ES2554427A2 - Cepas bacterianas y sus usos en reacciones de acilación y/o desacilación - Google Patents

Abstract

Cepas bacterianas y sus usos en reacciones de acilación y/o desacilación. La presente invención describe cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo reacciones de alcoholisis y esterificación regioselectivas y el uso de las mismas en la producción de carbohidratos y polifenoles lipófilos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria. Asimismo, la invención divulga el método de obtención de las cepas microbianas y el método de obtención de los carbohidratos y polifenoles lipofílicos.

Description

La presente invención se refiere a las cepas microbianas de los géneros Terribacillus denominada Tenibacillus sp. AE2B122, Bacil/us, denominada Bacillus sp. HR21-6, Enterobacter, denominada En/embaeter sp. AE1B89 y Pseudomonas, denominada Pseudomonas sp. AE2B120 con capacidad de llevar a cabo reacciones de alcoholisis y esterificación regioselectivas y el uso de las mismas en reacciones de acilación ylo desacilación, en general y más específicamente, en reacciones de acitación ylo desadlaci6n para la producción de carbohidratos y polifenoles lipófilos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria. Asimismo, la invención también se refiere a un método para obtener estas cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo estas reacciones. Así como la obtención de regioisómeros de los azúcares y polifenoles parcialmente acilados. Por lo tanto, la invención es de utilidad en los campos de la Microbiología Industrial e Ingeniería Química, en particular, en el sector de la producción de compuestos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La protección y desprotección quimio-, re'gio-y estereoselectiva constituye una de las estrategias más utilizadas en síntesis orgé~nica, especialmente valiosa en la síntesis de moléculas complejas y polifuncionales, entre las que se encuentran los carbohidratos y los polifenoles. Aunque son muchos los avances que se han conseguido en este campo en las últimas décadas, aún se está muy lejos de alcanzar la perfección de las reacciones naturales, por lo que este aspecto sigue siendo hoy en día uno de los grandes retos en síntesis orgánica.

La biocatálisis, y particularmente el use) de enzimas hidrolíticas como las lipasas, constituye una alternativa a los métodos convencionales en síntesis orgánica y puede ser útil para realjzar protecciones y desprotecciones estéreo-y regioselectivas en carbohidratos (Filice, M. el al. Na!. Protoc. 7, 1783-1796; 2012) Y polifenoles (Torres, P. et al. J. Agric. Food ehem. 58, 807-813; 2010). Delerminados carbohidratos y polifenoles son de interés en la industria farmacéutica y alimentaria como se explica a continuación.

Diversos estudios epidemiológicos han puesto de manifiesto los efectos beneficiosos para la salud que se derivan del consumo de alimentos ricos en antioxidantes, ya que previenen el desarrollo de enfermedades crónicas degenerativas, incluidas enfermedades cardiovasculares y cáncer (Grez et al., Curr Opin Pharmaco/104 , 362-368; 2010). Dichos compuestos evitan los daños producidos por el estrés oxidativo en ciertas biomoléculas (ADN, lipidos, proteínas), que se encuentran asociados con un incremento en el riesgo de problemas cardiovasculares, cáncer y otras enfermedades crónicas (Cilla el al., Ann Nutr

Metab 54, 35-42; 2009).

Algunos estudios demuestran que los compuestos polifenólicos naturales son, in vitro, más efectivos como antioxidantes que la vitamina A o e (Miller et a1. , J Nutr Enviren Med 12, 39-51; 2002), por lo que existe un creciente interés de este tipo de compuestos, en especial aquellos que pueden ser obtenidos a partir de subproductos generados en la industria alimentaria. En este contexto, d;estaca el hidroxitirosol, que predomina en el olivo (Olea europea) , tanto en las hojas como en su frulo, ya sea libre o en forma de derivado, y que es un compuesto fenólico de una reconocida eficacia como antioxidante

(Fernández-Bolaños et al., CurrOrg Chem 12, 442-463; 2008).

En los últimos años, se ha comprobado que este antioxidante natural posee además importantes propiedades biológicas: antiagregante plaquetarie (González Correa et al. Br

J Nutr, 101, 1157-1164, 2009), antiinflamatorio (Gong et al., Phytother Res 23, 646-650, 2009), cardioprotector (Poudyal, H.J. Nutrition 140, 946-953; 2010), antimicrobiano (Medina et al. J Agric Food Chem 55, 9817-9823; 2007), Y anti-VIH (Lee-Huang et al., Biochem Biophys Res Commun 354, 872-·878; 2007). Actualmente, son numerosas las

investigaciones que intentan demostrar el beneficio de este compuesto en el tratamiento de ciertas enfermedades neurodegenerativas (Schaffer et aL, J Agric Food Chem 55,

5043-5049, 2007), Y de la piel (Guo et al,. Phytother Res 24, 352-359; 2010), en la

prevención del ictus cerebral isquémico y en la prevención y tratamiento del cáncer

(Sirianni et al. , Mol NutrFood Res 54, 833-840, 2010).

La aceituna contiene, además de hidroxitirosol, una amplia variedad de compuestos

fenólicos, tales como el 3,4-dihidroxifenilglicol (Brenes, M.J. Agric Food Chem 47, 35353540; 1999) Y el alcohol protocatecuico (Saitta, M. et al. Food Chem 112, 525-532, 2009).

OH

HO~OH

HOA/ Hidroxitirosol

HO~~OH HO~

3,4-Dihidroxifenilglicol

HO~OH

HOA/ Alcohol protocatecuico

Diversos estudios sobre los compuestos fe'n6licos del olivo muestran la importancia de los acil derivados en la cadena lateral de estos compuestos polifenólicos naturales, ya que el 5 carácter Iip6filo permite su dispersión en aceite, el atravesar membranas celulares y la captación por las células. y la protección de constituyentes de membrana y de LDL (Gupta et al., Adv. Food Nutr. Res. 69, 183-217; 2013). Es decir, se mejoran las propiedades fisico-químicas y se conservan las propiedades antioxidantes. Por lo tanto, es de gran interés para la industria alimentaria la obtención de nuevos antioxidantes lipofíllcos

10 mediante modificación de pOlifenoles naturales. Estos análogos estructurales lipófilos tienen una mejor biodisponibilidad, son más eficaces que los polifenoles naturales utilizados como material de partida, y son útiles en la formulación de "alimentos funcionales" que presentan efectos beneficiosos para la salud.

15 Bouallagui y colaboradores (Bouallagui et al., App/ Biochem Biotechno/ 163, 592-599, 2011) han descrito la producción enzimática de hidroxitirosol acetato e hidroxitirosol oleato usando la lipasa de C. antarctica (Novozyrn 435), obteniendo compuestos con actividades biológicas optimizadas en cuanto a la biodisponibilidad y actividad antioxidante. La acilación catalizada con lipasa de C. antarctica B tiene lugar quimioselectivamente sobre el

20 hidroxilo de la cadena alifatica frente a los hidroxilos aromáticos (Torres de Pinedo et al., Tetrahedron 61 , 7654-7660; 2005).

Por otra parte, azúcares eslerificados parcialmente o con diferentes funciones en los distintos carbonos, constituyen importantes ~buifding blocks" para la slntesis de una amplia

25 variedad de derivados mas complejo!;. Así por ejemplo, los monosacáridos y oligosacáridos con un único hidroxilo libre son compuestos intermedios para la síntesis de heterooligosacáridos de interés biomédico y actividad farmacológica como antitumorales, antiinflamatorios, etc. (Plou et al., J Biotechno/96, 55-66; 2002).

Desafortunadamente, el elevado número de grupos hidroxilo en los azúcares y su similar reactividad hace que en muchos casos no sea posible introducir regioselectivamente determinadas funciones, o requiera recurrir a una larga y costosa secuencia de síntesis, para llevar a cabo transformaciones en solo alguno de los grupos hidroxilo.

A pesar del interés de las reacciones de carbohidratos biocatalizadas con lipasas, los antecedentes de casos de protección o des protección regioselectiva de monosacáridos en posiciones distintas a C-1 y C-6 son muy escasos. Asimismo, son también muy pocos los ejemplos en los que se describlen reacciones de protección/desprotección regioselectiva en uno de los dos carbonos primarios (C-6 y C-6') de disacáridos de hexosas.

Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de encontrar nuevas enzimas capaces de llevar a cabo reacciones de ':Icilación y/o desacilación regioselectivas con la finalidad de obtener nuevos compuestos de interés en la industria farmacéutica y alimentaria.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Para superar los problemas existentes en el estado de la técnica mencionados previamente, un primer aspecto de la pmsente invención describe cepas microbianas seleccionada de la lista que comprende cepa de Bacillus depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8484, cepa de Enterabacter depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) cen el número de acceso CECT 8462, cepa de Pseudomonas depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8463 y cepa de Terribacillus depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8231 que tienen 1;:1 capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de acilaci6n (esterificación) y/o desacilación (alcoholisis), preferentemente sobre polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales, lo que permite la obtención de una colección de compuestos de interés acilados y/o eterificados en diferentes posiciones. Así, en base a la capacidad de estas bacterias de llevar a cabo estas reacciones de esterificación y alc:oholisis, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicadOS Em detalle a continuación.

Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de cualquiera de las cepas bacterianas descritas en la presente invención.

5

Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso de las cepas bacterianas o al uso del extracto enzimático de la invención como catalizadores para las reacciones enzimáticas de acilaci6n y/o desacilación de compuestos, siendo preferidos los compuestos pOlifenoles ylo carbohidratos o sus derivados acilados.

10 '5 20

Otro aspecto descrito en la presente invl9nci6n se refiere a un método para obtener derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante reacciones enzimáticas de acilación o desacilación sobre politeno les y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas: a) poner el extracto enzimático se~lún se describe en la presente invención, en contacto con pOlitenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de aGilación o desacilación, respectivamente; y b) purificar los derivados acilados de politenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa (a). Otro aspecto descrito en la presente invendón se refiere al compuesto de f6rmula general (1)

OR, HO~OR2

HOV

25

(1)

30

donde: R, es un grupo alquilo (C,-C,.), un grupo alquenilo (C,-C,.), un grupo alquinilo (C2 -C20) , o un grupo arilalquilo; y R2 es un grupo aciJo (-COR3) , donde ~es un grupo alquilo C1-C20, o un hidrógeno.

Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso del compuesto de fónnula general (1) descrito previamente para la elaboración de un medicamento.

Otro aspecto descrito en la presente invend6n se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente junto con un vehículo farmacéutica mente aceptable.

5 Otro aspecto descrito en la presente invención hace referencia al uso de al menos un compuesto de f6rmula general (1) según se ha descrito previamente para la elaboración de una composición alimenticia.

Otro aspecto descrito en la presente invendón hace referencia al uso no terapéutico de al

10 menos un compuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente, como antioxidante, preferiblemente alimentario , o como componente de composiciones cosméticas.

Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a una composici6n alimenticia o 15 cosmética que comprende al menos un c1:lmpuesto de fórmula general (1) según se ha descrito previamente.

Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (1) según se ha descrito previamente a lo largo de la 20 presente invención, que comprende: a_ la reacción enzimática del compuesto 3,4-dihidroxifenilglicol peracilado con

R,OH; o

b. la reacci6n enzimática del compuesto 3,4-dihidroxifenilglicol peracilado con R,OH y posteriormente la reacción con metanol del compuesto obtenido en 25 el paso (a) bajo catálisis básica;

donde R, es un grupo alquilo (C,-C2Q), un grupo alquenilo (CT C20) , un grupo alquinilo (C2-C20) , o un grupo arilalquilo; SE!gún se ha definido para el sustituyente R1 del compuesto general de fórmula (1).

