ES2558080T3

ES2558080T3 - Hidrogel de dextrina para aplicaciones biomédicas

Info

Publication number: ES2558080T3
Application number: ES10809176.0T
Authority: ES
Inventors: Francisco Miguel Portela Da Gama; Maria Cabral Maio Molinos
Original assignee: Universidade do Minho
Current assignee: Universidade do Minho
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2016-02-01
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: US9205103B2; US20130045242A1; PT104879A; WO2011070529A3; PT104879B; WO2011070529A2; EP2509644B1; EP2509644A2

Abstract

Formulaciones de hidrogel de dextrina oxidada reticulada con dihidrazida de ácido adípico que comprende la siguiente estructura:**Fórmula** que presenta la capacidad de incorporación dentro de su poro tridimensional, en las que dicha dextrina tiene un peso molecular de entre 1200 y 8000 Da.

Description

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DESCRIPCION

Hidrogel de dextrina para aplicaciones biomedicas Campo de la invencion

La presente invencion pertenece al campo de los biomateriales con aplicacion en la regeneracion tisular, centrandose especlficamente en la produccion de hidrogeles de dextrina oxidada novedosos, que pueden ser inyectables, y con potencial para la inclusion y el transporte de biomoleculas, farmacos, nanogeles de dextrina y compuestos granulares, as! como para la encapsulation celular.

Antecedentes de la invencion

El aumento en la esperanza de vida promedio implica una sobrecarga de tejidos y organos. En los ultimos anos se han desarrollado un gran variedad de hidrogeles (clase de redes polimericas tridimensionales, altamente hidratadas (contenido en agua >30% del peso total)) y se han aplicado en regeneracion tisular. Estos materiales estan compuestos por cadenas polimericas hidrofilas, que pueden ser o bien sinteticas o bien naturales, atractivas para estrategias de ingenierla tisular debido a la posibilidad de imitar de manera reproducible la estructura qulmica de tejidos biologicos y sus propiedades en general.

Se han explorado pollmeros sinteticos y naturales como portadores farmacologicos. Desafortunadamente, la mayorla de los pollmeros usados cllnicamente, aunque se toleran ampliamente, son todavla pollmeros sinteticos no biodegradables, por ejemplo polietilenglicol (PEG) (Fuertges y Abuchowski, 1990) y copollmeros de N-(2- hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) (Vasey et al., 1999). Por tanto, con el fin de garantizar su elimination renal y excluir la amenaza de una acumulacion progresiva tras una administration repetida, solo pueden usarse pollmeros con un peso molecular por debajo del umbral renal (aproximadamente 40.000 Da) (Hreczuk-hirst et al., 2001).

Una variedad de materiales naturales pueden usarse para formar hidrogeles para ingenierla tisular, tal como colageno, quitosano, alginato y acido hialuronico (HA). Sin embargo, el rendimiento de estos materiales in vivo no es siempre el mejor, tal como establecen Drury y Mooney (2003). El quitosano altamente puro y homogeneo es bastante diflcil de producir; por otro lado, la bioactividad proinflamatoria limita su uso biomedico. La seguridad de los materiales de colageno es una preocupacion, debido al riesgo de contamination. El alginato se ha destacado varias veces como polisacarido prometedor para la slntesis de hidrogeles para aplicaciones de ingenierla tisular. Sin embargo, el alginato no se degrada especlficamente, experimentando una disolucion no controlada lenta, siendo por tanto diflcil de eliminarlo del cuerpo. Adicionalmente, pollmeros como el pululano (Nogusa et al., 1995) o dextrano (Nishikawa et al., 1996), a los que se hace referencia en esta area, que son biodegradables de manera inherente, incluso con bajos niveles de funcionalizacion (para promover una union del farmaco o para reducir las tasas de degradation) pueden pasar facilmente a ser no degradable (Vercauteren et al., 1996). Algunos de estos pollmeros derivados de manera natural (incluyendo el dextrano) son inmunogenicos, lo que impide su administracion repetida (Hreczuk-hirst et al., 2001). Un estudio de fase I que implica dextrano-doxorubicina ha mostrado pruebas de hepatotoxicidad (Danauser-Reidl et al., 1993).

