ES2555454T3 - Nueva familia de análogos de NADP+ o NADPH, su preparación y su aplicación en agentes terapéuticos - Google Patents
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Abstract
Compuestos de fórmula I:**Fórmula** en la que: (i) X representa un grupo aceptor de electrones, elegido entre el grupo que comprende: - NO2, - CN, - CHO, - COOH, - CF3, - F, - CH>=C(CN)2, - SO3H, - CONR9R10 o SO2NR9R10, en los que R9 y R10 cada uno representa independientemente del otro un hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C3) lineal o ramificado, o un grupo arilo, - COR9, en el que R9 representa un hidrógeno, un grupo alquilo (C1-C3) lineal o ramificado, o un grupo arilo, o - un grupo tetrazolilo, (ii) Y representa un grupo dador de electrones, elegido entre el grupo que comprende -NR9-, -OC(R19R14)- o -SC (R19R14)-, en el que: - R19 se elige entre: - un hidrógeno, - un grupo alquilo (C1-C8) lineal, en particular un etilo, estando dicho grupo alquilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados entre: grupo -OH, grupo -NH2, grupo -COOH, grupo CONH-arilCOOH o grupo NHCO-aril-COOH o grupo NHCOarilsulfato, o grupo NHCOarilsulfonato, en los que el grupo arilo se elige entre fenilo, naftilo o bifenilo, o - un grupo orgánico hidrosoluble, en particular PEG, - R14 representa un hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C4) lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con - OH. (iii) A representa un enlace elegido entre el grupo que comprende: (a) -C≡C-, o (b)**Fórmula** en el que: - M1 y M2 representan independientemente el uno del otro H, F, Cl, Br o I, n es un número entero elegido entre 1, 2 o 3, (iv) cada uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 o R8 se selecciona independientemente entre el grupo que comprende: - H, - F, Cl, Br, I, - un alquilo (C1-C4) lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes elegidos entre: - OH, - NR11R12, en el que R11 y R12 cada uno representa independientemente del otro un hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C3) lineal o ramificado, o - COOR11, en el que R11 representa un hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C3) lineal o ramificado, - CONHR13 o NHCOR13, en los que R13 representa un grupo alquilo (C1-C4) lineal o ramificado, (v) L representa un grupo espaciador seleccionado entre el grupo que comprende:**Fórmula** en los que m y q cada uno representa independientemente del otro un número entero elegido de 0 a 5, estando dichos grupos opcionalmente sustituidos con uno o más OH, (vi) B representa la siguiente fórmula II:**Fórmula**
Description
en el que m representa un número entero elegido de 0 a 5, q representa 0, respondiendo dichos compuestos a la siguiente fórmula (Ii):
[0034] En una realización más particular, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (Ia), en la que: 10 -A representa :
- siendo n un número entero elegido entre 1, 2 o 3,
- 15
- - T representa un átomo de oxígeno,
- -
- R18 representa un grupo adenina,
- -
- R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, X, L, R16, R17 y R19 son como se han definido anteriormente en el presente
- documento, respondiendo dichos compuestos a la siguiente fórmula (Ib):
[0035] En una realización más particular, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (Ib), en la que: -L representa
en la que m representa un número entero elegido de 0 a 5, q representa 0, -X, n, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R16, R17 y R19 son como se han definido anteriormente en el presente
documento, respondiendo dichos compuestos a la siguiente fórmula (Ic):
5 [0036] Aún en una realización más particular, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (Ic), en la que:
-R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 respectivamente representa un átomo de hidrógeno, -R19 representa un grupo etilo,
10 -R16, R17, X son como se han definido anteriormente en el presente documento, -n representa un número entero elegido entre 1, 2 o 3, -m representa un número entero elegido de 0 a 5,
respondiendo dichos compuestos a la siguiente fórmula (Id): 15
[0037] En una realización favorable, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (Id), en la que:
20 -m representa el número entero 2, -R16, R17, X son como se han definido anteriormente en el presente documento, -n representa 1, 2 o 3, respondiendo dichos compuestos a la siguiente fórmula (Ie)
25 [0038] En otra realización favorable, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (Id), en la que:
-n representa el número entero 1, -R16, R17, X son como se han definido anteriormente en el presente documento, 30 -m representa un número entero elegido de 0 a 5, respondiendo dichos compuestos a la siguiente fórmula
[0039] En otra realización favorable, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (Id), en la que:
-X representa grupo -NO2 o CN, -R16, R17 son como se han definido anteriormente en el presente documento, -n representa un número entero seleccionado entre 1, 2 o 3, -m representa un número entero elegido de 0 a 5, respondiendo dichos compuestos a la siguiente fórmula (Ig1):
o la siguiente fórmula (Ig2) :
15 [0040] En una realización más favorable, la presente invención proporciona compuestos de fórmula (Ig1), en la que:
-n representa el número entero 1, -m representa el número entero 2, -R16, R17 representa cada uno independientemente del otro OH, H2PO4, HSO4, OPO3(NH4)2, o cualquier sal de
20 estos grupos fosfato o sulfato, respondiendo dichos compuestos a la siguiente fórmula (Ih1):
en el que M1 y M2 representan independientemente el uno del otro H, F, Cl, Br o I.
