ES2554835T3 - Procedimiento de identificación de línea celular - Google Patents

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ES2554835T3 ES10705853.9T ES10705853T ES2554835T3 ES 2554835 T3 ES2554835 T3 ES 2554835T3 ES 10705853 T ES10705853 T ES 10705853T ES 2554835 T3 ES2554835 T3 ES 2554835T3
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Jean-Pol Cassart
Patricia Anne-Laure Lienard
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Abstract

Un procedimiento de identificación de línea celular que comprende las siguientes etapas: (a) análisis del gen de calmodulina, en el que un fragmento del gen de calmodulina es amplificado por PCR y en el que el fragmento amplificado comprende la secuencia entre el exón 3 y el exón 4 del gen de calmodulina; y (b) análisis del gen de tirosina quinasa receptora Axl, en el que un fragmento del gen de la tirosina quinasa receptora Axl es amplificado por PCR, y en el que el fragmento amplificado comprende la secuencia entre el exón 18 y el exón 19 del gen de la tirosina quinasa receptora Axl; y en el que la línea celular es identificada por el tamaño de un intrón en dichos genes.

Description

Procedimiento de identificación de línea celular
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la identificación de líneas celulares. Más particularmente, se refiere a la identificación de líneas celulares mediante el análisis por técnicas moleculares, y la identificación de variación en intrones o determinando si un gen particular está presente. Este procedimiento es particularmente útil para el control de calidad de las líneas de células utilizadas para la producción de preparaciones farmacéuticas.
Antecedentes de la invención
Los procedimientos actuales realizados en el control de calidad (QC) utilizan la técnica de la isoenzima. Este procedimiento se basa en el análisis de las movilidades electroforéticas de las isoenzimas que difieren entre especies. Los perfiles de movilidad se pueden establecer para cada especie utilizando el análisis combinado de las distancias de migración de las enzimas, tales como: glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), aspartato aminotransferasa (AST), lactato deshidrogenasa (LDH) y malato deshidrogenasa (MD). Este procedimiento proporciona un medio para determinar la especie de origen de una línea celular y detectar células con contaminación transversal con células de otra línea celular especie diferente (Stacey and Hockley, 2006). Sin embargo, esta prueba es laboriosa y requiere mucho tiempo. Liu et al. (2008) divulgan la identificación y autentificación de cultivo de células animales estrechamente relacionadas mediante amplificación por PCR del gen de la aldolasa.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han demostrado que las líneas celulares pueden identificarse por un procedimiento más fiable y más fácilmente que con las metodologías de identificación actuales. El procedimiento de identificación de la presente invención se basa en el análisis del tamaño de las secuencias intrónicas que difieren entre especies. Este procedimiento implica la amplificación de las secuencias intrónicas mediante lar reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los presentes inventores han identificado genes que están suficientemente conservados en las secuencias exónicas para permitir la hibridación con los cebadores de amplificación de PCR y suficientemente diferentes en la secuencia de intrón para permitir la discriminación basada en el polimorfismo de la longitud. Por tanto, la discriminación de estas variaciones puede determinarse mediante análisis de estas regiones genómicas.
El procedimiento permite la identificación de una serie de tipos de línea celular derivada de vertebrados (por ejemplo, MRC-5, Vero, CHO, FRHL-2, MDCK, fibroblastos de embrión de pollo [CEF]), basado en intrones polimórficos informativos que se encuentran en dos genes, calmodulina y la tirosina quinasa receptora de Axl. Además, el uso de un gen específico de líneas celulares de insectos, el análisis para determinar la presencia o ausencia de un gen de insecto puede ayudar a identificar líneas celulares derivadas de insecto por ejemplo Hi-5.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento de identificación de línea celular que comprende uno o más de las siguientes etapas:
(a)
análisis del gen de calmodulina, en el que un fragmento del gen de calmodulina se amplifica por PCR y en el que el fragmento amplificado comprende la secuencia entre el exón 3 y el exón 4 del gen de calmodulina; y
(b)
(c) análisis de la tirosina quinasa receptora Axl, en el que un fragmento del gen de la tirosina quinasa receptora Axl se amplifica por PCR, y en el que el fragmento amplificado comprende la secuencia entre el exón 18 y el exón 19 del gen de la tirosina quinasa receptora Axl;
y en el que la línea celular se identifica por el tamaño de un intrón en dichos genes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 Análisis de los productos de PCR de CALM3/4
Figura 2 Análisis de los productos de PCR de AXL 18/19.
Figura 3 Análisis del producto de PCR de PPATTA.
Descripción de la invención
Los inventores pretenden que los términos “que comprende”, “comprende” y “consiste”, puedan opcionalmente sustituirse con las expresiones que “consiste en”, “consiste en" “constituido por”, respectivamente, en cada caso.
