220> 20

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (58)..(58)

<223> X en posición 58 puede ser tirosina o fenilalanina

<220> 25

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (59)..(62)

<223> X en posiciones 59-62 puede ser cualquier aminoácido

<220> 30

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (64)..(86)

<223> X en posiciones 64-86 puede ser cualquier aminoácido

<220> 35

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (87)..(87)

<223> X en posición 87 puede ser arginina o lisina

<400> 267 40

<210> 268

<211> 87 45

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (2)..(2) 5

<223> X en posición 2 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (4)..(6) 10

<223> X en posiciones 4-6 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (9)..(10) 15

<223> X en posiciones 9-10 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (11)..(11) 20

<223> X en posición 11 puede ser isoleucina o leucina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (12)..(12) 25

<223> X en posición 12 puede ser arginina o lisina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (13)..(18) 30

<223> X en posiciones 13-18 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (20)..(42) 35

<223> X en posiciones 20-42 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (45)..(45) 40

<223> X en posición 45 puede ser isoleucina o leucina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (51)..(51) 45

<223> X en posición 51 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (52)..(52) 50

<223> X en posición 52 puede ser isoleucina o leucina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (53)..(53) 55

<223> X en posición 53 puede ser arginina o lisina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (56)..(56) 60

<223> X en posición 56 puede ser cualquier aminoácido

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (57)..(57) 65

<223> X en posición 57 puede ser fenilalanina o tirosina

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (58)..(60)

<223> X en posiciones 58-60 puede ser cualquier aminoácido 5

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (62)..(62)

<223> X en posición 62 puede ser ácido aspártico o ácido glutámico 10

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (63)..(75)

<223> X en posiciones 63-75 puede ser cualquier aminoácido 15

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (77)..(79)

<223> X en posiciones 77-79 puede ser cualquier aminoácido 20

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISCELÁNEA

<222> (81)..(85)