La inyectabilidad es comunmente una propiedad objetivo a la hora de desarrollar hidrogeles, garantizando su administracion en un procedimiento mlnimamente invasivo. El tiempo de entrecruzamiento es una caracterlstica muy importante de estos materiales, que determina su idoneidad para una aplicacion especlfica. Por ejemplo, un periodo de gelificacion de mas de 30 min no es adecuado para una intervention maxilofacial.

La presente invencion, que pretende superar los inconvenientes mencionados anteriormente, describe un hidrogel a base de dextrina inyectable, con potencial para la inclusion y el transporte de biomoleculas, farmacos, nanogeles y compuestos granulares, as! como para la encapsulacion celular. Simultaneamente, este biomaterial esta previsto para proporcionar tiempos de entrecruzamiento y propiedades mecanicas controlables, a traves del ajuste de parametros especlficos, tales como el grado de oxidation y concentration del agente de entrecruzamiento. Dextrina significa un pollmero de glucosa producido mediante la hidrolisis de almidon, que consiste en unidades de glucosa unidas principalmente mediante enlaces a-1,4. Ademas de a-1,4, puede haber una proportion de enlaces a-1,6, dependiendo la cantidad de la fuente del almidon. Cualquier dextrina es una mezcla de pollmeros de glucosa de diferentes longitudes de cadena.

Se hace referencia a las formulaciones de hidrogel a base de dextrina en un pequeno numero de artlculos y patentes, revisados mas adelante. De hecho, la dextrina es una herramienta emergente en el campo biomedico por no ser toxica y no presentar inmunogenicidad (Treetarnmathurot et al., 2009). Se ha aprobado por la FDA como la solution para dialisis peritoneal Icodextrin™. Icodextrin (una dextrina polidispersa) tambien se ha desarrollado como solution portadora para la administracion intraperitoneal de un agente anticarcinogenico (Kerr et al., 1996). Un trabajo reciente tambien ha informado de la capacidad de conjugados de dextrina para presentar una actividad antiendotoxina as! como para regular la respuesta inflamatoria (Davtyan et al., 2007; Avetisyan et al., 2006). En otro

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trabajo reciente, se uso el complejo de dextrina-hidroxiapatita (HAp) como material de relleno oseo, con buen rendimiento (Asai et al., 2009). Ademas, un nanogel, organizado mediante el autoensamblaje de dextrina anfifllica se ha descrito como posibles portadores de farmacos (Gonpalves et al., 2007). Un material similar (un nanogel de dextrina) se ha desarrollado tambien por Orienti et al. (2009; documento WO2009/016663A1). Se usaron microesferas a base de dextrina para la encapsulacion del fotosensibilizador porfirina, que se agrega en disoluciones acuosas, permitiendo su administracion en la forma monomerica, en terapia fotodinamica (Luz et al., 2008). Colin Brown (2010) tambien desarrollo una formulacion de dextrina que puede impedir o reducir la incidencia sobre adhesiones posoperatorias (documento US2010/0240607A1).

Recientemente, Carvalho et al. (2007) produjeron hidrogeles de dextrina, concretamente dextrina-VA y dextrina- HEMA, como sistemas de administracion controlada de farmacos. Sin embargo, el metodo usado para producir estos hidrogeles, es decir la polimerizacion radicalaria, requiere iniciadores qulmicos para activar el proceso de gelificacion (por ejemplo persulfato de amonio), que pueden reaccionar con estructuras celulares y resultar toxicos. Ademas, esto implica la modification de la cadena principal de dextrina con monomeros acrllicos y la gelificacion es rapida. Por tanto, estos materiales a base de dextrina no presentan las principales propiedades requeridas para un hidrogel inyectable, esencialmente debido a limitaciones tales como la citotoxicidad y la falta de control sobre los tiempos de entrecruzamiento.