Los presentes inventores han identificado regiones conservadas y variables en los genes que codifican la calmodulina y la tirosina quinasa receptora Axl. La variación en los genes permite la discriminación entre las diferentes líneas celulares; estas variaciones pueden detectarse usando cualquier procedimiento que permita el análisis del ácido nucleico. Adicionalmente, las regiones conservadas se pueden utilizar para diseñar cebadores complementarios, ya sea para la amplificación por PCR o para la reacción de secuenciación que se puede utilizar
para analizar líneas celulares de muchas fuentes. Las líneas celulares derivadas de insectos se pueden identificar mediante la detección de secuencias de nucleótidos específicas de insectos.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular como se define en las reivindicaciones.
La presente invención puede usarse para identificar muchos tipos de líneas celulares. La expresión "línea celular" como se usa en el presente documento se refiere a cultivos celulares establecidos cultivados in vitro. Las líneas celulares pueden derivar de cualquier especie de animales, incluyendo mamíferos, aves e insectos. En una realización particular, el procedimiento de identificación de la presente invención se utiliza para las líneas celulares utilizadas en la industria farmacéutica. En una realización particular, se utilizan los procedimientos de la presente invención para identificar líneas celulares utilizadas en la producción de virus que se pueden usar en las vacunas.. La expresión "línea celular" abarca cultivos celulares continuos que son cultivos celulares de células morfológicamente uniformes que pueden propagarse in vitro durante un tiempo indefinido. De acuerdo con lo anterior, en una realización, los procedimientos de la invención pueden usarse para identificar y / o diferenciar las líneas celulares seleccionadas del grupo: MRC-5, Vero, Hi-5, CHO, FRHL2 y MDCK. Las expresión "línea celular" también incorpora líneas celulares primarias, es decir, células que se aíslan directamente de un sujeto. De acuerdo con lo anterior, en una realización, los procedimientos de la presente invención se usan para identificar células derivadas de pollo, por ejemplo, CEF (fibroblastos de embrión de pollo).
Los presentes inventores han identificado genes de calmodulina y de tirosina quinasa receptora Axl, que comprenden exones conservados e intrones variables. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa de: análisis del gen de la calmodulina. En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa de: análisis del gen de la tirosina quinasa receptora de Axl.
Un gen específico de insectos también se ha identificado, lo que permite la discriminación entre células derivadas de insectos y células derivadas de otros organismos, por ejemplo células de mamífero o de aves. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa de: análisis de un gen de atacina.
El término "análisis" se refiere a cualquier técnica analítica que permitirá a la persona experta diferenciar / discriminar secuencias de ácido nucleico de diferentes líneas celulares. Hay un gran número de técnicas adecuadas para este propósito conocidas por los expertos, estas técnicas incluyen, pero no se limitan a: amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación, hibridación y polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). En un aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de línea celular de la invención en el que el procedimiento de análisis se selecciona del grupo que consiste en amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación, hibridación y polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP).
El término "gen de la calmodulina" es bien conocido por el experto en la técnica y como se utiliza en el presente documento se entiende que significa un gen que codifica un polipéptido que comprende al menos un motivo de EFmano que es capaz de la unión al calcio. La calmodulina desempeña un papel importante en la transmisión de las señales de Ca2+ intracelular a una amplia variedad de sistemas efectores (Rhyner et al., (1994) Euro J Biochem 225: 71-81). En mamíferos, 3 genes (CALM1, CALM2 y CALM3) codifican la proteína individual altamente conservada, calmodulina (CaM ) (Berchtold et al., (1993) Genomics 16: 461-465). En realizaciones particulares de la invención, la expresión gen de la calmodulina es una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEC ID Nº 7 o codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 % o99% con la SEC ID Nº 7.
Las expresión "gen de atacina" como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos antibacterianos de insectos conocidos como atacinas y proteínas similares a la atacina incluyendo atacinas básicas y ácidas (véase, por ejemplo, Boman et al., (1991) Eur J. Biochem 201: 21-31). El término abarca secuencias genómicas que codifican atacinas, proatacinas y pre-proatacinas; estos términos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las atacinas son polipéptidos que son específicos de los insectos y, por lo tanto, no se encuentran en mamíferos ni en aves. En aspectos concretos de la divulgación, la expresión gen de la atacina es una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEC ID Nº 9 o polipéptidos con secuencias de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97%, 98% o 99%con la SEC ID Nº 9.
La expresión "tirosina quinasa receptora de Axl" es bien conocida por el experto en la técnica y se usa en el presente documento para significar proteínas transmembrana que participan en la señalización intracelular que se desencadena a través de la activación del dominio de tirosina quinasa y la posterior fosforilación de diversos sustratos y que es una parte del receptor de tirosina quinasa de la familia Axl. Las tirosina quinasas receptoras de Axl se expresan de forma ubicua en una serie de líneas celulares, incluyendo las de origen epitelial, mesenquimatoso y hematopoyético, así como células no transformadas (Hafizi y Dahlhbäck, 2006 [Cytokine & Growth Factor Reviews 17: 295-304]).