30 Otro aspecto descrito en la presente invemci6n se refiere a un compuesto de fórmula 2,3,4,6,6'-penta-D-acetil-a.,a.-D-trehalosa o 2,3,4,6-tetra-D-acetil-a.,a.-o-trehalosa, así como al uso de dichos compuestos como intermediarios de reacción para la síntesis de derivados de trehalosa, así como en la preparación de análogos de glicollpidos presentes en Mycobacterium tuberculosis.

Otro aspecto descrito en la presente invenc:ión se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos 2,3,4,6,6'-penta-O-acetil-cx,cx-D-trehalosa o 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a,aD-trehalosa que comprende:

a. la reacción enzimática de per-Q-acetil-u,u-D-trehalosa con metanol o 5 metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Relación filogenética de las cEipas Terribacillus sp. AE28 122, Bacillus sp.

10 HR21-6 con otras bacterias Gram posilivas (A), y las cepas Entembacter sp. AE1889 Y Pseudomonas sp. AE28120 con otras bacterias Gram negativas (B) filogenéticamente relacionadas. Para su realización se ha utilizado el método de Neighbor-Joining. Junto a las ramas se muestra el porcentaje de réplicas de los árboles que presentan esos taxones juntos en un mismo agrupamiento en el test estadistico bootstrap (500 réplicas).

15 Las distancias evolutivas se han calculado con el método Maximum Composite Likelihood, y se expresa en unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Las secuencias comprendran entre 640 y 650 posiciones. Para los análisis filogenéticos se ha usado el programa MEGA4 (http://www.megasoftware.neUmega4/mega.html).

20 Figura 2. Se representa la actividad antirradicalaria (captación de radicales libres mediante donación de atamos de hidrógeno) frente al radical libre OPPH (2,2-difenil-1picrilhidracilo) expresada en valores de EC50 (j.lM) del acetato de hidroxitirosilo 2, de los éteres fenólicos 4a-4d, 5a-5d, y del 3,4-dihidroxifenilglicoI14.

25 Figura 3. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 27 (metil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a-D-glucopiranósido) mediante el extracto enzimático de la invención.

30 Figura 4. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) ampliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 30 (per-O-acetil-a,a-D-trehalosa) mediante el extracto enzimático de la presente invención.

Figura 5. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear CH-RMN) (A) y espectro de resonancia magnética nuclear (1 H-RMN) almpliado (B) del procedimiento de desacilación del compuesto 34 (per-O-acetilsacarosa) rnediante el extracto enzimático de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Los inventores de la presente invención han identificado una serie de cepas microbianas, en particular, las cepas bacterianas Terribacillus sp. AE28 122, Bacil/us sp. HR21-6, Enterobacter sp. AE1889 y Pseudomonas sp. AE28120 depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con los números de registro 8231 (con fecha de depósito 20.11.2012), 8464, 8462, 8463 (con fecha de depósno de 22 de Octubre de 2013), respectivamente, que tienen la capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de acilación (por ejemplo esterificación) y/o desacilación (por ejemplo alcoholisis). Dichas reacciones de acilación y/o desacilación se llevan a cabo preferentemente sobre polifenoles y/o carbohidratos naturales, y de eterificación en posiciones bencílicas de polifenoles durante la alcoholisis de ésteres de hidroxilos fenólicos, lo que permite la obtención ele una colección de compuestos de interés acilados y/o eterificados en diferentes posiciones. Así, en base a la capacidad de estas bacterias de llevar a cabo estas reacciones de esterificación y alcoholisis, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán explicados en detalle a continuación.

Cepas microbianas de la invención y SWi usos

Mediante métodos de screening sobre muestras obtenidas de diferentes lugares de procedencia, como por ejemplo almazaras, industrias de conservas de pescado, etc, se han seleccionado una serie de cepas microbianas con actividad lipolítica y capacidad de llevar a cabo reacciones regioselectivas de esterificación (acilación) y/o alcoholisis (desacilación), en particular sobre carbohidratos y/o polifenoles, preferentemente naturales.

Estas cepas microbianas fueron sometidas: a un análisis filogenético mediante el análisis de la secuencia del gen 168 ARNr. De este análisis se identificaron las cepas con las que

mayor valor de identidad presentaban las cepas microbianas de la invención, siendo

Terribacillus goriensis CL-GR16 (número ele acceso a GeneBank: NR_043895), Bacillus stratosphericus JCM 13349 (número de acceso a GeneBank NR_042336), Enterobacler

ludwigii EN-119 (número de acceso a G43neBank AJ853891) Y Pseudomonas stutzeri

5 ATCC 17588 (número de acceso a GeneBank NR_103934).

Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a las cepas microbianas de la invención, que pertenecen a los génHros Terribacillus, Bacillus, Enterobacter y Pseudomonas que, en otra realización todavra más particular, son las cepas microbianas

10 denominadas Tembacillus sp. cepa AE2B122 (CECT 8231), Bacillus sp. HR21 -6 (CECT 8484), Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).

Las cepas microbianas de la invención fueron depositadas bajo el Tratado de Budapest 15 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) [Parc Científic Universitat de Valencia, calle Catedrático Agustín Escardino, 9, 46!:180 Paterna (Valencia)] el 20 de Noviembre de

2012 (CECT 8231 ), y el 22 de Octubre de 2013 (CECT 8484, CECT 8462 y CECT 8463).

Por lo tanto, un aspecto de la invención se relaciona con las cuatro cepas microbianas, 20 con capacidad de llevar a cabo reacciones de acilación / desacilación que están

depositadas en la CECT con los números de registro CECT 8231 , CECT 8484, CECT

8462 y CECT 8463. En una realización particular, las cepas preferidas son: CECT 8464,

CECT 8462 y CECT 8463.

25 Como entiende el experto en la materia, las cepas microbianas de la invención pueden ser cultivadas en un medio de cultivo líquido para obtener un sobrenadante que, después de ser sometido a procesos de concentración y opcionalmente, liofilización y/o dialización, se obtiene un extracto enzimático que, al igual que cualquiera de las cepas de la invención, puede usarse para llevar a c:abo reacciones de acilaci6n y/o desacilaci6n,

30 siendo útil en la producción de los compuestos de interés.

Además, las cepas microbianas de la invención pueden ser cultivadas en presencia o en ausenaa de un sustrato lipídico con el objetivo de obtener sobrenadantes que contendrán

las enzimas y compuestos necesarios para llevar a cabo la reacción de acilación y/o desacilación.

A efectos de la presente invención, el término ·sustrato lipídico· se refiere a un compuesto de naturaleza lipídica, sobre el cual actuarán las lipasas de las cepas microbianas. Ejemplos de sustratos lipidicos incluyen, sin limitar a, surfactantes, triglicéridos, aceites esenciales, más particularmente, tributirina, Tween 80, Tween 20 y aceites vegetales, tales como aceite de oliva y/o aceite de girasol. En una realización particular, el sustrato lipídico es tributirina. La concentración del sustrato lipidico en el medio de cultivo puede ser variable, pudiendo emplearse concentraciones de entre 0,1 4%, e incluso mayores. Preferiblemente, la concentración del sustrato lipídico en el medio de cultivo es de alrededor del 2% en peso con respecto al cultivo fina l.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de las cepas microbianas de la invención, capaz de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación. A efectos de la presente invención los términos sobrenadante y extracto enzimático se utilizan indistintamente.

A efectos de la presente invención, el término ·extracto enzimático· o ·sobrenadante" se refiere al sobrenadante obtenible del c:ultivo de las cepas de la invención, que opcionalmente puede ser sometido a procedimientos de concentración, liofilización y/o dialización y que comprende las enzimas que las cepas microbianas descritas en la presente invención excretan al medio de cultivo y que presentan actividad lipolítica y que son capaces de llevar a cabo reacciones regioselectivas de esterfficación (acilación) y/o alcoholisis (desacilación), es decir se utilizan como cata lizadores biológicos. El extracto enzimático o sobrenadante de la invención es, a efectos de la presente invención, un cóctel enzimático obtenido de los cultivos de las cepas de la invención.

Sin querer estar vinculado a ninguna teoría, los inventores consideran que, en el sobrenadante obtenido de los cultivos de las cepas de la invención, en medio líquido, están comprendidas las enzimas necesarias para llevar a cabo dichas reacciones de acilación y/o desacilación. Entre las enzimas que pueden formar parte de dicho sobrenadante se encuentran las lipasas que son enzimas que catalizan un amplio rango de reacciones (hidrólisis, interesterificaciones, alcoholisis, acidólisis, esterificación y

aminolisis, entre otras), incluyendo las reacciones que se detectan y se muestran en los ensayos y ejemplos que se describen lo largo de la presente invención.

El sobrenadante obtenido mediante el cultivo de las cepas de la invención pueden

5 contener no sólo las enzimas necesarias para llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, sino que también puede contener otro tipo de compuestos que pueden interaccionar con dichas enzimas, disminuyendo o potenciando la eficacia de conversión del sustrato a los productos resultantes de las reacciones. Por lo tanto, puede ser conveniente someter al sobrenadante a un proceso de concentración y de diálisis para

10 eliminar aquellas partículas o compuestos no deseables.

En la presente invención se entiende por ·concentración y/o diálisis· al proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus Indices de difusión a través de una membrana semi permeable. Típicamente, una solución de varios tipos de 15 moléculas es puesta en una bolsa semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de celulosa con poros, y la bolsa es sellada. La bolsa de diálisis sellada se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de los poros (a menudo agua, sales y otras moléculas pequeñas) tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera de la bolsa

20 de diálisis en la dirección de la concentración más baja. La técnica de diálisis es ampliamente conocida en el estado de la técnica y su puesta en práctica es rutinaria para el experto en la materia. En la puesta en práctica de la presente invención, el sobrenadante de la invención se vertió en una bolsa de diálisis de 12 KDa y tras ser concentrado con polietilenglicol 8 KDa, se dializó con lampón fosfato potásico.

Por lo tanto, en una realización particular, el extracto enzimático descrito en la presente invención, obtenido a partir de los cultivos de las cepas de la invención, está concentrado y/o dializado.

30 Adicionalmente, tanto si el extracto enzimático de la invención está concentrado y/o dializado o no, éste puede ser sometido a un proceso de liofilización. Por lo tanto, en otra realización particular, el sobrenadante de la invención está liofilizado.

La liofilización es un proceso en el que :se congela el producto y, posteriormente, se introduce en una cámara de vacío para realizar la separación del agua por sublimación. De esta manera se elimina el agua desde· el estado sólido al gaseoso del ambiente sin pasar por el estado líquido. La técnica de liofilización es ampliamente conocida en el estado de la técnica y su aplicación es práctica de rutina para el experto en la materia.

Una vez obtenidas tanto las cepas microbianas de la invención, como los extractos enzimáticos producidos a partir del cultivo de éstas, y probado que son capaces de llevar a cabo reacciones de acilación y/o desacilación, el experto en la materia entiende que, tanto las cepas microbianas, como los extractos enzimáticos de la invención, pueden emplearse para producir los compuestos de interés que se indican más adelante.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de las cepas microbianas o de los extractos enzimáticos obtenidos de cultivos de dichas cepas, según la invención, para la producción de derivados acilados, siendo preferentemente los sustratos de partida, polifenoles y/o carbohidratos, naturales o no.

En una realización particular, la producción de derivados acilados de pOlifenoles y/o carbohidratos se lleva a cabo mediante reacciones regioselectivas de acilación o desacilación de polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales.

