ES2552858T3 - Recogida de muestras biológicas y sistema de transporte y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Una composición acuosa que incluye los componentes siguientes: un caotropo presente en una cantidad de entre 0,5 M y 6M; un detergente presente en una cantidad de entre 0,1% y 1% (peso/vol,), donde el detergente comprende docecilsulfato sódico (SDS), dodecilsulfato de litio (LDS), taurodesoxicolato sódico (NaTDC), taurocolato sódico (NaTC), glicocolato sódico (NaGC), desoxicolato sódico (NaDC), colato sódico, sulfonato de alquilbenceno sódico (NaABS), N-lauril sarcosina (NLS), sales de ácidos carboxílicos, sales de ácidos sulfónicos, sales de ácido sulfúrico, ésteres de ácido fosfórico y polifosfórico, alquilfosfatos, fosfato de monoalquilo (MAP), sales de ácidos perfluorocarboxílicos, detergentes aniónicos o cualquier combinación de estos elementos; un agente reductor, donde el agente reductor es ß-ME, DTT, DMSO o formamida presente en una cantidad de entre 0,05 M y 0,3 M, o donde el agente reductor es TCEP presente en una cantidad de entre 0,5 mM y 30 mM; un agente quelante presente en una cantidad de entre 0,5 mM y 50 mM; un agente tensoactivo presente en una cantidad de entre 0,0001% y 0,3% (peso/vol,), donde el agente tensoactivo comprende cocamidopropil hidroxisultaina, ácidos alquilaminopropiónicos, carboxilatos de imidazolina, betaínas, sulfobetaínas, sultaínas, etoxilatos de alquilfenol, etoxilatos de alcohol, glicoles de polioxipropileno polioxietilenados, mercaptanos polioxietilenados, ésteres de ácido carboxílico de cadena larga, alcanolamidas, glicoles acetilénicos terciarios, siliconas polioxietilenadas, N-alquilpirrolidonas, alquilpoliglicosidasas, polímeros de silicona como Antifoam A®, o polisorbatos como Tween®, o cualquier combinación de estos elementos; un alcanol de cadena corta presente en una cantidad de entre 1 y 25% (vol,/vol,); una solución tampón que proporciona a la composición un pH de entre 6 y 7, y agua libre de nucleasa, donde los componentes se encuentran presentes todos juntos en una cantidad suficiente como para desnaturalizar proteínas, inactivar nucleasas, eliminar patógenos y no degradar el ácido nucleico de una muestra que se sospecha que contiene agentes patógenos y donde la muestra está en contacto con la composición,

Description

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DESCRIPCION

Recogida de muestras biologicas y sistema de transporte y metodos de uso

1.1 Campo de la invencion

La invencion se refiere a composiciones acuosas para la recogida, el transporte y almacenamiento de una muestra biologica que contiene una poblacion de acidos nucleicos en un unico recipiente de reaccion, que posteriormente puede ser purificada y/o analizada utilizando metodos convencionales de biologfa molecular. En concreto, la invencion esta dirigida a una composicion de un solo paso que a) inactiva los virus o microbios de la muestra, b) lisa las celulas o tejidos biologicos para liberar los acidos nucleicos de restos celulares y biomoleculas extranas, c) protege los acidos nucleicos frente a la degradacion a traves de la actividad de la endonucleasa, y d) preserva los acidos nucleicos para su posterior aislamiento, deteccion, amplificacion y/o analisis molecular. En una aplicacion ventajosa, se pueden conseguir estas cuatro funciones en una unica composicion y en un unico recipiente de reaccion, y la muestra resultante se puede almacenar a temperatura ambiente durante periodos prolongados sin que se produzca una degradacion significativa de los polinucleotidos contenidos en la muestra.

1.2 Antecedentes de la invencion

En el ambito del analisis molecular y diagnostico, a menudo la capacidad para mantener la estabilidad de los acidos nucleicos de una muestra biologica, tanto si la muestra se toma en un lugar remoto, en la consulta de un medico o en un laboratorio, determina el exito del analisis de los acidos nucleicos. Los acidos nucleicos de una muestra biologica se degradan y/o desnaturalizan rapidamente a temperatura ambiente y, por lo general, es necesario almacenarlos en condiciones de congelacion para que se mantengan estables; aun asf, con el paso del tiempo se produce cierta degradacion. Este problema se agrava cuando se recoge una muestra en un lugar remoto o a una distancia importante de la consulta de un medico o del entorno del laboratorio y especialmente cuando puede haber un acceso limitado o no se tiene acceso a unas condiciones de refrigeracion/congelacion constantes hasta el momento en el que se analiza la muestra, por ejemplo cuando no se tiene acceso a una fuente de energfa (es decir, electricidad) o cuando no se dispone de un equipo de congelacion o este no mantiene una temperatura constante. El problema es todavfa mayor cuando los acidos nucleicos necesarios para el analisis posterior incluyen acido ribonucleico (ARN), que resulta particularmente susceptible a la degradacion, por ej., por la actividad de la endonucleasa endogena o exogena. La tecnologfa para el transporte de muestras actualmente disponible en la tecnica suele utilizar medios de transporte especiales para el transporte de las muestras biologicas a un laboratorio, en particular, embalajes que imponen plazos reducidos, bajas temperaturas y lfmites de viabilidad.

Ademas de las preocupaciones asociadas a la estabilidad de la muestra, a menudo se plantean otros problemas asociados con los reactivos utilizados para almacenar y/o transportar las muestras recogidas. Por ejemplo, los propios reactivos a menudo requieren bajas temperaturas u otros cuidados especiales para mantener la estabilidad. Debido a estos problemas de estabilidad, por ejemplo, el transporte de los reactivos a un punto operativo, el almacenamiento en el punto operativo antes de la utilizacion, y el transporte de regreso de las muestras biologicas y los reactivos al punto operativo continuan generando una preocupacion importante.

Otro problema significativo cuando se trabaja con muestras biologicas es la potencial inoculacion, liberacion o diseminacion de agentes biologicos o patogenos infecciosos vivos de la muestra al medio ambiente. En la actualidad existen protocolos espedficos que se aplican a la hora de manipular muestras que pueden ser infecciosas o presentar otros riesgos para la salud o la seguridad. Si la muestra se mantiene viable y/o biologicamente intacta para preservar su integridad para el ensayo, las personas que participan en el proceso de recogida, transferencia y ensayo se encuentran potencialmente expuestas a contagios altamente peligrosos. Por otra parte, puede haber terceros no implicados en las proximidades de un punto operativo (o durante el transporte) que se vean expuestos en caso de que se produzca un contagio. Como resultado, las medidas de seguridad necesarias normalmente incrementan los gastos y esfuerzos necesarios para desplazar estas muestras de un lugar a otro.

Hasta hace poco, los metodos de los laboratorios clmicos para la deteccion de patogenos eran procesos con unos costes elevados y que exigfan una gran carga de trabajo por parte de cientfficos altamente cualificados y expertos dotados de experiencia en el campo. La mayona de los laboratorios de diagnostico clmico empleaban metodos de cultivo tradicionales que por lo general requenan entre tres y siete dfas para un cultivo viral —e incluso mas en el caso de otros objetivos bacterianos—. Por otra parte, el cultivo tradicional requiere la recogida, el transporte y la propagacion y la manipulacion en laboratorio de agentes biologicos potencialmente infecciosos, tales como el Ebola, la gripe aviar, la neumoma asiatica (SARS), etc.

El campo del diagnostico molecular clmico cambio por completo con la llegada de la reaccion en cadena de polimerasa (PCR) a mediados de los ochenta y poco despues con la PCR en tiempo real, a mediados de los noventa. La PCR en tiempo real (RT-PCR) puede dar los resultados en unas horas y la mayona de los laboratorios de diagnostico modernos estan abandonando el cultivo tradicional en favor de plataformas de deteccion basadas en los acidos nucleicos, tales como la PCR en tiempo real. Las recientes mejoras de la qmmica de deteccion, tales como los nuevos y mas eficaces fluores reporters/inhibidores de la fluorescencia, ligandos de union al surco menor (MGB), y reactivos de amplificacion estabilizados han preparado el camino para ensayos de deteccion de patogenos mas sensibles y espedficos que han demostrado ser mas oportunos, solidos y economicos que los metodos de cultivo anticuados. Los avances en otras estrategias de deteccion de acido nucleico (ademas de la PCR en tiempo

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real), tales como la amplificacion mediada por transcripcion, la reaccion en cadena de ligasa (LCR), microarrays y chips de genes patogenos tambien han contribuido a la transicion desde los viales de cultivo en el laboratorio clmico.

Diversas empresas (como Qiagen, Roche y bioMerieux) han desarrollado instrumentos automaticos para la extraccion del acido nucleico y han intentado automatizar las distintas etapas que integran el proceso que comprende desde el aislamiento de la muestra hasta el analisis molecular. Por ejemplo, Tigris DTS® (Gen-Probe, San Diego, CA, USA) automatiza la totalidad del proceso de deteccion y a finales de 2004 obtuvo la aprobacion de la FDA para su uso con el ensayo Gen-Probe's APTIMA COMBO 2®, un ensayo de acido nucleico amplificado (NAT) aprobado por la FDA para la deteccion simultanea de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae.

Por consiguiente, existe la necesidad en esta tecnica de un sistema seguro de recogida, almacenamiento y transporte que mantenga la integridad de los acidos nucleicos incluso de una muestra biologica peligrosa, normalmente para su posterior ensayo de diagnostico o analisis molecular, sin necesidad de congelar la muestra biologica recogida, los reactivos empleados para recoger la muestra ni la muestra recogida en los reactivos, sin que esto suponga un riesgo para los trabajadores o terceros no implicados, y permitir el uso de metodos de transporte menos costosos y mas comodos o precauciones de transporte complicadas.

WO 97/05248 A divulga soluciones y metodos para el aislamiento/extraccion de ADN, ARN y protemas.

EP0313224 A divulga lmeas celulares procedentes de tejido pulmonar epitelial que producen protemas asociadas a agentes tensoactivos total o parcialmente procesadas.

US 2007/202511 A1 divulga composiciones de extraccion y metodos para el aislamiento de pequenas moleculas de ARN de una muestra biologica.

WO 2004/072270 A divulga metodos y composiciones para preparar muestras biologicas al objeto de preservar las macromoleculas de las muestras.

WO 91/02740 A1 divulga metodos y composiciones para el aislamiento de acidos nucleicos de las celulas.

2. Breve resumen de la invencion

La presente invencion incluye composiciones nuevas y utiles, asf como metodos para producirlas y emplearlas, que pueden mejorar de forma ventajosa los metodos convencionales de recogida, lisis, transporte y almacenamiento para la preparacion de acidos nucleicos a partir de una o mas fuentes biologicas. Por consiguiente, la presente invencion puede proporcionar de forma ventajosa un metodo de recogida y una formulacion de preservacion para inactivar y lisar una muestra biologica que contiene acidos nucleicos, y preservar los acidos nucleicos (ARN/ADN) de la muestra biologica, preferiblemente en un unico recipiente de reaccion, de forma que la integridad de los acidos nucleicos se mantenga al menos de forma sustancial —y preferiblemente de forma integral— y que una parte de los acidos nucleicos se encuentre facilmente disponible para el analisis de diagnostico molecular.

Una ventaja adicional de la presente invencion es que el metodo puede permitir que los acidos nucleicos separados o liberados se mantengan al menos sustancialmente estables, sin necesidad de temperaturas de enfriamiento uniformes y constantes, como en el caso de la refrigeracion o congelacion.

Las formulaciones de un solo paso divulgadas en el presente cumplen las siguientes funciones principales: inactivacion o eliminacion de patogenos en la muestra; lisis de celulas y separacion o liberacion de acidos nucleicos de las celulas; inactivacion de nucleasas endogenas o exogenas y otras enzimas celulares para prevenir la degradacion de los acidos nucleicos presentes en la muestra; y facilitacion de la recogida y manipulacion de la muestra a temperaturas ambiente, estabilizacion de los acidos nucleicos durante el posterior transporte y almacenamiento de la muestra, y preservacion/mantenimiento de la integridad de uno o mas polinucleotidos contenidos en los acidos nucleicos liberados.

La capacidad para conseguir todas estas funciones deseables con una formulacion de un solo paso, preferiblemente en una unica zona de reaccion o un unico recipiente de reaccion, representa una ventaja particularmente destacada respecto a la tecnica disponible en estos momentos. Las tecnologfas que existen en estos momentos no incluyen una composicion de un solo paso que permita la inactivacion de componentes biologicos que contienen acidos nucleicos, la liberacion de acidos nucleicos a traves de la lisis de celulas y la separacion o liberacion de acidos nucleicos, y el mantenimiento de la integridad de los acidos nucleicos. Sin animo de limitarnos a la teona, se cree que esto se debe en parte a que el proceso de eliminacion del organismo biologico presente en una muestra provoca tfpicamente la liberacion y activacion de enzimas que degradan las protemas y los acidos nucleicos. La degradacion enzimatica produce la destruccion de la muestra e impide su analisis. Sin embargo, la presente invencion estabiliza y preserva la integridad de los acidos nucleicos presentes en la muestra para el ensayo de diagnostico.

Las formulaciones de un solo paso de la presente invencion permiten preferiblemente la inactivacion simultanea de los componentes biologicos que contienen acidos nucleicos, la lisis y separacion o liberacion de los acidos nucleicos, la estabilizacion y preservacion. En una realizacion, la totalidad o parte de la inactivacion, lisis y separacion o liberacion, estabilizacion y preservacion son secuenciales. Sin embargo, en una realizacion preferible la mayona o preferiblemente la totalidad de estas funciones se produce de forma simultanea. En todas las realizaciones, la formulacion de un paso se combina con la muestra para iniciar estas funciones. Esto contrasta con la tecnologfa

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existente hasta la fecha en la que la inactivacion no se produda necesariamente; y la lisis, estabilizacion y preservacion se produdan en una sucesion de pasos separados, utilizandose tipicamente en cada paso uno o mas reactivos y protocolos distintos que se anadfan por separado.

El formato secuencial de los procedimientos anteriores era necesario para minimizar los errores, evitar la

incompatibilidad entre reactivos y proporcionar un control paso a paso de los resultados. La presente invencion

ofrece todas estas ventajas y anade los beneficios adicionales de mantener la integridad de los acidos nucleicos, permitiendo que se encuentren disponibles para la extraccion y purificacion, y mejorando por tanto su rendimiento final. Las funciones de la formulacion de un solo paso de inactivacion preferiblemente simultanea de los componentes biologicos que contienen acidos nucleicos, la lisis y liberacion de acidos nucleicos de los restos celulares, la estabilizacion y preservacion de los acidos nucleicos reducen las posibilidades de degradacion del ARN/ADN de la muestra que se puede producir durante la lisis, o con posterioridad a la lisis y antes de la

estabilizacion, lo que contribuye a un rendimiento mejorado de los acidos nucleicos que se extraen finalmente. Un

rendimiento mejorado puede proporcionar unos resultados de ensayo superiores.

La presente invencion es la que se establece en las reivindicaciones. En concreto, la presente invencion es la que se establece en las clausulas siguientes:

1. Una composicion acuosa que incluye los componentes siguientes: un caotropo presente en una cantidad de entre 0,5 M y 6M;

un detergente presente en una cantidad de entre 0,1% y 1% (peso/vol.), donde el detergente comprende docecilsulfato sodico (SDS), dodecilsulfato de litio (LDS), taurodesoxicolato sodico (NaTDC), taurocolato sodico (NaTC), glicocolato sodico (NaGC), desoxicolato sodico (NaDC), colato sodico, sulfonato de alquilbenceno sodico (NaABS), N-lauril sarcosina (NLS), sales de acidos carboxflicos, sales de acidos sulfonicos, sales de acido sulfurico, esteres de acido fosforico y polifosforico, alquilfosfatos, fosfato de monoalquilo (MAP), sales de acidos perfluorocarboxflicos, detergentes anionicos o cualquier combinacion de estos elementos;

un agente reductor, donde el agente reductor es p-ME, DTT, DMSO o formamida presente en una cantidad de entre 0,05 M y 0,3 M, o donde el agente reductor es TCEP presente en una cantidad de entre 0,5 mM y 30 mM;

un agente quelante presente en una cantidad de entre 0,5 mM y 50 mM;

un agente tensoactivo presente en una cantidad de entre 0,0001% y 0,3% (peso/vol.), donde el agente tensoactivo comprende cocamidopropil hidroxisultaina, acidos alquilaminopropionicos, carboxilatos de imidazolina, betamas, sulfobetamas, sultamas, etoxilatos de alquilfenol, etoxilatos de alcohol, glicoles de polioxipropileno polioxietilenados, mercaptanos polioxietilenados, esteres de acido carboxflico de cadena larga, alcanolamidas, glicoles acetilenicos terciarios, siliconas polioxietilenadas, N-alquilpirrolidonas, alquilpoliglicosidasas, polfmeros de silicona como Antifoam A®, o polisorbatos como Tween®, o cualquier combinacion de estos elementos;

un alcanol de cadena corta presente en una cantidad de entre 1 y 25% (vol./vol.);

una solucion tampon que proporciona a la composicion un pH de entre 6 y 7, y agua libre de nucleasa, donde los componentes se encuentran presentes todos juntos en una cantidad suficiente como para desnaturalizar protemas, inactivar nucleasas, eliminar patogenos y no degradar el acido nucleico de una muestra que se sospecha que contiene agentes patogenos y donde la muestra esta en contacto con la composicion.