5 [0054] En una realización en particular, la presente invención proporciona los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ii), mencionados anteriormente, cuando el enlace entre dos arilos de los compuestos mencionados anteriormente es un doble enlace, (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (Ig1), (Ig2), (Ih1), (Ih2) y los compuestos 9, 10, 11, 12, 15 o 16 en forma trans biológicamente activa.
10 [0055] En otra realización, la presente invención proporciona los compuestos de fórmula (I) mencionados anteriormente en forma cis, en los que el enlace A entre dos arilos de los compuestos mencionados anteriormente se representa con
15 en el que M1 y M2 representan independientemente el uno del otro H, F, CI, Br o I.
[0056] En una realización en particular, la presente invención proporciona los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ii), mencionados anteriormente, cuando el enlace entre dos arilos de los compuestos mencionados anteriormente es un
20 doble enlace, (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (Ig1), (Ig2), (Ih1), (Ih2) y los compuestos 9, 10, 11, 12, 15 o 16 en forma cis.
[0057] La presente invención también proporciona compuestos de fórmula (I) como un fármaco para su uso en quimioterapia.
25 [0058] En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) para uso como un agente antiangiogénico en quimioterapia para el tratamiento de cánceres, en particular para el tratamiento de cánceres superficiales, tales como melanomas, cánceres del tracto respiratorio superior, o cánceres del tracto aerodigestivo superior.
30 [0059] La presente invención también proporciona compuestos fotoactivables de fórmula (I), en la que el enlace A entre dos arilos de los compuestos mencionados anteriormente es un doble enlace.
[0060] En una realización, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) como un agente de formación de imágenes para diagnóstico de cáncer, en particular para diagnóstico de cáncer superficial.
35 [0061] La presente invención también proporciona una composición fotoactivable que comprende al menos un compuesto de fórmula (I), en la que el enlace A se representa mediante
40 y está en la forma cis, o el enlace A está tanto en la forma cis como trans, en el que M1 y M2 representan independientemente el uno del otro H, F, Cl, Br o I.
[0062] De acuerdo con la presente invención, los compuestos de fórmula (I) o sus sales farmacéuticamente
45 aceptables son útiles en composiciones farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención comprenden como principio activo uno o más de los compuestos de fórmula (I) o sus sales farmacéuticamente aceptables, en combinación con excipientes y/o diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Se puede usar cualquier material vehículo convencional. El material vehículo puede ser un material vehículo inerte orgánico o inorgánico, por ejemplo uno que sea adecuado para administración oral o para inyección
50 in situ. Algunos vehículos adecuados incluyen agua, gelatina, goma arábiga, lactosa, almidón, estearato de
Figura 6B: La fotografía a la izquierda ilustra formación de imágenes de epifluorescencia obtenida en células HUVEC incubadas con YL3. El diagrama a la derecha presenta espectros de emisión de fluorescencia a partir de zonas brillantes (●) o a partir de citoplasma (▲). El eje horizontal representa la longitud de onda (nm) de la fluorescencia. El eje de ordenadas representa la intensidad de la fluorescencia.
