ES2556961T3 - Células precursoras CD271 derivadas de la médula ósea para reparación cardiaca - Google Patents

Abstract

Una cantidad terapéuticamente eficaz de células precursoras de células madre mesenquimales (MSC) CD271+ aisladas de médula ósea de un sujeto y cultivadas en condiciones no adherentes para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades o trastornos cardiovasculares, en la que las células precursoras de MSC CD271+ son capaces de injertarse en un corazón in vivo en zonas de infarto y periféricas

Description

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DESCRIPCION

Celulas precursoras CD271 derivadas de la medula osea para reparacion cardiaca Campo de la invencion

Las realizaciones de la invencion se refieren a procedimientos para tratar enfermedades cardiovasculares usando celulas precursoras mesenquimales derivadas de medula osea.

Antecedentes

La insuficiencia cardiaca es responsable de 33.200 millones de dolares en costes directos e indirectos al sistema de salud de Estados Unidos (1, 2) y la mayor parte de pacientes con este diagnostico tienen miocardio cicatrizado a partir de un IM previo. La funcion ventricular izquierda es el determinante mas importante de supervivencia y calidad de vida en pacientes que han sufrido un infarto de miocardio (IM) (1, 3). El miocardio tiene un potencial regenerativo muy limitado despues de infarto y una busqueda principal en medicina actualmente es la de regeneracion de tejido basada en celulas. Esta busqueda mantiene la promesa de transformar el tratamiento de numerosas enfermedades cronicas. En el area de cardiomiopatfa isquemica cronica (un trastorno que afecta a mas de 4 millones de estadounidenses), un producto terapeutico basado en celulas exitoso tendra un efecto enorme en la morbimortalidad del paciente, y reducira las cargas sociales de este trastorno. Para avanzar en este campo, se han realizado intentos significativos para lograr un producto terapeutico celular exitoso a lo largo de los ultimos cinco anos y se han analizado estrategias que usan celulas derivadas de medula osea en ensayos clmicos tempranos (4, 5). Estos ensayos se han realizado para avanzar en el entendimiento de procedimientos de suministro de celulas y para establecer perfiles de seguridad; no obstante, una fuente celular ideal sigue sin estar totalmente establecida.

Sumario

El presente sumario se proporciona para presentar un resumen de la invencion que indique brevemente la naturaleza y la sustancia de la invencion. Se presenta con el entendimiento de que no se usara para interpretar o limitar el alcance o el significado de las reivindicaciones.

Las realizaciones de la invencion se refieren a composiciones que comprenden precursores de celulas mesenquimales derivadas de medula osea adulta. Estas celulas se administran in vivo, como, por ejemplo, al corazon y regeneran el miocardio.

En una realizacion preferente, se usan precursores de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + de medula osea de un sujeto en un procedimiento de prevencion o de tratamiento de enfermedades o trastornos cardiovasculares.

En una realizacion, las MSC CD271 + se afslan de celulas de medula osea que tienen un receptor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR; CD271). Las celulas madre CD271+ se afslan de donantes (o fuentes) que comprenden: autologos, singenicos, alogenicos o xenogenicos. Las celulas precursoras de MSC se diferencian en al menos un linaje que comprende: linajes miocardicos, vasculares o endoteliales.

En otra realizacion, las celulas madre mesenquimales precursoras aisladas se cultivan ex vivo y se expanden antes de su administracion a un paciente. En una realizacion, las celulas madre no adherentes se expanden y se administran a un paciente. En otra realizacion, las celulas madre mesenquimales precursoras se administran opcionalmente a un paciente en concentraciones variables a lo largo de un periodo de tiempo. En una realizacion las celulas madre mesenquimales precursoras se acondicionan opcionalmente con medios acondicionados con celulas estromales derivadas del corazon.

En otra realizacion, se administran opcionalmente uno o mas agentes al paciente, comprendiendo los agentes al menos uno de: citocinas, factores quimiotacticos, factores de crecimiento o factores de diferenciacion.

En una realizacion, una celula madre adulta comprende una celula derivada de un precursor de celulas madres mesenquimales (MSC) de medula osea que tiene un fenotipo CD271+.

Otros aspectos se describen mas adelante.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra la morfologfa de celulas CD271+. Se prepararon citospinas y se tineron con Wright Giemsa.

Las figuras 2A-2C muestran la formacion de MSC a partir de celulas CD271+ (figura 2A; 170.000 celulas por matraz T75 cm2); MNC de MO (Figura 2B; 15 millones de celulas por matraz T75 cm2) y C) celulas CD271 (Figura 2C; 17 millones de celulas por matraz T75 cm2).

La figura 3 muestra una colonia de CFU-F el dfa 10 de cultivo.

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La figura 4 muestra el cultivo de celulas CD271 + en bolsas de teflon durante 7, 14 y 21 dfas.

La figura 5 muestra el analisis de flujo de celulas madre mesenquimales no adherentes (NA-MSC). Se muestra la tincion de control de isotopos en la lmea verde y CD105-FITC en el area sombreada.

Las figuras 6A y 6B muestran la diferenciacion osteogenica y de adipositos de celulas CD271 + de medula osea humana. La diferenciacion osteogenica y de adipocitos se realizo como se describe en los procedimientos. La presencia de diferenciacion osteogenica se mostro mediante la expresion de fosfatasa alcalina (AP) tenido con FAST BCIP/NBT (Figura 6A; x/100) el d^a 14. La diferenciacion a adipocitos se mostro mediante tincion de aceite rojo O (Figura 6B; x/100) el dfa 11. Se muestra un ejemplo representativo de tres experimentos.

La figura 7 muestra la expresion de marcadores cardiacos en celulas CD271+ cultivadas.

La figura 8 muestra la comparacion ecocardiografica de grupos de tratamiento.

Las figuras 9A-9D muestran la inmunohistoqmmica de secciones cardiacas a partir de ratones NOD/SCID a los que se inyecto celulas CD271+. Las secciones cardiacas se tineron con secuencia de Alu y se tineron conjuntamente con marcadores cardiacos (a-SA, troponina I (Tnl), conexina 43 (Cx)(40X). La figura 9A muestra una rodaja de la zona periferica con celulas positivas embebidas en la pared celular y tambien entre miocitos del huesped. La figura 9B muestra una zona remota hacia la base del corazon que muestra aun celulas humanas inyectadas. La figura 9C: muestra un vaso sangumeo grande con celulas positivas a alu en zona remota. La figura 9D: muestra la zona periferica de otro corazon con numerosas celulas positivas.

Descripcion detallada

Las celulas madres muestran un potencial para muchas areas diferentes de la salud y la investigacion medica. Algunas de las afecciones medicas mas graves, tales como cancer y defectos de nacimiento, estan provocadas por problemas que tienen lugar en algun momento en el proceso de diferenciacion o de mantenimiento de celulas madre. En general, existes dos tipos diferentes de celulas madre, celulas madre embrionarias y celulas madre adultas. Las celulas madre embrionarias se encuentran en blastocitos y tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tejidos embrionarios especializados. Las celulas madre adultas son celulas no diferenciadas que se encuentran en todo el cuerpo despues del desarrollo embrionario. Las celulas madre adultas son capaces de dividirse y de reponer celulas moribundas y de regenerar el tejido danado. Ademas, las celulas madre adultas pueden mantener el recambio normal de organos regenerativos tales como sangre, piel y tejido intestinal. Las celulas madre adultas tienen la capacidad de dividirse y de autorrenovarse indefinidamente y son capaces de regenerar todos los tipos celulares del organo del que se han originado.

Las celulas madre pueden clasificarse en totipotentes, pluripotentes, multipotentes o unipotentes en base a su potencial para diferenciarse en diferentes tipos celulares. Las celulas madre totipotentes se producen a partir de la fusion de gametos y las primeras divisiones del huevo fertilizado. Estas celulas pueden diferenciarse en tipos celulares embrionarios y extraembrionarios. Las celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas de cualquiera de las tres capas germinales. Las celulas multipotentes pueden producir solo celulas de una familia estrechamente relacionada. Las celulas unipotentes pueden producir solo un tipo celular, pero tienen propiedades de autorrenovacion que las distingue de las celulas no madre. La mayor parte de las celulas madre adultas son celulas madre multipotentes de linaje restringido y se denominan mediante su tejido de origen. Las celulas madre adultas pluripotentes son raras y generalmente reducidas en numero, pero pueden encontrarse en una serie de tejidos que incluyen sangre del cordon umbilical (Ratajczak M. Z. y col., Leukemia 21(5): 860-867 (2007)). Existen varios tipos diferentes de celulas madre adultas que incluyen, pero sin limitacion, celulas madre derivadas de tejido adiposo (Zuk, P. A. y col., Tissue Engineering 7:211-216) (2001)), celulas madre epiteliales, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre mamarias (Shackleton, M. y col., Breast Cancer R E. 7:86-95 (2005)), celulas madre mesenquimales, celulas madre endoteliales, celulas madre neuronales (Alvarez-Bullta, A. y col., Brain Res. Bull. 57:751-758 (2002)), celulas madre olfativas (Murrel, W. y col., Dev. Dyn. 233:496-515 (2005)), celulas madre testiculares, celulas madre derivadas de pulpa dental y celulas progenitoras hematopoyeticas de sangre del cordon umbilical.

Cuando una celula madre adulta se divide, crea otra celula similar a sf misma y una celula mas diferenciada de sf misma. El proceso de division de celulas asimetrica proporciona una celula hija identica y una celula de amplificacion transitoria (TA temprana) que posee una capacidad proliferativa alta. Por medio de una serie de divisiones celulares, la celula de TA temprana proporciona una celula de TA tardfa seguida por una celula progenitora espedfica del tejido y finalmente una cantidad de celulas diferenciadas que recuperan el organo o el tejido (Ribacka, C. y col. Ann. Med. epub ahead of print: 1-10 (2008)).

Mas adelante se describen varios aspectos de la invencion con referencia a las aplicaciones de ejemplo con fines de ilustracion. Debe entenderse que se establecen numerosos detalles espedficos, relaciones y procedimientos para proporcionar un entendimiento completo de la invencion. Un experto en la tecnica en cuestion, no obstante, reconocera facilmente que la invencion puede ponerse en practica sin uno o mas de los detalles espedficos o con otros procedimientos. La presente invencion no esta limitada por la disposicion ilustrada de actos o acontecimientos, ya que algunos actos pueden tener lugar en un orden diferente y/o concurrentemente con otros actos o acontecimientos. Ademas, no se requieren todos los actos o acontecimientos ilustrados para implementar una

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metodolog^a segun la presente invencion.

Las realizaciones de la invencion pueden ponerse en practica sin los aspectos teoricos presentados. Ademas, los aspectos teoricos se presentan con el entendimiento de que los solicitantes no buscan vincularse a la teona presentada.

Definiciones

La terminologfa usada en el presente documento tiene unicamente el proposito de describir realizaciones particulares y no pretende limitar la invencion. Como se usan en el presente documento, las formas del singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyen las formas de plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ademas, se pretende que en la medida en que se usen los terminos y expresiones "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con" o variantes de los mismos en la descripcion detallada y/o en las reivindicaciones dichos terminos y dichas expresiones sean inclusivas de un modo similar a la expresion "que comprende".

El termino “aproximadamente” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se determina por parte de un experto en la tecnica, que dependera, en parte, de como se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar una desviacion tfpica de 1 o mas de 1, para la puesta en practica en la tecnica. Alternativamente, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferentemente de hasta el 10 %, mas preferentemente de hasta el 5 % y aun mas preferentemente de hasta el 1 % de un valor dado. Como alternativa, en particular con respecto a sistemas o procesos biologicos, el termino puede significar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y mas preferentemente dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describen valores particulares en la solicitud y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, debe asumirse que el termino "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Una "celula madre", como se usa en el presente documento, es una celula no diferenciada que es capaz de propagacion esencialmente ilimitada, in vivo o ex vivo, capaz de diferenciacion en otros tipos celulares. Esta puede ser en determinados tipos celulares diferenciados, comprometidos, inmaduros, progenitores o maduros presentes en el tejido del que se han aislado, o tipos celulares drasticamente diferenciados, tales como, por ejemplo, los eritrocitos y linfocitos que se derivan de una celula precursora comun, o incluso en tipos celulares en cualquier etapa en un tejido completamente diferente del tejido del que se ha obtenido la celula madre. Por ejemplo, las celulas madre sangumeas pueden volverse celulas cerebrales o celulas hepaticas, las celulas madre neuronales pueden volverse celulas sangumeas, de modo que las celulas madre son pluripotenciales, y segun las senales apropiadas de su entorno, pueden diferenciarse en cualquier tejido del cuerpo.

La "propagacion" puede determinarse, por ejemplo, mediante la capacidad de una celula madre aislada para propagarse a traves de al menos 50, preferentemente 100 e incluso hasta 200 o mas divisiones celulares en un sistema de cultivo celular. Las celulas madre pueden ser "totipotentes", lo que significa que pueden producir todas las celulas de un organismo como celulas germinales. Las celulas madre tambien pueden ser “pluripotentes”, lo que significa que pueden producir muchos tipos celulares diferentes, pero no todas las celulas de un organismo. Cuando una celula madre se diferencia produce en general un tipo celular mas adulto, que puede ser una celula parcialmente diferencia como una celula progenitora, una celula diferenciada o una celula terminalmente diferenciada. Las celulas madre pueden ser muy moviles.

El "aislamiento" de una celula madre se refiere a un proceso de retirada de una celula madre de una muestra de tejido y de separacion de otras celulas que no son celulas madre del tejido. Una celula madre aislada estara generalmente exenta de contaminacion con otros tipos celulares, es decir, "homogeneidad” o “pureza" y tendra generalmente la capacidad de propagacion y diferenciacion para producir celulas maduras del tejido del que se han aislado. Una celula madre aislada puede existir en presencia de una fraccion pequena de otros tipos celulares que no interfieren en el uso de la celula madre para el analisis o la produccion de otros tipos celulares diferenciados. Las celulas madre aisladas tendran generalmente al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o el 99,9 % de pureza. Preferentemente, las celulas madre aisladas segun la invencion tendran al menos el 98 % o al menos el 99 % de pureza.

Como se usa en el presente documento, “cultivar” se refiere a propagar o criar una celula, coleccion de celulas, tejido u organo, mediante la incubacion durante un periodo de tiempo en un entorno y en condiciones que apoyan la viabilidad o la propagacion celular. El cultivo puede incluir una o mas etapas de expansion y proliferacion de una celula, coleccion de celulas, tejido u organo segun la invencion.

"Celula progenitora derivada de medula osea" (BMDC) o "celula madre derivada de medula osea" se refiere a una celula madre primitiva con la maquinaria para una autorrenovacion constitutivamente activa. Incluidas en esta definicion estan las celulas madre que son totipotentes, pluripotentes y precursores. Una "celula precursora" puede ser cualquier celula en una ruta de diferenciacion celular que sea capaz de diferenciacion en una celula mas madura. Como tal, la expresion “poblacion de celulas precursoras" se refiere a un grupo de celulas capaz de desarrollarse en una celula mas madura. Una poblacion de celulas precursoras puede comprender celulas que son totipotentes, celulas que son pluripotentes y celulas que son celulas madre de linaje restrictivo (es decir, celulas

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capaces de desarrollarse en menos de todos los linajes hemetopoyeticos o en, por ejemplo, solo celulas de linaje eritroide).

Como se usa en el presente documento, "autologo" se pretende que se refiera a cualquier material derivado del mismo individuo al que es tarde que se reintroduzca en el individuo.

La expresion "celula xenogenica" se refiere a una celula que se deriva de una especie animal diferente a la especie animal que se convierte en el huesped animal receptor en un procedimiento de transporte o de vacunacion.

La expresion "celula alogenica" se refiere a una celula que es de la misma especie animal pero geneticamente diferente en uno o mas loci geneticos que el animal que se convierte en el "huesped receptor". Esto se aplica habitualmente a celulas transplantadas desde un animal a otro animal no identico de la misma especie.

La expresion "celula singenica" se refiere a una celula que es de la misma especie animal y tiene la misma composicion genetica para la mayor parte de los marcadores genotipicos y fenotfpicos que el animal que se convierte en el huesped receptor de esa lmea celular en un procedimiento de transplante o vacunacion. Esto se aplica habitualmente a celulas transplantadas desde gemelos identicos o puede aplicarse a celulas transplantadas entre animales muy consangumeos.

Como se usa en el presente documento, la expresion "cantidad segura y eficaz" o "cantidad terapeutica" se refiere a la cantidad de un componente que es suficiente para proporcionar la respuesta terapeutica deseada sin excesivos efectos secundarios adversos (tales como toxicidad, irritacion o respuesta alergica) proporcionales a una relacion beneficio/riesgo cuando se usa del modo de la presente invencion. Por "cantidad terapeuticamente eficaz" se quiere decir una cantidad de un compuesto de la presente invencion eficaz para proporcionar la respuesta terapeuticamente deseada. La cantidad segura y eficaz espedfica o la cantidad terapeuticamente eficaz variara con factores tales como la afeccion particular que se esta tratando, la condicion ffsica del paciente, el tipo de marnffero o animal que se esta tratando, la duracion del tratamiento, la naturaleza del tratamiento concurrente (si lo hay) y las formulaciones espedficas usadas y la estructura de los compuestos o sus derivados.

"Paciente" o "sujeto" se refiere a mamfferos e incluye sujetos humanos y veterinarios.

Como se usa en el presente documento, el termino "diagnosticar" se refiere a clasificar una enfermedad o un smtoma que determina la gravedad de la enfermedad, realizar un seguimiento de la progresion de la enfermedad, predecir las consecuencias de una enfermedad y/o las perspectivas de recuperacion. El termino "detectar" tambien puede abarcar opcionalmente cualquier de los anteriores. Debena indicarse que una "muestra biologica obtenida del sujeto" tambien puede comprender opcionalmente una muestra que no se ha extrafdo ffsicamente del sujeto, como se describe con mas detalle mas adelante.