A efectos de la presente invención los términos ~regioselectivo/a" o uregioselectividadM se refieren a la preferencia de una reacción de esterificación o hidrólisis en un hidroxilo alifático de varios posibles, o un hidroxilo aromático de varios posibles.

A efectos de la presente invención los términos "quimioselectivo/a" o -quimioselectividad" se refieren a la preferencia de una reacción de esterificación o alcoholisis en un hidroxilo alifático (alcohol) frente a un hidroxilo aromático (fenal) o viceversa.

Más detalles sobre la producción de derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante el empleo de las cepas microbianas o de los extractos enzimáticos de las mismas, descritos en la presente invención, puede encontrarse en los Ejemplos 3 y 5 donde se describe el método de producción de los mismos.

Biotransfonnaciones regiose/ectivas para /a obtención de derivados aci/ados lipofílicos de polifeno/es y/o carbohidratos.

Como se ha explicado anteriormente, los inventores han descubierto nuevas cepas microbianas con capacidad de llevar a cabo reacciones de acilaci6n y/o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, preferentemente naturales o no, por lo que tanto las cepas microbianas, como los extractos enzimáticos obtenidos a partir del cultivo de las mismas, pueden emplearse en la obtención de los compuestos que se indican a continuación.

Asi, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener derivados acilados de polifenoles y/o carbohidralos. preferenlemenle a partir de polifenoles y/o carbohidratos naturales, mediante reacciones de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas:

a) poner el extracto enzimático según S43 define a lo largo de la presente invención, en

contacto con polifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en

presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones

enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente y, opcionalmente

b) purificar los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la

elapa (a).

A efectos de la presente invención, el término wpurificar" o "purificaci6n~ se refiere tal y como se emplea en la descripción, a la separación de los derivados acilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos mE..~iante el método descrito en la invención y a su concentración. La separación de dichos compuestos del resto de productos que le puedan acompañar y que no sean de interés, puede llevarse a cabo mediante técnicas de solubilidad diferencial, cromatografia, electroforesis o isoelectroenfoque. Las técnicas de cromatografía pueden estar basadas en EII peso molecular, la carga o la afinidad de la proteína y puede realizarse en columna, en papel o en placa. La separación de los compuestos puede realizarse, por ejemplo, por cromatografía líquida rápida (FPLC, del inglés Fast Protein Liquid Cromatography), en un sistema automatizado que reduce notablemente el tiempo de purificación e incrementa el rendimiento de la purificación.

En una etapa previa a la etapa a) del método de la invención, las cepas microbianas de la invención son cultivadas en presencia o en ausencia de un sustrato lipídico con el objetivo de obtener unos extractos enzimáticos que contengan las enzimas y compuestos necesarios para llevar a cabo la reacción de acilación y/o desacitación sobre los

5 polifenoles y/o carbohidratos.

Las cepas bacterianas de la invención SEl crecen en un medio de cultivo liquido para extraer el sobrenadante y posteriormente obtener los extractos enzimáticos. Para Terribacil/us sp. AE28 122 (CECT 8231), Bscil/us sp. HR21-6 (CECT 8234) se ha

10 utilizado como medio de cultivo, PYA (agar, peptona y extracto de levadura). En el caso de Enterobacter sp. AE1 889 (CECT 8232) y Pseudomonas sp. AE28120 (CECT 8233) se ha utilizado como medio de cultivo, LB (Luria-Bertani), aunque es importante mencionar que se podría utilizar cualquier otro medio de cultivo en el cual las cepas de la invención puedan crecer.

Opcionalmente, el cultivo líquido se puede suplementar con un sustrato lipídico para incrementar la secreción de las enzimas presentes en el extracto enzimático de la invención, secretadas por las cepas de la invención y que son las responsables de llevar a cabo las reacciones de acilación/desacilación sobre los polifenoles y/o carbohidratos.

20 Como se ha comentado previamente, dichas enzimas se considera que son, preferentemente, lipasas. Así, en una realización particular, el medio de cultivo puede estar suplementado con un sustrato lipídico, de acuerdo a como se ha descrito previamente en la presente descripción de la invención.

25 Los cultivos se realizan a temperatura de entre 22°C y 37°C, en agitación durante 2-3 días. Transcurridos estos días se extrae el sobrenadante que como hemos mencionado anteriormente, contendrá las enzimas, prElferentemente lipasas, encargadas de llevar a cabo las reacciones descritas en la presente invención.

30 El sobrenadante resultante de los cultivos puede aislarse por técnicas de rutina para el experto en la materia. Por ejemplo, una vez transcurrido el periodo de incubación, el cultivo puede dejarse reposar para que las células decanten o puede someterse a centrifugación, consiguiendo de ambas formas separar las células del medio de cultivo

liquido. Posteriormente, puede obtenerse el sobrenadante, por ejemplo por aspiración con una pipeta.

Una vez obtenido el extracto enzimatico, éste se pone en contacto con los compuestos

5 que se quieran someter a las reacciones de acilaciónldesacilación (etapa (a)]. Las condiciones adecuadas para llevar a cabo estas reacciones se explican detalladamente en cada uno de los ejemplos que contiene la presente invención.

En una realización preferida, los compuestos de partida son preferentemente polifenoles 10 o carbohidratos.

En otra realización preferida, los sustratos de tipo fenólico de la etapa a) del método de la invención, se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de los siguientes: hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol, alcohol protocatecuico y derivados acetilados de los

15 mismos, preferiblemente: hidroxitirosol trialcetilado, 3.4-dihidroxifenilglocol tetraacilado y alcohol protocatecuico peracilado.

En otra realización preferida, los sustratos de tipo carbohidratos del paso a) del metodo de la invención, se seleccionan de entre mono-, di-, oligo-, pOlisacáridos o cualquiera de

20 sus derivados acilados, preferiblemente: metil a-O-glucopiranosido per-O-acetllado, trehalosa octaacetilada y sacarosa octaacetilada.

Por ~derivados acetilados~ se refiere a compuestos fenólicos o carbohidratos con al menos un grupo -OH sustituido por un grupo -oCOCH3.

Tal como se ha explicado previamente, Eln el presente documento, los sobrenadantes obtenidos en una etapa previa a la eté:lpa a) del método de la invención, pueden concentrarse y/o dializarse, según se ha explicado previamente, o pueden usarse tal cuales.

Por lo tanto, en una realización particular, el metodo de obtención de derivados acilados de polifenoles ylo carbohidratos de la invención comprende entre las etapas (a) y (b), una etapa opcional dirigida a la concentración y/o dialización de los sobrenadantes, así como

a su posterior liofilización. Las técnicas de concentración, dialización y liofilización se describen con detalle en el Ejemplo 2.

A continuación se detallan las diferent.es reacciones de acilación/desacilación de

5 compuestos fenólicos y/o carbohidratos mediante las reacciones enzimáticas catalizadas por las enzimas presentes en los sobrenadantes o extractos enzimáticos recogidos de los cultivos de las cepas descritas en la presente invención, para la obtención de compuestos fenólicos y/o carbohidratos acilados lipofílicos.

10 En una realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el polifenol del paso (a) es un derivado acetilado de hidroxitirosol, 3,4.dihidroxifenilglicol o alcohol protocatecuico, preferiblemente hidroxitirosol triacetilado, 3,4-dihidroxifenilglocol tetraacilado o alcohol protocatecuico peracilado, y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático.

Por ~alcohol alifático· se entiende en la presente invención a un grupo alquilo (C1 ·C7) , lineal o ramificado, con al menos un radical -OH, por ejemplo, pero sin limitarse a metanol, etanol, propanol, butanol, entre otros. Preferiblemente el alcohol alifático es metanol (MeOH). El alcohol alifático puede estar opcionalmente deuterado a temperatura

20 ambiente (aprox. 18-30"C).

En una realiza ción más preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el polifenol del paso (a) es un hidroxitirosol triacetilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de metanol.

En otra realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación de los hidroxilos aromáticos, el politenol del paso (a) es 3,4·dihidroxifenilglicol tetraacilado o alcohol protocatecuico peracilado y la reacción Be lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático para producir la eterificación en la posición bencílica.

En otra realización preferida, la reacción enzimática es de acilación, el polifenol del paso

(a) es hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocatecuico y la reacción se lleva a cabo en presencia de un grupo acilante y opcionalmente de un co·disolvente.

Por -grupo acilante" se entiende a un reactivo capaz de reaccionar con un compuesto agregando un grupo acilo a su estructura, como por ejemplo, el grupo acilante puede ser sin limitarse a acetato de isopropenilo o acetato de vinilo, que a su vez actúan de disolvente.

La reacción de acilación se puede hacer en ausencia o presencia de un adsorbente del sobrenadante de los cultivos de las cepas de la invención, tal como ceJita. Se obtienen mejores resultados con el extracto enzimático soportado sobre celita. Si el compuesto fenólico empleado es poco soluble en el agente acilante se puede utilizar un codisolvente, por ejemplo DMF (N,N-dimetil formamida).

En otra realización preferida, la reacción enzimática es de desacilación, el carbohidrato del paso (a) es metil a-D-glucopiranósido per-O-acetilado, per-O-acetil-a,a-D-trehalosa, per-O-acetil-sacarosa, trehalosa octaacetil¡ada o sacarosa octaacetilada y la reacción se lleva a cabo en presencia de alcohol .alifático, preferiblemente metanol o metanol deuterado a temperatura ambiente (16-28°C).

En un realización mas preferida, la reacción enzimatica es de per-O-acetil-a,a-o

trehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C, obteniéndose los compuestos 2,3,4,6,6'-pEmta-O-acetil-a,a-D-trehalosa o 2,3,4,6-tetra-0acetil-a,a-D-trehalosa o la reacción enzimática de per-O-acetil-sacarosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C, obteniéndose los compuestos 2,3,4,6,1' ,6'-hexa-O-acetil-sacarosa o 2,3,4,6,6' -penta-O-acetil-sacarosa.

En otra realización preferida, la reacción enzimática es de acilación, el carbohidrato del paso (a) es metll a-D-glucopiran6sido y la reacci6n se lleva a cabo en presencia de acetato de isopropenilo y OMF a una tempE~ratura de entre 50-70°C.

Otro aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula general (1)

OR1

HO)~OR2

HO

V

(1)

donde: R1 es un grupo alquilo (C1-C20) , un grupo alquenilo (C2-C20) , un grupo alquinilo (C,-C,,), o un grupo arilalquilo; y R2 es un grupo acilo (-COR3, donde R3 es un grupo alquilo C1-C20) o un hidrógeno.

Por "alquilo· se refiere en la presente invención a una cadena alifática, lineal o ramificada, que tiene de 1 a 20 átomos de carbonos, preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-pro pilo, ipropilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, entre otros.

Por "alquenilo" se refiere en la presente invención a cadena carbonada, lineal o ramificada, que presenta al menos un doble enlace y que contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono y más preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono.

Por ~alquinilo" se refiere en la presente invención a cadena carbonada, lineal o ramificada, que presenta al menos un triplet enlace y que contiene entre 2 y 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 2 y 10 átolTlos de carbono y más preferiblemente de 2 a 5 átomos de carbono.

Por "arilalquilo" se entiende en la presente invención a un grupo arito unido al resto de la molécula por un grupo alquilo (C1-C20) , tal y como se ha definido anteriormente. Un ejemplo, no limitanle, de arilalquilo es un grupo bencilo.

En una realización preferida, el compuesto de fónnula general (1) de la presente invención se caracteriza por que el R2 es un grupo acetilo (-COCH3).

En una realización preferida, el compuesto de fórmula general (1) de la presente invención se caracteriza por que el R2 es un hidrógeno.