La actividad transformadora de la tirosina quinasa receptora Axl demuestra que el receptor puede conducir a la proliferación celular. Aunque la función de la tirosina quinasa receptora Axl en células y tejidos no transformados se desconocía, Varnum et al. (1995, Nature, 373: 623-626) sospecharon que puede implicar la estimulación de proliferación celular en respuesta a una señal adecuada, es decir un ligando que activa el receptor. Varnum et al. (1995) purificaron el factor estimulador de la tirosina quinasa receptora de Axl e identificaron como el producto del gen 6 específico del cese del crecimiento (GAS6). El gen de la tirosina quinasa Axl codifica un receptor tirosina quinasa que regula el crecimiento y diferenciación celular (O’Bryan et al., (1991) Mol Cell Biol 11: 5016-31). La organización genómica del locus del gen de la tirosina quinasa Axl humana la describió Schulz et al., (1993 Oncogene 8: 509-13). El gen de la tirosina quinasa Axl humana contiene 20 exones que se distribuyen sobre una región de 44 kb.
En realizaciones particulares de la invención, la expresión gen de la tirosina quinasa receptora AxI significa una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEC ID Nº 8 o polipéptidos con secuencias de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99%con la SEC ID Nº 8.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las siguientes etapas: (a) análisis del gen de la calmodulina; y (b) análisis del gen de la tirosina quinasa receptora Axl.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las siguientes etapas: (a) análisis del gen de la calmodulina; y (b) análisis de un gen de atacina.
En un aspecto, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las siguientes etapas: (a) análisis de un gen de atacina; y (b) análisis del gen de la tirosina quinasa receptora Axl.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las siguientes etapas: (a) análisis del gen de la calmodulina; (b) análisis del gen de la tirosina quinasa receptora Axl; y
(c) análisis de un gen de atacina.
Se prevé que el experto puede desear utilizar diversas técnicas moleculares para identificar una o más líneas celulares. Por ejemplo, en ciertos aspectos de la divulgación el experto puede utilizar uno o más, o cualquier combinación de las siguientes técnicas: PCR, secuenciación, hibridación y RFLP. De acuerdo con lo anterior, los procedimientos de la divulgación pueden llevarse a cabo utilizando una o más de las técnicas moleculares seleccionadas de la lista que comprende PCR, secuenciación, hibridación y RFLP, o cualquier combinación de las mismas.
En un aspecto particular de la divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las etapas que comprenden una o más de las siguientes etapas: (a) amplificación por PCR de un gen de la calmodulina o fragmento del mismo; (b) amplificación por PCR de un gen de la tirosina quinasa receptora Axl o fragmento del mismo; o (c) amplificación por PCR de un gen de atacina o fragmento del mismo; o cualquier combinación de los mismos.
El término "fragmento" como se describe en el presente documento se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico de un gen, que no es toda la secuencia del gen, que comprende al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 400, 600, 800, 1.000, 1.200, 1.400, 1.600 o más nucleótidos.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende una o más de las etapas siguientes: (a) hibridación de una sonda al gen de la calmodulina o fragmento del mismo; (b) hibridación de una sonda a un gen de la tirosina quinasa receptora Axl o fragmento del mismo; o (c) hibridación de una sonda a un gen de atacina o fragmento del mismo; o cualquier combinación de los mismos.
En un aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende una o más de las etapas siguientes: (a) secuenciación del gen de la calmodulina o fragmento del mismo;
(b) secuenciación de un gen de la tirosina quinasa receptora Axl o fragmento del mismo; o (c) secuenciación de un gen de atacina o fragmento del mismo; o cualquier combinación de los mismos.
Los genes que codifican la calmodulina comprenden intrones de tamaño variable entre las diferentes líneas celulares.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la línea celular se identifica por el tamaño (número de nucleótidos) del amplicón (producto amplificado tras la PCR). Los inventores han determinado que los intrones dentro de los genes de la tirosina quinasa receptora Axl y de calmodulina varían en cuanto al tamaño entre las diferentes especies y / o cepas. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto particular de la divulgación las líneas celulares se pueden diferenciar y / o determinado por el tamaño de un intrón en particular entre dos exones. En un aspecto particular, las líneas celulares se determinan por el tamaño del amplicón derivado del gen de la calmodulina y / o del gen de la tirosina quinasa receptora Axl. En un aspecto, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa: amplificación por PCR del gen de la calmodulina o fragmento del mismo.
La amplificación por PCR de un fragmento del gen de la calmodulina permite la identificación y / o la diferenciación de líneas celulares ya que los mismos genes de diferentes líneas celulares difieren en la longitud de los intrones. Por
lo tanto se pueden usar conjuntos de cebadores que se diseñan para amplificar uno o más de los intrones que se encuentran en el gen de la calmodulina para identificar y / o diferenciar líneas celulares. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa de: amplificación por PCR de uno o más de los intrones de calmodulina o un fragmento de los mismos. En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa de: amplificación por PCR del intrón entre los exones 3 y 4 del gen de la calmodulina.