La tolerabilidad cllnica probada de la dextrina, que se degrada facilmente mediante amilasas (Davies, 1994), sugiere que puede reunir propiedades excelentes para el desarrollo de sistemas portadores de farmacos y en global en aplicaciones biomedicas. Con este proposito, es particularmente relevante el hecho de que la dextrina es un recurso abundante, estando ya disponible en una formulacion de calidad medica con excelente biocompatibilidad. Adicionalmente, se han conseguido largos tiempos de circulation de plasma (horas o dlas) mediante la funcionalizacion de la cadena polimerica principal, permitiendo una capacidad mejorada para la selection como diana de tejido (Hreczuk-hirst et al., 2001; Hardwicke et al., 2008; Treetarnmathurot et al., 2009). El bajo peso molecular de la dextrina tambien es una propiedad crucial y determinante, ya que favorece un aclaramiento renal sano.

La patente estadounidense n.° 5.541.234, de Unger et al., describe hidrogeles con alta porosidad y baja densidad, hechos de alginato y/u otros polisacaridos, incluyendo dextrina, en los que la concentration de pollmero que origina la densidad ideal para la estructura porosa se encuentra preferiblemente entre el 1% y el 10%. En los casos particulares de agar, carragenanos, gelatinas y caselnas, el proceso de entrecruzamiento tiene lugar preferiblemente a altas temperaturas, convirtiendo la gelificacion in situ en inviable, de lo contrario los tejidos que rodean el hidrogel podrlan verse danados seriamente. Tambien se indica el uso de disolventes a lo largo de la reaction de entrecruzamiento, que, teniendo presente las aplicaciones biomedicas, es una clara desventaja en comparacion con el procedimiento descrito en la presente invention. Unger et al. no ofrecen la posibilidad de asociar biomoleculas o celulas. Ademas, la gelificacion se basa estrictamente en el uso de agentes de entrecruzamiento, sin modificacion previa de los polisacaridos. La dextrina, un pollmero de glucosa, necesita un pretratamiento, por ejemplo, oxidation mediante acido peryodico, tal como se propone en esta invencion, que permita la posterior gelificacion mediante la adicion de un agente de reticulation. Ademas, todavla en el alcance de la presente invencion, la concentracion de pollmero que garantiza la textura ideal es del 30%, dando lugar a un hidrogel inyectable, con tiempos de entrecruzamiento atractivos (5-30 min), lo que permite su manipulacion e implantacion sin prisa, cuando se usa en aplicaciones de cirugla maxilofacial, como adyuvante a compuestos granulares osteogenicos. Una concentracion de pollmero por debajo del 25% originara un fluido viscoso en lugar de un hidrogel.

El documento WO98/12228 A1 da a conocer formulaciones de hidrogel para su uso en aplicaciones de ingenierla tisular. Los hidrogeles comprenden un alginato o un polisacarido, tal como dextrano, que se ha sometido a una etapa de oxidacion con peryodato de sodio y que se hace reaccionar adicionalmente con un agente de entrecruzamiento tal como dihidrazida de acido adlpico.

Bouhadir et al. (1999; US2007/07186413) concibieron hidrogeles para la liberation controlada de productos farmaceuticos, basandose en el uso de polisacaridos entrecruzados con dihidrazida de acido adlpico (ADH), como en la presente invencion. El polisacarido preferido es el alginato. El procedimiento que conduce a la production de un hidrogel incluye la oxidacion parcial de alginato seguido de polimerizacion con ADH. De esta manera, a traves de la oxidacion del polisacarido, los autores aspiran a la produccion de un material degradable in vivo. De hecho, la no degradabilidad es una limitation principal para el uso biomedico de alginatos, dado que evita su elimination y excretion eficaces. Tambien esta previsto un mejor control sobre la reaccion de gelificacion, dado que la gelificacion ionotropica llevada a cabo comunmente con alginato no es satisfactoria. En todavla otro aspecto de la patente, se desarrollan conjugados de farmaco-pollmero, que permiten un control mejorado de la liberacion de farmaco, en este caso no basandose solo en fenomenos de transferencia de masa.

