ES2552793T3 - Variantes de SAP y su uso - Google Patents

Abstract

Una variante del amiloide P del suero (SAP) que comprende cinco protómeros de SAP, en la que cada uno de los protómeros de SAP tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % idéntica a SEC ID NO: 1 y en la que uno o más de los protómeros de SAP comprenden un aminoácido en la posición 32 de SEC ID NO: 1 que no es asparagina (N).

Description

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longitud de cada hueco, que necesita introducirse para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación de la identidad en porcentaje y similitud entre dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matemático (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991).

En ciertas realizaciones, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com). En una realización específica, los siguientes parámetros se usan en el programa GAP: tanto una matriz Blossom 62 como una matriz PAM250 y un peso por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realización más, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387 (1984)) (disponible en http://www.gcg.com). Parámetros a modo de ejemplo incluyen usar una matriz NWSgapdna.CMP y un peso por hueco de 40, 50, 60, 70 o 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

En otra realización, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de

E. Myers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando un tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

Otra realización para determinar el mejor alineamiento global entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990)). En un alineamiento de secuencias, las secuencias de consulta y objeto son ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicho alineamiento global de secuencias se presenta en términos de identidad en porcentaje. En ciertas realizaciones, la identidad de secuencias de aminoácidos se realiza usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990)). En una realización específica, los parámetros empleados para calcular la identidad en porcentaje y la similitud de un alineamiento de aminoácidos comprenden: Matriz=PAM 150, k-tuple=2, Penalización por desapareamientos=1, Penalización por unión =20, Longitud del grupo de aleatorización=0, Puntuación de corte=1, Penalización por hueco=5 y Penalización por tamaño del hueco =0,05.

Algunos aspectos de la invención proporcionan polipéptidos SAP (es decir, protómeros), o proporcionan procedimientos terapéuticos para emplear aquellos polipéptidos, en los que dichos polipéptidos se definen, al menos en parte, por una secuencia de referencia. En realizaciones preferidas, la secuencia de referencia se corresponde con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1. Por consiguiente, tales polipéptidos pueden tener un cierto porcentaje de residuos de aminoácidos que no son idénticos a una secuencia de referencia. En una realización preferida, los residuos no idénticos tienen propiedades químicas similares a los residuos a los que no son idénticos. Grupos que tienen propiedades similares incluyen los siguientes aminoácidos: E, D, N y Q; H, K y R; Y, F y W; I, L, V, M, C y A; y S, T, C, P y A.

En otra realización, los residuos que no son idénticos son aquellos que no están evolutivamente conservados entre la secuencia de referencia y una secuencia ortóloga en al menos una especie evolutivamente relacionada, tal como en especies dentro del mismo orden. En el caso de una secuencia de referencia de mamífero, los aminoácidos que pueden mutarse en una realización preferida son aquellos que no están conservados entre la secuencia de referencia y la secuencia ortóloga en otra especie de mamífero. Por ejemplo, si se dice que un polipéptido usado en un procedimiento de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % idéntica a SAP humano (SEC ID NO:1), entonces dicho polipéptido puede tener residuos no idénticos a aquellas posiciones en las que se diferencian el SAP humano y el de otro mamífero.

Polipéptidos SAP (es decir, protómeros) que comparten al menos el 90 % de identidad con SEC ID NO: 1 incluyen polipéptidos que tienen sustituciones conservativas en estas áreas de divergencia. Normalmente consideradas como sustituciones conservativas son las sustituciones, uno por el otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Ile, intercambio de los residuos de hidroxilo Ser y Thr, intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, sustitución entre los residuos de amida Asn y Gln, intercambio de los residuos básicos Lys y Arg y sustituciones entre los residuos aromáticos Phe, Tyr. Orientación adicional referente a qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos puede encontrarse en Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990).

La divulgación también proporciona protómeros de SAP con mutaciones en residuos de aminoácidos específicos. Mutaciones a modo de ejemplo se desvelan en el presente documento y se numeran según la posición de aminoácido de SAP humano, por ejemplo, como se ejemplifica en SEC ID NO: 1. En ciertas realizaciones, una variante de SAP i) comprende uno o más protómeros que son al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 % o al menos el 99 % idénticos a SEC ID NO: 1, ii) tiene una o más de las siguientes características en comparación con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero: elevada semivida en plasma, elevada estabilidad in vitro, elevada estabilidad in vivo o elevada eficiencia de fabricación.

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Como se describe en el presente documento, los aminoácidos de un protómero de SAP pueden mutarse añadiendo uno o más residuos de aminoácidos especificados, delecionando uno o más residuos de aminoácidos especificados, o sustituyendo uno o más residuos de aminoácidos especificados. Procedimientos para mutar o modificar químicamente polipéptidos SAP se describen en las siguientes secciones.

Puede ser deseable potenciada semivida en suero y estabilidad in vivo para reducir la frecuencia de dosificación que se requiere para lograr la eficacia terapéutica. Por consiguiente, en ciertos aspectos, la semivida en suero de una variante de SAP es al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez, o al menos veinte días o más. Procedimientos para el análisis farmacocinético y determinación de la semivida y estabilidad in vivo serán conocidos para aquellos expertos en la materia. Pueden encontrarse detalles en Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2ª Rev. Ex edición (1982), que describe parámetros farmacocinéticos tales como semividas t alfa y t beta y área bajo la curva (ABC). Como se describe en los ejemplos de la divulgación, un procedimiento para determinar la estabilidad in vivo implica administrar una variante de SAP a un animal y medir la concentración de la variante de SAP dentro del plasma del animal a intervalos regulares después de la administración. El perfil farmacocinético (es decir, la concentración plasmática de SAP con el tiempo) de una variante de SAP puede compararse con el de otra proteína SAP, por ejemplo, una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero.