2. La composicion de la clausula 1 donde la solucion tampon proporciona a la composicion un pH de entre 6.4 y 6.8.

3. La composicion de la clausula 1 o la clausula 2 donde el caotropo comprende triocianato de guanidina, isocianato de guanidina o hidrocloruro de guanidina.

4. La composicion de cualquiera de las clausulas 1 o 3, donde el detergente comprende dodecilsulfato sodico, dodecilsulfato de litio, taurodesoxicolato sodico, taurocolato sodico, glicocolato sodico, desoxicolato sodico, colato sodico, sulfonato de alquilbenceno sodico o N-lauril sarcosina.

5. La composicion de cualquiera de las clausulas 1 a 4, donde el agente reductor comprende 2-mercaptoetanol, tris(2-carboxietil)fosfina, ditiotreitol, dimetilsulfoxida o tris(2-carboxietil)fosfina.

6. La composicion de cualquiera de las clausulas 1 a 5, donde el agente quelante comprende acido etilenglicoltetraacetico, acido hidroxietilendiamintriacetico, acido dietilentriaminpentaacetico, N,N- bis(carboximetil)glicina, acido etilendiamintetraacetico, citrato anhidro, citrato sodico, citrato calcico, citrato amonico, bicitrato amonico, acido dtrico, citrato diamonico, citrato de amonio ferrico o citrato de litio.

7. La composicion de cualquiera de las clausulas 1 a 6, donde el alcanol de cadena corta comprende metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol o hexanol.

8. La composicion de cualquiera de las clausulas 1 a 7, donde la solucion tampon comprende tris(hidroximetil) aminometano, citrato, acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico, acido N, N -Bis(2-hidroxietil)-2 -aminoetanosulfonico, 1,3- bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano, acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico, acido 3-( N -morfolino) propanosulfonico, bicarbonato o fosfato.

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9. La composicion de cualquiera de las clausulas 1 a 8, donde los patogenos comprenden virus influenza, celulas infectadas por el virus influenza, bacterias de la tuberculosis o celulas infectadas por la bacteria de la tuberculosis.

10. La composicion de cualquiera de las clausulas 1 a 9, que comprende ademas ARN desnudo, ADN o una combinacion de estos elementos; opcionalmente, donde el ARN desnudo, ARN o la combinacion de estos elementos sirve como vetnculo o contiene una secuencia predeterminada de acido nucleico como control positivo interno.

11. La composicion de cualquiera de las clausulas 1 a 10, donde el caotropo, el detergente, el agente reductor, el agente quelante, el agente tensoactivo, el alcanol de cadena corta y/o la solucion tampon incluyen uno o mas caotropos, uno o mas detergentes, uno o mas agentes reductores, uno o mas agentes quelantes, uno o mas agentes tensoactivos, uno o mas alcanoles de cadena corta y/o una o mas soluciones tampon.

12. Un sistema para la recogida de muestras que comprende:

un dispositivo de recogida de muestras y un recipiente de recogida en el que se coloca la muestra, donde el recipiente de recogida contiene una cantidad de la composicion de cualquiera de las clausulas 1 a 11, donde la composicion es efectiva para mantener la integridad del acido nucleico que puede estar presente en la composicion para permitir la identificacion mediante PCR de un patogeno presente en la muestra cuando la composicion que contiene la muestra se almacena a temperatura ambiente o superior durante un periodo de siete dfas o mas.

13. Un metodo para detectar una secuencia de acido nucleico que es indicativa de la presencia de un patogeno en la muestra que consiste, en un solo paso, en poner en contacto la muestra con una cantidad de la composicion acuosa de cualquiera de las clausulas 1 a 11, donde la composicion es efectiva para eliminar todos los patogenos de la muestra sin degradar ni modificar el acido nucleico de la muestra, de forma que la secuencia de acido nucleico del patogeno resulta detectable mediante amplificacion por PCR.

14. El metodo de la clausula 13, donde el patogeno comprende bacterias, virus o un hongo; opcionalmente, donde la bacteria es tuberculosis o el virus es influenza.

15. El metodo de cualquiera de las clausulas 13 o 14, donde la secuencia de acido nucleico se encuentra presente en la composicion en una cantidad de 1 pg/mL a 1 ug/mL.

16. Un metodo para preparar la composicion acuosa de cualquiera de las clausulas 1 a 11, que comprende:

la combinacion de dicho caotropo y agua libre de nucleasa a una temperatura de entre 20 °C y 90 °C;

la combinacion del caotropo con un agente reductor, un agente quelante, un agente tensoactivo y un detergente para formar una composicion intermedia;

opcionalmente la combinacion de un polfmero de silicona con la composicion intermedia en una cantidad suficiente para minimizar la espuma durante la posterior preparacion;

la combinacion de una cantidad suficiente de solucion tampon con la composicion intermedia para obtener un pH de entre 5 y 7;

el aumento de la temperatura de la composicion intermedia hasta 60-95 °C durante uno a 30 minutos y posteriormente reducirla hasta la temperatura ambiente;

la combinacion de un alcohol C1-6 con la composicion intermedia; y

el ajuste de la formulacion a un pH de entre 6 y 7 para formar la composicion acuosa.

En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona una composicion que incluye: a) uno o mas caotropos (cada uno preferiblemente presente en la composicion en una cantidad de 0,5 M a 6M); b) uno o mas detergentes (cada uno preferiblemente presente en la composicion en una cantidad de entre 0,1% a 1%); c) uno o mas agentes quelantes (cada uno preferiblemente presente en la composicion en una cantidad de entre 0,01 mM y 1 mM); d) uno o mas agentes reductores (cada uno preferiblemente presente en la composicion en una cantidad de entre 0,05 M y 0,3 M); y e) uno o mas agentes antiespumantes (cada uno preferiblemente presente en la composicion en una cantidad de entre 0,0001% y 0,3%).

Entre los ejemplos de caotropos se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, tiocianato de guanidina (GuSCN,), hidrocloruro de guanidina (GuHCl), isotionato de guanidina, tiocianato de potasio (KSCN), yoduro de sodio, perclorato de sodio, urea o cualquier combinacion de los mismos. Las descripciones de otros ejemplos de caotropos y sales caotropicas se pueden encontrar, por ejemplo, en la Patente estadunidense N° 5 234 809.

Entre los ejemplos de detergentes se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, docecilsulfato sodico (SDS), dodecilsulfato de litio (LDS), taurodesoxicolato sodico (NaTDC), taurocolato sodico (NaTC), glicocolato sodico (NaGC), desoxicolato sodico (NaDC), colato sodico, sulfonato de alquilbenceno sodico (NaABS), N-lauril sarcosina (NLS), sales de acidos carboxflicos (es decir, jabones), sales de acidos sulfonicos, sales de acido sulfurico, esteres de acido fosforico y polifosforico, alquilfosfatos, fosfato de monoalquilo (MAP), y sales de acidos perfluorocarboxflicos, detergentes anionicos incluyendo los que se describen en la Patente estadounidense N° 5 691 299, o cualquier combinacion de estos elementos.

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Entre los ejemplos de agentes reductores se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, 2-mercaptoetanol (-ME), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT), formamida, dimetilsulfoxido (DMSO) o cualquier combinacion de estos elementos. En un aspecto de la presente divulgacion, el agente reductor incluye o es TCEP.

Entre los ejemplos de agentes quelantes se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, acido etilenglicoltetraacetico (EGTA), acido hidroxietilendiamintriacetico (HEDTA), acido dietilentriaminpentaacetico (DTPA), N,N- bis(carboximetil)glicina (NTA), acido etilendiamintetraacetico (EDTA), citrato anhidro, citrato sodico, citrato calcico, citrato amonico, bicitrato amonico, acido cftrico, citrato diamonico, citrato de potasio, citrato de magnesio, citrato de amonio ferrico, citrato de litio o cualquier combinacion de estos elementos. En aspectos de la presente divulgacion, el agente quelante incluye EDTA, un citrato o una combinacion de estos elementos. En un aspecto de la presente divulgacion, el agente quelante incluye EDT.

Las composiciones de la presente divulgacion pueden incluir tambien un agente antiespumante para evitar la formacion de burbujas tfpicamente resultante de la presencia de detergentes en la formulacion. Los agentes antiespumantes facilitan el pipeteo y la manipulacion de las composiciones divulgadas. Entre los ejemplos de agentes tensoactivos/antiespumantes se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, cocamidopropil hidroxisultaina, acidos alquilaminopropionicos, carboxilatos de imidazolina, betamas, sulfobetamas, sultamas, etoxilatos de alquilfenol, etoxilatos de alcohol, glicoles de polioxipropileno polioxietilenados, mercaptanos polioxietilenados, esteres de acido carboxflico de cadena larga, alcanolamidas, glicoles acetilenicos terciarios, siliconas polioxietilenadas, N-alquilpirrolidonas, alquilpoliglicosidasas, poftmeros de silicona como Antifoam A®, o polisorbatos como Tween®, o cualquier combinacion de estos elementos. En un aspecto de la presente divulgacion, un agente antiespumante incluye un poftmero de silicona.

Opcionalmente, las composiciones de la presente divulgacion pueden incluir asimismo una o mas soluciones tampon (cada una preferiblemente presente en la composicion final en una cantidad aproximada de entre 1 mM y 1 M). Entre los ejemplos de soluciones tampon se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, tris(hidroximetil)aminometano (Tris), citrato, acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES), acido N,N-Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico (BES), 1,3- bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano (Bis-Tris), acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico (HEPES), acido 3- (N-morfolino)propanosulfonico (MOPS), N,AM3is(2-hidroxietil) glicina (Bicina), N-[tris(hidroximetil)metil]glicina (Tricina), acido N-2-acetamido-2-iminodiacetico (ADA), acido N-(2-Acetanu)-2-aminoetanosulfonico (ACES), acido piperazina-1,4-bis(2-etanosulfonico) (PIPES), bicarbonato, fosfato, o cualquier combinacion de estos elementos. En un aspecto de la presente divulgacion, la solucion tampon incluye un citrato.

La inclusion de una o mas de estas soluciones tampon opcionales resulta recomendable para controlar el pH de las formulaciones, dado que se ha descubierto que la extraccion de acido nucleico resulta optima en un rango de pH de entre 5 y 7. Opcionalmente la solucion o soluciones tampon empleadas en las composiciones divulgadas son seleccionadas para proporcionar una capacidad amortiguadora significativa en el rango de un pH aproximado de entre 6 y 8, mas preferiblemente en un rango de pH aproximado de entre 6 y 7, y mas preferiblemente todavfa, en un rango de pH aproximado de entre 6.2 y 6.8. En algunos ejemplos de realizaciones, el pH de PrimeStore™ Solutions (tambien denominado en el presente "PSS") es opcionalmente de 6.7 ±0.25.

Las composiciones de la presente divulgacion tambien pueden incluir opcionalmente uno o mas alcanoles de cadena corta (preferiblemente alcoholes de 1- a 6-carbonos [es decir, C1-C6]) (cada uno preferiblemente presente en la composicion en una cantidad aproximada de entre 1% a 25%, aunque se pueden emplear porcentajes superiores de los alcoholes, si se desea). Algunos ejemplos de alcanoles de cadena corta incluyen alcoholes de cadena lineal y ramificada, tales como, a tftulo meramente enunciativo, metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol o una combinacion de estos elementos.

Las composiciones de la presente divulgacion tambien pueden incluir opcionalmente uno o mas compuestos o reactivos adicionales, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, betama, albumina de suero bovino, y osmolitos tales como trehalosa, sorbitol y similares.

En determinadas realizaciones de la presente divulgacion, la adicion de acidos nucleicos (por ejemplo, ARN y/o ADN) se considera beneficiosa para diversos fines y aplicaciones de los metodos divulgados: a) como "vehftculo" (se ha demostrado anteriormente que la adicion de pequenas cantidades de ADN/ARN complementario aumenta/incrementa el rendimiento total de las muestras, particularmente de las muestras originales que pueden contener bajas cantidades de la diana, es decir de las celulas, los virus, las bacterias); b) como control positivo interno para los posteriores procesos moleculares y para control o realizar un seguimiento de la fidelidad de la preparacion de acido nucleico desde la recogida de la muestra hasta la deteccion; y c) para la comparacion con un "calibrador" para el posterior analisis cuantitativo, por ejemplo qRT-PCR y similares. En tales aspectos de la presente divulgacion, uno o mas acidos nucleicos conocidos o de "control" se podnan anadir a las composiciones en una concentracion final aproximada de entre 1 pg y 1 |jg.

Opcionalmente, las composiciones proporcionan una capacidad amortiguadora suficiente como para estabilizar de forma adecuada las poblaciones de polinucleotidos obtenidas de una muestra y proporcionaran mas preferiblemente una capacidad amortiguadora hasta un pH aproximado de entre 6.4 y 6.9 durante la formulacion, y mantendran las poblaciones aisladas de polinucleotidos en un rango de pH similar cuando la muestra se pone en contacto con las formulaciones de almacenamiento/recogida que se describen en el presente.

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Opcionalmente, las muestras recogidas incluiran una o mas poblaciones de acidos nucleicos que son aisladas de una muestra biologica, muestra o fuente, incluyendo, por ejemplo, ARN y ADN.

Tfpicamente, las composiciones de la presente invencion inactivaran al menos de forma sustancial, y preferiblemente por completo, cualesquiera ARNasas o ADNasas endogenas o exogenas presentes en la muestra, de forma que los acidos nucleicos de la muestra se encuentren sustancialmente libres de cualquier degradacion y preferiblemente que no se degraden ni pierdan su integridad durante la recogida, lisis, almacenamiento y transporte de la muestra para su posterior analisis in vitro o in vivo.

Entre los ejemplos de formulaciones de la invencion se incluye una solucion de recogida de un solo paso que lisa, estabiliza y preserva la integridad de los acidos nucleicos preparados a partir de una muestra biologica para el posterior analisis de ARN y/o ADN.

Las composiciones divulgadas se desarrollaron y optimizaron, entre otras cosas: 1) para facilitar la preparacion de acidos nucleicos de alta calidad a partir de muestras cftnicas o ambientales; 2) para inactivar, eliminar o neutralizar de otro modo patogenos potencialmente infecciosos en una muestra biologica, a fin de facilitar la manipulacion y transporte seguros de las muestras recogidas; y 3) estabilizar el ADN/ARN liberado (es decir, "desnudo") durante periodos prolongados sin degradacion de la nucleasa o hidrolisis de los acidos nucleicos liberados.

Las composiciones descritas en el presente son ideales para el uso cftnico, de campo y despliegue, asf como para la extraccion/recogida de muestras de gran volumen. Las muestras recogidas en una o mas de las composiciones divulgadas se inactivan biologicamente y pueden ser transportadas de forma segura, por lo general sin necesidad siquiera de refrigeracion o hielo seco.

Las formulaciones de las composiciones de almacenamiento/transporte/recogida de la presente divulgacion se describen en los ejemplos adjuntos e incluyen, a tftulo meramente enunciativo, una composicion que incluye aproximadamente 4 M de un caotropo (como tiocianato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, isocianato de guanidina o cualquier combinacion de estos elementos), aproximadamente entre 10 mM y 30 mM de un agente quelante (como EGTA, HEDTA, DTP A, NTA, EDTA, citrato anhidro, citrato de sodio, citrato de calcio, citrato de amonio, bicitrato de amonio, acido cftrico, citrato de diamonio, citrato de amonio ferrico, citrato de litio o cualquier combinacion de estos elementos), aproximadamente un 0,25% de un detergente (como SDS, LDS, NaTDC, NaGC, colato sodico, NaABS, NLS o cualquier sal o combinacion de estos elementos), aproximadamente 0,1 M de un agente reductor (como -ME, DTT, DMSO, formamida, TCEP o cualquier combinacion de estos elementos), y aproximadamente un 0,1% de un agente tensoactivo/antiespumante (como un poftmero de silicona [p. ej., Antifoam A®] o un polisorbato [p. ej., Tween®], o cualquier combinacion de estos elementos).

