ES2552456T3 - Mutantes de frataxina - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que tiene al menos un 90% de secuencia idéntica a SEQ ID NO:1 y que comprende un residuo R en la posición correspondiente a la posición 147 de SEQ ID NO:1

Description

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Mutantes de frataxina

Descripcion

CAMPO

[0001] Este invento se relaciona generalmente con composiciones utiles para tratar la Ataxia de Friedreich (FRDA). De forma mas especlfica, el invento esta relacionado con la identificacion de la protelna frataxina mutante y metodos para liberar esta protelna en las celulas.

ANTECEDENTES

[0002] La enfermedad. La FRDA es una enfermedad rara que afecta a >20.000 individuos de poblacion caucasica. Aparece entre los 10 y 15anos y conduce a una perdida de la locomocion y a una discapacidad total, con muerte prematura a causa de insuficiencia cardlaca. Los slntomas suelen aparecer a finales de la primera decada o a principios de la segunda decada de vida e incluyen inestabilidad motora y torpeza general. La ataxia motora tiene caracterlsticas tanto a nivel de cerebelo como sensoriales, incluyen tronco y miembros inferiores y es progresiva y generalmente sin tratamiento. El balanceo es comun y, a medida que se vuelve mas grave, requiere de un soporte constante y del uso de una silla de ruedas. La disartria o afasia se presenta en una frase temprana de la enfermedad y finalmente conduce a una discapacidad total para hablar. Ademas, la disfagia es una caracterlstica tardla que puede requerir alimentacion artificial. El principal hallazgo patologico es la perdida de neuronas perifericas en los ganglios de la espina dorsal. La hipertrofia ventricular caracteriza el cuadro cardlaco, y progresivamente puede conducir a un fallo cardlaco congestivo y a arritmias mortales. Una significativa minorla de pacientes tambien desarrollan diabetes mellitus por mecanismos que todavla no estan claramente definidos.

[0003] La FRDA esta causada por una hiperexpansion de tripletes homicigoticos GAA dentro del primer intron de FXN, un gen de cinco exones localizado en el brazo largo del cromosoma 9 humano, que codifica la protelna frataxina. Las expansiones patologicas de GAA (desde ±70 a >1.000 tripletes) da lugar a estructuras de ADN “pegajosas” y cambios epigeneticos que reducen gravemente la transcripcion del gen FXN. Los pacientes con FRDA viven con un 10-30% de frataxina residual, y la gravedad de la enfermedad normalmente es proporcional al numero de tripletes GAA y al grado de reduccion de frataixna. Una minorla de pacientes con FRDA, los llamados componentes heterocigoticos, tienen expansiones patologicas de GAA en u alelo FXN y mutaciones de perdida de funciones en el otro.

[0004] Enfoques terapeuticos en la actualidad. Actualmente no hay una terapia especlfica para impedir el avance de la enfermedad. La mayorla de enfoques terapeuticos estan enfocados a reducir la disfuncion mitocondrial y la sobrecarga de hierro y, por lo tanto, se basan en el uso de antioxidantes de los quelatos de hierro y de la idebenona, un analogo sintetico de la ubiquinona con ensayos antioxidantes. Ademas de esto, como los niveles de frataxina residual son cruciales para determinar la gravedad de la enfermedad, se han hecho muchos esfuerzos para identificar las moleculas que aumentan la transcripcion de frataxina (Gottesfeld 2007; Marmolino and Acquaviva 2009). Se ha obserbvado que una nueva clase de inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC) invierten la falta de FXN en las celulas con FRDA y actualmente esta en fase de evaluation precllnica (Rai et al., 2008). Tambien se ha observado recientemente que el agonista Azelaoil PAF (PPAR-gamma) del gamma receptor activado por un proliferador del peroxisoma, aumenta la transcripcionde FXN y actualmente hay una serie de agonistas de PPAR- gamma en fase precllnica. Otro agonista PPAR-gamma, la pioglitazona antidiabetica, extensamente utilizada, esta entrando en la fase III del ensayo para el tratamiento de la FRDA. Finalmente, se ha observado que la eritropoyetina parece incrementar los niveles de frataxina por medio de mecanismos desconocidos (WO 2006/050819). La eritropoyetina recombinante como tratamiento de la FRDA esta actualmente en fase II de los ensayos cllnicos.

[0005] Mientras que se han explorado numerosos enfoques para tratar la FRDA, cada uno de ellos tiene significativas limitaciones. Asl, existe una necesidad en este campo, para encontrar nuevos metodos mas eficaces para tratar la FRDA.

RESUMEN

[0006] Esta divulgation esta dirigida a las necesidades que desde hace tiempo en el campo de la medicina existen para obtener composiciones nuevas para tratar la Ataxia de Friedreich.

[0007] Dicho brevemente, esta divulgacion proporciona composiciones para utilizar en el tratamiento de la Ataxia de Friedreich (FRDA). Esta divulgacion hace referencia a los nuevos mutantes de la frataxina, nucleotidos que codifican dichos mutantes, la liberation de los mismos y el uso de dichos mutantes de la frataxina en el tratamiento de la FRDA.

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[0008] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona un polipeptido aislado que tiene al menos entre un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de la misma secuencia que la secuencia del amionoacido de la Figura 1 y que comprende un residuo R en una posicion que corresponde a la posicion 147 de la Figura 1.

[0009] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona una molecula aislada de acido nucleico que tiene una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene al menos entre un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de la misma secuencia que la secuencia del aminoacido de la Figura 1.

[0010] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona una molecula aislada de acido nucleico que tiene una secuencia de acido nucleico que codifica un nucleotido que tiene al menos entre un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de la misma secuencia que la secuencia de la misma longitud que la de la Figura 2.

[0011] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona composiciones que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido aislado en esta divulgacion, de forma optativa junto a uno o mas excipientes, diluyentes, preservativos, solubilizantes, emulsificantes, coadyuvantes o portadores, farmaceuticamente aceptables.

[0012] En otros aspectos, esta divulgacion proporciona composiciones farmaceuticas de la misma, para utilizar en el tratamiento de la Ataxia de Friedreich.

[0013] En ciertos aspectos, esta divulgacion proporciona composiciones farmaceuticas que incluyen un portador seleccionado entre un grupo consistente en un liposoma, un microportador polimerico, un exosoma, un portador bacteriano, y un equivalente funcional de los mismos, para usar en la liberacion del polipeptido aislado dentro de una celula. En otros aspectos,el polipeptido aislado se ha fusionado con una protelna transductora. Y, aun en otros aspectos, el polipeptido aislado se libera en la celula de la persona que sufre la Ataxia de Friedreich.

[0014] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un sistema portador seleccionado de un grupo consistente en un sistema vlrico, un sistema de hlbrido sintetico-vlrico, un sistema no vlrico, y un equivalente funciona de ellos, para utilizarse en la liberacion del polipeptido aislado, dentro de la celula.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0015]

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoacidos de la frataxina (SEQ ID NO:1). Los aminoacidos 1-210 representan al precursor de la frataxina, y la secuencia en cursiva (81-210) corresponde a la frataxina madura. Se ha subrayado la lisina en la posicion 147.

La Figura 2 muestra la secuencia de nucleotidos del gen FXN, que codifica la protelna humana frataxina.

La Figura 3 A muestra 293 celulas Flp-In que expresan deformaestable la frataxina1-210 (frataxina-293) o el mutantes K147R de la frataxina (frataxina mutante K147R). Las celulas se trataron durante el tiempo indicado, con 100 mg/ml de ciclohexamida (CHX) para bloquear nuevas slntesis de protelna. Las protelnas quedaron reflejadas en la PAGE-SDS y se manifestaron con anticuerpos de antifrataxina o antitubulina como control de carga. Pre: precursor de la frataxina. Se muestra un experimento representativo de tres que se realizaron con similares resultados.

La Figura 3 B muestra un analisis densitometrico de niveles de precursor de la frataxina, como se observa en la Figura 3 A, normalizados a niveles de tubulina. La grafica muestra el descenso, dependiente del tiempo, en el tratamiento de la CHX. WT: celulas de frataxina-293, K147R: celulas de frataxina-293 K147R.