En el caso de la presente invencion, la retention del biomaterial en los rinones no es un problema, debido al bajo peso molecular de la dextrina, cuya degradation y eliminacion puede controlarse a traves del grado de sustitucion. A este respecto, la dextrina conlleva una clara ventaja en comparacion con los alginatos. Por otro lado, en la presente invencion se planea una estrategia para evitar la liberacion rapida de productos farmaceuticos del hidrogel altamente

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poroso. De hecho, puede conseguirse un grado adicional de control sobre la liberacion de farmaco usando nanogeles con nucleos hidrofobos, que pueden solubilizar productos farmaceuticos poco solubles en agua, permitiendo simultaneamente un control adicional sobre las propiedades farmacocineticas del sistema. Este es un enfoque bastante mas simple que la estrategia planeada por Bouhadir y colegas, basandose en el uso de conjugados de producto farmaceutico-pollmero. Adicionalmente, estos autores no proporcionan information sobre el perfil de degradation de los hidrogeles en un medio fisiologico, ni en lo que respecta a su porosidad, parametros cruciales relativos a su viabilidad como sistemas de liberacion controlada de farmacos. Ademas, los hidrogeles de alginato revelan propiedades mecanicas comparativamente malas. Para la misma concentration de agente de entrecruzamiento (ADH), la resistencia del hidrogel a fuerzas compresivas (proporcional al numero de enlaces intermoleculares) es menor que el hidrogel de alginato, lo que es probable que se traduzca tambien en un peor perfil de biodegradacion.

En la patente estadounidense US 6.991.652 B2, Burg y colegas describen materiales compuestos hechos de una matriz porosa de micropartlculas con geometrla variable (esferas, cilindros o una red), hecha preferentemente de colageno, que puede portarse en un fluido llquido o viscoso. En esta invention, los materiales compuestos se cultivan con celulas, que pueden proliferar y originar un nuevo tejido. Ademas, los materiales compuestos pueden administrarse mediante inyeccion, de una manera mlnimamente invasiva, reivindicandose que son utiles para una amplia gama de aplicaciones de ingenierla tisular. Se hace referencia a la dextrina como uno de los materiales que pueden constituir la fase de fluido que porta la matriz porosa, sin embargo la patente no describe como pueden obtenerse hidrogeles a partir de dextrina, cuya funcion parece ser aumentar la viscosidad de la fase de fluido. En la presente invencion, los hidrogeles de dextrina pueden asociarse, por ejemplo, con granulos bioactivos, partlculas de ceramica, biomoleculas o celulas, como en la invencion de Burg et al., y tambien con nanogeles, concretamente nanogeles de dextrina, dotando al material compuesto de versatilidad mejorada, concretamente permitiendo su uso para el transporte y la liberacion controlada de moleculas bioactivas. Ademas, esta invencion incluye una metodologla para la gelificacion de dextrina, que da como resultado propiedades mecanicas y biodegradabilidad controlables, favoreciendo su uso para la liberacion controlada de productos farmaceuticos asociada con el transporte de una fase solida en un sistema inyectable.

La patente WO2005/042048A2, de Hill et al., publicada en 2005, describe la production de hidrogeles inyectables hechos de protelnas y polisacaridos, con tiempos de gelificacion de aproximadamente 2 horas, que permiten la incorporation de productos farmaceuticos, concretamente, pero no solo, para regeneration osea. El concepto desarrollado para la estrategia de gelificacion se basa en este caso en la reactividad de los grupos de amina de las protelnas y los polisacaridos. En el caso de polisacaridos neutros, la oxidation debe llevarse a cabo en primer lugar. De esta manera se obtiene como resultado un proceso de gelificacion largo, en oposicion al obtenido en el caso de la presente invencion a traves del uso de ADH.

