ES2556710T3

ES2556710T3 - Proteínas capsidiales VP1 modificadas del parvovirus B19

Info

Publication number: ES2556710T3
Application number: ES09174552.1T
Authority: ES
Inventors: Susanne Modrow; Torsten Lowin; Markus MÖBS; Michael Bröker
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2004-09-24
Filing date: 2005-09-23
Publication date: 2016-01-19
Anticipated expiration: 2025-09-23
Also published as: US9573979B2; WO2006032697A3; DE602005020815D1; CY1110185T1; PL1791858T3; US20170260239A1; ATE465173T1; ES2344739T3; PT1791858E; WO2006032697A2; EP2149583A1; US20070286870A1; EP1791858B1; EP2149583B1; EP1791858A2

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un adyuvante y una proteína capsidial VP1 modificada de parvovirus B19 que tiene una sustitución de aminoácido en uno o más de entre histidina 153, tirosina 157, lisina 162 y/o tirosina 168, y que tiene una actividad enzimática fosfolipasa A2 reducida de al menos 30 % en comparación con la proteína capsidial VP1 de tipo silvestre de parvovirus B19 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1.

Description

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como una activación del producto final (o regulación negativa) del sistema inmune adaptativo, preferentemente mediado por las células presentadoras de antígeno CPA (incluyendo las células dendríticas).

Adicionalmente, los compuestos neuroactivos, tales como la hormona de crecimiento (humana) (como se describe por ejemplo en el documento WO 0124822), pueden usarse como inmunoestimulantes (Inmunizadores).

Los compuestos policatiónicos derivados de fuentes naturales incluyen VIH-REV o VIH-TAT (péptidos catiónicos derivados, péptidos antennapedia, quitosan u otros derivados de quitina) u otros péptidos derivados de estos péptidos o proteínas por producción bioquímica o recombinante. Otros compuestos policatiónicos preferidos son la catelicidina o sustancias relacionadas o derivadas de la catelicidina, especialmente catelicidinas de ratón, bovinas o especialmente humanas y/o catelicidinas. Las sustancias de catelicidinas relacionadas o derivadas contienen toda o partes de la secuencia de catelicidina con al menos 15-20 restos aminoacídicos. Las derivaciones pueden incluir la sustitución o modificación de los aminoácidos naturales por aminoácidos que no se encuentran entre los 20 aminoácidos convencionales. Por otra parte, pueden introducirse otros restos catiónicos en dichas moléculas de catelicidina. Estas moléculas de catelicidina son las preferidas para combinar con la composición antígeno/vacuna de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, de manera sorprende estas moléculas de catelicidina han resultado ser también eficaces como un adyuvante para un antígeno sin la adición de adyuvantes adicionales. Por lo tanto es posible usar dichas moléculas de catelicidina como adyuvantes eficaces en las formulaciones de vacunas con o sin sustancias inmunoactivantes adicionales.

La vacuna de acuerdo con la presente invención contiene preferentemente como Péptido A KLKL5KLK y/o como I/U-ODN oligo d(IC)13. (La combinación del Péptido A y del Oligo-d(IC)13 también se denomina IC31). Estas dos sustancias son específicamente ventajosas de acuerdo con la presente invención.

La vacuna de acuerdo con la presente invención puede contener un oligodesoxinucleótido que contiene un motivo CpG como ácido nucleico inmunomodulador. Los ácidos nucleicos inmunomoduladores para usar de acuerdo con la presente invención pueden ser de origen sintético, procariota y eucariota. En el caso de origen eucariota, el ADN debe proceder de, basándose en el árbol filogenético, especies menos desarrolladas (por ejemplo insectos, pero también otras). En una realización preferida de la invención el oligodesoxinucleótido inmunogénico (ODN) es una molécula de ADN producida sintéticamente o mezclas de dichas moléculas. También se incluyen los derivados o modificaciones de los ODN tales como análogos tiofosfato sustituidos (restos tiofosfato sustituidos por fosfato) como por ejemplo se describe en las patentes de Estados Unidos US 5.723.335 y US 5.663.153 y otros derivados y modificaciones, que estabilizan preferentemente la composición (o composiciones) inmunoestimuladora pero no cambian sus propiedades inmunológicas. Un motivo de secuencia preferido es un motivo de ADN de seis bases que contiene un dinocleótido CpG (no metilado) flanqueado por dos purinas en 5’ y dos pirimidinas en 3’ (5’-Pur-Pur-C-GPyr-Pyr-3’). Los motivos CpG contenidos en los ODN de acuerdo con la presente invención son más comunes en el ADN microbiano que en el de vertebrados superiores y presentan diferencias en el patrón de metilación. Sorprendentemente, las secuencias que estimulan las CPA (células presentadoras de antígeno) de ratón no son muy eficaces para las células humanas. Los ODN palindrómicos o no palindrómicos preferidos para usar de acuerdo con la presente invención se describen por ejemplo en las solicitudes de Patente Australianas A 1973/2000, A 805/2001, EP 0 468 520 A2, WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 98/52962, WO 99/51259 y WO 99/56755 todas ellas incorporadas en este documento por referencia. Los ADN/ODN pueden producirse químicamente o de manera recombinante o pueden proceder de fuentes naturales. Las fuentes naturales preferidas son los insectos.

