ES2557741T3 - Procedimientos para incrementar la producción de polipéptidos - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de producción de un polipéptido que comprende el cultivo de una línea celular de mamífero a una temperatura de 29 °C a 36 ºC en un medio que comprende hexametileno bisacetamida (HMBA), en el que la línea celular de mamífero se ha modificado mediante ingeniería genética para producir el polipéptido y en el que la presencia de hexametileno bisacetamida (HMBA) aumenta la producción del polipéptido.
Description
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como los ligandos para las quinasas relacionadas con eph o LERKS). Las descripciones de polipéptidos que pueden producirse de acuerdo con los procedimientos de la invención se pueden encontrar en, por ejemplo, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research. Vol. II (Aggarwal y Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); y The Cytokine Handbook (A. W. Thompson, ed., Academic Press, San Diego, CA, 1991).
Otros polipéptidos que pueden producirse utilizando los procedimientos de la invención incluyen polipéptidos que comprenden todo o parte de la secuencia de aminoácidos de un receptor para cualquiera de los polipéptidos mencionados en lo que antecede, un antagonista de un receptor de este tipo o cualquiera de los polipéptidos mencionados en lo que antecede y / o polipéptidos sustancialmente similares a tales receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR, conocidas como p55 y p75, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.º 5.395.760 y la patente de Estados Unidos N.º 5.610.279, receptores de la interleucina-1 (tipos I y II); descritos en la Patente EP N.º 0 460 846, la patente de EE.UU. N.º 4.968.607, y la Patente de Estados Unidos N.º 5.767.064, antagonistas del receptor de IL-1 (como los descritos en la patente de Estados Unidos n.º 6.337.072), antagonistas o inhibidores de IL-1 (tales como los descritos en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.981.713, 6.096.728, y 5.075.222), receptores de IL-2, receptores de IL-4 (como los descritos en la patente EP N.º 0 367 566 la patente de Estados Unidos N.º 5.856.296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos-granulocitos, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos, receptores de la oncostatina M y factor inhibidor de leucemia, activador del receptor de NF-kappa B (RANK, descrito en el documento WO 01/36637 y en la Patente de Estados Unidos N.º 6.271.349), osteoprotegerina (descrita en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 6.015.938), receptores de TRAIL (incluyendo los receptores TRAIL 1, 2, 3, y 4), y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como Fas o el receptor inductor de apoptosis (AIR).
Otros polipéptidos que pueden producirse usando el proceso de la invención incluyen polipéptidos que comprenden todo o parte de las secuencias de aminoácidos de antígenos de diferenciación (denominados polipéptidos CD) o sus ligandos o polipéptidos sustancialmente similares a cualquiera de estos. Estos antígenos se divulgan en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani y col., eds., Kobe, Japan, 1996). Polipéptidos CD similares se divulgan en los talleres posteriores. Ejemplos de tales antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos de los mismos (ligando CD27, ligando CD30, etc.). Varios de los antígenos CD son miembros de la familia de receptores del TNF, que también incluye 4 IBB y OX40. Los ligandos son a menudo miembros de la familia del TNF, como lo son el ligando 41BB y el ligando OX40. De acuerdo con lo anterior, los miembros de las familias del TNF y TNFR también se pueden purificar utilizando la presente invención.
Los polipéptidos enzimáticamente activos o sus ligandos también se pueden producir de acuerdo con los procedimientos de la invención. Los ejemplos incluyen polipéptidos que comprenden todo o parte de uno de los siguientes polipéptidos o sus ligandos o un polipéptido sustancialmente similar a uno de estos: miembros de la familia de metaloproteinasa -desintegrina, varias quinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador del plasminógeno tisular, factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, un antagonista de IL-2, antitripsina alfa-1, enzima convertidora de TNF-alfa, ligandos de cualquiera de las enzimas mencionadas en lo que antecede, y otras numerosas enzimas y sus ligandos.