"’Tratamiento" es una intervencion realizada con la intencion de prevenir el desarrollo o alterar la patologfa o los smtomas de un trastorno. En consecuencia, "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno asf como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. Como se usa en el presente documento, "mejorado" o "tratamiento" se refiere a un smtoma que se enfoca en un valor normalizado (por ejemplo un valor obtenido en un paciente o individuo sano), por ejemplo tiene una diferencia inferior al 50 % con un valor normalizado, preferentemente una diferencia inferior a aproximadamente el 25 % de un valor normalizado, mas preferentemente tiene una diferencia inferior al 10 % de un valor normalizado y de modo aun mas preferente no es significativamente diferente de un valor normalizado determinado usando ensayos estadfsticos rutinarios.

Como se define en el presente documento, "una cantidad terapeuticamente eficaz" de un agente o compuesto, celulas, etc., (es decir, una dosificacion eficaz) significa una cantidad suficiente para producir un resultado terapeuticamente (por ejemplo, clmicamente) deseable. Las composiciones pueden administrarse de una o mas veces por dfa a una o mas veces por semana; incluyendo una vez cada dos dfas. El experto apreciara que determinados factores pueden influir en la dosificacion y la agenda temporal requerida para tratar eficazmente un sujeto, incluidos, pero sin limitacion, la gravedad de la enfermedad o el trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Ademas, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz de los compuestos de la invencion puede incluir un tratamiento unico o una serie de tratamientos. Una "cantidad profilacticamente eficaz" puede referirse a la cantidad de celulas madre mesenquimales precursoras suficiente para prevenir la recurrencia de enfermedades o trastornos cardiacos, por ejemplo, isquemia, o la aparicion de las mismas en un paciente, incluidos, pero sin limitacion, los predispuestos a enfermedades cardiacas, por ejemplo los predispuestos geneticamente a enfermedad cardiaca, apoplejfa, etc. Una cantidad profilacticamente eficaz puede referirse tambien a la cantidad del agente profilactico que proporciona un beneficio profilactico en la prevencion de la enfermedad.

El termino "muestra" se pretende que se interprete en su sentido mas amplio. Una "muestra" se refiere a una muestra biologica, tal como, por ejemplo, una o mas celulas, tejidos o fluidos (incluidos, sin limitacion, plasma, suero, sangre completa, lfquido cefalorraqrndeo, linfa, lagrimas, orina, saliva, leche, pus y exudados y secreciones de tejidos) aislados de un individuo o de constituyentes de cultivo celular, asf como muestras obtenidas mediante, por ejemplo, un procedimiento de laboratorio. Una muestra biologica puede comprender cromosomas aislados a partir

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de celulas (por ejemplo, una dispersion de cromosomas de metafase), organulos o membranas aislados a partir de celulas, celulas completas o tejidos, acido nucleico tal como ADN genomico en solucion o unido a un soporte solido tal como para analisis de inmunotransferencia Southern, ARN en solucion o unido a un soporte solido como para analisis de inmunotransferencia Northern, ADNc en solucion o union a un soporte solido, oligonucleotidos en solucion o unidos a un soporte solido, polipeptidos o peptidos en solucion o unidos a un soporte solido, un tejido, una impronta de tejido y similares.

Pueden usarse numerosos procedimientos de recogida de tejido o fluido bien conocidos para recoger la muestra biologica del sujeto para determinar el nivel de ADN, ARN y/o polipeptidos de la variante de interes en el sujeto. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, biopsia con aguja fina, biopsia con aguja, biopsia con aguja gruesa y biopsia quirurgica (por ejemplo, biopsia cerebral) y lavado. Independientemente del procedimiento usado, una vez se obtiene una biopsia/muestra el nivel de la variante puede determinarse y realizarse, de este modo, un diagnostico.

Como se usa en el presente documento, “enfermedades o trastornos cardiacos” o “enfermedades o trastornos cardiovasculares" se refiere a cualquier tipo de enfermedad o trastorno cardiaco, incluidos cardiomiopatfa, aterosclerosis, enfermedad arterial coronaria, cardiopatfa isquemica, miocarditis, infeccion vmca, heridas, cardiopatfa hipertensiva, enfermedad vascular, cardiopatfa congenica, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, arritmias, enfermedades resultantes en la remodelacion del corazon, insuficiencia cardiaca, isquemia, infarto de miocardio, transplante, hipertension, reestenosis, angina de pecho, cardiopatfa reumatica o defectos cardiovasculares congenitos. Las enfermedades o trastornos del corazon pueden deberse a cualquier motivo, tal como por ejemplo dano a tejido cardiaco tal como una perdida de contractibilidad (por ejemplo, como puede demostrarse por medio de una fraccion de eyeccion reducida).

Los danos o trastornos cardiacos caracterizados por una funcion cardiaca insuficiente incluyen cualquier alteracion o ausencia de una funcion cardiaca normal o la presencia de una funcion cardiaca anormal. La funcion cardiaca anormal puede ser el resultado de una enfermedad, una lesion y/o envejecimiento. Como se usa en el presente documento, la funcion cardiaca anormal incluye anormalidad morfologica y/o funcional de un cardiomiocito, una poblacion de cardiomiocitos, o el corazon mismo. Ejemplos no limitantes de anormalidades morfologicas y funcionales incluyen deterioro ffsico y/o muerte de cardiomiocitos, patrones de crecimiento anormal de cardiomiocitos, anormalidades en la conexion ffsica entre cardiomiocitos, subproduccion o sobreproduccion de una sustancia o sustancias por cardiomiocitos, insuficiencia de cardiomiocitos para producir una sustancia o sustancias que producen normalmente y la transmision de impulsos electricos en patrones anormales o en momentos anormales. Las anormalidades en un nivel mas burdo incluyen disquinesia, fraccion de eyeccion reducida, cambios observados mediante ecocardiograffa (por ejemplo, dilatacion), cambios en ECG, cambios en tolerancia del ejercicio, perfusion capilar reducida y cambios observados mediante angiograffa. La funcion cardiaca anormal se observa con muchos trastornos que incluyen, por ejemplo, cardiopatfa isquemica, por ejemplo angina de pecho, infarto de miocardio, cardiopatfa isquemica cronica, cardiopatfa hipertensiva, cardiopatfa pulmonar (cor pulmonale), cardiopatfa valvular, por ejemplo fiebre reumatica, prolapso de valvula mitral, calcificacion de anillo mitral, cardiopatfa carcinoide, endocarditis infectiva, cardiopatfa congenita, enfermedad de miocardio, por ejemplo miocarditis, cardiomiopatfa dilatada, cardiomiopatfa hipertensiva, trastornos cardiacos que tienen como consecuencia insuficiencia cardiaca congestiva y tumores del corazon, por ejemplo sarcomas primarios y tumores secundarios. El dano cardiaco tambien incluye heridas, tales como, por ejemplo, heridas por cuchillo; biologicas (por ejemplo vmcas, enfermedades autoinmunitarias) o qrnmicas (por ejemplo, quimioterapia, farmacos); cirugfa, transplante y similares.

"Isquemia miocardica" se refiere a una carencia del flujo de oxfgeno al corazon que tiene como consecuencia un dano isquemico miocardico. Como se usa en el presente documento, la frase dano isquemico miocardico incluye dano provocado por un flujo de sangre reducido al miocardio. Ejemplos no limitantes de causas de isquemia miocardica y dano isquemico miocardico incluyen: presion diastolica aortica reducida, presion intraventricular aumentada y contraccion miocardica, estenosis arterial coronaria (por ejemplo, ligacion coronaria, estenosis coronaria fijada, cambio de placa agudo (por ejemplo, ruptura, hemorragia), trombosis arterial coronaria, vasoconstriccion), estenosis de valvula aortica y regurgitacion, y presion atrial derecha aumentada. Los ejemplo no limitantes de efectos adversos de isquemia miocardica y dano isquemico miocardico incluyen: dano a miocitos (por ejemplo, perdida de celulas miocfticas, hipertrofia miocftica, hiperplasia celular miocftica, angina (por ejemplo, angina de pecho, angina variante, angina inestable, muerte cardiaca subita), infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca congestiva. El dano debido a isquemia miocardica puede ser agudo o cronico y las consecuencias pueden incluir formacion de cicatrices, remodelacion cardiaca, hipertrofia cardiaca, reduccion del espesor de pared, dilatacion y cambios funcionales asociados. La existencia y la etiologfa de dano miocardico agudo o cronico y/o isquemia miocardica puede diagnosticarse usando cualquiera de una diversidad de procedimientos y tecnicas bien conocidos en la tecnica que incluyen, por ejemplo, toma de imagenes no invasiva (por ejemplo, MRI, ecocardiograffa), angiograffa, analisis de estres, ensayos para protemas especfficas cardiacas tales como troponina cardiaca y smtomas clmicos. Estos procedimientos y tecnicas asf como otras tecnicas apropiadas pueden usarse para determinar que sujetos son candidatos adecuados para los procedimientos de tratamiento descritos en el mismo.

Celulas CD271+ derivadas de medula osea

La cardiomiopatfa isquemica es la causa principal de insuficiencia cardiaca en los pafses desarrollados; existen

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pocos tratamientos que mejoren la funcion cardiaca una vez ha tenido lugar la remodelacion del infarto y hay una carencia de tratamientos que realmente invierten la remodelacion perjudicial del corazon despues de un infarto de miocardio (IM). La administracion de celulas progenitoras derivadas de medula osea adulta en el corazon se muestra prometedora en la regeneracion del miocardio. Los inventores han demostrado en modelos preclmicos (y por primera vez en seres humanos en datos preliminares) la capacidad de celulas madre mesenquimales (MSC) derivadas de medula osea (MO) suministradas al corazon mediante sistemas de suministro quirurgicos y por cateter para injertarse, apoyar la remodelacion inversa, mejorar la funcion cardiaca y reducir el tamano de la cicatriz. Aunque las MSC han demostrado ser muy prometedoras, estas celulas requieren de 4 a 5 semanas de cultivo para obtener cantidades suficientes para su inyeccion. Un precursor de MSC puede aislarse de la medula osea en base a la expresion del receptor de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR; CD271) y las celulas CD271 + son una fuente de celulas facilmente disponible para uso terapeutico. De forma importante, las celulas CD271 + derivadas de medula osea pueden obtenerse a partir de la aspiracion de medula osea y aislarse en cantidades suficientes en 4 o 5 horas, proporcionando una ventaja logfstica para su uso inmediato. Ademas, estas celulas son drasticamente superiores en eficacia a MSC cultivadas. El objetivo de los estudios es realizar ensayos preclmicos que analizan celulas CD271+ de MO en un modelo de roedor o de cerdo de infarto de miocardio y traducir este trabajo a un ensayo clmico de inyecciones quirurgicas directas de celulas CD-271+ despues de una cirugfa de derivacion arterial coronaria. Sin desear vincularse a ninguna teona, la hipotesis central es que las celulas CD271 + de MO administradas mediante inyeccion quirurgica se injertaran, mejoraran la funcion cardiaca y reduciran el tamano de la cicatriz.

La terapia celular para cardiomiopatfas isquemicas cronicas ofrece el potencial de evitar danos posteriores al tejido que podnan derivar en una insuficiencia cardiaca. Los inventores han demostrado que las celulas CD271+ humanas son de hecho precursores de MSC y tienen el potencial de reparar tejido isquemico en un modelo de raton de infarto de miocardio (IM). Las celulas CD271+ son mas potentes y tienen una capacidad superior para la diferenciacion en cardiomiocitos que las MSC cultivadas. De forma importante, pueden aislarse numeros adecuados de celulas CD271+ de MO en cuatro o cinco horas, lo que proporciona un avance logfstico principal para tratar pacientes inmediatamente con terapia derivada de medula osea autologa.

En una realizacion preferente se usan celulas CD271+ mesenquimales precursoras derivadas de medula osea (MO) en el tratamiento de tejido isquemico en pacientes con insuficiencia cardiaca.

En otra realizacion se usan celulas madre mesenquimales (MSC) CD271+ en un procedimiento de prevencion o de tratamiento de enfermedades o trastornos cardiovasculares. Preferentemente, las celulas CD271+ se afslan de celulas de medula osea que tienen un receptor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR; CD271).

En otra realizacion preferente, las celulas madre CD271+ son autologas, singenicas, alogenicas, xenogenicas o combinaciones de las mismas. Las celulas madre administradas pueblan y reparan el tejido danado, por ejemplo, el tejido cardiaco. Estas celulas se diferencian en los diversos linajes que dan como resultado la regeneracion y la reparacion del tejido danado.

En otra realizacion preferente, se administran opcionalmente uno o mas agentes al paciente, comprendiendo los agentes al menos uno de: citocinas, factores quimiotacticos, factores de crecimiento o factores de diferenciacion.

En un aspecto, se usan celulas madre mesenquimales (MSC) CD271+ en procedimientos de tratamiento a pacientes con una enfermedad o lesion cardiaca que comprenden la administracion de una composicion celular terapeutica a un paciente con una enfermedad o una lesion del corazon o del aparato circulatorio, y evaluar al paciente para determinar mejoras en la funcion cardiaca, en los que dicha composicion celular comprende CD271+ como se ha descrito en el presente documento. En una realizacion, la cardiopatfa es una cardiomiopatfa. En realizaciones espedficas, la cardiomiopatfa es idiopatica o una cardiomiopatfa con una causa conocida. En otras realizaciones, la cardiomiopatfa es isquemica o no isquemica en naturaleza. En otras realizaciones, la enfermedad del corazon o del sistema circulatorio comprende una o mas de angioplasia, aneurisma, angina (angina de pecho), estenosis aortica, aortitis, arritmias, arteriosclerosis, arteritis, hipertrofia septal asimetrica (ASH), aterosclerosis, fibrilacion y aleteo atrial, endocarditis bacteriana, smdrome de Barlow (prolapso de valvula mitral), bradicardia, enfermedad de Buerger (thromboangiitis obliterans), cardiomegalia, cardiomiopatfa, carditis, enfermedad de la arteria carotida, coartacion de la aorta, cardiopatfa congetica (defectos cardiacos congenitos), insuficiencia cardiaca congestiva (insuficiencia cardiaca), enfermedad arterial coronaria, smdrome de Eisenmenger, embolismo, endocarditis, eritromelalgia, fibrilacion, displasia fibromuscular, bloqueo cardiaco, soplo al corazon, hipertension, hipotension, calcificacion arterial infantil idiopatica, enfermedad de Kawasaki (smdrome de ganglio linfatico mucocutaneo, enfermedades de ganglios linfaticos mucocutaneos, poliarteritis infantil), smdrome metabolico, angina microvascular, infarto de miocardio (ataque al corazon), miocarditis, taquicardia atrial paroxismal (PAT), periarteritis nodosa (poliarteritis, poliarteritis nodosa), pericarditis, enfermedad vascular periferica, isquemia cntica de los miembros, vasculopatfa diabetica, flebitis, estenosis de valvula pulmonar (estenosis pulmonica), enfermedad de Raynaud, estenosis de arteria renal, hipertension renovascular, cardiopatfa reumatica, defectos septales, isquemia silenciosa, smdrome X, taquicardia, arteritis de Takayasu, tetralogfa de Fallot, transposicion de los vasos grandes, atresia de tricuspide, trunco arterioso, cardiopatfa valvular, ulceras varicosas, venas varicosas, vasculitis, defecto septal ventricular, smdrome de Wolf- Parkinson-White o defecto de la almohadilla endocardica.

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En otras realizaciones, la enfermedad del corazon o el sistema circulatorio comprende uno o mas de fiebre reumatica aguda, pericarditis reumatica aguda, endocarditis reumatica aguda, miocarditis reumatica aguda, cardiopatias reumaticas cronicas, enfermedades de la valvula mitral, estenosis mitral, insuficiencia mitral reumatica, enfermedades de valvula aortica, enfermedades de otras estructuras endocardicas, cardiopatia isquemica (aguda y subaguda), angina de pecho, enfermedades de la circulacion pulmonar (cardiopatfa pulmonar aguda, embolismo pulmonar, cardiopatfa pulmonar cronica), cardiopatia quifoscoliotica, miocarditis, endocarditis, fibrosis endomiocardica, fibroelastosis endocardica, bloque atrioventricular, disritmias cardiacas, degeneracion miocardica, enfermedades del aparato circulatorio que incluyen enfermedades cerebrovasculares, oclusion y estenosis de arterias precerebrales, oclusion de arterias cerebrales, enfermedades de arterias, arteriolas y capilares (aterosclerosis, aneurisma), o enfermedades de venas y vasos linfaticos.

En una realizacion, el tratamiento comprende el tratamiento de un paciente con una cardiomiopatfa con una composicion celular terapeutica que comprende celulas CD271 + con o sin otro tipo celular. En otras realizaciones preferentes, el paciente experimenta beneficios a partir del tratamiento, por ejemplo a partir de la capacidad de las celulas para apoyar el crecimiento de otras celulas, que incluyen celulas madre o celulas progenitoras presentes en el corazon, a partir del crecimiento hacia dentro o la vascularizacion del tejido y a partir de la presencia de factores celulares beneficiosos, quimiocinas, citocinas y similares.

La mejora en un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio en la que se administran al individuo las celulas CD271 + o composiciones terapeuticas que proporcionan las mismas puede evaluarse o demostrarse mediante una mejora detectable en uno o mas smtomas de la enfermedad o el trastorno del aparato circulatorio.

En otra realizacion, la mejora en un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del aparato circulatorio, en la que se administran al individuo las celulas CD271+ o composiciones terapeuticas que las proporcionan puede evaluarse o demostrarse mediante una mejora detectable en uno o mas indicios de funcion cardiaca, por ejemplo, demostracion de mejora detectable en uno o mas de gasto cardiaco (CO) de pecho, mdice cardiaco (CI), presion arterial pulmonar (PAWP) e mdice cardiaco (CI), % de acortamiento fraccional (% FS), fraccion de eyeccion (FE), fraccion de eyeccion ventricular izquierda (LVEF); diametro diastolico del extremo ventricular izquierda (LVEDD), diametro sistolico del extremo ventricular izquierdo (LVESD), contractilidad (por ejemplo, dP/dt), bucles de presion- volumen, medidas del trabajo del corazon, un aumento en el funcionamiento atrial o ventricular; un aumento en la eficacia de bombeo, un aumento en la tasa de perdida de eficacia de bombeo, un aumento en la perdida de funcionamiento hemodinamica y una reduccion en complicaciones asociadas con cardiomiopatfas, en comparacion con el individuo antes de la administracion de celulas CD271+.