En ciertos aspectos, variantes de SAP de la divulgación son más estables que una composición por lo demás idéntica de SAP humano en condiciones idénticas. En ciertas realizaciones, las composiciones desveladas tienen una estabilidad en almacén, o in vitro, estabilidad al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, o al menos cinco veces o más que un SAP humano de muestra correspondiente. Se conocen muchos procedimientos para medir la estabilidad in vitro en la materia, que incluyen, por ejemplo, medir la estabilidad de proteínas por SDS-PAGE, transferencia Western, RP-HPLC, AEX-HPLC, CL-EM, o secuenciación del extremo N.

En algunas realizaciones, las variantes de SAP de la invención tienen una bioactividad alterada o similar en comparación con una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. La bioactividad de una variante de SAP puede determinarse, por ejemplo, determinando la CI50 para inhibir la diferenciación de monocitos en fibrocitos in vitro. En algunas realizaciones, la CI50 de una variante de SAP es inferior a 1/2, inferior a 1/3, inferior a 1/4, inferior a 1/10, o inferior a 1/100 que la de una muestra correspondiente de SAP silvestre aislado de suero humano. Hay muchos procedimientos bien caracterizados para determinar la sensibilidad de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) o células de monocito a SAP para la diferenciación de fibrocitos. Estos procedimientos pueden usarse para determinar la potencia relativa de cualquiera de la variante de SAP de la invención en comparación con una muestra de SAP derivado de suero humano, cualquier otro polipéptido de variante de SAP, u otro supresor de fibrocitos o agente de activación. Las CMSP o monocitos adecuados para su uso en estos procedimientos pueden obtenerse de diversas líneas de cultivo de tejido. Alternativamente, pueden obtenerse células adecuadas para los ensayos de diferenciación de fibrocitos de cualquier muestra biológica que contenga CMSP o células de monocito. La muestra biológica puede obtenerse de suero, plasma, tejido sano o tejido fibrótico. En general, se realizan ensayos de diferenciación de fibrocitos incubando CMSP o células de monocito en medios con diversas concentraciones de un polipéptido SAP para determinar el grado de diferenciación de fibrocitos. La concentración de SAP puede oscilar de 0,0001 µg/ml a 1 mg/ml y en algunas realizaciones es 0,001 µg/ml, 1,0 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml, 30 µg/ml, 35 µg/ml, 40 µg/ml, 45 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml, 300 µg/ml o 500 µg/ml. En algunos ensayos, los medios pueden complementarse con entre 1-100 ng/ml de hMCSF; siendo la concentración preferida de hMCSF 25 ng/ml. La indicación de que las CMSP y monocitos se han diferenciado en fibrocitos puede determinarse por un experto en la materia. En general, los fibrocitos se definen morfológicamente como células adherentes con una forma de husillo alargada y la presencia de un núcleo ovalado. En algunos ensayos, las células se fijan y se tiñen con Hema 3 antes de enumerar los fibrocitos por recuento directo, por ejemplo, usando un microscopio invertido. La cantidad de diferenciación de fibrocitos se interpreta por un experto en la materia como una indicación de la sensibilidad de una célula a SAP. Como se indica por los ejemplos de la divulgación, una mayor supresión de la diferenciación de fibrocitos indica un mayor grado de sensibilidad de SAP. Un procedimiento alternativo de medición de la diferenciación de fibrocitos implica determinar la expresión de marcadores de la superficie celular específicos de fibrocitos o factores secretados, por ejemplo, citocinas (tales como IL-1ra, ENA-78/CXCL-5, PAI-1), fibronectina, colágeno-1, quimiocina derivada de macrófagos). Procedimientos de detección y/o cuantificación de marcadores de la superficie celular o factores secretados son muy conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, diversas técnicas basadas en ELISA y FACS usando anticuerpos inmunorreactivos contra uno o más marcadores específicos de fibrocitos.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona variantes de SAP que son más resistentes a la escisión por proteasas que una muestra correspondiente de SAP humano derivado del suero. Una variante de SAP de la invención puede ser resistente a la escisión por proteasas de cualquier número de proteasas que incluyen serina proteasas, treonina proteasas, cisteína proteasas, ácido aspártico proteasas, metaloproteasas y ácido glutámico proteasas. En ciertas realizaciones, una variante de SAP es más resistente a la escisión por quimotripsina, tripsina o Pronase. En realizaciones preferidas, la variante de SAP resistente a proteasas tiene una elevada semivida en plasma en comparación con una

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resistencia relativa a la agregación en comparación con una muestra correspondiente de otra proteína SAP, por ejemplo, una muestra de SAP humano derivado del suero. En ciertas realizaciones, una variante de SAP comprende uno o más protómeros de SAP que son al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 % al menos 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idénticos a SEC ID NO: 1 y ii) comprende una o más de una de las siguiente sustituciones de aminoácidos: E167D, E167N, E167Q E167A, E167H. Cualquiera de los protómeros de SAP anteriormente mencionados que son resistentes a la auto-agregación puede comprender además cualquiera de las otras modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento.

