ES2553877T3 - 5'-trifosfato-oligonucleótido con extremo romo y sus utilizaciones - Google Patents

Abstract

Un preparado de oligonucleótido que comprende una población homogénea de un oligonucleótido, en donde el oligonucleótido tiene dos extremos romos, en donde los extremos romos son extremos de una sección totalmente bicatenaria, y en donde la sección totalmente bicatenario es por lo menos de 21 pares de bases de longitud, y el oligonucleótido bicatenario tiene un extremo romo que lleva un 5'-trifosfato unido a la mayoría de 5'-ribonucleótido y un segundo extremo romo que no lleva un 5'-trifosfato, en donde el oligonucleótido comprende al menos 1, preferiblemente al menos 3, más preferiblemente al menos 6 ribonucleótidos en el extremo 5' en el extremo romo que lleva el 5'-trifosfato, y en donde el 5'-trifosfato no tiene ninguna estructura de terminación.

Description

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DESCRIPCION

5'-trifosfato-oligonucleotido con extremo romo y sus utilizaciones Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la inmunoterapia y del descubrimiento de farmacos. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a un preparado oligonucleotfdico que comprende una poblacion homogenea de un oligonucleotido, a una composicion farmaceutica que comprende al menos uno de los preparados oligonucleotfdicos, a la utilizacion de al menos uno de los preparados oligonucleotidicos para la preparacion de un medicamento y a un metodo in vitro para provocar la produccion de IFN tipo I en una celula.

Antecedentes de la invencion

La presencia de acidos nucleicos vmcos representa una senal de peligro para el sistema inmunitario que inicia una respuesta antivmca para impedir la replicacion vmca y eliminar el patogeno invasor1. La respuesta al interferon (IFN) es un componente importante de la respuesta antivmca y comprende la produccion de los iFn de tipo I, IFN-a e IFN- p. Una respuesta antivmca tambien comprende la produccion de diversos otras citocinas, tales como IL-12, que favorecen la inmunidad innata y adaptativa 1.

Con el fin de detectar acidos nucleicos extranos, los inmunocitos estan equipados con un conjunto de receptores de reconocimiento de patrones (RRP) que actuan en la primera lmea del proceso de reconocimiento y que pueden agruparse en dos clases principales: los receptores tipo Toll y las ARN helicasas.

Los miembros de la familia del receptor tipo Toll (TLR) han estado implicados en la deteccion de ARNdc largo (TLR3)2, ARNmc (TLR7 y 8)3 4, ARNdc corto (TLR7) 5y CpG ADN (TLR9)6 Los TLR residen principalmente en las membranas endosomicas de los inmunocitos 7,8 y reconocen los acidos nucleicos vmcos que han sido absorbidos por los inmunocitos en los compartimentos endosomicos 9

Las ARN helicasas, tales como RIG-I, MDA-5 y LGP-2, han estado implicadas en la deteccion de ARN vmcos 10'11. A diferencia de los TLR, las ARN helicasas son citosolicas y se expresan en un amplio espectro de tipos de celulas, incluyendo los inmunocitos y las celulas no inmunes, tales como fibroblastos y celulas epiteliales 12 Por lo tanto, no solo los inmunocitos, sino tambien las celulas no inmunes que expresan una o mas de la(s) helicasa(s) de ARN, son capaces de detectar y responder al ARN vmco.

Tanto los TLR como los sistemas de ARN helicasa cooperan para detectar de manera optima ARN vmco.

Dada la abundancia de ARN anfitrion presente en el citoplasma, es una tarea compleja detectar espedficamente y de forma fiable ARN procedente de un virus. Se necesita sensibilidad maxima junto con un alto grado de especificidad para "no-auto". Dos mecanismos principales parecen estar en su lugar en las celulas de vertebrados para distinguir acidos nucleicos "no-auto" de "auto" mediante un sistema de reconocimiento basado en el receptor de protemas: (1) la deteccion de una compartimentacion espedfica de patogenos, y (2) la deteccion de una firma o un motivo molecular espedfica de patogenos.

El ARN endosomico es reconocido por los TLR como "no-auto" 4. Notablemente, el ARN anfitrion puede adquirir la capacidad de estimular una respuesta al IFN mediante la activacion de los TLR en determinadas situaciones patologicas 13

Ademas, existen motivos estructurales o firmas moleculares que permiten a los receptores de reconocimiento de patrones (RRP) determinar el origen de un ARN. Por ejemplo, se ha propuesto ARN bicatenario largo para estimular

una respuesta a IFN a traves de TLR3 2, RIG-I 11 y MDA-5 14 Los presentes inventores identificaron recientemente el resto 5'-trifosfato de transcritos de ARN vmcos como el ligando para RIG-I 15,19 A pesar de que los transcritos de ARN de anfitrion endogeno nuclear naciente inicialmente tambien contienen un 5'-trifosfato, varias modificaciones nucleares tras la transcripcion, incluidos el 5' de terminacion de la cadena, la division endonucleolttica, y modificaciones de bases y de la cadena principal, de las transcripciones del ARN naciente llevan a madurar ARN citoplasmicos que son ignorados por RlG-I. Ademas, los ARNdc cortos con extremos romos sin ningun grupo 5'- fosfato 16 o con 5' monofosfato 24 se ha propuesto tambien para estimular RIG-I. Todavfa no se ha publicado ninguna firma molecular claramente definida para los TLR, TLR7 y TLR8 detectores del ARNmc. Sin embargo, el hecho de que determinados motivos de secuencias son mejor reconocidos que otros por los TLR sugiere que la composicion nucleotfdica del ARN, en la parte superior de la localizacion endosomica, puede representar la base para discriminar entre "auto" y "no-auto" por los TLR -5,10, 11, 17,18

La solicitud de patente internacional WO 2008/017473 A2 describe la estructura y utilizacion de 5' fosfato- oligonucleotidos que son reconocidos por RIG-I lo que conduce a la induccion de la produccion de IFN tipo I, IL-18 e IL-1p.

Bowie A.G. y Fitzgeral K.A. (Trends in Immunology, vol. 28, n° 4, 27 de marzo de 2007, pags. 147-150) proporcionan un compendio de varias estrategias celulares para distinguir entre acidos auto-nucleicos extranos y abundantes a fin de proteger una celula anfitriona de patogenos invasores. Entre otros, Bowie A.G. y Fitzgeral K.A. se refieren a RIG-I

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que es uno de los diversos receptores patron de reconocimiento que se une directamente a un grupo 5'-trifosfato de determinados genomas de ARN vmico.

A pesar de su funcion fundamental en la defensa antivmca, el mecanismo de reconocimiento del ARN vmco por RIG-I no esta todavfa completamente aclarado. Por lo tanto, hay necesidad en la tecnica de comprender mejor el reconocimiento por RIG-I del ARN vmco y/o de otro no auto. Ademas, dada la eficacia de IFN-a en diversas aplicaciones clmicas, existe una necesidad en la tecnica de proporcionar agentes alternativos para inducir la produccion de IFN-a in vitro e in vivo.

Es por tanto un objetivo de la presente invencion identificar aun mas los motivos estructurales o firmas moleculares de una molecula de ARN que son reconocidos por RIG-I. Es otro objetivo de la presente invencion preparar moleculas de ARN que sean capaces de activar RIG-I y provocar una respuesta antivmca, en especial, un IFN, en celulas que expresan a RIG-I. Es un objetivo adicional de la presente invencion utilizar dichas moleculas de ARN para provocar una respuesta antivmca, en especial, un IFN, in vitro e in vivo. Es un objeto final de la presente invencion la utilizacion de dichas moleculas de ARN para prevenir y/o tratar enfermedades o afecciones 1): mas espedficamente, las que se beneficianan de una respuesta antivmca, en especial, un IFN, tales como infecciones, tumores/canceres y trastornos inmunitarios.

Compendio de la invencion

El problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante el tema en discusion de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las reivindicaciones preferidas pueden extraerse de las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Mas espedficamente, en un primer aspecto el problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante una preparado oligonucleotidico que comprende una poblacion homogenea de un oligonucleotido,

en donde el oligonucleotido tiene dos extremos romos,

en donde el oligonucleotido comprende al menos 1, preferiblemente al menos 3, mas preferiblemente al menos 6 ribonucleotido(s) en el extremo 5' del extremo romo,

en donde los extremos romos son extremos de una seccion completamente bicatenaria, y en donde la seccion completamente bicatenaria tiene una longitud de 21 pares de bases, y el oligonucleotido bicatenario tiene un extremo romo que lleva un 5'-trifosfato unido a la mayona de 5'-ribonucleotidos y un segundo extremo romo que no lleva un 5'-trifosfato,

en donde el oligonucleotido comprende al menos 1, preferiblemente al menos 3, mas preferiblemente al menos 6 ribonucleotido(s) en el extremo 5' del extremo romo que lleva el 5'-trifosfato, y

en donde el 5'-trifosfato no lleva ninguna estructura de terminacion.

En una realizacion, al menos el 85% de los oligonucleotidos en el preparado tienen la misma identidad qmmica o composicion qmmica.

En una realizacion, la seccion completamente bicatenaria tiene una longitud de 24 pares de bases.

En una realizacion, el oligonucleotido comprende al menos una inosina.

En una realizacion, la mayona de 5'-ribonucleotidos con el trifosfato unido a se selecciona de A, G, U o C, preferiblemente A o G.

En una realizacion espedfica, la secuencia de los 4 primeros ribonucleotidos en el extremo 5' se selecciona de: AAGU, AAAG, AUGG, AUUA, AACG, AUGA, AGUU, AUUG, AACA, AGAA, AGCA, AACU, AUCG, AGGA, AUCA, AUGC, AGUA, AAGC, AACC, AGGU, AAAC, AUGU, ACUG, ACGA, ACAG, AAGG, ACAU, ACGC, AAAU, ACGG, AUUC, AGUG, ACAA, AUCC, AGUC, en donde la secuencia esta en la direccion 5' ^ 3'.

En una realizacion, el oligonucleotido no presenta modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en pseudouridina, 2-tiouridina, 2'-fluorina-dDTP y NTP 2'-O-metilado, o el oligonucleotido contiene nucleotidos modificados que no ponen en peligro la actividad inductora de IFN tipo I.

En una realizacion, el oligonucleotido comprende al menos un motivo estructural reconocido por al menos uno de TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9.

En una realizacion, el oligonucleotido tiene actividad de silenciamiento genico.

El problema subyacente en la presente invencion se resuelve en un segundo aspecto mediante una composicion farmaceutica que comprende al menos un preparado oligonucleotidico de la presente invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion, la composicion farmaceutica comprende ademas al menos un agente seleccionado de un agente inmunoestimulante, un agente antivmco, un agente antibacteriano, un agente antitumoral, acido retinoico, IFN-a e IFN- p.

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Mas espedficamente, en un tercer aspecto el problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante la utilizacion de al menos un preparado oligonucleotfdico del primer aspecto para la preparacion de un medicamento adecuado para inducir la produccion de IFN tipo I.

Mas espedficamente, en un cuarto aspecto el problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante la utilizacion de al menos un preparado oligonucleotfdico del primer aspecto para la preparacion de un medicamento para su utilizacion en la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad o afeccion seleccionada de una infeccion, un tumor y un trastorno inmunitario.

En una realizacion del tercer y cuarto aspectos el preparado oligonucleotidico del primer aspecto es para su utilizacion en combinacion con al menos un agente seleccionado de un agente inmunoestimulante, un agente antivmco, un agente antitumoral, acido retinoico, IFN-a e IFN-p.

En una realizacion del tercer y cuarto aspectos el medicamento es para su administracion en combinacion con al menos un tratamiento seleccionado de un tratamiento profilactico y/o terapeutico de una infeccion, un tumor y un trastorno inmunitario.