La patente japonesa JP2005/298644A2, desarrollada por Akiyoshi y colegas, describe la produccion de un hidrogel hlbrido, hecho de pululano. El hidrogel se obtiene mediante la polimerizacion radicalaria, usando una mezcla de metacriloil-pululano con un nanogel de pululano, tambien metacrilado. El nanogel se autoensambla a traves de la interaction hidrofoba de restos de colesterol injertados en el polisacarido. De esta manera se obtiene un hidrogel con un nanogel dispersado que puede portar productos biofarmaceuticos, concretamente protelnas. La presente invencion tambien contempla la incorporacion de un nanogel como dispositivo de liberacion controlada de farmacos, difiriendo de la invencion de Akiyoshi en aspectos relevantes, concretamente el alto peso molecular del pululano usado por Akiyoshi et al. (100 kDa) (en oposicion a la dextrina de bajo peso molecular) y el uso de un iniciador de polimerizacion, 2,2'-azobis [2-(2-imidazolin-2-il)propano. Aunque la patente no describe detalles con respecto a la inyectabilidad del hidrogel, el alto peso molecular del pululano plantea dudas referentes a la eficacia de la excretion biologica, incluso mas porque no queda claro si los enlaces intermoleculares son degradables. De hecho, tal como se ha notificado para hidrogeles de metacriloil-dextrina, es probable que los hidrogeles de metacriloil-pululano no sean degradables in vivo (Cadee et al., 2000). Por otro lado, el iniciador puede ser toxico (Ameer et al., 2001). Por tanto, el uso del hidrogel de dextrina, as! como del nanogel de dextrina, asociado con el metodo de gelificacion basado en dextrina oxidada y ADH como agente de reticulation, ofrece ventajas significativas, con respecto a la biocompatibilidad y capacidad de excrecion. Posteriormente, Akiyoshi et al. (documento JP2009/149526A2) notificaron el uso del mismo hidrogel para la liberacion controlada de citocinas.

La presente invencion es unica ya que introduce un hidrogel hecho de dextrina, un hidrogel obtenido a traves de metodos qulmicamente simples y baratos, sin usar catalizadores o iniciadores toxicos. Estos procesos crean una velocidad de gelificacion conveniente para la manipulation del material, permitiendo su inyectabilidad en, por ejemplo, un defecto tisular, con fines de regeneracion, permitiendo la produccion de hidrogeles con propiedades mecanicas y biodegradabilidad adecuadas para cada aplicacion. Estas caracterlsticas hacen posible la facil incorporacion, por ejemplo, de biomoleculas, ceramica bioactiva y celulas, as! como de nanogeles (por ejemplo de dextrina), dando como resultado, en el ultimo caso, un material compuesto multidimensional (con una fase hidrofoba dispersada a nivel nanometrico), con una versatilidad mejorada en vista de su uso como portador para la liberacion controlada de moleculas bioactivas.

La presente invencion se refiere a la produccion de hidrogeles hechos de dextrina y dihidrazida de acido adlpico,

que pueden ser inyectables, con aplicacion como 1) estructura principal para regeneracion tisular; 2) como portador de microesferas bioactivas, por ejemplo compuestos granulares osteogenicos bioactivos para adyuvancia en regeneracion osea; 3) encapsulacion celular; 4) vehlculo para moleculas bioactivas (concretamente protelnas o polisacaridos, por ejemplo colageno) que promueven la adhesion y proliferacion celular, y 5) nanogeles 5 autoensamblados (por ejemplo hechos de dextrina) asociados con sistemas de administracion de farmacos.

En esta invencion, se usa una metodologla rapida para preparar hidrogeles degradables a partir de dextrina oxidada (oDex) y dihidrazida de acido adlpico, sin el uso de ningun iniciador qulmico. Pueden obtenerse periodos de gelificacion de desde 1 hasta 30 minutos, dependiendo de la concentracion de los componentes.