La vacuna de acuerdo con la presente invención puede contener preferentemente un péptido policatiónico y un oligodesoxinucleótido que contiene un motivo CpG en combinación. La combinación de CpG-ODN y péptido policatiónico tiene efectos de mejora en las composiciones de vacuna, que son comparables a los efectos de la combinación del Péptido A y los I-/U-ODN y no solo pueden combinarse con el Péptido A y los I-/U-ODN sino que incluso pueden usarse en lugar de estos. Por supuesto, pueden usarse todas las mezclas de ácidos nucleicos inmunoestimuladores diferentes (I-/U-ODN, CpG-ODN,...) y variantes del Péptido A (así como otros Inmunizadores) de acuerdo con la presente invención.

Previamente se ha demostrado (documento WO 02/13857) que los péptidos antimicrobianos derivados de la catelicidina, de origen natural o derivados de los mismos tienen una respuesta inmunitaria que estimula la actividad y por lo tanto constituyen adyuvantes de inducción de tipo 1 muy eficaces (Inmunizadores). Las principales fuentes de péptidos antimicrobianos son gránulos de neutrófilos y células epiteliales que revisten los tractos respiratorio, gastrointestinal y genitourinario. En general estos se encuentran en los sitios anatómicos más expuestos a la invasión microbiana, se secretan en los fluidos corporales internos o se almacenan en los gránulos citoplásmicos de los fagocitos profesionales (neutrófilos).

En el documento WO 02/32451 se describe un adyuvante de inducción de tipo 1 (Inmunizador) que puede potenciar fuertemente la respuesta inmunitaria contra un antígeno específico co-administrado y por lo tanto constituye un adyuvante muy eficaz, el Péptido A que comprende una secuencia R1-XZXZNXZX-R2. Un péptido específicamente preferido es KLKLLLLLKLK. Además de péptidos antimicrobianos de origen natural, se han producido e investigado péptidos sintéticos antimicrobianos. El péptido sintético antimicrobiano KLKLLLLLKLK-NH2 demostró tener actividad quimioterapéutica significativa en ratones infectados con Staphylococcus aureus; los neutrófilos humanos se

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Tabla 1: Enfermedades autoinmunes que se describen en asociación con la infección por el parvovirus B19

Órganos implicados Enfermedades

Articulaciones Artralgias Artritis Monoartritis Oligoartritis Poliartritis Artritis reumatoide Artritis idiopática juvenil

Tejido conectivo/vasos Lupus eritematoso sistémico (LES) Vasculitis Vasculitis leucocitoclástica Púrpura de Henlein-Schoenoch Síndrome papulopurpúrico en guantes y calcetines (SPPGC) ¿Enfermedad de Kawasaki? Arteritis de células Gigantes (ACG) Poliarteritis nodosa Granulomatosis de Wegener Dermatomiositis

Células sanguíneas Neutropenia autoinmune Trombocitopenia autoinmune Púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) Anemia hemolítica autoinmune Síndrome hemofagocítico asociado a virus (SHAV)

Tabla 2: Actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 en la región única de VP1 del parvovirus B19 y variantes construidas por mutagénesis dirigida

Posición modificada por mutagénesis dirigida del tipo Actividad enzimática (%) silvestre, genotipo 1 100

mutantes del centro activo

histidina 153 → alanina 0 tirosina 157 → fenilalanina 10 lisina 162 → leucina 61 tirosina 168 → fenilalanina 54 ácido aspártico 195 → alanina 204

mutantes del centro no activo

leucina 76 → glutamina, fenilalanina 81 → alanina 80 isoleucina 66 → leucina, leucina 70 → glutamina 144 leucina 59 → glutamina, leucina 62 → glutamina 143

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variaciones en regiones no conservadas

parvovirus B19, genotipo 2 /cepa Berlin 70, región única de VP1

ala18 → asp, gln21→lys, asn68 →ser, asn72 → asp, ser73 → thr,

ser96 → pro, ala101 → thr, val123 →ile, val192 → ala

10 parvovirus B19, genotipo 3 /cepa V9 59 , región única de VP1

lys4 → thr, ser5 → thr, gly6 → asn, aspl2 → ser, lys17 → gln,

ala18 → asp, gln21 → lys, glu25 → gln, val30 → ala, asn68 → ser,

ser98 → asn, his100 → ser, val123 → ile, ser144 → asn, val192 → ala

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extraídas los días que se indican después de la inoculación se ensayaron en ELISA usando como antígeno la región única de VP1. En cada caso se determinaron los valores promedio obtenidos del ensayo de muestras individuales de 5 ratones.

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Realizaciones preferidas de la presente invención:

1.: Una proteína capsidial VP1 modificada del parvovirus B19 que tiene una actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 reducida en comparación con la proteína capsidial VP1 de tipo silvestre del parvovirus B19 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Sec ID Nº: 1.

2.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque los restos aminoacídicos en la región única de VP-1 están modificados.

3.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque los restos aminoacídicos modificados residen en el centro activo de la fosfolipasa A2 en la proteína capsidial VP-1.

4.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque uno o más de los restos aminoacídicos en el centro activo de la fosfolipasa A2 se modifican.

5.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque uno o más de los restos aminoacídicos se modifican en la posición 153: histidina; en la posición 157: tirosina; en la posición

162: lisina; y/o en la posición 168: tirosina.

6.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque la histidina 153 se modifica a alanina.

7.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque la tirosina 157 se modifica a fenilalanina.

8.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque la lisina 162 se modifica a leucina.

9.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque la tirosina 168 se modifica a fenilalanina.

10.: La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la sustitución de los restos aminoacídicos se realiza por mutagénesis dirigida.

11.: También se desvela una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

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Claims

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