En un aspecto, se proporciona un procedimiento en el que un fragmento del gen de la calmodulina se amplifica por PCR y en un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento en el que el fragmento amplificado comprende la secuencia entre el exón 3 y el exón 4 del gen de la calmodulina.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento en el que un fragmento del gen de la calmodulina se amplifica usando al menos uno de los cebadores seleccionados de la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2 o un derivado funcional de los mismos.
El gen de la tirosina quinasa receptora Axl ha conservado exones e intrones que varían entre las diferentes líneas celulares. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa: amplificación por PCR de un gen de la tirosina quinasa receptora Axl o fragmento del mismo. La amplificación por PCR de un fragmento del gen de la tirosina quinasa receptora Axi permite la diferenciación entre líneas celulares, ya que las diferentes líneas celulares difieren en la longitud de los intrones. Por lo tanto, los conjuntos de cebadores que se diseñan para amplificar uno o más de los intrones que se encuentran en los genes de tirosina quinasa receptora AxI se pueden utilizar para diferenciar entre diferentes líneas celulares; de este modo la amplificación de un intrón que varía en cuanto a longitud entre las diferentes líneas celulares se puede usar en los procedimientos de la divulgación. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa: amplificación por PCR de uno o más intrones del gen de la tirosina quinasa receptora Axl o fragmento del mismo. En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa de: amplificación por PCR del intrón entre los exones 18 y 19 del gen de la tirosina quinasa receptora AxI. En un aspecto, se proporciona un procedimiento por el cual se amplifica un fragmento del gen de la tirosina quinasa receptora Axl por PCR. En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento en el que el fragmento amplificado comprende la secuencia entre el exón 18 y el exón 19 del gen de la tirosina quinasa receptora Axl. Adecuadamente, el procedimiento en el que un fragmento del gen de la tirosina quinasa receptora Axl se amplifica utiliza al menos uno de los cebadores seleccionados de las SEC ID Nº 3 y la SEC ID Nº 4 o un derivado funcional de los mismos.
El tipo de célula puede determinarse por la presencia o ausencia del gen es decir, la línea celular particular puede diferenciarse de otra a través de la presencia o ausencia de un gen particular o fragmento del mismo.
Por "presencia" de un gen se quiere decir que la totalidad o parte del gen especificado es detectable por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, una línea celular de insecto puede diferenciarse de una línea celular de mamífero a través de la detección de un gen solo presente en células de insecto.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa en la que el tipo de línea celular se determina por la presencia y / o ausencia de un gen de atacina o fragmento del mismo.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa: amplificación por PCR del gen de pre-proatacina (PPATT) o fragmento del mismo. En un aspecto, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende la etapa: amplificación por PCR del gen de pre-proatacina A (PPATTA) o fragmento del mismo. En un aspecto, se proporciona un procedimiento en el que un fragmento del gen de atacina se amplifica por PCR. De acuerdo con lo anterior, un procedimiento en el que un fragmento del gen PPATT se amplifica usando al menos uno de los cebadores que comprenden las secuencias seleccionadas de la SEC ID Nº 5 y la SEC ID Nº 6 o un derivado funcional de los mismos.
Sin embargo, está claro para la persona experta en la técnica que la presencia y o ausencia de un gen pueden determinarse por una serie de técnicas, que incluyen amplificación por PCR del gen o parte del mismo. Otras técnicas mediante las cuales la presencia de genes puede evaluarse incluyen, pero no se limitan a, hibridación de ADN, en particular en hibridación de ADN in situ. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "hibridación" o "hibridación específica" significa que el cebador o sonda forma un dúplex (secuencia de nucleótidos de doble cadena) con parte de una diana o con toda la región en las condiciones experimentales utilizadas, y que en dichas condiciones, el cebador o sonda no forma un dúplex con otras regiones de la secuencia de nucleótidos presente en la muestra a analizar. Se debe entender que los cebadores y sondas de la presente divulgación se diseñan para la hibridación específica a genes específicos y, por lo tanto, pueden estar completamente dentro de dicha región o pueden, en gran medida, superponerse con dicha región (es decir, forman un dúplex con nucleótidos en el exterior, así como dentro de dicha región). De acuerdo con lo anterior se proporciona un procedimiento en el
que los cebadores como se describe en el presente documento se pueden utilizar durante una reacción PCR o hibridación de ADN..
La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede realizar a partir del ácido nucleico genómico aislado y/o purificado partir de un cultivo celular. Abarcadas en la divulgación hay reacciones de PCR llevadas a cabo en una suspensión de células, preparación genómica bruta, aislada o purificada, utilizando técnicas de preparación de ADN genómico bien conocidas por los expertos en la técnica. Las preparaciones genómicas abarcadas por la presente divulgación pueden aislarse o purificarse sustancialmente. Por "aislada" o "sustancialmente purificada" se pretende que las moléculas de ácido nucleico estén sustancialmente o esencialmente libres de componentes que normalmente se encuentran en asociación con el ácido nucleico en su estado natural. Tales componentes incluyen otros materiales celulares y medios de cultivo, por ejemplo.
