ES2551580T3 - Procesamiento de péptidos estructurados - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar uno o más ligandos peptídicos, que comprende polipéptidos unidos covalentemente a un andamio molecular en dos o más residuos de aminoácidos, que comprende las etapas de: (a) presentar uno o más ligandos peptídicos en un sistema de presentación genético, en el que el polipéptido comprende dos o más grupos reactivos que forman una unión covalente con el andamio molecular, y al menos un bucle que comprende una secuencia de dos o más aminoácidos delimitados entre dos de dichos grupos reactivos; (b) exponer los ligandos peptídicos a más de una proteasa; y (c) cribar los ligandos peptídicos para unión frente a una diana, y seleccionar los ligandos que se unen a la diana y son resistentes a escisión por dichas más de una proteasas.

Description

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así los codones de cisteína en los bucles; y/o realizar las selecciones en presencia de agente reductor, de manera que se abren los bucles cerrados disulfuro. Más convenientemente, hemos encontrado que el tratamiento de los repertorios de fago modificados químicamente con proteasa en presencia de agente reductor (tal como ditiotreitol o TCEP), de manera que se abren y esciden los bucles, ayuda a minimizar la contribución de dichas especies.
Por lo tanto, los ligandos peptídicos de la invención son sustancialmente resistentes a proteasa. La exposición de los ligandos peptídicos a escisión después de selección frente a la diana favorecerá la identificación de ligandos peptídicos de unión que son resistentes a escisión por proteasa. Sin embargo, no puede excluirse que determinados ligandos peptídicos retendrán la capacidad de unirse a la diana después de la escisión.
Un cribado para resistencia a proteasa puede tener la forma simplemente de digestión limitada con una proteasa para identificar aquellos miembros del repertorio en los que la unión es sensible a proteasas, o requiere la acción de proteasas. Lo más deseable será el uso de una proteasa que sea activa en condiciones en las que se usará el péptido bicíclico, por ejemplo en presencia de suero.
Condiciones para la escisión por proteasa
El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión enzimática tal como el escindido por una proteasa tal como trombina, Factor Xa, una enteropeptidasa tal como serina proteasa, enteroquinasa (incluyendo las descritas en WO 01/98366), o por ejemplo por tripsina, o puede ser un sitio de escisión química escindible por químicos tal como CNBr que escinde en un residuo de metionina.
Preferiblemente, se usan agentes de escisión enzimática. Es importante equilibrar la escisión del péptido en el ligando con la escisión del fago, que destruirá la infectividad del fago.
Existen varias proteasas altamente específicas. Aunque la invención no reside en la elección de ninguna proteasa particular, la proteasa es preferiblemente suficientemente específica en las condiciones usadas de manera que en dichas condiciones de escisión, tiene la capacidad de escindir el sitio de escisión en el ligando peptídico pero no cualquier polipéptido esencial para la viabilidad del fago. La selección de condiciones de escisión particulares, por ejemplo, baja temperatura, hace factible el uso de una proteasa que de otra forma sería inadecuada.
El sistema de coagulación de la sangre y del complemento contiene varias proteasas muy específicas. Habitualmente, las enzimas en las etapas tempranas de la cascada son más específicas de lo que lo son en las últimas. Por ejemplo, el Factor X, (FX) es más específico que la trombina. La FX bovina escinde después de la secuencia Ile-Glu-Gly-Arg mientras FX humana escinde después de Ile-Asp-Gly-Arg. Puede usarse cualquier pareja de proteasa-conector, según se desee.
Si se usa la trombina, se encuentran sitios sensibles a trombina en fibrinógeno, Factor XIII, y protrombina. La especie de la que deriva FX influirá en la especificidad precisa de la proteasa, que está adaptada para escindir las secuencias precisas encontradas en sus dianas naturales in vivo.
El Factor XI humano escinde el Factor IX humano en dos sitios: QTSKLTR/AEAVF y SFNDFTR/VVGGE. Dicha proteasa proporciona, por lo tanto, un sistema de escisión muy específico, que escindirá péptidos sólo en un número muy limitado de sitios.
La calicreína humana corta FXII humano en R353: LFSSMTR/VVGFLV.
Esta secuencia tiene una similitud significativa con los sitos hFXI anteriores.
El FXII humano corta FXI humano en R369: KIPPR/IVGGT.
Otras proteasas que se han usado para escindir proteínas de fusión incluyen enteroquinasa, tripsina, colagenasa, quimosina, uroquinasa, renina, y determinados péptidos señal. Véase Rutter, US 4.769.326 que se incorpora en la presente memoria por referencia.
