ES2553356T3

ES2553356T3 - Un método para expandir monocitos

Info

Publication number: ES2553356T3
Application number: ES08707852.3T
Authority: ES
Inventors: Michael Sieweke
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2007-01-11
Filing date: 2008-01-10
Publication date: 2015-12-07
Anticipated expiration: 2028-01-10
Also published as: KR20090097964A; US20120122207A1; US8691964B2; US20140127268A1; EP2126051A1; JP5579442B2; EP2126051B1; US9125869B2; KR101518409B1; WO2008084069A1; JP2010515442A; JP2014158475A; EP1944361A1; US8574903B2; JP5908016B2; US20100003272A1

Abstract

Un método ex vivo para la expansión de monocitos, macrófagos o células dendríticas, método que comprende la inactivación de la expresión o la actividad de Mafb y c-Maf en monocitos, macrófagos o células dendríticas; y la expansión de las células en presencia de M-CSF.

Description

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invasión y la producción de fibroblastos de la matriz extracelular. Producen mediadores que movilizan las respuestas sistémicas del huésped, incluida fiebre, liberan y catabolizan las hormonas de tensión y otras, aumentan la actividad metabólica de otras células e influyen en el flujo de sangre a los tejidos y la permeabilidad capilar. Los propios macrófagos muestran una heterogeneidad considerable en sus funciones, que a menudo expresan activadores así

5 como inhibidores de una propiedad, por ejemplo, la actividad proteolítica, o la producción de citocinas pro y antiinflamatorias, en función de la evolución de una respuesta del huésped particular.

Por lo tanto, se describe un método para tratar a un sujeto afectado con una enfermedad que resulta de una deficiencia en el compartimiento de monocitos, cuyo método comprende administrar dicho sujeto con monocitos, macrófagos o células dendríticas, en el que la expresión o la actividad de MafB and c–Maf se inactivan, preferentemente con monocitos, macrófagos deficientes o células dendríticas deficientes en MafB y c-Maf.

Un objeto adicional de la invención es el uso de un monocito, macrófago o célula dendrítica como se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad seleccionada del

15 grupo que consiste en un cáncer, inmunodeficiencias agudas o adquiridas, lesión crónica o aguda, heridas, enfermedades degenerativas, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias crónicas, aterosclerosis, poli- y osteoartritis, osteoporosis, enfermedades infecciosas (por ejemplo, infecciones por virus o bacterias), y enfermedades metabólicas.

Las inmunodeficiencias incluyen las adquiridas o las de origen genético, o las que son el resultado de la radioterapia / quimioterapia. Particularmente se contempla el SIDA. Asimismo, la invención ofrece la posibilidad para el desarrollo de inmunoterapias de cáncer específicas de antígeno.

Los macrófagos acuerdo con el invención pueden ser útiles para el tratamiento de infecciones por el VIH. La

25 disfunción de los neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares [PMNL]) y las células macrofágicas se produce, de hecho, como consecuencia de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1). Los macrófagos contribuyen a la resolución de la inflamación temprana mediante ingestión de cuerpos apoptóticos de PMNL. Un estudio reciente sugiere que la alteración de la fagocitosis por los macrófagos de los cuerpos apoptóticos de PMNL puede contribuir a la persistencia del estado inflamatorio en sujetos infectados por el VIH, especialmente durante las infecciones oportunistas que suelen verse más favorecidas por la actividad fagocítica defectuosa (Torre D et al. 2002). Por lo tanto, los métodos para generar macrófagos como se ha descrito anteriormente pueden ser útiles para el tratamiento de sujetos infectados con el VIH.

Los pacientes en tratamiento con quimioterapia con agentes anticancerosos tales como ciclofosfamida (CP)

35 experimentan una fuerte reducción del tamaño de las poblaciones de macrófagos tisulares que acompaña a la leucopenia sanguínea. Por tanto, estos pacientes son especialmente susceptibles a las infecciones oportunistas, incluyendo la neumonía por bacterias gramnegativas. Tales infecciones oportunistas son una causa común de muerte en los pacientes con cáncer que se someten a quimioterapia (Santosuosso M, et al. 2002). Por lo tanto, los métodos para generar macrófagos como se ha descrito anteriormente pueden ser útiles para el tratamiento de sujetos que han sido sometidos a quimioterapia.