En otra realización más preferida, Jos compuestos de fórmula general (1) se seleccionan de la lista que comprende: acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-metoxietilo, acetato de 2(3,4-<lihidroxifenil)-2-€toxietilo, acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-propoxietilo, y acetato de 2-(3,4-<lihidroxifenil)-2-butoxietilo.

En otra realización preferida, los compuestos de fórmula general (1) se seleccionan de la lista que comprende: 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-metoxietanol, 2-(3,4-dihidroxifenil)-2etoxietanol, 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-propoxietanol y 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-butoxietanol.

5 La presente invención también describe el procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula (1) descritos anteriormente, que comprende:

a. la reacción enzimática del compuesto 3,4-dihidroxifenilglicol peracilado con R,OH; o

b. la reacción enzimática del compuesto 3,4-dihidroxifenilglicol peracilado con 10 R,OH y posteriormente la reacción del compuesto obtenido en el paso (a)

mediante catálisis básica, preferiblemente con CS2C03, en metanol; donde R, es un grupo alquilo (C,-C20) , un grupo alquenilo (C2-C20) , un grupo alquinilo (Cr C20) , o un grupo arilalquilo.

OR,OAc HO~OR1 OA Cal. ácida HO~OH

ACO~OAC ~E,-xt-,-r_cto-,en_zimá-,--<::: c I

a.:._ ___ti.:..c;>

HO I ~ MeOH HOV

15 ACOV R,OH

En una realización preferida, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza por que la reacción enzimática se lleva a cabc. en presencia del extracto enzimático descrito 20 en la presente invención.

La presente invención se refiere también al uso de al menos un compuesto de fórmula general (1) , segun se ha descrito previamente, para la elaboración de un medicamento o de una composición cosmética o de una composición alimenticia, dónde la composicIón

25 alimenticia se selecciona de entre un alimento, complemento alimenticio, alimento funcional o nutracéutico.

A efectos de la presente invención el término -medicamento· hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de 30 enfermedades en el hombre y los animales.

A efectos de la presente invención el término Mcomposición farmacéutica-tal y como se define en la presente invención se refiere a conjunto de componentes que están formados por al menos un producto de fórmula general (1) según se describe en la presente invención, en cualquier concentración, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o pSicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud. Dichas composiciones comprenden además al menos un vehlculo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede comprender un "vehículo" o portador, que es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica.

Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra cc>mposición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

A efectos de la presente invención el término "composición cosmética-o "cosmético· se refiere a aquellas preparaciones constituidas por sustancias naturales o sintéticas o sus mezclas, de uso externo en las diversas partes del cuerpo humano.

A efectos de la presente invención el término "composición alimenticia· se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosa mente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición puede ser destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfermedad. Por tanto, el término "composición alimentaria" de la presente invención se puede emplear como sinónimo de alimento funcional o alimento para fines nutricionales especificos o alimento medicinal. A efectos de la presente invención, el término "composición alimenticia-es, o forma parte de un alimento, alimento funcional, nutracéutico o suplemento alimenticio.

A efectos de la presente invención el térrnino "nutraceutico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a sustancias aisladas de un alimento y utilizadas de forma dosificada que tienen un efecto beneficioso sobre la salud.

5 A efectos de la presente invención el término "suplemento", sinónimo de cualquiera de los términos "suplemento dietético", "suplemento nutricional" o "suplemento alimenticio" es un "ingrediente alimenticio" destinado a complementar la alimentación.

La presente invención también se refiere al uso no terapéutico de al menos un compuesto 10 de fórmula general (1), segun se ha descrito previamente, como antioxidante, preferentemente como antioxidante aliment:ario.

Por el término "antioxidante" se entiende una composición capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas.

Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1), según se ha descrito previamente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20 Otro objeto descrito en la presente invención se refiere a una composición alimenticia o cosmética que comprende al menos un compuesto de fórmula general (1), según se ha descrito previamente.

Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a los derivados acilados de

25 carbohidratos, preferentemente a los compuestos de fórmula 2,3,4,6,6'-penta-O-acetila,a-D-trehalosa o 2,3,4,6-tetra-O-acetil-a,a··o-trehalosa.

Otro aspecto descrito en la presente inv43nción se refiere al uso de dichos derivados acilados de carbohidratos descritos previclmente como intermedios de reacción para la

30 síntesis de derivados de trehalosa o para la elaboración de análogos de glicolípidos presentes en Mycobacterium tuberculosis.

Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de los análogos de glicolipidos presentes en Mycobacterium tuberculosis que comprende:

a. la reacción enzimática de per-O-acetil-a,a-o-trehalosa con metanol o metanol deuterado a una temperatura de entre 16-28°C.

En una realización preferida, dicho procedimiento se lleva a cabo en presencia de un extracto enzimático según se define en la presente invención.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS.

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Ejemplo 1: Análisis filogenético de las cepas Terribacil/u$ sp. AE2B 122 (CECT

8231), Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464), Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).

El estudio filogenético se llevó a cabo mediante análisis de la secuencia del gen ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) 165. Para ello se amplificó el gen del ARNr 165 de cada una de las cepas de la invención mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

utilizando los cebadores 16F27. cuya secuencia es 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEQ 10 NO: 1). y 16R1488, con la secuencia 5'-CGGTTACCTTGTTAGGACTTCACC-3' (SEQ ID NO: 2) (Moreno M.L .. et al. FEMS Microbio/ Eco/, 2009; 68, 59-71.). Las

condiciones de la reacción de PCR fue la siguiente: un ciclo de 95 oC durante 5 minutos, 25 ciclos de 94 oC durante 1 minutos, 50 oC durante 1 minutos y 72 oC durante 2 minutos, y luego un paso de extensión de 10 minutos a 72 oC. Los productos de la amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. El ADN amplificado es secuenciado

mediante el método Sanger. Se utilizan entre 640 y 650 pb para la búsqueda de

secuencias similares entre las secuencias depositadas en GenBank, usando el algoritmo

BlastN , resultando ser Terribacillus goriensis CL-GR16 (Número de acceso a GeneBank

NR_043895), Bacillus stra/osphericus JCM 13349 (número de acceso a GeneBank NR_042336), En/erobaeler ludwigii EN-11 9 (número de acceso a GeneBank AJ853891) Y

Pseudomonas stutzeri ATCe 17588 (número de acceso a GeneBank NR_103934) los que mayor valor de identidad muestran con las secuencias de las cepas de la invención. Por lo tanto, las cepas de la invención se asignaron a los géneros Terribacillus como

Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), Bacillus, como Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8484), Enterabacter, como En/erabaeler sp. AEl B89 (CECT 8462) y Pseudomonas como Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8463).

Para la realización del árbol filogenético se utilizó el paquete de programas MEGA4. Primero se realizó un alineamiento múltiple, usando Clustal W, de las secuencias de 650

pb (correspondiente al fragmento entre las posiciones 53 hasta la 703 (Figura lA) y entre las posiciones 80 hasta 730 (Figura 1 B) del ARNr 16S de Escherichia coll) de las cepas y

de las secuencias de mayor identidad obt'enidas con BlastN. Finalmente los árboles se construyeron utilizando varios métodos, obteniendo resultados similares con todos ellos. En la presente invención se muestran los árboles construidos mediante el método

Neighbor-Joining (Figura 1).

Ejemplo 2: Preparación de los sobrenadantes de las cepas Terribacillus sp. AE2B

122 (CECT 8231), Baclllus sp. HR21-6 (C:ECT8464), En/erobae/er sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE2B120 (CEGT 8463).

Para la preparación de los extractos enzimáticos o sobrenadantes, se creció un preinoculo de cada una de las cuatro cepas descritas en la presente invención. Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231 ) se cultivó en medio PYA durante una noche. Al día siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio PYA. Tras crecer el cultivo en medio PYA, se recogió el sobrenadante.

Bacillus sp. HR21-6 (CECT8464) se cultivó en medio LB durante una noche. Al dia siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio PYA. Tras crecer el cultivo en medio

PYA, se recogió el sobrenadante.

Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE28120 (CECT 8463) se cultivaron en medio LB durante una noche. Al dra siguiente, se utilizó dicho cultivo para inocular medio LB + tributirina (TRI) 2%. Tras crecer el cultivo en medio LB+ TRI 2%, se recogió el sobrenadante.

Cada uno de los sobrenadanles se vertió en una bolsa de diálisis de 12 KDa (SIGMA, D9527). Las bolsas de diálisis se dejaron toda la noche a 4 oC cubiertas en polietilenglicol de 8 KDa y cuando las bolsas de diálisis estaban completamente secas, se limpió el exterior con agua destilada y se dializaron con tampón fosfato potásico O,05M pH 7,8 a 4

10 oC y agitación magnética. Estos dializados se congelaron a -80 oC.

Dichos sohrenadantes pueden ser liofilizados para así evitar que se produzcan las reacciones de hidrólisis. Además, liofilizar el sobrenadante ayuda a concentrar y conservar la enzima de la cepa microbiana, y también para poder ser almacenado.

Ejemplo 3: Preparación de ¡:llolifenoles lipófilos. Reacciones de acilación/desacilación catatalizadas por los sobrenadantes/extractos enzimáticos de las cepas de Terribacillus sp. AE28 122 (CECT 8231), Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8484), Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Pseudomonas sp. AE28120 (CECT

20 8463).

A continuación se muestran a modo de ejE~mplo ilustrativo y no limitativo, rutas sintéticas que conducen a la obtención de derivados fenólicos por desacilación regioselectiva catalizada por los extractos enzimáticos/sobrenadantes en medio alcohólico.

Ejemplo 3.1. Reacción de desacilación de compuestos fenólicos mediante catálisis enzimática para la obtención de polifenoles. lipofllicos.

Ejemplo 3.1.1.

30 Acetato de hidroxitirosilo (2) La desacilación del compuesto 1 (hidroxitirosol peracetilado) mediante alcoholisis (desacilación) catalizada por los extractos enzimáticos, obtenidos de los cultivos de las cepas de la invención, usando como disolvente un alcohol alifático, tal como el MeOH, da

lugar al derivado monoacilado (compu!~sto 2) mediante una reacción totalmente regioselectiva, según se describe en el Esquema 1.

AC0)Cl'0AC extracto enzimático H0)Cl'0AC

I ~ I AcO -? MeOH HO -?

1 2

5 Esquema 1

A una disolución del compuesto 1 (hidroxitirosol triacetilado) (50 mg, 0.18 mmol) en MeOH se le añade el extracto enzimatico obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Tembacillus sp. cepa AE2B122 (CEC T8231) (50 mg) y gel de silice (63-200 ~m, 100 10 mg). Se agita a 40 oC durante 18 horas. Se filtra sobre cerita y se concentra a sequedad. El residuo se purifica por cromatografla en columna (AcOEt-hexano 1:2 1 :1)

-0-4

obteniéndose el acetato de hidroxitirosilo 2 (31 mg, 90%). (Ver Esquema 1). El rendimiento para la obtención del compuesto 2 purificado por técnicas cromatográficas fue del 75-91 % dependiendo del extracto enzimático utilizado.

Ejemplo 3,1.2, La desacilación del compuesto 3 (3 ,4-dihidroxifenilglicol peracetilado) mediante alcoholisis catalizada por los extractos en;~imáticos descritos en la presente invención y usando como disolvente un alcohol alif¡Hico de tipo R10H, tiene lugar de manera

20 totalmente regioselectiva en los ésteres fenólicos (Esquema 2). En la posición bencílica el grupo aciloxi es sustituido por el grupo alcoxi R10 procedente del alcohol dando lugar a la formación del compuesto 4 que puede ser aislado con rendimientos del 40-90%. El radical R1 del alcohol alifático de tipo R 'OH se selecciona preferiblemente de entre cualquiera de los siguientes: -eH3 (metilo), -C2Hs (etilo), -C3H7 (propilo) o -C4Hg (butilo).