La Figura 4 muestra celulas HeLa que fueron inyectadas de forma transitoria con frataxina1-210 etiquetada con HA, o con el mutante de la frataxina K147R etiquetado con HA. Los extractos de protelnas, en los dlas indicados despues de la inyeccion, se reflejaron en la PAGE-SES y se manifestaron con anticuerpos anti-HA o anti-tubulinna como control de carga. Pre: precursor de la frataxina; int: intermedia; mat: madura; tub: tubulina. Se muestra un experimento representativo de tres que se realizaron con similares resultados.

DESCRIPCION DETALLADA

[0016] Las explicaciones siguientes de terminos y metodos sirven para describir mejor esta divulgacion y servir de gula a los expertos en este campo, en la practica de esta divulgacion. Tal como se utiliza aqul, “comprende” significa “incluye” y las formas singulares “un, una, el, la” incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Por ejemplo, la referencia a “comprende una celula” incluye una o una pluralidad de tales celulas, y as! con lo demas. El termino “o” se refiere a un elemento singular de una serie de elementos alternativos que se hayan nombrado o a una combinacion de dos o mas elementos, a menos que el contexto

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claramente indique otra cosa.

[0017] A menos que se indique otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en este documento, tienen los mismos significados que los que se entienden comunmente por todos los expertos en el campo al que pertenece esta divulgacion. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los que aqul se describen, puede usarse en la practica o prueba de esta divulgacion, a continuacion se describen metodos y materiales mas adecuados. Los materiales, metodos y ejemplos son puramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Otras caracterlsticas de esta divulgacion son aparentes a partir de las descripciones y reivindicaciones detalladas a continuacion.

[0018] Ciertos terminos se discuten en este documento para servir de gula adicional al experto para describir las composiciones, dispositivos, metodos y demas aspectos del invento, y como hacer uso de los mismos. Apreciarlamos se lo mismo se dijera en mas de una manera. En consecuencia, puede usarse un lenguaje alternativo y sinonimos para uno o mas terminos discutidos aqul. No se tendra en cuenta si un termino se ha elaborado o discutido en este documento. Se proporcionan algunos sinonimos o metodos sustitutivos, materiales y demas. Los considerandos de uno a varios sinonimos o equivalentes no excluyen el uso de otros sinonimos o equivalentes, a menos que se haya indicado expllcitamente. El uso de ejemplos, incluido ejemplos de terminos, es solo con propositos ilustrativos y no limita el ambito y significado de los aspctos del invento.

[0019] El termino “peptido” se utiliza aqul para referirse a un polipeptido corto, es decir, uno que tenga menos de unos 50 aminoacidos de longitud y, mas comunmente, cerca de unos 30. El termino, tal como se usa aqul, abarca analogos e identicos que tengan ua fucion estructural y biologica identica.

[0020] El termino “protelna aislada” o “polipeptido aislado” es una protelna o polipeptido que, en virtud de su origen o derivation (1), no esta asociado con componentes asociados de forma natural, que lo acompanan en su estado de origen, (2) existe en un grado de pureza que no se encuentra en la naturaleza, en la que la pureza puede ser adjudicada con respecto a la presencia de otro material celular (por ejemplo, esta libre de otras protelnas de la misma especie), (3) se expresa en forma de una celula de diferentes especies, o (4) no se da en la naturaleza (por ejemplo, un fragmento de un polipeptido encontrado en la naturaleza o que incluye aminoacidos analogos o derivados que no se encuentran en la naturaleza o uniones distintas a las uniones peptldicas estandar). Asl, pun polipeptido que se ha sintetizado qulmicamente o que se ha sintetizado en un sistema celular distinto de la celula de la que se origina de forma natural, se “aislara” de sus componentes naturalmente asociados. Un polipeptido o protelna tambien pueden pasar a ser sustancialmente libres de componentes naturalmente asociados por aislamiento, usando tecnicas de purification de protelnas bien conocidas en este campo. Tal como se ha definido, “aisladas” no necesariamente requieren que la protelna, polipeptido, peptido u oligopeptido descrito hay sido retirado de su entorno nativo.

[0021] El termino “fragmento de polipeptido” tal como se usa aqul, hace referencia a un polipeptido que tiene una supresion, por ejemplo, un terminal amino y/o carboxllico suprimido, en comparacion con un polipeptido en toda su longitud. En una modalidad preferida, el fragmento de polipeptido es una secuencia contigua en la que la secuencia de aminoacidos del fragmento es identica a las posiciones del correspondiente en estado natural. Los fragmentos tienen, normalmente, al menos 5,6,7,8,9 o 10 aminoacidos de longitud, preferiblemente al menos 12, 14, 16 o 18, y aun con mas preferencia, al menos 20 aminoacidos de longitud, mas preferiblemente al menos 25, 30, 40 o 45 aminoacidos, incluso mas preferiblemente al menos 50 o 60 aminoacidos de longitud, e incluso mas preferiblemente al menos 70 aminoacidos de longitud.

[0022] Una protelna tiene “homologla” o es “homologa” con una segunda protelna si la secuencia de acido nucleico que codifica la protelna tiene una secuencia similar a la secuencia de acido nucleico que codifica la segunda protelna. De forma alternativa, una protelna tiene homologla con una segunda protelna, si las dos protelnas tienen secuencias de aminoacidos “similares”. (Asl, el termino “protelnas homologas” se define para explicar que las dos protelnas tienen secuencias de aminoacidos similares). Tal como se usa aqul, la homologla entre dos regiones de una secuencia de aminoacidos (especialmente respecto a similitudes estructurales predichas) se interpreta como que implica una similitud en funciones.

[0023] Cuando “homologo” se utiliza en referencia a protelnas o peptidos, se reconoce que las posiciones residuales que no son identicas, a menudo difieren en sustituciones conservadoras de aminoacidos. Una “sustitucion conservadora de aminoacidos” es aquella en la que el residuo aminoacido es sustituido por otro residuo aminoacido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades qulmicas similares (por ejemplo, carga hidrofobica). En general, una sustitucion conservadora de aminoacidos no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de la protelna. En casos en los que dos o mas secuencias de aminoacidos difieran de cada una de las sustituciones conservadoras el porcentaje de identidad secuencial o grado de homologla no se ajustara para corregir la naturaleza conservadora de la sustitucion. Hay metodos para hacer estos ajustes, bien conocidos por los expertos en este campo. Vease, por ejemplo, Pearson, 1994, Methods Mol.Biol. 24:307-31 y 25:365-89.

[0024] Los siguientes seis grupos, contienen cada uno aminoacidos que son sustituciones conservadores de otros:

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1) serina (S), Treonina (T); 2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E) ; 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R) , Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V) y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). La Tabla 1 es una matriz de sustitucion aminoacida BLOSUM62.

Tabla 1

Matriz de sustitucion de aminoacida BLOSUM62

Referencia: Henikoff, S. and Henikoff, J.G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919

A B C D E F G H I K L M N P Q R S T V W X Y Z

A

4 -2 0 -2 -1 -2 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 1 0 0 -3 -1 -2 -1

B

-2 6 -3 6 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -1 -3 -4 -1 -3 2

C

0 -3 9 -3 -4 -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -1 -2 -4

D

-2 6 -3 6 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -1 -3 -4 -1 -3 2

E

-1 2 -4 2 5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -1 -2 5

F

-2 -3 -2 -3 -3 6 -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1 1 -1 3 -3

G

0 -1 -3 -1 -2 -3 6 -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 -2 -1 -3 -2

H

-2 -1 -3 -1 0 -1 -2 8 -3 -1 -3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 -1 2 0

I

-1 -3 -1 -3 -3 0 -4 -3 4 -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 -1 -3

K

-1 -1 -3 -1 1 -3 -2 -1 -3 5 -2 -1 0 -1 1 2 0 -1 -2 -3 -1 -2 1

L

-1 -4 -1 -4 -3 0 -4 -3 2 -2 4 2 -3 -3 -2 -2 -2 -1 1 -2 -1 -1 -3

M

-1 -3 -1 -3 -2 0 -3 -2 1 -1 2 5 -2 -2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -2