5 La Figura 7 representa el efecto de YL3 (10 µM) en la relajación dependiente del epitelio de aorta de ratones contraído previamente mediante KCl. En presencia de catalasa, indometacina (un inhibidor de la cicloxigenasa) y una concentración elevada de potasio extracelular, la relajación de los arcos aórticos de ratones, inducida por estimulación mediante receptores muscarínicos solamente descansa en el NO producido por células endoteliales. En esta situación, el YL3 inhibe la relajación inducida por acetilcolina, tal como se espera para un inhibidor de eNOS.
Figura 8: muestra el efecto de YL3 (0, 3 o 100 µM) inhibiendo la formación del tubo endotelial estimulada por tratamiento con VEGF, de acuerdo con el ejemplo 8. El alcance de la red endotelial en las diferentes condiciones
15 sometidas a ensayos siempre se comparó dentro de un mismo conjunto de experimentos y se usaron valores relativos para comparaciones interensayos. En estos experimentos se usaron 3-5 placas sembradas en Matrigel mediante pasaje con Células Endoteliales de Vena Umbilical Humana (HUVEC). Las fotografías de la columna a la izquierda muestran células antes del tratamiento con concentración de YL3 diferente. Las fotografías de la columna a la derecha muestran células después de 48 horas de tratamiento con YL3 3 µM o 100 µM, y muestra de control solo con tratamiento con VEGF.
Figura 9: muestra la formación de imágenes de HUVEC vivas usando las propiedades de fluorescencia de dos fotones de NS1 y la colocalización del complejo de Golgi. Las HUVEC se trataron con NS1 5 µM y se observaron adicionalmente con excitación de dos fotones (840 nm; ajuste de emisión: 520-680 nm) (a). El panel b muestra la
25 tinción del núcleo con Hoechst 33342 de HUVEC tratadas con NS1 (excitación de dos fotones, 740 nm; emisión a 410-510 nm). Panel c, imagen combinada de a y b. Panel d, imagen de dos fotones de control de HUVEC no tratadas en el mismo entorno (inserción: tinción del núcleo de células de control). (e-h) Formación de imágenes de colocalización de NS1 y del complejo de Golgi: las HUVEC vivas se trataron con NS1 (5 µM) y rastreador de Golgi (BODIPY TR Ceramida; 5 µM) durante 60 min. El panel e muestra el canal de formación de imágenes de NS1 (excitación de un fotón, 488 nm; ajuste de emisión: 520-680 nm). El panel f muestra el canal de formación de imágenes del rastreador de Golgi (excitación de un fotón, 543 nm; ajuste de emisión: 600-650 nm). Panel g, imagen combinada de e y f (con tinción del núcleo). Las zonas de color amarillo indican colocalización de NS1 y del aparato de Golgi. El panel h, corresponde a la imagen de transmisión de DIC.
35 Figura 10: muestra la formación de imágenes de colocalización de NS1 y Retículo Endoplasmático (ER), Mitocondria o Endosoma Temprano (EEA1). (a) Imagen combinada de NS1 y ER. (b) Imagen combinada de NS1 y mitocondria. Las HUVEC vivas se trataron con NS1 (5 µM) y rastreador de ER (colorante Rojo ER-TrackerTM; 100 nM) o MitoTracker (MitoTracker® Rojo Profundo FM; 50 nM) durante 30 min y adicionalmente se observó con microscopía confocal. (c) Imagen combinada de NS1 y EEA1. Las HUVEC vivas se trataron con NS1 (10 µM) durante 60 min antes de fijación e inmunotinción de EEA1, y adicionalmente se observaron con microscopía confocal. Los anticuerpos primario y secundario para inmunotinción fueron IgG de conejo policlonal para EEA1-Marcador de Endosoma Temprano y de burro anti-conejo Alexa Fluor® 594 (H+L), respectivamente. Ajustes de excitación y de emisión: NS1 (exc. 488 nm; em. 520-680 nm), ER (exc. 543 nm; em. 590-670 nm), mitocondria (exc. 633 nm; em. 650-700 nm), EEA1 (exc. 543 nm; em. 590-700 nm).