Las formulaciones de las composiciones de almacenamiento/transporte/recogida de la presente divulgacion se describen en los ejemplos adjuntos e incluyen, a tftulo meramente enunciativo, una composicion que incluye aproximadamente 3 M de un caotropo (como tiocianato de guanidina, hidrocloruro de guanidina, isocianato de guanidina o cualquier combinacion de estos elementos), aproximadamente entre 1 mM y 10 mM de un agente quelante (como EGTA, HEDTA, DTP A, NTA, EDTA, citrato anhidro, citrato de sodio, citrato de calcio, citrato de amonio, bicitrato de amonio, acido cftrico, citrato de diamonio, citrato de amonio ferrico, citrato de litio o cualquier combinacion de estos elementos), aproximadamente un 0,25% de un detergente (como SDS, LDS, NaTDC, NaGC, colato sodico, NaABS, NLS o cualquier sal o combinacion de estos elementos), aproximadamente 0,1 M de un agente reductor (como -ME, DTT, DMSO, formamida, TCEP o cualquier combinacion de estos elementos), y aproximadamente un 0,1% de un agente tensoactivo/antiespumante (como un poftmero de silicona [p. ej., Antifoam A®] o un polisorbato [p. ej., Tween®], o cualquier combinacion de estos elementos).

Otro ejemplo de formulacion de las composiciones de aislamiento y estabilizacion de polinucleotidos divulgadas incluye, a tftulo meramente enunciativo, una composicion que contiene aproximadamente entre 1 y 4 M de un agente caotropico, como tiocianato de guanidina, hidrocloruro de guanidina o isocianato de guanidina; aproximadamente entre 0,5 y 100 mM de un agente quelante como EDTA, o citrato de sodio, o ambos; aproximadamente entre un 0,1 y un 1% de un detergente anionico, como SDS o iV-lauril sarcosina, sal de sodio; aproximadamente entre un 0,001 y un 0,0001% de un agente tensoactivo o humectante, como el poftmero de silicona Antifoam A®, e); aproximadamente entre 10 y 500 mM de una solucion tampon como Tris-HCl; y aproximadamente entre un 10 y un 25% de un alcanol de cadena corta, como etanol.

En determinados aspectos, la presente divulgacion proporciona una composicion que contiene aproximadamente 3 M de tiocianato de guanidina; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 10 mM de citrato de sodio; aproximadamente 0,5% de N-lauril sarcosina, sal de sodio; aproximadamente 0,0002% de Antifoam A, aproximadamente 100 mM de Tris-HCl, aproximadamente 0,1 mM de EDTA; y aproximadamente un 23% de etanol.

La presente divulgacion tambien proporciona un metodo para obtener una poblacion de polinucleotidos a partir de una muestra que se sospecha que contiene acidos nucleicos. Por lo general, el metodo implica poner en contacto la muestra con una cantidad de una de las composiciones divulgadas, en condiciones efectivas para obtener una poblacion de polinucleotidos de la muestra. La presente divulgacion no requiere la separacion de la poblacion para "obtener" la muestra, dado que el diagnostico posterior puede exigir o no dicha separacion.

La presente divulgacion tambien proporciona un metodo para preparar una formulacion acuosa de un solo paso de las composiciones de recogida/lisis/transporte/almacenamiento descritas en el presente para la recogida de acidos

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nucleicos como ARN y/o ADN. En sentido general, el metodo implica combinar uno o mas caotropos y agua libre de nucleasa a una temperatura de entre 20 y 90 °C en una zona de reaccion; a continuacion, combinar el caotropo o los caotropos disueltos con uno o mas agentes reductores, uno o mas agentes quelantes, y uno o mas detergentes en la zona de reaccion para formar una composicion intermedia; opcionalmente, combinar un poftmero de silicona con la composicion intermedia en una cantidad suficiente para minimizar la espuma durante la posterior preparacion de la formulacion acuosa de un solo paso; combinar una cantidad suficiente de solucion tampon con la composicion intermedia para mantener un pH aproximado de entre 6 y 6.9; opcionalmente, combinar un segundo agente quelante en la zona de reaccion; a continuacion, incrementar la temperatura de la segunda composicion intermedia hasta aproximadamente 60-95 °C durante un periodo de entre 1 y 30 minutos, y posteriormente reducirla hasta la

temperatura ambiente; opcionalmente, combinar un alcohol Cl-6 con el contenido de la zona de reaccion; y

opcionalmente ajustar el pH entre 6.4 y 6.9.

En otros aspectos, la presente divulgacion proporciona un metodo para preparar formulaciones acuosas de un solo paso adaptadas para obtener una poblacion de polinucleotidos a partir de una muestra biologica que se sospecha que contiene acidos nucleicos. Por lo general, este metodo implica al menos los pasos siguientes: a) poner en contacto la muestra con una cantidad de la formulacion acuosa de un solo paso que resulte efectiva para:

i) al menos eliminar o inactivar de forma sustancial los patogenos potencialmente infecciosos de la muestra;

ii) lisar una parte de las celulas para liberar el ARN y/o ADN de la muestra; y

iii) inhibir o evitar sustancialmente que los polinucleotidos liberados en la muestra se sometan a una posterior degradacion enzimatica o hidrolisis, modificacion o inactivacion, al objeto de obtener la poblacion de polinucleotidos de la muestra.

Esta muestra puede ser de cualquier origen, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, una muestra clrnica o veterinaria, una muestra ambiental o ecologica, una muestra forense o de la escena de un crimen, o similares, y puede contener uno o mas acidos nucleicos de origen vftico, microbiano, animal, vegetal, o cualquier combinacion de estos elementos.

Opcionalmente, los metodos de la presente divulgacion consistiran al menos en poner en contacto la muestra con una cantidad de una o mas de las composiciones divulgadas a una temperatura de entre 0 y 40 °C (mas preferiblemente a una temperatura de entre 4 y 35 °C, y todavfa mas preferiblemente a una temperatura de entre 10 y 30 °C) durante un periodo de tiempo de al menos 24 horas, mas preferiblemente durante un periodo de tiempo de al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o mas, sin causar un deterioro, degradacion, clivaje enzimatico y/o digestion nucleolftica, modificacion o procesamiento sustancial de los acidos nucleicos presentes en la muestra que se ha puesto en contacto con dicha composicion.

En determinados aspectos, los metodos de la presente divulgacion consistiran al menos en poner en contacto la muestra con una cantidad de una o mas de las composiciones divulgadas a una temperatura de entre 0 y 40 °C (mas preferiblemente a una temperatura de entre 4 y 35 °C, y todavfa mas preferiblemente a una temperatura de entre 10 y 30 °C, y mas preferiblemente aun a una temperatura de entre 15 y 25 °C) durante un periodo de tiempo de al menos 7 dfas, mas preferiblemente durante un periodo de tiempo de al menos 14 dfas, al menos 21 dfas, al menos 28 dfas o mas, sin causar un deterioro, degradacion, clivaje enzimatico y/o procesamiento nucleolftico sustancial de los acidos nucleicos presentes en la muestra sometida a este proceso. Se entendera que el hecho de poner en contacto una muestra con una composicion de la invencion solo es necesario que ocurra durante un periodo limitado, pero para evitar la necesidad de una separacion inmediata de los acidos nucleicos de la muestra y de la composicion de un solo paso de la invencion, todos los materiales pueden permanecer en contacto durante los periodos de tiempo anteriormente especificados, sin que se produzca ninguna degradacion o degradacion sustancial de los acidos nucleicos.

Opcionalmente, la integridad de una poblacion de polinucleotidos liberados de la muestra en la composicion se mantendra de forma sustancial, aun cuando la composicion que comprende la muestra se almacene a temperaturas ambiente, e incluso durante periodos de tiempo prolongados, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, un almacenamiento durante un periodo superior a unos 10 dfas, superior a unos 20 dfas o incluso superior a unos 30 dfas o mas. Del mismo modo, resulta recomendable que la integridad de una poblacion de polinucleotidos liberados de la muestra en la composicion se mantenga de forma sustancial, aun cuando la composicion que comprende la muestra se almacene a temperaturas subtropicales y tropicales, e incluso durante periodos de tiempo prolongados, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, un almacenamiento durante un periodo superior a 5 dfas, superior a 15 dfas o incluso superior a 25 dfas o mas.

En la practica de los presentes metodos, resulta preferible que al menos una o mas celulas biologicas contenidas en la muestra se sometan a una lisis sustancial al objeto de liberar al menos una primera poblacion de polinucleotidos contenida en dichas celulas de la composicion. Opcionalmente, los componentes de la composicion divulgada son suficientes para liberar esta poblacion a partir de los restos celulares restantes (incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, ftpidos, protemas, polisacaridos, componentes celulares y similares).

Tambien resulta recomendable en la practica de los presentes metodos que al menos una o mas nucleasas exogenas o endogenas que puedan estar presentes en la muestra, sobre la muestra o alrededor de la propia muestra, sean suficientemente inactivadas por uno o mas componentes de la composicion de forma que los acidos

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nucleicos resultantes no se destruyan, no resulten danados ni se sometan a un clivaje nucleolttico cuando las celulas biologicas incluidas en la muestra sean sustancialmente lisadas para liberar la poblacion de polinucleotidos de las celulas. Preferiblemente, uno o mas componentes de la composicion divulgada son efectivos para eliminar, inactivar o inhibir sustancialmente la actividad biologica de una ADNasa o ARNasa, cuando esta protema se encuentra presente en la muestra.

Tambien resulta recomendable en la practica de los presentes metodos que cuando haya uno o mas microbios, virus y/o patogenos presentes en la muestra, sobre la muestra o alrededor de la propia muestra en el momento de su recogida, dichos microbios, virus y/o patogenos sean eliminados o suficientemente inactivados por uno o mas de los componentes de la composicion, al objeto de facilitar la manipulacion segura de la muestra por parte del profesional de la salud. Opcionalmente, uno o mas componentes de la composicion divulgada son efectivos para que una muestra patogenica pase a ser sustancialmente, o de forma preferible completamente, no patogenica, sin necesidad de anadir componentes adicionales a la composicion. Sin embargo, en determinadas aplicaciones, tambien puede resultar recomendable incluir uno o mas agentes antimicrobianos, antivirales o antifungicos a las composiciones para que pasen a ser sustancialmente no patogenicas y, por tanto, que su manipulacion resulte segura para el profesional de la salud.

Opcionalmente, la composicion que contiene la muestra es al menos suficientemente estable, o es completamente estable, para permitir el almacenamiento de la muestra en la composicion a temperatura ambiente o inferior al menos sustancialmente (o completamente) desde el momento de la recogida hasta el momento del analisis de una poblacion de polinucleotidos de la muestra. Para los fines del presente, "temperatura ambiente" se puede referir a temperaturas de aproximadamente entre 18 y 25 °C o en algunas realizaciones de aproximadamente entre 20 y 22 °C.

En determinados aspectos de la presente divulgacion, la composicion que contiene la muestra se puede almacenar a una temperatura de aproximadamente entre 0 y 40 °C, mas preferiblemente a una temperatura de aproximadamente entre 4 y 30 °C, mas preferiblemente, a una temperatura de aproximadamente entre 10 y 25 °C, al menos sustancialmente desde el momento de la recogida hasta el momento en el que los polinucleotidos obtenidos de la muestra son posteriormente aislados, purificados o caracterizados utilizando una o mas metodologfas convencionales de biologfa molecular.

En determinados aspectos de la presente divulgacion, la composicion que contiene la muestra que se sospecha que contiene acidos nucleicos estabilizara los acidos nucleicos en la medida en que se mantengan al menos sustancialmente en estado no degradado (es decir, al menos sustancialmente estables) incluso tras un almacenamiento prolongado de la composicion a temperatura ambiente, en un refrigerador o bajo cero. Resultara recomendable que esta estabilidad permita que al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 85%, mas preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, mas preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, o incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de los polinucleotidos contenidos en la muestra almacenada no se degrade tras un almacenamiento prolongado de la muestra. En determinados aspectos de la presente invencion, sustancialmente todos los polinucleotidos contenidos en la muestra se estabilizaran de forma que la integridad original de los polinucleotidos se preserve durante la recogida, lisis, almacenamiento y transporte de la muestra procesada.

En determinados aspectos de la presente divulgacion, el metodo proporcionara opcionalmente una poblacion de acidos nucleicos preparada a partir de una muestra biologica en la que menos de aproximadamente el 15% de los polinucleotidos incluidos en la muestra se degradaran durante la recogida, lisis, almacenamiento y transporte de la muestra, despues de que hayan sido almacenados en la composicion a una temperatura aproximada de entre -20 y 40 °C durante un periodo de al menos 24, 48, 72 o 96 horas o mas desde que la muestra se introdujese inicialmente en la composicion.

En aspectos relacionados de la presente divulgacion, el metodo proporcionara opcional y preferiblemente una poblacion de acidos nucleicos preparada a partir de una muestra biologica en la que menos de aproximadamente el 10% de los polinucleotidos incluidos en la muestra se degradaran durante la recogida, lisis, almacenamiento y transporte de la muestra, despues de que hayan sido almacenados en la composicion a una temperatura aproximada de entre -20 y 40 °C durante un periodo de al menos 24, 48, 72 o 96 horas o mas desde que la muestra se introdujese inicialmente en la composicion.

Del mismo modo, en algunas aplicaciones de la metodologfa divulgada en el presente, el uso de las composiciones divulgadas proporcionara preferiblemente una poblacion de acidos nucleicos preparada a partir de una muestra biologica en la que menos de aproximadamente el 5% de los polinucleotidos incluidos en la muestra se degradaran durante la recogida, lisis, almacenamiento y transporte de la muestra, despues de que hayan sido almacenados en la composicion a una temperatura aproximada de entre -20 y 40 °C durante un periodo de al menos 24, 48, 72 o 96 horas o mas desde que la muestra se introdujese inicialmente en la composicion.

En algunos ejemplos, la poblacion de acidos nucleicos preparada a traves de los metodos presentes se puede mantener con suficiente integridad para que no mas del 1 o 2% de la muestra se degrade, incluso cuando la composicion se almacene a una temperatura aproximada de entre 0 y 40 °C durante periodos de varios dfas a varias semanas. De hecho, los inventores han demostrado que las muestras de acidos nucleicos aisladas utilizando los metodos divulgados se mantienen al menos sustancialmente estables, preferiblemente estables, en su forma no

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degradada durante periodos de varias semanas o incluso varios meses o mas, incluso cuando la composicion que contiene los acidos nucleicos se almacena a una temperatura de entre 10 y 40 °C. En una realizacion preferible, el Kmite superior de los mencionados rangos de temperatura es de unos 37 °C. Por tanto, a efectos del presente, el termino "estable" se puede referir a las diversas realizaciones anteriormente mencionadas por lo que respecta a la integridad de la poblacion de acidos nucleicos tras un intervalo de tiempo concreto a una temperatura predeterminada.

2.2 Formulaciones y kits comerciales

La presente divulgacion tambien proporciona kits y sistemas de recogida de muestras que utilizan las composiciones divulgadas y soluciones de recogida/almacenamiento/transporte descritas en el presente. En aspectos concretos de la presente divulgacion, estos sistemas de recogida de muestras pueden incluir un dispositivo de recogida, como un tampon impregnado, una legra o un bucle de cultivo; y un recipiente de recogida, como un tubo de ensayo tipo vial o un vaso para muestras, que contenga una o mas de las composiciones divulgadas en el presente. El recipiente de recogida preferiblemente tiene un mecanismo de apertura extrafble, de forma que se pueda abrir para insertar las composiciones de un solo paso y cerrarse y embalarse, abrirse para insertar la muestra y opcionalmente una porcion del dispositivo de recogida y cerrarse para su almacenamiento y transporte, o ambas cosas. El recipiente de recogida puede utilizar cualquier mecanismo de apertura adecuado, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, una tapadera roscada, una tapadera a presion, una tapadera de presionar y girar o similares. Estos sistemas tambien pueden incluir opcionalmente uno o mas reactivos adicionales, dispositivos de almacenamiento, dispositivos de transporte y/o instrucciones para la obtencion, recogida, lisis, almacenamiento o transporte de muestras en estos sistemas. En un aspecto de la presente divulgacion, las composiciones de un solo paso de la divulgacion ya pueden estar dispuestas en la zona de reaccion a la que se puede asociar la muestra. En estos aspectos de la presente divulgacion, la divulgacion solamente requiere un dispositivo de recogida y el recipiente de recogida.