La mejora en un individuo que recibe las composiciones terapeuticas proporcionadas en el presente documento tambien puede evaluarse mediante parametros subjetivos, por ejemplo la autoevaluacion del individuo sobre su estado de salud despues de la administracion.

En determinadas circunstancias, los procedimientos de tratamiento proporcionados en el presente documento que inducen a las celulas CD271+ terapeuticas a diferenciarse a lo largo del linaje mesenquimal, por ejemplo hacia un fenotipo cardiomiogenico, angiogenico o vasculogenico, o en celulas tales como miocitos, cardiomiocitos, celulas endoteliales, celulas miocardicas, celulas epicardicas, celulas endoteliales vasculares, celulas de musculos lisos (por ejemplo, celulas de musculos lisos vasculares).

La administracion de celulas CD271+ o composiciones terapeuticas que comprenden dichas celulas a un individuo con necesidad de ello, puede realizarse, por ejemplo, por transplante, implante (por ejemplo, de las celulas mismas o las celulas como parte de una combinacion celula-matriz), inyeccion (por ejemplo, directamente al sitio de la enfermedad o la afeccion, por ejemplo, directamente a un sitio isquemico en el corazon de un individuo que ha tenido un infarto de miocardio), infusion, administracion mediante cateter, o cualquier otro medio conocido en la tecnica para proporcionar una terapia celular.

En una realizacion, las composiciones celulares terapeuticas se proporcionan a un individuo con necesidad de las mismas, por ejemplo, mediante inyeccion en uno o mas sitios en el individuo. En una realizacion espedfica, las composiciones celulares terapeuticas se proporcionan mediante inyeccion intracardiaca, por ejemplo a una zona isquemica del corazon. En otras realizaciones espedficas, las celulas se inyectan a la superficie del corazon, a una zona adyacente o incluso a una zona mas remota. En realizaciones preferentes, las celulas pueden administrarse a la zona enferma o lesionada.

Se pueden administrar celulas CD271+ a un individuo que tenga una enfermedad o afeccion de los aparatos coronario o vascular en cualquier momento en el que las celulas sean terapeuticamente beneficiosas. En determinadas realizaciones, por ejemplo, las celulas o composiciones terapeuticas de la invencion se administran dentro de un periodo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 dfas del infarto de miocardio. La administracion proxima en el tiempo a un infarto de miocardio, por ejemplo dentro de un periodo de 13 o 1-7 dfas, es preferible a la administracion distal en el tiempo, por ejemplo despues de 3 o 7 dfas despues de un infarto de miocardio. En otras realizaciones, por ejemplo, las celulas o composiciones terapeuticas de la invencion se

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administran dentro de un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 dfas del diagnostico de la enfermedad o afeccion.

Tambien se proporciona en el presente documento kits para usar en el tratamiento de infarto de miocardio. Los kits proporcionan la composicion celular terapeutica que puede prepararse en una forma farmaceuticamente aceptable, por ejemplo mezclandola con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. De forma ideal el kit puede usarse en el campo, por ejemplo en el despacho de un medico, o mediante un proveedor de cuidados de emergencia que se aplican a un paciente al que se ha diagnosticado que ha tenido un infarto de miocardio o acontecimiento cardiaco similar.

En algunos aspectos de los procedimientos de tratamiento proporcionados en el presente documento, las celulas CD271 + se administran con celulas madre que no son celulas CD271+, mioblastos, miocitos, cardiomiocitos o progenitores de mioblastos, miocitos, cardiomioblastos y/o cardiomiocitos.

En una realizacion espedfica, los procedimientos de tratamiento proporcionados en el presente documento comprenden la administracion de celulas CD271+, por ejemplo una composicion terapeutica que comprende las celulas, a un paciente con una enfermedad del corazon o del sistema circulatorio; y evaluar al paciente para determinar mejoras en la funcion cardiaca, en los que la composicion celular terapeutica se administra como complejo matriz-celula. En determinadas realizaciones, la matriz es un andiamaje, preferentemente bioabsorbible, que comprende al menos las celulas.

En algunas realizaciones, las poblaciones de celulas CD271+ se incuban o se administran a un paciente en presencia de uno o mas factores que estimulan la diferenciacion de celulas madre o progenitoras a lo largo de una ruta cardiogenica, angiogenica, hemangiogenica o vasculogenica. Dichos factores son conocidos en la tecnica; la determinacion de condiciones adecuadas para la diferenciacion puede realizarse con experimentos rutinarios. Dichos factores incluyen, pero sin limitacion, factores tales como factores de crecimiento, quimiolinas, citocinas, productos celulares, agentes de desmetilacion y otros estfmulos que son ahora conocidos o se determinan posteriormente para estimular la diferenciacion, por ejemplo de celulas madre, a lo largo de rutas o linajes cardiogeneticos, angiogenicos, hemangiogenicos o vasculogeneticos. Por ejemplo, las celulas CD271+ pueden diferenciarse a lo largo de rutas o linajes cardiogenicos, angiogenicos, hemangiogenicos o vasculogenicos mediante cultivo de las celulas en presencia de factores que comprenden al menos uno de un agente de desmetilacion, un BMP, FGF, protema de factor Wnt, Hedgehog y/o factores anti-Wnt.

La inclusion de agentes de desmetilacion tiende a permitir a las celulas diferenciarse a lo largo de lmeas mesenquimales, hacia una ruta cardiomiogenica. La diferenciacion puede determinarse mediante, por ejemplo, la expresion de al menos uno de cardiomiosina, miosina esqueletica o GATA4; o mediante la adquisicion de un ritmo de latido, espontaneo o inducido de otro modo; o mediante la capacidad para integrarse al menos parcialmente en un musculo cardiaco del paciente sin inducir arritmias. Los agentes de desmetilacion que pueden usarse para iniciar dicha diferenciacion incluyen, pero sin limitacion, 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, dimetilsulfoxido, cloruro de queleritrina, acido retinoico o sales del mismo, acido 2-amino-4-(etiltio)butmco, procainamida y procama.

En determinadas realizaciones en el presente documento, las celulas se vuelven celulas cardiomiogenicas, angiogenicas, hemangiogenicas o vasculogenicos, o progenitoras. Preferentemente las celulas se integran en un sistema cardiovascular del receptor, incluidos, pero sin limitacion, musculo cardiaco, vascular y otras estructuras del corazon, vasos cardiacos o perifericos y similares. En otras determinadas circunstancias, las celulas CD271+ se diferencian en celulas que adquieren dos o mas de los indicios de celulas cardiomiogenicas o sus progenitores y son capaces de integrarse en el corazon o la vasculatura del receptor. En realizaciones espedficas, las celulas que se administran a un individuo no dan como resultado ningun aumento de arritmias, defectos cardiacos, defectos de vasos sangumeos u otras anomalfas del sistema circulatorio del individuo o la salud del mismo. En determinadas realizaciones, las celulas CD271+ actuan promoviendo la diferenciacion de celulas madre presentes de forma natural en musculos cardiacos, vasos sangumeos, sangre y similares del paciente diferenciandose a sf mismas en, por ejemplo, cardiomiocitos, o al menos a lo largo de lmeas cardiomiogenicas, angiogenicas, hemangiogenicas o vasculogenicas.

Las celulas CD271+ y poblaciones de dichas celulas pueden proporcionarse terapeuticamente o profilacticamente a un individuo, por ejemplo, un individuo que tiene una enfermedad, trastorno o afeccion del corazon o del sistema circulatorio o que afecta a los mismos. Dichas enfermedades, trastornos o afecciones pueden incluir insuficiencia cardiaca congestiva debida a aterosclerosis, cardiomiopatfa o lesion cardiaca, por ejemplo una lesion isquemica, tal como de infarto o herida de miocardio (agudo o cronico).

Las celulas CD271+ pueden administrarse a un individuo en forma de una composicion terapeutica que comprende las celulas y otro agente terapeutico, como factor de crecimiento similar a insulina (IGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), IL-8, un agente antitrombogenico (por ejemplo, heparina, derivados de heparina, uroquinasa y PPack (dextrofenilalanina prolina arginina clorometilcetona); compuestos antitrombina, antagonistas del receptor de plaquetas, anticuerpos anti-

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trombina, anticuerpos del receptor anti-plaquetas, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inhibidores de prostaglandina y/o inhibidores de plaquetas, un agente antiapoptotico (por ejemplo, EPO, derivados y analogos de EPO y sus sales, TPO, IGF-I, IGFII, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) o inhibidores de caspasa), un agente antinflamatorio (por ejemplo, inhibidores de quinasa P38 MAP, estatinas, inhibidores de IL-6 y IL-1, pemirolast, tranilast, remicade, sirolimus, compuestos antinflamatorios no esteroideos, por ejemplo, acido acetilsalidlico, ibuprofeno, tepoxalina, tolmetina o suprofeno), un agente inmunodepresor o inmunomodulatorio (por ejemplo, inhibidores de calcineurina, por ejemplo ciclosporina, tacrolimus, inhibidores de mTOR tales como sirolimus o everolimus; antiproliferativos tales como azatioprina y micofenolato mofetilo; corticosteroides, por ejemplo, prednisolona o hidrocortisona; anticuerpos tales como anticuerpos del receptor de anti-IL-2Ra monoclonales, basiliximab, daclizuma, anticuerpos anti-linfocitos T monoclonales tales como globulina anti-timocitos (ATG), globulina anti-linfocitos (ALG) y el anticuerpo anti-linfocitos T monoclonales OKT3 y/o un antioxidante (por ejemplo, probucol; vitaminas A, C y E, coenzima Q-10, glutation, L cistema, N-acetilcistema o derivados antioxidantes, analogos o sales de los anteriores). En determinadas realizaciones, las composiciones terapeuticas que comprenden las celulas CD271 + comprenden ademas uno o mas tipos celulares adicionales, por ejemplo celulas adultas (por ejemplo fibroplastos o celulas endodermicas) o celulas madre o progenitoras. Dichos agentes terapeuticos y/o una o mas celulas adicionales pueden administrarse a un individuo con necesidad de ello individualmente o en combinaciones de dos o mas de dichos compuestos o agentes.

En determinadas realizaciones, el individuo que se va a tratar es un mairnfero. En una realizacion espedfica, el individuo que se va a tratar es un ser humano. En determinadas realizaciones, el individuo es un animal de ganadena o un animal domestico. En otra realizacion espedfica, el individuo que se va a tratar es un caballo, una oveja, una vaca o un toro, un cerdo, un perro o un gato.

En otra realizacion preferente, la poblacion de celulas madre tiene al menos aproximadamente el 80 % de pureza en comparacion con una muestra de control aislada de un tejido cardiaco, preferentemente la poblacion de celulas madre tiene aproximadamente el 90 % de pureza en comparacion con una muestra de control de celulas, preferentemente la poblacion de celulas madre tiene aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 % de pureza en comparacion con una muestra de control de celulas.

En otra realizacion preferente, las poblaciones de celulas madre CD271 + aisladas pueden usarse en cualquier ensayo deseado por el usuario final, tal como, por ejemplo, la expresion de una molecula extrana no nativa, una molecula nativa que puede o no puede activarse en las celulas. Ejemplos de dichas moleculas pueden ser factores de crecimiento, receptores, ligandos, agentes terapeuticos, etc. Las moleculas pueden seleccionarse por parte del usuario final para la expresion mediante celulas madre aisladas que dependen de la necesidad del usuario final. Las moleculas comprenden, por ejemplo, un polipeptido, un peptido, un oligonucleotido, un polinucleotido, una molecula organica o inorganica.

En otra realizacion preferente, las celulas madre pueden ser celulas madre embrionicas, celulas madre adultas, celulas madre de sangre del cordon umbilical o celulas madre cancerosas. En realizaciones preferentes, las celulas madre son celulas madre adultas, preferentemente celulas madre cardiacas.

Adicionalmente, las celulas madre de la presente invencion pueden ser celulas madre hematopoyeticas o celulas madre mesenquimales. Las celulas madre de la presente invencion pueden ser celulas madre totipotentes, pluripotentes, multipotentes o unipotentes. Las celulas madre segun la presente invencion pueden seleccionarse mediante la presencia de uno o mas marcadores de celulas madre que incluyen, pero sin limitacion: CD133, CD34, CD38, CD117/c-kit, OCT3/4, Nanog, RUNX2, SOX9, Integrina, SPARC, osteocalcina, endoglina y STRO-1.

Las celulas madre de la presente invencion pueden ser celulas madre primarias o pueden derivarse de una lmea de celulas madre establecida, lmea de celulas madre premalignas, lmea celular cancerosa o cualquier lmea celular que manifieste cualquier marcador de celulas madre. Las celulas madre primarias pueden derivarse de un paciente con cancer o un paciente sano.

Administracion: El aislamiento de poblaciones de celulas madre CD271+ es util para muchos tipos de aplicaciones, por ejemplo, transplante en el corazon u otros organos para el tratamiento de enfermedades o trastornos cardiacos, tales como miocardio danado. Como se usa en el presente documento, "miocardio danado" se refiere a celulas de miocardio que se han expuesto a condiciones isquemicas. Estas condiciones isquemicas pueden estar provocadas por un infarto de miocardio u otras enfermedades cardiovasculares o dolencias relacionadas. La carencia de oxfgeno causa la muerte de las celulas en la zona circundante, dejando un infarto, que formara, eventualmente, cicatrices. Como se usa en el presente documento, "cardiopatfa relacionada con la edad" se refiere al deterioro del miocardio como consecuencia de mecanismos intrmsecos que tienen lugar cuando el organismo envejece.

En una realizacion preferente, las celulas madre se usan en procedimientos de reparacion y/o regeneracion del miocardio danado o cardiomiopatfa relacionada con la edad en un sujeto con necesidad de ello administrando celulas madre aisladas a zonas de miocardio danado, en las que las celulas madre administradas se diferencian en uno o mas miocitos, celulas endoteliales o celulas del musculo liso. Las celulas diferenciadas pueden proliferar y forman diversas estructuras cardiacas que incluyen arterias coronarias, arteriolas, capilares y miocardio, que son todas estructuras esenciales para una funcion apropiada en el corazon. La capacidad de restaurar la integridad tanto

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funcional como estructural es otro aspecto mas de la presente invencion. En una realizacion preferente, las celulas madre son celulas madre cardiacas adultas. En otra realizacion, las celulas madre cardiacas adultas se a^slan de tejido cardiaco recogido del sujeto con necesidad de tratamiento terapeutico para una de las afecciones cardiacas o de vasculatura y se implantan de nuevo en el sujeto.

En otra realizacion preferente, las celulas madre CD271 + aisladas se cultivan y se expanden ex vivo antes de la administracion de las celulas madre a un paciente. Las celulas pueden ser, por ejemplo, autologas, singenicas, alogenicas, xenogenicas o cualquier combinacion de las mismas. La misma fuente de celulas madre no debe usarse si se requieren administraciones sucesivas.

Asf, en realizaciones preferentes, la invencion implica la administracion de una dosis o una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas madre al corazon. Una dosis eficaz es una cantidad suficiente para obtener un resultado clmico beneficioso o deseado. La dosis podna administrarse en una o en mas administraciones. La determinacion precisa de que podna considerarse una dosis eficaz puede basarse en factores individuales a cada paciente, incluidos su tamano, edad, zona de dano de miocardio y cantidades de tiempo desde el dano. Un experto en la tecnica, espedficamente un medico o cardiologo, sena capaz de determinar el numero de celulas madre que constituinan una dosis eficaz sin una gran experimentacion.

En algunas realizaciones de la invencion, las celulas madre aisladas se activan antes de la administracion a un sujeto. La activacion de las celulas madre puede realizarse exponiendo las celulas madre aisladas a una o mas citocinas, tales como factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1) o variantes de los mismos. El HGF incluye positivamente en la migracion y alojamiento mediante la activacion del receptor de c-Met (Kollet y col. (2003) J. Clin. Invest. 112: 160-169; Linke y col. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Rosu-Myles y col. (2005) J. Cell. Sci. 118: 4343-4352; Urbanek y col. (2005) Circ. Res. 97: 663673). De forma similar, el IGF-1 y su receptor correspondiente (IGF-1R) inducen la division de celulas madre, regulan al alza la actividad de telomerasa, impiden la senescencia replicativa y conservan el conjunto de celulas madre cardiacas funcionalmente competentes en el corazon (Kajstura y col. (2001) Diabetes 50: 1414-1424; Torella y col. (2004) Circ. Res. 94: 514-524; Davis y col. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 8155-8160). En una realizacion preferente, las celulas madre aisladas se ponen en contacto con factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y/o factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1).

Algunos de otros ejemplos no limitantes de citocinas que son adecuadas para la activacion de las celulas madre aisladas incluyen activina A, protema morfogenica de huesos 2, protema morfogenica de huesos 4, protema morfogenica de huesos 6, cardiotrofina 1, factor de crecimiento de fibroblastos 1, factor de crecimiento de fibroblastos 4, ligando Flt3, factor neurotrofico derivado de glial, heparina, factor de crecimiento similar a insulina II, protema de union al factor de crecimiento similar a insulina 3, protema de union al factor de crecimiento similar a insulina 5, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 8, factor inhibidor de leucemia, midkina, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA, factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, progesterona, putrescina, factor de celulas madre, factor derivado de estroma 1, trombopoyetina, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante 131, factor de crecimiento transformante P2, factor de crecimiento transformante 133, factor de crecimiento endotelial vascular, Wnt1, Wnt3a y Wnt5a, como se describe por Kanemura y col. (2005) Cell Transplant. 14:673-682; Kaplan y col. (2005) Nature 438:750-751; Xu y col. (2005) Methods Mol. Med. 121:189-202; Quinn y col. (2005) Methods Mol. Med. 121:125-148; Almeida y col. (2005) J Biol. Chem. 280:41342-41351; Bamabe-Heider y col (2005) Neuron 48:253-265; Madlambayan y col. (2005) Exp Hematol 33: 1229-1239; Kamanga- Sollo y col. (2005) Exp Cell Res 311:167-176; Heese y col. (2005) Neuro-oncol. 7:476-484; He y col. (2005) Am J. Physiol. 289:H968H972; Beattie y col. (2005) Stem Cells 23:489-495; Sekiya y col. (2005) Cell Tissue Res 320:269276; Weidt (2004) Stem Cells 22:890-896; Encabo y col. (2004) Stem Cells 22:725-740; y Buytaeri-Hoefen y col. (2004) Stem Cells 22:669-674, la totalidad del texto de cada una de las mismas se incorpora al presente documento por referencia.