N

-2 1 -3 1 0 -3 0 1 -3 0 -3 -2 6 -2 0 0 1 0 -3 -4 -1 -2 0

P

-1 -1 -3 -1 -1 -4 -2 -2 -3 -1 -3 -2 -2 7 -1 -2 -1 -1 -2 -4 -1 -3 -1

Q

-1 0 -3 0 2 -3 -2 0 -3 1 -2 0 0 -1 5 1 0 -1 -2 -2 -1 -1 2

R

-1 -2 -3 -2 0 -3 -2 0 -3 2 -2 -1 0 -2 1 5 -1 -1 -3 -3 -1 -2 0

S

1 0 -1 0 0 -2 0 -1 -2 0 -2 -1 1 -1 0 -1 4 1 -2 -3 -1 -2 0

T

0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -2 -1 -1 -1 -1 0 -1 -1 -1 1 5 0 -2 -1 -2 -1

V

0 -3 -1 -3 -2 -1 -3 -3 3 -2 1 1 -3 -2 -2 -3 -2 0 4 -3 -1 -1 -2

W

-3 -4 -2 -4 -3 1 -2 -2 -3 -3 -2 -1 -4 -4 -2 -3 -3 -2 -3 11 -1 2 -3

X

-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1

Y

-2 -3 -2 -3 -2 3 -3 2 -1 -2 -1 -1 -2 -3 -1 -2 -2 -2 -1 2 -1 7 -2

Z

-1 2 -4 2 5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -1 -2 5

[0025] La homologacion de secuencias para polipeptidos, a las que se refiere como porcentaje de identidad de secuencias, es un software de analisis de secuencias utilizando medidas tipicas. Vease por ejemplo Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group (GCG), niversity of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705. El software de analisis de proteinas hace concordar las secuenciassimilares utilizando una medida de homologia asignada a varias sustituciones, borrados y otras modificaciones, incluidas sustituciones conservadoras de aminoacidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit”, que pueden utilizarse con parametros defectuosos para determinar la homologia de secuencias o la identidad de secuencias entre polipeptidos intimamente relacionados, tales como los polipeptidos homologos de diferentes especies de organismos entre una proteina salvaje y una mutante de la misma. Vease por ejemplo, GCG Version 6.1.

[0026] Un algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de polipeptidos en particular en una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de distintos organismos, es el programa informatico BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth. Enzymol, 266 : 131-1412 (1996) ; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997) ; Zhang and Madden, Genome Res. 7 :649-656 (1997), especially blastp ortblastn (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997)).

[0027] Los parametros preferidos por BLASTp son : Valor esperado : 10 (defecto) ; Fitro:seg (defecto); Coste para abrir un intervalo: 11 (defecto); Coste para extender un defecto: 1 (defecto); n° maximo de alineaciones: 100(defecto); tamano de la letra: 11(defecto); N° de descripciones: 100 (defecto); Matriz de penalizacion: BLOSUM62.

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[0028] Una persona experta en este campo tambien puede usar el programa ALIGN que incorpora un algoritmo no linear de Myers and Miller (Comput. Appl. Biosci (1988) 4:11-17). Para la comparacion de secuencias de aminoacidos con el programa ALIGN, un experto en este campo puede usar una tabla de peso residual PAM 120, una penalizacion por longitud de intervalo de 12, y una penalizacion de intervalo de 4.

[0029] La longitud de las secuencias de polipeptidos comparado con la homologla, generalmente sera de al menos 16 aminoacidos residuales, normalmente de al menos 20 reslduos, mas normal de al menos 24 reslduos, tlpicamente de al menos 28 reslduos y, preferiblemente mas de 35 reslduos. Al buscar una base de datos que contenga secuencias de un gran numero de organismos distintos, es preferible comparar secuencias de aminoacidos. Las bases de datos que buscan secuencias de aminoacidos pueden medirse por algoritmos distitntos al conocido en este campo, el blastp. Por ejemplo, pueden compararse secuencias de polipeptidos con FASTA, un programa en GCG Version 6.1. FASTA proporciona la identidad de secuencias de porcentajes y alineaciones de las regiones que mejor se solapan entre las secuencias de consulta y de busqueda. Pearson, Methods Enzymol 183:63-98 (1990). Por ejemplo, la identidad de secuencia de porcentajes entre secuencias de aminoacidos puede determinarse usando FASTA con sus parametros por defecto (un tamano de palabras de 2 y la matriz de puntuacion PAM250), tal como se proporciona en GCG Version 6.1.

[0030] Molecula de Acido Nucleico; El termino “molecula de acido nucleico”o “polinucleotido” hace referencia a nucleotidos polimericos de, al menos, una longitud de 10 bases. El termino incluye moleculas de ADN (por ejemplo, moleculas de ARN y sinteticas o genomicas o ADNc (por ejemplo, ARNm o ARN sintetico), as! como analogos de ADN o ARN que contienen analogos de nucleotidos no naturales, con enlaces internucleosidos no nativos o ambos. El acido nucleico puede estar en cualquier conformacion tipologica. Por ejemplo, el acido nucleico puede ser de helice simple doble, triple, cuadruple,parcial doble, recogida, circular o en una conformacion en candado. Si es de helice simple, la molecula de acido nucleico puede ir en sentido de la helice o en sentido contrario. “Molecula de acido nucleico” incluye a moleculas de acido nucleico que no se den de forma natural.

[0031] Aislada: Un acido nucleico “aislado” o polinucleotido (1)(por ejemplo, un pollmero mezclado o ADN o ARN)es uno que se ha separado sustancialmente de otros componentes celulares que de forma natural acompanan al polinucleotido nativo en su celula huesped, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, y secuencias genomicas con las que estan asociados de forma natural, (2) no esta asociado con todo o con una parte de un polinucleotido en el que el “polinucleotido aislado” se encuentre en la naturaleza, (3) este operativamente unido a un polinucleotido que no esta unido en la naturaleza, o (4) no se da en la naturaleza. El termino “aislado” o “sustancialmente puro” tambien puede utilizarse en referencia a ADN clonado o recombinante, analogos de polinucleotidos sintetizados qulmicamente, o analogos de polinucleotidos que se sintetizan biologicamente por sistemas heterologos. No obstante, “aislado” no necesariamente requiere que el acido nucleico o polinucleotido descrito, haya sido flsicamente extraldo de su entorno nativo. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleio endogena en el genoma de un organismo, aqul se considera “aislada” si una secuencia heterologa (es decir, una secuencia que no esta naturalmente unida a su secuencia endogena de acido nucleico) se coloca al lado de la secuencia endogena de acido nucleico, de forma que la expresion de la secuencia endogena de este acido nucleico esta alterada. A modo de ejemplo, una secuencia promotora no nativa puede sustituirse (por ejemplo una recombinacion homologa) por el promotor nativo de un gen en el genoma de una celula humana, de forma que este gen tiene un patron de expresion alterado. Este gen se convertirla en “aislado” porque se ha separado de al menos algunas de las secuencias que lo flanquean de forma natural. Un aido nucleico tambien se considera ’’aislado” si contiene algunas modificaciones que no ocurren de forma natural en el correspondiente acido nucleico de un genoma. Por ejemplo, una secuencia de codificacion endogena se considera “aislada” si contiene una insercion, borrado o una mutacion introducida artificialmente, por ejemplo, por intervencion humana. Un “acido nucleico aislado” tambien incluye a un acido nucleico integrado en un cromosoma de una celula huesped en una colocacion heterologa, as! como una creacion de acido nucleico presente en un episoma. Ademas, un “acido nucleico aislado” puede estar sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros qulmicos cuando se sintetiza qulmicamente. El termino tambien incluye moleculas de acido nucleico y protelnas preparadas por recombinacion en celulas huesped, asi como moleculas de acido nucleico sintetizadas y protelnas.