El kit tambien puede incluir uno o mas dispositivos de extraccion para ayudar a liberar y separar los acidos nucleicos para obtener al menos sustancialmente ARN/ADN puro para su analisis.

Los kits tambien pueden ser embalados para su distribucion comercial y ademas pueden incluir opcionalmente uno o mas dispositivos de recogida, entrega, transporte o almacenamiento para la recogida, la manipulacion o procesamiento de muestras. El contenedor o contenedores de estos kits pueden incluir tfpicamente al menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, un vaso para muestras u otro contenedor, en el que se puede colocar la composicion o composiciones y, preferiblemente, dividirse en partes alfcuotas para la recogida, el transporte y almacenamiento de muestras individuales. El kit tambien puede incluir un contenedor de mayor tamano, como un estuche, que incluye los contenedores anteriormente mencionados, junto con otros equipos, instrucciones y similares. El kit tambien puede incluir opcionalmente uno o mas reactivos adicionales, soluciones tampon o compuestos, y puede incluir asimismo opcionalmente instrucciones de uso del kit en la recogida de una muestra clmica, de diagnostico, ambiental o forense, asf como instrucciones para el almacenamiento y transporte de dicha muestra una vez que se haya colocado en la composicion o composiciones divulgadas. El kit puede incluir, por ejemplo, multiplos de cinco o mas de los diversos dispositivos de recogida y recipientes de recogida, asf como cualesquiera otros compuestos a incluir, de forma que los kits se puedan utilizar para recoger multiples muestras de la misma fuente o de fuentes diferentes.

3. Breve descripcion de los dibujos

Para facilitar la comprension de los principios de la presente divulgacion, ahora se hara referencia a las realizaciones o ejemplos que se ilustran en los dibujos y se utilizara el lenguaje espedfico para describirlas. No obstante, se entendera que esto no pretende en modo alguno limitar el alcance de la invencion. Se contempla cualquier alteracion u otra modificacion de las realizaciones descritas y cualquier otra aplicacion de los principios de la invencion aqrn descrita, tal y como hana normalmente un experto en la tecnica a la que se refiere la invencion.

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria y se incluyen para demostrar determinados aspectos de la presente invencion. La presente divulgacion se puede entender mejor por referencia a la siguiente descripcion interpretada conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que los mismos numeros de referencia identifican los mismos elementos, y en los que:

La FIG. 1 muestra la eficiencia de extraccion de PrimeStore™ (ver. 1). PrimeStore (ver. 1 [ilustrado aqrn como "One- step +"]) comparado con Lysis Solution incluida en el RNaqueous®- Micro Kit (Ambion, Cat#AM1931) utilizando una cantidad estandar del virus influenza A completo. Para la comparacion se utilizo la formulacion de un solo paso o Lysis Solution proporcionada en el kit para la lisis del ARN viral y, a continuacion, se extrajo de conformidad con los protocolos del fabricante. Las reacciones replicadas se procesaron y analizaron mediante RT-PCR en tiempo real (rRT-PC) utilizando un sistema de deteccion de secuencias ABI7500;

La FIG. 2 muestra la eficiencia de extraccion de PrimeStore™ Solution (ver. 1) en comparacion con kits comerciales. Se recogieron muestras de nariz de rata algodonera homogeneizada (*) a la que se le habfa administrado el virus influenza A (H3N2) o un virus clmico de la influenza A humana (H1N1) durante la temporada 2006-07, se lisaron en PrimeStore™ Solution o se lisaron utilizando la respectiva solucion de lisis, el protocolo y el procedimiento de extraccion de tres kits disponibles en el mercado: RNaqueous-Micro (Ambion Car#AM1931), QiaAmp Viral Mini Kit (Qiagen), y AI/NCD MaxMag (Ambion) Kit. La eficiencia de la extraccion se evaluo utilizando ABI 7500 con el metodo del umbral del ciclo (CT) comparativo. Los resultados relativos del CT y las copias virales detectadas fueron optimos

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cuando se utilizo PrimeStore™ (representado como la "formulacion de un solo paso") en lugar de las respectivas soluciones tampon de lisis de cada kit comercial;

La FIG. 3 muestra la preservacion de ARN desnudo en PrimeStore™ Solution en comparacion con Ambion RNA Storage Solution. Se almaceno ARN aviar H5 de cadena simple en solucion PrimeStore™, solucion de almacenamiento de ARN (Ambion), o agua a temperatura ambiente (22-24 °C) durante 96 horas. Se extrajeron un total de 5 pg de ARN utilizando RNaqueous®-Micro Kit (Ambion, Cat#AM1931) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se analizaron mediante RT-PCR en tiempo real en ABI 7500 (Applied Biosystems). Los valores se proporcionan como umbrales del ciclo (CT) utilizando el metodo de cuantificacion absoluta;

La FIG. 4 muestra un ejemplo de un formato de embalaje de PrimeStore™ para la recogida para el diagnostico clmico. Instrucciones para la recogida de la muestra utilizando un tampon impregnado (Copan Diagnostics) y un tubo de 5 ml para la recogida de muestras que contiene 1.5 ml de PrimeStore™ Solution;

La FIG. 5 muestra un ejemplo de PrimeStore™ Collection Solution comercial. Tres ejemplos de formatos de solucion comercial para la recogida de muestras: botella de 25 ml, y formatos de tubo de 5 ml y 1,5 ml;

La FIG. 6 ilustra la capacidad de PrimeStore™ Solution para eliminar rapidamente los microorganismos. Se muestra una comparacion del crecimiento celular de MRSA en un medio de cultivo (TSB) o en una solucion de PS. Tras 10 segundos en PrimeStore™ Solution, no se detecto ningun patogeno bacteriano viable.

La FIG. 7A muestra la inactivacion de muestras de cloaca de gallina en PrimeStore™ Solution (Ver. 1). PrimeStore™ Solution inactiva los agentes microbianos en una hora. Se sumergieron cuatro muestras de cloaca de gallina originales en PrimeStore™ Solution (fila superior) o agua (fila inferior) y posteriormente se colocaron en placas de agar sangre;

La FIG. 7B demuestra que PrimeStore™ inhibe la hidrolisis de la base de ARN durante 30 dfas a temperatura ambiente. El ARN se incubo a temperatura ambiente (22-26 °C) en PrimeStore™ (barras de gel 1 y 3) y agua (barras de gel 2 y 4), y posteriormente se amplifico mediante RT-PCR (1500 pares de bases) en los Dfas 0 y 30. PrimeStore™ preservo el ARN recogido y evito la degradacion de ARN/ADN a temperatura ambiente hasta 30 dfas;

La FIG. 8A ilustra el analisis mediante RT-PCR en tiempo real de una plantilla de ARN de influenza A aviar H5 "desnudo" preservada en PrimeStore™ Solution tras la incubacion en nucleasas de ARN/ADN. El ARNc H5 (2 ng) se incubo con ribonucleasa A y T1, y DNAsel durante una hora a 37 °C y se extrajo utilizando RNAaqueous®-Micro Kit (Ambion). Se incluyeron reacciones por triplicado para cada una de las condiciones de reaccion. Los valores del umbral de ciclo (CT) de la RT-PCR en tiempo real del ARN desnudo preservado en PrimeStore con nucleasas anadidas (CT medio: 22,88) fueron similares a los de una cantidad igual de control de una plantilla de ARNc (CT medio: 23,70). Las reacciones de la plantilla de ARNc sometidas a digestion de nucleasa sin PrimeStore™ se degradaron practicamente por completo (CT medio: 39,58);

La FIG. 8B ilustra el analisis mediante RT-PCR en tiempo real y electroforesis en gel de una plantilla de ARN de influenza A aviar H5 "desnudo" preservada en PrimeStore™ Solution tras la incubacion en nucleasas de ARN/ADN a 37 °C durante siete dfas. Se incubaron dos nanogramos de ARNc H5 con RNasa A y Tl, y DNasa I, y a continuacion se extrajeron utilizando RNAaqueous®-Micro Kit (Ambion) despues de siete dfas. Se incluyeron reacciones por duplicado para cada reaccion. Los valores del umbral de ciclo (CT) de la RT-PCR en tiempo real del ARN desnudo preservado en PrimeStore con nucleasas anadidas (CT medio: 33.51) se detectaron despues de siete dfas. Las reacciones de la plantilla de ARNc sometidas a digestion de nucleasa sin PrimeStore™ se degradaron por completo y de forma similar a las reacciones de NTC.

La FIG. 8C demuestra que PrimeStore™ es insensible a la digestion de nucleasa. Electroforesis en gel y producto tras la amplificacion. La barra 3 es el producto de la PCR de la plantilla de ARN + PrimeStore™ a 37°C durante 7 dfas, y la barra 5 la amplificacion de un ARN de control positivo. La barra 5 (sin amplificacion) es ARN sin PrimeStore™ y las lmeas 2 y 6 son una escalera de 100 pb y reacciones de NTC, respectivamente.

La FIG. 9 ilustra que la preservacion en PrimeStore™ es superior a otras soluciones. PrimeStore™ (Ver. 2 y Ver. 2.2) Preservacion de ARN de virus influenza A en comparacion con solucion tampon Qiagen AVL, etanol y Viral Transport Media (VTM) a temperatura ambiente (22-25°C) durante 30 dfas.

La FIG. 10 muestra la eficiencia de la extraccion del virus influenza A preservado en PrimeStore™ (Ver. 2.2) durante 30 dfas a diversas temperaturas. Ambiente (21-37°C); Congelacion-descongelacion (-25°C; 32x); temperatura ambiente (22-26°C); y Barra 5: refrigerado (4°C).

La FIG. 11 es un grafico del umbral cntico frente a la concentracion molar utilizando virus influenza A completo con TCEP como agente reductor;

La FIG. 12 es un grafico del umbral cntico frente a la concentracion molar utilizando ARN de cadena simple de influenza aviar H5N1 con TCEP como agente reductor;

Las FIG. 13A y 13B muestran la comparacion entre TCEp y p-ME como agente reductor de las composiciones PrimeStore™ Solution, utilizando un control a base de agua solamente. En la FIG. 13A, se empleo ARN de influenza aviar H5, mientras que en la FIG. 13B se utilizo el virus completo.

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La FIG. 14A muestra los resultados de un estudio empleando PrimeStore™ Solution para preservar los acidos nucleicos de la sangre. Eficiencia de extraccion de PrimeStore de la sangre completa a la que se le ha anadido ARN en comparacion con la solucion de lisis en QIAamp® DNA Blood Mini Kit. Se anadieron 0,1 pg y 1 pg de ARN de influenza A y se practico la extraccion utilizando PrimeStore™ o una solucion tampon AL Lysis. A ambas concentraciones de ARN, PrimeStore™ produjo resultados superiores tal y como ponen de manifiesto los resultados de CT de la RT-PCR en tiempo real;

La FIG. 14B incluye una tabla de datos del estudio mostrado en la FIG. 14A que implica la extraccion de ARN de cadena simple de influenza aviar H5 "desnudo" de los tubos de sangre. Eficiencia de extraccion de PrimeStore de la sangre completa a la que se le ha anadido ARN en comparacion con la solucion de lisis en QIAamp® DNA Blood Mini Kit utilizando diferentes anticoagulantes para la sangre. PrimeStore™ fue superior en comparacion con AL Lysis Buffer de Qiagen utilizando sangre a la que se le hada anadido ARN en tubos de recogida de sangre con anticoagulantes habituales; y

La FIG. 14C incluye una tabla de datos del estudio mostrado en la FIG. 14A que implica la comparacion de PrimeStore™ Solution frente a un kit de extraccion comercial (Qiagen). Se muestra la eficiencia de extraccion de PrimeStore™ de la sangre completa a la que se le ha anadido ARN en comparacion con la solucion de lisis en QIAamp® DNA Blood Mini Kit. Se anadieron 0,1 pg y 1 pg de ARN del virus influenza A y se practico la extraccion utilizando PrimeStore™ o una solucion tampon AVL Lysis. A ambas concentraciones de ARN, PrimeStore™ produjo resultados superiores tal y como ponen de manifiesto los resultados de CT de la RT-PCR en tiempo real.

4. Descripcion de realizaciones ilustrativas

A continuacion se describen aspectos ilustrativos de la presente divulgacion. En aras de una mayor claridad, en la presente memoria no se describen todas las caractensticas de una implementacion real. Se apreciara sin lugar a dudas que para el desarrollo de cualquiera de estas realizaciones reales se deben tomar numerosas decisiones espedficas de la implementacion para conseguir los objetivos espedficos de los responsables de la implementacion, tales con la conformidad con las limitaciones asociadas al sistema y a la empresa, que variaran de una implementacion a otra. Por otra parte, se apreciara que este esfuerzo de desarrollo podna resultar complejo y prolongado, aunque supondna una tarea rutinaria para los expertos en la tecnica que se beneficien de la presente divulgacion.

La mejora de la estabilizacion, recogida, transporte y preservacion que ofrecen las formulaciones divulgadas resultan particularmente ventajosas cuando la muestra se encuentra en una region geografica alejada de las instalaciones de ensayo. Las ubicaciones remotas, tambien denominadas sitios de campo, incluyen diversos entornos en los que tfpicamente no se realizan ensayos de diagnostico. Estos sitios incluyen consultas medicas, centros de triaje, aeropuertos, pasos de fronteras, areas de brote y diversas ubicaciones de exterior. Las composiciones y metodos divulgados ofrecen especiales ventajas en lugares en los que no se dispone de acceso a la electricidad y/o refrigeracion o en los que este acceso no es constante. Dada la estabilidad mejorada a temperatura ambiente, se puede tomar una muestra en cualquier ubicacion remota, por ejemplo, a tttulo meramente enunciativo, en un lugar de Africa en el que se produce un brote de malaria, y la muestra se puede transportar a los Estados Unidos o Europa para el analisis de diagnostico en el laboratorio. Dado que las formulaciones de recogida divulgadas son estables a temperatura ambiente o inferior, y preferiblemente incluso a temperaturas tropicales o subtropicales durante un tiempo, se pueden tomar muestras de forma rutinaria sobre el terreno sin preocuparse por el hecho de que los propios reactivos incluidos (tales como controles de ARN) se degraden hasta que la muestra se pueda analizar, tfpicamente en una ubicacion remota con respecto al lugar de recogida.

Las composiciones de la presente divulgacion pueden ser cualquier formulacion acuosa adecuada descrita en el presente, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, una solucion, suspension (incluyendo suspension coloidal), lodos, emulsion, homogeneizado o similares. Una formulacion acuosa preferible es una solucion y, por tanto, el termino "solucion" se ha utilizado en los ejemplos de toda la descripcion detallada de las realizaciones preferibles para referirse a cualquiera de las composiciones acuosas de la presente divulgacion.

4.1 Recogida de muestras para los laboratorios de diagnostico clmico

La recogida es el primer paso de las plataformas de diagnostico o protocolos moleculares que requieren la deteccion de cantidades potencialmente mmimas de acidos nucleicos de patogenos, incluyendo virus. Para facilitar los avances dinamicos de las estrategias de deteccion basadas en acidos nucleicos y su integracion en los laboratorios de diagnostico convencionales, existe una necesidad apremiante de sistemas de recogida fiables, solidos y normalizados desarrollados de forma espedfica para ser utilizados para la deteccion basada en acidos nucleicos en una fase posterior del proceso, como las mencionadas plataformas. Alternativamente, la invencion se puede adaptar para el transporte de acidos nucleicos desde un quirofano o consulta medica o para su transporte a un centro regional, como un hospital.

Una muestra clmica o veterinaria de un sistema de recogida de muestras forenses o ambientales puede incluir una o mas herramientas de recogida y uno o mas reactivos a fin de conseguir de forma eficiente: 1) obtener un alto rendimiento de una muestra adecuada mas alla de lo que resulta posible en la tecnica en estos momentos; 2) inactivar los patogenos biologicos potencialmente infecciosos, de forma que dejen de ser viables y se puedan manipular, enviar o transportar con unas precauciones mmimas en materia de liberacion o contaminacion de patogenos; o 3) estabilizar y preservar de forma efectiva los polfmeros de ARN/ADN "desnudo" lisados frente a la

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hidrolisis o degradacion por nucleasa durante periodos prolongados a temperatures ambiente hasta que las muestras se puedan procesar en el laboratorio de diagnostico, y preferiblemente para conseguir dos de estos objetivos o los tres.

