ES2553458T3 - Variantes sintéticas de fitasa - Google Patents

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ES2553458T3 ES12773864.9T ES12773864T ES2553458T3 ES 2553458 T3 ES2553458 T3 ES 2553458T3 ES 12773864 T ES12773864 T ES 12773864T ES 2553458 T3 ES2553458 T3 ES 2553458T3
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Stefan Haefner
Annegret Welzel
Robert THUMMER
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BASF SE
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Abstract

Una fitasa que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 85 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID 24.

Description

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El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-063 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-064 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-065 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-066 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-067 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-068 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-069 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-070 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-071 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-072 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-073 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-074 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-075 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-076 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-077 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-078 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-079 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
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El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-097 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-098 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-099 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-100 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-101 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-102 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-103 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-104 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-105 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-106 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-107 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-109 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-110 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-111 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-112 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-113 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-114 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
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El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-115 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-116 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-117 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-118 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-119 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-120 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-121 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-122 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-123 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-124 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-125 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-126 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-127 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-128 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-129 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-130 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
El objeto se consigue además mediante una fitasa sintética que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 95 %, preferentemente 96 %, preferiblemente 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos del PHV-131 mutante (véase la Tabla 1, las mutaciones según la columna 2 basado en la SEC ID 24).
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(continuación)
Mutante Mutación
PhV–012 PhV–013 PhV–014 PhV–015 PhV–016 PhV–017 PhV–018 PhV–019 PhV–020 PhV–021 PhV–022 PhV–023 PhV–024 PhV–025 PhV–026 PhV–027 PhV–028
PhV–029 PhV–030 PhV–031 PhV–032 PhV–033 PhV–034 PhV–035 PhV–036 PhV–037 PhV–038 PhV–039 PhV–040
S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T V123A E144A G152T G217S D398E S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T V123A E144A G152T G217S D398K S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T V123A E144A G152T G217S D398G S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T Q109E V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5AA6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T Q109N V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T V123A E144A G152T Q159N G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T V123A E144A G152T G217S T322Q S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A E144A G152A G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A E144A G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T V123A E144A G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T V123A E144A G152T G217S I300L S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A S136K Q141K E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A S136K E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N 77SQD79 V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N 77SQG79 V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A S136K E144A G152T A166E G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A S136K E144A G152T A166H G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A S136K E144A G152T D2E A4E A6S F8Y D33M K76N N78T V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A E144A G152T N159K G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A E144A G152T G217S Q406K S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T E144A G152T G217S I300L S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A G152T A166E G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A G152T A166H G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A G152T S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A E144A G152T A166H G217S D398E S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A E144A G152T D398E
T50 [°C]
82 81 81 81 81 82 81 82 83 82 82 82 82 81 82 81 81
81 82 83 81 81 81 81 82 82 82 82 82
(continuación)
Mutante Mutación
PhV–041 PhV–042 PhV–043 PhV–044 PhV–045 PhV–046 PhV–047
PhV–048 PhV–049 PhV–050 PhV–051 PhV–052 PhV–053 PhV–054 PhV–055 PhV–056 PhV–057
PhV–058 PhV–059 PhV–060 PhV–061 PhV–062 PhV–063 PhV–064 PhV–065 PhV–066 PhV–067 PhV–068 PhV–069 PhV–070
