ES2553599T3

ES2553599T3 - Método y dispositivo para microscopía interferencial de campo completo de alta resolución

Info

Publication number: ES2553599T3
Application number: ES11723374.2T
Authority: ES
Inventors: Albert Claude Boccara; Fabrice Harms; Bertrand Le Conte Chrestien De Poly
Original assignee: LLTECH MANAGEMENT
Current assignee: LLTECH MANAGEMENT
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2015-12-10
Anticipated expiration: 2031-05-17
Also published as: EP2572157A1; WO2011144632A1; EP2572157B1; FR2960291B1; US20130107268A1; FR2960291A1; US9025150B2

Abstract

Dispositivo de microscopía interferencial (4) de campo completo de luz incoherente para la formación de imágenes de una muestra de dispersión volumétrica (106), que comprende: - una fuente (101) para emitir una onda incidente que tiene una banda espectral dada, - un dispositivo de interferencia (100) que comprende un brazo de referencia y un brazo objeto, para proporcionar interferencia óptica entre una onda de referencia (401) obtenida por reflexión de la onda incidente sobre una superficie reflectante (105) del brazo de referencia y una onda objeto (402) obtenida por la retrodispersión de la onda incidente mediante una sección de la muestra a una profundidad dada de dicha muestra, cuando dicha muestra se coloca en un plano focal objeto de un objetivo de microscopio (103) colocado en el brazo objeto, - un dispositivo de adquisición bidimensional (108) para la adquisición multicanal de al menos una primera señal de interferencia y de al menos una segunda señal de interferencia resultante de la interferencia óptica de dichas ondas de referencia y objeto, teniendo las al menos dos señales de interferencia un desfase producido al hacer variar la diferencia de marcha relativa entre los dos brazos del dispositivo de interferencia, estando dispuesto dicho dispositivo de adquisición bidimensional en un plano ópticamente conjugado con dicho plano focal objeto de dicho objetivo de microscopio del brazo objeto, - una unidad de procesamiento (403) para calcular una imagen de la sección de la muestra en base a dichas señales de interferencia primera y segunda, en el que - el dispositivo de interferencia comprende además un elemento óptico de modificación de fase (404) para modificar la fase del frente de onda de una de dichas ondas de referencia u objeto, y - el dispositivo de microscopía comprende una unidad de control (405) para el elemento óptico de modificación de fase, vinculada a la unidad de procesamiento (403), siendo controlado el elemento óptico de modificación de fase (404) mediante la optimización de un parámetro estadístico de al menos una parte de la imagen calculada por la unidad de procesamiento, comprendiendo dicho parámetro estadístico al menos uno del valor medio, de la desviación estándar y del contraste.

Description

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DESCRIPCION

Metodo y dispositivo para microso^a interferencial de campo completo de alta resolucion Tecnica anterior Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo y a un dispositivo para microscopfa interferencial de campo completo de alta resolucion, en particular para la formacion de imagenes de celulas.

Tecnica anterior

La figura 1 es un diagrama esquematico de un microscopio interferencial de campo completo de luz incoherente, o de un microscopio de campo completo de coherencia optica, basado en un metodo de formacion de imagenes tambien conocido como OCT de campo completo (donde OCT es la abreviatura del termino "Tomograffa de Coherencia Optica"). Este metodo de formacion de imagenes se describe, por ejemplo, en el artfculo "Full-field optical coherence tomography" de A. Dubois y C. Boccara, tomado del libro "Optical Coherence Tomography - Technology and Applications", editado por Wolfgang Drexler y James G. Fujimoto, Springer 2009. En la solicitud de patente francesa FR 2 817 030, tambien se describe la microscopfa basada en OCT de campo completo en luz de baja coherencia.

El dispositivo 1, como se ilustra en la figura 1, se basa en un interferometro de Michelson 100 iluminado por una fuente de longitud de coherencia corta 101, tal como una lampara halogena. El interferometro comprende un elemento divisor de haz 102, tal como un cubo divisor de haz no polarizador, formando dos brazos, y dos objetivos de microscopio identicos 103 y 104 estan dispuestos en estos dos brazos. Un dispositivo de este tipo se denomina interferometro Linnik. En uno de los brazos, denominado a continuacion brazo de referencia, hay una superficie plana 105 que tiene reflectividad uniforme, colocada en el plano focal objeto del objetivo de microscopio 104. En el otro brazo, denominado a continuacion brazo objeto, hay una muestra de difusion tridimensional 106 para la que se va a reconstruir el mapa tridimensional de la amplitud de retrodispersion. En la salida de este interferometro, una doble lente acromatica con una longitud focal grande, tfpicamente 300 mm, se utiliza para conjugar los planos focales objeto de los dos objetivos en un sensor multicanal 108, tal como una camara CCD. Con el fin de beneficiarse de una resolucion transversal limitada por la difraccion, se elige la distancia focal de esta lente para no submuestrear la funcion de dispersion de punto (PSF) de los objetivos. Las placas de vidrio 109, 110 estan dispuestas en cada brazo para compensar la dispersion.