Los procedimientos de la invención pueden también usarse para producir anticuerpos o porciones de los mismos y anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos que tienen dominios constantes de la inmunoglobulina anticuerpo humana acoplados a uno o más dominios variables de inmunoglobulina anticuerpo murina, fragmentos de los mismos, o proteínas sustancialmente similares. El procedimiento de la invención también se puede utilizar para producir conjugados que comprenden un anticuerpo y una sustancia citotóxica o luminiscente. Tales sustancias incluyen: derivados de maitansina (tales como DM1); enterotoxinas (tales como una enterotoxina de estafilococos); isótopos de yodo (tales como yodo-125); isótopos de tecnecio (tales como Tc-99m); fluorocromos de cianina (tales como Cy5.5.18); y polipéptidos inactivadores de ribosomas (tales como bouganina, gelonina, o saporina-S6). La invención también se puede utilizar para producir proteínas quiméricas seleccionadas in vitro para unirse a una proteína diana específica y modificar su actividad tales como las descritos en las solicitudes internacionales WO 01/83525 y WO 00/24782. Los ejemplos de anticuerpos, proteínas quiméricas seleccionadas in vitro, o conjugados anticuerpo/citotoxina o anticuerpo/luminóforo que pueden producirse mediante los procedimientos de la invención incluyen aquellos que reconocen uno cualquiera o una combinación de polipéptidos, incluyendo, pero sin limitarse a, las proteínas mencionadas en lo que antecede y / o los siguientes antígenos: subunidades de CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, receptor de IL-18, PDGF-β y análogos de los mismos (como los descritos en las patentes de EE.UU. N.º 5.272.064 y 5.149.792), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-βl, receptor de EGF (incluyendo los que se describen en la Patente de Estados Unidos N.º 6.235.883) receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, estimulador de linfocitos b (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1, y zTNF4; véase Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón), HER-2, una glicoproteína TAG-72 asociada a tumores, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumores que están presentes en niveles elevados en el suero de pacientes con cáncer de colon y o de páncreas, epítopos o polipéptidos asociados con cáncer expresados en células de cáncer de mama,
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de colon, de células escamosas, de próstata, de páncreas, de pulmón, y / o de riñón, y / o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores TRAIL 1, 2, 3, y 4, RANK, ligando de RANK, TNF-α, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular 3 (ICAM-3), adhesina leucointegrina, la glicoproteína de plaquetas gp IIb / IIIa, la cadena pesada de la miosina cardíaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor tisular-factor VIIa), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos), receptor de Fc-γ1, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, L-selectina, virus sincitial respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), Streptococcus mutans y Staphlycoccus aureus.
La invención también puede usarse para producir todo o parte de un anticuerpo antiidiotípico o un polipéptido sustancialmente similar, incluyendo anticuerpos antiidiotípicos contra: un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral gp72; un anticuerpo contra el gangliósido GD3; un anticuerpo contra el gangliósido GD2; o anticuerpos sustancialmente similares a estos.
Los procedimientos de la invención pueden también usarse para producir polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden cualquiera de los polipéptidos mencionados en lo que antecede. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden uno de los polipéptidos mencionados en lo que antecede, además de un dominio de multimerización, tal como una cremallera de leucina, una hélice en espiral, una porción Fc de un anticuerpo, o una proteína sustancialmente similar usando los procedimientos de la invención. Véase, por ejemplo, el documento WO94/10308; Lovejoy y col., (1993), Science 259:1288-1293; Miyagishi y col. (1993), Science 262:1401-05; Harbury y col., (1994), Nature 371:80-83; Hakansson y col.,(1999), Structure 7:255-64. 371: 80-83; Hakansson y col., (1999), Structure 7:. 255-64. Específicamente incluidos entre tales polipéptidos de fusión recombinantes se encuentran los polipéptidos en los que una porción del TNFR o RANK está fusionada con una porción Fc de un anticuerpo (TNFR: Fc o RANK: Fc). TNFR:Fc comprende la porción Fc de un anticuerpo fusionado a un dominio extracelular de TNFR, que incluye secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a los aminoácidos 1-163, 1-185, o 1-235 de la Figura 2A de la Patente de Estados Unidos Nº. 5.395.760. RANK:Fc se describe en la solicitud internacional WO 01/36637.
Preferentemente, los polipéptidos se expresan bajo el control de un elemento de control heterólogo tal como, por ejemplo, un promotor que, en la naturaleza, no dirige la producción de dicho polipéptido. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor viral fuerte (por ejemplo, CMV, SV40) que dirige la expresión de un polipéptido de mamífero. La célula huésped puede o no producir normalmente el polipéptido. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula CHO que se ha modificado mediante ingeniería genética para producir un polipéptido humano, lo que significa que el ácido nucleico que codifica el polipéptido humano se ha introducido en la célula CHO. Como alternativa, la célula huésped puede ser una célula humana que se ha modificado mediante ingeniería genética para producir niveles mayores de un polipéptido humano normalmente presente únicamente a niveles muy bajos (por ejemplo, sustituyendo el promotor endógeno con un promotor viral fuerte). Para la producción de polipéptidos recombinantes, un vector de expresión que codifica el polipéptido recombinante puede transferirse, por ejemplo, mediante transfección o infección viral, en un cultivo sustancialmente homogéneo de células huésped. El vector de expresión, que puede construirse usando los procedimientos de ingeniería genética, puede incluir ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de interés unido operativamente a secuencias reguladoras adecuadas.