<223> X en posiciones 81-85 puede ser cualquier aminoácido 25

<400> 268

<210> 269

<211> 10

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 269

<210> 270 40

<211> 15

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 270 45

<210> 271

<211> 30 5

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 10

<400> 271

acgttctaga atgggaagag caccgtgttg 30

<210> 272

<211> 32

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 272

atcgggatcc ttacacatga tttggcgcat tg 32

<210> 273

<211> 30

<212> DNA 30

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 273

acgttctaga atgggaagag caccgtgttg 30

<210> 274 40

<211> 37

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 45

<223> cebador sintético

<400> 274

atcgggatcc ttaaaaaaat tgctttgaat cagaata 37 50

<210> 275

<211> 27

<212> DNA

<213> secuencia artificial 55

<220>

<223> cebador sintético

<400> 275 60

acgtaagctt tcgtaaaatc tctcatg 27

<210> 276

<211> 40 65

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 5

<400> 276

gtcactcgag cctaggtttc ttgattcttg attcttgatc 40

<210> 277

<211> 35

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 277

aaagtcgacg catctttaca atgtaaagct tttct 35

<210> 278

<211> 27

<212> DNA 25

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 278

aaatctagat gttcgttgct tttcggg 27

<210> 279 35

<211> 38

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 40

<223> cebador sintético

<400> 279

aaagtcgaca gaagacaaat gagagttggt ttatattt 38 45

<210> 280

<211> 29

<212> DNA

<213> secuencia artificial 50

<220>

<223> cebador sintético

<400> 280 55

aaatctagac gcaacgaact ttgattcaa 29

<210> 281

<211> 30 60

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 65

<400> 281

atgggaagag caccgtgttg tgataaggcc 30

<210> 282 5

<211> 35

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 10

<223> cebador sintético

<400> 282

ttaatttggc gcattgaagt aacttgcatc ttcgg 35 15

<210> 283

<211> 28

<212> DNA

<213> secuencia artificial 20

<220>

<223> cebador sintético

<400> 283 25

acgttctaga atggggagag cgccgtgc 28

<210> 284

<211> 29 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 35

<400> 284

tgcaggatcc tactgcatcc cgaggtcag 29

<210> 285

<211> 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 285

acgttctaga atggggagag ctccttgttg 30

<210> 286

<211> 29

<212> DNA 55

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 286

acgtggatcc ctattgcgct cctcctggg 29

<210> 287 65

<211> 29

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 5

<400> 287

acgttctaga atggggaggg caccttgct 29

<210> 288 10

<211> 29

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 288

acgttctaga atggggagag ctccgtgct 29

<210> 289

<211> 28

<212> DNA 25

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 289

actgtctaga atggggaggg cgccgtgc 28

<210> 290 35

<211> 31

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 40

<223> cebador sintético

<400> 290

actgtctaga atgggaagag ctccttgctg t 31 45

<210> 291

<211> 29

<212> DNA

<213> secuencia artificial 50

<220>

<223> cebador sintético

<400> 291 55

acgttctaga atggggagag ctccgtgct 29

<210> 292

<211> 31 60

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 65

<400> 292

actgtctaga atgggaagag ctccatgttg t 31

<210> 293 5

<211> 35

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 10

<223> cebador sintético

<400> 293

gactggatcc ttagtaataa aacatcccta tctca 35 15

<210> 294

<211> 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial 20

<220>

<223> synthetic primier

<400> 294 25

acgttctaga atggggagag ctccttgctg 30

<210> 295

<211> 31 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 35

<400> 295

gactggatcc tcattgtggc ccaaagaagc t 31

<210> 296

<211> 35

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 296

aaagtcgacg catctttaca atgtaaagct tttct 35

<210> 297

<211> 27

<212> DNA 55

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 297

aaatctagat gttcgttgct tttcggg 27

<210> 298 65

<211> 38

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 5

<400> 298

aaagtcgaca gaagacaaat gagagttggt ttatattt 38

<210> 299

<211> 29

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 299

aaatctagac gcaacgaact ttgattcaa 29

<210> 300

<211> 29

<212> DNA 25

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 300

aaaggatcca tgggaagagc accgtgttg 29

<210> 301 35

<211> 32

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 40

<223> cebador sintético

<400> 301

aaaggatccc cactccctaa agacacagat tt 32 45

<210> 302

<211> 28

<212> DNA

<213> secuencia artificial 50

<220>

<223> cebador sintético

<400> 302 55

aaatctagaa tgggaagagc accgtgtt 28

<210> 303

<211> 29 60

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 65

<400> 303

aaaggatcct tacacatgat ttggcgcat 29

<210> 304 5

<211> 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 10

<223> cebador sintético

<400> 304

actgtctaga atgggaagag ctccatgctg 30 15

<210> 305

<211> 32

<212> DNA

<213> secuencia artificial 20

<220>

<223> cebador sintético

<400> 305 25

cagtggatcc ttaaacactg tggtagctca tc 32

<210> 306

<211> 30 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 35

<400> 306

actgtctaga atgggaagag ctccgtgttg 30

<210> 307

<211> 31

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 307

acgtggatcc taggagtaga aatagggcaa g 31

<210> 308

<211> 31

<212> DNA 55

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 308

actgtctaga atgggtaggg ctccatgttg t 31

<210> 309 65

<211> 34

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 5

<400> 309

acgtggatcc tcagtagtac aacatgaact tatc 34

<210> 310

<211> 28