La glucosilación de polipéptidos normalmente está tanto enlazada en N como enlazada en O. Enlazada en N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido, salvo prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de un resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación enlazado en 14. La glucosilación enlazada en O se refiere a la unión de restos de azúcar (por ejemplo, Nacetilgalactosamina, galactosa o xilosa) a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente sobre un residuo de serina o treonina.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona una variante de SAP que comprende al menos un protómero de SAP que está sustancialmente libre de glucanos. Por “sustancialmente libre”“ se indica que al menos aproximadamente el 25 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 27 %, al menos el aproximadamente el 30 %, al menos el aproximadamente el 35 %, al menos el aproximadamente el 40 %, al menos el aproximadamente el 45 %, al menos el aproximadamente el 50 %, al menos el aproximadamente el 55 %, al menos el aproximadamente el 60 %, al menos el aproximadamente el 65 %, al menos el aproximadamente el 70 %, al menos el aproximadamente el 75 %, al menos el aproximadamente el 80 %, al menos el aproximadamente el 85 %, al menos el aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 %) de los aminoácidos del protómero de SAP no están glucosilados. En realizaciones preferidas, un protómero de SAP, o variante de SAP, está libre de cualquier estructura asociada a glucano.

En algunas realizaciones, los protómeros de SAP de la divulgación se han modificado para inhibir la unión de glucanos enlazados en N, glucanos enlazados en O o tanto glucanos enlazados en N como en O. La eliminación de sitios de glucosilación enlazados en N sobre una variante de SAP se lleva a cabo modificando (por ejemplo, por deleción, adición o sustitución de aminoácidos) la secuencia de aminoácidos de uno o más de los protómeros de SAP de forma que el protómero carezca de una o más de las secuencias de tripéptidos anteriormente descritas (para sitios de glucosilación enlazados en N). La alteración también puede incluir la deleción o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina del protómero de SAP. Una variante de SAP de la invención comprende al menos un protómero de SAP que comprende un aminoácido variante en la posición 32 de SEC ID NO: 1. En realizaciones preferidas, una variante de SAP comprende al menos un protómero de SAP que comprende un aminoácido variante en la posición 33 y/o 34 de SEC ID NO: 1. En realizaciones preferidas, un protómero de SAP variante comprende un aspartato (D), glutamina (Q) o glutamato (E) en la posición 32 de SEC ID NO: 1. Un protómero de SAP variante también puede comprender, independientemente o en combinación con, una prolina en la posición 33 de SEC ID NO: 1. En ciertas realizaciones, una variante de SAP comprende uno o más protómeros que son i) al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 % al menos 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idénticos a SEC ID NO: 1 y ii) comprende una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: N32D, N32Q, N32E, 33P. Cualquiera de los protómeros de SAP anteriormente mencionados que están sustancialmente libres de glucanos puede comprender además cualquiera de las otras modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento.

En ciertos aspectos, una variante de SAP de la invención comprende uno o más protómeros de SAP que comprenden uno o más aminoácidos covalentemente unidos a uno o más polímeros inertes.

Un polímero inerte unido a un protómero de SAP puede ser de cualquier peso molecular eficaz y puede estar ramificado o sin ramificar. Polímeros usados en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, (a) dextrano y derivados de dextrano, que incluyen sulfato de dextrano, dextrina reticulada y carboximetildextrina; (b) celulosa y derivados de celulosa, que incluyen metilcelulosa y carboximetilcelulosa; (c) almidón, ciclodextrinas y dextrinas y derivados de los mismos; (d) polialquilenglicol y derivados del mismo, que incluyen PEG, mPEG, homopolímeros de PEG, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol con propilenglicol, en los que dichos homopolímeros y copolímeros están sin sustituir o sustituidos en un extremo con un grupo alquilo; (e) heparina y fragmentos de heparina; (f) poli(alcohol vinílico) y éteres poliviniletílicos; (g) polivinilpirrolidona; (h) ,-poli((2-hidroxietil)-DL-aspartamida; y (i) polioles polioxietilados. Cualquiera de los protómeros de SAP anteriormente mencionados que tenga uno o más aminoácidos covalentemente unidos a uno o más polímeros inertes puede comprender además cualquiera de las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento

En realizaciones preferidas, la divulgación proporciona una variante de SAP que comprende uno o más protómeros de SAP que comprenden al menos un aminoácido covalentemente unido a un resto de polietilenglicol. En algunas realizaciones, el peso molecular de un resto de polietilenglicol es entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100

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198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Tales técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otros péptidos (véanse, por ejemplo, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87:6378-6382; así como las patentes de EE.UU. N.ºs: 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).

Los protómeros de SAP variantes también pueden generarse usando técnicas de “evolución dirigida”. Estas estrategias son diferentes de los procedimientos de mutagénesis aleatoria tradicionales debido a que implican someter la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de interés a rondas repetitivas de mutación, cribado y amplificación.

En algunas técnicas de “evolución dirigida”, la diversidad de los ácidos nucleicos obtenidos se genera mediante procedimientos de mutación que crean al azar mutaciones puntuales en la secuencia de ácido nucleico. Las técnicas de mutación puntual incluyen, pero no se limitan a, “error-prone PCRTM” (Caldwell y Joyce, 1994; PCR Methods Appl. 2:2833; y Ke y Madison, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3371-3372), mutagénesis dirigida a oligonucleótidos repetidos (Reidhaar-Olson et al., 1991, Methods Enzymol. 208: 564-586) y cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados de mutagénesis aleatoria.