Las secuencias reguladoras normalmente derivan de genes de mamíferos, microbianos, virales y / o de insectos. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores de la transcripción, operadores y potenciadores, un sitio de unión al ribosoma (véase, por ejemplo Kozak (1991), J. Biol. Chem. 266:19867-19870), secuencias adecuadas para controlar la iniciación y terminación de la transcripción y de la traducción, señales de poliadenilación (ver por ejemplo (véase, por ejemplo McLauchlan y col., (1988), Nucleic Acids Res. 16:5323-33), y sitios de unión a la matriz y al armazón (véase Phi-Van y col., (1988), Mol. Cell. Biol. 10:2302-07; Stief y col., (1989), Nature 341:342-35; Bonifer y col., (1990), EMBO J. 9:2843-38). Las secuencias de nucleótidos están unidas operablemente cuando la secuencia reguladora se refiere a la secuencia de codificación del polipéptido. Por tanto, una secuencia nucleotídica promotora está unida operablemente a una secuencia de codificación del polipéptido si la secuencia nucleotídica promotora controla la transcripción de la secuencia de codificación. Generalmente en el vector de expresión se incorpora un gen que codifica un marcador seleccionable para facilitar la identificación de células recombinantes.
Las secuencias de control de la transcripción y la traducción para vectores de expresión de célula huésped de mamífero se pueden escindir de genomas virales. Las secuencias promotoras y potenciadoras de uso habitual derivan del virus del polioma, el adenovirus 2, el virus de simio 40 (SV40) y el citomegalovirus humano (CMV). Por ejemplo, se puede utilizar el promotor / potenciador del CMV humano del gen temprano inmediato 1. Véase, por ejemplo, Patterson y col., (1994), Applied Microbiol. Biotechnol. 40:691-98. Las secuencias de ADN derivadas del genoma del virus SV40, por ejemplo, el origen de SV40, el promotor temprano y tardío, el potenciador, los sitios de corte y empalme y de poliadenilación pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales tempranos y tardíos son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento, que también puede contener un origen de replicación viral (Fiers y col., (1978), Nature 273:113; Kaufman (1990), Meth. in Enzymol. 185:487-511). También se pueden usar fragmentos de SV40 menores o mayores, siempre que incluyan la
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secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el origen viral SV40 del sitio de replicación.
Además, una secuencia que codifica un péptido señal heterólogo o nativo adecuado (secuencia líder) se puede incorporar en el vector de expresión, para estimular la secreción extracelular del polipéptido recombinante. El péptido señal se escindirá del polipéptido recombinante después de la secreción desde la célula. La elección del péptido señal o secuencia líder depende del tipo de células huésped en las que se va a producir el polipéptido recombinante. Los ejemplos de péptidos señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen la secuencia señal para la interleucina-7 (IL-7) descrita en la Patente de Estados Unidos N.º 4.965.195, la secuencia señal para el receptor de la interleucina-2 descrita en Cosman y col., (1984), Nature 312:768; el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en la patente EP N.º 367.566; el péptido señal de la interleucina-1 de tipo I descrito en la Patente de Estados Unidos N.º 4.968.607; y el péptido señal del receptor de la interleucina 1 de tipo II descrito en la Patente EP Nº. 0 460 846.
Se han descrito los procedimientos establecidos para introducir ADN en células de mamíferos. Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Se pueden usar protocolos adicionales utilizando reactivos comercialmente disponibles, tales como los reactivos de lípidos catiónicos LIPOFECTAMINE™ , LIPOFECTAMINE™-2000 o LIPOFECTAMINE™-PLUS (que se pueden adquirir en Invitrogen), para transfectar células. Felgner y col., (1987)., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417. Además, se pueden usar electroporación o bombardeo con microproyectiles recubiertos con ácidos nucleicos para transfectar células de mamífero utilizando procedimientos, tales como los de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Fitzpatrick-McElligott (1992), Biotechnology (NY) 10(9):1036-40. La selección de transformantes estables puede realizarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman y col., ((1990), Meth. in Enzymology 185:487-511), describe varios esquemas de selección, tales como la resistencia a la dihidrofolato reductasa (DHFR). Una cepa huésped adecuada para la selección de DHFR puede ser la cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR. Urlaub y Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220. Un plásmido que expresa el ADNc de DHFR puede introducirse en la cepa DX-B11 y sólo las células que contienen el plásmido pueden crecer en el medio selectivo apropiado. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden incorporarse en un vector de expresión incluyen ADNc que confieren resistencia a los antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Las células que albergan el vector pueden seleccionarse sobre la base de la resistencia a estos compuestos.
Las secuencias control adicionales que se ha demostrado que mejoran la expresión de genes heterólogos de vectores de expresión de mamíferos incluyen elementos tales como el elemento de secuencia de aumento de la expresión (EASE) derivado de células CHO (Morris y col., en Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); las patentes de Estados Unidos N.º 6.312.951 B1, 6.027.915, y 6.309.841 B1) y los ARN del líder tripartito (TPL) y del gen VA del Adenovirus 2 (Gingeras y col., (1982), J. Biol. Chem. 257:13475-13491). Las secuencias del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) de origen viral permite traducir con eficiencia ARNm dicistrónicos (Oh y Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh y col., (1996), Nucleic Acids Research 24:2697-2700). Se ha demostrado que la expresión de un ADNc heterólogo como parte de un ARNm dicistrónico seguido por el gen para un marcador seleccionable (por ejemplo, DHFR) mejora la capacidad de transfección del huésped y la expresión del ADNc heterólogo (Kaufman y col., (1990), Methods in Enzymol. 185:487-511). Los ejemplos de vectores de expresión que emplean ARNm dicistrónicos son pTR-DC / GFP descrito por Mosser y col., Biotechniques 22:150-161 (1997) y p2A5I descrito por Morris y col., en Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997).