Las soluciones de recogida/transporte de la presente invencion pueden ofrecer una serie de mejoras y ventajas con respecto a las existentes actualmente en la tecnica. Entre las ventajas se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, una o mas de las siguientes:

inactivacion, eliminacion y/o lisis de microbios, virus o patogenos;

destruccion y/o inactivacion de nucleasas exogenas o endogenas, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, RNasa y/o DNasa;

compatibilidad con diversos sistemas convencionales de extraccion de acido nucleico, purificacion y amplificacion;

preservacion de la integridad del ARN y/o ADN de la muestra;

facilitacion del envfo y transporte a temperaturas ambiente, incluso durante periodos de tiempo prolongados o con variaciones de temperaturas extremas; e

idoneidad para el almacenamiento a corto plazo (varias horas a varios dfas), a medio plazo (varios dfas a varias semanas) o a largo plazo (varias semanas a varios meses) de los acidos nucleicos aislados.

Las composiciones divulgadas resultan particularmente adecuadas para estudios en el punto de atencion o de campo, atencion sanitaria o ensayos domiciliarios, evaluaciones en unidades de triaje/emergencias y urgencias, toma de muestras moviles forenses, patologicas o epidemiologicas, investigaciones de la escena del crimen, pruebas de paternidad, evaluaciones geneticas previas y posteriores al embarazo, ensayos en casos de violacion/incesto y asesoramiento familiar, examenes confidenciales y de enfermedades de transmision sexual, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, VIH, sffilis, clamidia, gonorrea y otras enfermedades venereas y similares; y pueden resultar especialmente utiles durante el seguimiento, la etiologfa y control de enfermedades epidemicas o pandemicas tanto de poblaciones humanas como animales en el plano nacional e internacional. Las composiciones pueden tener especial relevancia para recopilar y analizar muestras de virus influenza, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, para predecir y ayudar a gestionar la tendencia, asf como para gestionar una pandemia inminente o en curso.

En determinados aspectos de la presente divulgacion, el acido o los acidos nucleicos aislados a traves de los metodos de la presente invencion pueden servir de plantilla en una o mas aplicaciones posteriores de biologfa molecular, ensayos o tecnicas, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, toma de huellas geneticas, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) del polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP); analisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restriccion (RFLP); analisis de oligonucleotidos espedficos de alelos (ASOA); analisis de microsatelites; hibridacion Southern; hibridacion Northern; PCR del numero variable de repeticiones en tandem (VNTR); hibridacion por transferencia puntiforme (dot-blot); PCR cuantitativa en tiempo real; conjunto ciclismo polimerasa (PCA); PCR anidada; PCR cuantitativa (Q-PCR); PCR asimetrica; toma de huellas de ADN; genotipo del polimorfismo de nucleotido simple (SNP); PCR de transcripcion inversa (RT-PCR); PCR multiple (m-PCR); amplificacion por sonda dependiente de ligandos multiples (MLPA); PCR mediada por ligandos (LmPCR); PCR espedfica de metilacion (MPCR); amplificacion dependiente de helicasa (HDA); PCR de solapamiento- extension (OE-PCR); amplificacion del genoma completo (WGA); aislamiento de plasmidos; amplificacion de alelos; mutagenesis de sitio dirigido; examen genetico de alto rendimiento o similares, o cualquier combinacion de estos.

Las composiciones de la presente invencion proporcionan soluciones de recogida de muestras clrnicas/ambientales que consiguen de forma eficaz al menos tres de los objetivos siguientes y preferiblemente todos ellos: 1) eliminar o inactivar patogenos potencialmente infecciosos, de forma que dejen de ser viables y que se puedan manipular, enviar o transportar de forma segura; 2) lisar celulas para la liberacion de ARN y/o ADN de la muestra biologica incluida en el sistema de recogida; 3) proteger los polinucleotidos liberados o "desnudos" de la muestra frente a una posterior hidrolisis o degradacion enzimatica, modificacion o inactivacion; y 4) prolongar el marco temporal convencional para el almacenamiento y transporte de la muestra procesada en diversas condiciones de temperatura ambiente (inferior o superior a la temperatura optima), a fin de mantener la fidelidad e integridad de los polinucleotidos liberados hasta que el material biologico pueda ser procesado o analizado en las instalaciones de diagnostico o el laboratorio analftico.

En un aspecto de ejemplo de las presente divulgacion, los metodos y formulaciones mantienen al menos una estabilidad sustancial de los acidos nucleicos de la muestra durante un periodo de tiempo ampliado, por ejemplo, hasta unos 15 dfas, preferiblemente hasta unos 30 dfas, o mas preferiblemente hasta unos 60 dfas o mas, sin refrigeracion ni congelacion de la muestra, e incluso cuando se almacenan a temperatura ambiente, incluyendo temperaturas templadas, climas subtropicales o tropicales y similares. En otros aspectos de la presente divulgacion, el uso de las composiciones divulgadas para preparar acidos nucleicos a partir de una muestra de origen biologico resulta recomendable para mantener al menos una integridad y fidelidad sustanciales de los acidos nucleicos liberados por la muestra durante periodos prolongados, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, al menos entre 5 y 10 dfas aproximadamente, preferiblemente al menos entre 10 y 20 dfas, mas preferiblemente al menos entre 15 y

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Los acidos nucleicos obtenidos de muestras biologicas en la practica de los metodos divulgados son ventajosamente compatibles con una serie de metodologfas convencionales de aislamiento, purificacion, deteccion y/o analisis molecular y de diagnostico. Las composiciones divulgadas facilitan el almacenamiento de recuperacion y el transporte de poblaciones de polinucleotidos estabilizados y sustancialmente no degradados para su uso en diversas metodologfas posteriores, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, aislamiento de acido nucleico, purificacion, amplificacion y pruebas de analisis molecular y/o de diagnostico, ensayos, analisis o caracterizacion y similares.

4.2 Ejemplos de kits comerciales de la presente invencion

A continuacion se proporcionan ejemplos de kits comerciales que emplean composiciones PrimeStore™ de la presente invencion (FIG. 5).

4.2.1 Sistema de recogida embolsado

Tubo de 5 ml que contiene 1,5 ml de PrimeStore™ Solution; tampon impregnado (p. ej., FlockedSWABS® [Copan Diagnostics, Inc., Murrieta, CA, USA]); e instrucciones de recogida y/o procesamiento de muestras, (envasados, p. ej., en 50 bolsas/unidad) (veanse las FIG. 4A, 4B, 4C, 4D y 4E para una demostracion esquematica de estos sistemas).

4.2.2 Solucion madre de PrimeStore™ (p. ej., botellas de 25 ml)

Una vez formulada, la solucion madre de PrimeStore™ es estable a 4 °C o menos durante periodos de al menos un ano o mas. Tambien se ha demostrado que la formulacion de PrimeStore™ Solution es estable a temperatura ambiente (p. ej., a unos 20-30°C) durante periodos de entre tres y seis meses o mas.

Una vez que la muestra se pone en contacto con una formulacion PrimeStore™ como la divulgada en el presente, cabe esperar razonablemente que sea almacenada de forma indefinida a temperaturas de 0°C o inferiores, y al menos un ano o mas en condiciones de refrigeracion (p. ej., 4°C y al menos 30 dfas o mas a temperatura ambiente (p. ej., 20-30°C), sin una perdida significativa de su composicion en acidos nucleicos, fidelidad o integridad de la muestra. Por ejemplo, a tftulo meramente enunciativo, la integridad de una poblacion de polinucleotidos obtenidos de la muestra se mantiene al menos sustancialmente, y preferiblemente por completo, sin una degradacion detectable, cuando la composicion que comprende la muestra se almacena a una temperatura de entre -20 °C hasta 40 °C durante un periodo de entre 30 y 60 dfas.

El kit tambien puede incluir uno o mas viales que incluyen las composiciones de la invencion y uno o mas dispositivos de extraccion para ayudar a liberar y separar los acidos nucleicos para obtener al menos sustancialmente ARN/ADN puro para su analisis.

4.2.3 Muestra ambiental y sistemas de almacenamiento

Viales de recogida de 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, o 3 ml, que contiene cada uno 0,1 ml, 0,2 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 0,75 ml o 1 ml de solucion PrimeStore™; e instrucciones para la recogida y/o el procesamiento de muestras (envasados, p. ej., en 10 viales/unidad). Los viales de recogida pueden tener un tamano superior si resulta necesario, en funcion del metodo de recogida propuesto.

4.3 Definiciones

A efectos del presente, los terminos "aproximado" y "aproximadamente" resultan intercambiables y por lo general se entendera que se refieren a un intervalo de cifras cercano a un numero determinado, asf como a todos los numeros incluidos en el intervalo de cifras citado (por ejemplo, "aproximadamente entre 5 y 15" significa "desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15", a menos que se indique lo contrario. Por otra parte, se entendera que todos los intervalos numericos del presente incluyen todos los numeros enteros incluidos en el intervalo.

A efectos del presente, se entendera que el termino "vehuculo" incluye todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, diluyentes, soluciones tampon, agentes isotonicos, soluciones, suspensiones, coloides, inertes o similares, o una combinacion de estos elementos que resulte farmaceuticamente aceptable para su administracion al animal correspondiente o aceptable a efectos del diagnostico, segun corresponda. El uso de uno o mas vehfculos de administracion para los compuestos qrnmicos en general, y para los peptidos y epitopos en particular, es bien conocido por los expertos en la tecnica farmaceutica. Salvo en la medida en que algun agente o medio convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones de diagnostico, profilacticas y terapeuticas. Tambien se puede incorporar uno o mas ingredientes activos complementarios o administrarse conjuntamente con una o mas de las composiciones inmunogenicas divulgadas.

A efectos del presente, el termino "acido nucleico"incluye uno o mas tipos de: polidesoxirribonucleotidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleotidos (que contienen D-ribosa) y cualquier otro tipo de polinucleotido que sea N-glicosido de una base de purina o pirimidina, o bases de purina o pirimidina modificadas (incluyendo sitios

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abasicos). A efectos del presente, el termino "acido nucleico" tambien incluye poftmeros de ribonucleosidos o desoxirribonucleosidos covalentemente unidos, tipicamente mediante enlaces de fosfodiester entre subunidades, pero en algunos casos mediante fosforotioatos, metilfosfonatos y similares. "Acidos nucleicos" incluyen ADN de cadena simple y doble, asf como ARN de cadena simple y doble. Entre los ejemplos de acidos nucleicos se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, ADNg; ARNhn; ARNm; ARNr; ARN funcional, micro ARN (miARN), ARN pequeno de interferencia (ARNpi), ARN pequeno nucleolar (snORNA); ARN pequeno nuclear (ARNpn); ARN pequeno temporal (ARNpt) y similares, asf como cualquier combinacion de estos elementos.

A efectos del presente, los terminos "protema", "polipeptido" y "peptido" se utilizan de forma intercambiable e incluyen moleculas que comprenden al menos un enlace amida que se une a dos o mas residuos de aminoacidos. A pesar de que se han utilizado de forma intercambiable, por lo general un peptido es una molecula relativamente corta (p. ej., de entre 2 y 100 residuos de aminoacidos de longitud), mientras que una protema o polipeptido es un poftmero relativamente mas largo (p. ej., 100 o mas residuos de longitud). Sin embargo, a menos que se defina espedficamente por la longitud de una cadena, los terminos peptido, polipeptido y protema se emplean de forma intercambiable.

A efectos del presente, "muestra" incluye todo lo que contiene o se presume que contiene una sustancia de interes. Puede ser una composicion de sustancia que contiene acido nucleico, protema u otra molecula de interes. Por tanto, el termino "muestra puede incluir una solucion, celula, tejido o poblacion de uno o mas de estos elementos que contiene una poblacion de acidos nucleicos (ADN genomico, ADNc, ARN, protema, otras moleculas celulares, etc.). A efectos del presente, los terminos "fuente de acido nucleico" y "muestra" se utilizan de forma intercambiable en un sentido amplio y pretenden abarcar diversas fuentes biologicas que contienen acidos nucleicos, protema, una o mas biomoleculas de interes o cualquier combinacion de estos elementos. Entre los ejemplos de muestras biologicas se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, sangre completa, plasma, suero, esputo, orina, heces, leucocitos, eritrocitos, capa leucocitaria, tampones impregnados (incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, bucales, de garganta, vaginales, uretrales, cervicales, rectales, de lesiones, abscesos, nasofarmgeos y similares), orina, heces, esputo, lagrimas, moco, saliva, semen, fluidos vaginales, fluido linfatico, ftquido amniotico, fluido espinal o cerebroespinal, efusiones peritoneales, efusiones pleurales, exudados, punciones, frotis epiteliales, biopsias, muestras de medula espinal, fluido de quistes o abscesos, ftquido sinovial, humor vftreo o acuoso, lavados o aspirados oculares, lavados o aspirados pulmonares, asf como organos y tejidos, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, hftgado, bazo, rinon, pulmon, intestino, cerebro, corazon, musculo, pancreas y similares o cualquier combinacion de estos elementos. En algunas realizaciones, la muestra puede ser o proceder de un organismo que actua como vector, como un mosquito o garrapata, u otro insecto.

A efectos del presente, las celulas de cultivos de tejidos, incluyendo materiales explantados, celulas primarias, ftneas de celulas secundarias y similares, asf como lisados, homogenados, extractos o materiales obtenidos de cualquier celula, se incluyen asimismo en el significado del termino "muestra biologica". Los microorganismos (incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, procariotas como arqueobacterias y eubacterias; cianobacterias; hongos, levaduras, mohos, actinomicetos; espiroquetas y micoplasmas); virus (incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, Orthohepadnavirus [incluyendo, p. ej., virus de la hepatitis A, B y C], papilomavirus humano, Flaviviruses [incluyendo, p. ej., el virus del dengue], Lyssaviruses [incluyendo, p. ej., el virus de la rabia], Morbilliviruses [incluyendo, p. ej., el virus del sarampion], Simplexviruses [incluyendo, p. ej., el virus del herpes simple], Polyomaviruses, Rubulaviruses [incluyendo, p. ej., el virus de las paperas], Rubiviruses [incluyendo, p. ej., el virus de la rubeola], Varicellovirus [incluyendo, p. ej., el virus de la varicela], rotavirus, coronavirus, citomegalovirus, adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, parvovirus, retrovirus, vaccinia, poxvirus, y similares), algas, protozoos, protistas, plantas, briofitas, y similares, asf como cualquier combinacion de cualquiera de los elementos anteriores que pueda estar presente en una muestra biologica se incluyen en el ambito de la invencion, al igual que los materiales obtenidos de entornos cftnicos o forenses que contengan uno o mas acidos nucleicos. Los expertos en la tecnica apreciaran asimismo que los lisados, extractos o materiales obtenidos de cualquiera de los anteriores ejemplos de muestras biologicas se encuentran tambien incluidos en el ambito de la invencion.

A efectos del presente, el termino "solucion tampon" incluye una o mas composiciones, o soluciones acuosas de estas, que resisten la fluctuacion del pH cuando se anade un acido o un alcaft a la solucion o composicion que incluye la solucion tampon. Esta resistencia a un cambio de pH se debe a las propiedades amortiguadoras de estas soluciones y puede ser una funcion de uno o mas compuestos concretos incluidos en la composicion. Por tanto, las soluciones u otras composiciones que presentan actividad amortiguadora se denominan tampones o soluciones tampon. Por lo general, las soluciones tambien no tienen una capacidad ilimitada para mantener el pH de una solucion o composicion; por lo contrario, normalmente son capaces de mantener el pH dentro de ciertos rangos, por ejemplo en un pH de entre 5 y 7.

A efectos del presente, el termino "molecula biologica" se refiere a cualquier molecula que se encuentra en el interior de una celula o producida por un organismo vivo, incluyendo virus. Esto puede incluir, a tftulo meramente enunciativo, acidos nucleicos, protemas, carbohidratos y ftpidos. A efectos del presente, una "celula" se refiere a la unidad estructural mas pequena de un organismo que es capaz de funcionar independientemente y que se compone de citoplasma y diversos organelos rodeados por una membrana celular. Esto puede incluir, a tftulo meramente enunciativo, celulas que funcionan independientemente, como bacterias y protistas, o celulas que viven en el interior de un organismo de mayor tamano, como leucocitos y eritrocitos. Conforme a la definicion del presente, una celula puede no tener un nucleo, como un globulo rojo humano maduro.