Las variantes funcionales de las citocinas mencionadas anteriormente tambien pueden usarse en la invencion. Las variantes de citocina funcionales mantendnan su capacidad para unirse a sus receptores correspondientes y activarlos. Las variantes pueden incluir sustituciones, inserciones, deleciones de aminoacidos, variantes de ayuste alternativas o fragmentos de la protema nativa. Por ejemplo, NK1 y NK2 son variantes de ayuste naturales de HGF, que son capaces de unirse al receptor de c-MET. Estos tipos de variantes de ayuste de origen natural, asf como variantes obtenidas mediante ingeniena genetica de las protemas citocinas que conservan la funcion se contemplan por parte de la invencion.

En algunas realizaciones, la administracion de celulas madre a un sujeto con necesidad de ello viene acompanada por la administracion de una o mas citocinas al corazon. Las citocinas pueden seleccionarse del grupo que consiste en factor de celulas madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor destimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), factor derivado de celula estromal 1, factor de acero, factor de crecimiento endothelial vascular, factor estimulante de colonias de macrofagos, factor estimulante de granulocitos y macrofagos, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1), interleucina 3, o cualquier citocina capaz de la estimulacion y/o movilizacion de celulas madre. En una realizacion preferente, las citocinas se seleccionan de HGF, IGF-1, variantes funcionales de HGF o IGF-1, o combinaciones de los mismos. Las citocinas pueden administrarse simultaneamente con las poblaciones de celulas madre CD271+.

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Alternativamente, la administracion de las citocinas puede preceder o ser posterior a la administracion de las celulas madre en un periodo de tiempo espedfico. El periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 1 mes o aproximadamente 6 meses.

Las citocinas pueden administrarse al corazon en una o mas administraciones. En una realizacion, las citocinas se administran mediante una unica administracion. En otra realizacion, las administraciones multiples de la misma dosificacion de citocinas se realizan al corazon. Una realizacion preferente de la invencion incluye la administracion de multiples dosis de las citocinas al corazon, de modo que se forme un gradiente quimiotactico. Un gradiente quimiotactico que se extiende del atrio y/o apex del corazon a la region central de ventnculo izquierdo puede establecerse administrando multiples dosis de concentracion de citocinas creciente. Alternativamente, el gradiente quimiotactico puede formarse desde el sitio de implante de las celulas madre a la region central del ventriculo izquierdo o la region periferica del miocardio infartado.

En una realizacion, se usan al menos dos citocinas en la formacion del gradiente quimiotactico. En otra realizacion, la concentracion de la primera citocina permanece constante mientras que la concentracion de la segunda citocina es variable, formando, por lo tanto, el gradiente quimiotactico.

En una realizacion preferente, el gradiente quimiotactico se forma mediante administraciones multiples de IGF-1 y HGF, en las que las concentraciones de IGF-1 permanecen constantes y la concentracion de HGF es variable. En algunas realizaciones, las concentraciones variables de HGF pueden variar de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 400 ng/ml. En otras realizaciones, la concentracion de IGF-1 puede ser de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 ng/ml.

La poblacion de celulas madre CD271 + aisladas y citocinas puede administrarse al corazon mediante inyeccion. La inyeccion es preferentemente intramiocardica. Como sera consciente un experto en la tecnica, este es el procedimiento preferente de administracion para celulas madre y/o citocinas ya que el corazon es un musculo en funcionamiento. La inyeccion por esta via asegura que el material inyectado no se perdera debido a los movimientos de contraccion del corazon.

En otro aspecto de la invencion, las celulas madre y/o las citocinas se administran mediante inyeccion por via transendocardica o transepicardica. Esta realizacion preferente permite que las citocinas penetren la membrana circundante protectora, necesario para la realizacion en la que las citocinas se inyeccion por via intramiocardica. Otra realizacion preferente de la invencion incluye el uso de un enfoque basado en cateter para administrar las inyecciones transendocardicas. El uso de un cateter evita procedimientos mas invasivos de administracion en los que sena necesaria la apertura de la cavidad pectoral. Como apreciara un experto en la tecnica, el tiempo optimo de recuperacion se permitina mediante el procedimiento menos invasivo. Un enfoque de cateter implica el uso de tecnicas tales como el cateter NOGA o sistemas similares. El sistema de cateter NOGA facilita la administracion guiada proporcionando un mapeo electromecanico de la zona de interes, asf como una aguja retractil que pueda usarse para administrar inyecciones dirigidas o para banar una zona diana con un producto terapeutico. Cualquiera de las realizaciones de la presente invencion puede administrarse usando dicho sistema para administrar inyecciones o proporcionar un producto terapeutico. Un experto en la tecnica reconocera que tambien pueden usarse con la presente invencion sistemas alternativos que tambien proporcionan la capacidad de proporcionar un tratamiento dirigido mediante la integracion de toma de imagenes y un sistema de administracion de cateter. Puede hallarse informacion con respecto al uso de NOGA y sistemas similares en, por ejemplo, Sherman (2003) Basic Appl. Myol. 13: 11-14; Patel y col (2005) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 130:1631-38; y Perrin y col. (2003) Circulation 107: 2294-2302; el texto de cada uno de los mismos se incorpora al presente documento en su totalidad. En otra realizacion, las celulas madre cardiacas aisladas se administran por una via de administracion intracoronaria. Un experto en la tecnica reconocera que pueden usarse con la presente invencion otras procedimientos utiles de administracion o implante, incluidos los descritos por Dawn y col. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3766-3771, el contenido del cual se incorpora al presente documento en su totalidad.

La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + de la presente invencion es util para el tratamiento de enfermedad cardiovascular, incluidas, pero sin limitacion, aterosclerosis, isquemia, hipertension, reestenosis, angina de pecho, cardiopatfa reumatica, defectos cardiovasculares congenitos, cardiomiopatfa relacionada con la edad e inflamacion arterial y otra enfermedad de las arterias, arteriolas y capilares. Espedficamente, los procedimientos de la presente invencion proporcionan la reparacion y/o la regeneracion de miocardio danado consecuencia de una o mas de las enfermedades enumeradas anteriormente o de la disminucion general de celulas de miocardio con la edad.

La presente invencion tambien abarca el uso para prevenir o tratar insuficiencia cardiaca en un sujeto que comprende administrar una poblacion de celulas madre cardiacas adultas CD271+ aislada al corazon de un sujeto y administrar un antagonista del receptor de angiotensina II. En una realizacion, la poblacion de celulas madre cardiacas adultas CD271+ se activa antes de su administracion mediante exposicion a una o mas citocinas como se describe en el presente documento. En otra realizacion, se administran una o mas citocinas al corazon para formar un gradiente quimiotactico que provoca que las celulas madre cardiacas adultas administradas migren a zonas de

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dano miocardico. En otra realizacion las, una o mas, citocinas son HGF, IGF-1 o variantes de las mismas. El sistema renina-angiotensina (RAS) es un sistema hormonal que facilita la regulacion de la presion sangumea y el volumen extracelular en el cuerpo. Cuando la perfusion renal se reduce, las celulas presentes en el rinon liberan la enzima renina. La renina escinde el angiotensinogeno, un peptido precursor inactivo segregado por el tngado, en angiotensina I. La angiotensina I se convierte subsiguientemente en angiotensina II (Ang II) mediante la enzima convertidora de angiotensina (ACE), que se encuentra predominantemente en los pulmones. La Ang II produce muchos efectos, incluidos vasoconstriccion y secrecion de aldosterona y vasopresina, mediante la activacion del receptor de AT1. La Ang II se ha implicado en la acumulacion dependiente de la edad del dano oxidativo en el

corazon (Fiordaliso y col. (2001) Diabetes 50: 2363-2375; Kajstura y col. (2001) Diabetes 50: 1414-1424), y se ha

informado que inducen senescencia y reduce el numero y la funcion de celulas progenitoras endoteliales (Kobayashi y col. (2006) Hypertens. Res. 29: 449-455). Ademas, la Ang II desencadena apoptosis en miocitos (Leri y col. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1326-1342) y puede contribuir a la progresion de insuficiencia cardiaca (McMurray y col. (2003) Lancet 362: 767-771). De hecho, la inhibicion de receptores de AT1 se ha demostrado que mejora el rendimiento clmico de pacientes con insuficiencia cardiaca cronica y prolonga la vida en seres humanos (McMurray y col. (2003) Lancet 362: 767-771).

La invencion proporciona procedimientos de prevencion de insuficiencia cardiaca y/o tratamiento de insuficiencia cardiaca cronica en un sujeto administrando un antagonista del receptor de Ang II en combinacion con la administracion de celulas madre cardiacas adultas al corazon del sujeto. Preferentemente, el antagonista del receptor de Ang II es un antagonista del receptor de AT1. Algunos ejemplos no limitantes de antagonistas del

receptor de Ang II que estanan abarcados por la invencion incluyen valsartan, telmisartan, losartan, irbesartan,

olmesartan, candesartan y eprosartan.

Ademas pueden administrarse inhibidores de enzima convertidora de angiotensina (ACE) adicionalmente o en lugar del antagonista del receptor de Ang II. Como se ha descrito anteriormente, la ACE convierte angiotensina I en angiotensina II. La inhibicion de esta enzima producina niveles reducidos de Ang II y, asf, reducina los efectos perjudiciales de Ang II sobre celulas madre cardiacas. Los inhibidores de ACE que pueden usarse en los procedimientos de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, venazepril, enalapril, lisinopril, captopril, fosinopril, ramipril, perindopril, quinapril, moexipril y trandolapril.

Los antagonistas del receptor de Ang II o inhibidores de ACE pueden administrarse al sujeto en dosis multiples subsiguientemente a la administracion de las celulas madre cardiacas adultas. Los antagonistas o inhibidores pueden administrarse en una agenda rutinaria durante un periodo de tiempo establecido. Por ejemplo, los inhibidores pueden administrarse una vez al dfa durante aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 12 meses o aproximadamente 24 meses despues de la administracion de las celulas madre cardiacas adultas. Pueden usarse otras agendas de dosificacion Un experto en la tecnica, particularmente un medico o cardiologo, sena capaz de determinar la dosis y la agenda apropiada para la administracion de los inhibidores de ACE o antagonistas del receptor de Ang II. Preferentemente, uno o mas smtomas de insuficiencia cardiaca se reducen o se alivian siguiendo la administracion de las celulas madre cardiacas y el antagonista del receptor de angiotensina II y/o inhibidor de ACE. Los smtomas de insuficiencia cardiaca incluyen, pero sin limitacion, fatiga, debilidad, ritmo cardiaco rapido o irregular, disnea, tos o jadeos persistentes, edema en las piernas y los pies e hinchazon del abdomen.

La invencion tambien comprende procedimientos para preparar composiciones, tales como composiciones farmaceuticas, que incluyen celulas madre adultas y/o al menos una citosina, por ejemplo, para usar en procedimientos de la invencion para tratar enfermedades cardiovasculares, insuficiencia cardiaca u otras afecciones cardiacas. En una realizacion, la composicion farmaceutica comprende celulas madre cardiacas humanas aisladas y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En un aspecto preferente, los procedimientos y/o composiciones, incluidas composiciones farmaceuticas, comprenden cantidades eficaces de celulas madre cardiacas humanas o dos o mas citocinas en combinacion con un agente farmaceutico apropiado util en el tratamiento de afecciones cardiacas y/o vasculares.

En un aspecto adicionalmente preferente, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se administran por inyeccion. Estas vfas de administracion incluyen, pero sin limitacion, administracion por via subcutanea o parenteral, incluidas intravenosa, intraarterial (por ejemplo, intracoronaria), intramuscular, intraperitoneal, intramiocardica, transendocardica, transepicardica, intranasal, asf como intratecal y tecnicas de infusion. En consecuencia, la composicion farmaceutica se encuentra preferentemente en una forma que es adecuada para inyeccion. Cuando se administra un producto terapeutico de la presente invencion por via parenteral, se formulara generalmente en una forma inyectable de dosis unidad (solucion, suspension, emulsion). Las formulaciones farmaceuticas adecuadas para inyeccion incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para reconstitucion en soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El vehnculo puede ser un disolvente o un medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y/o mediante el uso de tensioactivos. Como sistemas disolventes para composiciones de compuestos tambien pueden usarse vehuculos no

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acuosos tales como aceite de algodon, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de ir^z, aceite de girasol o aceite de cacahuete y sus esteres, tales como miristato de isopropilo. Adicionalmente pueden anadirse otros aditivos que mejoran la estabilidad, la esterilidad y la isotonicidad de las composiciones, incluidos conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevencion de la accion de microorganismos se puede asegurar mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico y similares. En muchos casos, sera deseable incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, cloruro de sodio o similares. La absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable se puede provocar mediante el uso de agentes retardantes de la absorcion, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Segun la presente invencion, no obstante, cualquier vetnculo, diluyente o aditivo usado tendna que ser compatible con los compuestos. Pueden prepararse soluciones inyectables esteriles incorporando los compuestos usados en la puesta en practica de la presente invencion en la cantidad requerida del disolvente apropiado con diversas cantidades de los otros ingredientes, si se desea.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, que por ejemplo comprenden una dosis terapeutica de celulas madre CD271+, pueden administrarse al sujeto en una formulacion inyectable que contiene cualquier excipiente compatible, tal como diversos vetnculos, coadyuvantes, aditivos y diluyentes; o los compuestos usados en la presente invencion pueden administrarse por via parenteral al sujeto en forma de implantes subcutaneos de liberacion lenta o sistemas de administracion dirigida tales como anticuerpos monoclonales, matrices polimericas iontoforeticas, liposomas y microesferas. Las composiciones farmaceuticas usadas en la presente invencion pueden administrarse por via oral al sujeto. Se pueden usar procedimientos convencionales tales como la administracion de los compuestos en comprimidos, suspensiones, soluciones, emulsiones, capsulas, polvos, jarabes y similares. Son preferentes tecnicas conocidas que suministran el compuesto por via oral o intravenosa y conservan su actividad biologica.

En una realizacion, una composicion de la presente invencion puede administrarse inicialmente y mantenerse despues mediante otra administracion. Por ejemplo, una composicion de la invencion puede administrarse en un tipo de composicion y despues posteriormente administrarse en un tipo diferente o en el mismo que la composicion. Por ejemplo, una composicion de la invencion puede administrarse mediante inyeccion intravenosa para llevar niveles de sangre a un nivel adecuado. Los niveles del sujeto se mantienen despues mediante una forma de dosificacion oral, aunque pueden usarse otras formas de administracion, dependiendo de la afeccion del sujeto. La cantidad de la composicion farmaceutica que se va a administrar variara para el sujeto que se va a tratar. En una realizacion preferente, 2 x 104 a aproximadamente 1 x 105 celulas madre cardiacas adultas y, opcionalmente, 50-500 pg/kg por dfa de una citosina o variante de dicha citosina se administran a un sujeto. No obstante, la determinacion precisa de que se considerana una dosis eficaz puede basarse en factores individuales en cada paciente, incluidos su tamano, edad, zona de miocardio danado y periodo de tiempo desde el dano. Asf, el experto puede determinar facilmente las dosificaciones y la cantidad de compuestos y aditivos, vetnculos y/o excipientes opcionales en composiciones que se van a administrar en procedimientos de la invencion. Normalmente, cualesquiera aditivos (ademas de la(s) celula(s) madre activa(s) y/o la(s) citocina(s)) estan presentes en una cantidad del 0,001 al 50 % en peso de solucion en solucion salina tamponada con fosfato, y el ingrediente activo esta presente en el orden de microgramos a miligramos, tal como aproximadamente del 0,0001 a aproximadamente el 5 % en peso, preferentemente de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 1 % en peso, del modo mas preferente de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 0,05 % en peso o de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 20 % en peso, preferentemente de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 10 % en peso, y del modo mas preferente de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 5 % en peso. Por supuesto, para cualquier composicion que se va a administrar a un animal o ser humano y para cualquier procedimiento de administracion particular, es preferentemente determinar, por lo tanto: toxicidad, determinando la dosis letal (DL) y DL50 en un modelo animal adecuado, por ejemplo, un roedor tal como un raton; la dosificacion de las composiciones, la concentracion de componentes en las mismas y la agenda de administracion de las composiciones, que produzcan una respuesta adecuada. Dichas determinaciones no requieren excesiva experimentacion a partir del conocimiento del experto, la presente divulgacion y los documentos citados en la misma. El tiempo para administraciones secuenciales puede determinarse sin una excesiva experimentacion. Los ejemplos de composiciones que comprenden un producto terapeutico de la invencion incluyen preparaciones lfquidas para orificio, por ejemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragastrico, mucosal (por ejemplo, perlingual, alveolar, gingival, mucosa olfatoria o respiratoria), etc., la administracion tal como suspensiones, jarabes o elixires; y preparaciones para administracion parenteral, subcutanea, intradermica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administracion inyectable), tal como suspensiones o emulsiones esteriles. Dichas composiciones pueden mezclarse con un vetnculo, diluyente o excipiente adecuado tal como agua esteril, solucion salina fisiologica, glucosa o similar. Las composiciones tambien pueden liofilizarse. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agente humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, sabores, colorantes y similares, dependiendo de la via de administracion y la preparacion deseada. Pueden consultarse textos estandar, tales como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL ScIeNcE", 17a edicion, 1985, que se incorpora al presente documento por referencia, para preparar preparaciones adecuadas sin una excesiva experimentacion.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se proporcionan de forma conveniente como preparaciones lfquidas, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones o composiciones viscosas acuosas isotonicas que

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pueden tamponarse a un pH seleccionado.