45 Figura 11: presenta experimentos de colocalización de NS1 con eNOS. (a-f) Formación de imágenes de colocalización de NS1 y eNOS. Las HUVEC vivas se trataron con NS1 (10 µM) durante 60 min antes de fijación e inmunotinción de eNOS. Los anticuerpos primario y secundario para inmunotinción fueron IgG de ratón antieNOS/NOS purificada de Tipo III y cabra anti-ratón AlexaFluor® 594 (H+L), respectivamente. Los paneles a y d muestran el canal de formación de imágenes de NS1 (excitación de un fotón, 488 nm, y excitación de dos fotones, 840 nm, respectivamente; ajuste de emisión: 520-680 nm). El panel b y e muestran el canal de formación de imágenes de eNOS (excitación de un fotón, 543 nm; ajuste de emisión: 590-700 nm), que corresponde a a y d, respectivamente. Panel c: imagen combinada de a y b. Panel f: imagen combinada de d y
e. Las zonas de color amarillo a naranja indican colocalización de NS1 y eNOS. En los paneles c y f también se 55 muestra la tinción del núcleo con Hoechst 3342.
Ejemplo 1: Formación de modelos moleculares y Síntesis de mezcla YL3
[0070] La simulación de MD del complejo nNOS-YL3 se realizó usando el programa NAMD (Phillips et al., J Comput Chem 2005, 26, 1781-802) con el campo de fuerza CHARMM27. El sistema molecular formado con enzima dimérica de rata nNOS, FAD, FMN (PDB ID 1TLL) e YL3 se centró en una celda cúbica de moléculas de modelo de agua de TIP3P equilibradas previamente (Jorgensen et al., J. Chem. Physiol. 1983, 79, 926-35). Las interacciones de
65 prostática se calcularon sin truncamiento, usando el algoritmo de suma de Ewald de malla de partícula. El sistema se hizo electrostático ambiente neutro mediante la adición aleatoria de 20 cationes de sodio. Las interacciones de van
[0076] Compuesto 5: se añadió NaBH4 (806 mg, 21,5 mmol) a una suspensión de 4 (1,88 g, 4,3 mmol) en isopropanol / agua (6 / 1, 120 ml). Después de 1 h a 60 ºC, se añadió ácido acético (8 ml) a TA y la reacción se mantuvo a 80 ºC durante 48 h. El isopropanol se evaporó y el precipitado se filtró. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (MeOH:CH2Cl2: NH4OH = 3:97:0,25) para proporcionar 5 en forma de un sólido
5 de color rojo (1,02 g, 77%). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6): δ 8,17 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,49 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,41 (d, J = 16,4 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 16,4 Hz, 1 H), 6,76 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 3,42 (m, 4H), 2,83 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 1,09 (t, J = 7,0 Hz, 3H). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6): δ 148,1 (C), 145,2 (C), 145,1 (C), 133,9 (CH), 128,7 (CH), 126,3 (CH), 124,0 (CH), 123,6 (C), 120,9 (CH), 111,6 (CH), 49,8 (CH2), 44,4 (CH2), 37,8 (CH2), 12,0 (CH3). HRMS (ESI) calculado para C18H22N3O2 (MH+) m/z 312,1712, encontrado 312,1701.
[0077] Compuesto 7: se añadieron Et3N (0,8 ml) y HBTU (2,18 g, 5,7 mmol) a una solución de 5 (1,19 g, 3,8 mmol) y ácido urónico 6 (1,23 g, 3,8 mmol) en DMF anhidra (130 ml). Después de 48 h a TA en una atmósfera de Ar, se evaporó DMF y el tratamiento habitual con EtOAc / H2O proporcionó el producto en bruto que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc-CH2Cl2 a 60:40) para proporcionar 7 en forma de un sólido de color rojo
15 (1,64 g, 70%). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6): δ 8,29 (s, 1 H), 8,17 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 8,11 (s,1H), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,72 (s, 1H, D2O intercambiable), 7,45 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,39 (d, J = 16,4 Hz, 1H), 7,33 (s, 2H, D2O intercambiable), 7,08 (d, J = 16,4 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,37 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 5,43 (dd, 1H, J = 1,9, 6,1 Hz, 1H), 5,40 (dd, 1H, J = 1,6, 6,1 Hz, 1H), 4,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 3,31-3,24 (m, 6H), 1,54 (s, 3H), 1,34 (s, 3H), 1,03 (t, J = 7,0 Hz, 3H). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6): δ 168,9 (C), 156,0 (C), 152,4 (CH), 148,8 (C), 148,1 (C), 145,3 (C), 145,1 (C), 140,5 (CH), 133,9 (CH), 128,7 (CH), 126,2 (CH), 124,0 (CH), 123,4 (C), 120,7 (CH), 118,9 (C), 112,9 (C), 111,3 (CH), 89,5 (CH), 86,0 (CH), 83,2 (CH), 83,1 (CH), 47,7 (CH2), 44,2 (CH2), 35,7 (CH2), 26,7 (CH3), 25,0 (CH3), 12,0 (CH3). MS: m/z = 615 (MH+). Anal. calc. para C31H34N8O6 (614,26), C 60,58, H 5,58, N 18,23. Encontrado C 59,98, H 5,53, N 18,11.