Otro procedimiento para crear diversidad mediante el que puede actuar la evolución dirigida es el uso de genes mutadores. El ácido nucleico de interés se cultiva en una cepa de células mutadoras, cuyo genoma normalmente codifica los genes de reparación del ADN defectuoso (patente de EE.UU. N.º 6.365.410; Selifonova et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649; Long-McGie et al., 2000, Biotech. Bioeng. 68:121-125; véase Genencor International Inc., Palo Alto CA).

El logro de diversidad usando técnicas de evolución dirigida también puede realizarse usando mutagénesis de saturación junto con cebadores degenerados (Gene Site Saturation Mutagenesis™, Diversa Corp., San Diego, CA). En este tipo de mutagénesis de saturación se usan cebadores degenerados diseñados para cubrir la longitud de la secuencia de ácido nucleico que va a diversificarse para cebar la polimerasa en las reacciones de la PCR. De este modo, cada codón de una secuencia codificante para un aminoácido puede mutarse para codificar cada uno de los diecinueve aminoácidos usuales que quedan. Esta técnica también puede usarse para introducir mutaciones, deleciones e inserciones en regiones específicas de una secuencia codificante de ácido nucleico dejando a la vez sin tocar el resto de la molécula del ácido nucleico. Los procedimientos para la técnica de saturación de genes son muy conocidos en la técnica y pueden encontrarse en la patente de los EE.UU. N.º: 6.171.820.

También pueden generarse protómeros de SAP variantes usando las técnicas de transposición de genes, transposición de motivos, transposición de exones y/o transposición de codones (denominadas en su conjunto “transposición de ADN”). Las técnicas de transposición del ADN también pueden emplearse para modular las actividades de péptidos útiles en la invención y pueden usarse para generar péptidos que tengan actividad alterada. Véanse, generalmente, las patentes de EE.UU. N.ºs: 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; y 5.837.458 y Stemmer et al. (1994, Nature 370(6488):389391); Crameri et al. (1998, Nature 391 (6664):288-291); Zhang et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(9):45044509); Stemmer et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91(22):10747-10751), Patten et al. (1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33); Harayama, (1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82); Hansson, et al., (1999, J. Mol. Biol. 287:26576); y Lorenzo and Blasco (1998, Biotechniques 24(2):308 13).

La transposición de ADN implica el ensamblaje de dos o más segmentos de ADN mediante recombinación homóloga o específica de sitio para generar variación en la secuencia del polinucleótido. Se ha usado transposición de ADN para generar variaciones novedosas de proteínas del virus de tipo 1 de la inmunodeficiencia humana (Pekrun et al., 2002, J. Virol. 76(6):2924-35), triazina hidrolasas (Raillard et al. 2001, Chem Biol 8(9):891-898), proteínas del virus de la leucemia murina (VLM) (Powell et al. 2000, Nat Biotechnol 18(12):1279 1282) e indolglicerol fosfato sintasa (Merz et al. 2000, Biochemistry 39(5):880 889).

La técnica de transposición de ADN fue desarrollada para generar diversidad biomolecular imitando la recombinación natural permitiendo la recombinación homóloga in vitro del ADN (Stemmler, 1994, Nature 370: 389-391; y Stemmler, 1994, PNAS 91: 10747-10751). Generalmente, en este procedimiento, una población de genes relacionados se fragmenta y se somete a ciclos repetitivos de desnaturalización, rehibridación, seguidas por la extensión de los nucleótidos protuberantes de 5’ por la polimerasa Taq. Con cada ciclo, la longitud de los fragmentos aumenta y se produce la recombinación de ADN cuando los fragmentos que se originan a partir de diferentes genes se hibridan entre sí. La fragmentación inicial del ADN se realiza normalmente por digestión con nucleasas, usando normalmente DNasa (véanse las referencias a Stemmler, anteriormente), pero también puede realizarse por síntesis interrumpida de PCR (patente de EE.UU. N.º: 5.965.408, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad; véase, Diversa Corp., San Diego, CA). Los procedimientos de transposición del ADN tienen ventajas sobre los procedimientos de mutaciones puntuales aleatorias porque se consigue la recombinación directa de mutaciones beneficiosas generadas por cada ronda de transposición y por tanto, existe una auto-selección de fenotipos mejorados de péptidos. Las técnicas de transposición de ADN son muy conocidas para los expertos en la técnica. Explicaciones detalladas de tal tecnología se encuentran en Stemmler, 1994, Nature 370: 389-391 y Stemmler, 1994, PNAS 91: 10747-10751. La técnica de transposición de ADN

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también se describe en las patentes de EE.UU. N.ºs: 6.180.406, 6.165.793, 6.132.970, 6.117.679, 6.096.548, 5.837.458, 5.834.252, 5.830.721, 5.811.238 y 5.605.793.