Mas espedficamente, en un quinto aspecto el problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante un metodo in vitro para inducir la produccion de IFN tipo I en una celula, que comprende las etapas siguientes:

(a) mezclar al menos un preparado oligonucleotidico del primer aspecto con un agente de complejacion; y

(b) poner en contacto una celula con la mezcla de (a), en donde la celula expresa a RIG-I.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. El reconocimiento de 3pARN se produce a traves de vfas diferenciales en monocitos y las CDP. (A) Los monocitos y las CDP se incubaron previamente con 1.000 ng/ml de cloroquina (barras blancas) o se dejo sin tratar (barras negras). Despues de 30 min las celulas se estimularon con 3pARN GA o 3pARN GFP complejado con lipofectamina (como se indica) o referencia (sin acido nucleico). Se recogieron los sobrenadantes 20 h despues de la estimulacion y se determino la produccion de IFN-a por ELISA. Los resultados son representativos de dos experimentos y se muestra la media ± SEM. (B) CDP clasificadas de cultivos naturales de medula osea inducidas por Flt3-L (WT; barras negras) y ratones carentes de TLR7 (TLR7'/_; barras blancas) se transfectaron con 200 ng de SynARN, 3pARN y CpG ODN22l6 (3 pg/ml). Despues de 24 h, se determino la produccion de IFN-a por ELISA. Los datos se expresan en media ± SEM de dos experimentos independientes.

Figura 2. El ARN bicatenario sintetico con el extremo romo es un inductor deficiente de IFN-a en monocitos. (A-B) ARN monocatenario y ARN bicatenario sinteticos con (27+2) o sin (27+0) 2-nt prolongaciones se transfectaron en las CDP y monocitos en complejo con lipofectamina 2000. CpG ODN 2216 (3 pg/ml) y 3pARN GFP (200 ng ) se usaron como un estfmulo de referencia positiva para TLR y RIG-I, respectivamente. Los niveles de produccion de IFN-a se analizaron por ELISA 24 horas despues de la estimulacion y se representan como media ± SEM de dos experimentos independientes.

Figura 3. Diseno experimental: se utilizaron oligonucleotidos de ARN sintetico para probar el efecto de la estructura final de la actividad inmunoestimulante de 3pARN bicatenario.

Figuras 4-6. El extremo romo en el extremo que lleva el 5'-trifosfato aumenta la actividad inmunoestimulante de oligonucleotidos de 3pARN bicatenario sinteticos. Los monocitos purificados, las CMSP con escasas CDP y las CMSP pretratadas con cloroquina se transfectaron con los oligonucleotidos de ARN sintetico monocatenario o bicatenario indicados. La produccion de IFN-a se analizo 24 horas despues de la estimulacion. Los datos de tres o cuatro donantes independientes se resumieron y se representan como valores medios ± SEM.

Figuras 7. Los oligonucleotidos de ARN monocatenario pueden obtenerse por transcripcion in vitro. (A) Oligonucleotidos bicatenarios o monocatenarios transcritos in vitro, sinteticos o mixtos se transfectaron en monocitos purificados. La produccion de IFN-a se analizo 24 horas despues de la estimulacion. (B) Electroforesis en gel de poliacrilamida urea. (C) Secuencia de los oligonucleotidos ensayados.

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Descripcion detallada de la invencion

Inicialmente, se publico que los ARNip (ARN interferente pequeno) transcritos in vitro que llevan 5'-trifosfato, pero no ARNip sinteticos que llevan OH en 5', estimulaban la produccion de IFN tipo I de estirpes celulares seleccionadas 20,21. Sin embargo, el mecanismo molecular que condujo a la induccion de IFN tipo I no se conoda.

Posteriormente, se publico que los ARNdc largos transcritos in vitro (igual o mas largo que 50 pb) fueron detectados por RIG-110

Casi al mismo tiempo, se publico que los ARNdc cortos de 21-27 pb de longitud sinteticos con extremos romos y sin ningun grupo fosfato en 5' eran ligandos para RIG-116 Ademas, se publico que las prolongaciones en 3' de 2- nucleotidos, y en menor medida, las prolongaciones en 5', inactivaban RIG-I 16 Se propuso que el extremo romo era la firma molecular reconocida por RIG-I.

Poco despues, ARNmc corto transcrito in vitro y ARNdc que lleva 5'-trifosfato se identificaron como los ligandos para RIG-I15,19 Ademas, se demostro que los ARN bicatenarios cortos transcritos in vitro que tienen las mismas secuencias como los utilizados en Marques T.J. et al. (2006)16 estimulaban la produccion de IFN-a en monocitos humanos primarios purificados en la misma medida, independientemente de si el ARN bicatenario tema extremos romos o prolongaciones en 3'15 En otras palabras, en presencia de 5'-trifosfato, la estructura del extremo de un oligonucleotido de ARN bicatenario no afecto a la actividad inductora de IFN-a del oligonucleotido; la presencia de prolongaciones en 3' no inactivo a RIG-I. Este resultado confirma la nocion de que 5'-trifosfato es una firma molecular reconocida por RIG-I y lo activa 15,19 y sugiere que el extremo romo no es una firma molecular que activa a RIG-I16

Al mismo tiempo, se publico que el ARN genomico monocatenario de la gripe A que lleva 5' fosfatos fue reconocido por RIG-I25

Mas recientemente, se publico que el dominio regulador DR en el terminal C de RIG-I fue responsable del reconocimiento del 5'-trifosfato en ligandos de ARN monocatenario transcritos in vitro 26

Casi al mismo tiempo, se publico que el ARNdc de 25 nucleotidos de largo con un 5' monofosfato era tambien un ligando para RIG-I24 Ademas, se confirmo que el ARNmc que lleva 5'-trifosfato era un ligando para RIG-I24 Por otra parte, se publico que un ARNdc de extremos romos que lleva un 5' monofosfato era mas potente en la induccion de una respuesta a IFN que la que tienen prolongaciones en 3'24 Sin embargo, en contra de toda logica, se publico tambien que 5' monofosfato en ARNdc no era necesario para la interaccion con el dominio de RIG-I en el terminal C mientras que 5'-trifosfato interactuaba con el dominio en el terminal C. Ademas, se publico que la capacidad de un oligonucleotido de ARNdc para provocar una respuesta a IFN estaba inversamente correlacionada con la actividad de desenrollado por el dominio de helicasa, lo que contradice el informe anterior de que el extremo romo que no solo se necesitaba para la induccion de una respuesta a IFN, sino tambien para la actividad de helicasa 16

Ademas muy recientemente, se publico que la presencia de 2 o 3 G en el extremo 5' final de los shARN generado por transcripcion in vitro erradico la capacidad del ARN que lleva 5'-trifosfato de soporte para inducir la produccion de IFN-p por la ruta de RIG-I30. Cabe destacar que los shARN que llevan dos G en 5', que teman dos pares de bases G-U bamboleandose en el extremo, es decir, un extremo romo, eran completamente inactivos para provocar una respuesta a IFN.

En resumen, se ha publicado que un numero de moleculas de ARN estructuralmente diferentes son el ligando para RIG-I y diferentes firmas moleculares se han propuesto para ser reconocidas por RIG-I. Los datos en la tecnica anterior eran incongruentes y, a veces estaban en conflicto con respecto a las firmas moleculares que eran importantes para la activacion de RIG-I. En otras palabras, no existfa consenso en la tecnica anterior con respecto a la(s) firma(s) molecular(es) cntica(s) para el reconocimiento y la activacion de RIG-I.

A pesar de que varios tipos de inmunocitos, tales como monocitos, celulas dendnticas plasmocitoides (CDP), y celulas dendnticas mieloides (CDM), son capaces de producir IFN-a en respuesta a la estimulacion por oligonucleotidos de ARN bicatenario que llevan 5'-trifosfato (en lo sucesivo, "3pARN"; datos no publicados de los presentes inventores), en el reconocimiento de dichos oligonucleotidos de 3pARN bicatenario parece ser que intervienen como mediadores diferentes receptores en diferentes tipos de celulas. Mientras que las CDP parecen utilizar TLR7 principalmente, los monocitos parecen utilizar RIG-I principalmente (Ejemplo 1; figura 1). De hecho, CDP es el unico tipo de celula que produce una cantidad significativa de IFN-a tras la estimulacion con un ligando de TLR apropiado. En cambio, otros inmunocitos, tales como las celulas mieloides, producen citocinas distintas de IFN- a en respuesta a la estimulacion por ligandos de TLR. Por lo tanto, los monocitos (sin contaminar las CDP funcionales) son ideales para estudiar el mecanismo de reconocimiento de ligandos y la activacion de RIG-I, con la produccion de IFN-a como la lectura.

Los presentes inventores estimularon los monocitos humanos primarios purificados con el mismo ARN bicatenario corto sintetico con extremos romos sin ningun 5' fosfato como el utilizado en Marques T.J. et al. (2006)16, y descubrieron sorprendentemente que no habfa produccion de IFN-a (Ejemplo 2; figura 2, muestra "27+0 ds"). Ademas, los presentes inventores estimularon monocitos humanos primarios purificados con un ARNdc corto sintetico con extremos romos que lleva un 5'-fosfato similar al utilizado en Takahasi et al. (2008) 24, y descubrieron sorprendentemente que habfa poca o ninguna produccion de IFN-a (Ejemplo 3; figura 6, muestras con "PA" en la

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denominacion). Estos resultados contradicen las sugerencias en la tecnica anterior que el extremo romo era una firma molecular reconocida por RIG-I y era capaz de activar RIG-I en ausencia de 5'-trifosfato 16,24

Sin embargo, muy sorprendentemente, cuando los presentes inventores estimulaban monocitos humanos primarios purificados con oligonucleotidos de ARNdc sinteticos que llevan un 5'-trifosfato, descubrieron que la actividad inductora de IFN de los oligonucleotidos de ARNdc aumentaba drasticamente cuando el extremo que lleva el trifosfato 5' estaba romo (Ejemplo 3; figuras 4-6, muestras "3P-X + AS X24", "3P-X + AS X24 + A", "3P-X + AS X24+2A", "3P-X + AS X23"). Los mismos resultados se obtuvieron con celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) empobrecidas en CDP o CMSP pretratadas con cloroquina, en las que se excluyeron los casos de produccion de IFN-a a partir de CDP.

Este descubrimiento es sorprendente ya que contradice informe anterior que la presencia de extremos romos no aumentaba la actividad inductora en IFN del ARNdc que lleva 5'-trifosfato 15 Ademas, este descubrimiento demuestra por primera vez que el extremo romo tiene que estar en el mismo lado que el 5'-trifosfato para ser reconocido por RIG-I y activarlo.

Este sorprendente descubrimiento sugiere que tanto 5'-trifosfato como el extremo romo son firmas moleculares reconocidas por RIG-I. Mientras que 5'-trifosfato es la firma molecular primaria reconocida por RIG-I, el extremo romo es la secundaria que no es capaz de activar RIG-I por sf solo, pero es capaz de aumentar la activacion de RIG- I en presencia de 5'-trifosfato. Ademas, el hecho de que el efecto de aumento de actividad del extremo romo se observaba solamente cuando el extremo romo estaba en el extremo que llevaba el 5'-trifosfato sugiere que 5'- trifosfato y el extremo romo son reconocidos por dominios funcionales o subdominios de RIG-I que son adyacentes entre sf en la estructura tridimensional. En particular, es muy probable que 5'-trifosfato y el extremo romo sean reconocidos por el mismo dominio de RIG-I, el dominio regulador en el terminal C.

El presente descubrimiento es sorprendente tambien porque los presentes inventores descubrieron que los oligonucleotidos del ARNdc cortos de 21 pares de bases (pb) como maximo eran capaces de activar RIG-I e inducir la produccion significativa de IFN-a cuando llevaban 5'-trifosfato y un extremo romo, lo que contrasta con la sugerencia de Marques et al. (2006) de que se requena una longitud de 25 pb para activacion consistente de RIG-

I 16

Por otra parte, los presentes inventores descubrieron que la actividad activadora de RIG-l e inductora de IFN-a de un ARNdc que lleva 5'-trifosfato y extremo romo dependfan de la identidad del 5' nucleotido que lleva el 5'- trifosfato. Mientras que un ARN bicatenario que tiene una 5'-adenosina (A) era mas potente que la que tiene una 5'- guanosina (G) o la que tiene un 5'-uridina (U), todas eran mas potentes que la que tiene una 5'-citidina (C).