25 [0078] Compuesto 8: se añadió HCl (1 M, 20 ml) a una solución de 7 (0,75 g, 1,2 mmol) en THF (30 ml). Después de 24 h a 60 ºC, se añadió K2CO3 sat. Hasta un pH ~ 10 y la THF se retiró por evaporación. El precipitado se filtró, se lavó (pH ~ 7) y se secó para proporcionar 8 en forma de un sólido de color rojo (0,67 g, 96%). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6): δ 9,16 (t a, 1H, D2O intercambiable), 8,37 (s, 1H), 8,18 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 8,08 (s, 1H), 7,76 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,48 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,41 (d, J = 16,3 Hz, 2H), 7,09 (d, J = 16,3 Hz, 2H), 6,78 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,97 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 5,78 (d, J = 4,3 Hz, 1H, D2O intercambiable), 5,57 (d, J = 6,2 Hz, 1H, D2O intercambiable), 4,62 (m, 1H), 4,33 (s a, 1H), 4,17 (dd, J = 4,3, 3,5 Hz, 1H), 3,42 (m, 6H), 1,08 (t, J = 6,9 Hz, 3H). RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6): 170,0 (C), 161,8 (C), 156,2 (C), 152,6 (CH), 149,0 (C), 148,2 (C), 145,4 (C), 145,3 (C), 140,8 (CH), 134,1 (CH), 128,9 (CH), 126,4 (CH), 124,2 (C), 123,6 (CH), 120,9 (CH), 111,6 (CH), 87,9 (CH), 84,7 (CH), 73,0 (CH), 71,9 (CH), 48,7 (CH2), 44,6 (CH2), 36,5 (CH2), 12,1 (CH3), HRMS (ESI) calculado para C28H31N8O6 (MH+) m/z 575,2367,
35 encontrado 575,2386.
[0079] La mezcla de YL3 (Compuestos 9 + 10): nBu2SnO (52 mg, 0,21 mmol) se añadió a una suspensión de 8 (93 mg, 0,16 mmol) en tolueno anhidro (10 ml), Después de 2 h a 130 ºC en una atmósfera de Ar, el tolueno se evaporó. CH2Cl2 anhidro (10 ml) y ClP(O)(OEt)2 (47 µl, 0,32 mmol) se añadieron a la reacción. Después de 48 h a TA, CH2Cl2 se retiró por evaporación. Se añadieron THF (3 ml) y HCl (37%, 1,5 ml) y la mezcla se agitó a TA durante 2,5 h (control por TLC: CH3OH-CH2Cl2-H2O-Et3N a 30:65:4:1). Después de la adición de una solución ac. de NH3 (2%, hasta pH ~ 7), el sólido de color rojo profundo se filtró, se lavó con H2O. El producto en bruto se disolvió en DMF y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice en C18 (CH3CN-H2O-NH4OH al 2% a 25:75:1) para proporcionar una mezcla de los dos compuestos isoméricos 9 y 10 en una proporción de 40:60 después de liofilización (76 mg, 70%).
45 [0080] 2-PO4H2 (compuesto 9): RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): δ 9,16 (t a, 1H), 8,40 (s, 1H), 8,17 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 8,02 (s, 1H), 7,76 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 7,48 (d, 2H, J = 9,1 Hz), 7,40 (m, 3H), 7,10 (d, 2H, J = 16,4 Hz), 6,78 (d, 2H, J = 9,1 Hz), 6,07 (d, 1H, J = 7,1 Hz), 4,83 (m, 1H), 4,49 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 4,45 (s a, 1H), 3,44-3,35 (m, 6H), 1,09 (t, 3H, J = 7,0 Hz).