Los procedimientos para diseñar cebadores de PCR son generalmente conocidos en la técnica y se describen en Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Harbour Laboratory Press). Los procedimientos conocidos de PCR incluyen, pero no se limitan a, procedimientos utilizando cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos del vector, cebadores parcialmente coincidentes, y similares.
Con la PCR, es posible amplificar una única copia de una secuencia diana específica en el ADN genómico hasta un nivel detectable mediante varias metodologías diferentes (por ejemplo, sin limitaciones, hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores biotinilados; seguido de detección del conjugado de avidina-enzima; incorporación de los desoxinucleótidos trifosfato marcados con 32P, tales como dCTP o dATP, en el segmento amplificado, incorporación de un fluorocromo tal como bromuro de etidio u otros compuestos comerciales). Además del ADN genómico, se puede amplificar cualquier secuencia de nucleótidos con el conjunto adecuado de moléculas cebadoras. En concreto, los segmentos amplificados creados mediante el propio procedimiento de PCR son, ellos mismos, moldes eficientes para las posteriores amplificaciones por PCR.
La amplificación por PCR requiere "reactivos de PCR" o "materiales de PCR", que en el presente documento se definen como todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación, excepto la polimerasa, los cebadores y el molde. Los reactivos de PCR normalmente incluyen precursores de ácido nucleico (dCTP, dTTP, etc.), y tampón.
El término "cebador" se usa en el presente documento para referirse a cualquier secuencia de oligonucleótido de cadena sencilla que se puede usar como cebador en, por ejemplo, la tecnología PCR. Por lo tanto, un “cebador" se refiere a una secuencia de oligonucleótido de cadena sencilla que puede actuar como punto de inicio para la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a la hebra de ácido nucleico que se va a copiar. El diseño (longitud y secuencia específica) del cebador dependerá de la naturaleza de las dianas de ADN y / o ARN y de las condiciones en las que se utiliza el cebador (tales como la temperatura y la fuerza iónica).
Los cebadores que pueden consistir en las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID Nº 1 a 6, o pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 o 100 o más bases que comprenden o entran dentro de las secuencias de SEC ID Nº 1 a 6, siempre que sean adecuadas para la unión específica de ADN de los loci diana, en condiciones rigurosas. Cuando sea necesario, se pueden llevar a cabo ligeras modificaciones de los cebadores o sondas en cuanto a la longitud o a la secuencia para mantener la especificidad y la sensibilidad requeridas en las circunstancias dadas y, por lo tanto,1, 2, 3, 4, 5, 6 o más nucleótidos pueden estar sustituidos. Las sondas y / o los cebadores enumerados en el presente documento pueden extenderse en 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos, por ejemplo, en cualquier dirección.
Para evitar dudas, la designación de una letra que no sea A, T, G y C significan lo siguiente:
Código de una sola letra
B = C o G o T
D = A o G o T
H = A o C o T
K = G o T
M = A o C
N = A o C o G o T
R = A o G
S = C o G
V = A o C o G
W = A o T
Y = C o T
La expresión "derivado funcional" se usa en el presente documento para hacer referencia a un cebador que comprende una secuencia que es al menos un 95 % idéntica a un cebador tal como se define en el presente documento sobre la longitud del cebador, adecuadamente mayor que un 95 % idéntica tal como 96 %, 97 % , 98 %, 99 % y, más preferiblemente, tiene una identidad del 100 % sobre su longitud. Los derivados funcionales pueden tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 deleciones de bases en el extremo 5 'o 3' o ambos.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "condiciones rigurosas" significa cualquier condición de hibridación que permita que los cebadores se unan a una secuencia de nucleótidos específica, y no a cualquier otro locus en el genoma de la célula. Tales condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación a 6X de cloruro sódico / citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en 0,1 x SSC, 0,2% SDS a aproximadamente 68 ºC. Un ejemplo alternativo de condiciones de hibridación rigurosas son hibridación en 6 X SSC a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% de SDS a un 50-65 ºC (es decir, uno o más lavados a 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC o 65 ºC).
Los procedimientos de la divulgación pueden adaptarse de acuerdo con las líneas celulares que se tienen que diferenciar o determinar. Por ejemplo, algunas-líneas celulares pueden diferenciarse mediante amplificación por PCR de un intrón de solo calmodulina. Sin embargo, algunas líneas celulares-pueden dar lugar a un amplicón que es del mismo tamaño o como otra línea celular y, por lo tanto, se requieren medidas adicionales para la identificación de la línea celular.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las etapas: amplificación por PCR del gen de la calmodulina o fragmento del mismo.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las etapas de: amplificación por PCR del gen de la atacina o fragmento del mismo.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las etapas de: amplificación por PCR del gen de la tirosina quinasa receptora Axl o fragmento del mismo.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las etapas siguientes: (a) amplificación por PCR del gen de la calmodulina o fragmento del mismo; y (b) amplificación por PCR de un gen de atacina o fragmento del mismo.