[0032] El termino “identidad de porcentaje secuencial” o “identico” en el contexto de secuencias de acido nucleico, hace referencia a los nucleotidos de dos secuencias que son los mismos cuando estan alineados en su correspondencia maxima. La longitud de comparacion de identidad de secuencias puede ser en un tramo de al menos 28 nucleotidos, mas tlpico de al menos 32 nucleotidos, y preferiblemente al menos alrededor de 36 o mas nucleotidos. Hay varios algoritmos distintos conocidos en este campo, que pueden usarse para medir la identidad de la secuencia de nucleotidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleotidos pueden compararse usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisonsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. FASTA proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencias de regiones con el mejor solapamiento entre secuencias de consulta y busqueda. Pearson, Methods Enzymol 183:63-98 (1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de acido nucleico puede determinarse utilizando FASTA con sus parametros por defecto (tamano de letra de 6 y el factor NOPAM de la matriz de puntuacion) o con el Gap, con sus parametros por defecto, tal como se proporciona en GCG Version 6.1. De forma alternativa, las secuencias

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pueden compararse utilizando el programa informatico BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al., Meth.Enzymol 266:131-141 (1996); Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997) ; Zhang and Madden, Genome Res. 7 :649-656 (1997)), en especial blastp o tblastp (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 (1997)).

[0033] Un ejemplo particular, no limitante, de un algoritmo utilizado en la comparacion de secuencias de Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. (1990) USA 87:2264-68; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:5873-77), como se utilizo en los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul et al. (J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10). Pueden efectuarse busquedas de nucleotidos por BLAST, con el programa NBLAST, puntuacion =100, longitud de palabra=12, para obtener secuencias de nucleotidos homologas a moleculas de acido nucleico del invento. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al. (Nucleic Acids Research (1997) 25(17):3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parametros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) (vease la pagina web de BLAST de National Center for Biotechnology Information).

[0034] Purificado: El termino purificado no necesita una pureza absoluta; sino mas bien como termino relativo. Asl, por ejemplo, la preparacion de un producto purificado, es aquel en que el producto esta mas concentrado que el producto en su entorno dentro de la celula. Por ejemplo, una cera purificada es aquella que esta sustancialmente separada de los componentes celulares (acidos nucleicos, llpidos, carbohidratos, y otros peptidos) que pueden acompanarla. En otro ejemplo, una preparacion de cera purificada es aquella en la que la cera esta sustancialmente libre de contaminantes, como aquellos que pueden estar presentes durante la siguiente presentacion.

[0035] Recombinante: Una molecula de protelna o acido nucleico recombinante es aquella que tiene una secuencia que no se da de forma natural, tiene una secuencia hecha artificialmente combinando dos segmentos de secuencia, que de otra forma estarlan separados, o ambos. Esta combination artificial se puede conseguir, por ejemplo, por una slntesis qulmica o por la manipulation artificial de segmentos aislados de protelnas o moleculas de acido nucleico, tales como tecnicas de ingenierla genetica. La recombination tambien se utiliza para describir moleculas de acido nucleioc que se han manipulado artificialmente, pero que contienen las mismas secuencias regulatorias y regiones de codification, que las que se encuentran en los organismos en los que el acido nucleico ha sido aislado.

[0036] “Union especlfica” hace referencia a la capacidad de dos moleculas para unirse una a la otra antes que unirse a las moleculas del entorno. Tlpicamente, las “uniones especlficas” discriminan las uniones adventicias en una reaction de al menos dos pliegues, mas bien al menos 10, a menudo al menos 100. Tlpicamente, la afinidad o rapidez de una reaccion de union especlfica, cuantificada por la constante de disociacion, de de 10-7 o mas fuerte (por ejemplo, alrededor de 10-8 M, 10's M o incluso mas fuerte).

[0037] En general, “la hibridacion astringente” ser realiza a unos 25°C por debajo del punto de fusion (Tm ) para el hlbrido especlfico de ADN bajo unas condiciones particulares. La Tm es la temperatura a la cual se hibridiza un 50% de la secuencia deseada para obtener una investigation que concuerde perfectamente. Vease Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) page 9.51. Para los propositos aqul descritos, “condiciones astringentes” se definen para una hibridacion en fase de solution como hibridacion acuosa (por ejemplo, libre de formamida) in 6xSSC (donde20xSSC contiene 3.0 M de cloruro sodico y 0,3 M de citrato sodico), 1% SDS a 65°C durante 8-12 horas, seguido de dos lavados en 0,2xSSC 0,1% SDS a 65°C durante 20 minutos. El experto agradecerla que la hibridacion a 65°C ocurra a diferentes grados segun un numero de factores, incluidos la longitud y porcentaje de identidad de las secuencias que esten hibridando.

[0038] Un ejemplo preferido, no limitante, de condiciones de hibridacion astringente incluyen la hibridacion en 4x clorato de sodio/citrato de sodio (SSC) a 65-70°C (o hibridacion en 4xSSC mas un 50% de formamida a 42-50°C) seguido de uno o mas lavados en 1xSSC, a 65-70°C. Un ejemplo, no limitante, de condiciones de hibridacion altamente astringente, incluyen una hibridacion en 1xSSC, a 65-70°C (o hibridacion en 1xSSC mas un 50% de formamida a 50°C) seguido de uno o mas lavados en 0,3xSSC, a 65-70°C. Un ejemplo, no limitante, de condiciones de hibridacion reducidamente astringente, incluyen la hibridacion en 4xSSC, a 50-60°C (o una hibridacion alternativa 6xSSC mas un 50% de formamida a 40-45°C) seguido de uno o mas lavados a 50-60°C.Los rangos intermedios, por ejemplo a 65-70°C o a 42-50°C tambien entran en el proposito del invento. SSPE (1xSSPE es 0,15 M de cloruro de sodio, 10mM de NaH2PO4, y 1,25 mM EDTA, pH 7.4) puede sustituirse por SSC (1xSSC es 0,15 M de cloruro sodico y 15 mM de citrato sodico) en la hibridacion y tampones de lavado; los lavados se efectuan durante 15 minutos cada uno despues de completar la hibridacion. Las temperaturas de hibridacion para hlbridos se anticipa ser menos a 50 pares de bases de longitud deberlan ser 5-10°C inferiores al punto de temperatura, Tm del hlbrido, donde Tm se determina segun las ecuaciones siguientes. Para hlbridos menores a 18 pares de longitud, Tm (°C)=2(# de bases A+T)+4(# de bases G+G). Para hlbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm ((°c)=81,5+16-6(log10Na+)) + 0,41 (% G+G)-(600/N), donde N es el numero de bases del hlbrido, y (Na+) es la concentration de iones de soido en el tampon de hibridacion (Na+) para1xSSC=0,165M).

[0039] El experto reconoce que pueden anadirse agentes para hibridar y/o tampones de lavado. Por ejemplo, hacer

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descender la hibridacion no especlficas de moleculas de acidos nucleicos para, por ejemplo, agentes bloqueadores de la membrana de nilon o nitrocelulosa, incluidos pero no limitados a, BSA o ADN portador de esperma de arenque o salmon y/o detergentes, incluidos pero no limitados a, SDS, agentes quelantes EDTA, Ficoll, PVP y otros parecidos que tambien pueden utilizarse. Al usar membranas de nylon, en particular, se pone un ejemplo adicional, no limitante, de condiciones de hibridacion astringente en 0,25-0,5M de fosfato sodico, 7% SDS a 65°C, seguido de uno o mas lavados a 0,02M de fosfato sodico, 1% SDS a 65°C/Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 81:1991-1995) o, de forma alternativa, 0,2xSSC, 1% SDS.

[0040] El termino “homologia sustancial” o “similaridad sustancial” al referirse a fragmentos de acido nucleico, indica que, cuando se alinean adecuadamente las inserciones o borrados adecuados de nucleotidos con otro acido nucleico (o su hebra complementaria), hay una identidad de secuencia nucleotida al menos 71%, 72%, 73%, 74%,75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, preferiblemente alrededor del 90%,y mejor aun 95%, 96%, 97%,98% o 99% de bases nucleotidas, tal como se midio segun un conocido algoritmo de identidad de secuencia, como FASTA, BLAST o Gap, tal como se ha discutido anteriormente.