25 En función del alcohol alifático utilizado como disolvente se obtienen los compuestos 4a, 4b, 4c o 4d (Esquema 2). Los tiempos de reacción van desde 24 h para la obtención del compuesto 4a hasta 6 días para la obtención del compuesto 4d. El grupo acetilo del compuesto 4 puede ser eliminado mediante una alcoholisis (desacilación) con catálisis básica, utilizando como catalizador cualquier cata lizador básico, preferentemente Cs2CO)

30 en metanol.

De esta manera, los compuestos 4a-4d mediante una reacción de desacetilación dan lugar a los compuestos 5a-5d con rendimientos del 31-62% (Esquema 2).

OAc OR

HO~OAC CS2CO~

ACO~OACExtracto enzimático

I •

AcO h ROH HOV MeOH

'la R=Me -lbR=Et

4IcR=Pr

-Id R= Bu s

Esquema 2

Acetato de 2-j3,4-dihidroxifenit)-2-metoxietilo (40)

OMe

HO~~OAC HO~

OR

HO~OH

HOV

5a R = Me 5b R=Et Se R =Pr 5d R = Bu

Se disuelve el compuesto 3 (tetraacetilado) (28 mg, 0.08 mmol) en MeOH (3 mL) y se añaden 28 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana

Terribacillus sp. cepa AE2B122 (CEC T8231 ) y 56 mg de gel de sílice (63-200 ~m). Se

15 agita a temperatura ambiente durante daos días. Se añaden otros 28 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Te"ibacillus sp. cepa AE28122 (CEC T8231) y se prosigue con la agitación a temperatura ambiente durante dos días. Se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía en columna (CH2Cb

MeOH 60:1). Rendimiento: 17 mg. 90%, R, 0.6 (CH,CI,.MeOH 10:1).

20 'H-RMN (300 MHz, CD,OD): 66.80 (d 1H, J,., = 8.0 Hz, Ar-5), 6.79 (d, 1H, J", = 2.0 Hz, Ar-2), 6.68 (dd, 1 H, J,,> = 80 Hz, J,., = 2.0 Hz, Ar-6), 432 (dd, 1 H, J = 8.0 Hz, J = 3.9 Hz, CH), 4.18 (dd, 1H, J= 11,4 Hz, J= 8.0 Hz, CH,), 4.07 (dd, 1H, J= 11,4 Hz, J= 3.9 Hz, CH,), 3.25 (s 3H, OMe), 2.06 (s 3H, OAc). " C-RMN (75.5 MHz, CD,OD): 6 173.6 (CO),

145.7 (Ar-3 Y 4), 131.4 (Ar-l), 120.7 (Ar-E;), 117.2 (Ar-5), 115.8 (Ar-2), 83.4 (CH), 69.5 (CH,), 57.7 (OMe), 21 .6 (OAc).

5 Acetato de 2~3,4-dihidroxifenil)-2-etoxietilo (4b)

OEI

HO OAe

HO

Se disuelve el compuesto 3 (60 mg, 0.18 mmol) en EtOH (6 mL) y se añaden 60 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 (CECT 10 8484) Y 120 mg de gel de sílice (63-200 ~m). Se calienta a 60 'C durante 24 horas y

pasado ese tiempo se concentra a sequedad y se purifica el producto por cromatografía

en columna de gel de 511 ice (CH,CI,..EtOH 60:1). Rendimiento: 24 mg, 55%, R, 0.5 (CH,CI,-MeOH 10:1).

15 'H-RMN (300 MHz, COCI,): O 6.89 (d, lH, J",= 2.0 Hz, Ar-2), 6.83 (d, lH, J, .•= 8.1 Hz, Ar5), 6.72 (dd, 1 H, J •. ,= 8.1 Hz, J,,,. 2.0 Hz, Ar-6), 4.42 (dd, 1 H, J= 6.9 Hz, J= 5.0 Hz, CH), 4.20-4.12 (m, 2H, CH,), 3.43 (2dd, lH cada uno, 'J = 16.4 Hz, 'J = 7.0 Hz, CH,CH,), 2.06 (s, 3H, OAe), 1.17 (t, 3H, J= 7.0 Hz, CH,CrI,). " C·RMN (75.5 MHz, COCI,): O172.0 (CO),

144.5 (Ar-4), 144.4 (Ar-3), 131.0 (Ar-l), 119.9 (Ar-6), 115.5 (Ar-5), 113.9 (Ar-2), 79.6

20 (CH), 68.4 (CH,), 84.8 (CH,CH,), 21.3 (OAe), 15.4 (CH,CH,).

Acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-propoxietilo (40)

OPr

HO~~OAe HO~

25 Se disuelve el compuesto 3 (190 mg, 0.56 mmol) en PrOH (4 mL) y se añaden 190 mg de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8484) y 380 mg de gel de sílice (63-200 ~m). Se ag~a a 60 ·c durante dos días. Se añaden otros 190 mg del mismo extracto y se prosigue con la agitación durante dos días.

Se concentra a sequedad y se pUrifica el producto por cromatografía en columna (AcOEt

hexano 1:3 ~1:1). Rendimiento: 81.4 mg, 57%, Rf 0.6 (AcOEt-hexano 1:1).

' H-RMN (300 MHz, CDCI,): 06.90 (d, 1H, .1,.,: 2.0 Hz, Ar-2), 6.84 (d, 1H, J,.,: 8.1 Hz, Ar

5 5), 6.73 (dd, 1H, J,., : 8.1 Hz, J,.,: 2.0 Hz, Ar-6), 4.41 (dd, 1H, J: 7.6 Hz, J: 4.5 Hz, CH), 4.21-4.10 (m, 2H, CH,), 3.40-3.24 (m, 2H, OCH,CH,), 2.06 (s 3H, OAc), 1.59 (sextete, 2H, J: 7.4 Hz, OCH,CH,), 0.88 (t, 3H, J" 7.4 Hz, CH3). " C-RMN (75.5 MHz, CDCI3): O

171.9 (CO), 144.4 (Ar-4), 144.3 (Ar-3), 131 .2 (Ar-1), 120.0 (Ar-6), 115.5 (Ar-5), 113.9 (Ar2). 79.7 (CH), 71 .1 (CH,), 68.4 (OCH,CH,), 23.1 (CH,CH,), 21 .3 (OAc), 10.8 (CH3) .

Acetato de 2-(3,4-dihidroxifenil)-2-butoxietilo (4d)

OBu

HO~~OAC HO~

Se disuelve el compuesto 3 (190 mg, 0.56 mmol) en SuOH (4 mL) y se añaden 190 mg

15 de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6

(CECT 8464) y 380 mg de gel de sílice (63--200 ~m), calentandose a 60 oC durante 2

días. Se concentra a sequedad y se purifica por cromatografía en columna con AcOEt

Hex 1 :2. Rendimiento: 91 mg, 61 %, RF 0.6 (CH2Cb-MeOH 10: 1).

20 ' H-RMN (300 MHz, CDCI3): O6.90 (d, 1H, .1,.,: 1.9 Hz, Ar-2), 6.84 (d, 1H, J,.,: 8.0 Hz, Ar5), 6.73 (dd, 1H, J,.,: 8.0 Hz, J,.,: 1.9 Hz, Ar-6), 6.50 (s, 1H, OH), 5.95 (s, 1H, OH), 4.44 (dd, 1 H, J: 7.7 Hz, J: 4.4 Hz, CH), 4.22-4.10 (m, 2H, CH,), 3.45-3.28 (m, 2H, OCH,CH,),

2.07 (s, 3H, OAc). 1.55 (m, 2H, J: 6.6 Hz, OCH,CH,). 1.39-1.25 (m, 2H, CH,CH,), 0.86 (t, 3H, J: 7.3 Hz, CH,CH3). " C-RMN (70;.5 MHz, CDCI3): O 172.1 (CO), 144.4 (Ar-4),

25 144.3 (Ar-3), 131.1 (Ar-1), 120.0 (Ar-6), 115.5 (Ar-5), 113.9 (Ar-2), 79.7 (CH), 69.2 (OCH,CH,), 68.4 (CH,), 32.0 (OCH,CH,), 2.1.3 (OAc), 19.6 (CH,CH3), 14.2 (CH, CH3).

2-(3,4-Dihidroxifenil}-2-metoxietanol (5a)

OMe

HO OH

HO

5 A una disolución del compuesto 4a (54 m~J, 0.24 mmol) en MeOH seco (1 mi) se añade CS2C03 (231 mg, 0.72 mmol) y ascorbato !~ódico (48 mg, 0.24 mmol) en presencia de Ar y en oscuridad. Se agita a temperatura ambiente durante 4 horas. Cuando se da por tenninada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente, por cromatografía en columna utilizando como eluyente CH2Clr EtOH (1:0 --+ 1:10).

10 Rendimiento: 23 mg, 53%, R, 0.2 (CH,CI, -MeOH 10:1).

' H-RMN (300 MHz, 0 ,0): 06.94 (d, 1H, J, .•=8.1 Hz, Ar-5), 6.89 (d, 1H, J, .•= 2.0 Hz, Ar2), 6.80 (dd, 1H, J •. ,=8.1 Hz, J,,,: 2.0 Hz, Ar-6), 4.29 (dd, 1H, J= 7.5 Hz, J= 4.6 Hz, CH),

3.71 (dd, 1H, J= 11.9 Hz, J = 7.5 Hz, CH,), 3.64 (dd, 1H, J = 11.9 Hz, J = 4.6 Hz,

15 CH,),3.27 (s, 3H, OMe). 13C-RMN (75.5 MHz, 0,0): O 144.1 (Ar-1 ), 144.0 (Ar-2), 130.5 (Ar-4), 119.8 (Ar-5), 116.1 (Ar-6), 114.7 (Ar-3), 83.6 (CH), 65.0 (CH,), 56.0 (OMe).

2-(3,4-Dihidroxifenil)-2.etoxietanol (5b)

OEt

HO OH

HO

A una disolución del compuesto 4b (25 m!~, 0.10 mmol) en MeOH seco (1 mi) se añade CS2C03 (66 mg, 0.20 mmol) y ascorbato sódico (20 mg, 0.10 mmol) en presencia de Ar y en oscuridad. Se agita a temperatura arnbiente durante 3 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente, 25 por cromatografía en columna utilizando como eluyente CH2CI2-EtOH (1:0 --+ 1:10).

Rendimiento: 12.4 mg, 62%, R, 0.3 (CH,CI,-MeOH 10:1).

'H-RMN (300 MHz, CD,OD): O 6.91 (d, 1H, J, .•= 8.1 Hz, Ar-5), 6.88 (d, 1H, J,.,= 1.8 Hz, Ar-2), 6.80 (dd, 1H, J•.,= 8.1 Hz, J,.,= 2.0 Hz, Ar-6), 4.38 (dd, 1H, J= 7.7 Hz, J= 4.4 Hz, CH), 3.70 (dd, 1H, J= 11.7 Hz, J= 8.0 H>:, CH,), 3.61 (dd, 1H, J= 11 .7 Hz, J= 4.4 Hz, CH,) 3.48 (e, 2H, J= 6.9 Hz, CH,CH,), 1.19 (1, 3H, J= 7.1 Hz, CH,CH,). " C-RMN (75.5

5 MHz, CD,OD): O 146.1 (Ar-4), 145.9 (Ar-3), 133.1 (Ar-1), 121.3 (Ar-6), 117.7 (Ar-5), 116.3 (Ar-2), 83.9 (CH), 67.3 (CH,), 66.3 (CH,CH,).16.1 (CH,CH,).