Sin estar ligado por ninguna teona, se plantea la hipotesis de que los oligonucleotidos de ARN bicatenarios sintetizados qmmicamente son esencialmente poblaciones homogeneas, en donde los oligonucleotidos en cada poblacion estan qmmicamente bien definidos y tienen esencialmente la misma longitud, secuencia y estructuras finales. Por el contrario, los oligonucleotidos del ARNdc obtenidos por transcripcion in vitro tienen longitudes y estructuras finales variables.

Los presentes inventores de este modo han identificado oligonucleotidos de ARNdc bicatenarios sinteticos que llevan al menos un 5'-trifosfato y al menos un extremo romo en el mismo extremo que el 5'-trifosfato, con una referencia para A como el nucleosido que lleva 5'-trifosfato, como agentes muy potentes para activar RIG-I e inducir la produccion de IFN tipo I de las celulas que expresan RIG-l.

Definiciones

Como se utiliza en la presente memoria, "un" y "una" se refieren no solamente a un solo individuo, sino tambien a un grupo o especie de entidades a menos que se indique de otra manera.

Todos los terminos utilizados en la presente memoria tienen los significados que estan establecidos en la tecnica a menos que se indique de otra manera. Las tecnicas descritas en la presente memoria pueden ser realizadas por un experto en la tecnica siguiendo la presente descripcion y/o protocolos establecidos, tales como los descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbour Laboratory, Nueva York), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 2007, John Wiley & Sons, Nueva York) y Current Protocolos in Immunology (Coligan et al., 2007, John Wiley & Sons, Nueva York).

Las expresiones "un oligonucleotido de ARN que lleva 5'-trifosfato", " oligonucleotido de ARN trifosfato" y "oligonucleotido de 3pARN" se utilizan indistintamente.

Las expresiones "motivo estructural" y "firma molecular" se utilizan indistintamente.

Oligonucleotidos

La presente invencion proporciona un preparado oligonucleotidico como se define en las reivindicaciones que comprende una poblacion homogenea de un oligonucleotido y que es capaz de activar a RIG-I y provocar una respuesta antivmca, en especial, una respuesta a IFN tipo I, mas espedficamente, una respuesta a IFN-a.

El oligonucleotido tiene dos extremos romos y comprende al menos 1 ribonucleotido en el extremo 5' en el extremo romo, en donde un extremo romo lleva un 5'-trifosfato unido al 5 'ribonucleotido, en donde el 5'-trifosfato no lleva ninguna estructura de terminacion, y en donde el extremo romo va seguido de una seccion totalmente bicatenaria

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que tiene al menos 21 pares de bases (pb) de longitud. En otras palabras, el extremo romo es un/el extremo de la seccion totalmente bicatenaria.

Por "totalmente bicatenaria", se entiende que la seccion bicatenaria no esta interrumpida por ningunas estructuras monocatenaria. Una seccion oligonucleotidica es totalmente bicatenaria cuando las dos cadenas que forman la seccion tienen la misma longitud y las secuencias de las dos cadenas son 100% complementarias entre sr Como se demuestra en la tecnica, se dice que dos nucleotidos son complementarias entre sf si pueden formar un par de bases, ya sea un par de bases Waston-Crick (A-U, G-C) o un par de base oscilante (U-G, U-A, I-A, I-U, I-C).

La seccion bicatenaria tiene preferiblemente al menos 22 pb, mas preferiblemente 23 pb, aun mas preferiblemente al menos 24 pb de longitud. La seccion bicatenaria tiene preferiblemente como maximo 60 pb, mas preferiblemente como maximo 50 pb, aun mas preferiblemente como maximo 40 pb, mas preferiblemente al menos 30 pb de longitud.

El oligonucleotido tiene preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, mas preferiblemente al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, aun mas preferiblemente, al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, mas preferiblemente, al menos 19, 20, 21 ribonucleotidos en el extremo 5' de la cadena que lleva el 5'-trifosfato. En la realizacion mas preferida, la seccion totalmente bicatenaria se compone exclusivamente de ribonucleotidos.

En una realizacion, el oligonucleotido es un oligonucleotido de ARN. En otra realizacion, el oligonucleotido es un hforido ADN-ARN.

Por "una poblacion esencialmente homogenea", se entiende que los oligonucleotidos contenidos en el preparado tienen esencialmente la misma identidad qmmica (o composicion qmmica), incluida la misma secuencia de nucleotidos, eje central, modificaciones, longitud y estructuras finales. En otras palabras, los oligonucleotidos contenidos en el preparado estan qmmicamente definidos y son esencialmente identicos entre sf. En particular, se entiende que al menos 85%, preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95%, aun mas preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, mas preferiblemente al menos 99% de los oligonucleotidos en el preparado tienen la misma identidad qmmica (o composicion qmmica), incluida la misma secuencia de nucleotidos, eje central, modificaciones, longitud y estructuras finales. En otras palabras, el preparado es al menos 85%, preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95%, aun mas preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, mas preferiblemente al menos 99% puro. La pureza y la identidad qmmica (o composicion qmmica) de un preparado oligonucleotfdico pueden ser determinados facilmente por un experto en la tecnica utilizando cualquiera de los metodos apropiados, tales como electroforesis en gel (en especial, electroforesis en gel desnaturalizante), HPLC, espectrometna de masas (p. ej., MALDI-ToF MS), y secuenciacion.

En una realizacion, el oligonucleotido es un oligonucleotido bicatenario.

Espedficamente, el oligonucleotido bicatenario es uno en donde al menos una de las cadenas comprende al menos 1, preferiblemente al menos 3, mas preferiblemente al menos 6 ribonucleotido(s) en el extremo 5', en donde la cadena que comprende al menos 1 ribonucleotido en el extremo 5' tiene un trifosfato unido a la mayona de 5'- ribonucleotidos, en donde el trifosfato no presenta ninguna estructura de terminacion y en donde el oligonucleotido tiene dos extremos romos.

Se describe que el oligonucleotido bicatenario es totalmente bicatenario tiene un extremo romo que lleva el 5'- trifosfato y una prolongacion en 5' de 1,2, 3 o mas nucleotidos en el otro extremo que puede o no puede llevar un 5'- trifosfato. En otra realizacion, el oligonucleotido bicatenario tiene un extremo romo que lleva el 5'-trifosfato y una prolongacion en 3' de 1, 2, 3 o mas nucleotidos en el otro extremo que puede o no puede llevar un 5'-trifosfato. En aun otra realizacion, el oligonucleotido bicatenario tiene un extremo romo que lleva el 5'-trifosfato y un segundo extremo romo que puede o no puede llevar un 5'-trifosfato. En una realizacion adicional, el oligonucleotido bicatenario tiene dos extremos romos que lleva cada uno un 5'-trifosfato. En determinadas realizaciones, la prolongacion en 5' o 3' tiene 3 nucleotidos o menos, preferiblemente 2 o menos.

Se describe que el oligonucleotido bicatenario tiene un 5'-trifosfato. El oligonucleotido bicatenario puede tener dos 5'- trifosfatos. En una descripcion preferida, el segundo 5'-trifosfato tambien esta unido a un 5'-ribonucleotido.

El oligonucleotido bicatenario es de al menos 21 pb de longitud, En donde la longitud se refiere al numero de pares de bases de la seccion continua del oligonucleotido que es totalmente bicatenario. En otras palabras, la longitud de la prolongacion esta excluido de "la longitud del oligonucleotido bicatenario". Por "continuo", se entiende que la seccion del oligonucleotido es totalmente bicatenario y no esta interrumpida por ninguna estructura monocatenaria. Preferiblemente, el oligonucleotido es de al menos 22 pb, mas preferiblemente al menos 23 pb y aun mas preferiblemente al menos 24 pb de longitud. Preferiblemente, el oligonucleotido bicatenario es como maximo de 60 pb, mas preferiblemente como maximo de 50 pb, aun mas preferiblemente como maximo de 40 pb, y aun mas preferiblemente como maximo de 30 pb de longitud.

En una realizacion, el oligonucleotido bicatenario es un homoduplex. Por "homoduplex", se entiende que las dos cadenas que forman el oligonucleotido tienen exactamente la misma longitud y secuencia en la orientacion 5' a 3'. Un homoduplex puede formarse cuando cada cadena que forma el oligonucleotido bicatenario tiene una secuencia que es 100% auto-complementaria, lo que significa que la secuencia de la media 5' es 100% complementaria con la de la media 3'.

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En la tecnica se conocen varios metodos para la produccion de oligonucleotidos. Sin embargo, con el fin de obtener una poblacion esencialmente homogenea de un oligonucleotido bicatenario, el metodo de preparacion preferido es la smtesis qmmica. El metodo o procedimiento concreto de smtesis qmmica no es importante; solo es importante que el oligonucleotido sintetizado se purifique y se controle la calidad de tal manera que el preparado oligonucleotidico contenga esencialmente una poblacion homogenea de oligonucleotidos que tengan esencialmente la misma identidad qmmica (o composicion qmmica), incluidas la misma secuencia de nucleotidos, eje central, modificaciones, longitud y estructuras finales. Los oligonucleotidos pueden purificarse mediante cualquiera de los metodos

habituales en la tecnica, tales como electroforesis en gel capilar y HPLC. Los oligonucleotidos sinteticos, ya sea monocatenarios o bicatenarios, obtenidos a partir de la mayona de las fuentes comerciales contienen OH en 5'. Estos oligonucleotidos sinteticos pueden modificarse en el extremo 5' para llevar un 5'-trifosfato por cualesquiera de los metodos apropiados conocidos en la tecnica. El metodo preferido para el enlace 5'-trifosfato es el desarrollado por Janos Ludwig y Fritz Eckstein 27

Alternativamente, puede emplearse transcripcion in vitro. Sin embargo, a fin de obtener las cadenas sencillas para preparar un oligonucleotido bicatenario por transcripcion in vitro, las medidas necesarias que deben tomarse para asegurar que cada cadena sencilla transcrita in vitro deseada es de hecho monocatenaria. Transcritos aberrantes pueden generarse in vitro usando una ARN polimerasa. Por ejemplo, se supone que un transcrito de ARN generado por una ARN polimerasa in vitro puede plegarse sobre sf mismo y cebar la smtesis de ARN dependiente de ARN, lo que conduce a la generacion de transcritos aberrantes de longitudes y secuencias indefinidas y/o no uniformes. Por lo tanto puede emplearse, en principio, cualquier medida que impida la smtesis de ARN cebada por el propio transcrito de ARN.

Por ejemplo, un oligonucleotido monocatenario se disena para tener una secuencia X1-X2-X3- ... Xm-2-Xm-i-Xm. en donde m es la longitud del oligonucleotido, en donde la secuencia no tiene ninguna o la minima autocomplementariedad, en donde X1X2, X3, ..., Xm se seleccionan entre 1, 2 o 3 de los 4 nucleotidos convencionales A, U, C y G, en donde al menos uno de los nucleotidos que son complementarias de cualquiera de Xm-2, Xm-i y Xm, es decir, Ym-2, Ym-i e Ym no esta entre los 1, 2, o 3 nucleotidos seleccionados para Xi, X2, X3,

...,Xm.

Una plantilla de ADN apropiada para la generacion de dicho ARN de dicho oligonucleotido monocatenario puede generarse utilizando cualquiera de los metodos apropiados conocidos en la tecnica. Una reaccion de transcripcion in vitro se monta utilizando la plantilla de ADN y una mezcla de nucleotidos que no contiene el/los nucleotido(s) complementario(s) que no esta(n) comprendido(s) en X1-X2-X3- ... Xm-2-Xm-1-Xm. Pueden utilizarse cualesquiera de las condiciones de transcripcion in vitro apropiadas conocidas en la tecnica. Debido a la ausencia del nucleotidos complementarios, no puede tener lugar la smtesis de ARN cebada con ARN aberrante. Como resultado, puede obtenerse una poblacion monocatenaria de X1-X2-X3- ... Xm. El preparado de ARN monocatenario resultante se puede purificar por cualquiera de los metodos apropiados conocidos en la tecnica y una cantidad igual de dos preparados de ARN monocatenario purificados con secuencia complementaria puede hibridarse para obtener una poblacion esencialmente homogenea de un oligonucleotido de ARN bicatenario de la secuencia deseada.