Mosley y col., ((1989), Cell 59:335-348) han descrito un vector de expresión alto útil, pCAVNOT. Otros vectores de expresión para su uso en células huésped de mamífero se pueden construir como describen Okayama y Berg ((1983), Mol. Cell. Biol. 3:280). Un sistema útil para la expresión estable de alto nivel de ADNc de mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 puede construirse sustancialmente como se describe en Cosman y col., ((1986), Mol. Immunol. 23:935). Un vector útil de alta expresión, PMLSV N1 / N4, descrito por Cosman y col., ((1984), Nature 312:768), se ha depositado en la ATCC 39890. Vectores de expresión de mamífero útiles adicionales se describen en la patente EP N.º A-0 367 566 y el documento WO 01/27299 A1. Los vectores pueden derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia señal nativa, se puede añadir una secuencia señal heteróloga, tal como una de las siguientes secuencias: la secuencia señal para la IL-7 descrita en la Patente de Estados Unidos N.º 4.965.195; la secuencia señal para el receptor del IL-2 descrito en Cosman y col., (1984), Nature 312:768; el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en la patente EP N.º 367.566; el péptido señal de la interleucina-1 de tipo I descrito en la Patente de Estados Unidos N.º 4.968.607; y el péptido señal del receptor de la interleucina 1 de tipo II descrito en la Patente EP Nº. 0 460 846.
Los polipéptidos se pueden producir de forma recombinante en células eucariotas y preferiblemente son secretadas por células huésped adaptadas para crecer en cultivo celular. Opcionalmente, las células huésped para su uso en la invención son, preferiblemente, células de mamífero. Las células pueden también modificarse mediante ingeniería genética para que expresen un gen de interés, pueden ser células de producción de mamífero adaptadas para crecer en cultivo celular, y / o pueden ser líneas celulares homogéneas. Los ejemplos de tales células de uso habitual en la industria son VERO, BHK, HeLa, CVL (incluyendo Cos), MDCK, 293, 3T3, líneas celulares de mieloma (por ejemplo, NSO, NS1), PC12, células WI38, y células de ovario de hámster chino (CHO), que son ampliamente utilizadas para la producción de varios polipéptidos recombinantes complejos, por ejemplo, citocinas, factores de
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coagulación y anticuerpos (Brasel y col., (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman y col., (1988), J.Biol Chem 263:63526362; McKinnon y col., (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood y col., (1990), J. Immunol. 145:3011-3016). Las líneas celulares mutantes deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub y col., (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 y DG-44, son líneas de células huésped de CHO deseables porque el sistema de DHFR de expresión génica seleccionable y amplificable eficiente permite la expresión del polipéptido recombinante de alto nivel e estas células (Kaufman R.J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Además, estas células son fáciles de manipular como cultivos adherentes o de suspensión y exhiben una estabilidad genética relativamente buena. Las células CHO y los polipéptidos recombinantes expresados en ellas se han caracterizado ampliamente y han sido aprobadas para su uso en la fabricación comercial clínica por las agencias reguladoras. Los procedimientos de la invención también se pueden poner en práctica utilizando líneas celulares de hibridoma que producen un anticuerpo. Los procedimientos para preparar líneas de hibridoma son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Berzofsky y col., en Paul, ed., Fundamental Immunology, Segunda edición, pp.315-356, a 347-350, Raven Press Ltd., New York (1989). Las líneas celulares derivadas de las líneas mencionadas anteriormente son también adecuadas para la práctica de la invención.