Ya que la fuente luminosa 101 tiene una longitud de coherencia corta, la interferencia entre la luz reflejada por la superficie de referencia 105 y aquella retrodispersada por la muestra 106 solo se produce cuando los caminos opticos en ambos brazos son iguales, dentro de la longitud de coherencia efectiva. Existe por tanto una seccion virtual a traves del objeto, denominada seccion de coherencia, para la que la informacion de retrodispersion es relativa a la figura de interferencia vista por la camara. Puesto que la luz retrodispersada a ambos lados de esta seccion no es coherente con la luz reflejada por la referencia, contribuye a un fondo global en la serial. Cuando se modula la diferencia de marcha de los dos brazos del interferometro mediante un desplazamiento axial de la superficie de referencia 105 por medio de una pletina piezoelectrica 111, solo la figura de interferencia que lleva la informacion de la seccion de coherencia es modulada, mientras que el fondo permanece constante. Mediante la sincronizacion de esta modulacion con la formacion de imagenes de la camara se pueden registrar diferentes figuras de interferencia. Una combinacion no lineal de las imagenes permite entonces demodular la informacion relativa a la seccion de coherencia y por tanto discriminar la informacion relativa a los fotones balfsticos retrodispersados exclusivamente mediante esta seccion a partir de la informacion relativa a las que han sido difundidas en otros lugares de la muestra. Dado que la intensidad registrada en cada pixel de la camara contiene un termino constante y un termino modulado, que en sf esta compuesto de una amplitud y de una fase, al menos tres figuras de interferencia deben teoricamente ser registradas con el fin de extraer la amplitud compleja del termino modulado. Estas tres fases de la serial se eligen dentro de un penodo de modulacion, y por lo tanto la amplitud del desplazamiento de la superficie de referencia no sobrepasa la media longitud de onda central del espectro efectivo del instrumento. Una imagen tomografica de campo completo puede entonces ser adquirida en el volumen de la muestra, y la informacion tridimensional se puede registrar mediante el desplazamiento de la muestra con respecto al plano de coherencia. Las reconstrucciones en todas las direcciones, u otras representaciones tridimensionales, pueden ser producidas a continuacion.

Asf, el uso de microscopfa interferencial de campo completo hace que sea posible usar una fuente luminosa que tenga una banda espectral de mas de 300 nm, centrada, por ejemplo, en aproximadamente 750 nm, para obtener una resolucion espacial anatomopatologica correspondiente a una resolucion celular (aproximadamente 1 micra en las tres dimensiones), de hasta 1 milfmetro de profundidad en tejidos vivos. Para ello, ambos objetivos 103 y 104 son generalmente objetivos de microscopio de inmersion, por ejemplo objetivos de inmersion en agua (agua que tiene un mdice de refraccion, n, de 1,33), con una correccion adecuada de aberraciones geometricas y cromaticas.

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A fin de mantener una precision de 1 micra en X, Y y Z a la profundidad requerida, es necesario tener un medio homogeneo (agua pura) con un mdice optico fijo para mantener la igualdad de los caminos opticos entre el brazo de referencia y el brazo de medicion (objeto) del interferometro, en ambas dimensiones (sobre toda la superficie de analisis).

Cuando se analiza un tejido biologico, se vera que, por una parte, el mdice optico macroscopico rara vez es igual al del agua (siendo generalmente mayor), mientras que, por otro lado, vana localmente tanto transversalmente como en profundidad, dependiendo de las estructuras biologicas a analizar. Para la exploracion mecanica o de frecuencia convencional OCT, estos efectos son menos obvios porque la abertura numerica es pequena, ya que estos sistemas funcionan con una gran profundidad de campo, del mismo orden que la profundidad explorada.

El solicitante ha demostrado que, en microscopfa OCT de campo completo, cuando se trabaja a alta resolucion (una resolucion de 1 micra en las tres dimensiones), estos efectos de perdida de resolucion llegan a ser sustanciales a profundidades en el intervalo de 20 a 200 micras, dependiendo de los tejidos biologicos a observar.