Por ejemplo, el oligonucleotido de ARN monocatenario puede ser GACACACACACACACACACACACA (SEQ. ID. n°: 44) y la transcripcion in vitro puede llevarse a cabo en presencia de ATP, CTP y GTP, es decir, en ausencia de UTP.

Tambien es posible sintetizar las dos cadenas que forman el oligonucleotido bicatenario utilizando diferentes metodos. Por ejemplo, una cadena se puede preparar por smtesis qmmica y la otra por transcripcion in vitro. Ademas, si se desea, un ARN monocatenario transcrito in vitro puede tratarse con una fosfatasa, tal como fosfatasa de intestino de ternero (CIP), para eliminar el 5'-trifosfato.

Tambien se describe que el oligonucleotido es monocatenario y tiene una estructura en horquilla y la seccion totalmente bicatenaria es el tronco del oligonucleotido monocatenario.

Espedficamente, el oligonucleotido monocatenario tiene un 5'-trifosfato, un extremo romo y una estructura en horquilla, en donde el tronco es totalmente bicatenario (es decir, no interrumpido por ninguna estructura monocatenaria), y tiene al menos 21 pb de longitud. En otras palabras, al menos 21 nucleotidos en el extremo 5' y al menos 21 nucleotidos en el extremo 3' del oligonucleotido tienen 100% de complementariedad.

El tronco es preferiblemente al menos de 22 pb, mas preferiblemente al menos de 23 pb y aun mas preferiblemente de 24 pb de longitud. El tronco es preferiblemente como maximo de 60 pb, mas preferiblemente como maximo de 50 pb, aun mas preferiblemente como maximo de 40 pb y aun mas preferiblemente como maximo de 30 pb de longitud.

El tamano exacto y la secuencia del bucle no son cnticos; solo es cntico que el bucle no afecte negativamente a la formacion y la estabilidad del tronco y no interfiera (p. ej. , obstaculice estericamente) la interaccion entre el extremo romo y el 5'-trifosfato con RIG-I. Un experto en la tecnica puede predecir facilmente la formacion de una estructura en horquilla basandose en la secuencia de nucleotidos del oligonucleotido y ser verificada experimentalmente por metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un oligonucleotido de ARNmc puede ser digerido con una RNasa monocatenaria espedfica y analizarse en un gel desnaturalizante. El enlace entre un oligonucleotido y RIG-I puede

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determinate facilmente empleando cualquiera de los metodos apropiados conocidos en la tecnica, tales como

inmunoprecipitacion 15, medicion de la anisotropfa de fluorescencia 26 y ensayo de desplazamiento en gel24

El preparado oligonucleotidico puede obtenerse por smtesis qmmica o por transcripcion in vitro. El metodo o procedimiento de preparacion espedfico no importa; solo importa que el oligonucleotido pueda purificarse y se controle la calidad de tal manera que el preparado oligonucleotfdico contenga esencialmente una poblacion homogenea de oligonucleotidos que tienen esencialmente la misma identidad qmmica (o composicion qmmica), incluidos la misma secuencia de nucleotidos, eje central, modificaciones, longitud y estructuras finales. Si el oligonucleotido se sintetiza qmmicamente y tiene un OH en 5', puede anadirse un 5'-trifosfato por alguno de los metodos apropiados conocidos en la tecnica, preferiblemente el metodo desarrollado por Janos Ludwig y Fritz Eckstein 27

Sin estar limitados por ninguna teona, se supone que cuando los 5' y 3'-nucleotidos de un oligonucleotido monocatenario tienen 100% de complementariedad y el tronco tiene un extremo romo, los oligonucleotidos del ARN monocatenario en horquilla y un extremo romo con secuencia definida, longitud y estructura del extremo pueden obtenerse fielmente por transcripcion in vitro debido a la ausencia de transcripcion dependiente de ARN cebada con ARN anormal.

El emparejamiento incorrecto de uno o mas nucleotidos puede tolerarse en la seccion bicatenaria del oligonucleotido en la que la actividad inductora del IFN del oligonucleotido no se reduce significativamente. El emparejamiento incorrecto es preferiblemente al menos de 6 pb, mas preferiblemente al menos de 12 pb, aun mas preferiblemente al menos de 18 pb distanciado del extremo romo que lleva el 5'-trifosfato.

En una realizacion, el oligonucleotido del ARNdc o del ARNmc contiene uno o mas pares de bases oscilantes GU en lugar del emparejamiento de bases GC o UA.

En una realizacion preferida, el oligonucleotido bicatenario o monocatenario comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, preferiblemente al menos 6, 7, 8, 9, 10, mas preferiblemente al menos 11, 12, 13, 14 , 15, aun mas preferiblemente al menos 16, 17, 18, 19, 20 inosina (I). En otra realizacion preferida, al menos 1, 2, 3, 4, 5%, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 25, 30%, mas preferiblemente al menos 35, 40, 45, 50, 55, 60%, aun mas preferiblemente al menos 70, 80 o 90% de adenosina (A) y/o de guanosina (G) en el oligonucleotido se sustituye con inosina (I).

El 5'-ribonucleotido que lleva al menos un 5'-trifosfato es preferiblemente A, seguido de G, seguido de U, seguido de C, en orden de preferencia descendente.

En realizaciones preferidas, la secuencia de los primeros 4 ribonucleotidos en el extremo 5' del oligonucleotido bicatenario o monocatenario que lleva el 5'-trifosfato se selecciona de: AAGU (n° 1), AAAG (n° 2), AUGG (n° 3), AUUA (n° 4), AACG (n° 5), AUGA (n° 6), AGUU (n° 7), AUUG (n° 8), AACA (n° 9), AGAA (n° 10), AGCA (n° 11), AACU (n° 12), AUCG (n° 13), AGGA (n° 14), AUCA (n° 15), AUGC (n° 16), AGUA (n° 17), AAGC (n° 18), AACC (n° 19), AGGU (n° 20), AAAC (n° 21), AUGU (n° 22), ACUG (n° 23), ACGA (n° 24 ), ACAG (n° 25), AAGG (n° 26), ACAU (n° 27), ACGC (n° 28), AAAU (n° 29), ACGG (n° 30), AUUC (n° 31) , AGUG (n° 32), ACAA (n° 33), AUCC (n° 34), AGUC (n° 35), en donde la secuencia esta en la direccion 5'^ 3'. En realizaciones mas preferidas, la secuencia de las 4 primeras ribonucleotidos en el extremo 5 "del oligonucleotido que lleva el 5'-trifosfato se selecciona de los nos 119, mas preferiblemente de nos 1-9, aun mas preferiblemente de los nos 1-4. En determinadas realizaciones, el primer nucleotido de las secuencias de 5'-tetranucleotidos listadas anteriormente es un G, U o C, en orden descendente de preferencia, en lugar de A.

En determinadas realizaciones, el oligonucleotido bicatenario o monocatenario contiene uno o mas motivos estructurales o firmas moleculares que son reconocidos por los TLR, en concreto, TLR3, TLR7 y TLR8.

En una realizacion, el oligonucleotido bicatenario o el tronco del oligonucleotido monocatenario es al menos de 30 pb de longitud y es reconocido por TLR3 2.

En otra realizacion, el oligonucleotido bicatenario o el tronco del oligonucleotido monocatenario contiene motivos de

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secuencias definidas reconocidas por TLR7 11 . En una realizacion preferida, el oligonucleotido bicatenario o

el tronco del oligonucleotido monocatenario comprende al menos uno, preferiblemente al menos dos, mas preferiblemente al menos tres, aun mas preferiblemente al menos cuatro, aun mas preferiblemente al menos cinco, y mas preferiblemente al menos seis, de los motivos de tetranucleotidos (tetrameros) seleccionados de entre el grupo consistente en:

GUUC (n°101), GUCA (n°102), GCUC (n°103), GUUG (n°104), GUUU (n° 105), GGUU (n°106), GUGU (n°107), GGUC (n°108), GUCU (n°109), GUCC (n°110), GCUU (n°111), UUGU (n°112), UGUC (n°113), CUGU (n°114), CGUC (n°115), UGUU (n°116), GUUA (n°117), UGUA (n°118), UUUC (n° 119), UGUG (n°120), GGUA (n°121),

GUCG (n°122), UUUG (n°123), UGGU (n°124), GUGG (n°125), GUGC (n°126 ), GUAC (n°127), GUAU (n°128),

UAGU (n°129), GUAG (n°130), UUCA (n°131), UUGG (n°132), UCUC (n° 133), CAGU (n°134), UUCG (n°135),

CUUC (n°136), GAGU (n°137), GGUG (n°138), UUGC (n°139), UUUU (n°140), CUCA (n°141), UCGU (n° 142),

UUCU (n°143), UGGC (n°144), CGUU (n°145), CUUG (n°146), UUAC (n° 147), en donde las secuencias nucleotfdicas de los motivos son 5'^3'.

Preferiblemente, los motivos del tetramero se seleccionan del grupo que consiste en los nos 101-119, nos 101-118, nos 101-117, nos 101-116, mas preferiblemente, los nos 101-115, nos 101-114, nos 101-113, nos 101-112, mas

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preferiblemente, los nos 101-111, nos 101-110, nos 101 a 109, nos 101-108, nos 101-107, aun mas preferiblemente, los nos 101-106, nos 101-105, nos 101-104, nos. 101-103, aun mas preferiblemente, los nos 101-102 de los motivos del tetramero. El oligonucleotido puede comprender una o mas copias del mismo motivo del tetramero o una o mas copias de uno o mas motivos de tetramero diferentes.

Se describe que el oligonucleotido bicatenario tiene un extremo romo que lleva un 5'-trifosfato y un extremo con una prolongacion en 5' o 3', en donde la prolongacion en 5' o 3' contiene motivos de secuencias definidas reconocidos por TLR8 , , , . En una realizacion adicional, un bucle del oligonucleotido monocatenario contiene motivos de

secuencias definidas reconocidos por TLR8. En determinadas realizaciones, la prolongacion en 5' o 3' del oligonucleotido bicatenario o el bucle del oligonucleotido monocatenario es de al menos 4, preferiblemente al menos 6, mas preferiblemente al menos 12, aun mas preferiblemente al menos 18 nucleotidos de longitud . En realizaciones preferidas, la prolongacion en 5' o 3' del oligonucleotido bicatenario o el bucle del oligonucleotido monocatenario comprende al menos uno, preferiblemente al menos dos, mas preferiblemente al menos tres, aun mas preferiblemente al menos cuatro, aun mas preferiblemente al menos cinco, y lo mas preferiblemente al menos seis, de los motivos de tetranucleotidos (tetrameros) seleccionados del grupo que consiste en:

UCGU (n°201), GUUG (n°202), UGGU (n°203), UGGC (n°204), GGUA (n° 205), UGAU (n°206), UGCU (n°207), UUGC (n°208), UUGU (n° 209), UAGU (n°210), GGUU (n°211), GUUU (n°212), UGUG (n°213), GUGU (n° 214),

UGCC (n° 215), GUAU (n° 216), GUGC (n° 217), UGUA (n° 218), UGUC (n° 219), CUGU (n° 220), UGAC (n° 221),

UGUU (n° 222), UAAU (n° 223), GUAG (n° 224), UCUU (n° 225), UUGG (n° 226), UUUG (n° 227), GGAU (n° 228) ,

UUUU (n° 229), CGUU (n° 230), UUAU (n°231), GUUC (n° 232), GUGG (n° 233), GGUG (n°2 34), UAUU (n° 235) ,

UCUG (n° 236), GUAC (n° 237), UAGG (n° 238), UCUC (n° 239), UAGC (n° 240), UAUC (n° 241), CUAU (n° 242),

UACU (n° 243), CGGU (n° 244), UGCG (n° 245), UUUC (n° 246), UAUG (n° 247), UAAG (n° 248), UACC (n° 249),

UUAG (n° 250), GCUU ( n° 251), CAGU (n° 252), UGAG (n° 253), GAUU (n° 254), GAGU (n° 255), GUUA (n° 256),

UGCA (n° 257), UUCU (n° 258), GCCU (n° 259), GGUC (n° 260), GGCU (n° 261), UUAC (n° 262), UCAU (n° 263),

GCGU (n° 264), CGAU (n° 265), GAUG (n° 266), GUCU (n° 267), CGUA (n° 268), CGAU (n° 269), en donde las secuencias de nucleotidos de los motivos son 5'^3'.