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 310

aaaatctaga atgggaagag caccgtgc 28

<210> 311

<211> 31

<212> DNA 25

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 311

aaaaagatct ctactcatta tcgtatagag g 31

<210> 312 35

<211> 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 40

<223> cebador sintético

<400> 312

acgtgtcgac gaagcagcag aagccttgat 30 45

<210> 313

<211> 32

<212> DNA

<213> secuencia artificial 50

<220>

<223> cebador sintético

<400> 313 55

acgttctaga ggtagagaaa agagaaagcc tc 32

<210> 314

<211> 30 60

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 65

<400> 314

acgttctaga atggggagag cgccgtgctg 30

<210> 315 5

<211> 32

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 10

<223> cebador sintético

<400> 315

tgcaggatcc ctactgcatc ccgaggtcag ct 32 15

<210> 316

<211> 29

<212> DNA

<213> secuencia artificial 20

<220>

<223> cebador sintético

<400> 316 25

acgttctaga atggggaggg caccttgct 29

<210> 317

<211> 28 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 35

<400> 317

acgtggatcc tattgcgccc ccgggtag 28

<210> 318

<211> 34

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 318

aaatctagaa tggggagagc tccgtgctgc gaca 34

<210> 319

<211> 34

<212> DNA 55

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 319

aaaggatccc tacttcatcc caaggtttcc tggc 34

<210> 320 65

<211> 30

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 5

<400> 320

acgttctaga atggggagag ctccttgttg 30

<210> 321

<211> 29

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 321

acgtggatcc ctattgcgct cctcctggg 29

<210> 322

<211> 39

<212> DNA 25

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 322

aaatctagaa tgggaagagc accgtgttgt gataaggcc 39

<210> 323 35

<211> 42

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220> 40

<223> cebador sintético

<400> 323

aaaggatcct tacacattat ttggcccatt gaagtatctt gc 42 45

<210> 324

<211> 39

<212> DNA

<213> secuencia artificial 50

<220>

<223> cebador sintético

<400> 324 55

aaatctagaa tgggaagagc accgtgttgt gacaaggct 39

<210> 325

<211> 42 60

<212> DNA

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sintético 65

<400> 325

aaaggatcct tacaaatgat ttgccccatt gaagtaactt gc 42

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una planta tolerante al estrés térmico, que comprende:

a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de MYB del subgrupo 14 seleccionado del grupo que consiste en MYB36, MYB37, MYB38, MYB68, MYB84 y MYB87;

b) introducir dicho ácido nucleico en un vector; 5

c) transformar una planta, un cultivo de tejido, o una célula vegetal, con dicho vector para obtener una planta, cultivo de tejido o célula vegetal transformados con incremento de la expresión de dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14;

d) hacer crecer dicha planta transformada o regenerar una planta a partir de dicho cultivo de tejido o célula vegetal transformados, en donde se produce una planta tolerante al estrés térmico que tiene incrementada la tolerancia al 10 estrés térmico en comparación con una planta de tipo silvestre.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14 se selecciona del grupo que consiste en MYB36, MYB68 y MYB84.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14 es MYB68.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14 es MYB36. 15
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14 es MYB37.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho vector comprende un promotor constitutivo o un promotor inducible.
7. Una planta transgénica tolerante al estrés térmico producida de acuerdo con el método de la reivindicación 1, en donde dicha planta transgénica contiene un vector o un casete de expresión que comprende dicho ácido nucleico 20 que codifica dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14 que da lugar al incremento de la expresión de dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14, y que tiene incrementada la tolerancia al estrés térmico, y en donde dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14 es MYB68.
8. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha planta transgénica tiene incrementada la cosecha de semillas respecto al control de tipo silvestre. 25
9. Una semilla transgénica producida por la planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha semilla transgénica está transformada con dicho ácido nucleico que codifica el MYB68 y produce una planta tolerante al estrés térmico que expresa dicho ácido nucleico que codifica dicho MYB68, y que tiene incrementada la tolerancia al estrés térmico.
10. Una planta transgénica tolerante al estrés térmico producida de acuerdo con el método de la reivindicación 1, 30 en donde dicha planta transgénica contiene un vector o un casete de expresión que comprende dicho ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14 que da lugar a un incremento de la expresión de dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14, y que tiene incrementada la tolerancia al estrés térmico, y en donde dicho polipéptido de MYB del subgrupo 14 es MYB36.
11. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha planta transgénica tiene 35 incrementada la cosecha de semillas respecto a un control de tipo silvestre.
12. Una semilla transgénica producida por la planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha semilla transgénica está transformada con dicho ácido nucleico que codifica el MYB36 y produce una planta tolerante al estrés térmico que expresa dicho ácido nucleico que codifica el MYB36, y que tiene incrementada la tolerancia al estrés térmico. 40