En un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las etapas siguientes: (a) amplificación por PCR del gen de la calmodulina o fragmento del mismo; y (b) amplificación por PCR del gen de la tirosina quinasa receptora Axl o fragmento del mismo.
En una realización adicional, se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las etapas siguientes: (a) amplificación por PCR de un gen de atacina o fragmento del mismo; y (b) amplificación por PCR de un gen de la tirosina quinasa receptora Axl o fragmento del mismo.
En un aspecto se proporciona un procedimiento de identificación de la línea celular que comprende las etapas siguientes: (a) amplificación por PCR del gen de la calmodulina o fragmento del mismo; (b) amplificación por PCR de un gen de la atacina o fragmento del mismo; y (c) amplificación por PCR del gen de la tirosina quinasa receptora Axl
o fragmento del mismo.
En un aspecto particular, las reacciones de PCR pueden llevarse a cabo en una sola reacción de PCR. De acuerdo con lo anterior, un aspecto proporciona un procedimiento en el que se multiplexan las reacciones de amplificación de PCR. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "multiplexado" significa que cualquier número de reacciones de PCR se realiza en un único tubo de reacción, es decir, el contenido de un único tubo de reacción comprende más de 1 conjunto de cebadores. Los cebadores de la divulgación están diseñados de forma que se pueda realizar una sola reacción de PCR usando las condiciones de reacción especificadas que permiten amplificaciones de cada gen o fragmento del mismo utilizado en el procedimiento de la identificación celular (calmodulina, tirosina quinasa receptora Axl y atacina) sin perjuicio de la amplificación de otro gen. La multiplexación permite un procedimiento más rápido y más fácil de identificación molecular de la línea celular como se describe en el presente documento.
Los procedimientos de la divulgación son adecuadas para la identificación de varias líneas celulares que comprenden un gen de calmodulina, tirosina quinasa receptora Axl o atacina. En un aspecto, se proporciona un
procedimiento para la identificación de líneas celulares utilizadas en la industria farmacéutica, particularmente en la producción de vacunas. En un aspecto, se proporciona un procedimiento para la identificación de las líneas celulares MRC-5, Vero, Hi-5, CHO, FRHL2, CEF y MDCK. Estas líneas de células-son bien conocidas para los expertos en la técnica, sin embargo, para resumir:
Línea celular
Organismo
CHO
Cricetulus griseus Hámster chino
MRC-5
Homo sapiens ser humano
Canis familiaris
MDCK
Perro
Vero
Cercopithecus aethiops Mono verde africano
Macaca mulatta
FRHL2
macaco Rhesus
Pollo
Gallus gallus
Hi-5
Trichoplusia ni Insectos lepidópteros
En un aspecto adicional se proporciona un kit para la identificación de línea celular que comprende cebadores complementarios a uno cualquiera de: el gen de la calmodulina; un gen de la tirosina quinasa receptora Axl; o un gen de atacina; o cualquier combinación de los mismos. En un aspecto adicional, el kit comprende al menos un cebador
10 que comprende o que consiste en las siguientes secuencias o derivados funcionales de las mismas: SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº 2, la SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 4, la SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 6 o un derivado funcional de los mismos.
En un aspecto, se proporciona el uso de un gen de calmodulina, un gen de tirosina quinasa y / o el gen de atacina o cualquier combinación de los mismos en la identificación de la línea celular.
Ejemplos
15 1.1 Extracción de ADN genómico y amplificación por PCR
El ADN genómico se extrajo de células CHO, MRC-5, MDCK, VERO, FRHL2, Hi-5 y Gallus [CFO] usando el kit High Pure PCR template Preparation Kit (Roche). A continuación, la PCR se realizó en las siguientes condiciones de reacción utilizando los cebadores Calm ex 3F (SEC ID Nº 1 Calm ex 4R (SEC ID Nº 2), Axl ex 18F (SEC ID Nº 3), Axl 19R (SEC ID Nº 4), ppatta F (SEC ID Nº 5) y ppatta R (SEC ID Nº 6)
Mezcla
Ciclos
Volumen (μl)
Ingredientes Temperatura Tiempo Ciclos
hasta 25
H2OPCR 95 ºC 4 min
2,5
Tp PCR10x(+MgC12) 95 ºC 30 s X35
1
dNTP 10 mM 60 ºC 30 s
0,2
Cebador Axl exl 8F 72 ºC 1 min
0,2
Cebador Axl exl 9R 72 ºC 7 min
0,1
Cebador Calm ex 3F
0,1
Cebador Calm ex 4R
0,05
Cebador ppatta F
0,05
Cebador ppatta R
0,3
Ex Taq Takara
1
ADN (100 ng)
2.1 Determinación del tamaño de los productos de PCR mediante electroforesis capilar
El siguiente ejemplo demuestra que la diferencia en el tamaño del intrón entre los exones 3 y 4 de la calmodulina y 18 y 19 de Axl, puede, inequívocamente, identificar las 7 líneas celulares diferentes de las que se extrajo el ADN 5 genómico (véase 1.1).
