ES2552055T3

ES2552055T3 - Método para purificar FSH biotecnológica

Info

Publication number: ES2552055T3
Application number: ES10713424.9T
Authority: ES
Inventors: Christian Scheckermann; Dietmar Eichinger; Stefan Arnold
Original assignee: Ratiopharm GmbH
Current assignee: Ratiopharm GmbH
Priority date: 2009-04-01
Filing date: 2010-04-01
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2030-04-01
Also published as: JP5845170B2; IL215234A0; AU2010234028B2; US20120135928A1; CN102448979A; CN102448979B; BRPI1012647A2; EP2414380B1; ME02277B; US20150353599A1; EP2414380A2; HUE025959T2; CY1116963T1; UA106369C2; MX2011010480A; US20160304575A1; SI2414380T1; JP2016027050A; BRPI1012647B1; WO2010115586A3

Abstract

Un método para purificar FSH biotecnológica humana o una variante de FSH biotecnológica, que comprende las etapas de someter a un líquido que contiene dicha FSH o la variante de FSH a: - una cromatografía de intercambio aniónico, - una cromatografía de interacción hidrófoba, y - una cromatografía de afinidad de los colorantes, que puede realizarse en cualquier orden, en donde el método no comprende una cromatografía de intercambio aniónico débil ni una cromatografía de fase inversa.

Description

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En una realización preferida, la etapa de intercambio catiónico del método de la invención se realiza como una membrana de intercambio catiónico. Preferiblemente, la etapa de intercambio catiónico se lleva a cabo con un ácido sulfónico intercambiador catiónico ácido fuerte fijado en una membrana o un intercambiador que tiene características similares.

5 Adsorbentes de membrana adecuados para su uso en la etapa de intercambio catiónico de la invención son conocidos en la técnica y están disponibles en varios proveedores. Por ejemplo, la cromatografía de intercambio catiónico del método de la invención puede llevarse a cabo utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada y que tiene una matriz cromatográfica de ácido sulfónico formada en el núcleo central de la celulosa. Un ejemplo de un adsorbente de membrana útil son los adsorbentes de membrana Sartobind S comercializados por Sartorius. Los

10 datos técnicos de los adsorbentes de membrana Sartobind S se dan a continuación.

Designación Sartobind SingleSep ® (intercambiador catiónico ácido fuerte S) Ligando ácido sulfónico (R-CH2-SO3-) Capacidad de unión estática ≥ 0,8 mg/cm2 (29 mg/ml) medida con albúmina de suero bovino y

lisozima de huevo de gallina

15 Capacidad iónica 4-6 μeq/cm2 Membrana Material de base celulosa reforzada estabilizada Espesor de membrana 275 μm Tamaño nominal de poro > 3 μm

20 Cápsula Diseño Cilíndrico, número nominal de capas: 15 Altura del lecho: 4 mm Material de la cápsula Polipropileno (FDA) Presión max. 0,4 MPa (4 bar, 58 psi)

25 Estabilidad del pH 3-14 (a corto plazo) Almacenamiento Descartar después de un uso Estabilidad química Estable contra todos los tampones utilizados normalmente en

cromatografía , NaOH 1 M (30-60 min a 20ºC), urea 8 M, hidrocloruro de guanidina 8 M, etanol, acetona y acetonitrilo al 100%. Evita los

30 agentes oxidantes. La etapa de CIC puede realizarse según el protocolo del fabricante. Por ejemplo, un tampón de Tris-HCl puede utilizarse a pH 7,0.