2-(3,4-0 i h id roxilon i 1)-2-propox ieta nol (Se) OPr

H0Y'~OH HO)lJ

A una disolución del compuesto 4c (55 mn, 0.22 mmol) en MeOH seco (1 mi) se añade

Cs,CO, (66 mg, 0.20 mmol) y ascobato sódico (44 mg, 0.22 mmol) en presencia de Ar y

en oscuridad. Se agita a temperatura arnbiente durante 2 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el disolvente, 15 por cromatografia en columna utilizando como eluyente (AcOEt-hexano 1:1).

Rendimiento: 14.5 m9, 31%, RF 0.1 (AcOEt-Hex 1 :1).

'H-RMN (300 MHz, CO,OO): O6.78 (d, 1H, J".= 1.9 Hz, Ar-2), 6.76 (d, 1H, J, .•= 8.0 Hz, Ar-5), 6.65 (dd, 1H, J •. ,= 8.0 Hz, J•.,= 2.0 Hz, Ar-6), 4.22 (dd, 1H, J= 8.0 Hz, J= 4.1 Hz, 20 CH), 3.64 (dd, 1H, J = 11 .6 Hz, J= 8.0 Hl:, CH,), 3.51 (dd, 1H, J= 11 .6 Hz, J= 4.1 Hz, CH,), 3.37-3.29 (m, 2H, OCH,CH, ), 1.61 (s, 2H, J =7.2 Hz, OCH,CH,), 0.93 (t, 3H, J =

7.4 Hz, CH,). " C-RMN (75.5 MHz, CO,OD): O 147.3 (Ar-4), 146.9 (Ar-3), 133.3 (Ar-1),

120.6 (Ar-6), 117.0 (Ar-5), 115.8 (Ar-2), 85.2 (CH), 72.5 (CH,), 68.9 (OCH, CH,), 24.9 (OCH, CH,), 11.8 (CH,).

25 2-(3,4-dihidroxilenll)-2-butoxietanol (Sd)

OBu

HO~OH

HO)lJ

A una disolución del compuesto 4d (78 mg, 0.29 mmol) en MeOH seco (2 mi), se añaden

ascorbato sódico (58 mg, 0.29 mmol) y Cs,CO, (280 mg, 0.88 mmol) y se agita a

temperatura ambiente, en oscuridad y atmósfera de argón durante 3 horas. Cuando se da por terminada la reacción se purifica el compuesto, sin neutralizar ni evaporar el 5 disolvente, por cromatografía en columna utilizando como eluyente AcOEt-Hex (1: 1).

Rendimiento: 28.1 mg, 43%, R, 0.3 (CH,CI,-MeOH 10:1). 'H-RMN (300 MHz, CDCI,): 5

6.84 (d, 1H, J,.,= 1.8 Hz, Ar-2), 6.83 (d, 1H, J,.,= 8.0 Hz, Ar-5), 6.72 (dd, 1H, J,.,= 8.0 Hz, J,.,= 1.8 Hz, Ar-6), 6.04 (sa, 3H, OH), 4.29 (dd, 1H, J= 7.8 Hz, J= 4.4 Hz, CH), 3.69-3.57

10 (m, 2H, CH,), 3.47-3.28 (m, 2H, OCH,CH, ), 1.60-1.51 (m, 2H, OCH,CH,), 1.43-1.26 (m, 2H, CH,CH,), 0.88 (t, 3H, J= 7.3 Hz, CH,CH3). " C-RMN (75.5 MHz, CDCI,): 5 144.3 (Ar4), 144.2 (Ar-3), 131.8 (Ar-1), 119.9 (Ar-6), 115.7 (Ar-5), 114.1 (Ar-2), 82.5 (CH), 69.2 (OCH,CH,), 67.6 (CH,), 32.2 (OCH, CH,), 19.7 (CH,CH,), 14.2 (CH,CH,).

15 Ejemplo 3.1.3,

La desacilación (alcoholisis) del compuesto 6 (alcohol protocatecuico peracilado) con un grupo acetoxilo en posición bencílica catalizada por los extractos enzimáticos usando como disolvente un alcohol alifático de tipo ROH, también tiene lugar de manera totalmente regioselectiva en los ésteres fenólicos (Esquema 3). De manera similar al 20 comportamiento observado en el compuesto 3, en la posición bencflica el grupo aciloxi es sustituido por el grupo alcoxi procedente del alcohol usado como disolvente. Asl , por ejemplo, usando como disolvente el MeOH se puede obtener el compuesto 7 de foona cuantitativa en 24 h. El compuesto 7 ha sido aislado previamente del caldo de

fenmentaclón del hongo marino Y26-02 rNu, H.-H. et al. J Asian Nat Prod Res 11 , 747

25 750; 2009).

ACO~OAC

ACO~ Extracto enzimático

•

MeOH Esquema 3

HO~OMe HO~

4-(Metoximetil)benceno-1 ,2-diol (7)

H0)(J I '" OMe

HO ~

5 A una disolución del compuesto 6 (30 mg, 0.19 mmol) en MeOH (1 mi) se añaden 30 mg

de extracto enzimático obtenido del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6

(CECT 8464) y 60 mg de gel de sílice (63-200 ~m) y se calienta a 40 'C durante 24 h. Se

concentra a sequedad y se purifica mediante cromatografía en columna (AcOEt-hexano 1:1) obteniéndose el producto como un sirupo rojizo. Rendimiento: 29 mg, cuantitativo Rf

10 0.6 (AcOEt-hexano 1 :1).

'H-RMN (300 MHz, CDCI,): 66.83-6.78 (m, 2H, Ar-3, Ar-5), 6.70 (d, lH, J,.,= 7.7 Hz, Ar6), 4.30 (s, 2H, CH,), 3.33 (s, 3H, OMe).

15 Ejemplo 3.2. Reacción de acilación de compuestos fenólicQs mediante catálisis enzimática para la obtención de polifenoles lipofílicos.

Se llevaron a cabo reacciones de acilación (esterificación) regioselectiva de diversos polifenoles, preferentemente de polifenoles presentes en el aceite de oliva (Esquema 4).

Extracto HO~OHenzimático HO,~OH ACO~OH

I • I

HO ¿ 1--Á. AcO~ ¿ + HO~

8 O 9 10

HO,~OAC ACO~OH

I +

HO~ ¿

AcO~

HO,~OAC ACO~OAC

I +

AcO~ ¿ HO~

12 13

OH Extracto OH OH HO~OHenzimático HO.~OHACO~OH

• I + I

HO.JlJ .5l.Á. AcO' ..., HO ¿

DMF

14 15 16 OH OH

HO~OACAcO~OH

1+1 HO"" AcO¿

17 18

HO~OAC

AcO

Esqu:ema 4

Extracto enzimático

HO~OH + ACO~OH

•

HO~ HO~

20 21 22

ACO~OH AcO~

23 24

ACO~OAC HO~

25 26

ACO'~OAC AcO~V

Esquema 4 (Icontinuación)

5 Dichos polifenoles son el compuesto 8 (hidroxitirosol), el compuesto 14 (3,4dihidroxifenilglicol) y el compuesto 20 (alc()hol protocatecuico). Como agente acilante se empleo el acetato de isopropenilo, que a :su vez actúan de disolvente del politenol y de sus derivados acilados. La acilación se puede hacer en ausencia o presencia de un adsorbente del sobrenadante de los cultivos de las cepas de la invención, tal como celita.

10 Se obtienen mejores resultados con el extracto enzimatico soportado sobre ceMa. Si el

compuesto fenólico empleado es poco soluble en el agente acilante se puede utilizar DMF (N,N-dimetil formamida) como ca-disolvente. El resultado de la acilación se cuantifica mediante 1H-RMN previa elimin.ación del sobrenadante o extracto enzimatico que contiene las enzimas encargadas de llevar a cabo la reacción de acilación.

El producto mayoritario obtenido de la reacción de acilación (eslerificación) del polifenol hidroxitirosol (compuesto 8) tras 24 h (Tabla 1) es el compuesto 9 que es derivado monoacilado en posición 4 del anillo aromatico. El compuesto 9 y su regioisómero en la posición 3 (compuesto 10), se forman en la proporción de 2: 1. Además, de los compuestos derivados monoacilados 2, 9 Y 10, se detectan, en menor cantidad, otros tres compuestos que son los derivados diacilaclos 11 , 12 Y 13. El grado de conversión oscila del 88 al 96%. Los resultados contrastan con la regioselectividad que se obtiene con la

5 lipasa procedente de C. antarctica, que conduce exclusivamente al compuesto regioisómero 2, acilado en la cadena latera l.

La reacción de acilación (esterificación) d€~1 compuesto 14: 3,4-dihidroxifenilglicol tras 24 h (Tabla 1) conduce a la obtención de una mezcla de los compuestos 15 y 16 que son los 10 derivados monoacilados en el anillo aromático, y del compuesto 17 que es el derivado monoacilado en el extremo de la cadena lateral, en proporción 1: 1: 1, con los extractos de Terribacil/us sp. AE2B 122 (CECT 8231) y Enterobacter sp. AE1 B89 (CECT 8462), yen la relación 1:1:2 con Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8462), Bacil/us sp. HR21-6 (CECT 8464) y la lipasa pura de C. antaretica. El grado de conversión va del 53 al 70%.

15 El menor grado de conversión se consigue con la C. antarctica. No se detecta la acilación del hidroxilo bencflico del compuesto 14 con ninguna de las enzimas, ni extractos enzimáticos.

La reacción de acilación (esterificación) del compuesto 20: alcohol protocatecuico tras 24

20 h (Tabla 1) conduce a la obtención de una mezcla de los derivados mono, di y triacilados. La relación de los derivados monoacilados en posición 4, 3 Y cadena lateral es sensible al extracto enzimático utilizado; así, la proporciones son 1:1:1 para el sobrenadante del cultivo de Terribacillus sp. AE2B 122 (CECT 8231), 1 :2:2 para el sobrenadante del cultivo de Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 6462.), 1:3.5:1 para el sobrenadante del cultivo de

25 Pseudomonas sp. AE2B120 (CECT 8462), 1:3:2 para el sobrenadante del cu~ivo de Bacil/us sp. HR21 -6 (CECT 8464) y 1:0:16 para la lipasa de C. antarctica. El grado de conversión va del 77 al 81 % para los 4 sobrenadantes ensayados, mientras que con la lipasa de C. antárctica, la conversión es cuantitativa. La formación del compuesto 6: derivado triacetilado, solo se detecta con la lipasa de C. anttJrtic8.

Tabla 1. Porcentaje determinado por lH-RMN en la mezcla de reacción formada por acilación de los compuestos 8, 14 Y 20 con extractos de los sobrenadante obtenido del cultivo de las cepas bacterianas de la invención o de una lipasa comercial.

Extractos bacterianos y lipasa

Acilación del hidroxitirosol (compuesto 8). Se disuelve hidroxi!irosol (50 mg) en acetato de isopropenilo (3.0 mi) y se añaden celita (50 mg) y el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a

10 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se filtra la disolución y se concentra a sequedad. Se analiza por 1H-RMN el resultado de la acila.ci6n (Ver Tabla 1).