A fin de permitir la detección de los productos de ADN después de electroforesis capilar, los cebadores inversos usados durante la amplificación por PCR se marcaron con colorantes fluorescentes distintos; el cebador inverso para PPTTA se marcó con NED, el cebador inverso para la calmodulina se marcó con Hex y el cebador inverso para Axl se marcó con 6-FAM. Los fragmentos de ADN marcado resultante se hicieron correr en paralelo con un marcador de
10 tamaño, lo que permite el análisis del producto de PCR con una resolución de tamaño de aproximadamente 1 pb para los fragmentos de menos de 500 pb.
El ADN genómico se amplificó utilizando cebadores inversos fluorescentes a una temperatura de hibridación de 60 ºC (de acuerdo con las condiciones de PCR descritas anteriormente). La electroforesis capilar se realizó con el instrumento Genetic Analyzer (ABl3730) utilizando capilares de 50 cm (ROX-1200 de escalera, ABI).
15 Los tamaños de los productos amplificados se compararon con los tamaños esperados en la Tabla 1. Los perfiles de electroforesis capilar se presentan en las Figuras 1 a 3.
Tabla 1: Comparación de los tamaños de los productos de PCR determinados por electroforesis capilar (observada a partir de las células) con los tamaños deducidos a partir de las secuencias publicadas (esperadas a partir del organismo).
Células PPATTA
CALM3/4 AXL18/19
Tamaño (pb) Células observadas Organismo esperado
Células observadas Organismo esperado Células observadas Organismo esperado
MRC-5 NA NA
316 320 1001 1010
VERO NA NA
273 ND 1027+1031 ND
CHO NA NA
274 ND 654 ND
FRHL2 NA NA
274 278 1007 1021
MDCK NA NA
277+279 283 355+577 583
Pollo NA NA
267 270 1350 1489
Hi-5 244 235
NA NA NA NA
NA: No aplicable ND: No descrito
Productos de PCR CALM3/4 (amplificación del gen de la calmodulina entre los exones 3 y 4)
El tamaño de los productos de PCR amplificados a partir de las células MRC-5, FRHL-2, MDCK y de pollo fue muy 20 cercano a los tamaños previstos. Se observaron dos picos a partir de las células MDCK (277 y 279 pb).
Un fragmento 274bp se amplificó a partir de células CHO y FHRL-2, cerca del fragmento de 273 pb amplificado a partir de células VERO. Otros fragmentos fueron diferentes en al menos 3 pares de bases. Los tamaños de los fragmentos VERO y CHO no se conocían antes de realizar el experimento.
Productos de PCR AXL18/19 (amplificación del gen de la calmodulina entre los exones 18 y 19)
La PCR de AXL 18/19 permitió la discriminación de los ADN de 6 vertebrados. El tamaño de los productos amplificados a partir de células VERO (1.027 y 1.031 pb) y CHO (654 pb) fue claramente diferente.
Productos de PCR de PPATTA (atacina)
El tamaño del fragmento de ADN amplificado a partir del ADN de T. ni usando los cebadores de PPATTA se estimó en 244 pb. Este tamaño coincidió con los 235 pb esperados.
Conclusiones
El análisis combinado de los productos de la PCR de CALM3 / 4 y AXL18 / 19 produjo patrones de tamaño que permiten la identificación inequívoca de las 6 líneas celulares de vertebrados.
3.1 Capacidad para detectar una especie menor es decir, la contaminación
El objetivo del siguiente ejemplo era evaluar la capacidad del ensayo de PCR anterior para detectar una mezcla de 2 tipos diferentes de células en la que las principales especies representan el 90 %, y las especies menores representan el 10 % de la mezcla.
Las mezclas de 90/10% de diferentes tipos de células se realizaron a nivel del ADN genómico considerando el número de copias del genoma (véase la Tabla 2).
El número de copias del genoma se calculó a partir de la cantidad de DNA (medida por el sistema Threshold) y de los tamaños del genoma (http://www.genomesize.com).