Los macrófagos pueden inhibir la apoptosis de las células precursoras en un contacto entre células y pueden servir como soporte de estroma para el injerto celular eficiente para la reparación de tejidos (véase, por ejemplo, el documento WO2005014016). En particular, los macrófagos podrían inhibir la apoptosis de las células precursoras

45 miogénicas. Por lo tanto, los métodos para generar macrófagos como se ha descrito anteriormente pueden ser útiles para el tratamiento de lesiones tales como lesiones óseas o musculares, posiblemente como resultado de una enfermedad o una lesión. Puede ser, por ejemplo, una fractura ósea, o un desgarro muscular. En una realización más particular de la invención, dicha lesión es una lesión o daño cardíaco. En particular, puede ser, por ejemplo, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, trombosis coronaria, miocardiopatía dilatada o cualquier disfunción de los cardiomiocitos con posterioridad a, o como resultado de, cualquier defecto genético. Por lo tanto, los métodos para generar los macrófagos como se ha descrito anteriormente pueden ser útiles para el tratamiento de insuficiencias cardiacas agudas con mal pronóstico a pesar del progreso en los tratamientos, tales como miocardiopatía infiltrativa, o miocardiopatía por toxicidad por antraciclinas o miocardiopatía secundaria a la infección por VIH.

55 Los métodos para generar los macrófagos como se ha descrito anteriormente pueden ser también útiles para el tratamiento de lesiones de la médula espinal. Una terapia para la lesión medular completa (LMC) puede, de hecho, consistir en injertos autólogos de macrófagos que se han instruido en un fenotipo de cicatrización de heridas mediante coincubación con tejido de la piel (Schwartz M et al. 2006).

Los macrófagos son esenciales para la cicatrización de heridas y, por lo tanto, los métodos para generar los macrófagos como se ha descrito anteriormente pueden ser útiles para mejorar la cicatrización de heridas y / o la reparación de daños en los tejidos. El proceso de cicatrización de la herida tiene, de hecho, 3 fases. Durante la fase inflamatoria, los macrófagos secretan numerosas enzimas y citocinas. Estas incluyen colagenasas, que limpian la 65 herida de residuos, interleucinas y factor de necrosis tumoral (TNF), que estimulan los fibroblastos (para producir colágeno) y estimulan la angiogénesis; y el factor transformante de crecimiento α (TGF?), que, en la curación de

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En una realización preferida, los monocitos, macrófagos, células dendríticas se obtienen directamente del sujeto al que se administran. En ese caso, el trasplante es autólogo. Sin embargo, en otra realización, el trasplante puede ser también no autólogo. Para el trasplante no autólogo, el receptor recibe, preferentemente, un fármaco inmunosupresor para reducir el riesgo de rechazo de la célula trasplantada. Los métodos de administración de las 5 células de acuerdo con el invención incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal y epidural. Las células se pueden administrar por cualquier vía conveniente y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La vía de administración es, preferentemente, intravenosa o intradérmica. El título de los monocitos y/o macrófagos y/o células dendríticas transplantadas que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del

10 trastorno o afección y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro pueden emplearse, opcionalmente, para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o trastorno y se decidirá de acuerdo con el juicio del médico encargado y las circunstancias de cada sujeto.

15 Composiciones farmacéuticas:

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un monocito y / o macrófago y / o célula dendrítica producidos de acuerdo con la invención, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por una "cantidad terapéuticamente eficaz" de

20 una célula como se ha descrito anteriormente se entiende una cantidad suficiente de dicha célula para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en una relación beneficio / riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. No obstante, se entenderá que el uso diario total de composiciones de la presente invención será decidido por el médico responsable dentro del alcance de un juicio médico sólido. El nivel de dosis específico terapéuticamente eficaz para cualquier paciente dependerá de diversos factores, incluyendo el trastorno que se esté tratando y su

25 gravedad, la actividad del compuesto específico usado, la composición específica usada; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente o sujeto; la hora de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico usado; la duración del tratamiento, los fármacos usados en combinación o coincidiendo con las células específicas usadas y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

30 Vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol y combinaciones de los mismos. El vehículo y la composición pueden ser estériles. La formulación debe adaptarse al modo de administración. La composición, si se desea, puede también contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o tamponadores del pH. La composición puede

35 ser una solución líquida, suspensión, o emulsión. En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición puede también incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lignocaína, para aliviar el dolor en el punto de la inyección.