La cadena de homopolisacarido de dextrina puede oxidarse usando acido peryodico. El ion peryodato ataca uno de 10 los grupos hidroxilo del diol vecino en residuos de dextrina, entre las posiciones C2-C3 del anillo de glucopiranosido, rompiendo el enlace C-C y produciendo dos grupos aldehldo reactivos. Los aldehldos reaccionan con moleculas tales como acido adlpico (ADH), que a su vez actua como agente de reticulacion, dando lugar a hidrogeles. La concentracion de agente de entrecruzamiento afecta directamente a la densidad de enlaces intermoleculares, lo que a su vez influye en las propiedades mecanicas, de degradacion y de gelificacion de los hidrogeles. Sin embargo, la 15 cantidad de ADH usada debe optimizarse teniendo en cuenta el numero de residuos oxidados disponibles, de modo que se maximice el numero de enlaces qulmicos viables, en detrimento de la aparicion de grupos colgantes. Ademas, la presencia de excesivos grupos reactivos puede comprometer las propiedades mecanicas de hidrogeles por medio de impedimento esterico, por lo que debe moderarse el grado de funcionalizacion de la cadena polimerica.

20 Los hidrogeles de oDex/ADH son degradables tanto hidrollticamente, a nivel de sus enlaces intermoleculares covalentes, como enzimaticamente, a traves de la accion a-amilasa. Dependiendo de la densidad de entrecruzamiento es posible obtener diferentes perfiles de degradacion. La estructura apretada de poros de cientos de nanometros altamente interconectados se suelta suavemente a lo largo del proceso de degradacion, permitiendo predecir cierta conformidad hacia la invasion celular, una vez que el material se ha inyectado, especialmente si la 25 matriz presenta senales quimioatrayentes o peptidos de adhesion, que pueden introducirse facilmente (por ejemplo usando nanogeles cargados con moleculas bioactivas).

En cuanto a la biocompatibilidad, los hidrogeles de dextrina no son toxicos. Las celulas se adhieren y proliferan a lo largo de su superficie de contacto, permitiendo la perspectiva de una buena interaccion tejido-hidrogel in vivo. Adicionalmente, los hidrogeles de oDex/ADH no son hemollticos.

30 Pueden destacarse muchas ventajas con respecto a los hidrogeles de oDex/ADH en comparacion con otros hidrogeles conocidos, concretamente 1) una metodologla de production simple y rapida; 2) ausencia de iniciadores qulmicos (generalmente toxicos); 3) bajo peso molecular (lo que favorece la biodegradation y el aclaramiento renal); 4) biocompatibilidad; 5) posibilidad de inclusion/encapsulacion de moleculas/celulas especlficas; 6) material de partida derivado de manera natural, de bajo coste, y ya disponible en calidad medica; 7) potencial para servir como 35 portador de sistemas microparticulados, por ejemplo para aplicaciones de regeneracion osea; 8) gran potencial para servir como sistema de liberation controlada de farmacos, tanto para productos biofarmaceuticos (protelnas terapeuticas) como moleculas insolubles en agua (a traves de la incorporation de nanogeles con nucleos hidrofobos).

Sumario de la invencion

40 La presente invencion se preparo en vista de la tecnica anterior descrita anteriormente y el objeto de la presente invencion son formulaciones de hidrogel de dextrina oxidada reticulada con dihidrazida de acido adlpico que comprende la siguiente estructura:

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que presenta la capacidad de incorporacion dentro de su estructura porosa tridimensional.

45 En una realization preferida el hidrogel incorpora polisacaridos tales como quitosano, acido hialuronico, entre otros;

protelnas, tales como colageno, fibronectina, caselna, entre otros; nanogeles; materiales granulares; moleculas bioactivas y celulas.

En otra realizacion preferida, las protelnas estan incluidas en un porcentaje de entre el 0-20 de la composition de hidrogel, en peso seco, y los polisacaridos estan incluidos en un porcentaje de entre el 0-20 de la composicion de 5 hidrogel, en peso seco.

El hidrogel de la presente invention es inyectable, no toxico no hemolltico.

En otra realizacion el hidrogel se obtiene a partir de una dextrina con un grado de oxidation de entre el 10-50%, preferiblemente entre el 25-35%, con un bajo peso molecular, entre 1200-8000 Da y presenta una estructura porosa continua, con un diametro de aproximadamente 1 mm.