En una realización preferida de la invención, la proteasa es una cualquiera en el grupo seleccionado de las siguientes: PreScission™ que reconoce y escinde el sitio de escisión LEVLFQGP; factor Xa que escinde el sitio IEGRGI; y trombina que escinde el sitio LVPRGS y el sitio LVPKGS.
Los expertos en la técnica apreciarán que las condiciones de escisión deben controlarse cuidadosamente de manera que el fago no se inactiva por la escisión de polipéptidos del fago esenciales. Como se ha indicado anteriormente, un rango completo de proteasas que son adecuadas para modificar polipéptidos expuestos pero que no afectan al fago se describen en Kristensen, P. y Winter, G. (Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages; Fold Des. 1998; 3(5): 321-8).
D: Dianas
Los ligandos peptídicos según la presente invención pueden diseñarse para unirse a cualquier diana dada. Un experto en la técnica apreciará que la elección de molécula diana es amplia y variada. Pueden ser, por ejemplo,
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proteínas humanas o animales, citoquinas, receptores de citoquinas, co-factores de enzimas para enzimas o proteínas de unión a ADN. Las citoquinas y factores de crecimiento adecuados incluyen, pero no están limitados a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENA78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FGFácido, FGF-básico, factor de crecimiento de fibroblastos-10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-I, insulina, IFNy, IGF-I, IGF-II, IL-la, IL-1 (3, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17a, IL-17c, IL-17d, IL-17e, IL-17f, IL-18 (IGIF), IL-21, IL-22, IL-23, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, Inhibina α, Inhibina β, IP-10, factor de crecimiento de queratinocitos-2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibidora Mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, MDC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67
a. a.), MDC (69 a. a.), MIG, MIP-la, MIP-1p, MIP-3a, MIP3, MIP-4, factor inhibidor del progenitor mieloide-1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, Factor de crecimiento nervioso, P-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDFIa, SDFlp, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF2, TGF-3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-α, TNF-β, receptor de TNF I, receptor de TNF II, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor de VEGF 1, receptor de VEGF 2, receptor de VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1,1-309, HER 1, HER 2, HER 3 y HER 4; los receptores de citoquinas incluyen receptores para las citoquinas anteriores. Las dianas quimoquinas incluyen ligandos de quimoquina CC CCL21/6Cquina, CCL12/MCP-5, CCL6/C10, CCL22/MDC, CCL14/HCC-1/HCC-3, CCL3L1/MIP-1 isoforma alfa LD78 beta, CCL23/Ck beta 8-1, CCL3/MIP-1 alfa, CCL28, CCL4L1/LAG-1, CCL27/CTACK, CCL4/MIP-1 beta, CCL24/Eotaxina-2/MPIF-2, CCL15/MIP-1 delta, semejante a CCL26/semejante a Eotaxina-3, CCL9/10/MIP-1 gamma, CCL26/Eotaxina-3, CCL19/MIP-3 beta, CCL11/Eotaxina, CCL20/MIP-3 alfa, CCL14a/HCC-1, CCL23/MPIF-1, CCL14b/HCC-3, CCL18/PARC, CCL16/HCC-4, CCL5/RANTES, CCL1/I-309/TCA-3, TAFA1/FAM19A1, MCK-2, TAFA5/FAM19A5, CCL2/JE/MCP-1, TAFA3/FAM19A3, CCL8/MCP-2, TAFA4/FAM19A4, CCL7/MCP-3/MARC, CCL17/TARC, CCL13/MCP-4 y CCL25/TECK; los receptores de quimoqujnas incluyen CCR1, CCR7, CCR2, CCR8, CCR3, CCR9, CCR4, CCR10, CCR5, CCRL2/LCCR/CRAM-A/B y CCR6; los ligandos quimoquina CXC incluyen CXCL13/BLC/BCA-1, CXCL10/IP-10/CRG-2, CXCL14/BRAK, LIX, CXCL16, CXCL15/Lungquina, CXCL5/ENA-78, CXCL9/MIG, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL1/2/3/GRO, CXCL4/PF4, CXCL1/GRO alfa/KC/CINC-1, CXCL12/SDF-1 alfa, CXCL2/GRO beta/MIP-2/CINC-3, CXCL12/SDF-1 