De acuerdo con la presente invención, una célula huésped de mamífero se cultiva en condiciones que promueven la producción del polipéptido de interés, que puede ser un anticuerpo o un polipéptido recombinante. Las formulaciones del medio de cultivo de células basales son bien conocidas en la técnica. A estas formulaciones de medio de cultivo basal, el experto en la técnica añadirá componentes tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, tampones, antibióticos, lípidos, oligoelementos y similares, dependiendo de los requisitos de las células huésped que se van a cultivar. El medio de cultivo puede o no contener suero y / o proteína. Varios medios de cultivo de tejidos, incluidos los medios de cultivo libres de suero y / o definidos, están disponibles comercialmente para el cultivo celular. El medio de cultivo tisular se define, para los propósitos de la invención, como un medio adecuado para el crecimiento de células animales, preferiblemente células de mamífero, en cultivo celular in vitro. Típicamente, los medios de cultivo de tejidos contienen un tampón, sales, fuente de energía, aminoácidos, vitaminas y oligoelementos esenciales. Se puede usar cualquier medio capaz de soportar el crecimiento de la célula eucariota apropiada en cultivo; la invención es ampliamente aplicable a células eucariotas en cultivo, particularmente células de mamífero, y la elección de los medios no es crucial para la invención. Los medios de cultivo tisular adecuados para su uso en la invención están disponibles comercialmente de, por ejemplo, el ATCC (Manassas, VA). Por ejemplo, se puede usar uno cualquiera o una combinación de los siguientes medios: Medio RPMI-1640, medio RPMI-1641, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio mínimo esencial Eagle, medio F-12K, medio de Ham F12, medio de Dulbecco modificado de Iscove, medio McCoy 5A, medio Leibovitz L-15 y medios sin suero, tales como la serie EX-CELL™ 300 (disponible en JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, EE.UU.), entre otros, que se puede obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo o JRH Biosciences, así como de otros proveedores. Cuando se usa medio definido que está libre de suero y / o libre de peptona, el medio normalmente está altamente enriquecido en aminoácidos y oligoelementos. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5.122.469 de Mather y col., y 5.633.162 de Keen y col.,
En los procedimientos y composiciones de la invención, las células pueden cultivarse en medios libres de suero, libres de proteínas, libres de factor de crecimiento y / o libres de peptona. La expresión "libre de suero", como se aplica a los medios, incluye cualquier medio de cultivo de células de mamífero que no contiene suero, tal como suero bovino fetal. La expresión "libre de insulina", como se aplica a los medios, incluye cualquier medio al que no se ha añadido nada de insulina exógena. Por exógena se entiende, en este contexto, otra distinta a la producida por el cultivo de las propias células. La expresión "libre de IGF-1" como se aplica a los medios, incluye cualquier medio al que no se ha añadido factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) o un análogo (tal como, por ejemplo, LongR3, [Ala31], o [Leu24 ] [Ala31] exógenos, análogos de IGF-1 disponibles de GroPep Ltd. de Thebarton, Australia del Sur). La expresión "libre de factor de crecimiento", como se aplica a los medios, incluye cualquier medio al que no se ha añadido factor de crecimiento exógeno (por ejemplo, insulina, IGF-1). La expresión "libre de proteínas", tal como se aplica a los medios, incluye medios libres de proteína añadida exógenamente, tal como, por ejemplo, transferrina y los factores de crecimiento de proteínas IGF-1 e insulina. Los medios libres de proteínas pueden o no tener peptonas. La expresión "libre de peptona", como se aplica a los medios, incluye cualquier medio al que no se han añadido hidrolizados de proteínas exógenas, tales como, por ejemplo, hidrolizados de proteínas animales y/o vegetales. La eliminación de peptona de los medios tiene las ventajas de reducir la variabilidad lote a lote y mejorar el procesamiento, tal como filtración. Los medios químicamente definidos son los medios en los que se define y obtiene cada componente a partir de una fuente pura, preferiblemente una fuente no animal.
El experto en la materia también puede optar por utilizar una de las muchas formulaciones de medios individualizadas que se han desarrollado para maximizar el crecimiento celular, la viabilidad celular y / o la producción de polipéptido recombinante en una célula huésped cultivada particular. Los procedimientos de acuerdo con la presente invención se pueden usar en combinación con medios de cultivo celular disponibles comercialmente
o con un medio de cultivo celular que se ha formulado individualmente para su uso con una línea celular particular. Por ejemplo, un medio enriquecido que podría apoyar el aumento de la producción de polipéptido puede comprender una mezcla de dos o más medios comerciales, tales como, por ejemplo, DMEM y de medio de Ham F12 combinados en proporciones tales como, por ejemplo, 1: 1, 1: 2 , 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8, o incluso hasta a 1:15 o superior. Como alternativa o adicionalmente, un medio se puede enriquecer mediante la adición de nutrientes, tales como aminoácidos o peptona, y / o se puede utilizar un medio (o la mayoría de sus componentes con las excepciones
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El grado deseado de pureza final depende del uso previsto del polipéptido. Se desea un grado relativamente alto de pureza cuando el polipéptido se va a administrar in vivo, por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos se purifican de tal manera que no hay bandas de polipéptido correspondientes a otros polipéptidos detectables tras el análisis mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Un experto en el campo pertinente reconocerá que se pueden visualizar múltiples bandas correspondientes al polipéptido mediante SDS-PAGE, debido a glicosilación diferencial, procesamiento postraduccional diferencial, y similares. Opcionalmente, el polipéptido de la invención se purifica hasta una homogeneidad sustancial, como indica una única banda de polipéptido tras análisis por SDS-PAGE. La banda de polipéptido puede visualizarse mediante tinción con plata, tinción con azul de Coomassie, o (si el polipéptido está radiomarcado) mediante autorradiografía.