Un objeto de la presente invencion es mejorar la resolucion de imagen, y por consiguiente la profundidad de analisis. Para este proposito, la invencion propone la modificacion controlada del plano de onda en dos dimensiones en el brazo objeto del interferometro para corregir la deformacion del frente de onda en el medio biologico debido a variaciones locales en el mdice de las diferentes celulas a traves de las cuales pasa el haz luminoso. Para lograr esto, la invencion propone un nuevo enfoque de la optica adaptativa (OA) controlada en base a las propiedades estadfsticas de la senal OCT

Resumen de la invencion

En un primer aspecto, la invencion se refiere a un dispositivo de microscopfa interferencial de campo completo de luz incoherente de una muestra de dispersion volumetrica, que comprende todas las caractensticas detalladas en la reivindicacion 1.

En una realizacion preferida, el elemento optico de modificacion de fase esta dispuesto en el brazo objeto, permitiendo el control de la fase de la onda incidente sobre la muestra.

En una variante, el dispositivo de interferencia comprende un objetivo de microscopio en cada uno de los brazos, y el elemento optico de modificacion de fase esta dispuesto en un pupila o en una imagen de la pupila del objetivo de microscopio del brazo objeto.

En una variante, el elemento optico de modificacion de fase es un espejo deformable.

En una variante, el calculo de la imagen de la seccion de la muestra comprende la sustraccion de al menos dos senales de interferencia que tienen un desfase de n y el elemento optico de modificacion de fase es controlado por la optimizacion de la desviacion estandar medida en al menos algunos de los valores de los puntos de la imagen calculada.

En una variante, el calculo de la imagen de la seccion de la muestra comprende, ademas, el calculo del valor absoluto de la sustraccion antes mencionada, y el elemento optico de modificacion de fase se controla mediante la optimizacion del valor medio, de la desviacion estandar o del contraste medido en al menos algunos de los valores de los puntos de la imagen calculada.

En una variante, la optimizacion del parametro estadfstico comprende la medicion del parametro para tres estados del elemento optico de modificacion de fase correspondientes a la introduccion de tres valores dados respectivos de una aberracion optica.

En una variante, el dispositivo de interferencia es de tipo Linnik, que comprende un elemento divisor de haz para formar los brazos objeto y de referencia, y un objetivo de microscopio en cada uno de los brazos.

En una variante, el dispositivo de interferencia comprende un filtro optico variable en uno de sus brazos y una placa en el otro brazo para compensar la diferencia de marcha introducida por el filtro optico variable.

En un segundo aspecto, la invencion se refiere a un metodo de microscopfa interferencial de campo completo de luz incoherente de una muestra de dispersion volumetrica, que comprende todas las etapas del metodo que se detallan en la reivindicacion 10.

En una variante, el calculo de la imagen de la seccion de la muestra comprende la sustraccion de al menos dos senales de interferencia que tienen un desfase de n, y la fase de la onda incidente sobre la muestra es controlada mediante la optimizacion de la desviacion estandar medida en al menos algunos de los valores de los puntos de la imagen.

En una variante, el calculo de la imagen de la seccion de la muestra comprende, ademas, el calculo del valor absoluto de la sustraccion antes mencionada, y la fase de la onda incidente sobre la muestra se controla mediante la optimizacion del valor medio, de la desviacion estandar o del contraste medido en al menos algunos de los valores de los puntos de la imagen.

5 En una variante, el control de la fase de la onda incidente sobre la muestra comprende, para una aberracion optica dada, la medicion de un numero determinado de valores del parametro estadfstico despues de la introduccion del mismo numero de valores de la aberracion optica en la fase de la onda incidente sobre la muestra, donde el calculo del valor de la aberracion maximiza el valor del parametro, y la introduccion del valor de la aberracion en la fase de la onda incidente sobre la muestra.

10 En una variante, el numero de valores introducidos de la aberracion optica es tres.

Breve descripcion de los dibujos

Otras ventajas y caractensticas de la invencion se pondran de manifiesto a la luz de la descripcion, ilustrada por las siguientes figuras:

- La figura 1 (descrita anteriormente) es un diagrama esquematico de un microscopio interferencial de campo 15 completo de luz poco coherente de acuerdo con la tecnica anterior;

La figura 2 es un diagrama que explica el origen de la naturaleza aleatoria de una senal OCT;

Las figuras 3A a 3C son tres imagenes que representan, respectivamente, un patron moteado, la superposicion de 16 patrones moteados no correlacionados y la superposicion de 100 patrones moteados no correlacionados;

La figura 4 muestra una realizacion ejemplar de un microscopio interferencial de campo completo de acuerdo con la 20 invencion;

Las figuras 5A y 5B muestran otras dos realizaciones ejemplares de un microscopio interferencial de campo completo de acuerdo con la invencion.