Obviamente, la eleccion de los vehnculos adecuados y otros aditivos dependera de la via exacta de administracion y de la naturaleza de la forma de dosificacion particular, por ejemplo una forma de dosificacion Kquida (por ejemplo si la composicion se formula en una solucion, una suspension, un gel u otra forma lfquida) o una forma de dosificacion solida (por ejemplo si la composicion se va a formular en una pfldora, un comprimido, una capsula, un comprimido oblongo, una forma de liberacion temporal o una forma rellena de lfquido). Las soluciones, las suspensiones y los geles contienen normalmente una cantidad principal de agua (preferentemente agua purificada) ademas del compuesto activo. Tambien pueden estar presentes cantidades secundarias de otros ingredientes tales como ajustadores del pH (por ejemplo, una base como NaOH), agentes emulsionantes o dispersantes, agentes tamponadores, conservantes, agentes humectantes, agentes gelificantes (por ejemplo, metilcelulosa), colorantes y/o aromas. Las composiciones pueden ser isotonicas, es decir, pueden tener la misma presion osmotica que la sangre o el fluido lagrimal. La isotonicidad deseada de las composiciones de la presente invencion puede realizarse usando cloruro de sodio u otros agentes farmaceuticamente aceptables tales como dextrosa, acido borico, tartrato de sodio, propilenglicol u otros solutos inorganico u organicos. El cloruro de sodio es preferente, en particular, para tampones que contienen iones sodio.

La viscosidad de las composiciones puede mantenerse al nivel seleccionado usando un agente espesante farmaceuticamente aceptable. Es preferentemente la metilcelulosa debido a que esta facilmente y economicamente disponible y es facil de manipular. Otros agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, goma xantana, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carbomero y similares. Puede usarse un conservante farmaceuticamente aceptable para aumentar la vida en almacenamiento de las composiciones. Puede ser adecuado el alcohol bendlico, aunque tambien pueden usarse una diversidad de conservantes que incluyen, por ejemplo, parabenos, trimerosal, clorobutanol o cloruro de benzalconio. Una concentracion adecuada del conservante sera del 0,02 % al 2 % en base al peso total aunque pueden existir variaciones apreciables en funcion del agente seleccionado. Los expertos en la tecnica reconoceran que los componentes de la composicion debenan seleccionarse para que fueran qmmicamente inertes con respecto al compuesto activo. Esto no presentara problemas a los expertos en principios qmmicos y farmaceuticos, o pueden evitarse facilmente problemas mediante la referencia a textos estandar o mediante experimentos sencillos (que no implican una experimentacion excesiva) a partir de la divulgacion y los documentos citados en la misma.

Las composiciones pueden administrarse en dosificaciones y mediante tecnicas bien conocidas por los expertos en las tecnicas medica y veterinaria tomando en consideracion factores tales como la edad, el sexo, el peso y la afeccion del sujeto particular, y la forma de composicion usada para administracion (por ejemplo, solida frente a lfquida). Las dosificaciones para seres humanos u otros mairnferos pueden determinarse sin una excesiva experimentacion por parte del experto a partir de la presente divulgacion, los documentos citados en la misma y el conocimiento en la tecnica. Los regfmenes adecuados para la administracion inicial y dosis posteriores o para administraciones secuenciales tambien son variables, pudiendo incluir una administracion inicial seguida por administraciones subsiguientes, pero de todas las maneras, pueden evaluarse por parte del experto a partir de la presente divulgacion, los documentos citados en el mismo y el conocimiento en la tecnica.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se usan para tratar insuficiencia cardiaca y enfermedades cardiovasculares, incluidas, pero sin limitacion, aterosclerosis, isquemia, hipertension, reestenosis, angina de pecho, cardiopatfa reumatica, defectos cardiovasculares congenitos e inflamacion arterial y otras enfermedades de las arterias, arteriolas y capilares o dolencias relacionadas. En consecuencia, la invencion implica la administracion de celulas madre adultas como se discute en el presente documento, solas o en combinacion con una o mas citocinas o variantes de dicha citosina, como se discute en el presente documento, para el tratamiento o la prevencion de una cualquiera o mas de estas afecciones u otras afecciones que implican enfermedades o trastornos cardiacos. Las vfas de administracion ventajosas implican aquellas mas adecuadas para el tratamiento de estas afecciones, tales como la via por inyeccion, que incluye, pero sin limitacion, administracion por via subcutanea o parenteral, incluidas intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intramiocardica, transendocardica, transepicardica, intranasal, asf como intratecal y tecnicas de infusion.

Aunque se han descrito anteriormente diversas realizaciones de la presente invencion, debena entenderese que se han presentado solo a modo de ejemplo y no de limitacion. Pueden realizarse numerosos cambios a las realizaciones divulgadas segun la divulgacion del presente documento sin apartarse del esprntu o el ambito de la invencion. Por lo tanto, la amplitud y el ambito de la presente invencion no debenan estar limitados por cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

Todos los documentos mencionados en el presente documento se incorporan al presente documento por referencia. Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente solicitud se incorporan por referencia para todos los fines en la misma medida que si se denotara individualmente cada publicacion o documento de patente individual. Por medio de la mencion de diversas referencias en el presente documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea “tecnica anterior” a su invencion. Las realizaciones de las composiciones y los procedimientos de la invencion se ilustran en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

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Los ejemplos no limitantes siguientes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invencion. Se apreciara que seran evidentes variaciones en proporciones y alternativas en elementos de los componentes mostrados para los expertos en la tecnica y estan dentro del ambito de realizaciones de la presente invencion.

Materiales y procedimientos

Abreviaturas y acronimos no estandares: medula osea (MO); unidad de formacion de colonias-fibroblasto (CFU-F); injerto de derivacion arterial coronaria (CABG); fraccion de eyeccion (FE); volumen diastolico final (EDV); volumen sistolico final (ESV); celula madre mesenquimal (MSC); celula mononuclear (MNC); medio acondicionado con celulas estromales de corazon de raton (MsHrtStr CM); infarto de miocardio (IM); MSC no adherentes (NA-MSC); factor de crecimiento de fibroblastos basico humano recombinante (rhbFGF).

Ratones: Se transplantaron celulas humanas a ratones NOD/SCID que se habfan sometido a ligacion arterial coronaria izquierda e induccion de infarto de miocardio (IM). Solo se estudiaron ratones macho de 2 meses de edad. Las cohortes fueron los siguientes: 1) 10 ratones inyectados con MSC humana; 2) 10 ratones inyectados con celulas CD271 + de MO.

Procedimiento de ligacion de la arteria coronaria izquierda: Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 5 % para la induccion y despues etomidato 20 mg/kg i.p. La intubacion endotraqueal se realizo y el raton se dispuso despues en un monitor cardiaco y se ventilo mecanicamente. La piel del sitio de toracotoirna lateral izquierda se preparo para la cirugfa y se cubrio de forma esteril usando solucion al 10 % de povidona yodada. Se uso una almohadilla termica para mantener los ratones calientes durante los producimientos para evitar la perdida de calor. Se aplico pomada oftalmica no medicada quirurgicamente esteril a los ojos preoperativamente para evitar el secado de la cornea.

Una vez se logro una sedacion adecuada, se abrio el pecho mediante toracotomfa lateral izquierda. La arteria coronaria izquierda se expuso y se ligo para producir un IM anterior. 10 minutos despues de la oclusion se infundio eritropoyetina (2-6 pg/kg) a traves de un cateter yugular interno. El pecho se cerro en capas con sutura absorbible 0 y 3,0 (para musculo) y se administro buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg s.c.) postoperativamente contra el dolor. Los ratones se vendaron y se mantuvieron en alojamientos aislados esteriles estandar en los que se recuperaron durante 3 a 4 dfas despues de la cirugfa. El control del dolor se logro con bupernorfina 0,05-0,1 mg/kg s.c. q12 h x 6 dosis. Se realizo un seguimiento estrecho (4 veces al dfa) de los animales para determinar dolor e infeccion en el periodo postoperatorio, buscando signos tales como anorexia, fracaso en la recuperacion, agresividad y respiracion laboriosa. Los animales que mostraron paralisis, ulceras abiertas, respiracion laboriosa o reticencia a moverse se retiraron del estudio y se sacrificaron.

Los ratones operados simuladamente que experimentaron todo menos la disposicion de la ligadura de la arteria coronaria sirven como controles. La mortalidad perioperativa fue baja en el grupo de simulacion (< 15 %) y ligeramente superior en las cohortes con infarto. De los ratones restantes, aproximadamente el 75 % sobrevivio al menos dos meses despues del IM. Los ratones se estudiaron normalmente durante cuatro semanas despues de la cirugfa.

Se administraron celulas madre mediante inyeccion intramiocardica usando una aguja de calibre 30. El dfa del infarto, mientras se abrio el pecho para la induccion de IM, las celulas se inyectaron directamente en el miocardio. Se administraron tres inyecciones de 100 pl.

Procedimiento para las mediciones hemodinamicas: El analisis hemodinamico de corazon intacto se realizo usando micromanometna de conductancia miniaturizada. Los animales se anestesiaron del modo siguiente: gas isoflurano seguido de etomidato 12 mg/kg i.p., uretano 600 mg/kg i.p. y morfina 1 mg/kg i.p. Se realizo la intubacion endotraqueal y el raton se dispuso despues en un monitor cardiaco y se ventilo mecanicamente. La vena yugular interna izquierda se expuso y se canulo con una aguja de calibre 30 para la administracion de los farmacos. Se inserto un cateter de presion-volumen de 4 electrodos (SPR-839, Millar Instruments Inc) en la arteria carotida derecha y se avanzo hacia el interior del ventnculo izquierdo. Las medidas de bucles de presion-volumen se realizaron en la lmea base y despues de la infusion de isoproterenol (1 a 100 ng/min). Por ultimo, se redujo la precarga pinzando la vena cava inferior mediante una incision toracica. Se realizo un seguimiento de la profundidad de la anestesia observando el movimiento de la pared del pecho, el ritmo cardiaco, la presion sangumea, el tono muscular y la percepcion de estfmulos. Al finalizar los experimentos, el animal (bajo una anestesia profunda como anteriormente) se sacrifico y se recogio el corazon para estudios biologicos moleculares futuros e inmunohistoqmmica.

Modelo de cardiomiopatia isquemica cronica: Se usaron minicerdos de Gottingen (25-30 kg, hembras, 10-12 meses de edad) y se sometieron a un modelo de animal grande de insuficiencia cardiaca isquemica. Para crear el modelo preclmico de cardiomiopatia isquemica cronica se administro al minicerdo quetamina para la induccion de anestesia, se realizo una intubacion endotraqueal y se administro isoflurano para el mantenimiento de la anestesia general. Se realiza un seguimiento continuo de los cerdos para determinar Bp no invasiva, el ritmo cardiaco, la temperatura, oximetna de pulso y capnograffa. Se realiza una incision longitudinal en el centro del cuello y se expusieron la arteria carotida comun derecha y la vena yugular interna. Se obtiene un control proximal y distal con bucles de vasos, y una funda de acceso vascular 7 Fr se dispuso despues tanto en la arteria carotida comun derecha como en la vena

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yugular interna derecha. Se obtuvieron bucles de presion-volumen con oclusion IVC antes y despues del IM. Se realizaron angiogramas coronarios izquierdos y derechos con un cateter JR 4. Despues, los minicerdos se sometieron a infarto de pared anterior experimental mediante la oclusion de globos de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) justo distal a la primera rama diagonal durante 2,5 horas. Se realizo un seguimiento en el cerdo para determinar arritmias y se inicio, si era necesario, un soporte vital cardiaco avanzado. Al completar la angioplastia con globo, la arteria carotida se repara con suturas de proleno 6-0 y la vena yugular interna se liga. La incision del cuello se cierra en 3 capas; la fascia, tejido subcutaneo y la piel se vuelven a aproximar con polisorb 3-0. El minicerdo se recupero despues y la cicatriz, normalmente un infarto transmural aproximadamente al 20 % del ventnculo izquierdo y localizado en la pared anteroseptal, se dejo curar durante 3 meses mientras el corazon experimentaba remodelacion.

Administracion de MSC de MO humanas o celulas CD271+ de MO humanas: A los 3 meses despues del IM, se administro al minicerdo quetamina para la induccion de anestesia, se dispuso en posicion supina en la mesa de operacion, se administro isoflurano por medio de una mascara, se realizo la intubacion endotraqueal y se continuo con isoflurano para mantener la anestesia general. Se obtuvo un acceso vascular de la arteria carotida izquierda y la vena yugular interna como se ha descrito anteriormente para realizar la evaluacion hemodinamica con bucles de presion-volumen. Se realizo una incision de toracotoirna lateral anterior en el 5°-6° espacio intercostal con un escalpelo del numero 10; los tejidos blandos se diseccionaron con electrocauterizacion para controlar la hemorragia; la pleura parietal se identifico; usando tijeras de Metzenbaum se abrio para penetrar en la cavidad pleural izquierda con cuidado de no danar el parenquima pulmonar; se uso un retractor de costillas para separar las costillas. Se identifico el pericardio y se realizo una incision longitudinal con tijeras de Metzenbaum con cuidado de que este anterior al nervio frenico y de no danar el miocardio. El corazon se expuso y se realizaron 10 inyecciones en la zona de la cicatriz y la zona periferica con una jeringa rellena con 0,5 cm3 de MSC o celulas CD271 + El volumen total inyectado fue de 5 cm3. Algunas zonas de hemorragia se controlaron con suturas con compresas. La incision de toracotomfa se cerro en tres capas con suturas de polisorb 2-0 con un tubo pectoral 18Fr para succionar por debajo del agua dispuesto en el aspecto lateral de la incision. Despues el cerdo se deshabituo al ventilador y se recupero. El tubo pectoral se retiro el dfa siguiente. Las cohortes fueron los siguientes: 1) Inyeccion de 200 millones de MSC a 3 meses post-IM (n=6); 2) Inyeccion de 2 millones de celulas CD271 + a 3 meses despues del IM (n=6).

Evaluacion de la funcion cardiaca: Los efectos de celulas CD271+ y MSC transplantadas se evaluaron con bucles de presion-volumen del ventnculo izquierdo y MR cardiaca seriada. La hemodinamica del ventnculo izquierdo (LV) se evaluo con un cateter transductor de presion-volumen Millar dispuesto en el LV durante la cateterizacion cardiaca antes y despues de IM agudo, en el momento de la inyeccion y en el sacrificio. Los datos de funcion cardiaca no invasiva concurrente se adquirieron usando un escaner Siemens 1.5T MRI. La MR cardiaca se ha convertido en una modalidad de toma de imagenes comprensible y muy precisa para evaluar la funcion general, la funcion regional, el tamano de la cicatriz y parametros de perfusion. Muchos consideran que la MR cardiaca es una ventanilla unica para la toma de imagenes del corazon ya que se evaluan numerosos parametros cardiacos con un estudio. El protocolo de MR cardiaca incluye imagenes de cine producidas por ECG, toma de imagenes de perfusion de gadolinio del primer pase, imagenes de MR etiquetadas e imagenes con hiperrealce tardfo. Los barridos de MR obtienen aproximadamente 1.200 imagenes del corazon que requieren un analisis despues del procesamiento amplio. Todas las imagenes se mantuvieron en el sistema WebPax de la Universidad de Miami y cada estudio se descargo a una estacion de trabajo Dell Precision 690. Se usaron dos programas informaticos aprobados por la FDA para el analisis, Segment (Medviso AB y Universidad de Lund, Lund, Suecia) y Diagnosoft (Cary, NC). Las imagenes de cine y con realce tardfo se analizaron usando el programa informatico Segment. Las imagenes etiquetadas y las imagenes de perfusion de primer pase se analizaron con el programa Diagnosoft para obtener la disfuncion circunferencial euleriana maxima y la subida miocardica y el area bajo la curva, respectivamente.

Sacrificio e histolog^a: A los 3 meses despues de la inyeccion de celulas todos los animales se sacrificaron bajo anestesia profunda como se ha discutido anteriormente. El corazon se detuvo mediante infusion central de 40 meq de cloruro de potasio que detuvo el corazon en diastole. Se recogio el corazon de los cerdos y se conservo en formaldehndo. Cada corazon se secciono en el eje corto y se analizaron biopsias del infarto, la zona periferica y la zona remota con microscopia confocal para determinar injerto y diferenciacion. Ademas, se realizo una necropsia de cuerpo entero a los cerdos para evaluar la formacion de tejido ectopico.

Ratones: Se usaron ratones NOD-SCID ya que son inmunodeficientes y un receptor apropiado de celulas madre humanas. La funcion cardiaca de ratones que se han sometido a IM fue menor que la de los ratones operados simuladamente dentro de un periodo de cuatro semanas despues de la cirugfa. En base a calculos se necesito incluir 8 ratones en cada cohorte para lograr una potencia de 0,90 y a = 0,05. No obstante, la mortalidad despues de IM para ratones de tipo silvestre fue de aproximadamente el 25 % a lo largo de las seis primeras semanas despues de la operacion. Asf, para realizar estudios de IM se usaron al menos 10 ratones para cada cohorte.

Cerdos: Se usaron minicerdos de Gottingen en estudios preclmicos debido a su anatomfa coronaria similar a un ser humano y en aproximadamente 12-15 meses de edad tiene una curva de crecimiento estable que los permite seguir en estudios de supervivencia a largo plazo con un crecimiento de confusion mmimo del corazon. Los calculos mostraron que era necesario incluir 6 cerdos en cada cohorte para lograr una potencia de 0,90 y a = 0,05.