Se encontró que la etapa de CIC, preferiblemente la etapa del adsorbente de membrana catiónica, limpia las proteínas de la célula anfitriona de todos los tamaños moleculares, mientras que mantiene cortos los tiempos de 35 proceso. El rendimiento, a aproximadamente 95%, es muy favorable porque la FSH no se une al adsorbente a pH

7,0. En general, se encontró que cromatografía de intercambio catiónico en la forma de una membrana cromatográfica es muy útil para la purificación de FSH biotecnológica o de la variante de FSH. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de un adsorbente de membrana catiónica en un método de purificación de FSH o la

40 variante de FSH. En una realización preferida, el adsorbente de membrana catiónica es un intercambiador de cationes adsorbente, preferiblemente un adsorbente de intercambio catiónico fuerte, hecho de celulosa regenerada y que tiene una matriz cromatográfica de ácido sulfónico formado en el núcleo central de celulosa.

En otro aspecto, el método de purificación de una FSH biotecnológica o una variante de FSH según la invención comprende las etapas de someter un líquido que contiene dicha FSH o una variante de FSH a 45  una cromatografía de intercambio aniónico,  una cromatografía de interacción hidrófoba,

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 una cromatografía de afinidad de los colorantes,  una cromatografía de intercambio catiónico opcional, y además a una cromatografía de intercambio aniónico adicional, que puede realizarse en cualquier orden,

5 en donde el método evita cualquier cromatografía de intercambio aniónico débil así como cualquier cromatografía de

fase inversa. En una realización, las etapas se llevan a cabo en el siguiente orden: una primera cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía de interacción hidrófoba, una cromatografía de afinidad de los colorantes, una cromatografía de intercambio catiónico opcional y una segunda cromatografía de intercambio aniónico.

10 La segunda cromatografía de intercambio aniónico puede realizarse utilizando resinas de intercambio aniónico típicas como se mencionó anteriormente en relación con la primera cromatografía de intercambio aniónico. También la segunda cromatografía de intercambio aniónico es preferiblemente un cromatografía de intercambio aniónico fuerte que se lleva a cabo utilizando una resina de intercambio aniónico fuerte que tiene grupos funcionales N+(CH3)3, o una resina que tiene características similares. Los ejemplos preferidos de resinas de intercambio

15 aniónico fuertes que pueden utilizarse para la invención son las resinas intercambiadoras de aniones fuertes de amonio cuaternario conocidas en la técnica como UNOsphere Q, Q Sepharose HP y otras resinas que tienen restos de amonio cuaternario (Q). Las características del intercambiador aniónico fuerte UNOsphereQ y Q Sepharose HP se han dado anteriormente en relación con la primera cromatografía de intercambio aniónico. Además en la segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico es preferible evitar el uso de resinas de intercambio aniónico

20 débiles, tales como las de dietilaminoetilo (DEAE) o dimetilaminoetilo (DMAE) como grupos funcionales. La etapa de cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo preferiblemente utilizando un tampón que tiene un pH ligeramente alcalino, p. ej., en o aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 9,0, o desde aproximadamente 7,5 hasta aproximadamente 8,5. Los tampones adecuados incluyen, por ejemplo, tampón de borato, trietanolamina/ácido iminodiacético Tris, acetato de amonio, tricina, bicina, TES, HEPES, TAPS. Se prefiere

25 el uso de un tampón Tris. La elución de la resina de intercambio aniónico se consigue normalmente aumentando la conductividad de la fase móvil mediante la adición de sal, preferiblemente cloruro de sodio. En una realización, la segunda cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo utilizando un tampón de Tris

HCl/cloruro de sodio como eluyente a un pH comprendido en el intervalo entre 7,0 y 9,0. En otro aspecto, el método de purificación de una FSH o de una variante de FSH biotecnológica según la invención

30 comprende las etapas de someter un líquido que contiene dicha FSH o variante de FSH a  una cromatografía de intercambio aniónico,  una cromatografía de interacción hidrófoba y  una cromatografía de afinidad de los colorantes, que puede realizarse en cualquier orden,

35 en donde el método evita cualquier cromatografía de intercambio aniónico débil, así como cualquier cromatografía de fase inversa, y

en donde el método comprende además una cromatografía de exclusión por tamaño. En otro aspecto, el método de purificación de una FSH biotecnológica o variante de FSH según la invención comprende las etapas de someter un líquido que contiene dicha FSH o variante de FSH a