Acilación del 3,4-dihidroxifenilglicol (compuesto 14). Se disuelve 3,4dihidroxifenilglicol (50 mg) en una mezcla de DMF/acetato de isopropenilo 1: 1 (6.0 mi) y se añade el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se elimina el disolvente y el residuo que resulta se redisuelve en acetona seca y se filtra. Por último, se concentra a sequedad. Se analiza por ' H-RMN el resultado de la acilación ever Tabla 1)

Acilación del alcohol protocatecuico (c'"",puesto 20). Se disuelve el alcohol (50 mg) en acetato de isopropenilo (3.0 mi) y se añade el extracto enzimático correspondiente obtenido de los cultivos de las cepas de la invención (50 mg). Se agita a 40 oC y en oscuridad 24 horas. Se filtra la disolución y se concentra a sequedad. Se analiza por 1H_ RMN el resullado de la ,dlación ever Tabla 1)

Ejemplo 4. Evaluación de la capacidad antioxidante de los polifenoles lipófilos descritos en la presente Invención.

A continuación se representa los resultados obtenidos en la prueba de actividad antirradicalaria frente al OPPH para los compuestos 4a-4d, 5a-5d, 2 y 14. La actividad antirradicalaria expresada como EC50 frente al OPPH (radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) representa la cantidad de antioxidante necesario para disminuir la concentración de OPPH al 50%. Se utilizó el método de Sánchez-Moreno (Sánchez-Moreno, C. et al. J. Sci. Food Agric. 1998, 76, 270-276) con las lTlodificaciones de Jiménez y col. J. Agric. And Food ehem. 2005, 53, 5212-5217).

De los nuevos compuestos sintetizados, el más activo resultó ser el compuesto 4a con una actividad parecida al acetato de hidroxitirosilo (Compuesto 2), aunque menor que el 3,4-dihidroxifenilglicol (compuesto 14) (Tabla 2 y Figura 2)

Tabla 2. Actividad antirradicalaria frente a DPPH expresada en valores de ECso ().LM)

Tabla 2. Actividad antirradicalaria trente a DPPH expresada en valores de ECso (J1M)

20.3 ± 1.73

5d 16.7±1.81

Ejemplo 5: Preparación de carbohidratos parcialmente acilados. Reacciones de

acilación/desacilación de carbohidrato!; catalizadas por los extractos enzimáticos

5

obtenidos de los cultivos de las cepas Terribaclllu$ sp. AE2B 122 (CEeT 8231),

Sacil/us sp. HR21-6 (CECT 8464), Enterobactersp. AE1B89 (CECT 8462).

Ejemplo 5.1.

Se

ha llevado a cabo la reacción de desacetilación del compuesto 27 (metil (X-D

10

glucopiranósido per-O-acetilado) por alcoholisis en medio metanólico catalizada por los

sobrenadantes obtenidos de los cultivos die las cepas bacterianas Terribacillus sp. AE28

122 (CECT 8231), Enterobaeter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Saeil/us sp. HR21-6 (CECT

8464). Se han comparado los resultados obtenidos con las cepas de la invención con los

resultados obtenidos con las lipasas comerciales procedentes de Pseudomonas cepacea

'5

30 U/mg (Sigma-Aldrich, EC 232-619-9) y C. antaretiea soportada sobre resina acrilica

5,000 U/g (Sigma-Aldrich, EC 3.1.1.3, Novozyme 435) (Esquema 5).

El medio de reacción consiste

en una suspensión del compuesto 27 y del extracto

enzimático o de la lipasa correspondiente, en metanol o en metanol deuterado (COlOD).

20

Una vez que se da por finalizada la reacción , las proporciones entre los distintos

compuestos detectados en el crudo de reacción (compuestos 27-29) se obtienen a partir

del

correspondiente espectro de ' H-RMN en C030D, tras la eliminación del extracto

enzimático o de las enzimas correspondientes.

Extracto ~OAe OH enzimátieo HO/' O

• HO

C0300, t.a. OH

OAe

OMe OMe

27 28 29

Esquema 5

El extracto enzimático procedente de TE!rribBcil/us sp. AE2B 122 (CECT 8231) sólo 5 permitió un 28% de conversión (Tabla 3) tras 12 h de reacción. Dicha conversión resultó ser totalmente regioselectiva, ya que s610 se observó la presencia del compuesto 28 (derivado metil 6-O-acetil-a-o-glucopiranósido). junto con el compuesto 27 utilizado como

materia prima (72%).

10 Destacan los extractos enzimáticos procedentes de los cultivos de Enferobacfer sp. AE1B89 (CECT 8462) y Bacil/us sp. HR2.1-6 (CECT 8464), que mostraron un 84 y un 86% de conversión, respectivamente en un tiempo de reacción sensiblemente inferior (6 h). Dichos extractos enzimáticos muestran una tendencia elevada a la desacetilaci6n completa, para dar el compuesto 29 (metil a-o-glucopiranósido), que se encuentra en 15 una proporción en la mezcla del 64% o del 65%, respectivamente. El compuesto 28 que

es el derivado acetilado en e-6 se erncuentra en una proporción del 20 y 21%, respectivamente.

Las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antarctica, estando esta última

20 soportada sobre resina acrilica, no condLJjeron a reacción alguna, a pesar de llevar a cabo la reacción a una temperatura sensiblemente superior (hasta 60 OC) Y usar una mayor proporción de enzima (hasta 1.5 veces el peso del monosacárido).

Tabla 3. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 27 catalizada por los sobrenadantes de los cultivos de las cepas de la invención o por lipasas comerciales

(Sigma-Aldrich, EC 232-619-9)

Desacilación del compuesto 27 (metil 2,3,4,6-tetra-O-acetil--a.-o-glucopiranósido).

5 Una suspensión del compuesto 27 (6.0 mg, 17 IJmol) y del sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en CD,OD (1.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En el caso de las lipasas procedentes de P. cepacea y C. antarclica soportada sobre resina acrílica, se usó una relación monosacáridollipasa 1: 1.5, una temperatura de 60 oC y un tiempo de reacción de

10 22 h. En la Figura 3 se muestra el espectro de 1H-RMN de la mezcla de reacción CHRMN (300 MHz, CD,OD)]; los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ejemplo 5.2. Los sobrenadantes de los cultivos de las cepas descritas en la presente invención, 15 también permiten la desacetilación parcial del compuesto 30 (trehalosa octaacetilada), usando las mismas condiciones que en el caso del monosacárido 27 (Esquema 6).

OAe

AeO o AeO HO

~

OAeO'--..--'''I

AcO~OAeo

AcO Extracto

OAe AcO 31

enzimático

o

AcO

AeO

32 R' = Ae 33 R' = H HO HO

E~squema 6

5 Los extractos enzimáticos de Terribaeil/us sp. AE2B 122 (CECT 8231 ), Enterobaeter sp. AE1B89 (CECT8462) y Baeillus sp. HR21-6 (CECT 8464), permttieron una conversión

entre el 89-91% en un tiempo de reacción comprendido entre 7-12 h (Tabla 4). Se observó la preferenda de las enzimas presentes en los sobrenadantes de los cultivos de las cepas mencionadas anteriormente por llevar a cabo la desacetilaci6n sobre uno de los 10 anillos de glucopiranosa (Tabla 4), permitit3ndo la detección de dos compuestos nuevos,

el compuesto 31 (2,3,4,6,6'-penta-O-acetil·-a,a.-D-trehalosa) (26-35%) y el compuesto 32

(2,3,4,6-tetra-o-acetil-a,a-D-trehalosa) (38-40%), de los que no existen antecedentes en

el estado de la técnica.

15 Cabe destacar, además, que el compuesto 32 es el resultado de una desimetrización en tan sólo dos etapas (acetiladón y desacetilación selectiva) de la trehalosa. La desimetrización es el proceso mediante el cual se consigue que la trehalosa per-Oacetilada 30 pierda su simetría original y se transforme en 31 y 32, donde una unidad de azúcar se encuentra acetilada y la otra total o parcialmente desacetilada. Este proceso se

20 ha conseguido en dos etapas (acetilación de la trehalosa comercial y desacetilación regioselediva con el extrado enzimático de la invención y representa un número de

etapas muy inferior con respecto a cualquier ruta puramente química conocida y utilizada en el estado de la técnica para el mismo fin.

5 Tabla 4. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 30 (trehalosa octaacetilada) catalizada por los sobrenadantes de los cultivos de las cepas bacterianas de,la invención o por lipasas comerciales

Porcenlaje calculado (RMN) Microorganismo Ilipasa I (h)

Este mismo ensayo también se llevó a cabo con fines cuantitativos utilizando el extracto

20 enzimalico de Bacillus sp. HR21-6 (CECT 84(4), lo cual permilió el aislamienlo de los compuestos 31 y 32 (29% y 49%, respectivamente, tras purificación cromatográfica) y su caracterización.

Es destacable que los compuestos 31 y 3:2 pueden emplearse como materias primas en 25 la preparación de glicolipidos derivados de trehalosa, que presentan interés como vacunas frente a la tuberculosis, provocada por el patógeno Mycobaclerium tuberculosis

(M. Gilleron el al. J. Exp. Med. 2004, 199, (;49-659).

De nuevo, cuando la reacción se llevó a cabo usando las lipasas comerciales 30 procedentes de P. cepacea y C. antarctica soportada sobre resina acrílica, no se observó reacción alguna.

Desacilación del compuesto 30 (per-O-acetil-a,a-o-trehalosa)

Método A. Una suspensión de per-O-acetil-a,a-D·trehalosa (compuesto 30) (6.0 mg, 8.8

IJmol) y del sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0

5 mg) en CD30D (1 .0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En la Figura 4 se muestra el espectro de 1H-RMN de la mezcla de reacción CH-RMN (500 MHz, C0300)]; los resultados se muestran en la Tabla 3.

Método B. Una suspensión de per-O-acetil-Cl,Cl-D-trehalosa 30 (60.0 mg, 88,0 IJmol) y el

10 sobrenadante del cultivo de la cepa bacteriana Bacillus sp. HR21-6 CECT 8464 (30.0 mg) en MeOH (20 mL) se agita a temperatura ambiente durante 3.5 h. A continuación, se purifica mediante cromatografía en columna (CH2CI2 _ CH2Ch-MeOH 1 :2) para dar lugar a 31 y 32 como sirupos.

15 2,3,4,6,S'-Penta-O-acetil-a,a-o-trehalosa (compuesto 31)

OAc

ACO~(\

ACO~~ HO

OAcO ~~'" OH

AcO OH

Rendimiento: 14 mg (29%). ' H-RMN (500 MHz, CD, OD) 0 5.57 (dd, 1H, J,,= 10.2 Hz,

J".= 9.5 Hz, H-3), 5.30 (d, 1H, J",= 3,7 H:z, H-1), 5.07 (dd, 1H, J.,,= 10.3 Hz, H-4), 5.04

20 (d,1H, J1',2'= 3.7 Hz, H-1 '), 4.94 (dd, 1H, H-2), 4.43 (ddd, 1H, Js.6a= 4.1 Hz, JS.6b= 2.4 Hz,

H-5), 4.28 (dd, 1H, J,.,,,,,= 2.0 Hz, J"" .",= 1'1.7 Hz, H·6a'), 4.24 (dd, 1H, J",,= 12.4 Hz, H6a), 4.15 (dd, 1H, J".",= 7.3 Hz, H-6b'), 4: 12 (dd, 1H, H·6b), 3.82 (ddd, 1H, Jo '= 9.7 Hz, H-5'), 3.74 (dd, 1H, J"",= 9.7 Hz, J" ",= 9.1 Hz, H-3'), 3.51 (dd, 1H, H-2'), 3,26 (dd, 1H, H4'),2,08,2.05 (x2), 2.01, 2.00 (5s, 3H cada uno, 50Ac); "C-RMN (125.7 MHz, CD,OD) o 25 172.7,172.4,171,7,171.5,171.3 (5 COl, '96.3 (C·1'), 92.8 (C-1), 74,6 (C·3'), 72.8 (C-2'),

72.2 (C-5'), 720 (C-4'), 71,9 (C-2) , 71.5 (C·3), 69,9 (C·4), 69.1 (C·5), 65.0 (C-6'), 62.9 (C6),

2,3,4,6-Tetra-O-acetil-a,a-D-trehalosa (cCllmpuesto 32).