Descripcion detallada

La presente invencion propone un metodo original de microscopfa interferencial con optica adaptativa, que utiliza 25 una propiedad estadfstica particular de las imagenes adquiridas por el metodo de formacion de imagenes OCT de campo completo durante la exploracion en profundidad de medios de difusion, relacionado con la naturaleza aleatoria de las senales.

El origen de la naturaleza aleatoria de una senal OCT de campo completo se explica esquematicamente en la figura 2. La onda incidente 201 es enfocada en un volumen elemental, o voxel, de la muestra 202. La seccion transversal a 30 traves del voxel en ausencia de aberraciones es dada por el punto de difraccion del objetivo de microscopio 103. La seccion desde la cual es devuelta la onda retrodispersada, correspondiente a la longitud del voxel, tiene un espesor L igual a la longitud de coherencia temporal de la fuente dividida por dos veces el mdice de refraccion del medio. La onda retrodispersada 203 resulta de la suma de ondfculas retrodispersadas por las estructuras 204 que tienen posiciones aleatorias en el voxel en cuestion. La onda retrodispersada es detectada mediante interferencia con la 35 onda de referencia, no mostrada aqm. La naturaleza aleatoria de las estructuras que forman la muestra proporciona a las imagenes OCT un aspecto moteado. El termino "moteado" se utiliza comunmente para indicar la granularidad laser observada cuando un objeto difusor es iluminado por un laser altamente coherente. En este caso, el fenomeno descrito es de un tipo diferente, aunque se puede representar matematicamente en ambos casos mediante una marcha aleatoria en el plano complejo (vease, por ejemplo Goodman, "Speckle phenomena in optics", de Roberts 40 and Company Publishers, 30 de Octubre 2006). Una imagen afectada por moteado se muestra en la figura 3a. El moteado generalmente tiene una propiedad especial en la distribucion de intensidades. El contraste, que es igual a la relacion entre la desviacion estandar y el valor medio de la distribucion de intensidades, es igual a la unidad.

Como regla general, los usuarios de microscopfa OCT tratan de eliminar en la medida de lo posible el moteado de las imagenes suavizando la distribucion de intensidades, a menudo en detrimento de la resolucion. A pesar de esto, 45 el solicitante ha demostrado que es posible hacer uso de la naturaleza aleatoria de la imagen OCT y del moteado para poner en practica un metodo de optica adaptativa.

Por un lado, debido a las propiedades de reflexion local aleatoria de las muestras estudiadas, el solicitante ha demostrado que una imagen de intensidad de la muestra se puede obtener con solo dos figuras de interferencia con un desfase de n, producido por ejemplo mediante dos posiciones de espejo de referencia. La imagen se calcula 50 entonces mediante la busqueda de la diferencia (o el modulo de la diferencia) entre las dos senales de interferencia, suprimiendo asf el fondo mientras que conservan las propiedades estadfsticas esenciales de la imagen.

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Ademas, las aberraciones geometricas introducidas por las heterogeneidades macroscopicas de las estructuras penetradas que son mucho mas grandes en tamano que las estructuras microscopicas de los difusores causan una expansion del punto focal de la onda incidente en la muestra. La imagen es entonces el producto de la convolucion de la imagen ideal, libre de aberraciones, por el punto de difusion resultante de la presencia de aberraciones. Si el punto ocupa una superficie correspondiente a la ocupada por N granos de moteado, la convolucion de la imagen ideal por el punto de difusion equivale a superponer un numero N de motas no correlacionadas, lo que da como resultado una division del contraste por la rafz cuadrada de N.

A modo de ejemplo, las figuras 3b y 3c muestran la superposicion de entre 16 y 100 motas no correlacionadas. Es facil verificar mediante calculo basado en estas imagenes que el contraste, definido como la relacion entre la desviacion estandar y el valor medio calculados sobre la distribucion de intensidades, es de hecho 0,25 y 0,1 respectivamente.

La senal OCT resultante esta asf directamente relacionada con la presencia de aberraciones. Los parametros estadfsticos de la imagen se ven afectados por la presencia de las aberraciones. Esto es porque la convolucion de la imagen "ideal" por el punto de enfoque disminuye el valor de los parametros estadfsticos de la imagen, tales como la desviacion estandar o la intensidad media.

La invencion comprende la introduccion de una correccion variable del frente de onda incidente sobre la muestra, con el fin de corregir algunas o todas las aberraciones introducidas por las heterogeneidades macroscopicas de las estructuras en la muestra. Esta correccion variable se controla mediante la optimizacion de uno de los parametros estadfsticos de la imagen de la seccion de la muestra obtenida.

La figura 4 muestra una realizacion ejemplar de un microscopio interferencial de acuerdo con la invencion.