Preferiblemente, los motivos de tetrameros se seleccionan del grupo que consiste en los nos 201-211, mas preferiblemente los nos 201-210, nos 201-209, nos 201-208, aun mas preferiblemente los nos 201-207, nos 201-206, nos 201-205, nos 201 -204, aun mas preferiblemente nos 201-203, nos 201-202 de los motivos de tetrameros anteriormente enumerados. Aun mas preferiblemente, el motivo de tetramero es UCGU (n° 201). El oligonucleotido puede comprender una o mas copias del mismo motivo de tetramero o una o mas copias de uno o mas motivos de tetrameros diferentes.

Se describe tambien que el oligonucleotido bicatenario puede tener un extremo romo que lleva un 5'-trifosfato y un extremo con prolongacion en 5' o 3', en donde la prolongacion en 5' o 3' se compone de desoxirribonucleotidos y contiene motivos de secuencia definidos reconocidos por TLR96 En otra realizacion, un bucle del oligonucleotido monocatenario se compone de desoxirribonucleotidos y contiene motivos de secuencia definidos reconocidos por TLR9. En realizaciones preferidas, la prolongacion en 5 'o 3' del oligonucleotido bicatenario o el bucle del oligonucleotido monocatenario comprende uno o mas dinucleotidos CpG no metilados.

El oligonucleotido bicatenario o monocatenario puede contener uno o mas de los mismos o diferentes motivos estructurales o firma(s) molecular(es) reconocido(s) por TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9 descritos anteriormente.

En determinadas realizaciones, el oligonucleotido bicatenario o monocatenario descrito anteriormente tiene actividad de silenciamiento genico. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "actividad de silenciamiento genico" se refiere a la capacidad del oligonucleotido para disminuir la expresion de un gen, preferiblemente mediante ARN interferente (ARNi). En una realizacion preferida, el oligonucleotido es un ARNip (ARN interferente pequeno) o un ARNhp (ARN en horquilla pequeno).

Dada la secuencia de codificacion de un gen, un experto en la tecnica puede disenar facilmente los ARNip y ARNhp utilizando algoritmos disponibles publicamente, tal como el descrito en Reynolds et al. 23 y disenar maquinas tales como "BD-RNAi design" (Beckton Dickinson) y "Block-iT RNAi" (Invitrogen). A pesar de que los ARNip convencionales generalmente tienen una longitud de 19 pb y tienen dos prolongaciones en 3' de 2 nucleotidos (es decir, cada cadena sencilla es de 21 nucleotidos de longitud), un experto en la tecnica puede modificar facilmente la secuencia de los ARNip disenados por los algoritmos conocidos o maquinas de diseno y obtener oligonucleotidos bicatenarios que tienen las caractensticas estructurales de los descritos anteriormente. Ademas, un experto en la tecnica puede modificar facilmente la secuencia de ARNhp disenado para obtener oligonucleotidos monocatenarios que tienen las caractensticas estructurales de los descritos anteriormente. Por otra parte, un experto en la tecnica puede probar facilmente la eficacia de silenciamiento genico de los oligonucleotidos utilizando metodos conocidos en la tecnica tales como el analisis de transferencia Northern, RT- PCR cuantitativa o semicuantitativa, analisis de transferencia Western, analisis FACS en superficie o intracelulares.

En una realizacion preferida, el ARNip tiene una longitud de al menos 21 pb; la cadena transcrita lleva un 5'- trifosfato; el extremo que lleva el 5'-trifosfato es un extremo romo y el otro extremo es un extremo romo, un prolongacion en 3' de 1 o 2 nucleotidos, o una prolongacion en 5' de 1 o 2 de nucleotidos. Preferiblemente, el extremo que no lleva 5'-trifosfato es un extremo romo o una prolongacion en 3' de 1 o 2 nucleotidos, mas preferiblemente una prolongacion en 3' de 1 o 2 nucleotidos.

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En realizaciones preferidas, el ARNip o el ARNhp es espedfico para un gen relacionado con la enfermedad/trastorno. Como ampliamente utilizado en la tecnica, la expresion "un gen relacionado con la enfermedad /trastorno" se refiere a un gen que se expresa en una celula en una enfermedad/trastorno, pero no se expresa en una celula normal o en un gen que se expresa a un nivel superior en una celula en una enfermedad/trastorno que en una celula normal. En una realizacion preferida, la expresion del gen relacionado con la enfermedad/trastorno produce o contribuye a la creacion y/o evolucion de la enfermedad/trastorno.

En una realizacion, la enfermedad/trastorno es un tumor o un cancer y el gen relacionado con la enfermedad/trastorno es un oncogen. Ejemplos de oncogenes incluyen Bcl-2, c-Myc, c-Ras, c-Met, Her2, EGFR, PDGFR, VEGFR, Edg4, Edg7, S1P, Raf, ERK WNT, survivina, HGF, cdk2, cdk4, MITF, ciclina D1, GRO naturales y/o mutantes.

En otra realizacion, la enfermedad/trastorno es una infeccion vmca y el gen relacionado con la enfermedad /trastorno es un gen que es o el producto del cual se requiere para el reconocimiento de la celula anfitriona, la entrada de la celula anfitriona, la replicacion vmca, el montaje parcial vmico, y/o la transmision vmca. El gen relacionado con la enfermedad/ trastorno puede ser un gen vmco o un gen anfitrion. Un ejemplo de un gen vmco es HBsAg de HBV.

El oligonucleotido bicatenario o monocatenario puede contener cualesquiera de los nucleotidos naturales, sinteticos, modificados, o una de sus mezclas, siempre y cuando los nucleotidos sinteticos y/o modificados no comprometan (es decir, reduzcan) la actividad inductora del IFN de tipo I del oligonucleotido. En una realizacion preferida, el oligonucleotido no contiene ninguna modificacion tales como pseudouridina, 2-tiouridina, 2'-fluor-dNTP, NTP 2'-O- metilado, en especial 2'-fluor-dCTP, 2'-fluor-dUTP, CTP 2'-O-metilado, UTP 2'-O-metilado. El oligonucleotido bicatenario o monocatenario puede contener cualesquiera de los enlaces entre nucleosidos de origen natural, sinteticos, modificados, o una de sus mezclas, siempre y cuando los enlaces no comprometan la actividad inductora de IFN tipo I del oligonucleotido. El grupo 5'-trifosfato del oligonucleotido bicatenario o monocatenario puede modificarse siempre y cuando la modificacion no comprometa la actividad inductora de IFN tipo I del oligonucleotido. Por ejemplo, uno o mas de oxfgeno (O) en el grupo trifosfato puede sustituirse con un azufre (S); el grupo trifosfato puede modificarse con la adicion de uno o mas grupos fosfato.

El oligonucleotido bicatenario o monocatenario puede ser modificarse de forma covalente o no covalente para mejorar su estabilidad qmmica, la resistencia a la degradacion por nucleasas, la capacidad para atravesar las membranas celulares y/o subcelulares, especificidad para el objetivo (organo, tejido, tipo celular, compartimento subcelular), las propiedades farmacocineticas, la biodistribucion o cualquiera de sus combinaciones. Por ejemplo, el/los enlace(s) fosforotioato y/o el/los enlace(s) pirofosfato pueden introducirse para aumentar la estabilidad qmmica y/o la resistencia a las nucleasas de un oligonucleotido de ARN. En otro ejemplo, el oligonucleotido puede unirse por enlace covalente a uno o mas grupos o moleculas lipofilos, tal como un lfpido o una molecula a base de lfpidos, preferiblemente, un colesterol o uno de sus derivados. El grupo lipofilo o molecula preferiblemente no esta unido al extremo romo que lleva el 5'-trifosfato. Preferiblemente, la modificacion no comprende la actividad inductora de IFN tipo I del oligonucleotido. Alternativamente, una reduccion en la actividad inductora de IFN tipo I del oligonucleotido producida por la modificacion se compensa con un aumento en la estabilidad y/o administracion y/u otras propiedades como se ha descrito anteriormente.

El oligonucleotido bicatenario o monocatenario puede llevar cualquier combinacion de cualquier numero de caractensticas descritas anteriormente. Un oligonucleotido bicatenario preferido es un oligonucleotido de ARN que tiene un extremo romo con un 5'-trifosfato unido a un A en 5' y una longitud de entre 21 y 30 pb. Un oligonucleotido bicatenario mas preferido es un oligonucleotido de ARN que tiene dos extremos romos cada uno con un 5'-trifosfato unido a un A en 5' y una longitud de entre 21 y 30 pb. Un oligonucleotido monocatenario preferido tiene un tronco que tiene entre 21 y 30 pb de longitud.

Composicion Farmaceutica

La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende al menos uno de los preparados de oligonucleotidos de la invencion descritos anteriormente y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Por "al menos uno", se entiende que uno o mas preparados de oligonucleotidos del mismo o diferentes oligonucleotidos pueden utilizarse juntos.

En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica comprende ademas un agente que facilita la administracion del oligonucleotido en una celula, en especial, en el citosol de la celula.

En una realizacion, el agente de administracion es un agente de complejacion que forma un complejo con el oligonucleotido y facilita la administracion del oligonucleotido a las celulas. Los agentes de complejacion tambien se denominan "agentes de transfeccion" en la tecnica. Puede emplearse cualquier agente de complejacion que sea compatible con el uso previsto de la composicion farmaceutica. Los ejemplos de agentes de complejacion incluyen polfmeros y microesferas biodegradables. El polfmero es preferiblemente un polfmero cationico, mas preferiblemente un lfpido cationico. Ejemplos de un polfmero incluyen polietilenimina (PEI) tales como jetPEI™ in vivo (PolyPlus) y derivados de colageno. Ejemplos de microesferas biodegradables incluyen liposomas, virosomas, partmulas estables de acido nucleico-lfpido (SNALP), SICOMATRIX® (CSL Limited) y microesferas del copolfmero poli (D,L- lactida-co-glicolida) (PLGA).

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En otra realizacion, el agente de administracion es un virus, preferiblemente un virus de replicacion insuficiente. El oligonucleotido que se debe administrar esta contenido en la capsula vmca y el virus puede seleccionarse basandose en su especificidad de la diana. Ejemplos de virus utiles incluyen los polimixovirus que se dirigen a los epitelios del aparato respiratorio superior y a otras celulas, el virus de la hepatitis B que se dirige a las celulas del tngado, el virus de la gripe que se dirige a las celulas epiteliales y a otras celulas, los adenovirus que se dirigen a numerosos tipos de celulas diferentes, los virus del papiloma que se dirige a las celulas epiteliales y escamosas, el virus del herpes que se dirige a las neuronas, los retrovirus tales como el VIH que se dirige a los linfocitos CD4+ T, las celulas dendnticas y otras celulas, vacuna de Ankara modificada que se dirige a una variedad de celulas y los virus oncolfticos que se dirigen a las celulas tumorales. Los ejemplos de virus oncolfticos incluyen el virus de la enfermedad de Newcastle de origen natural, cepas atenuadas de reovirus, el virus de la estomatitis vesicular (VSV), y los mutantes geneticamente modificados del virus del herpes simple tipo 1 (VHS-1), adenovirus, virus de la viruela y virus del sarampion.