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Métodos para la modificación por ingeniería de células de la invención:

Los monocitos, macrófagos y células dendríticas de la invención pueden diseñarse genéticamente además de manera que dichas células expresen un ácido nucleico terapéutico de interés, que codifica una proteína de interés.

45 Los genes adecuados de interés incluyen factores de crecimiento. Por ejemplo, las células de la invención pueden modificarse genéticamente para producir productos génicos beneficiosos en el trasplante de las células manipuladas genéticamente a un sujeto. Tales productos génicos incluyen, pero no se limitan a, factores antiinflamatorios, por ejemplo, anti–TNF, anti–IL–1, anti– II–6, anti–IL–2, etc. Como alternativa, las células de la invención pueden

50 manipularse genéticamente para "desactivar" la expresión de MHC con el fin de disminuir el riesgo de rechazo. Se ha demostrado que los macrófagos se fusionan con células musculares o hepatocitos y pueden corregir un defecto genético en estas células (Camargo et al., 2003) (Camargo et al., 2004) (Willenbring et al., 2004). Las células de la invención pueden, por tanto, manipularse también para expresar una o varias copias de variantes normales o hiperactivos de genes que están mutados en trastornos genéticos. Los ejemplos incluyen, pero no se

55 limitan a, deficiencias enzimáticas en el hígado o la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne.

Los macrófagos son un componente principal del infiltrado tumoral. Los genes adecuados de interés para su expresión por las células de la invención pueden, por lo tanto, ser también genes que llevan actividad antitumoral.

60 Además, las células de la invención pueden manipularse para inactivar la expresión de genes mediante ARNip o antisentido o genes que codifican ARNip o antisentido que se introducen de forma estable o transitoria en las células. Los objetivos para la inactivación incluyen, pero no se limitan a, citocinas inflamatorias, proteasas, factores de transcripción y enzimas que afectan a las vías inflamatorias.

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expansión observada de monocitos deficientes en Mafb / c-Maf se debe a un fuerte aumento de la capacidad de proliferar en respuesta a M-CSF.

Los monocitos deficientes en MafB/c–Maf se pueden mantener en cultivo de M–CSF durante varios meses y

5 se expanden en más de 1010 veces: A fin de analizar aún más durante cuanto tiempo se podía mantener esta autorrenovación potenciada y la capacidad de proliferación dependiente de M–CSF de los monocitos deficientes en Mafb / c-MAF, se tomaron las UFC-M de las colonias monocíticas en cultivo líquido y se cultivaron en presencia de medio que contiene M–CSF. Bajo estas condiciones, las células continuaron proliferando y expandiéndose en cultivo. Cuatro poblaciones de células se obtuvieron de forma independiente a partir de diferentes embriones y ensayos de resiembra y se pudieron mantener en cultivo que contiene M-CSF durante al menos 15 pases o 4 meses sin ningún signo de crecimiento lento o crisis. Dos poblaciones entraron en crisis en el pase 16, pero los otros dos no mostraron ningún signo de la crisis hasta el pase 24 o a los 6,5 meses y una de ellas se ha mantenido continuamente en cultivo durante 18 meses sin crisis o ralentización del crecimiento. Las curvas de crecimiento hasta el pase 15 de tres de estas poblaciones (denominadas DKO 42, 46 y 56) se muestran en la Fig.4. Las células

15 congeladas en cada pase se pudieron suspender fácilmente en el cultivo de nuevo. Las poblaciones derivadas también pudieron clonarse y se han establecido al menos 6 líneas independientes derivadas de células individuales de poblaciones de pase temprano.

Se calculó el número total de células que se pueden obtener sin crisis en el cultivo a largo plazo para representar un factor de amplificación de al menos 1010. Para ilustrar este enorme factor de amplificación, los monocitos presentes en un típico volumen de un análisis de sangre de rutina (aproximadamente 5 ml) serían teóricamente suficientes para generar los monocitos totales de 10 millones de personas, si se amplificaron de forma similar.