El dispositivo 4 del ejemplo mostrado en la figura 4 se basa en el uso de un interferometro de tipo Linnik 100 como se describe en la figura 1. Los elementos identicos se indican con las mismas referencias. El dispositivo comprende, en particular, una fuente 101 para la emision de una onda incidente con baja coherencia espacial y temporal. Esta es, por ejemplo, una lampara halogena con una banda espectral por encima de 300 nm, que se utiliza convencionalmente como una fuente de iluminacion de luz fna en microscopfa (vease, por ejemplo la Fuente Luminosa Fna KL1500 LCD -de Olympus). El interferometro 100 comprende un brazo de referencia con un objetivo de microscopio 104 y un espejo de referencia 106 montado en una pletina piezoelectrica 111 y un brazo objeto con un objetivo de microscopio 103 identico al objetivo 104. Los objetivos pueden ser, por ejemplo, objetivos con una abertura numerica media (de aproximadamente 0,4), disenados para funcionar en una combinacion de punto infinito / focal, con una correccion de cromatismo en un amplio espectro (tal como la serie de inmersion UMPLFLN-W de Olympus). La onda incidente emitida por la fuente 101 es separada por un cubo divisor de haz 102, por ejemplo, para formar una onda de referencia 401 reflejada por el espejo de referencia en el brazo de referencia y una onda objeto 402 retrodispersada por una seccion de una muestra 106 montada, por ejemplo, en una pletina del brazo de referencia. A la salida del interferometro, una doble lente acromatica se utiliza para conjugar los planos focales objeto de los dos objetivos en un dispositivo de adquisicion multicanal bidimensional 108, tal como una camara CCD. Este sistema optico se elige de manera que el aumento obtenido por la combinacion del objetivo y esta doble lente proporcione un muestreo correcto mediante los pfxeles de detector del punto de difraccion del objetivo, a una tasa de al menos dos pfxeles por punto de difraccion de acuerdo con el teorema de Shannon. Las longitudes focales tfpicas vanan de 300 a 500 mm en funcion de la abertura de los objetivos y del tamano de los pfxeles de la camara. Como se ha descrito anteriormente, ya que la fuente luminosa 101 tiene una longitud de coherencia corta, la interferencia entre la luz reflejada por la superficie de referencia 105 y la retrodispersada por la muestra 106 solo se produce cuando los caminos opticos en ambos brazos son iguales que los que estan dentro de la longitud de coherencia efectiva. Al variar la diferencia de marcha relativa entre los dos brazos del interferometro mediante la pletina 111, se introduce un desfase entre las senales de interferencia resultantes de la interferencia entre la onda de referencia y la onda objeto. Por tanto, tfpicamente, con el fin de aplicar un desfase de n en la configuracion de tipo Linnik, un movimiento de Ao / 4n debe aplicarse al espejo de referencia (donde n es el mdice del medio de propagacion orientado hacia el espejo de referencia y Ao es la longitud de onda media de la fuente de emision, tipicamente alrededor de 750 nm).

El dispositivo 4 tambien comprende una unidad de procesamiento 403 de senales de interferencia para calcular una imagen de la seccion de la muestra.

De acuerdo con un aspecto de la invencion, el dispositivo de interferencia 100 comprende un elemento optico para modificar la fase del frente de onda, y el dispositivo 4 comprende una unidad 405 para controlar el elemento optico, vinculada a la unidad de procesamiento 403.

El elemento optico de modificacion de fase es, por ejemplo, un espejo deformable de tipo membrana continua o segmentada o una matriz de cristales lfquidos. Un espejo deformable tal como el modelo Mirao52e (de Imagine Eyes, Paris, Francia) con 52 actuadores colocados bajo una membrana deformable reflectante puede ser adecuado.

De manera ventajosa, el elemento optico de modificacion de fase esta dispuesto en el brazo objeto del interferometro. Esto hace que sea posible corregir las aberraciones de la onda objeto relacionadas con las heterogeneidades de la estructura en la muestra con el fin de obtener una onda objeto que tenga una calidad optica comparable con la onda de referencia, proporcionando asf un aumento de resolucion.

5 De manera ventajosa, el elemento optico de modificacion de fase esta dispuesto en una pupila de entrada del objetivo de microscopio 103 del brazo objeto o en una imagen de la pupila, a fin de mantener el haz centrado en este elemento para todos los puntos de campo.