beta, CXCL3/GRO gamma/CINC-2/DCIP-1, CXCL12/SDF-1, CXCL11/I-TAC, CXCL7/Quimoqujna de Timo-1 y CXCL8/IL-8; los receptores de quimoquinas CXC incluyen CXCR3, CXCR7/RDC-1, CXCR4, CXCR1/IL-8 RA, CXCR5, CXCR2/IL-8 RB y CXCR6; los ligandos de la superfamilia de TNF incluyen ligando 4-1 BB/TNFSF9, LIGHT/TNFSF14, APRIL/TNFSF13, Linfotoxina, BAFF/BLyS/TNFSF13B, Linfotoxina beta/TNFSF3, ligando CD27/TNFSF7, ligando OX40/TNFSF4, ligando CD30/TNFSF8, TL1A/TNFSF15, ligando CD40/TNFSF5, TNF-alfa/TNFSF1A, EDA (general), TNF-beta/TNFSF1B, EDA-A1/Ectodisplasina A1, TRAIL/TNFSF10, EDA-A2, TRANCE/TNFSF11, ligando Fas/TNFSF6, TWEAK/TNFSF12 y ligando GITR/TNFSF18; los receptores de la superfamilia TNF incluyen 4-1BB/TNFRSF9/CD137, NGF R/TNFRSF16, BAFF R/TNFRSF13C, Osteoprotegerina/TNFRSF11B, BCMA/TNFRSF17, OX40/TNFRSF4, CD27/TNFRSF7, RANK/TNFRSF11A, CD30/TNFRSF8, RELT/TNFRSF19L, CD40/TNFRSF5, TACI/TNFRSF13B, DcR3/TNFRSF6B, TNFRH3/TNFRSF26, DcTRAIL R1/TNFRSF23, TNF RI/TNFRSF1A, DcTRAIL R2/TNFRSF22, TNF RII/TNFRSF1B, DR3/TNFRSF25, TRAIL R1/TNFRSF10A, DR6/TNFRSF21, TRAIL R2/TNFRSF10B, EDAR, TRAIL R3/TNFRSF10C, Fas/TNFRSF6/CD95, TRAIL R4/TNFRSF10D, GITR/TNFRSF18, TROY/TNFRSF19, HVEM/TNFRSF14, TWEAK R/TNFRSF12, Linfotoxina beta R/TNFRSF3 y XEDAR; receptores Semejantes a Toll incluyendo TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8 y TLR-9; enzimas, incluyendo Catepsina A, Catepsina B, Catepsina C, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina F, MMP 1, MMP2, MMP 3, MMP 7, MMP 8, MMP 9, MMP 10, MMP 11, MMP 12, MMP 13, MMP 14, MMP 15, MMP 16, MMP 17, MMP 19, MMP 20, MMP 21, MMP 23A, MMP 23B, MMP 26, MMP 27, MMP 28, uroquinasa, calicreínas, incluyendo KLK1, KLK2, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14 y KLK15; componentes del sistema del complemento; moléculas de señalización intracelular y factores de trascripción; p53; y MDM2.
Se apreciará que esta lista no es de ninguna manera exhaustiva.
Las dianas también pueden ser proteínas plasmáticas mayores, tales como albúminas de suero, como se muestra más adelante.
Cuando el conjugado polipeptídico se une a dos epítopos (en la misma diana o dianas diferentes), las moléculas diana pueden seleccionarse de esta lista. Las dianas pueden competir para la unión al conjugado polipeptídico, de manera que no pueden unirse simultáneamente. Alternativamente, pueden unirse ambas simultáneamente, de manera que el conjugado polipeptídico forma un puente con las dianas.
Los ligandos resistentes a proteasa pueden seleccionarse para uso en dianas de unión tales como proteasas, o para uso en entornos ricos en proteasa, tal como en plasma o superficies mucosales.
Dichos ligandos son útiles en aplicaciones médicas, tales como vacunas, agentes terapéuticos y de diagnóstico.
Ejemplos
La invención se describe adicionalmente con referencia a los ejemplos siguientes.
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Ejemplo 1. Péptidos bicíclicos resistentes a proteasa frente a MDM2
MDM2 es una enzima (una ubiquitina ligasa E3) que reconoce el dominio de trans-activación de p53, el supresor tumoral, que da lugar a la ubiquitinilación y degradación de p53 por el proteosoma. Un inhibidor nutlina de la interacción p53-MDM2 puede dar lugar a la activación in vivo de la ruta de p53, y se ha sugerido que dichos agentes pueden tener potencial como agentes anti-cancerosos. Aquí, describimos la selección de dos péptidos bicíclicos (PEP10 y PEP48) frente a MDM2, un "antígeno" diana. La afinidad de cada péptido sintético fue submicromolar, y en el intervalo 250-750 nM. Se mostró por ELISA de competición que al menos uno de los péptidos se une al mismo sitio que un péptido lineal que previamente se había mostrado que bloqueaba la interacción p53-MDM2.