[0081] 3-PO4H2 (compuesto 10): RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6):δ 9,26 (t a, 1H), 8,40 (s, 1H), 8,17 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 8,02 (s, 1H), 7,76 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 7,48 (d, 2H, J = 9,1 Hz), 7,40 (m, 3H), 7,10 (d, 2H, J = 16,4 Hz), 6,78 (d, 2H, J = 9,1 Hz), 5,97 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 4,62 (m, 1H), 4,71 (m, 1H), 4,36 (s a, 1H), 3,44-3,35 (m, 6H), 1,09 (t, 3H, J = 7,0 Hz).
55 [0082] RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6): δ 169,9 (C), 169,5 (C), 156,2 (C), 152,4 (CH), 148,9 (C), 148,0 (C), 145,3 (C), 145,0 (C), 140,5 (CH), 134,0 (CH), 128,8 (CH), 126,2 (CH), 124,0 (CH), 123,4 (C), 120,8 (CH), 111,4 (CH), 88,3 (CH), 83,9 + 83,6 (CH), 75,7 (CH), 72,3 (CH), 48,7 + 48,6 (CH2), 44,8 + 44,5 (CH2), 36,4 (CH2), 12,0 (CH3), HRMS (ESI-) calculado para C28H30N8O9P [M-H]-653,1873, encontrado 653,1877.
Ejemplo 2: Ensayos enzimáticos
65 Protocolo del experimento
espectroscopía de EPR usando experimentos de inmovilización de espín en presencia de la nitrona cíclica BocMPO.
Protocolo del experimento
[0090] El de N-óxido 5-terc-butiloxicarbonil 5-metil-1-pirrolina de inmovilización de espín (BocMPO) se sintetizó
5 usando un procedimiento descrito (Zhao et al., Free Radic Biol Med 2001, 31, 599-606). Una mezcla de incubación habitual contenía NADPH 1 mM, CaCl2 1,0 mM, CaM (10 µg/ml), y BocMPO 50 mM en tampón Hepes 50 mM a pH 7,4. Se mezclaron 5-10 µl de nNOS (100-150 nM) con la mezcla anterior que se transfirió rápidamente en una celda demuestra Aqua-X equipada con una cavidad shq001 (Bruker, Wissembourg, Francia). La acumulación de datos comenzó inmediatamente. Todas las medidas se realizaron at 21 ºC en un espectrómetro EPR Elexsys 500 de
10 Bruker funcionando a frecuencia de la banda X (9,82 GHz). Se usaron los siguientes ajustes del instrumento: frecuencia de modulación del campo, 100 kHz; amplitud de modulación del campo, 0,2 mT; constante de tiempo, 0,081 s; potencia de microondas, 5,1 mW; tiempo de barrido, 41,9 s; número de barridos, 27. Los espectros de BocMPO-OOH y BocMPO-OH se identificaron por comparación con incubaciones realizadas en presencia de xantina/xantina oxidasa (para BMPO-OOH) como se ha descrito anteriormente (Zhao et al., Free Radic Biol Med
15 2001, 31, 599-606). Como se esperaba, el aducto de espín BocMPO-OOH se descompuso espontáneamente en el aducto de espín BocMPO-OH con una vida media de aproximadamente 15 min, y su formación se eliminó completamente en presencia de SOD. Las cantidades relativas de aductos BocMPO-OOH y BocMPO-OH observados en las mezclas de incubación se calcularon mediante simulaciones con el software X-sophe (Bruker). Los segundos picos de los aductos BocMPO-OOH y BocMPO-OH se superponen (máximo, 348,8 mT; mínimo,
20 349,2 mT), y la amplitud de este pico se usó para cuantificar las cantidades de superóxido generado en las incubaciones de los inventores. La expresión "aducto de espín BocMPO-OOH" se usará en lugar de "aductos de espín BocMPO-OOH y BocMPO-OH" por razones de brevedad.
Resultados del experimento
25 [0091] En ausencia de L-arginina y H4B, los elementos de 4 líneas característicos que corresponden al aducto de espín BocMPO-OOH (un nitróxido) se observaban claramente (Figura 3B) y su intensidad aumentó de una manera dependiente del tiempo (Figura 3A). La tasa de formación del aducto de espín BocMPO-OOH se redujo fuertemente mediante la adición de L-arginina 100 µM y H4B 10 µM (los datos nos muestran). Como se observa en la Figura 3A,
30 la adición de YL3 15 µM a la mezcla de reacción redujo de forma significativa la tasa de formación de la señal de EPR del aducto de espín BocMPO-OOH y la adición de YL3 100 µM eliminó totalmente su señal de EPR sin formación de otras especies paramagnéticas.