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En la practica de la invencion, las muestras se pueden utilizar frescas o tras haber estado almacenadas durante un periodo de tiempo, o durante un periodo de tiempo prolongado, incluyendo, por ejemplo, muestras criopreservadas y similares, y pueden incluir materiales de origen clrnico, veterinario, ambiental o forense; pueden ser aisladas de alimentos, bebidas, materias primas, fuentes de agua potable, corrientes de aguas residuales, residuos o efluentes industriales, fuentes de agua naturales, suelos, fuentes suspendidas, poblaciones pandemicas o epidemicas, muestras epidemiologicas, materiales de investigacion, muestras patologicas, agentes sospechosos de bioterrorismo, pruebas de una escena del crimen y similares.

A efectos del presente, el termino "paciente" (al que tambien se hace referencia de forma intercambiable como "huesped" o "sujeto") se refiere a cualquier huesped que pueda servir como fuente de una o mas de las muestras biologicas que se mencionan en el presente. En determinados aspectos, el donante sera un animal vertebrado, por lo que se pretende referirse a cualquier especie animal (y preferiblemente una especie de mamfero como un ser humano). En determinados aspectos, por "paciente" se entiende cualquier huesped animal, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, primates humanos y no humanos, aves, reptiles, anfibios, bovinos, caninos, caprinos, cavinos, corvinos, epinos, equinos, felinos, hircinos, lapinos, leporinos, lupinos, murinos, ovinos, porcinos, racinos, vulpinos y similares, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, ganado domesticado, rebanos o animales o aves migratorias, especies exoticas o zoologicas, asf como animales de comparfta, mascotas y cualquier animal sometido a cuidado veterinario. Algunos aspectos de la presente divulgacion tambien se pueden utilizar para controlar el brote de enfermedades, su progresion y estadfsticas epidemiologicas para diversas poblaciones globales, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, caquexia en ungulados, tuberculosis, ebola, SARS e influenzas aviares. En determinadas realizaciones, las muestras seran preferiblemente de origen mamfero y mas preferiblemente de origen humano.

A efectos del presente, el termino "caotropo" o "agente caotropico" incluyen sustancias que causan alteraciones en una protema o acido nucleico, por ejemplo, a tftulo meramente enunciativo, alterando la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una protema o un acido nucleico al tiempo que deja intacta la estructura primaria.

A efectos del presente, el termino "p. ej.," se utiliza unicamente a modo de ejemplo, sin fines limitadores, y no se interpretara que se hace referencia unicamente a los elementos enumerados de forma expftcita en la memoria.

A efectos del presente, el termino "sustancialmente libre" o "esencialmente libre" significa tfpicamente que una composicion contiene menos del 10% en peso, preferiblemente menos del 5% en peso y mas preferiblemente menos del 1% en peso de un compuesto. En una realizacion preferible, estos terminos se refieren a menos de aproximadamente un 0,5% en peso, mas preferiblemente menos de un 0,1% en peso o incluso menos de un 0,01% en peso. Los terminos abarcan asimismo una composicion completamente libre de un compuesto u otra propiedad senalada. Con respecto a la degradacion o el deterioro, el termino "sustancial" tambien puede referirse a los porcentajes en peso anteriormente senalados, de forma que prevenir una degradacion sustancial se referina a una perdida por degradacion inferior al 15% en peso, inferior al 10% en peso, preferiblemente inferior al 5% en peso, etc. En otras realizaciones, estos terminos se refieren a meros porcentajes y no a porcentajes en peso, por ejemplo con respecto al termino "sustancialmente no patogenico", donde el termino "sustancialmente" se refiere a que deja menos de un 10%, menos de un 5%, etc., de la actividad patogenica.

De acuerdo con las convenciones del Derecho de patentes tradicionales, los terminos "un" y "una" cuando se utilizan en la presente solicitud, incluyendo las reivindicaciones, significan "uno/una o mas".

5. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones ilustrativas de la invencion. Los expertos en la tecnica apreciaran que las tecnicas divulgadas en los siguientes ejemplos representan tecnicas descubiertas para funcionar bien en la practica de la invencion y, por tanto, se consideraran que constituyen modos preferibles para esta practica.

5.1 EJEMPLO 1 - FORMULACION DE EJEMPLOS DE SOLUCIONES DE ALMACENAMIENTO

El presente ejemplo proporciona una formulacion general de las composiciones PrimeStore™ (PanFlu) de la presente invencion. Los ejemplos de formulaciones se detallan asimismo en los Ejemplos 2-5.

Materiales

Tiocianato de guanidina, citrato de sodio, Antifoam A® Concentrate, y N-laurilsarcosina, sal de sodio, todo ello adquirido en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Tris(2-carboxieti)fosfina hidrocloruro (TCEP) adquirido en Soltec Ventures Inc. (Beverly, MA, USA). 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (TRIS) adquirido en Applied Biosystems/Ambion (Austin, Tx, USA), acido 2-[2-(Bis(carboximetil)amino)etil-(carboximetil)amino]acetico (EDTA) GIBCo® Ultra Pure adquirido en Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA). Todos los demas reactivos son comercializados por Sigma-Aldrich o USB Corporation.

TABLA 1

RANGOS DE FORMULACION DE EJEMPLOS DE COMPONENTES PARA LA PREPARACION DE COMPOSICIONES PRIMESTORE™

Reactivo

Rangos de concentracion finales del componente

1. Un caotropo, p. ej.,

Tiocianato de guanidina o Hidrocloruro de guanidina

o Isocianato de guanidina

2. Un detergente anionico, p. ej.:

N-lauril sarcosina {entre otros sal de sodio)

o Dodecil sulfato sodico,

Dodecil sulfato de litio,

Glicocolato sodico,

Desoxicolato sodico,

Taurodesoxicolato sodico, o Colato sodico

3. Un agente reductor, p. ej.:

TCEP

o p-ME, DTT, formamida, o DMSO

4. Un agente quelante, p. ej.:

Citrato de sodio

o EDTA, EGTA, HEDTA, DTP A, NTA, o APC A

5. Una solucion tampon (p. ej., TRIS, HEPES, MOPS, MES, Bis-Tris, etc.)

6. Un acido (p. ej., HC1 o acido cftrico)

7. Agua libre de nucleasa

Opcionalmente uno o mas de los elementos siguientes:

8. Un agente tensoactivo/antiespumante, p. ej.: Antifoam A® o Tween®

9. Un alcanol (p. ej., metanol, etanol, propanol, etc.)

10. ARN o ADN

entre aprox. 0,5 M y 6 M entre aprox. 0,5 M y 6 M

entre aprox. 0,5 M y 6 M

entre aprox. 0,15% y 1% (peso/vol.)

Igual

Igual

Igual

Igual

Igual

entre aprox. 0,1% y 1% (peso/vol.)

entre aprox. 0,5 mM y 30 mM entre aprox. 0,05 M y 0,3 M

entre aprox. 0,5 mM y 50 mM entre aprox. 0,01 mM y 1 mM

entre aprox. 1 mM y 1 M

q.s. hasta ajustar a un pH de aprox. 6 a 7,

preferiblemente de 6.4 a 6.8.

q.s. hasta el volumen final deseado

entre aprox. 0,0001 % y 0,3% (peso/vol.) entre aprox. 1% y 25% (vol./vol.) entre aprox. 1 pg y 1 pg/mL

5.2 EJEMPLO 2 - FORMULACION DE UN EJEMPLO DE SOLUCION DE ALMACENAMIENTO

El presente ejemplo describe un primer ejemplo de formulacion de las composiciones de la invencion. Esta 5 formulacion tambien ha sido denominada alternativamente por los inventores "PrimeStore™ Solution" o "PSS" version 1.

TABLA 2

PREPARAClON DE LA COMPOSIClON PRIMESTORE™ (VER. 1)

Reactivo

Concentracion final

Tiocianato de guanidina Citrato de sodio Dodecil sulfato sodico 7V-lauril sarcosina, sal de sodio

4 M 30 mM

0,25% (peso/vol.) 0,25% (peso/vol.)

2-mercaptoetanol (P-ME) Antifoam A Acido citrico Agua libre de nucleasa

0,1 M

0,1% (peso/vol.)

q.s. para ajustar a un pH de 6.5

11,82 mL

5.3 EJEMPLO 3 - PREPARACION DE UN SEGUNDO EJEMPLO DE SOLUCION DE ALMACENAMIENTO

5 El presente ejemplo describe la preparacion de otro ejemplo de solucion de almacenamiento de la presente invencion. Esta formulacion tambien ha sido denominada alternativamente por los inventores PrimeStore™ version 2.

TABLA 3

10 PREPARACION DE LA COMPOSIClON PRIMESTORE™ (VER. 2)

Reactivo

Cantidad

Concentracion final

Tiocianato de guanidina

35,488 gm 3M

TCEP

0,02867 gm 1 mM

Citrato de sodio

0,2931 gm 10 mM

7V-lauril sarcosina, sal de sodio (NLS)

0,5 gm 0,5%

Antifoam A (solucion al 10%)

200 jL 0,002%

TRIS (1 M)

10 mL 100 mM

EDTA (0,5 M)

20 jL 0,1 mM

Acido hidroclorico (HO)

q.s. para ajustar a un pH de 6.7 --

Agua libre de nucleasa

q.s. hasta 100 mL --

5.4 EJEMPLO 4 - PREPARACION DE UN TERCER EJEMPLO DE SOLUCION DE ALMACENAMIENTO

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El presente ejemplo describe la preparacion de otro ejemplo de solucion de almacenamiento de la presente invencion. Esta formulacion tambien ha sido denominada alternativamente por los inventores PrimeStore™ version

2.2.

Tabla 4

Preparacion de la composicion PrimeStore™ (ver. 2.2)

Reactivo

Cantidad

Concentracion final

Tiocianato de guanidina TCEP

Citrato de sodio

N-lauril sarcosina, sal de sodio (NLS) Antifoam A (solucion al 10%)

TRIS (1 M)

EDTA (0,5 M)

Etanol, grado molecular (96-100%) Acido hidroclorico (HC1)

35,488 gm 0,02867 gm 0,2931 gm 0,5 gm 200 |jL 10 mL 20 jL 23 mL

q.s. para ajustar a un 6.7

3M 1 mM 10 mM 0,5%

0,002%

100 mM 0,1 mM 23% (vol./vol.) pH de --

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50

Agua libre de nucleasa q.s. hasta 100 mL

Ejemplo de protocolo para la preparacion de PrimeStore™ Solution (ver. 2.2)

1. Anadir 40 ml de agua libre de nucleasa en una probeta limpia con una barra de agitar.

2. Colocar la probeta en una placa caliente/agitador y ajustar la temperatura a 60-65 ° C. Ajustar la velocidad de agitacion en el nivel medio.

3. Anadir 35,488 gm de tiocianato de guanidina lentamente al agua dejando que se disuelva.

4. Anadir 0,0287 gm de TCEP a la probeta e incrementar la velocidad de agitacion para ayudar a disolver los cristales.

5. Anadir 0,2931 gm de citrato de sodio a la probeta.

6. Anadir 0,5 gm de NLS a la solucion. Aumentar la velocidad de agitacion para crear un remolino en la probeta. Esto incorporara el NLS a la solucion y ayudara a disolver el reactivo.

7. Agitar una solucion preparada Antifoam A al 10% (1 ml Antifoam A Concentrate + 9 ml agua libre de nucleasa). Pipetear 200 pl de la solucion Antifoam A al 10% en la solucion.

8. Pipetear 10 ml de 1 M TRIS en la solucion.

9. Pipetear 20 pl de 0,5 M EDTA en la solucion.

10. Incrementar la temperatura para llevar la solucion a 75-80 °C y agitar durante 3-5 minutos.

11. Retirar la probeta del calor y dejar que la solucion se enfne hasta la temperatura ambiente (22-25 °C).

12. Anadir 23 ml de etanol a la solucion y mezclar bien.

13. Ajustar el pH a 6.7 con HC1.

14. Verter la solucion en un tubo cilmdrico graduado y limpio de 100 ml.

15. Anadir agua libre de nucleasa hasta alcanzar un volumen de 100 ml.

16. Transferir la solucion a un contenedor esteril etiquetado. Almacenar a temperatura ambiente (22-25 °C). *Nota: Preferiblemente, comprobar que cada uno de los reactivos esta completamente disuelto antes de anadir el siguiente.

5.5 EJEMPLO 5 - COMPARACION DE SOLUCIONES PRIMESTORE™ CON FORMULACIONES

CONVENCIONALES

Una muestra de tejido nasal homogeneizado de una rata algodonera (Sigmodon hispidus) a la que se le habfa administrado el virus influenza A (H3N2) o una muestra de un virus clmico de influenza A humana (H1N1) recogido por lavado nasal clmico humano durante la temporada 2006-07 se introdujo en PrimeStore™ Solution (Ver. 1) y se sometio a ensayo en comparacion con la formulacion y el protocolo de lisis correspondientes, y con el procedimiento de extraccion de tres kits disponibles en el mercado: RNAqueous®-Micro (Ambion, Austin, tX, USA), QIAamp Viral RNA Mini Kit (Catalogue #52904, Qiagen, Valencia, CA, uSa), y MagMax AI/ND Viral RNA Isolation Kit (Catalogue #AM1929, Ambion). La eficiencia de la extraccion se evaluo utilizando el sistema de deteccion de secuencias ABI 7500 con el metodo del umbral del ciclo (CT) comparativo (vease la FIG. 2). En la FIG. 2, "delta Rn" representa la senal del reporter fluorescente menos una cantidad de partida. Tal y como se muestra en la FIG. 1 y la FIG. 2, los resultados relativos del CT y las copias virales detectadas fueron optimos cuando se uso la formulacion de fijacion en lugar de la solucion tampon de lisis convencional correspondiente de cada uno de los kits comerciales. En estos dos tipos de muestras, las composiciones de la invencion funcionaron mejor que los dos kits convencionales a efectos de la extraccion. La composicion PrimeStore™ Solution (ver. 1) tambien demostro una buena compatibilidad con los kits de extraccion de acido nucleico disponibles en el mercado. La FIG. 1 ilustra los resultados de extraccion de ARN cuando se utilizo la version 1 de PrimeStore™ Solution conjuntamente con tres kits disponibles en el mercado: Qiagen Viral Mini, Ambion RNAqueous Mini, y Ambion Al/NCD MagMax. Tal y como se muestra en la FIG. 1, cuando se sustituyo la solucion tampon de lisis del kit de extraccion por la formulacion de fijacion (denominada en la figura "One-Step+"), se consiguio una extraccion superior de acido nucleico en comparacion con la extraccion realizada utilizando los kits de acuerdo con el protocolo estandar (denominado en la figura "One-Step-". La eficiencia de la extraccion se midio mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) de transcripcion inversa (RT) en tiempo real (r) [rRT-PCR].

La FIG. 3 muestra la preservacion de ARN desnudo en PrimeStore™ Solution en comparacion con la preservacion en una solucion anterior, utilizando agua como control. Tal y como se muestra en la FIG. 3, la deteccion (por fluorescencia) se produjo en el ciclo de amplificacion mas temprano en el caso del ARN guardado en PrimeStore™ Solution (ver. 1) en todos los puntos temporales sometidos a ensayo.

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5.6 EJEMPLO 6 - SOLUCION PRIMESTORE™ PARA LA RECOGIDA DE MUESTRAS DE LAVADO NASAL

Se realizo un estudio de deteccion clmico prospectivo utilizando muestras de lavado nasal de: 1) pacientes pediatricos sintomaticos, y 2) miembros de la familia sintomaticos o asintomaticos. Deteccion del virus influenza comparando muestras de lavado nasal recogidas en PrimeStore™ Solution y Viral Transport Medium (VTM) mediante RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR) y cultivo tradicional, respectivamente. La caracterizacion genetica de los genes del virus influenza que codifican hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) y protemas de superficie de la matriz (MA) se realizo utilizando muestras seleccionadas de lavado nasal preservadas en PrimeStore™ Solution para evaluar la efectividad de la vacuna y la sensibilidad al farmaco dentro de las cepas virales.

El virus influenza es un virus respiratorio basado en el ARN altamente mutante de forma sustancial y es responsable de mas de 200 000 hospitalizaciones y unas 36 000 muertes cada ano en los Estados Unidos. La aparicion generalizada de variantes mutadas de influenza entre los virus humanos que circulan actualmente provoco un cambio de los tres componentes de la vacuna para la siguiente temporada 2008/2009. El incremento de la morbilidad y mortalidad durante la temporada 2007/2008 incluyo 72 muertes pediatricas asociadas con influenza y resistencia sostenida a los farmacos (oseltamivir [TamiFlu®, Roche Laboratories, Inc., Nutley, NJ, USA] y adamantadina) entre las cepas en circulacion.