[0041] De forma alternativa, existe homologla sustancial o similar cuando un acido nucleico un fragmento del mismo hibridiza con otro acido nucleico, en una hebra de otro acido nucleico, o de una hebra complementaria de ellos, en condiciones de hibridacion astringente. “Condiciones de hibridacion astringente” y “condiciones de lavado astringente” en el contexto de experimentos de hibridacion astringente, depende de cierto numero de parametros flsicos distintos. La hibridacion de acidos nucleicos se vera afectada por dichas condiciones, como la concentration de sal, temperatura, solventes, composition de la base de las especies a hibridar, longitud de las regiones complementarias y el numero de desigualdades de la base nucleotida entre los acidos nucleicos que hibridan, tal como apreciaran los expertos en este campo. Un experto sabe como variar estos parametros para conseguir una astringencia determinada de hibridacion.

[0042] Tal como se utiliza aqul, una composicion que sea un compuesto “sustancialmente puro” es que esta sustancialmente libre de uno o mas compuestos, por ejemplo, la composicion contiene mas de un 80% de volumen, 90%, 95%, 96%, 97%, 99,8% o 99,9% del compuesto; o menos de un 20% de volumen, 10%, 5%, 3%, 1%, 0,5%, 0,1% de uno o mas compuestos, segun el volumen total de la composicion.

[0043] Vector: El termino “vector” tal como se utiliza aqul, hace referencia a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un “plasmido”, que es un bucle de ADN de doble helice circular en el que pueden unirse otros segmentos de ADN. Otros vectores incluyen cosmidos, cromosomas bacterianos artificiales (BACs) y cromosomas de levadura artificial (YACs). Otro tipo de vector es un vector virico, en el que pueden unirse otros segmentos de ADN artifical con el genoma virico (discutido en mas detalle a continuation). Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autonoma en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replication que funciona en la celula huesped). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de una celula huesped al introducirse en ella, y asi replicarse ljunto con el genoma huesped. Ademas, ciertos vectores preferidos son capaces de dirigir la expresion de los genes a los que estan unidos de forma operativa. En este documento se les denomina “vectores de expresion recombinante” (o simplemente, “vectores de expresion”). Un vector tambien puede incluir uno o mas genes marcadores selectivos y otros elementos geneticos conocidos en este campo. Vectores adecuados para utilizar en cianobacterias incluyen plasmidos auto-replicantes (por ejemplo, copias multiples y expresion de alto nivel) y plasmidos de integration cromosomica. La integracion de vectores en el genoma o en vectores de replicacion autonoma permite la expresion de los genes en la celula huesped. Cuando la expresion estable proviene de la integracion, puede producirse de forma aleatoria la integracion en el sitio de la union, dentro del genoma huesped o puede estar dirigido con el uso de uniones que contengan regiones de homologia con el genoma huesped, suficiente para recombinarse con la position del huesped. Cuando las uniones se enfocan a una position endogena, todas o algunas de las regiones de transcription y traslacion pueden haber sido proporcionadas por la posicion endogena.

Mutantes de la frataxina

[0044] Como la gravedad de la FRDA se corresponde inversamente con los niveles de frataxina en la celula, la mayoria de investigadores se han centrado en la caracterizacion de moleculas que aumentasen la transcripcion de FXN. Aqui, esta divulgation proporciona un metodo novedoso de mantener los niveles adecuados de frataxina celular, no aumentando la transcripcion de FXN, sino desarrollando un precursor mutante de frataxina.

[0045] La frataxina humana se sintetiza como precursor del aminoacido 210 (SEQ ID NO:1), que rapidamente se dirige a la mitocondria. Al entrar en la mitocondria, el precursor de frataxina sufre un proceso proteolitico que genera frataxina madura, un polipeptido globular del aminoacido 130 que reside mayoritariamente dentro de la matriz de la mitocondria. La frataxina esta involucrada en el adecuado funcionamiento de la maquinaria de union azufre-hierro (ISC). Las celulas de frataxina defectuosa, de hecho han reducido la actividad de las enzimas que contienen ISC, un desequilibrio general en la distribution del hierro intracelular y el aumento de la sensibilidad al estress oxidativo. La frataxina se conserva muchisimo entre las especies, desde las bacterias a los humanos, y no es excesivo, sino que es absolutamente necesario para la vida de los eucariotas superiores.

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[0046] Se observo que el precursor de frataxina se modificaba directamente por la ubiquitina y, en consecuencia, iba dirigida al proteosoma para degradarlo. Lo mas normal es que la ubiquitina se una a los residuos de lisina en los sustratos, y en el caso de la frataxina, se determinaba que la ubiquitina se unla al residuo K147 (Figura 1). Por mutagenesis especlfica de K 147, se genera una frataxina mutante que es menos facil de unirse a la ubiquitina. En una modalidad, los mutantes de la frataxina tienen otros residuos que no son la lisina en el residuo 147 (relativo a SEQ ID NO:1).

[0047] En una modalidad, los mutantes de frataxina tienen arginina en el residuo 147. De forma alternativa, los mutantes de frataxina tienen histidina en el residuo 147. En otra alternativa, el residuo 147 es serina, treonina, asparginina o glutamina. En otra alternativa, el residuo 147 es glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina o triptofano. En otra alternativa, el residuo 147 es cistelna o prolina. En otra alternativa, el residuo 147 es acido aspartico o acido glutamico.

[0048] Por mutagenesis especlfica de la lisina crucial (K) en arginina (r), se genero la frataxina K147R, un mutante de la frataxina sin ubiquitona. Como dicha frataxina K147R no puede unirse a la ubiquitona, es relativamente resistente a la degradacion por medio del proteosoma.

0049] Los mutantes de la frataxina que tienen otro residuo que no es la lisina en la posicion 147, incluida la frataxina K147R, son introducidos en las celulas de frataxina defectuosa mediante uno de varios procedimientos. La protelna puede ser liberada directamente o despues de cargarseen los liposomas, microportadores polimericos, exosomas o portadores bacterianos, con o sin haverse unido a un dominio transductor de protelna. Los mutantes de la frataxina tambien pueden ser liberados a las celulas mediante un sistema de union vlrico, hibrido sintetico-vlrico o no vlrico con FXN mutante cADN y luego administrandolo al sujeto. Un sujeto que tenga una deficiencia de frataxina puede tratarse eficazmente recibiendo una cantidad terapeuticamente eficza de composicion farmaceutica de frataxina k147R, que de forma opcional incluye excipientes farmaceuticamente aceptables.

[0050] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona polipeptidos aisladosque tienen al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad secuencial a SEQ ID NO:1 y comprenden un residuo distinto a la lisinaen la posicion correspondiente a la posicion 147 de SEQ ID NO:1. En un aspecto, esta divulgacion proporciona polipeptidos que tienen al menos un un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad secuencial a SEQ ID NO:1 y comprenden un residuo R en la posicion correspondiente a la posicion 147 de SEQ ID NO:1.

[0051] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona moleculas de acido nucleico aislado que comprenden una secuencia de acido nucleico que codifica un nucleotido que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de secuencia identica a SEQ ID NO:1.

[0052] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona moleculas de acido nucleico aislado que comprenden una secuencia de acido nucleico que codifica un nucleotido que tiene al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de secuencia identica a SEQ ID NO:2.