Ademas de administrarse por un agente de administracion, el oligonucleotido y/o la composicion farmaceutica puede administrarse a las celulas por medios ffsicos tales como la electroporacion, la administracion de ondas de choque, la transfeccion desencadenada por ultrasonidos, y la administracion de aceleradores de genes con partfculas de oro.

La composicion farmaceutica puede comprender ademas otro agente tal como un agente que estabiliza el oligonucleotido. Ejemplos de un agente estabilizante incluyen una protema que forma complejos con el oligonucleotido para formar un iRNP, quelantes tales como EDTA, sales y los inhibidores de Rnasa.

En determinadas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende ademas uno o mas agentes terapeuticos farmaceuticamente activos. Ejemplos de un agente farmaceuticamente activo incluyen los agentes inmunoestimulantes, agentes antivmcos, antibioticos, agentes antifungicos, agentes antiparasitarios, agentes antitumorales, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, factores antiangiogenicos, agentes quimioterapeuticos, anticuerpos y agentes de silenciamiento genico. Preferiblemente, el agente farmaceuticamente activo se selecciona del grupo que consiste de un agente inmunoestimulante, un agente antivmco y un agente antitumoral. Mas de un agente farmaceuticamente activo puede ser de la misma o diferente categona.

En determinadas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende ademas acido retinoide, IFN-a y/o IFN-p. Sin estar limitado por ninguna teona, el acido retinoide, IFN-a y/o IFN-p son capaces de sensibilizar a las celulas para la produccion de IFN-a, posiblemente mediante el incremento de la expresion de RIG-I.

La composicion farmaceutica puede formularse en cualquier forma que sea compatible con su aplicacion terapeutica, incluida la via de administracion pretendida, el formato de administracion y la dosis deseada. Las composiciones farmaceuticas optimas pueden ser formuladas por un experto segun el conocimiento general frecuente en la tecnica, tal como el descrito en Remington's Pharmaceutical Sciences (18a ed., Gennaro A.R. ed., Mack Publishing Company, 1990).

La composicion farmaceutica puede formularse para liberacion inmediata, liberacion controlada, liberacion retardada, liberacion mantenida, liberacion prolongada, o liberacion continua.

La composicion farmaceutica puede administrarse por cualquier via conocida en la tecnica, incluidas, pero no limitadas a, las vfas topica, enterica y parenteral, siempre que sea compatible con la aplicacion prevista. La administracion topica incluye, pero no se limita a, la administracion epicutanea, por inhalacion, intranasal, vaginal, enema, colirios y gotas para los ofdos. La administracion enteral incluye, pero no se limita a, la administracion oral, rectal y la administracion a traves de tubos de alimentacion. La administracion parenteral incluye, pero no se limita a, la administracion intravenosa, intraarterial, intramuscular, intracardfaca, subcutanea, intraosea, intradermica, intratecal, intraperitoneal, transdermica, a traves de las mucosas y por inhalacion.

En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica es para aplicaciones locales (p. ej., mucosa, piel), tal como en forma de un preparado para atomizacion (es decir, aerosol).

La composicion farmaceutica puede ser para fines profilacticos y/o terapeuticos. Por ejemplo, un preparado para atomizacion (es decir, aerosol) puede utilizarse para reforzar la capacidad antivmca de la mucosa nasal y pulmonar.

Un experto en la tecnica puede determinar facilmente la dosis optima, frecuencia, duracion y via de administracion basandose en factores tales como la enfermedad o afeccion a tratar, la gravedad de la enfermedad o afeccion, la edad , sexo y estado ffsico del paciente, y la presencia o ausencia de tratamiento previo.

Aplicaciones in vitro

La presente solicitud proporciona la utilizacion in vitro del preparado de oligonucleotidos de la invencion descrito anteriormente. En particular, la presente solicitud proporciona la utilizacion de al menos un oligonucleotido preparado para provocar una respuesta antivmca, en especial una respuesta a IFN tipo I, mas concretamente, una respuesta a IFN-a, in vitro. La presente solicitud tambien proporciona la utilizacion de al menos un preparado de oligonucleotidos para la induccion de apoptosis de una celula tumoral in vitro.

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La presente invencion proporciona un metodo in vitro para estimular una respuesta antivmca, en especial, una respuesta a IFN de tipo I, mas concretamente, una respuesta a IFN-a en una celula, que comprende las etapas siguientes:

(a) mezclar al menos un oligonucleotido de la invencion descrito anteriormente con un agente de complejacion; y

(b) poner en contacto una celula con la mezcla de (a), en donde la celula expresa a RIG-I.

Las celulas pueden expresar RIG-I de manera endogena y/o exogena a partir de un acido nucleico exogeno (ARN o ADN). El aDn exogeno puede ser un ADN plasmido, un vector vmco, o uno de sus fragmentos. El ADN exogeno puede ser ingerido en el genoma de la celula o puede existir fuera de los cromosomas. Las celulas incluyen, pero no se limitan a, inmunocitos primarios, celulas no inmunes primarias y estirpes celulares. Los inmunocitos incluyen, pero no se limitan a, celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP), celulas dendntricas plasmocitoides (CDP), celulas dendnticas mieloides (CDM), macrofagos, monocitos, linfocitos B, linfocitos citolfticos naturales, granulocitos, linfocitos CD4+ T, linfocitos CD8+ T y linfocitos NKT. Los celulas no inmunes incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, celulas endoteliales, celulas epiteliales y celulas tumorales. Las estirpes celulares pueden obtenerse a partir de inmunocitos o de celulas no inmunes.

La presente invencion proporciona un metodo in vitro para provocar apoptosis de una celula tumoral, que comprende las etapas siguientes:

(a) mezclar al menos un oligonucleotido de la invencion descrito anteriormente con un agente de complejacion; y

(b) poner en contacto una celula tumoral con la mezcla de (a).

La celula tumoral puede ser una celula tumoral primaria recien aislada de un animal vertebrado que tiene un tumor o una estirpe de celulas tumorales.

Aplicaciones in vivo

La presente solicitud proporciona la utilizacion in vivo del preparado de oligonucleotidos de la invencion definido en las reivindicaciones.

En particular, la presente solicitud proporciona al menos un preparado de oligonucleotidos para provocar una respuesta antivmca, en especial, una respuesta a IFN tipo I, mas concretamente, una respuesta a IFN-a, en un animal vertebrado, en especial, una mairnfero. La presente solicitud proporciona ademas al menos un preparado de oligonucleotidos para su utilizacion en la provocacion de apoptosis de una celula tumoral en un animal vertebrado, en especial, un mamffero. La presente solicitud proporciona ademas al menos un preparado de oligonucleotidos para su utilizacion en la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad y/o trastorno en un animal vertebrado, en especial, un mamffero, en la practica medica y/o veterinaria. La invencion tambien proporciona al menos un preparado de oligonucleotidos para su utilizacion como un adyuvante de vacuna.

Ademas, la presente solicitud proporciona la utilizacion de al menos un preparado de oligonucleotidos para la preparacion de una composicion farmaceutica como se define en las reivindicaciones para provocar una respuesta antivmca, en especial, una respuesta a IFN tipo I, mas concretamente, una respuesta a IFN-a, en un animal vertebrado, en especial, un mamffero. La presente solicitud proporciona ademas la utilizacion de al menos un preparado de oligonucleotidos para la preparacion de una composicion farmaceutica para su utilizacion en la provocacion de apoptosis de una celula tumoral en un animal vertebrado, en especial, un mamffero. La presente solicitud proporciona ademas la utilizacion de al menos un preparado de oligonucleotidos para la preparacion de una composicion farmaceutica para su utilizacion en la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad y/o trastorno en un animal vertebrado, en especial, un mam^era, en la practica medica y/o veterinaria.

Las enfermedades y/o trastornos incluyen, pero no se limitan a, infecciones, tumores/canceres y trastornos inmunitarios.

Las infecciones incluyen, pero no se limitan a, infecciones vmcas, infecciones bacterianas, antrax, infecciones parasitarias, infecciones por hongos e infeccion por priones.

Las infecciones vmcas incluyen, pero no se limitan a, infecciones por hepatitis C, hepatitis B, virus de la gripe, virus del herpes simple (VHS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus respiratorio sincitial (VRS), virus de la estomatitis vesicular (VEV), citomegalovirus (CMV), virus de la polio, virus de la encefalomiocarditis (VEMC), virus del papiloma humano (VPH) y el virus de la viruela. En una realizacion, la infeccion es una infeccion del aparato respiratorio superior causada por virus y/o bacterias, en especial, la gripe, mas espedficamente, la gripe aviar.

Las infecciones bacterianas incluyen, pero no se limitan a, infecciones por estreptococos, estafilococos, E. Coli y pseudomonas. En una realizacion, la infeccion bacteriana es una infeccion bacteriana intracelular que es una infeccion por una bacteria intracelular tales como micobacterias (tuberculosis), clamidia, micoplasma, listeria y una bacteria intracelular facultativa tal como Staphylococcus aureus.

Las infecciones parasitarias incluyen, pero no se limitan a, infecciones por helmintos, en especial, infeccion por lombrices intestinales.

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En una realizacion preferida, la infeccion es una infeccion vmca o una infeccion bacteriana intracelular. En una realizacion mas preferida, la infeccion es una infeccion vmca por hepatitis C, hepatitis B, virus de la gripe, VRS, VHP, VHS1, VHS2, y CMV.

Los tumores comprenden tanto tumores benignos como malignos (es decir, cancer).

Los canceres comprenden, pero no se limitan a cancer de las vfas biliares, cancer cerebral, cancer de mama, cancer cervicouterino, coriocarcinoma, cancer de colon, cancer de endometrio, cancer de esofago, cancer gastrico, neoplasia intraepitelial, leucemia, linfoma, cancer de hugado, cancer de pulmon, melanoma, mielomas, neuroblastoma, cancer oral, cancer de ovario, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer rectal, sarcoma, cancer de piel, cancer testicular, cancer de tiroides y cancer renal.

En determinadas realizaciones, el cancer se selecciona de leucemia de celulas pilosas, leucemia mielogena cronica, leucemia de linfocitos T cutaneos, leucemia mieloide cronica, linfoma no hodgkiniano, mieloma multiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas renales, carcinoma de prostata, carcinoma de celulas de la vejiga, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, cancer pulmonar no microdtico, cancer pulmonar microdtico, carcinoma hepatocelular, carcinoma basocelular, carcinoma de colon, displasia cervicouterina y sarcoma de Kaposi (relacionados con el SIDA y no relacionados con el SIDA).

Los trastornos inmunitarios incluyen, pero no se limitan a, alergias, trastornos autoinmunitarios e inmunodeficiencias.

Las alergias incluyen, pero no se limitan a, alergias respiratorias, alergias por contacto y alergias a los alimentos.

Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, esclerosis multiple, diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriasica), encefalomielitis, miastenia grave, lupus eritematoso diseminado, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo la dermatitis atopica y la dermatitis eccematosa), psoriasis, smdrome de Siogren, enfermedad de Crohn, ulcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alergico, lupus eritematoso cutaneo, esclerodermia, vaginitis, rectitis, erupciones por medicamentos, reacciones antagonistas de la lepra, eritema nudoso leproso, uveftis autoinmunitaria, encefalomielitis alergica, encefalopatfa hemorragica aguda necrotizante, perdida auditiva neurosensorial progresiva bilateral idiopatica, anemia aplasica, anemia pura de globulos rojos, trombocitopenia idiopatica, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa cronica, smdrome de Stevens-Johnson, esprue idiopatico, liquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveftis posterior y fibrosis pulmonar intersticial.

Las inmunodeficiencias incluyen, pero no se limitan a, inmunodeficiencia espontanea, inmunodeficiencia adquirida (incluido el SIDA), inmunodeficiencia o inmunodepresion provocada por farmacos (tal como la provocada por inmunosupresores utilizados en trasplantes y los agentes quimioterapeuticos utilizados para tratar el cancer), y la inmunodepresion producida por hemodialisis cronica, procedimientos traumaticos o quirurgicos.

En una realizacion preferida, el trastorno inmunitario es la esclerosis multiple.