La técnica también proporciona modificaciones incluso más recientes de la técnica básica de transposición de ADN. En un ejemplo, la transposición de exones, exones o combinaciones de exones que codifican dominios específicos de péptidos se amplifican usando oligonucleótidos quiméricos. A continuación, las moléculas amplificadas se recombinan autocebando el ensamblaje de PCR (Kolkman y Stemmler, 2001, Nat. Biotech. 19:423-428). En otro ejemplo, usando la técnica de quimeragénesis aleatoria en la construcción de bibliotecas mediante moldes transitorios (RACHITT), se hibridan fragmentos de ADN parental monocatenario sobre un molde monocatenario de longitud completa (Coco et al., 2001, Nat. Biotechnol. 19:354-359). En otro ejemplo más, el proceso de extensión por etapas (StEP), se emplea el termociclado con ciclos de hibridación/extensión muy abreviados para interrumpir repetidamente la polimerización del ADN a partir de cebadores flanqueantes (Zhao et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16:258-261). En la técnica conocida como CLERY, se combina la transposición de la familia in vitro con la recombinación homóloga in vivo en levadura (Abecassis et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:E88). Para maximizar la recombinación intergénica, el ADN monocatenario de hebras complementarias de cada uno de los ácidos nucleicos se digiere con DNasa y se hibrida (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137). Los extremos romos de dos ácidos nucleicos truncados de longitudes variables que están enlazados por una secuencia escindible se enlazan a continuación para generar la fusión génica sin recombinación homóloga (Sieber et al., 2001, Nat Biotechnol. 19: 456-460; Lutz et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:E16; Ostermeier et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17:1205-1209; Lutz y Benkovic, 2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11:319-324). También se ha potenciado la recombinación entre ácidos nucleicos con poca homología de secuencias en común usando extremos romos mediados por exonucleasas de fragmentos de ADN y enlazando los fragmentos juntos para recombinarlos (patente de EE.UU. N.º: 6.361.974).

Además de los protocolos publicados que detallan las técnicas de evolución dirigida y de transposición de genes, ahora están disponibles servicios comerciales que llevan a cabo los procedimientos de transposición y de selección de genes en los péptidos de elección. Maxygen (Redwood City, CA) ofrece servicios comerciales para generar bibliotecas personalizadas de ADN transpuesto. Además, esta empresa realizará procedimientos personalizados de evolución dirigida que incluyen la transposición y la selección de genes de una familia de péptidos de elección.

Optigenix, Inc. (Newark, Del.) ofrece el servicio relacionado de transposición de plásmidos. Optigenix usa familias de genes para obtener mutantes de los anteriores que tienen nuevas propiedades. El ácido nucleico de interés se clona en un plásmido en un sistema de expresión de Aspergillus. A continuación, el ADN de la familia relacionada se introduce en el sistema de expresión y se produce la recombinación en las regiones conservadas de la familia en el huésped. A continuación, el ADN mutante resultante se expresa y se criba el péptido producido a partir del anterior para la presencia de propiedades deseadas y la ausencia de propiedades no deseadas.

Tras cada ronda repetitiva de “evolución”, los péptidos deseados expresados mediante genes mutados se criban para las características de interés. Los genes “candidatos” se amplifican a continuación y se combinan para la siguiente ronda de transposición del ADN. El procedimiento de cribado usado es muy dependiente del péptido que está siendo “evoluciona” y las características de interés. Pueden seleccionarse características tales como la estabilidad del péptido, actividad biológica, antigenicidad, entre otras, usando procedimientos que son muy conocidos en la técnica.

El técnico experto apreciará que las anteriores técnicas de mutación y selección pueden combinarse entre sí y con procedimientos adicionales para generar el mejor protómero de SAP variante posible útil en los procedimientos de la invención. Así, la invención no se limita a un procedimiento específico para la generación de variantes de SAP y debe considerarse que engloba todas y cada una de las metodologías descritas en el presente documento. Por ejemplo, inicialmente puede realizarse un procedimiento para introducir mutaciones puntuales especificadas en una secuencia de ácido nucleico, seguido de rondas repetitivas de transposición, selección y amplificación de ADN. Para algunas variantes puede usarse la introducción inicial de mutaciones puntuales para introducir diversidad en una población de genes que carece de esta y la siguiente ronda de transposición y cribado de ADN seleccionará mutaciones puntuales ventajosas.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona procedimientos para modificar químicamente uno o más aminoácidos de un protómero de SAP. Hay varios procedimientos descritos en la materia para unir polímeros inertes a un polipéptido que incluyen, pero no se limitan a, usar bromuro de cianógeno (alquilación) y química de acoplamiento de dialdehídos y oxidación con peryodato. En particular, se han descrito en la materia muchos procedimientos para PEGilar aminoácidos. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º: 4.088.538 desvela un conjugado de polímero enzimáticamente activo-enzima de una enzima covalentemente unida a PEG. Similarmente, la patente de EE.UU. N.º: 4.496.689 desvela un complejo covalentemente unido del inhibidor -1 de la proteasa con un polímero tal como PEG o metoxipoli(etilenglicol) (“mPEG”). Abuchowski et al. (J. Biol. Chem. 252: 3578 (1977) desvelan la unión covalente de mPEG a un grupo amina de albúmina de suero bovino. La patente de EE.UU. N.º: 4.414.147 desvela un procedimiento de conversión de interferón menos hidrófobo conjugándolo con un anhídrido de un ácido dicarboxílico, tal como poli(anhídrido etilensuccínico). El documento PCT WO 87/00056 desvela la conjugación de PEG y polioles polioxietilados con proteínas tales como interferón-, interleucina-2 e inmunotoxinas. El documento EP 154.316 desvela y reivindica linfocinas químicamente modificadas, tales

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1995 Oct 6;270(40):23415-20)). Los polímeros se enlazan o modifican para contener una amina primaria que actuará de donante de amina de la transglutaminasa.