Tabla 2: Determinación del número de copias del genoma
Línea celular
Tamaño del genoma haploide(qg) Concentración de ADN (ng/µl) Volumen en 100 µl para obtener 9.000 copias / µl Volumen en 100 µl para obtener 1000 copias / µl
MRC-5
3,5 83 37,8 4,2
Vero
3,5 58 54 6
Hi-5
0,5 96 5 0,5
CHO
3,5 69 45 5
FRHL2
3,5 126 25,2 2,8
MDCK
3,2 34 85,5 9,5
Pollo
1,25 38 29,7 3,3
Aproximadamente 27.000 copias de las principales especies y 3.000 copias de las especies menores se mezclaron y se amplificaron en las condiciones de PCR descritas anteriormente (véase 1.1)
Resultados Los resultados de la detección de las diferentes mezclas se resumen en la Tabla 3. Tabla 3: Detección de una especie menor presentes en el 10 % en la mezcla de líneas celulares
Línea
MRC-5 VERO Hi-5 CHO FRHL-2 MDCK Pollo
celular
Gen 10 % 10 % 10 % 10 % 10 % 10 % 10 %
Calm
OK NA OK OK OK OK
MRC-5
90 % Axl OK NA OK OK OK OK
PPATTA
NA OK NA NA NA NA
VERO
90 % Calm OK NA 278/277 278/277 OK OK
Axl
NO NA OK OK OK OK
PPATTA
NA OK NA NA NA NA
Hi-5
90 % Calm OK OK OK OK OK OK
Axl
OK OK OK OK OK OK
PPATTA
NA NA NA NA NA NA
CHO
90 % Calm OK 277/278 NA 278/278 OK OK
Axl
OK OK NA OK OK OK
PPATTA
NA NA OK NA NA NA
FRHL-2
90 % Calm OK 277/278 NA 278/278 NO OK
Axl
NO OK NA OK OK OK
PPATTA
NA NA OK NA NA NA
MDCK
90 % Calm OK OK NA OK OK OK
Axl
OK OK NA OK OK OK
PPATTA
NA NA OK NA NA NA
Pollo
90 % Calm OK OK NA OK OK OK
Axl
OK OK NA OK OK OK
PPATTA
NA NA OK NA NA NA
OK: El 10 % de las especies menores se detectó utilizando la PCR mencionada Cuando no se puede distinguir la especie porque el tamaño del fragmento es idéntico, o muy cercano, el tamaño de ambos productos se indica en la tabla
5 NO: El 10 % de las especies menores no se detectó utilizando la PCR mencionada NA: No aplicable Para algunas mezclas, una sola amplificación por PCR no permitió detectar las especies menores:
 Las mezclas de CHO/VERO/FRHL2 no se pudieron detectar usando la PCR de CALM3 / debido a que los productos mostraron tamaños idénticos o similares 10  10 % de MDCK en FRHL-2 no se pudo detectar con el ensayo de CALM3/4
 El 10 % de MRC5 in FRHL-2 y en VERO no se pudo detectar con el ensayo de AXL18/19 Por lo tanto, puede verse que el análisis combinado de los productos de PCR de CALM3/4, AXL18/19 y PPATTA permitió la detección de una contaminación de10 % de ADN entre las 7 líneas celulares diferentes y que, en algunos casos, se requirió sólo análisis de 1 o 2 genes para detectar la contaminación.
15 Listado de secuencias
<110> Cassart, Jean-Pol Lienard, Patricia
<120> Nuevo procedimiento
<130> VB63206P
<160> 9 20 <170> FastSEQ para la versión 4.0 de Windows
<210> 1
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 25 <220>
<223> oligonucleótido
<400> 1 caaagaagcy ttttcactat ttgacaa 27
<210> 2 30 <211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido
5
<400> 2
tcatttttct tgccatcatt gtcaga
26
<210> 3
<211> 20
<212> ADN
10
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 3
ggrgactact accgycaggg
20
15
<210> 4
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
20
<223> oligonucleótido
<400> 4
caatctccca catbgtcacc cc
22
<210> 5
<211> 25
25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 5
30
ctattgtcga ccatacctct accgt 25
<210> 6
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
35
<220>
<223> oligonucleótido
<400> 6
cgtggccgtt gctggataag 20
<210> 7
<211> 149
<212> PRT
<213> H. sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 894
<212> PRT
<213> H. sapien
<400> 8
<210> 9
<211> 192
<212> PRT
<213> Trichoplusia
<400> 9

Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de identificación de línea celular que comprende las siguientes etapas:
    (a) análisis del gen de calmodulina, en el que un fragmento del gen de calmodulina es amplificado por
    PCR y en el que el fragmento amplificado comprende la secuencia entre el exón 3 y el exón 4 del gen de 5 calmodulina; y
    (b) análisis del gen de tirosina quinasa receptora Axl, en el que un fragmento del gen de la tirosina quinasa receptora Axl es amplificado por PCR, y en el que el fragmento amplificado comprende la secuencia entre el exón 18 y el exón 19 del gen de la tirosina quinasa receptora Axl;
    y en el que la línea celular es identificada por el tamaño de un intrón en dichos genes.
    10 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el gen de la calmodulina es una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEC ID Nº 7 o codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 70%, 75%, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o 99% con la SEC ID Nº 7.
  2. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el gen de la tirosina quinasa receptora Axl es una
    secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEC ID Nº 8 o polipéptidos con secuencias de 15 aminoácidos que tienen una identidad de secuencia del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %
    o 99%con la SEC ID Nº 8.
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