Cirug^as en ratones: Las cirugfas en ratones se realizaron con precaucion para prevenir dolor y molestias. Como se

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ha indicado anteriormente, se usaron agentes apropiados durante cualquiera de los procedimientos quirurgicos para proporcionar anestesia y analgesia. Para la ligacion arterial coronaria, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 5 % para la induccion y despues etomidato 20 mg/kg i.p. El control del dolor se logro con buprenorfina 0,05-0,1 mg/kg s.c. q12 h. Ademas, la temperatura corporal del raton se mantuvo usando mantas termicas o lamparas. Aunque algunos ratones desarrollaron hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca debido a los diferentes procedimientos quirurgicos, se evaluaron ratones que experimentaron una perdida de peso excesiva, respiracion laboriosa, cianosis y falta de respuesta, y si era apropiado, se sacrificaron de forma temprana.

Cirug^as en cerdos: Todos los procedimientos en cerdos se realizaron con consciencia de prevencion de dolor y sufrimiento. Como se ha discutido anteriormente, todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia general. El dolor post-operatorio se controlo con una inyeccion postoperatoria de buprenofina 0,05-0,1 mg/kg subcutanea y un parche de 25 mcg de fentanila se dispuso en el dorso del cerdo durante 72 horas. El que en cualquier momento durante el transcurso del estudio un cerdo padeda sufrimiento se evaluo por el veterinario y el equipo de investigacion. Muchos casos de sufrimiento son debidos a una infeccion de la herida o los pulmones que puede gestionarse con antibioticos de uso oral o intramuscular.

Eutanasia: Estos procedimientos son coherentes con las recomendaciones de las 2007 American Veterinary Medical Association Guidelines on Euthanasia (directrices de la Asociacion veterinaria estadounidense sobre eutanasia).

Todos los cerdos y ratones se sacrificaron por una o dos indicaciones: 1) muestran un dolor o sufrimiento postoperatorio significativo que no se ha aliviado mediante analgesicos, antibioticos y otras medidas; 2) completan el periodo de tiempo disenado paa el estudio de fisiologfa. Los ratones se sacrificaron con una sobredosis de quetamina (150 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) y despues mediante dislocacion cervical. Los cerdos se dispusieron bajo anestesia profunda como se ha discutido previamente y el corazon se detuvo con 40 meq de cloruro de potasio.

Ejemplo 1: Comparacion de MSC de MO y celulas CD271+ de MO humanas en un modelo de raton (NOD/SCID) de infarto de miocardio.

Para analizar esto, se uso un modelo de raton de infarto de miocardio establecido mediante ligacion temporal a pecho abierto de la arteria coronaria descendiente anterior izquierda (LAD) en ratones NOD/SCID. Despues de 1 hora de isquemia se retiro la ligacion de sutura desde la LAD para permitir la repercusion total. Los ratones se aleatorizaron despues de un modo 1:1 a MSC de MO o celulas 271+ de MO humanas. Se usaron grupos adicionales de animales para establecer controles apropiados y comparaciones. Estos incluyen celulas derivadas de medula osea CD34+ y CD133+, que contienen celulas madre/progenitoras hemotopoyeticas y precursores endoteliales. Despues de la reperfusion, las celulas se inyectaron despues bajo vision directa a la zona de la cicatriz y a la zona periferica con un volumen inyectado total de 10 pl. Despues, se realizo un seguimiento de los ratones durante 8 semnanas mediante ecocardiograffa seriada para evaluar la eficacia de la terapia celular. A las 8 semanas despues de la inyeccion, los ratones se sometieron a evaluacion hemodinamica detallada, se sacrificaron y los corazones se recogieron para el analisis inmunohistoqmmico para determinar injerto y diferenciacion de celulas inyectadas.

Histopatolog^a: Despues de las mediciones hemodinamicas al final del estudio, el corazon del raton se perfundio con cloruro de potasio y fijadores para estudios inmunohistoqmmicos. Se midieron el peso del cadaver total, el corazon, el pulmon y el hugado y la longitud de la tibia para detectar hipertrofia del tejido ventricular no infartado. Se tineron secciones del corazon con hematoxilina y eosina para la inspeccion general. La fraccion de la circunferencia del ventnculo izquierdo tenido en secciones transversales de azul mediante Masson proporciona una medida del tamano del infarto.

Se realizo un seguimiento de las celulas madre diferenciadas mediante inmunotincion. Se detectaron celulas humanas dentro de los corazones de los ratones usando tincion con alu. La tincion para troponina I, a-actina sarcomerica, miocito cardiaco, desmina, a-actinina cardiaca, conexina-43, GATA-4, Nkx-2.5 y MEF2 indicaron miocitos. Se uso tincion con CD31 y vimentina para identificar celulas endoteliales, mientras que se usaron a-actina de musculo liso y SMA22 para identificar celulas de musculo liso. Asf, pueden identificarse todas las celulas resultantes de inyeccion de CD271 o MSC humanos y el potencial para que estas celulas regeneren linajes diferentes.

Una descripcion completa de la regeneracion cardiaca tambien inclrna la medicion total de numeros y tamano de celulas miodticas. El numero de miocitos por ventnculo izquierdo se estimo contando nucleos usando el procedimiento de Bruel y Nyengaard. Para medir el area de seccion transversal de miocitos se tineron rodajas con aglutinina de germen de trigo conjugada con fluorescema (Invitrogen) y Hoechst 33258. El volumen de los miocitos se calculo usando una combinacion de principios de Cavalieri y disectores. Alternativamente, pueden medirse miocitos individuales mediante microscopia confocal despues de disociacion aguda usando un programa informatico morfometrico. Para detectar la fibrosis asociada a remodelacion patologica, se tineron secciones con rojo sirio (colageno) y verde rapido (celulas). Los resultados se corroboraron mediante tricroirna de Masson. Para detector cualesquiera miocitos apoptoticos que podnan asociarse con remodelacion creciente, se tineron secciones embebidas con parafina usando el kit de deteccion de apoptosis in situ Apoptag Red (Millipore) basado en el procedimiento TUNEL indirecto. Otros ensayos incluyen inmunohistoqmmica con un anticuerpo espedfico para caspasa-3 escindida, deteccion mediante inmunotransferencia Western de escision de PKCd dependiente de

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caspasa y escalonado de ADN.

Estudios en ratones: Las celulas CD271 de MO inyectadas al corazon de ratones NOD/SCID siguiendo un IM experimental mejoran la fraccion de eyeccion (FE) y el acortamiento fraccional se comparo con placebo y celulas madre mesenquimales. De forma importante, las celulas CD271 fueron muy potentes mejorando FE y la mejora aumenta en tamano la camara del corazon en un grado superior a un numero muy superior de MSC cultivadas. La inyeccion de celulas CD271 tambien produce una contractilidad de miocardio mejorada en comparacion con el placebo, como se evidencia mediante la pendiente aumentada y el desplazamiento hacia la izquierda de la curva de presion-volumen sistolica final. Cuando se evaluan histologicamente, las celulas CD271 muestran un grado alto de injerto y evidencias de diferenciacion de miocitos, apoyando la idea de que la recuperacion cardiaca es debida a injerto celular en el miocardio danado. Estos estudios analizan definitivamente la hipotesis de que los precursores de MSC CD271 son capaces de diferenciacion de miocitos y vascular y que reparan el corazon danado en un grado superior a las MSC cultivadas.

Ejemplo 2: Comparacion de MSC de MO y celulas CD271++ de MO humanas en un modelo de cerdo de infarto de miocardio.

Se uso un modelo de animal grande de cardiomiopatfa isquemica cronica y bien establecido en este laboratorio (7, 8) para analizar si las celulas CD271 se injertan y se diferencian en miocitos, celulas endoteliales y celulas de musculo liso vasculares. Tambien se uso MRI cardiaco para analizar los efectos de celulas CD271 + sobre la funcion cardiaca, el tamano de la cicatriz y la perfusion miocardica Los inventores tienen una experencia amplia en la creacion de modelos de cardiomiopatfa isquemica en diversas razas de cerdos (8, 9). Para este estudio, 10 minicerdos de Gottingen adultos se sometieron a una angioplastia de globo de la arteria coronaria descendiente anterior izquierda durante 2,5 horas, dando como resultado un infarto transmural de la pared del septo anterior que abarcaba aproximadamente el 20 % del miocardio ventricular izquierdo, seguido por repercusion total despues de la deflacion del globo. Los animales se recuperaron despues y se continuo con MR cardiaca seriada mientras el corazon experimenta una remodelacion amplia. A los 3 meses despues del IM, los cerdos se aleatorizaron de un modo 1:1 para MSC de MO humanas o celulas CD271 + de MO humanas. Despues los animales teman una minitoracotoirna izquierda en la que se inyectaron celulas CD271+ derivadas de medula osea humana o MSC bajo vision directa con una aguja de calibre 22. Se ligaron con sutura todas las zonas de hemorragia. Despues se cerro el pecho y se continuo con MR cardiaca de forma seriada con los animales. Todos los minicerdos se inmunodeprimieron con ciclosporina A (CsA) de administracion oral para evitar el rechazo inmunitario de xenotransplante de celulas humanas en el corazon del cerdo (10, 11).

La eficacia de las celulas CD271+ se evaluo con toma de imagenes de resonancia magnetica cardiaca (MRI) de forma seriada. Esta modalidad de toma de imagenes permite el analisis fenotfpico detallado de la funcion cardiaca general, la funcion cardiaca regional usando HARP, el tamano de la cicatriz usando toma de imagenes con hiperrealce tardfo y subida de perfusion miocardica y area bajo la curva mediante perfusion de primer pase de gadolinio. A los 3 meses despues de la inyeccion, los animales se sacrificaron y los corazones se recogieron para el analisis inmunohistoqmmico para determinar injerto y diferenciacion de celulas CD271+. Se realizo una necropsia de cuerpo completo a cada animal para evaluar la formacion de tejido ectopico.

La evaluacion detallada de seguridad y eficacia se realizo en estos estudios animales como se describe (7-9). El objetivo general era establecer seguridad a largo plazo que incluye libertad de neoplasia o formacion de tejido ectopico y anadir a la base de datos en crecimiento que la administracion quirurgica aguda de celulas en el corazon con insuficiencia era segura. Ademas, en paralelo se realizaron estudios mecamsticos detallados usando toma de imagentes, evaluacion hemodinamica e inmunohistoqmmica para analizar la hipotesis de que la inyeccion de celulas CD271+ era muy eficaz en la creacion de remodelacion inversa en cardiomiopatfa isquemica cronica y que el mecanismo de este efecto era al menos en parte debido a injerto y diferenciacion celular.

Las celulas madre mesenquimales autologas producen remodelacion inversa en cardiomiopat^a isquemica cronica: El trabajo en este laboratorio en modelos de animales grandes con cicatrices totalmente curadas despues de infarto de miocardio mostro que la administracion de MSC puede mejorar significativamente la estructura ventricular izquierda e indices funcionales, lo que indica una reparacion significativa. Mediante la explotacion de esta experiencia con tecnicas de imagen se realizo un seguimiento de las mejoras fenotfpicas desencadenadas mediante implante de MSC en el modelo porcino de cardiomiopatfa isquemica cronica y se cuantificaron estos cambios morfometricamente. Se creo un IM en cerdo; despues de 12 semanas, el segmento de infarto se habfa reducido en espesor, dejando la cicatriz transmural. Se expandieron MSC autologas para cada animal, y estas celulas o placebo se administraron a la zona de infarto y periferica circundante en este momento. Durante otro periodo de seguimiento de 12 semanas, la MRI revelo que las inyecciones intramiocardicas de MSC no solo redujeron la carga de cicatriz (masa de LV) en 21,8 + 3,9 % (p < 0,05 frente a. placebo y semana 12 frente a semana 24), sino que tambien mejoraron significativamente la contractibilidad regional, la funcion de LV general, fraccion de eyeccion y flujo sangumeo miocardico. De forma importante, la terapia produjo remodelacion inversa y redujo la medida circunferencial de la cicatriz del infarto. El conjunto de efectos evidencia una reparacion muy eficaz en cardiomiopatfa isquemica.

Las celulas madre mesenquimales alogenicas restauran la funcion cardiaca en cardiomiopat^a isquemica cronica

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mediante capacidad de diferenciacion en tres linajes: La hipotesis se analizo para determinar si la reparacion cardiaca basada en MSC regenera el corazon mediante mecanismos que comprenden injerto a largo plazo y mediante diferenciacion tanto en elementos miocardicos como vasculares. Las MSC alogenicas se generaron a partir de donantes cerdos macho, y se administraron celulas de sexo desigual mediante inyeccion transendocardica en cerdo hembra 12 semanas despues del IM. Se continuo con los animales con MRI seriada, y 12 semanas mas tarde los corazones se recogieron para evaluacion inmunohistologica. El destino de las celulas de donantes macho se determino mediante colocalizacion de celulas de cromosoma Y (Ypos) con marcadores de linajes cardiacos, vasculares y endoteliales. Las MSC se injertaron en zonas de infarto y perifericas y se diferenciaron en cardiomiocitos determinados mediante colocalizacion con marcadores GATA-4, Nkx2.5 y a-actina sarcomerica. Ademas, las MSC Ypos muestran diferenciacion de celulas de musculo liso vascular y endotelial, lo que contribuye a la formacion de vasos grandes y pequenos. El numero de celulas que se injertan se correlaciona con los cambios funcionales que ocurren. La supervivencia de MSC a largo plazo, el injerto y la diferenciacion en linajes miocardico, vascular y endotelial se demostraron despues de transplante en miocardio cronicamente cicatrizado. La capacidad de estas celulas para cardiomiogenesis y vasculogenesis contribuye probablemente, en ambos casos, a su capacidad para reparar miocardio cronicamente cicatrizado.

Ejemplo 3: Analisis de celulas CD271++ en un ensayo clmico de pacientes con un IM que se someten a drug^a de derivacion y un ensayo ctfnico de celulas CD271++ en pacientes que se someten a drug^a de derivacion.

Se va a realizar un ensayo clmico de fase I/II [denominado "Prospective Randomized Study of CD271 + Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (Estudio prospectivo aleatorizado de tratamiento con celulas CD271 + en pacientes que se someten a cirugfa cardiaca)" (PROMETHEUS-II)]. Es un ensayo de doble ciego, aleatorizado, controlado por placebo, que compara celulas CD271+ con el placebo en 15 pacientes que se someten a cirugfa de derivacion. Los puntos finales de este ensayo son seguridad y eficacia. El punto final de eficacia usa toma de imagenes de resonancia magnetica (MRI) cardiaca para evaluar el tamano del infarto de miocardio, funcion ventricular izquierda (LV) general y perfusion de miocardio. Tambien se recoge un biorrepositorio de medula osea del paciente y muestras de sangre en circulacion para determinar biomarcadores que puedan predecir una respuesta exitosa al tratamiento. Los productos celulares CD271+ usados en este ensayo se aislaron en el Cell Manufacturing Program (programa de fabricacion de celulas) que se facilita en la Universidad de Miami. La celula CD271+ para su uso en este ensayo es una celula madre adulta derivada de medula osea que es un precursor de MSC.

Datos preliminares del ensayo clmico: Celulas autologas transendocardicas en ensayo de insuficiencia cardiaca isquemica (TAC-HFT): La TAC-HFT es un estudio de fase I/II, aleatorizado, de doble ciego que esta aprobado por la Food and Drug Administration (Agencia de alimentos y medicamentos de Estados Unidos) para la inscripcion en 2009. Este estudio inscribira a 60 pacientes con disfuncion ventricular izquierda isquemica cronica (FE entre el 20-50 %) secundaria respecto a un infarto de miocardio. Se uso el cateter de infusion de helice (BioCardia, San Jose, CA) para la administracion mediante inyecciones transendocardicas de: MSC, medula osea completa o placebo durante la cateterizacion cardiaca.

El ensayo TAC-HFT se diseno para que se inscribieran 8 pacientes como una serie abierta en fase con datos de seguridad establecidos preliminares antes de la fase de doble ciego aleatorizada de 60 pacientes. Estos primeros 8 pacientes recibieron o bien medula osea completa (n=4) o bien celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea de un modo no ciego. Los ocho pacientes toleraron las inyecciones de celulas madre sin ningun evento adverso importante, permitiendo la fase de doble ciego a pacientes inscritos subsiguientemente. Dado que los primeros ocho pacientes recibieron todos inyecciones celulares, se analizaron sus imagenes por MR cardiaca. Las imagenes de cine y las imagenes con realce tardfo se analizaron usando el programa informatico Segment (Medviso AB y Universidad de Lund, Lund, Suecia) y las imagenes cardiacas etiquetadas se analizaron usando el programa informatico HARP (Diagnosoft, Inc.). Los datos preliminares de estos pacientes revelan que en 6 meses despues de la inyeccion de celulas madre, mejoras en la funcion general demostraron una reduccion en volumen diastolico final del 11,2 ± 3,4 % (p < 0,05), una reduccion del 13,5 ± 4,2 % (p < 0,01) en volumen sistolico final y un aumento promedio en la fraccion de eyeccion de 4,9 ± 6,7 %. En imagenes con realce tardm, el tamano de la cicatriz como porcentaje de masa ventricular izquierda se redujo un promedio del 13,3 ± 7,2 % (p = 0,06). Las imagenes de MR etiquetadas mostraron una mejora regional en contractilidad en la zona de infarto y la zona periferica demostrada mediante disfuncion circunferencial euleriana. Estos datos muestran que las MSC son seguras, mejoran la funcion cardiaca, apoyan la remodelacion inversa y reducen el tamano de cicatriz.

Estos datos se establecieron de forma precedente ya que ninguna otra estrategia terapeutica logra este grado de remodelacion inversa acompanada de la reduccion real de la cicatriz miocardica. Estos hallazgos, excitantes, apoyan significativamente el imperativo de investigacion clmica acelerada en este campo.