Pueden producirse variantes de SAP y oligómeros de SAP covalentemente reticulados descritos en el presente documento en células bacterianas, células de insecto, levadura, células fúngicas o células de mamífero que incluyen, por ejemplo, células humanas. En aquellos casos en los que la célula huésped es humana, la célula puede estar en un sujeto vivo o puede aislarse de un sujeto, por ejemplo, en un cultivo celular, muestra de tejido, suspensión de células, etc. Otras células huésped adecuadas son conocidas para aquellos expertos en la materia.

La divulgación proporciona además vectores de expresión para producir protómeros de SAP. Por ejemplo, se contemplan vectores de expresión que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica un protómero de SAP, en el que la secuencia codificante está operativamente enlazada a al menos una secuencia reguladora transcripcional. Secuencias reguladoras para dirigir la expresión de protómeros de SAP son reconocidas en la técnica y se seleccionan por varios criterios bien entendidos. Secuencias reguladoras a modo de ejemplo se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, puede usarse cualquiera de una amplia variedad de secuencias reguladoras que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se enlazan operativamente a ella en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican protómeros de SAP. Tales secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos del SV40, promotor temprano inmediato del adenovirus o citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, promotor T7 cuya expresión está dirigida por T7 ARN polimerasa, un promotor para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de ácido fosfatasa, por ejemplo, Pho5 y los promotores de los factores de apareamiento  de la levadura y otras secuencias conocidas por controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped diana que va transformarse. Además, también debe considerarse el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibiótico.

La divulgación también proporciona una célula huésped transfectada con un gen recombinante con el fin de expresar un protómero de SAP. La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, puede expresarse un protómero de SAP en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, levadura, o células de mamífero. Otras células huésped adecuadas son conocidos para aquellos expertos en la materia.

Por consiguiente, la divulgación proporciona procedimientos de producción de protómeros de SAP. Por ejemplo, puede cultivarse una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifica un protómero de SAP de la invención en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido. El protómero de SAP puede secretarse, por inclusión de una secuencia señal de la secreción y aislarse de una mezcla de células y medio que contiene la proteína. Alternativamente, el protómero de SAP puede ser retenido citoplásmicamente y las células recogerse, lisarse y aislarse el protómero. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. Medios adecuados para el cultivo celular son muy conocidos en la técnica. Las proteínas pueden aislarse del medio de cultivo celular, células huésped, o ambos, usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, que incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de la proteína.

Así, puede usarse una secuencia codificante para un protómero de SAP para producir una forma recombinante de la proteína mediante procesos microbianos o celulares eucariotas. El enlazar la secuencia de polinucleótidos en una construcción génica, tal como un vector de expresión y transformar o transfectar en huéspedes, tanto eucariotas (levadura, aviares, de insecto o de mamífero) como procariotas (células bacterianas), son procedimientos convencionales.

Vehículos de expresión para la producción de una proteína recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, vectores adecuados para la expresión de protómeros de SAP incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coli.

Existen varios vectores para la expresión de proteínas recombinantes en levadura. Por ejemplo yEp24, YIp5, YEp51, YEp52, pYES2 y YRp17 son vehículos de clonación y expresión útiles en la introducción de construcciones genéticas en

S. cenerisiae (véase, por ejemplo, Broach et al., (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83). Estos vectores pueden replicarse en E. coli debido a la presencia de pBR322 ori y en S. cerevisiae debido al determinante de replicación del plásmido de 2 micrómetros de levadura. Frecuentemente se usa selección o contraselección autótrofa en levadura. Además, puede usarse resistencia a marcadores de fármaco, tales como ampicilina, en bacterias.

Los vectores de expresión de mamífero pueden contener tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2 gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG,

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Las variantes de SAP pueden purificarse usando procedimientos y medios de fraccionamiento y/o de purificación convencional. Puede usarse precipitación con sulfato de amonio y extracción con ácido o caótropo para el fraccionamiento de muestras. Etapas de purificación a modo de ejemplo pueden incluir hidroxiapatita, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. Medios de intercambio aniónico adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad y similares. Son adecuados derivados de PEI, DEAE, QAE y Q, que incluyen, por ejemplo, DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Medios cromatográficos a modo de ejemplo incluyen aquellos medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, tales como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticulada, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada y similares que son insolubles en las condiciones en las que van a usarse. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de hidrato de carbono. Ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida y derivados de carboxilo y amino para las químicas de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son muy conocidos y se usan ampliamente en la materia y están disponibles de proveedores comerciales. Procedimientos para unir polipéptidos a medios de soporte son muy conocidos en la técnica. La selección de un procedimiento particular es una cuestión de diseño rutinario y se determina en parte por las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988). Las variantes de SAP descritas en el presente documento también pueden aislarse de una marca de afinidad (por ejemplo, polihistidina, proteína de unión a maltosa, GST, dominio de unión a almidón, FLAG, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación como se describe adicionalmente en el presente documento.