[0053] Una frataxina mas estable como herramienta terapeutica. La mutacion FXN del residuo K147 en un residuo distinto a la lisina confiere estabilidad al precursor de la frataxina y permite la generation de mas cantidades de frataxina madura. La arginina sustituye a la K147. El aumento de estabilidad de la frataxjna K147 comparada con la frataxina salvaje puede ser una clara ventaja para ambas aproximaciones terapeuticas de sustitucion base-gen y base-protelna, al tratamiento de la Ataxia de Friedrech. De forma especlfica, la frataxina mutante K147T es util en las siguientes areas de intervention terapeutica:

[0054] Liberation de protelna. La frataxina K147R puede liberarse a las celulas de frataxina defectuosa despues de cargarla en los liposomas convencionales, tanto en forma de veslculas unilaminares (ULV) o miltilaminares (MLV), tal como estaba descrito en (Balasubramanian et al., 2010; Torchilin, 2005; Walde and Ichikawa, 2001) y demas referencias. Para aumentar la estabilidad liposomial, los liposomas pueden envolverse con polietilenglicol (PEG) o encapsulados en matrices polimericas, como el chitosan (Werleand Takeuchi, 2009), alginatos (Dai et al., 2006) u otros. Tambien pueden utilizarse liposomas encapsulados mas estables (capsosomas), tal como se describe en (Stadler et al., 2009), y tambien pueden utilizarse otros liposomas (liposomas desencadenantes) que liberan su contenido despues de un desencadenante externo encontrado en tejidos especlficos o condiciones metabolicas, tal como se describe en (Chen et al., 2004).

[0055] De forma alternativa, la frataxina K147R puede liberarse despues de quedar atrapada en microportadores polimericos, como el acido poli(lacti-co-glicolico), micropartlculas de acido, tal como se describen en (Kim et al., 2009), poli(e-caprolactona) de larga duration (Coccoli et al., 2008), microesferas de polianhldridos, tales como poli(1,3-bis-(p-carboxifenoxipropano)-co-anhldrido sebacico) (P(CPP-SA)) (Sun et al., 2009), o microcapsulas de capsula acorazada (Haidar et al., 2008). La liberacion de frataxina K147R puede conseguirse utilizando sistemas mas eficaces como nanopartlculas polimericas (Singh and Lillard, 2009) (Hadarsri et al., 2009), micelos polimericos (Miler et al., 2009) o polimersomas (Onaca et al., 2009) (Christian et al.2009), utilizando poliestireno (Zauner et al.,

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2001), acido poli(lacti-co-glic6lico) (Garnacho et al., 2008), PEG (Christian et al., 2009) (Dziubla et al., 2005) u otros pollmeros.

[0056] La frataxina K147R tambien puede introducirse en las celulas de frataxina defectuosa utilizando bacterias como Listeria monocytogenes como vehlculo de liberaci6n (Dietrich et al., 1998; Ikonomidis et al., 1997) u otras formas atrapadas en exosomas, que se dan de forma natural en nanoveslculas liberadas por las celulas (Simons and Raposo, 2009). Ademas, la frataxina K147R puede liberarse fusionandola con anticuerpos o peptidos, anadiendo glicosilaci6n, quitando lugares involucrados en la activaci6n, o con la protelna PEG, anadiendo de forma covalente polietilenglicol a la protelna (Goodson and Katre, 1990). Finalmente, la frataxina k147R puede administrarse directamente por metodos tradicionales de liberaci6n de protelnas, como microinyecci6n y electroporaci6n.

[0057] La liberaci6n de frataxina K147R en celulas de frataxina defectuosa, puede verse muy mejorada gracias al uso de dominios de transducci6n de protelnas (PTD), incluldo TAT, Antp., VP22 y otros. Los 11 peptidos de la protelna TAT HIV-1 es la que se ha investigado de forma mas extensa entre los PTDs (Rapoport and Lorberboum- Galski, 2009). As! pues, TAT u otros PTDs, puede ser utilizados para modificar liposomas, microportadores, nanopartlculas, micelas o exosomas que contengan frataxina K147R, para facilitar la entrada en las celulas.

[0058] TAT u otros PTDs pueden fusionarse directamente en el marco con frataxina K147R, para una liberaci6n directa de protelna a las celulas de frataxina defectuosa, tal como se describe para otras protelnas cuyo objetivo es la mitocondria (Rector et al., 2008) (Rapoport et al., 2008).

[0059] En un ejemplo que se parece mucho al de la liberaci6n de frataxina en las mitocondrias de las celulas con FRDA, la protelna mitocondrial lipoamida deshidrogenasa (LAD), de hecho se fusion6 con TAT en un intento terapeutico de curar la deficiencia de LAD (Rapoport et al., 2008). La deficiencia de LAD (enfermedad urinaria del jarabe de arce) es un trastorno neurol6gico recesivo autos6mico raro causado por mutaciones en el gen lipoamida deshidrogenasa, y da lugar a una actividad defectuosa de LAD, un enzima mitocondrial involucrado en el metabolismo de los carbohidratos y aminoacidos. De forma similar a la frataxina, el precursor de LAD se introduce en la mitocondria y, despues procesado proteollticamente en una forma funcionalmente madura.

[0060] As! pues, la frataxina K147R puede clonarse descendiendo de TAT en un plasmido pTAT. El resultado puede utilizarse para transformar celulas competentes E. coli , y luego puede purificarse la fusi6n de protelna TAT-frataxina K147R recuperada de la bacteria flotante, mediante cromatografla llquida u otros metodos (Rapoport et al. 2008). Para probar la actividad del producto purificado, la protelna fusionada TAT-frataxina k147R puede liberarse directamente a los fibroblastos o linfoblastos afectados de FRDA, que estan en cultivo, y despues puede cuantificarse la cantidad de frataxina intracelular e intramitocondrial gracias a un analisis SDS-PAGE y “Western blot”. Normalmente los ensayos se haclan para probar funcionalmente la frataxina en las celulas, como la actividad enzimatica de la aconitasa, que puede utilizarse para confirmar la recuperaci6n funcional de celulas afectadas de FRDA, despues de haber estado expuestas a la fusi6n protelnica TAT-frataxina K147R. Despues, la eficacia de esta fusi6n puede probarse en el modelo disponible de ratones afectados por FRDA, sea por infusi6n sistemica directa o por infusi6n sistemica tras encapsulaci6n en cualquier micro o nanoportador de los previamente descritos. Los ratones tratados pueden marcarse bioqulmicamente (cuantificaci6n de niveles de frataxina en multiples tejidos) y fenotlpicamente (retraso en la progresi6n de la enfermedad, mejora de la ejecuci6n sensomotora, etc.) para evaluar la eficacia.

[0061] En todos los anteriores ejemplos mencionados de liberaci6n de protelna, la posibilidad de cargar los liposomas, microportadores o exosomas con una forma mas estable de frataxina, por ejemplo, la frataxina k147R mutante, o la posibilidad de fusionar cualquier PTD con una forma mas estable de frataxina, por ejemplo la frataxina k147R mutante, puede dar lugar a una biodisponibilidad mas larga de la frataxina administrada, comparado con ensayos similares, en los que se us6 frataxina salvaje con una posible reducci6n en el regimen de administraci6n, dosificaci6n, etc.que puede reducir costes y malestar y efectos secundarios en los pacientes.

[0062] En ciertos aspectos,esta divulgaci6n proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un portador seleccionado de un grupo que puede consistir en un liposoma, un microportador polimerico, un exosoma, un portador bacteriano, y un equivalente funcional de ellos, para usarse en la liberaci6n del polipeptido aislado, en la celula. En mas aspectos, el polipeptido se ha fusionado en el marco con un dominio transductor protelnico. Y aun en otros aspectos, el polipeptido aislado se ha liberado en las celulas de un sujeto con Ataxia de Friedreich.

[0063] En algunos aspectos, esta divulgaci6n proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden un sistema portador seleccionado de un grupo consistente en un sistema vlrico, un sistema hlbrido vlrico-sintetico, un sistema no vlrico y un equivalente funcional de los mismos, para usar en la liberaci6n de un polipeptido aislado, en las celulas.

[0064] Terapia genetica. La terapia genetica para enfermedades neurodegenerativas, esta enfocada a utilizar sistemas vlricos y no vlricos, tal como lo resume (Nanou and Azzouz 2009) y las referencias que all! se citan. Los

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sistemas vlricos incluyen adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, lentivirus, virus del herpes, virus de vacunas, poxivirus y otros (Cardone 2007) (Lim et al., 2010). Los sistemas no vlricos puede hacer uso de ADN o liposomas desnudos como portadores. Tambien pueden utilizarse sistemas hlbridos vlrico-sinteticos (Nanou and Azzouz 2009), as! como sistemas bacterianos, como Escherichia coli, o Shigella flexneri (Sizemore at al., 1995; Courvalin et al., 1995). Por consiguiente, las propuestas de terapia genetica para tratar FRDA mediante la codificacion de ADN para la frataxina mutante K147R, puede conseguirse usando uno de estos sistemas.