Los protocolos fueron generalmente como los descritos anteriormente en Heinis et al., 2009, Nature Chemical Biology 5, 502-507, a no ser que se indique otra cosa. En el trabajo de Heinis et al., ambas dianas, calicreína y catepsina G, eran proteasas, y el inhibidor de calicreína es bastante resistente a proteolisis por calicreína, aunque incluye un sitio de escisión de calicreína. MDM2 no es una proteasa, y por lo tanto no estaba claro si los péptidos seleccionados también serían resistentes a proteasa. Por esto, y otras razones (para detalle véase más adelante), incluimos una o más etapas de proteasa (quimotripsina) después de la reacción de los repertorios de péptidos de fago con el TBMB (incluyendo en condiciones reductoras) y antes de la selección del repertorio frente a MDM2. Los dos péptidos de fago seleccionados PEP10 y PEP 48 aparecieron resistentes a proteolisis, como se muestra por ELISA de fago.
Producción y purificación de fagos
Se preparó la biblioteca de péptido de fago con diversidad de al menos 4x109 clones y TBMB se conjugó como se ha descrito antes con unas pocas modificaciones.
1.
La biblioteca cx6 de fago como se ha descrito antes (que se había preparado a partir de células TG1) se usó para infectar la cepa no supresora HB2151 (Carter, Bedouelle y Winter. 1985. Nucleic Acids Res. 13:4431-43), y las células infectadas se sembraron en placas. Las bacterias se rasparon de las placas en aproximadamente 8 ml de medio 2xTY, 30 ug/ml cloranfenicol, 10% glicerol (v/v).
2.
Se añadieron aproximadamente 0,8 ml de la preparación madre a 800 ml de medio 2xTY con 30 ug/ml de cloranfenicol para obtener una DO de aproximadamente 0,1 a 600 nm. El cultivo se incubó a 30ºC, y se agitó en un matraz de 2 litros a 200 rpm durante 16hrs.
3.
El cultivo celular se centrifugó a 4.000 rpm (Megafuga Heraeus 2R) durante 30 min a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a 200 ml de 20% PEG frío, 2,5 M NaCl. La mezcla se dejó en hielo durante 1 hr.
4.
El sobrenadante/mezcla de fago precipitado se centrifugó durante 30 min a 4ºC y el sobrenadante se desechó.
5.
El fago se resuspendió en 35 ml PBS, 5mM EDTA seguido de centrifugación durante 15 min a 4.000 rpm (Megafuga Heraeus 2R) para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Falcon de 50 ml.
Modificación de fago con TBMB
1.
Se añadieron 5ml de 8mM TCEP (en H2O) al fago para obtener una concentración final 1mM TCEP. El tubo se invirtió varias veces para mezclar y se incubó durante 1hr en un baño de agua a 42ºC.
2.
El TCEP se eliminó por una segunda precipitación de PEG. Se añadieron 10 ml de 20% PEG, 2,5 M NaCl (disolución desgaseada), se mezcló, y se incubó en hielo durante 45 min y se centrifugó durante 30 min a 4.000 rpm, 4ºC.
3.
El sobrenadante se eliminó cuidadosamente y el sedimento se resuspendió en 12 ml PBS, 5mM EDTA, 10 uM TCEP (tampón desgaseado)
4.
Se añadieron 3ml de 50 uM TBMB en acetonitrilo a los 12 ml de fago reducido para obtener una concentración final de TBMB de 10 uM. El tubo se invirtió varias veces y se dejó a 30ºC durante 1 hr en un baño de agua. Los fagos se enfriaron en hielo y se precipitaron con 1/5 de volumen de 20% PEG, 2,5 M NaCl durante 30 min. Los fagos se recogieron centrifugando a 4.000 rpm (Megafuga Hereaus 2R) durante 20 min. El sobrenadante se eliminó y los fagos se resuspendieron en 4 ml de PBS. El fago se transfirió a los tubos Eppendorf de 2ml y se centrifugó a 13.000 rpm (centrífuga de mesa Eppendorf) durante 10 min. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf y se midió la infectividad de los fagos.
Selección de fagos: protocolo general
Primera ronda de selección
1. El fago purificado y conjugado químicamente como anteriormente se seleccionó frente a péptido MDM2 biotinilado (bio-MDM2) (res 2-125) inmovilizado en la superficie de las Dynabeads recubiertas de estreptavidina (Dynal
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PEP48+MDM2, ex medida=295 nm, Kd=567 nM
Ensayos de competición
La unión de fago PEP48 a MDM2 fue competida por un péptido pMI (TSFAEYWNLLSP) que se une a MDM2 en el sitio p53 con una Kd = 3,3 nM (Pazgier et al., 2009 PNAS, 106, 4665-4670). Se inmovilizaron 0,6 μg/mL de péptido MDM2 biotinilado (res 2-125) en una placa recubierta con estreptavidina (Roche). La placa se bloqueó con PBSM. Se premezcló fago conjugado con TBMB (107 TU/pocillo en 1% PBSM) con un intervalo de concentraciones de pDI (de 6,94 nM a 1 uM) y se incubó en la placa durante 75 min a temperatura ambiente. El fago se detectó usando un anticuerpo monoclonal anti-M13-HRP (1:5.000, Amersham). La unión de fago PEP48 a MDM2 se inhibió por la adición del péptido pMI, con una CI50 estimada = 125 nM.