La invención también abarca opcionalmente la formulación adicional de los polipéptidos. Por el término "formular" se entiende que los polipéptidos pueden intercambiarse con tampón, esterilizarse, envasarse a granel, y / o envasarse para un usuario final. Para los propósitos de la invención, la expresión "forma de masa estéril" significa que una formulación está libre, o esencialmente libre, de contaminación microbiana (a un grado tal que es aceptable para fines de alimentación y / o de fármacos), y tiene una composición y concentración definidas. El término "forma de dosis unitaria estéril" significa una forma que es adecuada para el cliente y / o la administración o el consumo por el paciente. Tales composiciones pueden comprender una cantidad eficaz del polipéptido, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. La expresión “fisiológicamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente o los ingredientes activos.
Formulaciones adecuadas para la administración incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacterioestáticos y solutos, que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre que se pretenda; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los polipéptidos pueden formularse de acuerdo con procedimientos conocidos utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Pueden combinarse en mezcla, ya sea como el único material activo o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, soluciones tamponadas con solución salina, Tris-HCl, acetato y fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenes), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y / o vehículos. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen las descritas en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA. Además, tales composiciones pueden formar complejos con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporarse en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano, etc., o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoblastos. Los lípidos adecuados para formulación liposómica incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, Iisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales está dentro del nivel de habilidad en la técnica, como se divulga en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos nº. 4.235.871, 4.501.728,
4.837.028 y 4.737.323. Tales composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de eliminación in vivo, y, por lo tanto, se eligen según la aplicación prevista, de modo que las características del vehículo dependerán de la vía de administración seleccionada. Las formas de liberación sostenida adecuadas para su uso incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos que están encapsulados en un polímero biocompatible de disolución lenta (tales como las micropartículas de alginato descritas en la Patente de Estados Unidos N.º 6.036.978), mezcladas con un polímero de este tipo (incluyendo hidrogeles aplicados tópicamente) y o encerrados en un implante semipermeable biocompatible.
Habiéndose descrito la invención se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración, y no de limitación.
Ejemplo 1
Comparación de la actividad inductora de la cafeína y el butirato a 31 ºC
En este experimento, la cafeína (a concentraciones de 0,5 a 2,0 mM) se comparó con el butirato de sodio por su capacidad para inducir la expresión de un polipéptido recombinante. Se usó una línea de producción de células CHO modificada mediante ingeniería genética para que expresara TNFR: Fc (línea celular n.º 5) para probar la eficacia de la cafeína como agente inductor. Las células CHO se cultivaron en matraces de agitación a 37 ºC utilizando medio de crecimiento libre de suero que contiene metotrexato. Cuando se obtuvo la masa celular apropiada, las células se colocaron en condiciones de inducción mediante una centrifugación de cinco minutos a
1.000 x g, seguido de la sustitución del medio de crecimiento con medio libre de suero sin metotrexato. Las células, a las densidades celulares iniciales de 2 x 10 6 células / ml en 20 ml, se introdujeron en matraces Erlenmeyer de 125 ml de plástico con tapas de sellado blandas y se colocaron en plataformas de agotación en incubadores fijados a las temperaturas apropiadas. La viabilidad y el número de las células se controlaron mediante recuento en hemocitómetro utilizando colorante azul tripán. Los títulos del polipéptido recombinante se evaluaron mediante ensayos basados en ELISA.
Para esta línea celular, se sabía que 0,2 mM era la concentración óptima de butirato de sodio para la inducción. De acuerdo con lo anterior se comparó el butirato de sodio 0,2 mM contra los efectos inductores de la cafeína a 0,5, 1,0,
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El título de proteínas a 5 días más alto se observó en las células inducidas con cafeína 0,5 mM (305 g / ml), que fue de aproximadamente 111 % del título del cultivo control sin inductor. En general, el título del polipéptido recombinante fue menor a medida que las concentraciones de cafeína aumentaban por encima de 0,5 mM. La productividad (en g de proteína / 10 6 células / día) parecía estar ligado a la concentración de cafeína, con la mayor productividad obtenida a partir de células inducidas con cafeína 2,0 mM y un nivel más bajo de productividad obtenido a partir de las células inducidas con concentraciones de cafeína menores. Puesto que un 0,5 mM fue la concentración de cafeína más baja analizada, así como la concentración más eficaz analizada para la inducción de la producción de proteínas, estos datos no excluyen la posibilidad de que una menor concentración de cafeína podría ser igual o más eficaz que un inductor de la línea celular nº. 60 incubada a 36 ºC.