[0065] Los vectores derivados de lentivirus en particular, se ha observado que permiten la expresion genetica efectiva en la Atrofia Muscular Espinal (SMA), otra enfermedad monogenica hereditaria, caracterizada por perdida neuronal periferica. La SMA es debida a mutaciones o supresiones del gen protelnico “superviviencia de las neuronas motoras” (SMN por sus siglas en ingles “survival motor neuron”) que conduce a una reduccion de SMN, una protelna nucleica y citoplasmatica necesaria para la supervivencia de las neuronas motoras. En un modelo animal con SMA, se ha demostrado que un virus de anemia infecciosa equina (EIAV) basada en un lentivector del pseudotipo de los virus de la rabia G, es eficaz en frenar el transporte axonal y se ha usado para transducir neuronas de la espina dorsal, tras inyecciones vlricas en los musculos (Azzouz et al., 2004).

[0066] Por consiguiente, la frataxina mutante K147R puede clonarse en vectores de transferencia basados en EIAV de la rabia G, inactivos (Azzouz et al., 2002). El lentivector ElAV-frataxina K147R, puede probarse primero acerca de la habilidad para expresar y reconstituir la frataxina en celulas con frataxina defectuosa, mediante una exposicion in vitro de fibroblastos afectados de FRDA, y la consiguiente cuantificacion por analisis SDS-PAGE y western blot. Pueden usarse ensayos comunmente utilizados para probar de forma funcional la frataxina en las celulas, como la actividad enzimatica de la aconitasa, para confirmar la recuperacion funciona de celulas con FRDA tras la exposicion del lentivector. Luego, este lentivector ElAV-frataxina K147R se inyectara en multiples lugares en los musculos perifericos de ratones con FRDA. Los ratones tratados se mediran bioqulmicamente (cuantificacion de niveles de frataxina en multiples tejidos) y fenotlpicamente (retraso en el progreso de la enfermedad, mejora de la funcion sensomotora, etc.) para evaluacion de la eficacia.

[0067] En todos los ejemplos antes mencionados de terapia genetica, la posibilidad de unir sistemas vlricos, no vlricos o hlbridos con un gen que codifique una forma mas estable de frataxina, por ejemplo, la frataxina mutante k147R, puede dar lugar a una biodisponibilidad mas larga de la frataxina comparada con otras aproximaciones similares usando frataxina salvaje,con una posible reduccion en el regimen de administracion, dosificacion, etc. que pueda reducir los costes as! como las molestias y efectos secundarios en los pacientes.

[0068] En algunos aspectos, esta divulgacion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de polipeptido aislado, en esta divulgacion, opcionalmente junto a uno o mas excipientes , diluyentes, preservativos, solubilizantes, emulsificantes, coadyuvantes o portadores farmaceuticamente aceptables.

[0069] Ademas, puede utilizarse una catidad terapeuticamente eficaz de composicion farmaceutica de frataxina mutante K147R para tratar la deficiencia de frataxina. Esta composicion farmaceutica, ademas, puede comprender uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para proporcionar una composicion farmaceutica. Los excipientes que sirven de ejemplo incluyen, sin limitacion alguna, carbohidratos, sales inorganicas, agentes antimicrobioticos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, acidos, bases y una combination de ellos. Los excipientes adecuados para composiciones inyectables incluyen agua, alcoholes, polialcoholes, glicerina, aceites vegetales, fosfollpidos y tensioactivos. Pueden estar presentes derivados del azucar, como el alditol, acido aldonico, azucar esterificado, y o un pollmero de azucar como excipientes. Los excipientes a base de carbohidratos especlficos inluyen por ejemplo: monosacaridos, como la fructosa, maltosa, galactosa, glucosa-D-manosa, sorbosa,y parecidos; disacaridos, como lactosa, sacarosa, trebalosa, celobiosa y parecidos; y alditoles, como manitol, xilitol, lactitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol, y parecidos. El excipiente tambien puede incluir una sal organica o tampon, como acido cltrico, cloruro sodico, cloruro potasico, sufato sodico, nitrato potasico, fostato sodico monobasico, fosfato sodico dibasico y una combinacion de ellos.

[0070] Una composicion del invento puede incluir tambien un agente antimicrobiano para prevenir o ralentizar el crecimiento bacteriano. Ejemplos no limitativos de agentes antimicrobianos adecuados para este invento incluyen, cloruro de benzalconio, cloruro de benzeltonio, alcohol bencllico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletllico, nitrato fenilmercurico, timerosol y una combinacion de ellos.

[0071] Tambien puede estar presente un antioxidante en la composicion. Los antioxidantes se utilizan para evitar la oxidation, previniendo as! el deterioro de la trataxina mutante K147R u otros componentes de la preparation. Los antioxidantes adecuados para usar en este invento incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno, acido hipofosforoso, monotioglicerol, propilgalato, bisulfito sodico, formaldehido sodico, sufloxilato sodico, metabisulfito, y una combinacion de ellos.

[0072] Puede haber un tensioactivo como excipiente. Ejemplos de tensioactivos incluyen: polisorbatos, como “Tween 20” y “Tween 80”, y pluronicos, como F68 y F88 (BASF, Mount Olive, N.J.), esteres de sorbitan, llpidos, como fosfollpidos del tipo lisina o otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque, preferiblemente no en forma liposomial), acidos grasos y esteres grasos, esteroides, como el colesterol, agentes quelantes, como EDTA; y zinc y

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otros cationes adecuados.

[0073] Los acidos y bases pueden estar presentes como excipientes en la composicion. Ejemplos no limitativos de acidos que pueden suarse, incluyen aquellos acidos seleccionados de un grupo consistente en acido hidroclorhldrico, acido acetico, acido fosforico, acido cltrico, acido malico, acido lactico, acido formico, acido tricloroacetico, acido nltrico, acido perclorico, acido sulfurico, acido fumarico, y una combinacion de ellos. Ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin ninguna limitacion, bases seleccionadas del grupo consistente en hidroxido sodico, acetato sodico, hidroxido amonico, hidroxido potasico, acetato amonico, acetato potasico, fosfato sodico, fosfato potasico, citrato sodico, formato sodico, sulfato sodico, sulfato potasico, fumarato potasico, y una combinacion de ellos.

[0074] La cantidad de frataxina mutante K147R (por ejemplo, cuando esta contenida en un sistema de liberacion de un farmaco) en la composicion, dependera de un cierto numero de factores, pero de forma optima, sera una dosis terapeuticamente eficaz cuando la composicion sea en forma de dosis unitaria o contenedor (por ejemplo, un vial). Puede determinarse la dosis terapeuticamente eficaz, de forma experimental, mediante la administracion repetitiva de cantidades crecientes de la composicion para determinar que cantidad produce el efecto final cllnicamente deseado.

[0075] La cantidad de un excipiente individual en la composicion, variara segun la naturaleza y funcion del excipiente y las necesidades especlficas de la composicion. De forma tlpica, la cantidad optima de excipiente individual se determina por experimentacion rutinaria, por ejemplo, preparando composiciones que contengan cantidades variables del excipiente (de menos a mas), examinando la estabilidad y otros parametros, y luego determinando el rango en el cual se consigue la funcionalidad optima, sin afectos secundarios significativos.

[0076] Las composiciones abarcan todo tipo de formulaciones y, en especial, aquellas que son adecuadas para inyeccion, por ejemplo, polvos o liofilizados que pueden reconstituirse con un solvente antes de usarse, as! como soluciones listas para inyectar o suspensiones, composiciones insolubles secas para combinar con un vehlculo antes del uso, y emulsiones y concentrados llquidos para diluir antes de administrar. Ejemplos de diluyentes adecuados para reconstituir composiciones solidas antes de inyectar incluyen aguan bacteriostatica para inyeccion, dextrosa 5% en agua, fosfato en solucion salina tamponada, solucion de Ringer, agua esteril, agua desionizada, y combinaciones de ellos. Con respecto a composiciones llquidas farmaceuticas, se preven soluciones y suspensiones. Otras composiciones adicionales de preferencia aqul, incluyen aquellas para liberacion oral, ocular, o localizada.