Un Estudio aleatorizado, doble ciego, controlado por placebo, de escalado de dosis de celulas madre mesenquimales humanas adultas intravenosas (proquimales) despues de infarto de miocardio agudo: Los datos de seguridad y eficacia del estudio de fase I de 53 pacientes inscritos se publicaron recientemente en el Journal of the American College of Cardiology (18) y proporcionaron datos de seguridad fundamentales de MSC alogenicas. En este ensayo, pacientes con IM agudo reperfundido se aleatorizaron a una infusion intravenosa unica de placebo o MSC aislada de medula osea obtenidas a partir de un donante no relacionado unico que no coincidfa en antfgeno

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leucocftico humano con los receptores. Las tasas de eventos adversos fueron similares en los tratados con hMSC (5,3 por paciente) y los tratados con placebo (7,0 por paciente). Los registros de ECG ambulatorio demostraron un numero reducido de episodios de taquicardia ventricular en pacientes tratados con hMSC en comparacion con el placebo. La ecocardiograffa en pacientes con IM mostraron una fraccion de eyeccion mejorada en pacientes tratados con hMSC. De forma importante, este ensayo proporciono datos de seguridad fundamentals para el uso de MSC alogenicas en cardiopatia isquemica.

Se han obtenido datos de seguridad y de eficacia preclinicos adicionales a partir del laboratorio del inventor (7, 8, 15) en una diversidad de razas de modelos porcinos con IM agudo y cronico. La inyeccion de MSC mediante cateter en tejido infartado reduce el tamano del infarto de miocardio mejora la funcion de LV general y regional, normaliza la energfa cardiacas y restaura la perfusion del tejido (7, 8, 16).

Aislamiento de celulas CD271+ de MO humana normal: Se obtuvieron aspirados de medula osea a partir de la cresta ilfaca del paciente bajo sedacion consciente y analgesia local por un hemotologo/oncologo experimentado. Las celulas mononucleares de MO se aislaron usando centrifugacion de gradiente de densidad y despues las celulas se marcaron con microperlas unidas a un anticuerpo a CD271 y las celulas CD271 + se aislaron con el dispositivo clmico CliniMACS (Miltenyi Biotech, Colonia, Alemania). Las celulas se lavaron despues y se prepararon para la infusion. Este proceso precisa de aproximadamente 4 a 5 horas. Todas las celulas CD271 + (1-5 M) se usaron para la inyeccion al paciente.

El trabajo previo de este laboratorio ha demostrado la fiabilidad de celulas CD271+ aisladas. Las celulas CD271+ se aislaron de celulas de medula osea de donante normal usando un etiquetado indirecto de celulas con microperlas anti-CD271-APC y anti-APC. La mediana en el numero de celulas de MNC de MO inicial fue de 1,4 x 108 celulas nucleadas (intervalo de 2,9 x 107 a 3,3 x 108, N=7) dando como resultado una mediana de 4,2 x 105 celulas CD271 + despues de la seleccion (intervalo de 3,9 x 104 a 9,4 x 105). Esto representa una frecuencia del 0,3 % de celulas CD271+ en el producto de MNC de MO. Las celulas CD271+ aisladas demostraron una morfologfa primitiva con una relacion citoplasma con respecto al nucleo baja. Cuando se dispusieron en cultivo lfquido, las celulas CD271 + formaron mSc en un periodo de 7 dfas, mientras que las MNC de MO completas formaron menos MSC. La generacion de MSC de celulas CD271+ se comparo con celulas CD271 y mientras 170.000 celulas CD271 + generaron MSC significativamente despues de 7 dfas de cultivo en un matraz T162 cm2, cien veces mas celulas CD271 (1,7 x 107 celulas en un matraz T162 cm2) no pudieron generar MSC significativamente en 7 dfas. Habfa algunas celulas adherentes en el cultivo de celulas CD271, pero estas parecieron ser celulas endoteliales no MSC. Las celulas CD271+ se enriquecieron para CFU-F, con 1 en 222 celulas CD271+ formando CFU-F en comparacion con 1 en 12.500 MNC de MO. Tambien la fraccion negativa de CD271 contema muy pocas CFU-F con menos de 1 en 100.000 celulas.

Administracion de celulas: Al completar la cirugfa de derivacion de arteria coronaria, las celulas CD271+ de MO o placebo se inyectaron por el cirujano cardiaco bajo vision directa a traves del epicardio a la zona de cicatriz y la zona periferica. Algunas zonas de hemorragia se controlaron con suturas con compresas.

MRI cardiaca: Este grupo tiene una experiencia amplia en la determinacion de la estructura y la funcion cardiaca mediante explotacion de tecnicas de imagen no invasivas de borde del corte (17, 19, 20). Se uso MR cardiaco para evaluar la eficacia de la terapia celular. La funcion miocardica, la perfusion de tejido y la determinacion no invasiva del tamano del infarto se determinaron mediante etiquetado de tejido en fase armonica (HARP), cinetica de absorcion de gadolinio y protocolos de MRI de realce de contraste tardfo, respectivamente. Los pacientes se tumban en posicion supina sobre la mesa magnetica y se obtienen todas las imagenes manteniendo la respiracion a 12-15 de ritmo cardiaco hasta la expiracion final, promediando 10-15 s con periodos de descanso adecuados entre intervalos sin respirar (10-15 s). El protocolo de toma de imagenes incluyo en primer lugar imagenes de exploracion sagitales, axiales y oblicuas para localizar el corazon. Se estima que cada sesion de MRI dura 45-60 min. Para determinar la funcion miocardica se realizaron protocolos de etiquetado de tejidos como se ha descrito previamente. El protocolo se baso en secuencia de pulsos de eco de gradiente rapido desencadenada por ECG que dio como resultado una separacion etiquetada de 6 mm del miocardio. Este procedimiento proporciona la mocion cuantitativa y parametros de disfuncion sobre una base regional que pueden usarse para la comparacion a lo largo de sujetos en diferentes puntos temporales despues de la intervencion, proporcionando de este modo un procedimiento rapido y repetible para evaluar la funcion de LV seriada y cuantitativa. Despues, los pacientes recibieron una inyeccion intravenosa en embolada de 0,2 mmol/kg de gadolinio-DTPA. Las imagenes con realce tardfo de alta resolucion se obtuvieron a partir de ocho a diez secciones transversales de eje corto del LV (asegurando la cubricion cardiaca completa) usando una recuperacion de inversion preparada de secuencia de eco de gradiente rapido accionada. Se ha mostrado que las regiones hiperaumentadas adquiridas obtenidas con este procedimiento estaban dentro del 10 % del tamano del infarto medido post-mortem mediante tincion con cloruro de trifenil-tetrazolio (TTC), indicando este procedimiento, por lo tanto, un modo muy preciso para determinar el tamano del infarto (19).

Ejemplo 4: Potencial cardiaco de celulas precursoras de MSC CD271+ de medula osea

Procedimientos

Aislamiento de celulas CD271+: Se obtuvieron aspirados de medula osea (25 a 50 ml) de AllCells LLC (Emeryville,

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CA) bajo consentimiento informado apropiado y aprobacion por IRB . Las celulas de medula osea (MO) se diluyeron 1:1 con PBS + 1 % de FCS y se formaron capas sobre ficol para aislar la fraccion celular mononuclear de baja densidad (MNC). Las MNC se etiquetaron despues con microperlas CD271 (Miltenyi Biotech, Colonia, Alemania) y las celulas CD271 + se aislaron usando un dispositivo de seleccion celular MiltenyiMACS (VarioMACS) segun procedimientos recomendados por los fabricantes. Las celulas CD271 + se contaron y se prepararon citospinas para el analisis morfologico.

Aislamiento y expansion de celulas madre mesenquimales (MSC): Se aislaron MNC de MO como se ha descrito anteriormente y las celulas se cultivaron en matraces de cultivo T162 cm2 en 1 a 3 millones de MNC por ml de alfa- MEM que contema el 20 % de FBS mas el 1 % de glutamina, penicilina y estreptomicina. El medio se cambio cada 3 a 4 dfas sin descartar las celulas no adherentes. Los MSC crecieron como celulas adherentes sobre la superficie de los matraces y los cultivos se pasaron cuando habfa confluencia usando tratamiento con tripsina. Las MSC se recogieron en el pasaje 4 o 5 y se congelaron en nitrogeno lfquido. Antes de la inyeccion las celulas se descongelaron y se lavaron.

Ensayo de CFU-F: El potencial clonegenico de MNC de MO, celulas CD271 + y CD271 se evaluo usando el ensayo de unidad de formacion de colonias-fibroblasto (CFU-F). Las celulas se plaqueron en placas de 35 mm en 2 ml de medio estimulante de celulas madre mesenquimales mas suplementos (Stem Cell technologies, Vancouver, Canada). Se plaqueron celulas en densidades celulares diferentes que vanan de 10.000 celulas por placa hasta 1 millon de celulas por placa. Se cultivaron cultivos a 37 °C en CO2 al 5 % durante 10 dfas y despues se tineron con tincion de Giemsa y se clasificaron usando un microscopio de diseccion. Normalmente las colonias de CFU-F tienen entre 1 y 8 mm en diametro y pueden clasificarse macroscopicamente.

Induccion y evaluacion del potencial de diferenciacion adipodtica y osteogenica: Las celulas CD271 + se cultivaron en condiciones no adherenbtes en bolsas de teflon y las celulas se recogieron y se plaquearon en placas de cultivo celular de 6 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para ensayos de diferenciacion. La diferenciacion adipocftica se indujo cultivando estas celulas en medio NH AdipoDiff (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, Estados Unidos) a una concentracion de 5 x 104 celulas/ml durante 2 semanas. Estas celulas se usaron para la tincion de gotas de lfpidos usando aceite rojo O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La diferenciacion osteogenica se indujo cultivando estas celulas en medio NH AdipoDiff (Miltenyi Biotec Inc.) a una concentracion de 3 x 104 celulas/ml durante 3 semanas. Despues, las celulas se tineron con comprimido de sustrato tamponado SIGMA FAST BCIP/NBT (Sigma) para detectar su expresion de fosfatasa alcalina (AP), una enzima que esta implicada en la mineralizacion de la matriz osea. Las celulas que se cultivaron en alfa-MEM durante este periodo se usaron como controles.

Modelo animal, infarto de miocardio y transplante celular. Todos los experimentos sobre animales vivos se realizaron segun el protocolo aprobado mediante el programa de cuidado y uso de animales en la Universidad de Miami. Los animales se anestesiaron usando inhalacion de isoflurano mediante intubacion endotraqueal (1-2 %) mientras se controlaban niveles de anestesia con la temperatura del cuerpo y el ritmo cardiaco. Se uso bupernorfina (0,3 mg/kg, inyeccion SQ) en periodos prequirurgicos y postquirurgicos (Q6 horas) para la gestion del dolor. Usando una toracotoirna anterior izquierda se expuso el corazon de ratones hembra NOD/SCID (NOD/SCID; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) de 8-10 semanas de edad y la arteria LAD se ligo permanentemente con sutura de proleno 7-0. El infarto se confirmo mediante blanqueo visual distal a la ligacion y elevacion del segmento ST en electrocardiograma (ECG). El primer ECG de seguimiento se uso 48 horas despues de la cirugfa como un criterio de inscripcion para el estudio, por lo que todos los animales teman un IM de igual tamano. Se establecieron cuatro grupos experimentales que consistfan en animales que recibieron inyecciones de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) como control; celulas CD271+ (1,2 x 105 celulas), MSC de MO humanas en dos dosis diferentes de 1,2 x 105 (dosis baja) o celulas 1 x 106 (dosis alta). Inmediatamente despues del infarto, cada animal recibio tres inyecciones (10 pl/inyeccion) de PBS o celulas en los lfmites y el centro de la region infartada usando una aguja de calibre 30. La mortalidad quirurgica fue del 11,5 % y la mortalidad en las primeras 48 horas despues de la inyeccion celular fue del 5 % (la mortalidad total para el tiempo periquirurgico es del 16,5 %). Ocho semanas despues del transplante, los animales se sacrificaron y los corazones se prepararon para el analisis inmunohistologico.

Ecocardiografia: Se realizo un seguimiento de la funcion cardiaca mediante el sistema de imagenes Vevo 770 (VisualSonic Inc., Toronto, Canada) en lmea base antes de la cirugfa, 48 horas, 1, 2, 4 y 8 semanas despues del infarto y la inyeccion celular. Las imagenes se registraron bajo anestesia con inhalacion de isoflurano (1-2 %) a ritmos cardiacos superiores a 400 lpm y temperaturas corporales de (37 ± 10 °C). Se calcularon los parametros de estructura del corazon y anatomfa que inclrnan volumen diastolico final (EDV), volumen sistolico final (ESV) y fraccion de eyeccion (FE) usando imagenes bidimensionales.

Analisis de bucle de presion-volumen: Ocho semanas despues de la inyeccion de celulas y usando el enfoque de carotida derecha progreso un cateter monometrico de conductancia Millar (SPR 839) (Millar Instruments, TX) al ventnculo izquierdo. Durante el procedimiento, se infundio una solucion de albumina al 6,25 % diluida en la vena yugular a una velocidad de 5 pl/min y se obtuvo la anestesia con inhalacion de isoflurano al 1-2 % a traves de intubacion traqueal. Los datos de presion-volumen se obtuvieron usando el sistema MPVS Ultra (Millar Instruments, TX) en lmea base y despues de la oclusion de la vena cava inferior (IVC). La calibracion del volumen se realizo usando un procedimiento de cubeta e infusion de solucion salina hipertonica.

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Preparacion del tejido e histopatolog^a: Despues de finalizar los registros de bucles de PV, se recogieron los corazones y se perfundieron durante 10 minutos con solucion de cloruro de potasio 20 pM y formalina al 10 % en 1 ml/min a traves de canulacion aortica para fijar los corazones en diastole. Los corazones se partieron en rodajas y los cortes de histiolog^a se tineron con Mason Trichrome (TM) y H&E o se usaron para inmunohistoqmmica.

Se usaron sondas de ADN espedficas humanas (Human Alu Probe, BioGenex, CA) y el procedimiento de hibridacion in situ de fluorescencia (FISH) para realizar un seguimiento de celulas humanas inyectadas en el tejido de raton (conjugado de anti-fluorescefa-HRP, Perkin Elmer, Boston, MA). Las muestras de corazon fetal humano y de ratones inyectados con PBS se usaron como controles positivo y negativo respecticamente. Las rodajas tenidas con Alu se escanearon con un escaner de laser fluorescente Zeiss y las imagenes se analizaron usando un programa informatico de vision Mirax a un aumento de 20 X. Las imagenes se tomaron por separado y se combinaron usando Adobe Photoshop CS3 y las celulas positivas se contaron en dos zonas separadas del mismo corte.

Inmunohistoqumica: Las muestas se tineron con anticuerpos espedficos cardiacos, alfa actina sarcomerica (a-SA) (Sigma, St. Louis, MO), troponina I (Tnl) (Abcam, Cambridge, MA) y conexina 43 (Cx43) (Santa Cruz, CA). Se uso tincion con laminina (Abcam) para delinear celulas. Las muestras tenidas se estudiaron en primer lugar mediante microscopfa inmunofluorescente y despues microscopio confocal Zeiss LSM710 para preparar imagenes.

Analisis estad^stico: Los datos se analizaron usando el programa informatico Graph Pad Prism y los valores se expresaron como promedio ± error tfpico de media (SEM). Se uso analisis de varianza con mediciones repetidas (ANOVA de dos vfas con ensayo de Bonferoni post hoc para analizar datos de eco y ANOVA de una via para comparar datos hemodinamicas terminales con ensayo de comparacion multiple de Newman-Keuls post hoc.

Resultados

Aislamiento de celulas CD271+ de MO humana normal: Las celulas CD271 + se aislaron de celulas de MO de donante normal usando un etiquetado indirecto de celulas con microperlas anti-CD271-APC y anti-APC. La mediana en el numero de celulas de MNC de MO inicial fue de 1,4 x 108 celulas nucleadas (intervalo de 2,9 x 107 a 3,3 x 108, N=7) dando como resultado una mediana de 4,2 x 105 celulas CD271 + despues de la seleccion (intervalo de 3,9 x 104 a 9,4 x 105). Esto representa una frecuencia del 0,3 % de celulas CD271 + en el producto de MNC de MO. Las celulas CD271 + aisladas demostraron una morfologfa primitiva con una relacion citoplasma con respecto al nucleo baja (figura 1).

Cuando se dispusieron en cultivo lfquido, las celulas CD271+ formaron MSC en un periodo de 7 dfas (figura 2A), mientras que las MNC de MO completas formaron menos MSC (figura 2B). La generacion de MSC a partir de celulas CD271+ se comparo con celulas CD271 y mientras 170.000 celulas CD271+ generaron MSC significativamente despues de 7 dfas de cultivo en un matraz T162 cm2, cien veces mas celulas CD271 (1,7 x 107 celulas en un matraz T162 cm2) no pudieron generar MSC significativamente en 7 dfas (figura 2C). Como se muestra en la figura 2C habfa algunas celulas adherentes en el cultivo de celulas CD271, pero estas parecieron ser celulas endoteliales no MSC.

Las celulas CD271+ se enriquecieron para CFU-F (figura), con 1 en 250 celulas CD271+ formando CFU-F en comparacion con 1 en 12.500 MNC de Mo. Tambien la fraccion negativa de CD271 contema muy pocas CFU-F con menos de 1 en 100.000 celulas.

Cultivo in vitro de celulas CD271+ en condiciones no adherentes: Las celulas CD271+ se cultivaron en condiciones de cultivo no adherentes en bolsas de teflon durante 1 a 3 meses y las etapas tempranas de crecimiento se presentan en la figura 4. El medio para estos cultivos consistfa en alfa-MEM + 20 % de FCS con 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basicos humanos recombinantes (rhbFGF). En la primera semana pudieron observarse agrupaciones de celulas formadas por algunas celulas sobre la superficie de la bolsa de teflon de forma similar en morfologfa a MSC adherente a plastico. Se masajearon las bolsas para separar las celulas adherentes y el medio se cambio semanalmente. Las agrupaciones de celulas continuaron proliferando y formaron esferas como se muestra en la figura 4 desarrollandose esferas grandes el dfa 21. Estas celulas se analizaron despues de 4 semanas en cultivo por citrometna de flujo y la figura 5 muestra que la mayor parte expreso CD105, un marcador MSC tfpico.