40  una cromatografía de intercambio aniónico,  una cromatografía de interacción hidrófoba, -una cromatografía de afinidad de los colorantes,  una cromatografía de intercambio catiónico opcional,  una cromatografía de intercambio aniónico adicional opcional, y

45  una cromatografía de exclusión por tamaño, que puede realizarse en cualquier orden,

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en donde el método evita cualquier cromatografía de intercambio aniónico débil, así como cualquier cromatografía

de fase inversa. En una realización, las etapas se realizan en el orden siguiente: una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía de interacción hidrófoba, una cromatografía de afinidad de los colorantes, una cromatografía de intercambio catiónico opcional, una cromatografía de intercambio aniónico adicional opcional y una cromatografía de exclusión por tamaño.

En una realización preferida, el método de la invención comprende las etapas siguientes en el orden siguiente: una primera cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrófoba, una cromatografía de afinidad de los colorantes, una cromatografía de intercambio catiónico opcional, una segunda cromatografía de intercambio aniónico opcional y una cromatografía de exclusión por tamaño.

La cromatografía de exclusión por tamaño (CET), también conocida como cromatografía de filtración en gel, es un método cromatográfico en el que las partículas, p. ej., proteínas y otras biomoléculas, se separan en base a su tamaño. Un medio de gel típico para CET es poliacrilamida, dextrano, agarosa o una de sus mezclas. Las matrices de la CET están disponibles en varios fabricantes de accesorios y columnas de cromatografía, p. ej., en Tosoh Bioscience LLC o GE Healthcare.

La cromatografía de exclusión por tamaño se realiza preferiblemente utilizando una matriz de compuesto esférico de

agarosa reticulada y dextrano. Ejemplos de matrices de cromatografía de exclusión por tamaño útiles son las matrices conocidas en la técnica como Superdex 75 pg, disponibles por ejemplo en GE Healthcare. Las columnas Superdex 75 pg permiten la separación de alta resolución de proteínas, péptidos y otras biomoléculas según el tamaño. Generalmente, las columnas de exclusión por tamaño son ideales para la etapa de pulido en un procedimiento de purificación.

Los detalles técnicos de la matriz Superdex 75 pg son los siguientes: Límite de exclusión (Mr) 1 x 105 proteína globular Intervalo de separación (Mr) 3.000-70.000 proteína globular Matriz Compuesto esférico de agarosa reticulada y dextrano Tamaño medio de partículas 34 μm Estabilidad química Estable en todos los tampones comunes:

ácido acético 1 M, urea 8 M, hidrocloruro de guanidina 6 M,

alcohol isopropílico al 30%, etanol al 70%, NaOH 1 M (para limpieza en el lugar) Estabilidad de pH 3-12 (en funcionamiento y a largo plazo), 1-14 (a corto plazo ) Columnas Superdex™ 10/300 GL (Tricorn)* Dimensiones del lecho 10 x 300 mm Volumen de muestra recomendado 25 a 250 μl Volumen de lecho 24 ml Presión máx. 18 bar (261 psi, 1,8 MPa) Caudal máx.(H2O a 25ºC) 1,5 ml/min Platos teóricos > 30.000 m-1

Columnas Superdex™ PC 3.2/30 Dimensiones del lecho 3,2 x 300 mm Volumen del lecho 2,4 ml Volumen de muestra recomendado 2-25 μl Presión máx. 24 bar (348 psi, 2,4 MPa)

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adaptadas al uso del codón en células de ovario de hámster chino (CHO) con el fin de aumentar el nivel de expresión y el rendimiento de la FSH biotecnológica en estas células anfitrionas.