[0077] Las preparaciones farmaceuticas de aqul, tambien pueden estar metidas en una jeringa, un dispositivo de implantacion, o similar, segun el modo de liberacion y el uso. Preferiblemente, las composiciones descritas aqul son en forma de dosis unitarias, lo que significa una cantidad de conjugado o composicion del invento adecuada para una dosis unitaria, en forma preempaquetada o premedida.

[0078] Habiendo descrito ahora de forma de forma general varios aspectos y formas del invento, se entendera mas facilmente mediante los ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustracion, y que no son limitantes, a menos que se especifique.

ASPECTOS EJEMPLARES

EJEMPLO 1

Uniones de ADN

[0079] La union de pcADN3-frataxina-HA se genero subclonando la frataxina etiquetada-HA 3' a partir de frataxina HA-pBS en el vector ADNpc3. Las uniones de mutantes de lisina se generaron usando el kit de mutagenesis dirigido Quick-Change site (Stratagene) con cebadpres especlficos usando ADN5pc-frataxina o ADN3pc-frataxina-HA como modelo. Todas las uniones generadas se verificaron secuenciando el ADN.

EJEMPLO 2

Inmunotransferencia

[0080] Anticuerpos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos para el analisis western blot: mAb anti-frataxina (MAB- 10876, Immunological Science). mAb anti-HA (clon HA-7, Sigma) mAb anti-tubulina (Sigma) anticuerpo secundario HRP-conjugado cabra anti-raton (Pierce).

[0081] Immunotransferencia. Los extractos de celulas se prepararon modificando el tampon RIPA (10 mM de fosfato sodico pH 7.2, 150 mM de cloruro sodico, 1% deoxicolato de sodio, 0,1% SDS, 1% Np40, 2 mM EdTA) o un tampon IP (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de cloruro sodico, 1% Nonidet P-40, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA)

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suplementado con un coctel inhibidor de proteasa completa y 2 mM N-Etil-maleimida (NEM). Para inmunotransferencia, se separaron 100 mg de extracto de proteina en 12% SDS-PAGE, manchados en la membrana de nitrocelulosa y detectados con anticuerpos especificos. Todas las inmunotransferencias se revelaron por ECL (Healthcare), se hizo un analisis densitometrico utilizando el software Image J.

EJEMPLO 3

Resistencia de la frataxina K147R a la degradacion por medio de proteosoma

[0082] La frataxina mutante K147R fue expresada de forma estable en celulas Flp-In-203 para probar si la perdida de colocacion de la ubiquitina otorgaba a la frataxina mutante K147R una resistencia relativa a la degradacion por proteosoma, aumentando asi su estabilidad. Las celulas Flp-In-203 (Invitrogen) son variantes de rinon embrionario humano HEK293 que otorgan la integration estable e isogenica y la expresion de un gen infectado. Las celulas Flp- In-293 se mantuvieron en DMEM con un suplemento de un 10% de FBS y se infectaron con un metodo de precipitation calcio/fosfato. Brevemente, las celulas se pusieron en centros de 10cm y se infectaron con 10mg de ADN. Se utilizo ADN5pc-frataxina K147R para generar una line de celulas estables Flp-In 293. Dichas celulas que expresaban de forma estable la frataxina K147R, se obtuvieron de cultivos de selection media que contenia 100 mg/ml de higromicina B (Invitrogen). Despues de la exposition a la ciclohexamida para bloquear nuevas sintesis de proteinas, la estabilidad del precursor de la frataxina k147R se monitorizo un tiempo y se comparo con la estabilidad del precursor de frataxina1'210salvaje, que se expresaba de forma estable en celulas Flp-In-293 y se trataron de forma similar. La Figura 3 A-B muestra que el precursor de la frataxina K147R es significativamente mas estable (± 45% de la introduction tras 24 horas), que el precursor de frataxina1-210(± 15% de la introduction tras 24 horas).

EJEMPLO 4

Estabilidad de la frataxina K147R

[0083] En un diferente juego de experimentos, el mutante Ha-frataxina K147R etiquetada, o el mutante Ha-frataxina '210 wt etiquetada, se expreso de forma transitoria en celulas Hel a usando ADN3pc-frataxina-HA K147R. Las celulas Hela se mantuvieron en DMED con un suplemento de un 10% de FBS y se infectaron usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen), segun las instrucciones del fabricante. Esta aproximacion fuerza la expresion ectopica y permite detectar todos los productos en proceso, incluyendo la frataxina madura. La persistencia de frataxina K147R fue seguida durante un periodo de 5 dias despues de infectarla y se comparo con la de la frataxina salvaje. La Figura 4 muestra que la frataxina K147R esta correctamente procesada y que su expresion permite acumular niveles mas altos de precursor de frataxina, de frataxina intermedia y de frataxina madura. De forma importante, aun se podia observar una cantidad significatifa de frataxina K147 madura despues de 3 dias de la infection, en un momento en que la frataxina de tipo maduro ya no se detectaba.

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   Reivindicaciones

   1. Un polipeptido que tiene al menos un 90% de secuencia identica a SEQ ID NO:1 y que comprende un residuo R en la posicion correspondiente a la posicion 147 de SEQ ID NO:1
2. 2. El polipeptido de la reivindicacion 1, en el que el polipeptido tiene al menos un 95 o al menos un 99% de secuencia identica a la secuencia del aminoacido SEQ ID NO:1.
3. 3. Un polinucleotido aislado o recombinante que comprende o que consiste en una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2.
4. 4. El polinucleotido de la reivindicacion 3, en el que la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que tienen al menos un 90% de secuencia identica a la longitud total de SEQ ID NO:2.
5. 5. Un vector o celula huesped que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4.
6. 6. Una composition farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido aislado de cualquiera de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, sea junto a uno o mas excipientes, diluyentes, preservativos, solubilizantes, emulsificantes, coadyuvantes o portadores farmaceuticamente aceptables.
7. 7. La composicion de la reivindicacion 6, para usar en un metodo para tratar la Ataxia de Friedreich.
8. 8. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 6, o la composicion farmaceutica para usar de la reivindicacion 7, en la que la composicion comprende:

   (i) Un portador seleccionado de un grupo consistente en un liposoma, un microportador polimerico, un exosoma, un portador bacteriano, y un equivalente funcional de ellos; o

   (ii) Un sistema portador seleccionado de un grupo consistente en un sistema vlrico, un sistema hlbrido vlrico- sintetico, un sistema no vlrico, y un equivalente funcional de los mismos;

   En el que el portador o sistema portador es la liberation del polipeptido aislado en la celula.
9. 9. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 8(i), o la composicion farmaceutica para usar de la reivindicacion 8(i), en la que el polipeptido aislado se ha fundido en un marco con un dominio de transduction de protelna.
10. 10. El polinucleotido de la reivindicacion 3 o 4, para usar en un metodo de terapia genetica para tratar la Ataxia de Friedreich.
11. 11. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 7, para el uso de esa reivindicacion, o el polinucleotido de la reivindicacion 10, para el uso de esa reivindicacion, en la que se impide la degradation de la frataxina por medio del proteosoma o ubiquitona, en las celulas de un sujeto.
12. 12. Un metodo ex vivo de liberar el polipeptido aislado de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en una celula por medio de un portador (i) seleccionado de un grupo consistente en un liposoma, un microportador polimerico, un exosoma, un portador bacteriano y un equivalente funcional de los mismos o (ii) un sistema portador seleccionado de un grupo consistente en un sistema vlrico, un sistema hlbrido sintetico-vlrico, un sistema no vlrico y un equivalente funcional de los mismos.
13. 13. Un metodo ex vivo de evitar la degradacion de la frataxina por medio de un proteosoma o ubiquitona, en una celula que comprende la expresion del polipeptido de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en la celula o introduciendo el polipeptido de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en la celula.