Ejemplo 2. Resistencia a proteasa de péptidos bicíclicos
Los péptidos bicíclicos PK15 y CG4 de Heinis et al., 2009, se seleccionaron frente a las proteasas calicreína y catepsina G, respectivamente, y no sería sorprendente si los péptidos bicíclicos fueran resistentes a digestión por estas proteasas, particularmente la naturaleza restringida del andamio debería ayudar a proteger frente al ataque proteolítico.
Comparamos PK15 lineal (cisteínas tratadas con yodoacetamida) con PK15 conjugado con el andamio TBMB, con calicreína y con otras proteasas, véase la Tabla más adelante (la escala varía de +++ (sustancialmente intacto) a (completamente escindido). Como se esperaba, el conjugado de PK15 con TBMB fue más resistente que el lineal al ataque por calicreína. El factor fue aproximadamente 100 veces, como se muestra comparando diferentes concentraciones de la enzima.
Para las demás proteasas, el factor varió entre 10 y 100 veces, dependiendo de la proteasa. También comparamos la resistencia de CG4L1-PK15L1 bicíclico (WO 2009/098450) a la proteolisis. En este caso, el factor varió entre 1 y más de 100 veces, dependiendo de la proteasa. Así, el conjugado tiene una resistencia incrementada a proteasas distintas de la proteasa (calicreína) a la que se expuso durante el proceso de selección.
La variación de la resistencia según la proteasa sugiere que es deseable incluir una etapa de proteolisis en el proceso de selección o cribado, como ya se ha descrito en el Ejemplo 1. Lo más deseable será usar una proteasa que sea activa en las condiciones en las que se usará el péptido bicíclico, por ejemplo en presencia de suero. Por interés, evaluamos la resistencia de PK15 a suero. Esto mostró que el PK15 lineal se digiere por las proteasas en el suero a 37ºC en aproximadamente 2 horas. Sin embargo, el conjugado de PK15 resiste la proteolisis durante al menos 48 horas; todavía tienen que ensayarse tiempos más largos.
Tabla: Digestión de conjugado peptídico con varias proteasas
PK15 lineal
PK15-TBMB CG4L1-PK15L1 CG4L1-PK15L1
lineal
TBMB
Catepsina G
1
- ++ - ++
0,1
- +++ - +++
0,01
+/ +++ - +++
Quimotripsina
10
- ++ - -
1
- +++ - +
0,1
+ +++ - ++
0,01
+++ +++ ++ +++
Calicreína
1
- +++ - ++
0,1
+ +++ - +++
0,01
+++ +++ - +++
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Pronasa
10
- + + ++
1
+/ ++ ++ +++
0,1
++ +++ ++ +++
0,01
+++ +++ +++ +++
Proteinasa K
10
- ++ - +/
1
+/ +++ + +
0,1
+ +++ + +
0,01
++ +++ ++ ++
Subtilisina
9
- - - -
0,9
- + - +/
0,09
++ ++ - +
0,009
+++ +++ - +++
Tripsina
10
- - - -
1
- + - +
0,1
+/ ++ - ++
0,01
+ +++ +/ +++
Los números corresponden al número de μg de enzima por reacción
Métodos
Para los métodos, véase el Ejemplo 3 siguiente. La proteolisis se realizó a 37ºC. Las reacciones con catepsina G y calicreína se llevaron a cabo en 10 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,1% BSA, 0,01%
5 Tritón X100, 5% DMSO. Las reacciones con quimotripsina se llevaron a cabo en 100 mM Tris pH 7,4, 10 mM CaCl2. Las reacciones con pronasa y proteinasa K se llevaron a cabo en 100 mM Tris pH 7,4, 0,5% SDS. Las reacciones con subtilisina se llevaron a cabo en 50 mM KH2PO4 pH 7,5. Las reacciones con tripsina se llevaron a cabo en 67 mM fosfato de sodio pH 7,6. Las condiciones de la reacción con suero implican disolver el péptido en 1xPBS (volumen total 24 μl) y 6 μl de suero humano añadidos a la reacción.