Un ejemplo de secuencias de ácidos nucleicos que codifican la FSH humana y que han sido modificados con respecto al uso del codón en las células CHO se describe en la solicitud de patente internacional WO 5 2009/000913. La secuencia de ácido nucleico modificado que codifica la cadena β de la FSH humana es la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico representada en SEQ. ID. nº 5 (en la SEC. ID nº 5 la región codificadora comienza en el nucleótido 56 y se extiende hasta el nucleótido 442 ), y la secuencia de ácido nucleico modificado que codifica la cadena α de FSH humana es la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico dada en SEQ. ID. nº 6 (en la SEQ. ID. nº 6 la región codificadora comienza en el nucleótido 19 y se extiende hasta

10 hasta el nucleótido 366). Una estirpe de células CHO que contiene una molécula de ácido nucleico recombinado que comprende una primera secuencia de ácido nucleico modificado que codifica la cadena β de FSH humana y una segunda secuencia de ácido nucleico modificado que codifica la cadena α de FSH humana se depositó el 28 de marzo de 2007 en la DSMZ en Braunschweig con el número de depósito DSM ACC2833.

En una realización preferida, la formulación líquida de FSH contiene una FSH natural humana biotecnológica que se

15 obtiene por expresión del gen recombinado a partir de secuencias de ácido nucleico de FSH que se modifican con respecto al empleo de codones en las células CHO con respecto tanto a la cadena β de FSH humana como a la cadena α de FSH. En otra realización preferida, la FSH biotecnológica se obtiene por la expresión de las secuencias de ácido nucleico de FSH descritas en el documento WO 2009/000913.

La expresión "variante de FSH" está concebida para abarcar las moléculas que difieren en la secuencia de

20 aminoácidos, modelo de glucosilación o en el enlace entre subunidades de la FSH humana, pero que presentan actividad de FSH. Los ejemplos incluyen CTP-FSH, una FSH biotecnológica modificada de acción prolongada, que consiste en la subunidad α natural y una subunidad β híbrida en la que el péptido del terminal carboxi de hCG se ha fusionado al terminal C de la subunidad β de FSH, como se describe en LaPoIt et al. (1992) Endocrinology, 131, 2514-2520; o en Klein et al. (2003) Human Reprod., 18, 50-56. También se incluye CTP-FSH monocatenaria, una

25 molécula monocatenaria descrita por Klein et al. (2002) Fertility & Sterility, 77, 1248-1255. Otros ejemplos de variantes de FSH incluyen moléculas de FSH que tienen secuencias de glucosilación adicionales incorporadas en la subunidad α y/o β, como se describe en el documento WO 01/58493, y moléculas de FSH con enlaces S-S entre subunidades, como se describe en el documento WO 98/58957. Otros ejemplos de variantes de FSH se describen en el documento WO 2004/087213, que se caracterizan por eliminaciones en el terminal carboxi de la subunidad

30 β. Otros ejemplos de variantes de FSH incluyen moléculas de FSH con un grado alterado de glucosilación en comparación con la FSH natural debido a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante los cuales se introducen secuencia(s) de glucosilación adicional(es) o se eliminan secuencia(s) de glucosilación de origen natural.

Además, la FSH o la variante de FSH según la invención pueden ser una molécula de FSH que ha sido modificada

35 por grupos químicos. Dichos conjugados de FSH pueden comprender, por ejemplo polialquilenglicol (tal como PEG), hidroxialquil-almidón (tal como HES) u otros grupos poliméricos.

Heterodímeros de FSH o heterodímeros de la variante de FSH se pueden producir por cualquier método adecuado, tal como por biotecnología, mediante aislamiento o purificación a partir de fuentes naturales o por síntesis química, o cualquier combinación de los mismos.

40 El empleo del término "recombinado" se refiere a preparados de FSH o de variantes de FSH que se producen mediante el empleo de ingeniería genética (véase por ejemplo el documento WO 85/01958). Las secuencias de los clones genómicos y de ADNc de FSH son conocidas por las subunidades α y β de varias especies. Varios métodos de producción de FSH biotecnológica o variantes de FSH que emplean ingeniería genética se describen en la técnica anterior, véase por ejemplo la solicitud de patente europea EP 0 711 894 y la solicitud de patente europea

45 EP 0 487 512.

Preferiblemente, la FSH purificada según la invención tiene una subunidad alfa según la SEQ. ID. nº 1 y una subunidad beta según la SEQ. ID. nº 2.