Ejemplo 3: Efectos de YL3 en la producción de anión superóxido a partir de arcos aórticos aislados medidos 35 mediante inmovilización de espín de EPR
Protocolo del experimento
[0092] La formación de O2-a partir de arcos aórticos aislados se sometió ensayo mediante inmovilización de espín
40 de EPR usando cloruro de 1-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-4-il-trimetilamonio (CAT1-H, Alexis Biochemical Inc.). Las aortas torácicas se diseccionaron a partir de ratones C57BL/6 anestesiados (macho, 15 semanas de edad), limpios de tejidos conectores y grasa, y se corta en anillos pequeños (de aproximadamente 2 mm de longitud). Los arcos aórticos se incubaron previamente en tampón KREBS-DTPA-Hepes (0,1 mmol/litro de DTPA, 10 mmol/litro de HEPES, pH 7,5), y, después de la adición de CAT1-H (5 mM) e YL-3 (10 µM) o vehículo, se insertaron en capilares
45 (micropipetas, 50 µl, Blaubrand ®) que se colocaron directamente en el resonador del espectrómetro EPR de banda X de CW (Magnettech MiniScope MS200), equipado con un controlador de temperatura (37 ºC). La formación del radical (CAT1) se controló durante 20 minutos y la tasa de formación de anión superóxido se cuantificó después de sustracción de la señal basal y normalización a peso de tejido seco.
50 Resultados del experimento
[0093] Los experimentos ex vivo realizados en arco aórtico de ratones muestran que la mezcla de YL3 (10 µM) inhibe la síntesis de especies reactivas del oxígeno (ROS). Las ROS sintetizadas se pueden detectar después de la reacción con hidroxilamina CAT1-H que se oxida a nitróxido de CAT1 medido por EPR. El resultado presentado en la
55 Figura 4 muestra que YL3 inhibe la producción de superóxido dependiente de NADPH a partir de la actividad de la NADPH oxidasa de NO-sintasas y de otras enzimas que dependen de la presencia de NADPH en vasos.
Ejemplo 4: Métodos espectroscópicos: caracterización de Yl3 libre o unido a NOS
60 4.1 Protocolos del experimento:
Espectro de absorción
[0094] El espectro de absorción UV-visible se realizó con un espectrofotómetro XL de Uvikon. 65
acetilcolina, tal como se espera para un inhibidor de (Figura 7). YL3 no puede modificar la viabilidad de células endoteliales (HUVEC). Se puede detectar una inhibición débil del metabolismo mitocondrial de células de músculo liso.
5 Ejemplo 7 : Ensayos de Angiogénesis
[0109] 7.1: protocolo: Para evaluar in vitro el proceso angiogénico, se usó un ensayo de formación de red endotelial (por ejemplo, siembra de célula endotelial (EC) en Matrigel) como se ha indicado anteriormente (14,20). La reorganización de EC en estructuras de tipo capilar se observó usando un microscopio de contraste de fase invertida y la longitud de la red endoteliales se cuantificó mediante análisis de imágenes capturadas aleatoriamente mediante un sistema de cámara de vidrio. Debido a diferencias de combinación inevitables en la composición de Matrigel privado de factor de crecimiento (por ejemplo, en la capacidad proangiogénica basal del Matrigel), la extensión de la red endotelial en las diferentes condiciones sometidas a ensayos siempre se comparó dentro de un mismo conjunto de experimentos y los valores relativos se usaron para comparaciones interensayos.
15 [0110] En estos experimentos se usaron 3-5 pasajes de Células Endoteliales de Vena Umbilical Humana (HUVEC).
[0111] Los resultados se expresan como porcentaje de red endotelial ± ETM con respecto a la condición de control y n refleja el número de experimentos.
[0112] Se calcularon diferencias significativas entre grupos mediante ANOVA seguido de un ensayo de Bonferroni.
[0113] P < 0,05 se consideró significativo.