Este experimento, junto con los descritos en los Ejemplos 1 y 2, demuestra que la capacidad de la cafeína para inducir la expresión del polipéptido recombinante no es específica de la línea celular y la viabilidad celular favorable que se mantiene en presencia de cafeína. Además, la cafeína se puede usar en una fase de inducción o de producción implementada a temperaturas de 31 ºC a 36 ºC. Sin embargo, estos datos también indican diferencias entre líneas celulares en cómo la cafeína induce la síntesis de una proteína recombinante. Por ejemplo, la inducción de la línea celular n.º 9 con cafeína es más eficaz que la inducción de la línea celular n.º 60. Compárese el Ejemplo 2 y la Figura 2 con el Ejemplo 3.
Ejemplo 4
Optimización de la inducción para la línea celular n.º 60
El propósito de este experimento era analizar los intervalos de temperatura y de concentraciones de cafeína en matraces de agitación con el fin de optimizar las condiciones de inducción para la línea celular n.º 60.
Materiales y procedimientos. Doce matraces de agitación se establecieron en las condiciones descritas en la Tabla
1.
TABLA 1: Concentraciones de cafeína y temperaturas de las muestras
- Número de matraz
- Temperatura (ºC) Cafeína (mM)
- 1
- 36 0
- 2
- 36 0,5
- 3
- 36 1,0
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- 36 1,5
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- 7
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- 37 0,5
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- 10
- 37 1,5
- 11
- 37 2,0
- 12
- 37 2,5
Las células se recogieron mediante centrifugación a partir de un cultivo giratorio de la línea celular n.º 60 (26,85 x 105 células / ml, 95,2 % viables) y se inocularon en un matraz de agitación de 575 ml a 2 x 10 6 células / ml en medio de producción libre de suero. Después, el cultivo se dividió en alícuotas en doce matraces de agitación. Se añadió cafeína según el plan experimental descrito en la Tabla 1. Los matraces de agitación se incubaron a las temperaturas designadas durante 7 días. Se tomaron muestras los días 3, 5 y 7. La densidad y la viabilidad celular se midieron usando un sistema automatizado de recuento de células que emplea tinción con azul tripán para determinar la viabilidad (la sistema de análisis de la densidad celular o Cedex, desarrollado por innovatis GmbH, Bielefeld, Alemania). Se realizaron mediciones de glucosa y lactato con Yellow Springs Instruments 2700 Select (disponible en Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio, EE.UU.). Se añadió glucosa a demanda para mantener una concentración de> 2 g / l. El CO2 y pH externo se midieron utilizando el analizador de gas en sangre Ciba-Corning 248 (disponible en Bayer Diagnostics, Tarryton, New York, EE.UU.). Los títulos de proteína se determinaron a través de un prepurificación del anticuerpo sobre una columna de proteína A seguida de una
La aminofilina es un compuesto teofilina con 1,2-etilendiamina (2: 1) dihidrato.
Estos derivados de xantina, incluyendo algunas combinaciones, se analizaron en la línea celular n.º 9 en un formato de frasco de agitación (20 ml en matraces de agitación de 125 ml) como se ha descrito anteriormente para los Ejemplos 1 y 2. Para disolver 3-isobutil-l-metilxantina (IBX), se solubiliza en agua calentada a casi el punto de ebullición, y rápidamente se añadió a los matraces antes de que precipitara. Como alternativa, IBX se disolvió en DMF. La fase de inducción del cultivo celular se llevó a cabo durante 6 días a 31 ºC, y se retiraron muestras para análisis a los puntos de tiempo de 3 días y 6 días. Los títulos de proteínas de cada matraz de agitación se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3: Título del polipéptido recombinante en varias condiciones de inducción
- Condición
- Título (g/ml) Día 3 Título (g/ml) Día 6
- Cafeína 0,6 mM + butirato 0,5 mM
- 120 280
- Teobromina 0,1 mM
- 90 270
- Teobromina 0,5 mM
- 100 260
- Teobromina 1 mM
- 100 260
- Aminofilina 0,1 mM
- 110 260
- Aminofilina 0,5 mM
- 120 250
- Aminofilina 1 mM
- 100 200
- Pentoxifilina 0,1 mM
- 110 320
- Pentoxifilina 0,5 mM
- 130 380
- Pentoxifilina 1 mM
- 130 400
- 0,3 % de DMF + IBX 0,5 mM
- no determinado 340
- 0,3 % de DMF
- 120 330
- IBX 0,5 mM
- 150 420
- IBX 0,5 mM + cafeína 0,6 mM
- 130 370
- IBX 0,1 mM + cafeína 0,6 mM
- 140 390
- IBX 0,1 mM + cafeína 0,6 mM + butirato 0,5 mM
- 130 280
- IBX 0,1 mM + cafeína 0,6 mM + 0,3 % de DMF
- 150 390
- Cafeína 0,2 mM
- 150 400
- Cafeína 0,6 mM
- 120 320
- Butirato 0,5 mM
- 100 220
- SIN INDUCTOR
- 100 290
10 Varias conclusiones se pueden extraer de estos datos. La producción del matraz inducida con IBX 0,5 mM fue incluso mejor que la cafeína, y los 3 matraces que contienen pentoxifilina también dieron resultados prometedores. Los títulos de los cultivos inducidos con pentoxifilina se incrementaron al aumentar la dosis y fueron más altos que el título del cultivo control sin inductor. Adicionalmente, algunas combinaciones de diferentes derivados de xantina, así como diferentes derivados de xantina con otros agentes inductores (por ejemplo, butirato y / o DMF) produjeron
15 títulos de proteínas por encima de los niveles de control. La teobromina y la aminofilina no indujeron títulos de proteínas superiores a los observados en el cultivo control sin inductor. Los títulos de proteínas más altos obtenidos cuando se usó cafeína como inductor se obtuvieron a la concentración más baja analizada, es decir, cafeína 0,2 mM. Como se ha explicado anteriormente, dicho resultado deja abierta la posibilidad de que incluso concentraciones más bajas de cafeína pueden ser eficaces. Por último, a diferencia de en el Ejemplo 2 (Figura 2), el butirato no induce
20 aumento del título de proteínas sobre el que se observa en un cultivo sin inductor.