En otro aspecto, la descripción se refiere a una FSH o proteína de la variante de FSH purificadas obtenidas por el método de purificación según la invención.

50 La descripción se refiere además a una composición farmacéutica que comprende la FSH o la variante de FSH purificada empleando el método de la invención, así como un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la composición farmacéutica contiene un conservante y se puede utilizar para la administración de varias dosis. Las composiciones farmacéuticas preferidas se describen en el documento PCT/EP2009/051451.

Además, la invención se refiere también al uso de la FSH o a la variante de FSH purificada empleando el método de

55 la invención, o a la utilización de una composición farmacéutica que comprende dicha FSH o una variante de FSH en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables para el tratamiento de trastornos de la fertilidad.

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En otro aspecto, la invención se refiere a un método de producción de una FSH biotecnológica o de una variante de FSH biotecnológica que comprende las etapas siguientes:

a) obtención de un clon de la célula CHO que produce la FSH biotecnológica o la variante de FSH biotecnológica a partir de una o más moléculas de ácido nucleico recombinado que codifican la FSH o la variante de FSH,

5 b) cultivo de las células anfitrionas de CHO en condiciones adecuadas, y

c) purificación de la FSH biotecnológica o de la variante de FSH biotecnológica procedente del cultivo celular según el método de la invención.

La FSH humana biotecnológica se purifica a partir del sobrenadante de cultivo de células anfitrionas por el método de la invención. La FSH humana biotecnológica o la variante de FSH se produce preferiblemente como se describe

10 en la solicitud de patente internacional WO 2009/000913.

Más preferiblemente, la FSH es la FSH humana que se ha producido por ingeniería genética, en particular se ha producido preferentemente en células de ovario de hámster chino transfectadas con un vector o vectores que comprende(n) ADN que codifica la para la subunidad α de la glucoproteína humana y la subunidad β de FSH, ya sea codificada por la SEQ. ID. nº 3 y nº 4 (= secuencias de ácido nucleico naturales) o por la SEQ. ID. nº 5 y nº 6 (=

15 secuencias de ácidos nucleicos de codones optimizados). El ADN que codifica las subunidades α y β puede estar presente en el mismo o diferentes vectores.

La FSH biotecnológica presenta varias ventajas sobre su homóloga urinaria. Técnicas de cultivo y aislamiento que utilizan células biotecnológicas permiten consistencia entre lotes. En cambio, la FSH urinaria varía en gran medida de lote a lote en características tales como pureza, modelo de glucosilación, sialilación y oxidación de las

20 subunidades. Debido a la mayor consistencia y pureza lote a lote de FSH biotecnológica, la hormona puede ser fácilmente identificada y cuantificada empleando técnicas tales como isoelectroenfoque (IEF). La facilidad con la que la FSH biotecnológica puede identificarse y cuantificarse permite el llenado de viales por masa de hormona (llenado por masa) en lugar de llenado por bioanálisis.

La expresión "actividad de FSH" se refiere a la capacidad de una formulación de FSH para provocar respuestas

25 biológicas relacionadas con FSH, tales como aumento de peso ovárico en el ensayo de Steelman Pohley (Steelman et al. (1953) 53 Endocrinology, 604-616), o el crecimiento folicular en una paciente. El crecimiento folicular en una paciente puede ser evaluado por ultrasonidos, por ejemplo, en relación con el número de folículos que tienen un diámetro medio de aproximadamente 16 mm el 8º día de estimulación. La actividad biológica se evalúa con respecto a un patrón aceptado para FSH.