OAc AcO,....-,\--'''---

AcO'~_~..:.

HO

OH

HO HO

Rendimiento: 22 mg (49%). 'H-RMN (500 MHz, CD,OD) ¡; 5.55 (dd, 1H, J",= 10.2 Hz,

5 J".= 9.5 Hz, H-3), 5.34 (d, 1H, J,.,= 3.7 Hz, H-1), 5.07 (dd, 1H, J.,,= 10.3 Hz, H-4), 5.05 (d, 1H, J,.,, = 3.3 Hz, H-1'), 4.96 (dd, 1H, H-2), 4.46 (ddd, 1H, J",,= 3.8 Hz, J" ..= 2.4 Hz, H-5), 4.23 (dd, 1H, J" ,,,= 12.4 Hz, H-6a), 4.12 (dd, 1H, H-6b), 3.75 (dd, 1H, J,.,,,,= 2.1 Hz, J, ....,,= 11.3 Hz,H-6a'), 3.75 (t, 1 H, J" A'= 9.7 Hz, H-3'), 3.70 (ddd, 1 H, J....'= 9.8 Hz, J, .." . = 5,7 Hz, H-5'), 3.65 (dd, 1 H, H-6b'), 3.50 (dd, 1 H, H-2'), 3.31 (m, 1 H, H-4'), 2.06, 2.05,

10 2.01 , 1.99 (45, 3H cada uno, 40Ac); " C-RMN (125.7 MHz, CD,OD) ¡; 172.4, 171.7, 171 .6,

171.3 (4CO), 96-8 (C-1'), 93.3 (C-1), 74.7 (C-3', C-5'), 72.9 (C-2'), 71,7 (x2), 71.6 (C-2, C3, C-4'), 69.9 (C-4), 69.0(C-5), 62.9 (C-6), 62.6 (C-6').

Ejemplo 5,3

15 En la presente invención también se llevó :3 cabo el proceso de desacetilación parcial del

compuesto 34 (sacarosa octaacetilada) (Esquema 7), usando las mismas condiciones

que en el caso del monosacárido 27.

OAe

OAe

AeRe~

OH

AeO O Ae

Extracto

OAe

OAe +

C0300, t.a. OAe OAe OH

Ae A~e~

OH

Ae O Ae

OH36

Esquema 7

Los sobrenadantes obtenidos de los cultivos de Terribacillus sp. AE2B122 (CECT 8231),

Enterobacter sp. AE1B89 (CECT 8462) y Bacillus sp. HR21-6 (CECT 8464) permitieron

una conversión comprendida entre el 82-90% (Tabla 5). Se observó la preferencia de las enzimas presentes en dicho sobrenadantes por llevar a cabo la desacetilaci6n del anillo

10 de Iructoluranosa (Tabla 5), permitiendo la detección de los compuestos 35 (2,3.4,6,1',6'hexa-O-acetilsacarosa) y 36 (2,3.4,6,6'-penta-O-acetilsacarosa).

Adicionalmente, se observó una mayor conversión (90%) en un tiempo de reacción inferior (4h) para el caso del sobrenadante obtenido del cultivo de la cepa de Terribacillus

15 sp. AE2B122 (CECT 8231).

Tabla 5. Proporciones encontradas para la desacetilación del compuesto 34 (sacarosa octaacetilada) catalizada pelr los sobrenadantes de los cultivos de las cepas bacterianas de la invención o por lipasas comerciales

Porcentaje calculado (RMN) Microorganismo/Lipasa t (h) 34 35 36

l I

CECT 8231 10% 38% 52% 4

CECT 8462 18% 43% 39% 7.5

CECT 8464 '14% 44% 42% 8.5

Lipasa P. cepacea 100% 0% 0% 10 (Sigma-Aldrich, EC 232-619-9) Lipasa C. antárctica 100% 0% 0% 10 (Novozyme 435)

Para el aislamiento de los compuestos mencionados previamente, también se realizó este mismo ensayo con el sobrenadante obtenido de los cultivos de Bacillus sp. HR21-6 5 (CECT 8464) y se efectuó una purificación cromatográfica, para dar lugar a los compuestos 35 (26%) Y 36 (27%).

Con las lipasas comerciales procedentes de P. cepacea y C. antarctica soportada sobre resina acrílica, tampoco se observó reacción alguna para este sustrato.

Desacilación de per-O-acetilsacarosa (c1Jmpuesto 34)

Método A. Una suspensión de per-O-acetilsacarosa (compuesto 34) (6.0 mg, 8.8 ~mol) y el sobrenadante del cultivo de las cepas de la invención correspondiente (3.0 mg) en

15 CD30D (1.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante el tiempo indicado en cada caso. En la Figura 5 se muestra el espectro de 1H-RMN de la mezcla de reacción CHRMN (500 MHz, CD30D)]; los resultados s~:! muestran en la Tabla 4.

Método B. Una suspensión de per-O-acetilsacarosa (compuesto 34) (50.0 mg, 74 IJmol) y

20 el sobrenadante del cultivo de la cepa Bacillus sp. HR21-6 CECT 8464 (25.0 mg) en MeOH (16.0 mL) se agita a temperatura ambiente durante 4h. A continuación, se purifica mediante cromatografía en columna (CH 2CI2 __ CH2CI2-MeOH 1 :2) para dar lugar al compuesto 35 (11.2 mg, 26%) y al compuesto 36 (10.9 mg, 27%) como sirupos.

Ejemplo 5.4. Acilación regioselectiva de carbohidratos Los extractos enzimáticos de las cepas bacterianas descritas en la presente invención también permiten las reacciones de acilación regioselectiva de carbohidralos. Así, por ejemplo la acilación, preferentemente acetilación del compuesto 29 (metil 0.-0

5 glucopiranósido) usando acetato de isopropenilo como agente acilante, el extracto enzimático de Baci/lus stratosphericus como catalizador enzimático y DMF como codisolvente (Esquema 8), ha dado lugar a la obtención de los compuestos 37 y 28, que presentan grupos acilos en las posiciones 4 y 6, respectivamente.

OH O OAe

~O~ ~~'O

----

=--_0· HO HO' \._~-,+ AcO HO \._,...~

Extracto enzimatico-..., OH O Bacillus stratosphericus Me DMF

29 28 37

60·C

Esquema 8

A pesar de llevar a cabo calentamientos prolongados (60 oC durante 105 h) , la conversión

15 es del 49%, aunque con una alta regioselectividad, ya que se observa la presencia del producto monoacetilado en C-6 (compuesÍl:) 28) (13%), Y el compuesto 37 (metil 4,6-di-Oacetil-a.-D-glucopiranósido) como derivado acetilado mayoritario (36%), no detectado en los correspondientes ensayos de desacetilación.

20 Acilaci6n del metil 2,3,4,6-tatra-O-acatil-a-o-glucopiran6sido (compuesto 29) Una disolución del compuesto 29 (6.0 mg, 0.017 mmol), el sobrenadante del cultivo de la cepa Bacillus sp. HR21-6 CECT 8464 (3.0 mg) y acetato de isopropenilo (0.5 mL) en DMF (0.3 mL) se calienta con agitación a 60 oC durante 105 h. A continuación se concentra a sequedad y el residuo se analiza mediante 1H-RMN, mostrando una mezcla

25 de los compuestos 28. 29 Y37 en una proporción de 13%, 51% Y 36%. respectivamente.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Cepa microbiana de Enterobacler depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 8462.

2. 2.

   Extracto enzimático obtenible a partir del cultivo de la cepa bacteriana descrita según la reivindicación 1.

3. 3.

   Extracto enzimálico según la reivindicación 2, caracterizado porque está concentrado y/o dializado.

4. 4.

   Extracto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 caracterizado porque el extracto enzimático está liofilizado.

5. 5.

   Extracto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el cultivo además comprende un sustrato lipidico.

6. 6.

   Extracto enzimático según la reivindicación 5 donde el sustrato lipidico se selecciona de entre surfactantes, triglicéridos o aceites esenciales.

7. 7.

   Uso de la cepa bacteriana según la reivindicación 1, o del extracto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 como catalizador para reacciones enzimáticas de acilación y/o desaciladón de compuestos.

8. 8.

   Uso según la reivindicación anterior, donde los compuestos son polifenoles y/o carbohidratos.

9. 9.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, donde las reacciones son regioselectivas.

10. 10.

    Método para obtener derivados alcilados de polifenoles y/o carbohidratos mediante reacciones enzimáticas de acilación o desacilación sobre polifenoles y/o carbohidratos, que comprende las siguientes etapas:

    a) poner el extracto enzimático descrito según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 en contacto con polifenoles, carbohidratos o cualquiera de sus derivados acilados, en presencia de un agente acilante o un alcohol alifático para llevar a cabo reacciones enzimáticas de acilación o desacilación, respectivamente; y

    b) purificar los derivados ac:ilados de polifenoles y/o carbohidratos obtenidos en la etapa a).
11. 11 . Método según la reivindicaci6n 10, donde los polifenoles del paso a) son hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol, alcohol protocateuico o cualquiera de sus derivados acilados.

12. 12.

    Método según la reivindicaci6n 10 donde los carbohidratos del paso a) se seleccionan de entre mono-, di-, c:>ligo-, polisacáridos o cualquiera de sus derivados acilados, preferiblementE! metil-a-D-glucopiran6sido tetraacetilado, tetrahelosa octaacetilada o sacarosa octaacetilada.

13. 13.

    Método según la reivindicación 10 u 11, donde la reacción enzimática es de desacilaci6n, el polifenol del paso a) es un derivado acetilado de hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocateuico y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático.

14. 14.

    Método según la reivindicaci6n 13, donde la reacción enzimática es de desacilaci6n, el polifenol del paso a) es hidroxitirosol triacetilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de metanol.

15. 15.

    Método según la reivindicación 13, donde la reacci6n enzimática es de desacilaci6n de los hidroxilos aromáticos, el polifenol del paso a) es 3,4dihidroxifenilglicol tetraacilado y la reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático para producir la eterificaci6n en la posición bencilica.

16. 16.

    Método según la reivindicación 13, donde la reacci6n enzimática es de desacilación, el pollfenol del paso a) es alcohol protocatecuico peracilado y la

    reacción se lleva a cabo en presencia de un alcohol alifático para producir la eterificaci6n de la posición bencílica.

17. 17.

    Método según la reivindicadón 10 u 11 , donde la reacci6n enzimática es de acilación, el polifenol del paso a) es hidroxitirosol, 3,4-dihidroxifenilglicol o alcohol protocateuico y la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente acilante y opcionalmente de un co-disolvente.

18. 18.

    Método según la reivindicación 17 donde el agente acilante es acetato de isopropilo o acetato de vinilo y/o el ce-disolvente es DMF.

19. 19.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12, donde la reacción enzimática es de desacilación, el carbohidrato del paso (a) es metil a-Dglucopiranósido tetraacetilado, trehalosa octaacetilada o sacarosa octaacetilada y la reacción se lleva a cabo en presencia de alcohol alifático opcionalmente metanol deuterado a temperatura ambiente.