10
15
20
25
30
35
40
Estos datos muestran que los cultivos de biorreactor cambiaron a 31 ºC después de una fase de crecimiento inicial a 37 ºC produjeron más receptor de IL-1 de tipo II si el HMBA se añadió en el momento del cambio de temperatura que si no. Estos datos sugieren además que la invención puede ser útil para producir diversos polipéptidos en varias líneas celulares y que la mecánica de cómo se cultivan las células, por ejemplo, en un matraz de agitador de frente en un biorreactor, no son críticos.
Ejemplo 10
Producción de un anticuerpo contra el receptor de IL-4 murino en células CHO
El experimento descrito a continuación analiza los efectos de usar butirato de sodio o HMBA como un inductor en todavía otra línea celular a varias temperaturas.
Los ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo contra un receptor de IL-4 murino insertados en un vector adecuado se introdujeron en células CHO. Aproximadamente dos millones de células de una línea transformada de forma estable propagada a 37 ºC se inocularon en 20 mililitros de medio a las temperaturas indicadas en la Figura 4 y en presencia o ausencia de HMBA (2 mM) o butirato de sodio (0,5 mM), como se indica en la Figura 4. Las células se cultivaron durante un máximo de 14 días en un matraz agitador. Se extrajeron alícuotas en los tiempos indicados en la Figura 4, y el título del anticuerpo (en microgramos por mililitro de medio cosechado) se determinó mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un procedimiento bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo Reen (1994), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), en Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol. 32:461-466. Los resultados se muestran en la Figura 4. Estos datos indican que el crecimiento a 31 ºC dio como resultado la producción de más anticuerpos durante un tiempo más largo que el crecimiento a 34 ºC
o 37 ºC cuando se cosechó medio a los 7 días o más tarde. Estos datos también indican que tanto el HMBA como el butirato de sodio, de forma individual, aumentó la producción del anticuerpo y que el HMBA lo hizo en mayor medida de lo que lo hizo el butirato de sodio a 31 ºC.
Ejemplo 11
Producción de TNFR:Fc en células CHO
Se introdujeron ácidos nucleicos que codifican TNFR: Fc humano en un vector adecuado en células CHO. Aproximadamente 3 ± 0,5 x 10 6 células de una línea celular transformada de forma estable propagada a 37 ºC se introdujeron en cada uno de tres biorreactores 1 litro y se cultivaron a 32,5 ºC en un medio enriquecido libre de suero. Se añadió butirato de sodio (0,5 mM) a los tres cultivos y se añadió HMBA (2 mM) a dos de los cultivos ("día 1 + HMBA") un día después el cambio a 32,5 ºC. Las células se incubaron durante un total de 11 días a 32,5 ºC. Se recolectó el medio y el título de proteínas se determinó midiendo la densidad óptica a 280 nanómetros tras una purificación previa usando cromatografía de perfusión con proteína A POROS® (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.). Estos resultados se muestran en la Tabla 7 como un porcentaje del título obtenido de la muestra sin HMBA ("día 1") redondeados al número entero más cercano.
TABLA 7: Efectos del momento de la adición de inductores
- Título relativo de TNFR:Fc (porcentaje del título el día 0)
- Día 1
- 100 %
- Día 1 + HMBA
- 131 %
- Día 1 + HMBA
- 110 %
Estos datos indican que la adición de HMBA aumentó el título de TNFR:Fc producido por estos cultivos cuando se añade un día después de un cambio de temperatura a 32,5 ºC. Estos datos, junto con los datos en los ejemplos anteriores, indican que la adición de HMBA puede aumentar el título de proteínas cuando se añade en el momento de o después de un cambio a una temperatura más baja.
La fraseología y la terminología empleadas en el presente documento son para el propósito de descripción y no de limitación.
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