S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A S136K E144A G152T G217S D398E S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A S136K E144A G152T Q193L G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T N119A V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T N119T V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T Q109N V123A E144A G217S I300L S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T Q109N V123A E144A G217S K268N I300L S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T Q109N V123A E144A G152T G217S K268N I300L S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76I N78T V123A E144A G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76R N78T V123A E144A G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76D N78T V123A E144A G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T Q118S V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T Q118S N119A V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T E144A G217S I300L S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T Q118S N119A V123A E144A G217S D2E A4E A6S F8Y D33M K76N N78T V123A E144A G217S Q276N D2E A4E A6S F8Y D33M K76N N78T V123A E144A G152T G217S Q276N N346G S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T Q109N V123A E144A G217S Q276N I300L N346G D2E A4E A6S F8Y D33M K76N N78T V123A E144A G217S D2E A4E A6S F8Y D33M K76N N78T V123A E144A G217S D398E S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T Q109N V123A E144A G217S I300L N346G S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A E144A G152T E155N G217S D345G S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T S136K E144A G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T V123A E144A G152T E155N G217S Q276N S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T N92A V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T N92T V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T N92V V123A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T N92A E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T N92E E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T N92T E144A G152T G217S S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33N K76N N78T N92V E144A G152T G217S
T50 [°C]
82 82 81 81 83 81 81
83 82 82 82 81 83 82 83 82 82
83 83 83 81 82 82 84 83 83 85 84 84 85
imagen14
(continuación)
Mutante Mutación
PhV–102 D33M K76N N78T V123A E144A G152T G217S N258D H261S Q270N PhV–103 V123A E144A G217S PhV–104 D33M K76N N78T V123A E144A G217S PhV–105 T121Q V123A E144A G152T G217S PhV–106 K76N N78T V123A E144A G217S Q270N PhV–107 K76N N78T V123A E144A G152T G217S PhV–109 Q159N G217S PhV–110 V123A E144A Q159N M260I PhV–111 N92A V123A E144A Q159N M260I PhV–112 S1–D2–T3Q A4G P5A V123A E144A G217S PhV–113 S1–D2–T3Q A4G P5A V123A E144A G217S PhV–114 A6D G7K F8M Q9K V123A E144A G217S PhV–115 N92A Q159N M260I PhV–116 Q159N M260I PhV–117 S1A D2S T3R A4N V123A E144A G217S PhV–118 M260I PhV–119 V123A E144A Q159N M260I PhV–120 D2E A4E A6S F8Y D33M K76N N78T V123A E144A G217S PhV–121 S1–D2–T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M K76N N78T V123A E144A G217S PhV–122 D33M K76N N78T V123A E144A G217S PhV–123 D2E A4E A6S F8Y T121Q V123A E144A G152T G217S N258D H261S Q270N PhV–124 D2E A4E A6S F8Y K76N N78T V123A E144A G217S Q270N PhV–125 N92A E144A G217S PhV–126 N92A E144A G217S M260I PhV–127 V123A Q159N M260I PhV–128 A4E A6S V123A E144A G217S PhV–129 R67L V123A Q159N M260I PhV–130 L16V V123A Q159N M260I PhV–131 K12R V123A Q159N M260I PhV–132 K12R L16V V123A E144A Q159N M260I PhV–133 R67L E144A Q159N M260I PhV–134 V123A Q159N A166E M260I PhV–135 R67L Q159N A166E M260I PhV–136 N92A Q159N A166E M260I PhV–137 N92A V123A E144A Q159N A166E M260I D398E PhV–138 Q159N A166E M260I D398E PhV–139 V123A Q159N PhV–140 K12R R67L PhV–141 L16V R67L PhV–142 R67L A166E PhV–143 A166E I300L PhV–144 I120L I300L PhV–145 I120L L371A PhV–146 R67L I120L A166E L371A PhV–147 I120L I300L L371A
Determinación del perfil de pH
T50 [°C]
82
84 84 83 83 83 83 84 85 84 84 84 85 84 84 84 84 84 84
84 82
85 84 84 84 84 84 83 84 83 85 85 84 84 83 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84
Para determinar el perfil de pH, un tampón de reacción modificado (acetato de Na 100 mM, glicina 100 mM, imidazol 100 mM, CaCl2 1 mM, 0,01 % de Tween 20), que se lleva a valores de pH en el intervalo de pH 1,5 – 7 usando ácido clorhídrico diluido, se utiliza para el ensayo de fitasa. Para determinar la actividad relativa, la actividad determinada a pH 5,5 se fija en 100 %. Los resultados se muestran en las tablas 2 y 3.
Tabla 2: Perfiles de pH de la fitasa HF598 y sus variantes. La fitasa se expresa en A. niger y se mide directamente en el sobrenadante del cultivo. La actividad de la fitasa se muestra en % como un valor relativo de la actividad determinada a pH 5,5 (véase la figura 2A).
pH
1,5 2 3 4 5,0 5,5 6 7,0
HF598
8 30 57 81 123 100 68 4
PhV–107
8 24 51 78 117 100 60 3
PhV–109
6 24 49 76 127 100 59 3
PhV–110
6 27 48 85 134 100 70 4
PhV–111
7 38 76 105 134 100 57 3
PhV–124
7 41 61 76 125 100 67 4
Tabla 3: perfiles de pH de algunas variantes de la fitasa. La fitasa se expresa en E. coli y se purifica mediante cromatografía de afinidad de Ni. La actividad de la fitasa se muestra en % como un valor relativo de la actividad determinada a pH 5,5 (véase la figura 2B).
pH
1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7
PhV–007
7 23 43 80 126 155 160 142 100 45 13 4
PhV–058
3 22 44 75 108 138 147 132 100 51 15 4
PhV–067
6 32 70 123 171 201 182 158 100 52 17 5
PhV–071
4 23 44 77 119 151 157 143 100 53 16 4
PhV–081
4 23 55 79 110 125 131 130 100 53 16 1
Determinación de la estabilidad a pH 2
10 Para determinar la estabilidad a pH 2, la muestra de fitasa se diluye en tampón (glicina 250 mM, 3 mg / ml de BSA, pH 2) a 30 U / ml. La muestra se incuba durante 30 minutos a 37 °C. Después, la muestra se diluye directamente con tampón de reacción (acetato de Na 250 mM, CaCl2 1 mM, 0,01 % de Tween 20, pH 5,5) al intervalo de medición óptimo de la determinación de la actividad fitasa (aprox. 0,6 U / ml) y se mide la actividad de fitasa. A modo de referencia, la muestra se incuba en paralelo durante 30 minutos a 37 °C en tampón de reacción a una concentración
15 de 30 U / ml y también se analiza la actividad de fitasa. Las actividades de las muestras sometidas a estrés de pH estresadas se normalizan con el valor de referencia, que se establece como una estabilidad del 100 %. En el ensayo también se usa Natuphos® (BASF) a modo de comparación con una fitasa comercial.
Tabla 4: Determinación de la estabilidad a pH 2 de la fitasa HF598 y sus variantes y de la fitasa Fus5 # 2 y la fitasa comercial Natuphos®. Las muestras con una estabilidad de > 90 % se marcan como "estables". Para una mejor
20 diferenciación gradual entre las muestras inestables, las estabilidades medidas se indican en %.
Fitasa
Natuphos®
Fus5#2
SEC ID 18
Mutante
Mutación
HF598
SEC ID 24
PhV–056
D2E A4E A6S F8Y D33M K76N N78T V123A E144A G152T
G217S Q276N N346G
PhV–057
S1– D2– T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R D33M
K76N N78T Q109N V123A E144A G217S Q276N I300L
N346G
PhV–058
D2E A4E A6S F8Y D33M K76N N78T V123A E144A G217S
Estabilidad a pH 2
65 % estable
estable estable estable
estable

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