Procedimientos de tratamiento

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona procedimientos para tratar un trastorno sensible a SAP en un paciente administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de una variante de SAP u oligómero de SAP de la invención a un paciente en necesidad del mismo. La dosificación y frecuencia de tratamiento pueden ser determinadas por un experto en la materia y variarán dependiendo de los síntomas, edad y peso corporal del paciente y la naturaleza y gravedad del trastorno que va a tratarse o prevenirse. En algunas realizaciones, una variante de SAP u oligómero de SAP se administra a un paciente una vez o dos veces por día, una vez o dos veces por semana, una vez o dos veces por mes, o justo antes de o en la aparición de los síntomas.

Pueden determinarse fácilmente dosificaciones por técnicas conocidas para aquellos expertos en la materia o como se enseña en el presente documento. La toxicidad y eficacia terapéutica de SAP pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL50 y la DE50. La DE50 (dosis eficaz 50) es la cantidad de fármaco requerida para producir un efecto especificado en el 50 % de una población de animales. La DL50 (dosis letal 50) es la dosis de fármaco que destruye el 50 % de una población de muestra.

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP es fibrosis. El uso de SAP como tratamiento terapéutico para la fibrosis se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N.º: 2007/0243163. Trastornos relacionados con la fibrosis que pueden ser susceptibles al tratamiento con el procedimiento objeto incluyen, pero no se limitan a, enfermedad del colágeno, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar fibrótica humana (por ejemplo, bronquiolitis obliterante, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis pulmonar de una etiología conocida, estroma tumoral en enfermedad pulmonar, esclerosis sistémica que afecta los pulmones, síndrome de Hermansky-Pudlak, neumoconiosis de los trabajadores del carbón, asbestosis, silicosis, hipertensión pulmonar crónica, hipertensión pulmonar asociada al SIDA, sarcoidosis, asma de moderado a grave y similares), enfermedad vascular fibrótica, esclerosis arterial, aterosclerosis, venas varicosas, infartos coronarios, infartos cerebrales, fibrosis miocárdica, fibrosis musculoesquelética, adherencias post-quirúrgicas, enfermedad renal humana (por ejemplo, síndrome nefrítico, síndrome de Alport, nefropatía asociada al VIH, enfermedad renal poliquística, enfermedad de Fabry, nefropatía diabética, glomerulonefritis crónica, nefritis asociada a lupus sistémico y similares), esclerosis sistémica progresiva (PSS), colangitis esclerosante primaria (PSC), fibrosis hepática, cirrosis hepática, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, enfermedad crónica de injerto contra huésped, esclerodermia (local y sistémica), oftalmopatía de Graves, retinopatía diabética, glaucoma, enfermedad de Peyronie, fibrosis del pene, uretrostenosis después de cistoscopio, adherencia interna después de cirugía, cicatrización, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal idiopática, fibrosis peritoneal de una etiología conocida, ergotismo inducido por fármacos, fibrosis conducente a cáncer benigno o maligno, fibrosis conducente a infección microbiana (por ejemplo, viral, bacteriana, parasítica, fúngica, etc.), enfermedad de Alzheimer, fibrosis conducente a enfermedad inflamatoria del intestino (que incluye formación de constricción en enfermedad de Crohn y colitis microscópica), tumores de células del estroma, mucositis, fibrosis inducida por productos químicos o agresiones medioambientales (por ejemplo, quimioterapia para el cáncer, pesticidas o radiación (por ejemplo, radioterapia para el cáncer)).

En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con la fibrosis está seleccionado de esclerodermia sistémica o local,

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queloides, cicatrices hipertróficas, aterosclerosis, reestenosis, inflamación pulmonar y fibrosis, fibrosis pulmonar idiopática, cirrosis hepática, fibrosis como resultado de infección crónica por hepatitis B o C, enfermedad renal, enfermedad cardíaca resultante de tejido cicatricial, degeneración macular y retinopatía retiniana y vítrea. En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con la fibrosis resulta de fármacos quimioterapéuticos, fibrosis inducida por la radiación y lesiones y quemaduras. En algunas realizaciones, el trastorno o afección relacionada con la fibrosis resulta de cicatrización post-quirúrgica, por ejemplo, tras trabeculectomía u otra cirugía de filtración del ojo.

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP es un trastorno de hipersensibilidad tal como aquellos mediados por respuestas Th1 o Th2. El uso de SAP como tratamiento terapéutico para los trastornos de hipersensibilidad también se describe en la solicitud provisional de EE.UU. N.º: 61/209.795. Los trastornos relacionados con la hipersensibilidad que pueden ser susceptibles a tratamiento con SAP incluyen, pero no se limitan a, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, conjuntivitis alérgica, broncoconstricción alérgica, disnea alérgica, aumento alérgico en la producción de moco en los pulmones, eccema atópico, dermatitis, urticaria, anafilaxis, neumonitis y asma alérgica.

En algunas realizaciones, una variante de SAP u oligómero de SAP de la invención puede usarse para tratar respuestas inmunitarias específicas de alérgenos tales como anafilaxis, a diversos antígenos, que incluyen, pero no se limitan a, antimicrobianos (por ejemplo, cefalosporinas, sulfonamidas, penicilina y otras -lactamas), anticonvulsivos (por ejemplo, fenitoína, fenobarbital, carbamazepina, dapsona, alopurinal y minociclina), quimioterapéuticos (por ejemplo, taxanos, compuestos de platino, asparaginasas y epipodofilotoxinas), heparina, insulina, protamina, aspirina y otros fármacos antiinflamatorios no esteroideos, relajantes musculares (por ejemplo, succinilcolina, atracurio, vecuronio y pancuronio), agentes de inducción (por ejemplo, barbitúricos, etomidato, propofol), narcóticos (por ejemplo, fentanilo, meperidina, morfina), coloides para la expansión del volumen intravascular, materiales de radiocontraste, hemoderivados, látex, productos animales, caspa de animal, ácaros del polvo, insectos (por ejemplo, mordeduras, picaduras o veneno), cosméticos, metales (por ejemplo, níquel, cobalto y cromato), plantas, esporas, polen, alimento (por ejemplo, leche, huevos, trigo, soja, cacahuetes y frutos secos de árbol, marisco), vacunación y antígenos fúngicos (por ejemplo, especies de Aspergillus, Curvularia, Exserohilum y Alternaria).