El potencial de diferenciacion adipodtico y osteoblastico de las celulas CD271+ cultivadas en condiciones no adherentes tambien se evaluo. Las celulas se recogieron de las bolsas de cultivo y se plaquearon en placas de cultivo celular de 6 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para ensayos de diferenciacion. Como se muestra en la figura 6, las celulas CD271+ cultivadas se diferenciaron tanto en adipocitos como en osteoblastos.

Las celulas tambien se cultivaron en condiciones de cultivo de MSC tfpicas, es decir cultivo en matraces de cultivo tisular con medio alfa MEM mas el 20 % de FCS. Las esferas mostradas en la figura 4 se unieron a la superficie del plastico de los matraces y las MSC crecieron a partir de las esferas y formaron cultivos confluentes despues de 1 a 2 semanas.

Estos resultados demostraron que las celulas CD271+ cultivadas en condiciones no adherentes forman esferas de celulas que son CD105+, tienen potencial de adipositos y osteoblastos y forman celulas similares a MSC adherentes

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al plastico con propiedades de MSC.

Usando el medio acondicionado por celulas estromales de raton derivadas de tejido cardiaco (MsHtStr CM) se evaluo el potencial cardiaco de celulas CD271 + cultivadas en condiciones no adherentes durante 2 semanas. La MSC no adherente (NA-MSC) expreso alfa-actinina sarcomerica, Nkx2.5 y conexina-43, GAT-4 y N-cadherina (figura 7). Estos resultados demuestran que las celulas CD271 + tienen el potencial de diferenciarse en celulas cardiacas, asf como adipocitos y osteoblastos y evidencian que las celulas CD271+ tienen un potencial de diferenciacion superior en comparacion con MSC generadas como celulas adherentes al plastico. Ya que CD271 es un receptor neuronal se propuso que estas celulas tambien pueden poseer potencial de diferenciacion neuronal y actualmente se llevan a cabo experimentos para evaluar esta cuestion.

Potencial in vivo de celulas CD271+de MO: Para evaluar el potencial cardiaco in vivo de celulas CD271+ de MO, celulas CD271+ humanas aisladas recientemente se inyectaron en corazones infartados de ratones NOD/SCID. La lesion de IM produjo una dilatacion y una disfuncion ventricular dependiente del tiempo (figura 8). El efecto inicial de infarto entre todos los grupos fue igual. La comparacion de volumen ventricular en la diastole final (EDV) (figura 8) mostro una remodelacion inversa marcada en los ratones tratados con celulas CD271+ (112,8 ± 13,6 jl) en comparacion con el control (128,1 ± 15,7 jl)(P=0,02). El grupo tratado con CD 271 tambien lo hizo marcadamente mejor que animales tratados con una dosis igual de MSC (dosis baja; 145,5 ± 14,9 jl) (p=0,0001) pero similar a animales tratados con la dosis alta de MSC (116,5 ± 14,5 jl). Se demostro una respuesta de dosis en los animales tratados con MSC con una diferencia significativa entre animales tratados con la dosis baja de MSC en comparacion con la dosis alta (p=0,0001). Las mismas tendencias resultaron en el volumen sistolico final (ESV): los animales tratados con CD 271 teman un ESV significativamente inferior (81,5 ± 12,4 jl) en comparacion con animales de control (119,7 ± 17,8 jl, p<0,0001) y animales tratados con MSC de dosis baja (117,1 ± 13,4 jl, p<0,0001) pero no los animales tratados con MSC de dosis elevada (91,2 ± 12,6 jl). Los animales tratados con CD 271 mostraron una fraccion de eyeccion (FE) superior al final de 8 semanas (32,3 ± 3,7 %) en comparacion con animales tratados con control (17,6 ± 4,1 %, p<0,0001) y animales tratados con MSC de dosis baja (19,7 ± 3,1 %, p=0,0005) pero no animales tratados con MSC de dosis alta (24,7 ± 2,9 %).

Analisis de bucle de presion-volumen: La evaluacion hemodinamica de corazones tratados y de control se realizo 8 semanas despues de la inyeccion. Se uso manometna de conductancia mediante enfoque de transcarotida. La elastancia arterial (Ea) se calculo y los ratones tratados con CD271 teman una Ea mas baja (3,0 ± 0,2 mm de Hg/jl) en comparacion con animales de control (4,7 ± 0,2 mm de Hg/jl, p<0,05), pero no se diferenciaba significativamente a ratones tratados con dosis bajas o altas de MSC (4,3 ± 0,6 y 3,5 ± 0,4 mm de Hg/jl, respectivamente). La constante de relajacion isovolumica (Tau_ Weiss) mostro propiedades diastolicas mejoradas de corazones con CD271 (12,3 ± 0,8 ms) que los controles (15,2 ± 1,0 ms, p<0,05).

Inmunohistoqumica: Secciones de tejido de corazones de animales tratados con celulas CD271+, MSC y placebo se tineron con sondas de Alu espedficas humanas 8 semanas despues de la inyeccion. Como se muestra en las figuras 9A-9D, los animales inyectados con celulas CD271+ demostraron la presencia de celulas humanas en zonas remotas o perifericas de los corazones. Un gran numero de celulas humanas se detectaron bien embebidas en la pared vascular o entre celulas del huesped. Ademas, algunos cardiomiocitos fueron positivos para Alu y las celulas positivas a Alu expresaron troponina I (figura 9B) y alfa-actinina de musculo liso (figura 9D). Esto evidencia algun potencial de diferenciacion cardiaca de celulas CD271+. Tambien se detectaron celulas humanas en los corazones de animales inyectados con la dosis alta de MSC y de nuevo estas celulas estaban embebidas en la pared vascular o entre cardiomiocitos del huesped No hubo deteccion de cardiomiocitos tenidos con Alu o la expresion de marcadores cardiacos en celulas positivas a Alu en los corazones de animales inyectados con la dosis alta de MSC.

Discusion

Las celulas CD271+ estaban presentes en una frecuencia baja en celulas de MO que consistfan en el 0,3 % de la poblacion de MNC de MO. Usando reactivos y dispositivos de seleccion de Miltenyi MACS, se aislo una poblacion muy purificada de celulas CD271+ que teman una pureza superior al 90 % con una recuperacion promedio de 4,2 x 105 celulas a partir de 25 cm3 de aspirado de MO. La morfologfa de las celulas CD271+ demostro un fenotipo primitivo de blastocitos uniformes que consistfan en una relacion citoplasma con respecto al nucleo. Los datos confirmaron que el enriquecimiento de celulas formadoras de MSC en la poblacion de CD271+ con un nivel 60 veces superior de CFU-F en celulas CD271+ en comparacion con MNC de MO. Ademas, la frecuencia de CFU-F en poblaciones negativas a CD271 se redujo ampliamente a 1 en 100.000 celulas en comparacion con 1 en 12.500 en la poblacion de MNC de MO y 500 veces inferior a la poblacion de CD271+. Las MSC generadas a partir de celulas CD271+, mediante adherencia a matraces de plastico, presentaron identicas propiedades in vitro que las MSC generadas a partir de MNC de MO con expresion de CD105+ y capaces de formar adipositos y osteoblastos in vitro. Estudios previos han demostrado que el potencial de MSC reside en la poblacion de celulas CD271+CD45. Ademas, el analisis fenotfpico demostro que las celulas CD271+ eran negativas para marcadores MSC tfpicos que incluyen CD105 y CD90, no obstante, despues del cultivo las celulas expresaron marcadores de MSC clasicos, CD105, cD90 y CD73. La expresion de CD271 posterior inhibe la diferenciacion de MSC a linajes osteogenicos, adipogenicos, condrogenicos y miogenicos. Los datos del presente documento son coherentes con la literatura y apoyan la propuesta de que celulas CD271+ son una poblacion de celulas madre que es un precursor de mSc y que la diferenciacion de celulas CD271+ a MSC adherentes al plastico da como resultado la disponibilidad de linajes

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adipogenicos, condrogenicos y osteogenicos.

Experimentos adicionales se realizaron in vitro para evaluar metodologfas para generar MSC en condiciones de cultivo no adherentes. Dado este enfoque de laboratorio sobre la reparacion cardiaca se planteo la hipotesis de que las MSC generadas como celulas adherentes a plastico pueden no ser optima para regeneracion cardiaca. En la MO, las MSC tienen la superficie osea para que actue como un sustrato para el crecimiento de celulas adherentes, no obstante, no existe un sustrato equivalente en el tejido cardiaco. Se desarrollaron condiciones de cultivo, por lo tanto, para la expansion de MSC en condiciones no adherentes (NA-MSC). Las celulas CD271 + se cultivaron en bolsas de teflon que mininizaron la adherencia de celulas y el masaje regular de las bolsas mantuvo las celulas en suspension. Como se muestra en la seccion resultados, los MSC proliferaron en las bolsas formando esferas de celulas con propiedades de MSC, formando celulas similares a MSC adherentes clasicas cuando se disponen en matraces de plastico estandar y que expresan CD105. Las NA-MSC tambien se diferenciaron en adipocitos y condrocitos en condiciones de cultivo apropiadas. La capacidad osteogenica de las NA-MSC se esta evaluando actualmente. Ademas, se ha demostrado en el presente documento de que las celulas CD271 + pueden inducirse para expresar genes espedficos cardiacos cuando se cultivan en presencia de medios acondicionados mediante celulas estromales derivadas de corazon murino. Los medios acondicionados con celulas estromales derivadas de tejido de corazon fetal humano tambien estimulan la expresion genica cardiaca. Estos datos evidencian que las celulas CD271+ puede tener una capacidad de diferenciacion superior en comparacion con MSC generadas adherentes a plastico que no pudieron expresar genes cardiacos cuando se cultivaron en condiciones identicas.

El potencial in vivo de celulas CD271+ humanas se evaluo en ratones NOD/SCID inmunodeprimidos despues de la induccion de un infarto de miocardio. Con fines comparativos las MSC humanas aisladas y expandidas usando adherencia estandar a matraces de plastico se inyectaron y un grupo de control de animales recibio inyeccion de placebo. La inyeccion de 120.000 celulas CD271+ dio como resultado una funcion cardiaca mejorada en comparacion con ratones inyectados con el numero equivalente de MSC y animales de control con fraccion de eyeccion aumentada. Los resultados equivalentes se obtuvieron para animales inyectados con una dosis mas alta de MSC. Estos datos evidenciaron que el potencial de celulas CD271+ es superior al de MSC en dosis de celulas equivalentes. Ademas, la expresion de marcadores cardiacos se detecto en celulas humanas en animales inyectados con celulas CD271+, pero no animales inyectados con MSC, lo que es coherente con los datos in vitro que demuestran un potencial cardiaco de las celulas CD271+ pero no de las MSC.

Un numero de grupos han evaluado el potencial de varias poblaciones derivadas de medula osea que incluyen celulas mononucleares, celulas CD34+, celulas CD133+ y MSC. En este estudio, el potencial de MSC derivadas de MO se evaluo en estudios preclmicos en animales grandes y se demostro que las MSC puden injertarse en y adyacentemente a cicatrices de infarto cronico y estimulan la recuperacion miocardica significativa que incluye reducciones sustanciales en tamano de infarto, remodelacion inversa de corazones danados y aumento tanto en contractibilidad miocardica y perfusion de tejido. Estos estudios preclmicos han conducido a ensayos clmicos constantes de MSC en la Universidad de Miami. Uno de estos estudios se ha realizado en pacientes con disfuncion ventricular izquierda isquemica cronica secundaria a infarto de miocardio que se han sometido a cirugfa cardiaca para injerto de derivacion de arteria coronaria (CABG). La inscripcion a este ensayo se ha limitado debido a la urgencia de pacientes por someterse a cirugfa de derivacion y solo un numero pequeno de pacientes fue capaz de esperar las 5 o 6 semanas necesarias para generar MSC autologas. Estas celulas CD271+ derivadas de MO representan una fuente de celulas autologas para estos pacientes. Las celulas CD271+ pueden aislarse de un aspirado de MO dentro de un periodo de 4 a 5 horas proporcionando una poblacion de celulas facilmente disponible para el tratamiento de pacientes con CABG que requieren una cirugfa urgente. Estos estudios proporcionan evidencias de que las celulas CD271+ derivadas de MO ofrecen una poblacion de celulas unica para el estudio de reparacion cardiaca. En comparacion con MSC aisladas mediante adherencia a plastico, las celulas CD271+ teman un potencial de diferenciacion cardiaca in vitro superior y el tratamiento de ratones despues de un IM dio como resultado una mejora superior de la funcion cardiaca. Las celulas CD271+ pueden aislarse rapidamente usando una seleccion de celulas magneticas, por lo tanto podnan ser una fuente de celulas potencial para pacientes que requieren cirugfa de derivacion.

Aunque la invencion se ha ilustrado y descrito con respecto a una o mas implementaciones, tendran lugar alteraciones y modificaciones equivalentes para otros expertos en la tecnica despues la lectura y el entendimiento de la presente memoria descriptiva y los dibujos anexos. Ademas, aunque una caractenstica particular de la invencion puede haberse divulgado con respecto a solo una de varias implementaciones, dicha caractenstica puede combinarse con una o mas de otras caractensticas de las otras implementaciones si es deseable y ventajoso para cualquier aplicacion dada o particular.

El resumen de la divulgacion permitira al lector determinar rapidamente la naturaleza de la divulgacion tecnica. Se presenta con la conviccion de que no se usara para interpretar o limitar el alcance o el significado de las reivindicaciones.

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(15) Amado LC, Saliaris AP, Schuleri KH, St JM, Xie JS, Cattaneo S, Durand DJ, Fitton T, Kuang JQ, Stewart G, Lehrke S, Baumgartner WW, Martin BJ, Heldman AW, Hare JM. Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102(32):11474- 11479. PMID: 16061805

(16) Amado LC, Schuleri KH, Saliaris AP, Boyle AJ, Helm R, Oskouei B, Centola M, Eneboe V, Young R, Lima JA, Lardo AC, Heldman AW, Hare JM. Multimodality noninvasive imaging demonstrates in vivo cardiac regeneration after mesenchymal stem cell therapy. J Am Coll Cardiol 2006; 48(10):2116-2124. PMID: 17113001

(17) Schuleri KH, Amado LC, Boyle AJ, Centola M, Saliaris AP, Gutman MR, Hatzistergos KE, Oskouei BN, Zimmet JM, Young RG, Heldman AW, Lardo AC, Hare JM. Early improvement in cardiac tissue perfusion due to mesenchymal stem cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008;294(5):H2002H2011. PMID: 18310523

(18) Hare JM,Traverse JH, Henry TD, Dib N, Strumpf RK, Schulman SP, Gerstenblith G, DeMaria AN, Denktas AE, 5 Gammon RS, Hermiller JB, Jr., Reisman MA, Schaer GL, Sherman W. A randomized, double-blind, placebo-

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(19) Amado LC, Gerber BL, Gupta SN, Rettmann DW, Szarf G, Schock R, Nasir K, Kraitchman DL, Lima JA. Accurate and objective infarct sizing by contrast-enhanced magnetic resonance imaging in a canine myocardial

10 infarction model. J Am Coll Cardiol 2004;44(12):2383-2389. PMID: 15607402

(20) Schuleri KH, Centola M, George RT, Amado LC, Evers KS, Kitagawa K, Vavere AL, Evers R, Hare JM, Cox C, McVeigh ER, Lima JA, Lardo AC. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol 2009;53(18):1699-1707. PMID: 19406346

15

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas de medula osea de un sujeto y cultivadas en condiciones no adherentes para su uso en la prevencion o el tratamiento de enfermedades o trastornos cardiovasculares, en la que las celulas precursoras de mSc CD271 + son capaces de injertarse en un corazon in vivo en zonas de infarto y perifericas.
2. 2. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun la reivindicacion 1, en la que las celulas precursoras de MSC CD271+ se afslan de celulas de medula osea que tienen un receptor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR; CD271).
3. 3. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun las reivindicaciones 1 o 2, en la que las celulas precursoras de MSC CD271+ se afslan de donantes que comprenden: autologos, singenicos, alogenicos o xenogenicos.
4. 4. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun las reivindicaciones 1-3, en la que las celulas precursoras de MSC CD271+ se diferencian en al menos un linaje que comprende: linajes miocardicos, vasculares o endoteliales.
5. 5. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun las reivindicaciones 1-4, en la que las celulas precursoras de MSC CD271+ se diferencian en linajes que comprenden: linajes miocardicos, vasculares o endoteliales.
6. 6. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun la reivindicacion 4, en la que las celulas miocardicas se identifican por marcadores que comprenden: GATA-4, Nkx2.5 o a-actina sarcomerica.
7. 7. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun las reivindicaciones 4 o 5, en la que las celulas vasculares se identifican por marcadores que comprenden: a-actina de musculo liso o SMA22.
8. 8. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun las reivindicaciones 4 o 5, en la que las celulas endoteliales se identifican por marcadores que comprenden: CD31 o vimentina.
9. 9. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun las reivindicaciones 1-8, usada conjuntamente con uno o mas agentes, comprendiendo los agentes al menos uno de: citocinas, factores quimiotacticos, factores de crecimiento o factores de diferenciacion.
10. 10. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun las reivindicaciones 1-9, en la que las enfermedades o los trastornos cardiovasculares comprenden: insuficiencia cardiaca, aterosclerosis, isquemia, infarto de miocardio, transplante, hipertension, reestenosis, angina de pecho, cardiopatfa reumatica o defecto cardiovascular congenito.
11. 11. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun la reivindicacion 1, en la que las celulas precursoras de MSC CD271+ se administran a un paciente en concentraciones variables a lo largo de un periodo de tiempo.
12. 12. La cantidad terapeuticamente eficaz de celulas precursoras de celulas madre mesenquimales (MSC) CD271 + aisladas para su uso segun las reivindicaciones 1-11, en la que las celulas precursoras de MSC CD271+ se acondicionan con medios acondicionados con celulas estromales derivadas del corazon.