30 La actividad biológica específica in vivo de la FSH biotecnológica está comprendida por lo general en el intervalo de aproximadamente 8.000 UI de FSH/mg de proteína a aproximadamente 16.000 UI de FSH/mg de proteína. Por ejemplo, la FSH humana biotecnológica en el producto Puregon (de Organon) disponible en el mercado tiene una bioactividad específica de aproximadamente 10.000 IE/mg de proteína, y para Gonal-f de Serono la bioactividad de la FSH humana biotecnológica es de aproximadamente 13.600 IE/mg de proteína.

35 La actividad de FSH puede determinarse por métodos conocidos relacionados con FSH y otras gonadotropinas. Dichos métodos incluyen p. ej., el ensayo de inmunoactividad enzimática (EIA) o ensayos de gen indicador. La bioactividad se determina generalmente por el bioanálisis descrito en la Farmacopea Europea, 5ª edición para FSH procedente de orina, estimándose la bioactividad comparando el efecto de FSH en la ampliación de los ovarios de ratas inmaduras tratadas con gonadotropina coriónica con el mismo efecto de un preparado patrón

40 .

La actividad biológica de la FSH o de la variante de FSH se puede evaluar comparando, en las condiciones dadas, su efecto en la ampliación de los ovarios de ratas inmaduras tratadas con gonadotropina coriónica con el mismo efecto utilizando un preparado patrón internacional o de un preparado de referencia calibrado en unidades internacionales (Farmacopea Europea, 5ª edición).

45 La medición de la actividad de FSH in vitro la describe, p. ej. Albanese et al. (1994) Mol. Cell Endocrinol. 101: 211

219.

La pureza de la FSH o de la variante de FSH obtenido por el método de la invención es al menos 95%, preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 99% y más preferiblemente más de 99%. El grado de pureza puede determinarse mediante el análisis HPLC. Los materiales y protocolos adecuados para la realización de

50 dicho análisis se pueden obtener de proveedores comerciales tales como Vydac o TOSOH Bioscience.

Los ejemplos siguientes se proporcionan simplemente para ilustrar más el método de purificación de la invención. El alcance de la invención no debe interpretarse como meramente consiste en los ejemplos siguientes.

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Ejemplos

Ejemplo 1 Preparación de una FSH humana biotecnológica por ingeniería genética La FSH humana biotecnológica se produce en células anfitrionas CHO transfectadas por métodos

5 normalizados. Estos métodos incluyen la generación de un clon de células CHO que produce FSH humana biotecnológica a partir de una o más moléculas de ácido nucleico recombinado que codifican la cadena α y la cadena β de la FSH humana, y el cultivo de las células anfitrionas en condiciones adecuadas. La FSH humana biotecnológica se purifica a continuación a partir del cultivo celular según la invención.

En una realización preferida, la FSH humana biotecnológica se produce como se describe en la solicitud de patente 10 internacional WO 2009/000913. Ejemplo 2 Purificación de FSH a partir de cultivo celular El esquema de purificación es el siguiente: Etapa de cromatografía de intercambio aniónico 15 ↓ Etapa CIH ↓ Etapa de afinidad de colorantes ↓ 20 Inactivación de virus ↓ 10 kDa UF/DF ↓ Adsorbente de membrana catiónica 25 ↓ Etapa de cromatografía de intercambio aniónico ↓ 10 kDa UF ↓ 30 Etapa de cromatografía de exclusión por tamaños ↓

Nanofiltración La duración de la fermentación fue de 28 días, y el volumen de fermentación fue de 30 l. La recolección se filtró por 0,22 μm y se diluyó con agua RO por el factor 3,5.