Las diversas aberraciones que contribuyen a ampliar el punto de difusion pueden estar asociadas a deformaciones del frente de onda que pueden ser expresadas en una base de polinomios ortogonales, lo que permite modificar el 10 nivel de una aberracion presente sin afectar al nivel de las otras aberraciones. Estos polinomios se conocen como polinomios de Lukosz, y se describen, por ejemplo, en el artmulo de D. Debarre y otros, "Image Based Adaptative Optics Through Optimisation of Low Spatial Frequencies", Optics Express (2007), vol. 15 (13), pags 8176 -. 8190. Pueden utilizarse otras descomposiciones del frente de onda, tales como las descritas en el artmulo de B. Wang y otros, "Optimun deformable mirror modes for sensoreless adaptative optics", Optics Comunications 282 (2009), 4467 15 - 4474. La base ortogonal descrita utiliza los modos de deformacion intrmsecos del espejo deformable en cuestion

para construir una base de representacion para las aberraciones que tienen las mismas propiedades que los polinomios de Lukosz, aunque haciendo una mejor estimacion de las deformaciones reales del espejo deformable. Las aberraciones mas comunmente encontradas son la aberracion de desenfoque, la aberracion esferica, introducida por ejemplo por una placa con una cara plana y paralela dispuesta en el camino de enfoque de un 20 objetivo de microscopio, tal como una placa de microscopio, y la coma.

Por tanto, un objeto de la presente invencion es anular el efecto de cada una de las aberraciones que contribuye a la degradacion de un parametro estadfstico de la senal OCT resultante de la adquisicion de una imagen de la seccion de la muestra.

En un ejemplo, la imagen se calcula hallando la diferencia entre dos senales de interferencia que tienen un desfase 25 de n (obteniendose estas dos senales mediante la variacion de la diferencia de marcha relativa entre los dos brazos del interferometro, por ejemplo moviendo la pletina piezoelectrica), o mediante la busqueda del valor medio de un numero dado de imagenes calculadas de esta manera. El valor medio de los puntos de la imagen calculada de esta manera es cero en este caso. Por el contrario, la desviacion estandar (a), dada por:

imagen1

£ (/(*, r)- f

ysl

30 donde I(x, y) es el valor de un punto de la imagen con las coordenadas (x, y), M y N son los numeros correspondientes de los puntos de la imagen en las dos dimensiones y ith es la media, no es cero, y disminuye en presencia de aberraciones a causa de la suma de motas no correlacionadas, tal como se describe anteriormente.

En un ejemplo, el nivel de cada una de las aberraciones a cancelar se vana mediante la unidad de control 405 y la operacion espedfica del elemento de modificacion de frente de onda 404, optimizando el valor calculado de la 35 desviacion estandar. El solicitante ha demostrado que, en general, tres mediciones para cada aberracion a corregir son suficientes para lograr el objetivo, debido a las propiedades de los polinomios ortogonales elegidos. Esto se debe a que la variacion de la calidad de imagen de acuerdo con los parametros estadfsticos intrmsecos de la senal OCT, como se ha descrito anteriormente, se puede representar de forma cuadratica, y en particular el maximo de esta curva de variacion se puede aproximar mediante una parabola. Para cada aberracion es por tanto posible, a 40 partir de tres valores del parametro en cuestion obtenidos mediante la unidad de control 405 mediante una operacion espedfica del elemento de modificacion de frente de onda 404 que corresponde a cada aberracion considerada, reconstruir la parabola que mejor representa esta variacion y deducir el valor optimo de la aberracion. Al repetir este proceso de optimizacion para cada aberracion, es posible deducir los parametros de control optimos para el elemento de modificacion de fase 404, es decir, la forma del frente de onda que permite optimizar la imagen 45 obtenida mediante la compensacion de los defectos introducidos a lo largo del camino optico.

En otro ejemplo, la imagen se calcula tomando el valor absoluto de la diferencia de dos senales de interferencia que tienen un desfase de n, o mediante la busqueda de la media de un numero determinado de imagenes calculado de esta manera. En este caso, un parametro estadfstico caractenstico de la imagen puede ser, por ejemplo, el valor medio de los puntos de la imagen, la desviacion estandar o el contraste, que es igual a la relacion entre la 50 desviacion estandar y la media.

En una variante, y, en particular si el campo es amplio, es posible trabajar unicamente en una parte de la imagen. Esto se debe a que es posible que una correccion "media" hecha en la imagen entera puede no ser optima para todo

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el campo. En este caso, es preferible trabajar unicamente sobre una parte de la imagen, o incluso hacer una serie de correcciones sucesivas en varias partes de la imagen y luego recombinar estas imagenes diferentes.