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP es un trastorno autoinmunitario tal como aquellos mediados por respuestas Th1 o Th2. El uso de SAP como tratamiento terapéutico para trastornos autoinmunitarios también se describe en la solicitud provisional de EE.UU. N.º: 61/209.845. Trastornos relacionados autoinmunitarios que pueden ser susceptibles al tratamiento con SAP incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis psoriásica, miocarditis autoinmune, pénfigo, miastenia grave, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, hepatitis autoinmune, artritis crónica de Lyme, cardiomiopatía dilatada familiar, dermatomiositis juvenil, policondritis, síndrome de Sjogren, psoriasis, artritis idiopática juvenil, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad del injerto contra el huésped.

En algunas realizaciones, el trastorno sensible a SAP es una mucositis. El uso de SAP como tratamiento terapéutico para la mucositis también se describe en la solicitud de EE.UU. N.º: 12/217.614. Los procedimientos descritos en el presente documento pueden ser útiles para tratar mucositis oral, esofágica y gastrointestinal, además de úlceras gástricas y duodenales, o erosiones del estómago y esófago.

En algunas realizaciones, una variante de SAP u oligómero de SAP puede usarse para tratar una enfermedad inflamatoria. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria puede ser una infección viral, bacteriana, fúngica o parasítica. El uso de SAP como tratamiento terapéutico para la infección viral también se ha descrito en la patente de EE.UU. 6.406.698 y en la solicitud PCT WO1997/026906.

Preparaciones y formulaciones farmacéuticas

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden uno o más agentes terapéuticos de SAP (es decir, variantes de SAP y oligómeros de SAP) formulados para administración. Los agentes terapéuticos de la invención pueden formularse de un modo convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Por ejemplo, agentes terapéuticos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para administración por, por ejemplo, inyección (por ejemplo, SubQ, IM, IP), inhalación o insuflación (tanto por la boca como la nariz) o administración oral, bucal, sublingual, transdérmica, nasal, parenteral o rectal. En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos pueden administrarse localmente, en el sitio en el que las células diana están presentes, es decir, en un tejido, órgano o líquido específico (por ejemplo, sangre, líquido cefalorraquídeo, masa tumoral, etc.).

La presente invención proporciona además el uso de cualquier variante de SAP u oligómero de SAP de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno o una afección, como se ha descrito en el presente documento, en un paciente, por ejemplo, el uso de una variante de SAP u oligómero de SAP en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno o afección descrita en el presente documento. En algunos aspectos, cualquier variante de SAP u oligómero de SAP de la invención puede usarse para preparar una preparación farmacéutica para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección descrita en el presente documento.

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Los agentes terapéuticos pueden formularse para una variedad de modos de administración, que incluyen administración sistémica y tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones generalmente puede encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA. Para administración parenteral, se prefiere inyección, que incluye intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, los compuestos pueden formularse en disoluciones líquidas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank o disolución de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse en forma sólida y redisolverse o suspenderse inmediatamente antes de uso. También están incluidas formas liofilizadas. En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos pueden administrarse a células mediante una variedad de procedimientos conocidos para aquellos conocidos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas.

Para administración por vía oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos, pastillas para chupar, o cápsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por procedimientos muy conocidos en la técnica. Preparaciones líquidas para administración por vía oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampón, aromatizantes, colorantes y edulcorantes, según convenga. Las preparaciones para administración por vía oral pueden formularse adecuadamente para dar la liberación controlada del compuesto activo.

Para administración por inhalación (por ejemplo, administración pulmonar), los agentes terapéuticos pueden administrarse convenientemente en forma de una presentación de espray en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor apropiado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de gelatina, por ejemplo, para su uso en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

En los procedimientos de la invención, los compuestos farmacéuticos también pueden administrarse por vías intranasales

o intrabronquiales que incluyen insuflación, polvos y formulaciones en aerosol (por ejemplos, de inhalantes de esteroides, véase Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107-111). Por ejemplo, pueden disponerse formulaciones en aerosol en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. También pueden formularse como productos farmacéuticos para preparaciones no presurizadas tales como en un nebulizador o un atomizador. Normalmente, tal administración es en un tampón acuoso farmacológicamente aceptable.

Pueden prepararse composiciones farmacéuticas adecuadas para administración respiratoria (por ejemplo, intranasal, inhalación, etc.) de polipéptidos de SAP de variante en tanto forma sólida como líquida.

Pueden formularse variantes de SAP u oligómeros de SAP de la invención para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multi-dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes de uso.

Además, también pueden formularse variantes de SAP u oligómeros de SAP de la invención como preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, pueden formularse agentes terapéuticos con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como sal moderadamente soluble. La fórmula de liberación controlada también incluye parches.

En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse para administración al

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