10 Ejemplo 3. Sitios de escisión de tripsina y quimotripsina de PK15
Para identificar los sitios de escisión de tripsina y quimotripsina de PK15, usamos tanto el péptido derivatizado con yodoacetamida como el conjugado con TBMB, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Las condiciones de la proteolisis también fueron como se describen en el Ejemplo 2. Mediante análisis espectrométrico de masa, a partir de análisis de las masas moleculares de las especies escindidas, fuimos capaces de mostrar que el en péptido
15 derivatizado con yodoacetamida (AC*SDRFRNC*PADEALC*G) R7 y R9 fueron ambos escindidos por tripsina, y F8 escindido por quimotripsina. Los mismos sitios de escisión se observaron en el péptido conjugado con TBMB, excepto que las escisiones se produjeron a una velocidad mucho más lenta como se indica en el Ejemplo 2. Además, con tripsina, la etapa de escisión inicial fue en R7, seguido en incubaciones más largas por la escisión en R9.
20 Métodos
Los péptidos y conjugados se purificaron en una columna Proteo C12 (4 μ, Phenomenex) usando un HPLC Varian
940. Los tampones usados fueron 0,1% TFA (A) y 90% MeCN, 0,1% TFA (B). Generalmente, las muestras se eluyeron en un gradiente de tampón B 10-65% durante 23 minutos.
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Para la conjugación de TBMB, usamos nuestras condiciones generales, que son como sigue. Se disolvieron 5-6 mg del péptido crudo después de la síntesis (véase el Ejemplo 1 para condiciones típicas de síntesis) en 600 μl de agua (añadiendo 20 μl de 10% disolución de amoniaco si es insoluble) seguido de 60 μl TCEP y se dejó permanecer durante 20 mins. En dos inyecciones, el péptido reducido se purificó por HPLC (condiciones anteriores) recogiendo el péptido en aproximadamente 3-4 ml de tampón de elución. La disolución se neutralizó con un volumen igual de 100 mM tampón fosfato de amonio y se añadió 1 ml de acetonitrilo. Se disolvieron 10 equivalentes de TBMB en 1 ml de acetonitrilo y se añadieron al péptido reducido. El pH se monitorizó y se añadió 100 mM tampón fosfato de amonio adicional si el pH era ácido. Generalmente, las reacciones finalizaron en 20-30 minutos. La reacción se purificó por HPLC, cargando en primer lugar hasta 4,5 ml de la reacción en la columna equilibrada en 0,1% TFA, lavando durante 8 mins con 0,1% TFA y eluyendo de la columna como sigue. Las fracciones puras se liofilizaron y se disolvieron en agua (10% DMSO si era insoluble). Los productos y reacciones se monitorizan todo el rato por espectrometría de masa MALDI-TOF, desalando las mezclas de reacción usando un ZipTip. Los rendimientos del conjugado fueron típicamente 1-2 mg.
Para los conjugados con yodoacetamida usamos nuestras condiciones generales que son como sigue. Después de la síntesis, los péptidos crudos (5-6 mg) se disolvieron en agua (600 μl) y se trataron con TCEP (60 μl de 0,5M) durante 20 minutos antes de HPLC. La fracción purificada de HPLC (aproximadamente 3 ml) se neutralizó con un volumen igual de 100 mM bicarbonato de amonio y se trató con 10 equivalentes de yodoacetamida en 1 ml MeCN. En estas condiciones, las reacciones finalizan habitualmente en 30 minutos. La mezcla de reacción se purificó por HPLC directamente, cargando hasta 4,5 ml de la mezcla en la columna equilibrada con 0,1% TFA, lavando con 0,1% TFA durante 8 minutos y eluyendo como se ha descrito anteriormente.
Los péptidos (lineal y conjugados) se disolvieron en agua a una concentración de 1 mg/ml, proporcionando una concentración efectiva de ~0,5 mM de disoluciones madre y la concentración se determinó usando análisis de aminoácidos. Se disolvieron 2 μl de los conjugados peptídicos (20 μM concentración final) (~30 μM en reacciones dependiendo del peso molecular real) en tampón de reacción (véase más adelante) en un volumen total de reacción de 30 μl, seguido de la proteasa (típicamente en el intervalo 1, 0,1 y 0,01 μg por reacción), y las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hr. Se pararon alicuotas de 10 μl en 10 μl de 1% TFA. Las muestras se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF para identificar los picos de fragmentos y determinar así el sitio de escisión. Cuando existió ambigüedad respecto al sitio de escisión, las muestras se analizaron bien por MALDI-TOF-TOF (Bruker Ultraflex 3) o por Trampa de Iones Lineal (Thermoscientific Orbitrap XL) para determinar masas exactas.