5.6.1 Materiales y metodos

Un total de 100 pacientes pediatricos (mdice) que cumplfan los criterios de caso clmico de infeccion por influenza y 126 contactos familiares participaron en el estudio. Los lavados nasales se introdujeron en PrimeStore™ Solution y Universal Viral Transport Medium (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) y se analizaron mediante rRT-PCR o analisis de cultivo, respectivamente. La rRT-PCR se realizo utilizando sondas/cebadores espedficos para influenza tipo (A o B) y subtipo (H3, H1, H5) segun Daum et al. (2007). Se realizo otra caracterizacion genetica de muestras clmicas seleccionadas preservadas en PrimeStore™ Solution utilizando RT-PCR estandar y secuenciacion de nucleotidos directa de las protemas virales MA, NA y hemaglutinina (HA).

5.6.2 Resultados

Del total de muestras evaluadas (N = 226; mdice 100, 126 contactos familiares), 66 (29%) dieron positivo en el virus influenza (45 H3N2, 2 H1N1 y 19 B) por rRT-PCR. La rRT-PCR de lavados nasales preservados en PrimeStore™ Solution detecto virus influenza en 11 (9 gripe A y 2 gripe B) que no habfan sido detectados en el cultivo (Tabla 5 y Tabla 6). De estas 11 muestras, cinco procedfan de pacientes participates como contactos familiares.

El analisis filogenetico de los genes de HA del virus influenza A y B mostraron una mutacion en comparacion con las cepas de la vacuna de 2007/2008 y revelaron una homologfa genetica superior con las cepas de la vacuna Brisbane de 2008/2009. Se observaron algunas diferencias geneticas en los virus entre los miembros de las familias, particularmente entre las cepas de influenza A (H3N2). Los analisis MA revelaron una resistencia al adamantano en todas las cepas de la influenza A H3N2, y sensibilidad en los dos virus H1N1. Todas las cepas de la influenza B (n = 18) eran sensibles a los farmacos inhibidores de la neuraminidasa zanamivir (Relenza® GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC, USA) y oseltamivir (Tamiflu® Roche) basados en la presencia de acido aspartico (D) en el aminoacido 197 (numeracion de influenza B) del gen de NA.

Rt-pcr en tiempo real frente al cultivo

La rRT-PCR es superior al cultivo tradicional para la deteccion del virus influenza de las muestras de lavado nasal originales preservadas en soluciones PrimeStore™: la influenza se detecto en el plazo de dos horas (c.f. 2 a 7 dfas en los metodos de cultivo convencionales); y los analisis fueron mas sensibles (11 muestras; 9 gripe A y 2 gripe B detectados por debajo de los lfmites del cultivo). Por otra parte, el uso de metodos de diagnostico molecular en lugar del cultivo de organismos convencional no propago virus potencialmente infecciosos y, al mismo tiempo, proporciono el tipo y subtipo de virus influenza.

Analisis genetico

Conexion con la vacuna

Cepas H3N2: El analisis del gen HA1 de la hemaglutinina (HA) de influenza A revelo una mutacion genetica que inclma diferencias en cinco aminoacidos en todas las cepas Texas, en comparacion con la cepa de la vacuna 200708 A/Wisconsin/67/2005. Una mutacion de HA1 observada en todas las cepas Texas (D122N) es un potencial punto de glicosilacion. Todas las cepas A/Texas (H3N2) mostraron una homologfa de HA superior (99,0-99,7%) en comparacion con la cepa recien seleccionada 2008-09 A/Brisbane/10/2007.

Cepas H1N1: El gen HA1 de hemaglutinina de 2 influenza A (H1N1) presentaba cambios en siete aminoacidos en comparacion con la cepa de la vacuna A/Solomon Island/3/2006. Cuatro sustituciones (R90K, T145V, K210T y E290K) se encontraban dentro de puntos de combinacion de anticuerpos HI conocidos. Las dos cepas Texas H1N1 mostraron una mayor homologfa de HA (98,8% y 99,4%) en comparacion con la cepa de la vacuna recien seleccionada 2008-09 A/Brisbane/59/2007.

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Cepas de la influenza B: El analisis de los genes HA1 de la hemaglutinina y neuraminidasa revelo que todas las cepas Texas proced^an de la lmea B/Yamagata y manteman una mayor homolog^a genetica con la cepa de la vacuna 2008-09 B/Brisbane/5/2007 que con la cepa de la vacuna 2007/08 B/Malaysia/2506/2004.

Mutacion en familiares

Los cambios en los aminoacidos se observaron en NA, HA1, Ml y M2e entre los miembros de la familia. El HA1 de la hemaglutinina demostro el mayor grado de mutacion de los genes del virus influenza analizados, con un familiar que presentaba cinco cambios en los aminoacidos.

El analisis de la bomba de protones de la superficie viral M2e del aminoacido 24 demostro algunas variaciones dentro de las familias. La cepa de un paciente del mdice contema tres sustituciones unicas de M2e en el aminoacido que eran "tipo salvaje" dentro de las cepas de los miembros de la familia.

Susceptibilidad antiviral

Adamantano: El analisis genetico del gen de la matriz (MA), concretamente una sustitucion de serina por asparagina en la posicion 31 (S3 IN), revelo resistencia al adamantano en todas las cepas de influenza A (H3N2), pero sensibilidad en los dos virus influenza A (H1N1).

Inhibidores de la neuraminidasa: Todos los aislados Texas influenza A (H3N2) demostraron ser sensibles al oseltamivir a traves del analisis genetico de las sustituciones El 19V, R292K, y N294S en el gen NA. El analisis genetico del gen NA de influenza B revelo que todas las cepas Texas conteman un residuo de acido aspartico (D) en la posicion 197 y que, por tanto, son sensibles al oseltamivir.

Los protocolos y ensayos del presente se pueden adaptar para otros microbios como la tuberculosis, la malaria, el estafilococo y similares, asf como para otros patogenos que impliquen la necesidad de conocer rapidamente la susceptibilidad antimicrobiana.

5.7 EJEMPLO 7 - RECOGIDA DE MUESTRAS DE INFLUENZA UTILIZANDO LA SOLUCION PRIMESTORE™

Las composiciones de la presente invencion preven la recogida de una unica muestra, transporte y el reactivo de almacenamiento para facilitar: 1) la obtencion de acidos nucleicos de alta calidad procedentes de muestras clmicas o ambientales; 2) la inactivacion de patogenos potencialmente infecciosos para la manipulacion y transporte seguro de las muestras; y 3) la estabilizacion y preservacion del ARN/ADN "desnudo" liberado, impidiendo la hidrolisis/degradacion de la nucleasa durante periodos prolongados y a temperaturas ambiente. Los resultados de estos estudios se presentan en el siguiente ejemplo:

TABLA 5

Deteccion del tipo de influenza: rRT-PCR frente al cultivo

Influenza A Influenza B

Muestras totales gripe B (n=47) Pacientes del mdice (28) Contactos familiares (19)

rRt-PCR(N=47) (N=40) 28/28 (100%) (82%) 19/19 15/19(79%) Cultivo 23/28 (100%) rRt-PCR(N=19) Cultivo (N=17) 16/16 (100%) 14/16 (88%) 3/3 (100%) 3/3 (100%) Muestras totales gripe B (n=19) Pacientes del mdice (16) Contactos familiares (3)

TABLA 6

Deteccion de influenza positiva: rRT-PCR frente al cultivo

Muestras totales (N=226) Positivo en gripe

rRT-PCR (N Cultivo (N=66)

(N=66)

=66)

Pacientes del mdice (100) 44/100

39/39 (100%) 27/27 (100%)

Contactos familiares (126) 22/126

18/27 (67%) 37/39 (94%)

Este ejemplo ilustra la efectividad de PrimeStore™ Solution (ver. 2.2) en la eliminacion de un microbio(s) patogenico.

5.7.1 Metodos

Se utilizo la RT-PCR en tiempo real para someter a ensayo el acido nucleico del virus influenza A (H5N1) preservado en PrimeStore™ Solution. Se realizo un estudio de la evolucion a temperatura ambiente para evaluar la integridad de las muestras clmicas, muestras de cloaca, y se almaceno y extrajo una plantilla de ARN del virus

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influenza A (H5) aviar clonado de PrimeStore™ Solution, Viral Transport Media, RNA Storage Solution, o agua libre de nucleasa. Se comparo la eficiencia de extraccion de PrimeStore™ Solution con tres kits de extraccion de acido nucleico disponibles en el mercado. Por otra parte, se evaluo la capacidad del ARN contenido en PrimeStore™ Solution para resistir la degradacion de la nucleasa.

5.7.2 Resultados

PrimeStore™ Solution (version 2, pero sin etanol) inactivo agentes microbianos, al tiempo que preservo el ARN/ADN liberado frente al material clmico, es decir, los lavados nasales, los tampones impregnados o las muestras ambientales. Las muestras clmicas o ambientales introducidas en esta solucion se estabilizaron a temperatura ambiente durante un maximo de 30 dfas, mientras que en los demas medios de transporte se produjo una degradacion de los acidos nucleicos. PrimeStore™ Solution es compatible con los kits de aislamiento de ARN disponibles en el mercado y produjo una mayor produccion de acido nucleico.

5.8 EJEMPLO 8 - ELIMINACION DE MRSA (ATCC33592) EN PRIMESTORE™ SOLUTION

Este ejemplo ilustra la efectividad de PrimeStore™ Solution (ver. 2.2) en la eliminacion de un potencial contaminante bacteriano. La cepa de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) ATCC33592 se diluyo 10 veces y 1000 veces en PrimeStore™ Solution (Ver. 2.2) y se cuantifico (vease la FIG. 6).

5.8.1 Protocolo experimental

DfA PROCEDIMIENTO

0 Transferencia de MRSA (ATCC33592) de Culti-loop® (Remel) a 1,5 ml de TSB en un tubo de ensayo conico de 15 ml. Incubacion a 37 °C durante unos 15 minutos. Suspension con agitacion suave y transferencia de 100 pL a una placa de agar sangre. Incubacion de la placa hasta el dfa siguiente a 37 °C.

1 Observacion de un crecimiento notable y uniforme de una colonia tras 12 horas de incubacion. Transferencia de -10% de las colonias a 300 ml de caldo de hidrolizado de casema de soja (TSB) en un matraz esteril de un litro. Colocacion del matraz en un agitador a 37 °C y 200 rpm.

Tras unas 4-6 horas de incubacion, transferencia de unos 50 ml de suspension bacteriana a un nuevo matraz de un litro que contema 300 ml de TSB fresco.

Tras unas 4-6 horas de incubacion, transferencia de -100 pL de cultivo a 900 pL de TSB (dilucion de control 1:10). De esta suspension se transfirieron 10 pL a 990 pL de TSB (dilucion de control 1:1000).

Transferencia de 100 pL de cultivo a 900 pL de PrimeStore™ Solution (dilucion PrimeStore™ 1:10). De esta suspension se transfirieron 10 pL a 990 pL de TSB (dilucion PrimeStore™ 1:1000).

Inmediatamente despues de la transferencia a TSB o PrimeStore™ Solution (ver. 2.2), las suspensiones se agitaron suavemente y se pusieron 100 pL en placas de ambas diluciones de control y suspensiones de PrimeStore™ en placas de agar sangre. El punto temporal cero fue en realidad unos dos minutos despues de la adicion de las bacterias al TSB o PrimeStore™ Solution.

Las suspensiones en TSB y PrimeStore™ Solution (ver. 2.2) se mantuvieron a temperatura ambiente.

Otros 100 pL se colocaron en placas de agar sangre a los 5, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos de la preparacion de las suspensiones en TSB y PrimeStore™ Solution.

Se dejaron secar las suspensiones bacterianas sobre las placas, se invirtieron las placas y se incubaron hasta el dfa siguiente a 37 °C.

Tambien se realizo una titulacion del cultivo del agitador mezclando 100 pL de la suspension del cultivo del agitador con 900 pL de TSB (dilucion 10_1). Se prepararon diluciones en serie por 10 veces hasta 10-9. Se colocaron muestras de 100 pL en placas de agar sangre de todas las diluciones salvo 10-1.

2 Se observaron las placas para detectar colonias bacterianas. Todas las placas se almacenaron a 4 °C para su posterior observacion, en caso necesario.

5.8.2 Resultados

Los resultados se presentan en la Tabla 7 y la Tabla 8. En resumen, la suspension bacteriana contema aproximadamente 4,7 x 109 cfu/ml. Por tanto, la dilucion 1:10 contema aproximadamente 4,7 x 108 cfu/ml y la dilucion 1:1000 contema 4,7 x 106 cfu/ml. En todos los puntos temporales, las bacterias suspendidas en TSB eran demasiado numerosas para un recuento. En todos los puntos temporales, las bacterias suspendidas en PrimeStore™ Solution y colocadas en placas de agar sangre no presentaban colonias detectables.

TABLA 7

ELIMINACION DE MRSA (ATCC 33592) POR PRIMESTORE™ SOLUTION (VER. 2.2)

5

10

15

20

25

Tiempo de incubacion (Minutos)

En TSB 1:10 1:1000 EIn Primestore 1:10 1:1000

0

tntc tntc 0 0

5

tntc tntc 0 0

15

tntc tntc 0 0

30

tntc tntc 0 0

60

tntc tntc 0 0

120

tntc tntc 0 0

240

tntc tntc 0 0

TNTC = demasiado numeroso para el recuento.

TABLA 8

TITULACION DE MRSA ATCC33592 DEL CULTIVO DE SUSPENSION

Dilucion

CFU/placa CFU/ml

1.E+01

TNTC

1.E+02

TNTC

1.E+03

TNTC

1.E+04

TNTC

1.E+05

TNTC

1.E+06

TNTC

1.E+07

35 3,5X10a9

1.E+08

6 6X10a9

1.E+09

0

NOTA: Los calculos de CFU/ml estan corregidos para incluir el volumen de las placas de 0,1 mls Conc. final: 4,7X10A9/ml

TNTC = demasiado numeroso para el recuento.

CFU = unidades de formacion de colonias.

Se realizo un estudio adicional para determinar el tiempo de exposicion necesario para eliminar MRSA ATCC33592 cuando se diluye 10 veces en PrimeStore™ Solution (Ver. 2.2), asf como para establecer el efecto de dilucion de las bacterias tras la exposicion a PrimeStore™ Solution, pero antes de pasar a las placas.

5.8.3 Protocolo experimental

DfA PROCEDIMIENTO

0 Transferencia de MRSA (ATCC33592) de la placa TNTC del estudio anteriormente descrito a 4 ml de TSB.

Estas placas se habfan almacenado a 4 °C durante aproximadamente 48 horas. Las bacterias se agitaron suavemente y se dejaron a temperatura ambiente unos 10 minutos, antes de su utilizacion.

Se transfirieron 0,1 ml de suspension bacteriana a 0,9 ml de PrimeStore™ Solution y se agitaron suavemente. Transcurridos unos 60 segundos, las bacterias de PrimeStore™ se agitaron de nuevo con suavidad y se transfirieron 0,1 ml de suspension bacteriana a 0,3 ml de TSB (dilucion 1:4).

Se pusieron en placas de agar sangre (5% de eritrocitos de oveja en TSA) 100 pL de bacterias en PrimeStore™ Solution (designadas "limpias") y de la dilucion 1:4 en TSB.

Este proceso se repitio a los 5 y a los 15 minutos y, posteriormente, de nuevo con las diluciones realizadas en TSB en lugar de PrimeStore™ Solution.

Las suspensiones bacterianas lfquidas de las placas de agar sangre se dejaron secar a temperatura ambiente y, a continuacion, se incubaron hasta el dfa siguiente a 37 °C.

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35

40

45

1 Tras unas 16 horas de incubacion, las placas se retiraron de la incubadora y se realizo un recuento de las

colonias.

5.8.4 Resultados

La suspension bacteriana contema un numero desconocido de unidades de formacion de colonias (cfu) por ml. En todos los puntos temporales, las bacterias suspendidas en caldo de soja triple (TSB) eran demasiado numerosas para un recuento (TNTC). En todos los puntos temporales, las bacterias suspendidas en las composiciones PrimeStore™ y colocadas en placas de agar sangre no produjeron colonias (Tabla 9).

Tiempo de incubacion (minutos)

En TSB limpio 1:4 En TSB limpio 1:4

1

TNTC TNTC 0 0

5

TNTC TNTC 0 0

15

TNTC TNTC 0 0

TNTC = demasiado numeroso para el recuento.