En determinadas realizaciones preferidas, el oligonucleotido tiene actividad de silenciamiento genico. Asf pues, el oligonucleotido tiene dos funcionalidades, silenciamiento genico e inmunoestimulacion, combinadas en una molecula. En realizaciones preferidas, el oligonucleotido tiene una actividad de silenciamiento genico que es espedfica para un gen relacionado con enfermedades/trastornos, tal como un oncogen o un gen necesario para la infeccion y/o replicacion vmca.

En determinadas realizaciones, el oligonucleotido se utiliza en combinacion con agentes uno o mas agentes farmaceuticamente activos tales como los agentes inmunoestimulantes, agentes antivmcos, antibioticos, agentes antifungicos, agentes antiparasitarios, agentes antitumorales, citocinas, quimiocinas , factores de crecimiento, factores antiangiogenicos, agentes quimioterapeuticos, anticuerpos y agentes de silenciamiento genico. Preferiblemente, el agente farmaceuticamente activo se selecciona del grupo que consiste de un agente inmunoestimulante, un agente antivmco y un agente antitumoral. Mas de uno de los agentes farmaceuticamente activos pueden ser de la misma o diferente categona.

En una realizacion, el oligonucleotido se utiliza en combinacion con una vacuna antivmica, una vacuna antibacteriana y/o una vacuna antitumoral, en donde la vacuna puede ser profilactica y/o terapeutica. El oligonucleotido puede servir como adyuvante de vacuna.

En otra realizacion, el oligonucleotido se utiliza en combinacion con acido retinoico y/o IFN tipo I (IFN-a y/o IFN- p). Sin estar ligado por ninguna teona, el acido retinoide, IFN-a y/o IFN-p son capaces de sensibilizar celulas para la produccion de IFN-a, posiblemente a traves del incremento de la expresion de RIG-I.

En otras realizaciones, la composicion farmaceutica es para su uso en combinacion con uno o mas tratamientos profilacticos y/o terapeuticos de enfermedades y/o trastornos tales como infecciones, tumores y trastornos del sistema inmunitario. Los tratamientos pueden ser farmacologicos y/o ffsicos (p. ej., cirugfa, radiacion).

Los animales vertebrados incluyen, pero no se limitan a, peces, anfibios, aves y marnfferos. Los mairnferos incluyen, pero no se limitan a, ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ovejas, ganado, vacas, cerdos, conejos, primates y seres humanos. En una realizacion preferida, el mam^era es un ser humano.

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La presente invencion se ilustra mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos son solo a tftulo ilustrativo y de ningun modo debe interpretarse que limitan el alcance de la invencion.

Ejemplos

Materiales y metodos

1. Celulas

Se prepararon CMSP humanas a partir de sangre completa donada por donantes sanos jovenes por centrifugacion con gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Biochrom, Berlm, Alemania). Se aislaron CDP por MACS utilizando el kit de aislamiento de celulas dendnticas Ag (BCDA) -4 de las celulas dendnticas de la sangre de Miltenyi Biotec (Bergisch-Gladbach, Alemania). En resumen, se marcaron CDP con Ab anti-BDCA-4 acoplados a microperlas paramagneticas coloidales y se pasaron dos veces a traves de una columna de separacion magnetica (columna LS, luego columna MS; Miltenyi Biotec). La pureza de las CDP aisladas (celulas de linaje negativo, positivas a MHC-II y positivas a CD123) fue superior al 95%. Antes de aislamiento de los monocitos, las CDP se redujeron con MACS (columna LD; Miltenyi Biotec) y luego se aislaron los monocitos utilizando el kit ii de aislamiento de monocitos (Miltenyi Biotec). Las CDM se purificaron de CMSP por clasificacion inmunomagnetica con perlas anti-CD1c (CD1c (BDCA-1) + kit de aislamiento de celulas dendnticas, humanas, Miltenyi Biotec). La viabilidad de todas las celulas fue superior al 95%, determinada por exclusion con azul de tripano. A menos que se indique lo contrario, las celulas se cultivaron en placas de 96 pocillos para experimentos de estimulacion. Las CDM (0,5x106/ml) se mantuvieron en RPMI 1640 que contema FcS al 10%, L-glutamina 1,5 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de

estreptomicina. Las CDP (0,25x106/ml) se cultivaron en el ismo medio enriquecido con 10 ng/ml de IL-3 (R&D Systems GmbH). Los monocitos (0,5x106/ml) se volvieron a poner en suspension en medio RPMI con suero AB al 2% (BioWhittaker, Heidelberg, Alemania), L-glutamina 1,5 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Todos los compuestos se analizaron para determinar la contaminacion por endotoxinas antes de su utilizacion.

2. Ratones

Los ratones con carencia en TLR7 (TLR7'/‘) fueron proporcionados gentilmente por S. Akira 3 Los ratones C57BL/6 hembra se adquirieron de Harlan-Winkelmann (Borchen, Alemania). Los ratones eran de 6-12 semanas de edad al inicio de los experimentos. Los estudios en animales fueron aprobados por la agencia reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania).

3. ARN

Los oligonucleotidos de ARN sintetizados qmmicamente se adquirieron en Eurogentec (Leiden, Belgica), MWG- Biotech AG (Ebersberg, Alemania), biomers.net GmbH (Ulm, Alemania), y opcionalmente fueron modificados por Janos Ludwig (Rockefeller Univ., EE.UU.). Se prepararon ARN transcritos in vitro utilizando el Kit Megashort Script (Ambion, Huntingdon, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. La transcripcion in vitro se llevo a cabo durante la noche a 37°C. La plantilla de ADN se digerio utilizando DNasa I (Ambion). Los ARN se purificaron por extraccion con fenol:cloroformo y precipitacion con alcohol. El exceso de sales y NTP se eliminaron haciendo pasar los ARN a traves de una columna Mini Quick Spin™ Oligo (Roche). El tamano y la totalidad de los ARN se verifico por electroforesis en gel. CpG ODN se adquirio en Coley Pharmaceutical Group (Wellesley, EE.UU.) o Metabion (Martinsried, Alemania).

4. Estimulacion celular (transfeccion)

A menos que se indique lo contrario, 200 ng de los oligonucleotidos de ARN purificado se transfectaron en celulas utilizando 0,5pl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos segun el protocolo del fabricante. Se utilizo CpG ODN a una concentracion final de 3 pg/ml. Para la transfeccion con el polipeptido policationico poli-L-arginina (Sigma, P7762), se mezclaron 200 ng de acido nucleico diluido en PBS (PAA Laboratories GmbH) con 280 ng de poli-L-arginina y se incubaron durante 20 min antes de la estimulacion. En algunos experimentos, las celulas se pretrataron con 1 o 2,5 pg/ml de cloroquina (Sigma) durante 30 min antes de la estimulacion. 24h despues de la estimulacion/transcripcion, los sobrenadantes de cultivo de tejidos se recogieron y se ensayaron para la produccion de IFN-a.

5. ELISA de IFN-a

Se evaluo el IFN-a humano en sobrenadantes de cultivo celular recogidos 24 horas despues de la estimulacion/ transfeccion utilizando el modulo del IFN-a (Bender MedSystems, Graz, Austria) segun las recomendaciones del fabricante. Se midio el IFN-a murino segun el siguiente protocolo: como Ab de captura se utilizo anti-IFN-a monoclonal de raton en rata (clon RMMA-1), para la deteccion se utilizo suero de anti-IFN-a policlonal de raton en conejo (ambos de PBL Biomedical Laboratories) y como reactivo secundario se utilizo anti-IgG de conejo en burro conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Como patron se utilizo rIFN-a de raton (PBL Biomedical Laboratories) (concentracion de IFN-a en UI/ml).

Resultados

Ejemplo 1. Oligonucleotidos de ARN que llevan 5'-trifosfato son reconocidos por diferentes receptores en monocitos y CDP.

Se descubrio que las CDP, CDM y los monocitos eran todas capaces de responder a la estimulacion de oligonucleotidos de ARN que llevan 5'-trifosfato (3pARN) mediante la produccion de IFN-a (datos no mostrados). Para identificar los receptores implicados en el reconocimiento de 3pARN en estas diferentes poblaciones de inmunocitos, 3pARN transcritos in vitro (Tabla 1) se transfectaron en estas celulas en presencia y 5 ausencia de cloroquina, un potente inhibidor de reconocimiento de acidos nucleicos en el que intervienen como mediadores TLR7, TLR8 y TLR9.

Tabla 1. Secuencias de oligonucleotidos de ARN y ADN.

Denominacion

Secuencia Tipo SEQ ID n°

GA

5'-pppGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAAA-3 ' ARN, transcrito in vitro 1

GFP

5'-pppGGGGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU-3 ' ARN, transcrito in vitro 2

SynARN

5'-OHGGGGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU-3 ' ARN, sintetico 2

3pARN

5'-pppGGGGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU-3 ' ARN, transcrito in vitro 2

CpG

5'-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3 ' ADN sintetico 3

(ppp: trifosfato; letras subrayadas: enlace fosforotioato en 3' de la base; letras en negrita, dinucleotidos CpG)

Como se muestra en la figura 1A, mientras que la produccion de IFN-a inducida por 3pARN a partir de monocitos no 10 se vio afectada por la adicion de cloroquina, la produccion de IFN-a inducida por 3pARN a partir de las CDP disminuyo en gran medida por la adicion de cloroquina.

Ademas, como se muestra en la figura 1A, la capacidad de 3pARN para inducir IFN-a a partir de las CDP dependfa de la presencia de U en la secuencia que se sabe que es una firma molecular reconocida por TLR7.

Por otra parte, como se muestra en la figura 1B, mientras que las CDP de ratones naturales respondieron a la 15 estimulacion por 3pARN produciendo IFN-a, esta respuesta disminuyo drasticamente, si no en su totalidad, en las CDP de ratones con carencia de TLR7 (TLR7'/_).

En conjunto, estos resultados sugieren que mientras que el reconocimiento de 3pARN en las CDP interviene como mediador principalmente TLR7 en funcion de la secuencia de nucleotidos, en el reconocimiento de 3pARN en monocitos interviene principalmente, si no enteramente, como mediador RIG-I y es independiente de las secuencia 20 sde nucleotidos.

Ejemplo 2. La induccion de IFN-a en monocitos requiere estrictamente la presencia de un 5'-trifosfato.

Los oligonucleotidos de ARN sinteticos que llevan 5'-monofosfato (Tabla 2) se transfectaron en monocitos humanos primarios purificados. Un ARN transcrito in vitro que lleva 5'-trifosfato se utilizo como referencia positiva. El nivel de secrecion de IFN-a se determino 24 horas despues de la transfeccion/estimulacion.

25 Tabla 2. Secuencias de oligonucleotidos de ARN.

Denominacion

Secuencia Tipo SEQ ID n°

27 + 0 s

5'-OHAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC-3' ARN, sintetico 4

27 + 0 a

5'-OHGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUU-3' ARN, sintetico 5

27 + 0 ds

5-OHAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC-3' 3'-UUCGACUGGGACUUCAAGUAGACGUGGOH-5' ARN, sintetico

27 + 2 s

5'-OHGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACUU-3' ARN, sintetico 6

27 + 2 a

5'-OHGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUU-3' ARN, sintetico 7

27 + 2 ds

5'-OHGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACUU-3' 3'-UUCGACUGGGACUUCAAGUAGACGUGGOH-5' ARN, sintetico

3pARN

5'-pppGGGGCUGACCCUGAAGUUCAUCUU-3 ' ARN, transcrito in vitro 2

CpG-A

5'-GGGGGACGAT CGT CGGGGGG-3 ' ADN 3

(p: monofosfato; ppp: trifosfato; letras subrayadas: enlace fosforotioato en 3 'de la base; letras en negrita, dinucleotidos CpG)

Como se muestra en la figura 2B, independientemente de la presencia o ausencia de un 5'-trifosfato, todos los 5 oligonucleotidos de ARN probados fueron capaces de inducir la produccion de IFN-a a partir de las CDP que utilizan principalmente TLR7 para reconocimiento del ARNdc corto (vease el ejemplo 1).