25 7.2 Resultados: Las diferencias significativas entre grupos mostraron el efecto antiangiogénico de YL3 en un ensayo de angiogénesis (Figura 8).
Ejemplo 8: Estudio de la formación de imágenes de NS1 y colocalización con marcadores de orgánulos subcelulares y un anticuerpo monoclonal con respecto a eNOS
[0114] Formación de imágenes de NS1 en células endoteliales: La selectividad de la fluorescencia de NS1 para NOS constitutivas llevó a los inventores a someter a ensayo si NS1 resaltaría eNOS de forma específica en células vivas. Una rápida absorción de NS1 (máximo de 10 min en incubación) con células endoteliales de vena umbilical humana vivas (HUVEC) se controló fácilmente después de excitación en el infrarrojo cercano, mostrando la 35 idoneidad de NS1 para estudios de fluorescencia de 2-PE de células vivas (Fig. 9). El NS1 unido presentaba una fluorescencia intensa en el citoplasma, especialmente en la región perinuclear y -en menor medida -en la membrana celular (Fig. 9a, 11a,d). Los puntos en las membranas celulares eran prominentes a confluencia celular elevada, en acuerdo con el papel de eNOS en el mantenimiento de uniones estrechas de célula a célula. La localización subcelular de NS1 dentro de los orgánulos se investigó adicionalmente a continuación mediante experimentos de colocalización. NS1 se colocalizó principalmente con el aparato de Golgi identificado mediante rastreador específico de Golgi (Fig. 9e-h). NS1 no se colocalizó con el retículo endoplasmático, núcleo celular o mitocondria mientras que se observó solamente una co localización parcial con él en dos o más temprano (EEA1) (Fig. 10). Las dos ubicaciones principales de NS1 (Golgi y membrana plasmática) son compatibles con la localización subcelular de eNOS. Usando inmunotinción específica de eNOS combinada con formación de imágenes
45 de uno (Fig. 11a-c) o dos fotones (Fig. 11d-f) de NS1, los inventores observaron una colocalización excelente de NS1 y eNOS, en la región perinuclear y al nivel de la membrana plasmática, mostrando que NS1 realmente se dirige a eNOS en células HUVEC. Dado que el proceso de 2-PE evitaba la autofluorescencia celular, la relación de señal con respecto a ruido era notablemente superior usando formación de imágenes de dos fotones en comparación con la de un fotón, según se considera mediante la zona de colocalización más restringida obtenida usando λex = 840 nm en lugar de 488 nm.
Ejemplo 9: Efecto de de NSl en la formación de superóxido con células RAW 264.7 estimuladas con PMA
[0115] La generación de superóxido mediante células RAW 264.7 estimuladas con éster de forbol se controló
55 mediante espectroscopía de EPR usando experimentos de inmovilización de espín en presencia de la nitrona cíclica DEPMPO.
[0116] 9.1: Protocolo: Las células se incubaron durante 20 minutos a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5% en 5 ml de medio DMEM recién preparado que contiene FCS al 5% y 12-miristato-13-acetato de forbol 10 µM (PMA, de Sigma). Estas se lavaron dos veces con 5 ml de PBS y se añadió 1 ml de una mezcla de tripsina / EDTA para separar las células. Después de un periodo de incubación de 7 min a 37 ºC, las células se recogieron en 4 ml de DMEM que contiene FCS al 5%, se centrifugaron durante 5 min a 900 g y 4 ºC. El sedimento celular se volvió a suspender en 5 ml de PBS, se hizo recuento, y se centrifugó de nuevo durante 5 min a 900 g y 4 ºC. El sedimento se volvió a suspender en 97 ml de PBS que contiene DTPA 100 µM, DEPMPO 25 mM, y concentraciones variables de 65 NS1. La suspensión se transfirió en un tubo de teflón permeable al gas y se insertó en una cavidad shq001. La acumulación de datos comenzó inmediatamente. Las medidas se realizaron a 21 ºC en un espectrómetro EPR
Claims (1)
-
imagen1 imagen2 imagen3 imagen4 imagen5 imagen6 imagen7 en forma cis o mezcla cis-trans con una muestra biológica que contiene dicha enzima,(b) radiar con luz la muestra en condiciones apropiadas para transformar la forma cis en compuesto activo de dicha forma trans.33
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