Ejemplo 4. Cambios en el núcleo para resistir la proteolisis
El conjugado biciclo PK15 es más resistente a la digestión por quimotripsina y tripsina que la forma lineal como se describe en el Ejemplo 2. Sin embargo, después de una incubación prolongada, se escinde en los residuos de arginina por tripsina y fenilalanina por quimotripsina, como se describe en el Ejemplo 3. Haciendo cambios en las cadenas laterales de los aminoácidos, puede ser posible proporcionar una resistencia adicional a la proteolisis. También puede ser posible hacer esto haciendo cambios en el núcleo peptídico como se describe aquí y se ejemplifica por la introducción cerca de los sitios de escisión, de un D-aminoácido, o N-metilación, o un enlace peptídico reducido. Así, para proporcionar resistencia en los sitios de escisión de proteasa de PK15, se sintetizaron las variantes siguientes:
H-ACSDR f RNCPADEALCG-OH (donde f representa D-Phe), y H-ACSDRF-(NMeArg)-NCPADEALCG-OH, y H-ACSDRF Y[CH2NH] RNCPADEALCG-OH (donde el Y[CH2NH] representa el enlace peptídico reducido).
En las descripciones siguientes de síntesis peptídica, las abreviaturas son como sigue. THF: tetrahidrofurano; NMM: N-metilmorfolina; IBCF: iso-butilcloroformato; DMF: N,N-dimetilformamida; DiPEA: diisopropiletilamina; TFA: ácido trifluoroacético; EDT: etano ditiol; PyBOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio; PyBrOP: hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio.
El péptido D-Fenilalanina (H-ACSDR f RNCPADEALCG-OH) se sintetizó como se describe en el Ejemplo 1, añadiendo D-Phe en lugar de L-Phe.
El péptido NMe-Arginina, H-ACSDRF-(NMeArg)-NCPADEALCG-OH, se sintetizó en un sintetizador de péptidos automatizado CEM Liberty como se describe en el Ejemplo 1 hasta el aminoácido que precede la NMeArginina. La resina se recogió en una jeringa y después de desprotección del grupo Fmoc, se disolvieron 6 equivalentes de Fmoc-NMe-Arg(Mtr)-OH, 6 equivalentes de PyBOP y 12 equivalentes de DiPEA en 4 mL de DMF. La disolución se añadió a la resina y se agitó durante 40 minutos. La etapa se reproduce para un acoplamiento doble. Después, la desprotección de Fmoc se llevó a cabo usando 20% v/v Piperidina/DMF. Después de lavados con DMF (4 veces), se disolvieron 6 equivalentes de Fmoc-Phe-OH, 6 equivalentes de PyBrOP y 12 equivalentes de DiPEA en 4 mL de DMF. La disolución se añadió a la resina y se agitó durante 3 horas. La etapa se reproduce para un doble acoplamiento. Después, la resina se lava con DMF y se pone de nuevo en un sintetizador de péptidos CEM Liberty para completar la secuencia. La escisión de los grupos protectores de la cadena lateral y del soporte se efectuó usando 82,5:5:5:5:2,5 v/v/v/v/v TFA/Fenol/Tioanisol/agua/EDT toda la noche. La mezcla péptido/TFA se filtró para eliminar el soporte y la mezcla péptido/TFA se diluyó con agua y se lavó con Et2O (5 veces) y la capa acuosa se liofilizó
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El péptido con enlace peptídico reducido, H-ACSDRF Y[CH2NH] RNCPADEALCG-OH, requirió en primer lugar la preparación de Fmoc-fenilalaninal. Se disolvieron 5 mmoles de Fmoc-Phe-OH en 10 mL de THF anhidro y se mantuvo a 15ºC bajo nitrógeno. Se añadieron 5 mmoles de NMM y 5 mmoles de IBCF. Después de 15 min, la suspensión se filtró y se lavó con 2×5 mL de THF anhidro. Se añadieron gota a gota 5 mmoles de morfolina al filtrado y después de una hora, la reacción estaba finalizada. La mezcla se concentró en vacío y se añadió acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con una disolución de KHSO4 5%, después una disolución de KHCO3 5% y agua destilada, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró en vacío. La amida Weinreb obtenida se purificó por cromatografía flash en gel de sílice.. Después, se disolvieron 1,95 mmoles del compuesto en 20 mL de THF anhidro y se pusieron en un baño de hielo bajo nitrógeno. Se añadieron 1,25 eq de LiAlH4 y la reacción se evaluó por TLC de una alicuota hidrolizada separadamente con KHSO4 acuoso. Después de 45 min, la reacción estaba finalizada y se paró con 5 mL de KHSO4 acuoso. El compuesto se extrajo con éter dietílico y se usó sin ninguna purificación adicional.