Como se muestra en la figura 2B, mientras que el oligonucleotido de ARN se transcribio in vitro, 3pARN, que lleva 5'- trifosfato, provoco una cantidad significativa de IFN-a, los oligonucleotidos de ARN sinteticos que llevan 5' OH no pudieron provocar ninguna produccion de IFN-a a partir de monocitos, independientemente de si el oligonucleotido 10 tema extremos romos o prolongaciones en 3'.

Estos resultados indican que el 5'-trifosfato es estrictamente necesario para la induccion de IFN-a en los monocitos. Dado que en el reconocimiento de ARN y la induccion de IFN-a interviene como mediador principalmente RIG-I en monocitos (vease el ejemplo 1), estos datos sugieren que el extremo romo no es reconocido por RIG-I, al menos no en ausencia de 5'-trifosfato.

15 Ejemplo 3. El extremo romo aumenta la actividad inmunoestimulante de los oligonucleotidos bicatenarios sinteticos que llevan 5'-trifosfato.

Dado que los oligonucleotidos de 3pARN son capaces de inducir la produccion de IFN-a a partir de las CDP a traves de una ruta dependiente de TLR7 (vease el ejemplo 1), con el fin de estudiar la induccion de IFN-a dependiente de RIG-I, los oligonucleotidos de ARN (figura 3 y Tabla 3) se transfectaron en monocitos purificados, CMSp reducidas 20 por CDP (CMSP-CDP) o CMSP tratadas con cloroquina (CMSP+Chl).

El diseno y la designacion de los oligonucleotidos de ARN se muestran en la figura 3 y las secuencias de los oligonucleotidos se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Secuencias de oligonucleotidos de ARN y ADN

Denominacion

Secuencia Extremo 5' Tipo SEQ ID n°

3P-A

AACACACACACACACACACACUUU 3P ARN, syn 8

ivt3P-G

GACACACACACACACACACACUUU 3P ARN, ivt 9

3P-G

GACACACACACACACACACACUUU 3P ARN, syn 9

3P-C

CACACACACACACACACACACUUU 3P ARN, syn 10

3P-U

UACACACACACACACACACACUUU 3P ARN, syn 11

HO-A

AACACACACACACACACACACUUU OH ARN, syn 8

P-A

AACACACACACACACACACACUUU P ARN, syn 8

AS A26

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUUGU OH ARN, syn 12

AS A25

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUUG OH ARN, syn 13

AS A24 + 2A

AAAAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 14

AS A24 + A

AAAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 15

AS A24

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 16

AS A23

AAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 17

AS A21

GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 18

AS A20

UGUGUGUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 19

AS A19

GUGUGUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 20

AS A17

GUGUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 21

Denominacion

Secuencia Extremo 5' Tipo SEQ ID n°

AS A15

GUGUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 22

AS A13

GUGUGUGUGUGUU OH ARN, syn 23

AS G26

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUCGU OH ARN, syn 24

AS G25

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUCG OH ARN, syn 25

AS G24 + 2A

AAAAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 26

AS G24 + A

AAAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 27

AS G24

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 28

AS G23

AAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 29

AS G21

GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 30

AS G20

UGUGUGUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 31

AS G19

GUGUGUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 32

AS G17

GUGUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 33

AS G15

GUGUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 34

AS G13

GUGUGUGUGUGUC OH ARN, syn 35

AS C26

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGGU OH ARN, syn 36

AS C24

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUG OH ARN, syn 37

AS U26

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUAGU OH ARN, syn 38

AS U24

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUA OH ARN, syn 39

AS23

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU OH ARN, syn 40

AS21

AAAGUGUGUGUGUGUGUGUGU OH ARN, syn 41

AS19

AAAGUGUGUGUGUGUGUGU OH ARN, syn 42

IVT2

GACGACGACGACGACGACGACGACGACGAC 3P ARN, ivt 43

dAdT

(AT)200-4000 P ADN, syn

(syn: sintetico; ivt: transcrito in vitro)

Como se muestra en las figuras 4A, 5A y 6A, se necesito una longitud mmima de 21 nucleotidos para un oligonucleotido de 3pARN bicatenario para inducir IFN-a a partir de monocitos. Ademas, la actividad inductora mayor

de IFN-a se observo cuando el oligonucleotido de 3pARN bicatenario tema un extremo romo en el mismo extremo 5 que lleva el 5'-trifosfato. La estructura del extremo que no lleva un 5'-trifosfato no pareda afectar a la

actividad inductora de IFN-a-del oligonucleotido en ningun grado significativo. Por otra parte, los oligonucleotidos de ARNdc con una A en el extremo 5' que lleva el 5'-trifosfato eran mas potentes en la induccion de IFN-a que aquellos con una Go U en la misma posicion; los oligonucleotidos de ARNdc con una C en el extremo 5' que lleva el 5'- trifosfato fue el menos potente. Resultados similares se obtuvieron con las CMSP reducidas con CDP y las CMSP 10 tratadas con cloroquina (figura 4-6, B y C).

En contraste, los oligonucleotidos bicatenarios que llevan un 5'-monofosfato no fueron eficaces en la induccion de IFN-a, con independencia de las estructuras del extremo (figura 6).

Estos datos sugieren que se requiere 5'-trifosfato para reconocimiento de RIG-I. Ademas, el extremo romo es una firma molecular reconocida por RIG-I; ella aumenta la potencia de un oligonucleotido de ARN bicatenario sintetico 15 que lleva 5'-trifosfato en el mismo extremo en la induccion de IFN-a traves de la ruta de RIG-I.

Ejemplo 4. Transcritos de ARN monocatenario pueden generarse por transcripcion in vitro.

Tanto el dcARN sintetico que lleva 5'-trifosfato como el ARNmc transcrito in vitro han demostrado ser capaces de

15 25 ' 1

activar RIG-I . Los presentes inventores descubrieron que se requiere una configuracion bicatenaria para la activacion de RIG-I 19 Se supuso que el ARNmc obtenido por transcripcion in vitro era capaz de activar RIG-I, 5 probablemente debido a la presencia de transcritos de ARN anomalos que teman una configuracion bicatenaria.

De hecho, cuando ARNmc se transcribio in vitro en presencia de los 4 NTP (es decir, ATP, UTP, GTP, CTP) y se introdujo en un gel de urea poliacrilamida, se observaron dos bandas, lo que indica la presencia de especies bicatenarias (figura 7C, muestra 4, "ivt3P-G_ACA").

Tabla 4. Secuencia de oligonucleotidos de ARN.

Denominacion

Secuencia Tipo SEQ ID n°

3P-G

5'-pppGACACACACACACACACACACUUU-3 ' ARN, sintetico 9

AS-G21

5'-OHGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUC-3 ' ARN, sintetico 30

inv3P-G_ACA

5'-pppGACACACACACACACACACACACA-3 ' ARN, transcripcion in vitro 44

10

Posteriormente, la transcripcion in vitro se llevo a cabo en ausencia de UTP. Sorprendentemente, la banda superior desaparecio a partir del gel y la transcripcion no indujo ninguna induccion de IFN-a a partir de monocitos humanos primarios purificados (figura 7A-C, muestra 5, "ivt3P-G_ACA-U").

La adicion de una cadena complementaria sintetica (AS G21) a dicho oligonucleotido de ARN monocatenario 15 transcrito in vitro (ivt3P-G_ACA-U), que por sf mismo no tiene actividad inductora de IFN restablecio la actividad inductora del IFN (figura 1A-C, muestra 6, "ivt3P-G_ACA-U + AS G21").

Este resultado sugiere que es posible obtener un ARNmc sin formacion de la doble cadena y sin actividad inductora del IFN a partir de la transcripcion in vitro. Dicho ARNmc transcrito in vitro puede convertirse en un ligando de RIG-I activo unicamente tras la formacion de la doble cadena con una cadena complementaria.

5

10

15

20

25

30

Referencias

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2. Alexopoulou L. et al. Nature 2001; 413(6857): 732-8.

3. Diebold S.S. et al. Science 2004; 303(5663): 1529-1531.

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5. Hornung V. et al. Nat. Med. 2005; 11(3): 263-70.

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7. Matsumoto M. et al. J. Immunol. 2003; 171(6): 3154-62.

8. Nishiya T., DeFranco A.L. J. Biol. Chem. 2004; 279(18): 19008-17.

9. Latz E. et al. Nat. Immunol. 2004; 5(2): 190-8.

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16. Marques J.T. et al. Nat. Biotechnol. 2006; 24(5): 559-65.

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18. Sioud M. Eur. J. Immunol. 2006; 36(5): 1222-30.

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20. Kim D.H. et al. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 321-5.

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29. Documento WO 2007/031322

30. Gondai T. et al. Nucleic Acids Res. 36 (3): e18

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un preparado de oligonucleotido que comprende una poblacion homogenea de un oligonucleotido,

   en donde el oligonucleotido tiene dos extremos romos,

   en donde los extremos romos son extremos de una seccion totalmente bicatenaria, y en donde la seccion totalmente bicatenario es por lo menos de 21 pares de bases de longitud, y el oligonucleotido bicatenario tiene un extremo romo que lleva un 5'-trifosfato unido a la mayona de 5-ribonucleotido y un segundo extremo romo que no lleva un 5'-trifosfato,

   en donde el oligonucleotido comprende al menos 1, preferiblemente al menos 3, mas preferiblemente al menos 6 ribonucleotidos en el extremo 5' en el extremo romo que lleva el 5'-trifosfato, y

   en donde el 5'-trifosfato no tiene ninguna estructura de terminacion.
2. 2. El preparado de oligonucleotidos de la reivindicacion 1, en donde al menos el 85% de los oligonucleotidos en el preparado tienen la misma identidad qrnmica o composicion qrnmica.
3. 3. El preparado de oligonucleotidos de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el oligonucleotido comprende al menos una inosina.
4. 4. El preparado de oligonucleotidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la mayona de 5'- ribonucleotidos con el trifosfato unido se selecciona de A, G, U o C preferiblemente A o G.
5. 5. El preparado de oligonucleotidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el oligonucleotido no presenta modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en pseudouridina, 2-tiouridina, 2'-fluor-dNTP y NTP 2'-O-metilado, o en donde el oligonucleotido contiene nucleotidos modificados que no ponen en peligro la actividad inductora del IFN tipo I.
6. 6. El preparado de oligonucleotidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el oligonucleotido comprende al menos un motivo estructural reconocido por al menos uno de TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9.
7. 7. El preparado de oligonucleotidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el oligonucleotido tiene actividad de silenciamiento genico.
8. 8. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un preparado de oligonucleotidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
9. 9. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 8, que comprende ademas al menos un agente seleccionado de un agente inmunoestimulante, un agente antivmco, un agente antibacteriano, un agente antitumoral, acido retinoico, IFN-a, e IFN-p.
10. 10. Utilizacion de al menos un preparado de oligonucleotidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la preparacion de una composicion para inducir la produccion de IFN tipo I.
11. 11. Utilizacion de al menos un preparado de oligonucleotidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la preparacion de un medicamento para su uso en la prevencion y/o el tratamiento de una enfermedad o afeccion seleccionada de una infeccion, un tumor y un trastorno inmunitario.
12. 12. La utilizacion de la reivindicacion 10 u 11, en donde el medicamento es para su uso en combinacion con al menos un agente seleccionado de un agente inmunoestimulante, un agente antivmco, un agente antibacteriano, un agente antitumoral, acido retinoico, IFN-a e IFN-p.
13. 13. La utilizacion de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde el medicamento es para administracion en combinacion con al menos un tratamiento seleccionado de un tratamiento profilactico y/o terapeutico de una infeccion, un tumor y un trastorno inmunologico.
14. 14. Un metodo in vitro para inducir la produccion de IFN tipo I en una celula, que comprende las etapas siguientes:

    (a) mezclar al menos un preparado de oligonucleotidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 con un agente de complejacion; y

    (b) poner en contacto una celula con la mezcla de (a), en donde la celula expresa a RIG-I.