35 Etapa de cromatografía de intercambio de aniónico (CIA): La recolección de sobrenadante de cultivo celular diluida se aplicó a la cromatografía de intercambio aniónico utilizando la resina de intercambio aniónico fuerte de amonio cuaternario conocida en la técnica como UNOsphere

Q. Esta matriz está disponible de BioRad.

Tres volúmenes de columna (VC) de Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 se utilizaron para el equilibrado. La columna se cargó 40 con la recolección (diluida 1:3,5 con agua RO; el valor de la recolección fue de aprox. 1,8 μg de FSH/ml) y se lavó después con Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 (5 VC). A continuación, la columna se lavó con Tris-HCl 50 mM, NaCl 15 mM,

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Etapa de cromatografía de intercambio aniónico: Se llevó a cabo una segunda cromatografía de intercambio aniónico utilizando la resina de intercambio aniónico fuerte de amonio cuaternario conocida en la técnica como Q Sepharose HP. Esta resina está disponible en GE Healthcare. 5 La columna de CIA se equilibró con Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 (3 VC). El conjunto flujo a través adsorbente de membrana se cargó en la columna (3 VC), y la columna se lavó en primer lugar con Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 (2 VC),

luego con Tris-HCl 20 mM, pH 8,5 (3 VC) y por último se lavó con Tris-HCl 20 mM, NaCl 60 mM, pH 8,5 (5 VC). A continuación, la FSH se eluyó con Tris-HCl 20 mM, NaCl 130 mM, pH 8,5 (6 VC). El eluido de Q Sepharose HP tiene una pureza muy alta comparable con el producto comercial GONAL-f®.

10 10 kDa UF: Se llevó a cabo la ultrafiltración 10 kDa según protocolos habituales utilizando el casete de ultrafiltración Sartocon

(PESU, 10 kD) de Sartorius (área de filtro: 3.000 cm2, factor de UF: 10-30, carga: 0,2 a 1,0 mg de FSH/cm2). La ultrafiltración se llevó a cabo generalmente con factores de ultrafiltración (concentración) 10 a 30. Etapa de cromatografía de exclusión por tamaños (CET):

15 La cromatografía de exclusión por tamaños se realizó utilizando Superdex 75 pg, disponible en GE Healthcare. La columna se equilibró utilizando 50 mM Na-PO4, pH 7,0 (2 VC). Lo retenido de UF 10 kDa se cargó en la columna (0,025 VC), y la columna se lavó después con Na-PO4 50 mM, pH 7,0 (2 VC). El eluido de la CET tiene una alta pureza en el mismo intervalo que el producto comercial GONAL-f®. Nanofiltración:

20 Finalmente el eluido de la CET se nanofiltró utilizando filtros Planova 15N, comercializados por Asahi Kasei Medical Co., Ltd., siendo el tamaño medio de poro de 15 nm. La carga máxima objetivo era 2,5 ml/cm2. La filtración se realizó según el protocolo del proveedor.

La pureza de la FSH purificada se midió por SE-HPLC y SDS-PAGE. La pureza e impurezas especificadas de la FSH obtenida fueron las siguientes: 25 SE-HPLC (dímeros y sustancias afines de masa molecular superior < 1% SDS-PAGE red. (coloidal) pureza > 97% HCP (genérica) < 10 ppm ADN < 0,006 pg/UI de FSH La bioactividad de la FSH humana biotecnológica se determinó como por lomenos aproximadamente 10.000 UI/mg.

30 Preferiblemente, la bioactividad de la FSH humana biotecnológica o la variante de FSH es el intervalo de aproximadamente 10.000 UI/mg a aproximadamente 17.000 UI/mg, más preferiblemente la bioactividad es por lo menos aproximadamente 12.000 UI/mg, y aún más preferiblemente la bioactividad es por lo menos aproximadamente 15.000 UI/mg.

Listado de secuencias:

35 SEQ. ID. nº 1: secuencia de aminoácidos de la cadena α de la FSH humana SEQ. ID. nº 2: secuencia de aminoácidos de la cadena β de la FSH humana SEQ. ID. nº 3: secuencia de ácido nucleico natural que codifica la cadena α de la FSH humana SEQ. ID. nº 4: secuencia de ácido nucleico natural que codifica la cadena β de la FSH humana SEQ. ID. nº 5: secuencia de ácido nucleico optimizada en el codón que codifica la cadena β de la FSH

40 humana SEQ. ID. nº 6: secuencia de ácido nucleico optimizada en el codón que codifica la cadena α de la FSH humana

Claims

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