Para la introducción del enlace reducido en la secuencia peptídica, el péptido se sintetizó, como en el Ejemplo 2, en un sintetizador de péptidos automatizado CEM Liberty hasta la arginina implicada en el enlace reducido. Después de desprotección del grupo Fmoc con 20% piperidina/DMF, se añadió una disolución de 3 eq de Fmoc-fenilalaninal en 5 mL de 1% AcOH en DMF al péptido soportado en la resina en una jeringa. Después, se añadieron 3 eq de NaBH3CN por partes durante 1 hora. La reacción se agitó toda la noche, la resina se lavó con DMF y se puso de nuevo en el Sintetizador CEM Liberty para completar la secuencia.
La escisión de los grupos protectores de la cadena lateral y del soporte se efectuó usando 94:2,5:2,5:1 v/v/v/v TFA/EDT/H2O/iPr3SiH durante 2 horas. La mezcla péptido/TFA se filtró para eliminar el soporte y la mezcla péptido/TFA se diluyó con agua y se lavó con Et2O (5 veces) y la capa acuosa se liofilizó.
Después de la purificación, los péptidos se conjugaron con TBMB y se ensayaron para inhibición de la actividad calicreína, como sigue:
Las enzimas se adquirieron en Sigma Aldrich y los sustratos en Bachem AG. El tampón de ensayo está compuesto por 10 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,1% BSA, 0,01% Tritón X100 y 5% DMSO. Las enzimas se incuban con los inhibidores durante 30 minutos a RT antes de la adición del sustrato. Todos los experimentos se registraron a 30ºC durante 90 minutos.
Los ensayos se realizaron en un lector de placas BMG Pherastar a longitudes de onda de exc/em 350/450 nm. La calicreína se adquirió como una disolución de 1.080 μg/mL y se diluyó hasta una concentración de trabajo de 0,3 nM en tampón de ensayo. El sustrato Z-Phe-Arg-amc se solubilizó a la concentración madre de 10 mM en DMSO y se diluyó hasta una concentración de trabajo de 300 μM con tampón de ensayo. Los inhibidores se solubilizaron en tampón de ensayo hasta una concentración madre de 60 μM. Se introducen 50 μL de cada reactivo en pocillos para un volumen final de 150 μL por pocillo. La concentración final de calicreína en el ensayo es 0,1 nM y de sustrato es 100 μM.
Las concentraciones finales de los inhibidores fueron: 0,5 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 8 nM, 10 nM, 20 nM, 50 nM, 80 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM, 800 nM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 8 μM, 10 μM y 20 μM. La velocidad inicial de la reacción se obtiene representando los datos de fluorescencia = f (tiempo) y ajustando una línea de tendencia lineal para cada concentración de inhibidor. Las curvas de inhibición se obtienen representando la velocidad inicial = f ([I]) y pueden evaluarse los valores de CI50.
Esto reveló que todos los péptidos inhibieron la actividad de calicreína; los valores para los péptidos H-ACSDRfRNCPADEALCG-OH, H-ACSDRF-(NMeArg)-NCPADEALCG-OH y H-ACSDRF Y[CH2NH] RNCPADEALCG-OH fueron respectivamente 4 μM, 3,1 μM, 16,6 μM.
Sin embargo, la alteración en el núcleo también dio lugar, como se esperaba, a una resistencia incrementada a la proteolisis (para los métodos, véase el Ejemplo 2). Usando las concentraciones más altas de tripsina (0,1 μg) descritas en el Ejemplo 2, donde el conjugado PK 15 TBMB se escinde completamente en 5 min en R7, los tres conjugados (con núcleo modificado) péptido TBMB no fueron escindidos. De hecho, con 1 μg de tripsina, y después de 1 hora, hubo poca escisión o ninguna de cualquiera de los conjugados con TBMB con núcleo modificado. Usando las concentraciones más altas de quimotripsina (0,1 μg) descritas en el Ejemplo 2, donde el conjugado PK15 TBMB se escinde aproximadamente en un 50% después de 1 hr, los tres conjugados péptido TBMB con núcleo modificado no se escindieron. Con 1 μg de quimotripsina, donde el conjugado PK 15 TBMB se escinde completamente después de 1 hora, los conjugados con núcleo modificado estaban en gran medida (75-85%) intactos.
Así, los conjugados con núcleo modificado tienen una estabilidad mejorada frente a proteasas, sin embargo con alguna pérdida de afinidad de unión para la diana.
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