En una variante, un filtro optico variable 406 puede estar previsto en uno de los brazos del interferometro, por ejemplo, el brazo de referencia. El proposito del filtro optico es el de ajustar la intensidad luminosa relativa de las ondas de referencia y objeto. Esto es debido a que el solicitante ha demostrado que la senal de interferencia optima, y por consiguiente el contraste de imagen optimo, se obtiene cuando la intensidad luminosa relativa de los dos brazos es sustancialmente equivalente. Usando este sistema, la senal OCT que se obtiene puede ser optimizada mediante un dispositivo adaptativo que permite las variaciones de reflectividad de diferentes muestras biologicas. La intensidad luminosa del brazo del interferometro en cuestion se puede optimizar, por ejemplo, mediante el uso de un conjunto de filtros opticos diferentes e intercambiables, teniendo cuidado de incluir un medio en el otro brazo del interferometro para compensar la diferencia de marcha y la dispersion introducidas por el filtro en cuestion, tal como una placa transparente con una cara plana y paralela 407, hecha del mismo material y con el mismo espesor que el filtro en cuestion.

Las figuras 5A y 5B muestran dos variantes de realizacion de un microscopio interferencial de campo completo de acuerdo con la invencion. La figura 5A muestra un microscopio interferencial 5 basado en un interferometro de tipo Michelson 100, y la figura 5B muestra un microscopio interferencial 6 basado en un interferometro de tipo Mirau l0o. En estos dos dibujos, los elementos identicos a los del conjunto mostrado en la figura 4 se indican con las mismas referencias.

En el ejemplo de la figura 5A, el interferometro 100 comprende un unico objetivo de microscopio 501 y una placa divisora de haz para formar el brazo de referencia que contiene el espejo de referencia 105 y el elemento de modulacion 111 del espejo, y el brazo objeto que contiene la muestra 506 y el elemento optico de modificacion de fase 404. Una ventaja de este dispositivo es que permite usar un unico objetivo, reduciendo asf al mmimo las aberraciones diferenciales entre los dos brazos del interferometro de tipo Linnik descrito anteriormente.

En el ejemplo de la figura 5B, el interferometro 100 comprende un unico objetivo de microscopio 503 en cuya salida esta dispuesto el espejo de referencia 105 montado en la pletina de traslacion 111, y una placa semireflectante 504 para formar el brazo de referencia y el brazo objeto en el que se encuentran la muestra 506 y el elemento optico de modificacion de fase 404. Como en el caso anterior, este dispositivo utiliza un solo objetivo.

Aunque se ha descrito a traves de un determinado numero de ejemplos de realizacion detallados, el dispositivo de microscopfa interferencial y el metodo de acuerdo con la invencion incorporan otras variantes, modificaciones y mejoras que seran evidentes para una persona experta en la tecnica, entendiendose que tales otras variantes, modificaciones y mejoras estan dentro del campo de aplicacion de la invencion como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Dispositivo de microscop^a interferencial (4) de campo completo de luz incoherente para la formacion de imagenes de una muestra de dispersion volumetrica (106), que comprende:

- una fuente (101) para emitir una onda incidente que tiene una banda espectral dada,

- un dispositivo de interferencia (100) que comprende un brazo de referencia y un brazo objeto, para proporcionar interferencia optica entre una onda de referencia (401) obtenida por reflexion de la onda incidente sobre una superficie reflectante (105) del brazo de referencia y una onda objeto (402) obtenida por la retrodispersion de la onda incidente mediante una seccion de la muestra a una profundidad dada de dicha muestra, cuando dicha muestra se coloca en un plano focal objeto de un objetivo de microscopio (103) colocado en el brazo objeto,

- un dispositivo de adquisicion bidimensional (108) para la adquisicion multicanal de al menos una primera senal de interferencia y de al menos una segunda senal de interferencia resultante de la interferencia optica de dichas ondas de referencia y objeto, teniendo las al menos dos senales de interferencia un desfase producido al hacer variar la diferencia de marcha relativa entre los dos brazos del dispositivo de interferencia, estando dispuesto dicho dispositivo de adquisicion bidimensional en un plano opticamente conjugado con dicho plano focal objeto de dicho objetivo de microscopio del brazo objeto,

- una unidad de procesamiento (403) para calcular una imagen de la seccion de la muestra en base a dichas senales de interferencia primera y segunda,

en el que

- el dispositivo de interferencia comprende ademas un elemento optico de modificacion de fase (404) para modificar la fase del frente de onda de una de dichas ondas de referencia u objeto, y