Las células monocíticas deficientes en c–Maf/MafB en los cultivos de M–CSF tienen un fenotipo de

25 monocitos/macrófagos normal: Las células deficientes en c-Maf / MafB cultivadas de forma continua en presencia de M-CSF durante periodos prolongados de tiempo mantienen un fenotipo de monocitos / macrófagos. Como se muestra en la figura 5ª, las células deficientes en c–Maf/MafB mostraron una morfología típica de los macrófagos en la tinción de Giemsa / May-Gruenwald. Su aparición en cultivo con contraste de fase fue menos aplanada que en los cultivos de macrófagos típicos, lo que es probable que sea una indicación de su continua proliferación (figura 5A). El análisis FACS mostró también que la población total de células deficientes en c–Maf/MafB expresaba los marcadores de monocitos / macrófagos típicos F4/80, Mac–1 (CD11b), M–CSFR (CD115) y FcgRII/III (CD16/CD32) pero ninguno de los marcadores de linfocitos T seleccionados (CD3, CD4, CD8), linfocitos B (CD19), eritroides (Ter– 119), granulocíticos (Gr–1) (fig.5C,D). En los cultivos que contienen cantidades bajas de M-CSF, pero no cantidades altas de M-CSF, se observó que se CD11c estaba regulado por aumento, lo que sugiere que estas células tienen el

35 potencial de diferenciación de las CD, que puede suprimirse con la presencia continua de M-CSF. Adicionalmente, las células deficientes en c–Maf/MafB exhibieron una función típica de monocitos / macrófagos, ya que fueron capaces de fagocitar cuantitativamente grandes cantidades de perlas de látex fluorescente en un grado igual o superior a las de los macrófagos primarios salvajes o líneas celulares de macrófagos (fig.5E).

En conjunto, estas observaciones indicaron que a pesar de su continua proliferación en el cultivo, todas las células mantuvieron un fenotipo maduro de monocitos / macrófagos totalmente diferenciados y funcionales.

Los monocitos y macrófagos deficientes en c–Maf/MafB no desarrollan neoplasias malignas in vivo: El aumento de la eficiencia de la repetición de la siembra in vitro se observa también para las células transformadas 45 malignas que tienen potencial leucémico in vivo. Para controlar esta posibilidad, los inventores reconstituyeron los ratones receptores irradiados letalmente con células de hígado fetal deficientes en c-Maf / MafB y se observó a los ratones reconstituidos durante largos períodos de tiempo para analizar si desarrollarían los trastornos de leucemia mieloide o mieloproliferativa. Hasta el momento se reconstituyó a 8 ratones a las 6-8 semanas de edad y se analizaron a los 8, 11, 14 y 22 meses de edad, el último de los cuales está cerca de la vida útil máxima de un ratón. Durante todo el periodo de observación, los ratones parecían normales y no mostraron ningún signo de malestar. El análisis de sangre regular hasta los 22 meses mostró recuentos y morfología de glóbulos blancos normales sin indicación de blastos o células anormales. Mediante análisis FACS, los monocitos tenían un fenotipo CD115+, CD11b+, F4/80+ normal y no se detectó aumento del número de células que expresan marcadores de superficie de las células progenitoras o inmaduras. Tras el sacrificio, la disección tampoco reveló signos macroscópicos de 55 leucemia, el bazo presentaba un tamaño normal y un aspecto saludable. El análisis FACS y la tinción histológica de los citoespín de la sangre, la médula ósea, el bazo y el exudado peritoneal no reveló ninguna indicación de leucemia

o enfermedad mielo-proliferativa. No se observó un aumento del número de células con un perfil de marcador de superficie progenitor (CMP, GMP) o células con morfología de blastos o inmadura en la médula ósea. Esto indica que el los monocitos deficientes en c–Maf/MafB y las células derivadas de monocitos pueden contribuir con normalidad y a largo plazo al sistema hematopoyético sin causar patologías hematológicas.

Los monocitos deficientes en c–Maf/MafB de ratones envejecidos se pueden expandir en cultivo de M–CSF:

Los inventores querían analizar si los monocitos / macrófagos deficientes en c–Maf/MafB con capacidad ampliada de autorrenovación no pudieron solo derivar de células embrionarias, sino también de las células diferenciadas 65 terminalmente de adultos o incluso animales de edad avanzada. Por lo tanto, los inventores han analizado si los monocitos de ratones reconstituidos con un sistema hematopoyético deficiente en MafB/c–Maf podrían expandirse

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