5.9 EJEMPLO 9 - ESTUDIOS ADICIONALES DE EVALUACION DE LAS SOLUCIONES PRIMESTORE™

Los datos de la FIG. 7B ilustran la capacidad de PSS para inactivar microbios. Se muestra un estudio en el que se recogieron muestras de cloaca de gallina en PrimeStore™ Solution (Ver. 1). PrimeStore™ Solution inactivo los agentes microbianos en < una hora. Se sumergieron cuatro muestras de cloaca de gallina originales en PrimeStore™ Solution o agua y posteriormente se colocaron en placas de agar sangre. Estos resultados demostraron que la composicion divulgada podfa eliminar o inactivar rapidamente los microorganismos de la muestra.

Los datos de la FIG. 7B demuestran la capacidad de PSS para inhibir la hidrolisis de la base de ARN durante 30 dfas a temperatura ambiente. El ARN se incubo a temperatura ambiente (22-26 °C) en PrimeStore™ (barras de gel 1 y 3) y agua (barras de gel 2 y 4), y posteriormente se amplifico mediante RT-PCR (1500 pares de bases) en los Dfas 0 y 30. PrimeStore™ preservo el ARN recogido y evito la degradacion de ARN/ADN a temperatura ambiente hasta 30 dfas (vease tambien, p. ej., la Tabla 11).

5.9.1 Ensayo de inhibicion de la gripe

Los reactivos de este ensayo incluyen un medio de tripsina:

145 mL de N/C EMEM esteril 3 ml de caldo 7.5% Na Bicarbonato (2%)

1.5mLSPG (l%)

75 |jL de tripsina (0,05%)

1.5 ml de Fungizone (1%)

150 jl de gentamicina Medio de filtrado Cristal violeta:

150 ml de dialdehido glutarico 2 gm de cristal violeta 2850 ml de agua desionizada

Protocolos

Preparacion de muestras de suero para el ensayo

Descongelar y agitar las muestras de suero. Para cada muestra, etiquetar la tapa del correspondiente tubo Spin-X. Combinar 450 u de EMEM no completo con 50 jL de suero en un tubo Spin-X. Calentar los tubos que contienen los sueros y EMEM en un bano de agua durante 30 minutos. Centrifugar los tubos a 8000 rpm durante dos minutos a temperatura ambiente. Etiquetar y colocar las muestras en un congelador a -20 °C hasta el ensayo.

Placas de dilucion

Cargar 160 jL de cada componente limpio o muestra de suero en los pocillos Al a A12. Cargar los pocillos restantes con 120 jL con tripsina. Utilizando una pipeta multicanal, extraer 40 jL de la muestra limpia de la fila A y diluir en los correspondientes pocillos de la fila B. Repetir la dilucion para cada una de las filas, mezclando el pocillo despues de

5

10

15

20

25

30

35

cada transferencia. En la fila H, despues de mezclar la transferencia de la fila G, extraer 40 pL de cada pocillo y desechar. Obtener caldo de virus (106) del congelador a -80 °C y descongelar. Diluir el caldo de virus en medio de tripsina a una dilucion de 103 Tras completar las diluciones en serie, transferir 120 pL de virus influenza (104 TCID50 por ml) a todos los pocillos de la placa de dilucion. Esto da como resultado un total de 240 pL en todos los pocillos. Incubar la placa o placas de dilucion a temperatura ambiente durante una hora.

Placas de celulas MDCK

Esterilizar y colocar el deposito de vidrio, el dispensador de peine y los tubos que se encuentran en el interior de la campana de humos. En el interior de la campana, conectar los tubos al deposito y llenar la boquilla del peine. Conectar el tubo del aspirador a la boquilla de vado del peine. Colocar el deposito en una superficie elevada y encender el aspirador. Colocar PBS en el deposito (se puede necesitar un litro o mas en funcion del numero de placas). Lavar las placas de las celulas tres veces con el peine de PBS (aspirar el medio, a continuacion presionar el boton durante aproximadamente un segundo para lavar los pocillos y repetir en dos ocasiones). Utilizando una pipeta multicanal, transferir 50 pL de cada pocillo de la columna 1 de la placa de dilucion a las columnas 1 a 4 de la placa de las celulas. Transferir 50 pL de cada pocillo de la columna 2 de la placa de dilucion a las columnas 5 a 8 de la placa de las celulas. Transferir 50 pL de cada pocillo de la columna 3 a las columnas 9 a 12 de la placa de las celulas. Repetir la transferencia a otras placas de celulas para las muestras restantes. Incubar las placas de celulas durante una hora a 37 °C. Tras el periodo de incubacion, anadir 50 pl de medio de tripsina a todos los pocillos de las placas de las celulas. Devolver las placas a la camara de incubacion e incubar durante cuatro dfas contados a partir de la post-infeccion.

Tincion

Anadir 100 pL de cristal violeta a todos los pocillos. Dejar asentar durante una hora. Enjuagar las placas en agua corriente fna y secar al aire.

TABLA 10

TITULACION DE TCEP UTILIZANDO VIRUS INFLUENZA A COMPLETO

5mM

10 mM 25 mM 35 mM 50 mM

30,353 30,2261 30,28955 0,089732

24,58 22,74 23,66 1,301076 24,52 24,26 24,39 0,183848 24,14 22,74 23,44 0,989949 25,9582 26,0337 25,99595 0,053387

Titulacion de TCEP utilizando ARN monocatenario aviar H5

5 mM

10 mM 25 mM 35 mM 50 mM

27,2

25,25 25,63 27,3 28,3039

26,73

24,89 25,36 27,62 26,6854

26,965

25,07 25,495 27,46 27,49465

0,33234

0,254558 0,190919 0,226274 1,144452

5.9.2 Estudio de la evolucion de la estabilidad a largo plazo de las composiciones PrimeStore

Los siguientes datos demuestran la efectividad de las diversas composiciones PrimeStore para preservar la integridad del acido nucleico en un periodo de treinta dfas con las muestras almacenadas a temperatura ambiente. Las composiciones PrimeStore se han comparado con agua sola, etanol solo, soluciones tampon comercializadas como VTM y AVL.

Tabla 11

ESTUDIO DE COMPARACION DE LA EVOLUCION DE DIVERSAS COMPOSICIONES EN UN PERIODO DE 30

dJas

Dfa 1

VTM

Agua EtOH AVL PS-V1 (ano) PS-V1 (nuevo lote) PS-V2 PS-V2.2 (w/EtOH)

VTM

Agua EtOH AVL PS-VI (ano) PS-Vl (nuevo lote) PS-V2 PS-V2.2 (w/EtOH)

27,0225

26.1403 18,4463 24,2698 24,2607 23,9524 23,4426 20,2102

24,42

25,6044 18,3206 24,4789 24,3716 23,9615 23,7387 20,063

25,72125

25,87235 18,4463 24,37435 24,31615 23,95695 23,59065 20,1366

1,840245

0,378939 0,088883 0,147856 0,0784181 0,006435 0,209374 0,10408612

AVG

STDEV

D^a 6

VTM

Agua EtOH AVL PS-V1 (ano) PS-V1 (Nuevo lote) PS-V2 PS-V2.2 (w/EtOH)

29,1988

29,3053 27,4058 37,9226 27,2379 27,165 24,53 22,4887

28,6799

28,7916 27,0781 40 26,4857 26,7658 24,4418 22,4676

28,93935

29,04845 27,24195 38,9613 26,8618 26,9654 24,4859 22,47815

0,366918

0,363241 0,231719 1,468944 0,5318857 0,282277 0,062367 0,01491995

AVG

STDEV

D^a 12

VTM

Agua EtOH AVL PS-V1 (ano) PS-V1 (Nuevo lote) ; PS-V2 PS-V2.2 (w/EtOH)

27,997

28,151 26,9011 40 30,8352 31,0478 25,8926 22,2074

28,0062

28,2211 26,2139 38,0439 30,4502 30,1935 25,3037 22,0025

28,0016

28,18605 26,5575 39,02195 30,6427 30,62065 25,59815 22,10495 AVG

0,006505

0,049568 0,485924 1,383172 0,2722361 0,604081 0,416415 0,14488618 STDEV

5 D^a 20

VTM

Agua EtOH AVL PS-V1 (ano) PS-V1 (Nuevo lote) PS-V2 PS-V2.2 (w/EtOH)

27,9851

28,7713 27,1105 40 30,1844 27,193 25,7407 20,8364

28,4067

27,7929 27,0105 40 30,2465 27,2274 25,6213 20,2843

28,1959

28,2821 27,0605 40 30,21545 27,2102 25,681 20,56035

0,298116

0,691833 0,070711 0 0,0439113 0,024324 0,084429 0,39039365

AVG

STDEV

Dfa 30

VTM

Agua EtOH AVL PS-V1 (ano) PS-VI (nuevo lote) PS-V2 PS-V2.2 (w/EtOH)

29,23

31,9168 33,012 40 29,1993 30,2386 23,0589 20,9348

29,9067

31,3252 32,3001 40 28,827 29,6081 22,9662 20,4973

29,56835

31,621 32,65605 40 29,01315 29,92335 23,01255 20,71605

0,478499

0,418324 0,503389 0 0,2632559 0,445831 0,065549 0,30935922

AVG

STDEV

PS-V1 (anos) = -Formulacion PrimeStore de un ano (Ver, 1),

10 PS-V1 (lote nuevo) = -Formulacion PrimeStore fresca (Ver, 2),

PS-V2 = Formulacion PrimeStore fresca (Ver 2) (sin etanol),

PS-V2,2 (w/EtOH) = Formulacion PrimeStore fresca (Ver, 2,2) (es dedr, con etanol),

Todas las composiciones y metodos divulgados y reivindicados en el presente se pueden realizar y ejecutar sin una experimentacion excesiva a la luz de la presente divulgacion.

15

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion acuosa que incluye los componentes siguientes: un caotropo presente en una cantidad de entre 0,5 M y 6M;

   un detergente presente en una cantidad de entre 0,1% y 1% (peso/vol,), donde el detergente comprende docecilsulfato sodico (SDS), dodecilsulfato de litio (LDS), taurodesoxicolato sodico (NaTDC), taurocolato sodico (NaTC), glicocolato sodico (NaGC), desoxicolato sodico (NaDC), colato sodico, sulfonato de alquilbenceno sodico (NaABS), N-lauril sarcosina (NLS), sales de acidos carboxflicos, sales de acidos sulfonicos, sales de acido sulfurico, esteres de acido fosforico y polifosforico, alquilfosfatos, fosfato de monoalquilo (MAP), sales de acidos perfluorocarboxflicos, detergentes anionicos o cualquier combinacion de estos elementos;

   un agente reductor, donde el agente reductor es p-ME, DTT, DMSO o formamida presente en una cantidad de entre 0,05 M y 0,3 M, o donde el agente reductor es TCEP presente en una cantidad de entre 0,5 mM y 30 mM;

   un agente quelante presente en una cantidad de entre 0,5 mM y 50 mM;

   un agente tensoactivo presente en una cantidad de entre 0,0001% y 0,3% (peso/vol,), donde el agente tensoactivo comprende cocamidopropil hidroxisultaina, acidos alquilaminopropionicos, carboxilatos de imidazolina, betamas, sulfobetamas, sultamas, etoxilatos de alquilfenol, etoxilatos de alcohol, glicoles de polioxipropileno polioxietilenados, mercaptanos polioxietilenados, esteres de acido carboxflico de cadena larga, alcanolamidas, glicoles acetilenicos terciarios, siliconas polioxietilenadas, N-alquilpirrolidonas, alquilpoliglicosidasas, polfmeros de silicona como Antifoam A®, o polisorbatos como Tween®, o cualquier combinacion de estos elementos;

   un alcanol de cadena corta presente en una cantidad de entre 1 y 25% (vol,/vol,);

   una solucion tampon que proporciona a la composicion un pH de entre 6 y 7, y

   agua libre de nucleasa,

   donde los componentes se encuentran presentes todos juntos en una cantidad suficiente como para desnaturalizar protemas, inactivar nucleasas, eliminar patogenos y no degradar el acido nucleico de una muestra que se sospecha que contiene agentes patogenos y donde la muestra esta en contacto con la composicion,
2. 2. La composicion de la reivindicacion 1 donde la solucion tampon proporciona a la composicion un pH de entre 6,4

   y 6,8,
3. 3. La composicion de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 donde el caotropo comprende triocianato de guanidina, isocianato de guanidina o hidrocloruro de guanidina,
4. 4. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, donde el detergente comprende dodecilsulfato sodico, dodecilsulfato de litio, taurodesoxicolato sodico, taurocolato sodico, glicocolato sodico, desoxicolato sodico, colato sodico, sulfonato de alquilbenceno sodico o N-lauril sarcosina,
5. 5. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el agente reductor comprende 2- mercaptoetanol, tris(2-carboxietil)fosfina, ditiotreitol, dimetilsulfoxida o tris(2-carboxietil)fosfina,
6. 6. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el agente quelante comprende acido etilenglicoltetraacetico, acido hidroxietilendiamintriacetico, acido dietilentriaminpentaacetico, N,N- bis(carboximetil)glicina, acido etilendiamintetraacetico, citrato anhidro, citrato sodico, citrato calcico, citrato amonico, bicitrato amonico, acido cftrico, citrato diamonico, citrato de amonio ferrico o citrato de litio,
7. 7. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el alcanol de cadena corta comprende metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol o hexanol,
8. 8. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la solucion tampon comprende tris(hidroximetil) aminometano, citrato, acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico, acido N, N -Bis(2-hidroxietil)-2 - aminoetanosulfonico, 1,3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano, acido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazinetanosulfonico, acido 3-( N -morfolino) propanosulfonico, bicarbonato o fosfato,
9. 9. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde los patogenos comprenden virus influenza, celulas infectadas por el virus influenza, bacterias de la tuberculosis o celulas infectadas por la bacteria de la tuberculosis,
10. 10. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende ademas ARN desnudo, ADN, o una combinacion de ambos; opcionalmente, donde el ARN desnudo, ARN o la combinacion de estos elementos sirve como vehnculo o contiene una secuencia predeterminada de acido nucleico como control positivo interno,
11. 11. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el caotropo, el detergente, el agente reductor, el agente quelante, el agente tensoactivo, el alcanol de cadena corta y/o la solucion tampon incluye uno o

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    mas caotropos, uno o mas detergentes, uno o mas agentes reductores, uno o mas agentes quelantes, uno o mas agentes tensoactivos, uno o mas alcanoles de cadena corta y/o una o mas soluciones tampon,
12. 12. Un sistema para la recogida de muestras que comprende:

    un dispositivo de recogida de muestras y un recipiente de recogida en el que se coloca la muestra, donde el recipiente de recogida contiene una cantidad de la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la composicion es efectiva para mantener la integridad del acido nucleico que puede estar presente en la composicion para permitir la identificacion por PCR de un patogeno presente en la muestra cuando la composicion que contiene la muestra se almacena a temperatura ambiente o superior durante un periodo de siete dfas o mas,
13. 13. Un metodo para detectar una secuencia de acido nucleico que es indicativa de la presencia de un patogeno en la muestra que consiste, en un solo paso, en poner en contacto la muestra con una cantidad de la composicion acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a ll, donde la composicion es efectiva para eliminar todos los patogenos de la muestra sin degradar ni modificar el acido nucleico de la muestra, de forma que la secuencia de acido nucleico del patogeno resulta detectable por amplificacion por PCR,
14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, donde el patogeno comprende bacterias, virus o un hongo; opcionalmente, donde la bacteria es tuberculosis o el virus es influenza,
15. 15. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, donde la secuencia de acido nucleico se encuentra presente en la composicion en una cantidad de 1 pg/mL a 1 pg/mL,
16. 16. Un metodo para preparar la composicion acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende: la combinacion de dicho caotropo y agua libre de nucleasa a una temperatura de entre 20 °C y 90 °C;

    la combinacion del caotropo con un agente reductor, un agente quelante, un agente tensoactivo y un detergente para formar una composicion intermedia;

    opcionalmente la combinacion de un polfmero de silicona con la composicion intermedia en una cantidad suficiente para minimizar la espuma durante la posterior preparacion;

    la combinacion de una cantidad suficiente de solucion tampon con la composicion intermedia para obtener un pH de entre 5 y 7;

    el aumento de la temperatura de la composicion intermedia de 60 a 95 °C durante uno a 30 minutos y posteriormente reducirla hasta la temperatura ambiente;

    la combinacion de un alcohol C1-6 con la composicion intermedia; y

    el ajuste de la formulacion a un pH de entre 6 y 7 para formar la composicion acuosa.