- el dispositivo de microscopfa comprende una unidad de control (405) para el elemento optico de modificacion de fase, vinculada a la unidad de procesamiento (403), siendo controlado el elemento optico de modificacion de fase (404) mediante la optimizacion de un parametro estadfstico de al menos una parte de la imagen calculada por la unidad de procesamiento, comprendiendo dicho parametro estadfstico al menos uno del valor medio, de la desviacion estandar y del contraste.
2. Dispositivo de microscopfa de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el elemento optico de modificacion de fase (404) esta situado en el brazo objeto para controlar la fase de la onda incidente sobre la muestra.
3. Dispositivo de microscopfa de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el dispositivo de interferencia comprende un objetivo de microscopio (103, 104) en cada uno de los brazos, y el elemento optico de modificacion de fase esta situado en una pupila o en una imagen de la pupila del objetivo de microscopio (103) del brazo objeto.
4. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento optico de modificacion de fase (404) es un espejo deformable.
5. Dispositivo de microscopfa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el calculo de la imagen de la seccion de la muestra comprende la sustraccion de al menos dos senales de interferencia que tienen un desfase de n y el elemento optico de modificacion de fase es controlado por la optimizacion de la desviacion estandar medida en al menos algunos de los valores de los puntos de la imagen calculados de esta manera.
6. Dispositivo de microscopfa de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el calculo de la imagen de la seccion de la muestra comprende, ademas, el calculo del valor absoluto de la sustraccion antes mencionada, y el elemento optico de modificacion de fase se controla mediante la optimizacion del valor medio, de la desviacion estandar o del contraste medido en al menos algunos de los valores de los puntos de la imagen calculada de esta manera.
7. Dispositivo de microscopfa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la optimizacion del parametro estadfstico comprende la medicion del parametro para tres estados del elemento optico de modificacion de fase correspondientes a la introduccion de tres valores dados respectivos de una aberracion optica.
8. Dispositivo de microscopfa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dispositivo de interferencia es del tipo Linnik, que comprende un elemento divisor de haz (102) para formar los brazos objeto y de referencia, y un objetivo de microscopio (103, 104) en cada uno de los brazos.
9. Dispositivo de microscopfa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dispositivo de interferencia comprende un filtro optico variable (406) en uno de sus brazos y una placa (407) en el otro brazo para compensar la diferencia de marcha introducida por el filtro optico variable.

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35
10. Metodo de microscopfa interferencial de campo completo de luz incoherente para la formacion de imagenes de una muestra de dispersion volumetrica (106), que comprende:

- la emision de una onda incidente que tiene una banda espectral dada,

- la interferencia optica entre una onda de referencia (401) obtenida por reflexion de la onda incidente en un espejo (105) de un brazo de referencia del dispositivo de interferencia y una onda objeto (402) obtenida por retrodispersion de la onda incidente mediante una seccion de la muestra a una profundidad dada de dicha muestra, estando la muestra colocada en un plano focal objeto de un objetivo de microscopio (103) colocado en un brazo objeto del dispositivo de interferencia,

- la adquisicion, usando un dispositivo de adquisicion multicanal bidimensional dispuesto en un plano opticamente conjugado con dicho plano focal objeto de dicho objetivo de microscopio del brazo objeto, de al menos una primera senal de interferencia y de al menos una segunda senal de interferencia resultante de la interferencia de las ondas de referencia y objeto, teniendo las al menos dos senales de interferencia un desfase producido por la variacion de la diferencia de marcha relativa entre los dos brazos del dispositivo de interferencia,

- el procesamiento de las senales de interferencia primera y segunda para calcular una imagen de la seccion de la muestra,

- el control de la fase de la onda incidente sobre la muestra mediante la optimizacion de un parametro estadfstico de al menos una parte de la imagen calculada en base al procesamiento de las senales de interferencia, comprendiendo dicho parametro estadfstico al menos uno del valor medio, de la desviacion estandar y del contraste.
11. Metodo de microscopfa de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el calculo de la imagen de la seccion de la muestra comprende la sustraccion de al menos dos senales de interferencia que tienen un desfase de n, y la fase de la onda incidente sobre la muestra es controlada mediante la optimizacion de la desviacion estandar medida en al menos algunos de los valores de los puntos de la imagen.
12. Metodo de microscopfa de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el calculo de la imagen de la seccion de la muestra comprende, ademas, el calculo del valor absoluto de la sustraccion antes mencionada, y la fase de la onda incidente sobre la muestra se controla mediante la optimizacion del valor medio, de la desviacion estandar o del contraste medido en al menos algunos de los valores de los puntos de la imagen.
13. Metodo de microscopfa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el control de la fase de la onda incidente sobre la muestra comprende, para una aberracion optica dada, la medicion de un numero determinado de valores del parametro estadfstico despues de la introduccion del mismo numero de valores de la aberracion optica en la fase de la onda incidente sobre la muestra, donde el calculo del valor de la aberracion maximiza el valor del parametro, y la introduccion del valor de la aberracion en la fase de la onda incidente sobre la muestra.
14. Metodo de microscopfa de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que el numero de valores de la aberracion optica introducida es tres.