10 Ademas, en otra realizacion, la biodegradation del hidrogel se produce mediante erosion, o bien superficial o bien erosion volumetrica, y se caracteriza por un perfil de degradation no lineal acompanado de un aumento en el tamano del poro.

En otra realizacion preferida la degradacion del hidrogel se produce hidrollticamente, al nivel de sus enlaces intermoleculares covalentes, o enzimaticamente, a traves de la action a-amilasa presente en tejidos humanos o 15 incluida en la formulacion de hidrogel.

Otro objeto de la presente invencion es el metodo de production de la formulation de hidrogel, que comprende las siguientes etapas:

a) oxidar la dextrina con acido peryodico;

b) eliminar el peryodato sin reaccionar;

20 c) gelificar desde 1 hasta 30 minutos, mediante la adicion de un agente de reticulation, tal como dihidrazida de acido adlpico, preferentemente a un pH en el intervalo de 5,0-7,5, y a una concentration de entre el 3-40%, preferiblemente entre el 3-10%, en base molar en relation con los residuos de glucosa.

En una realizacion preferida la concentracion de dextrina oxidada es de entre el 5-40% (p/v), preferiblemente entre el 25-30% (p/v).

25 En otra realizacion preferida se incorpora un nanogel en el hidrogel en una proporcion del 1-25% del peso de dextrina, mezclando el nanogel con la dextrina oxidada, antes de la adicion de ADH, siendo las dimensiones del nanogel de entre 10-10000 nm.

En otra realizacion preferida el nanogel se carga previamente con productos farmaceuticos.

Otro objeto de la presente invencion es el uso del hidrogel para regeneration tisular y liberation controlada de 30 farmacos.

Otro objeto de la presente invencion es un biomaterial que comprende el hidrogel.

Ademas, la presente invencion se refiere a un sustituto de hueso sintetico que comprende el hidrogel.

Otro objeto de la presente invencion es un sistema para la administration controlada de farmacos que comprende el hidrogel.

35 Otro objeto de la presente invencion es un implante oseo o relleno oseo que comprende el hidrogel.

Ademas la presente invencion se refiere a una composicion que comprende un hidrogel.

Finalmente, la presente invencion se refiere a una protesis medica que comprende el hidrogel de la presente invencion.

Descripcion de los dibujos

40 Figura 1 - Oxidacion con peryodato de la dextrina, produciendo dos grupos aldehldo en las posiciones C2 y C3 de una unidad de D-glucosa.

Figura 2 - Espectro de 1H-RMN de dextrina oxidada (DO del 25%).

Figura 3 - Reaccion de polimerizacion de oDex con ADH y productos de degradacion mediante hidrolisis.

Figura 4 - Variacion de los tiempos de entrecruzamiento con el grado de oxidacion y la concentracion de dihidrazida de acido adlpico. (+) a lo largo de 1 h de gelificacion (++) gelificacion en menos de 30 min (+++) gelificacion en 5 menos de 1 min. El material se considero gelificado cuando dejo de deslizarse a lo largo de una superficie inclinada 90°. * Calculado como la razon molar de peryodato de sodio por unidad de glucosa inicial en dextrina. ** Calculado en base molar, teniendo en cuenta el numero de residuos de glucosa en la dextrina original.

Figura 5 - Curva de compresion que muestra el comportamiento tlpico para un hidrogel de oDex DO del 35% con un 4% de ADH.

10 Figura 6 - Modulo de compresion de (A) hidrogeles de oDex entrecruzados como una funcion de la concentracion de ADH (en razon molar, teniendo en cuenta el numero de residuos de glucosa en la dextrina original, oDex DO del 35% (30% p/v) en tampon fosfato 0,1 M, pH 6,0), y (B) hidrogeles de oDex entrecruzados como una funcion del grado de oxidacion de dextrina (oDex DO del 35% y un 5% de ADH en tampon fosfato 0,1 M, pH 6,0)). Los resultados se presentan como promedio ± DE, n=3. ns: no significativo, p > 0,05; ** p < 0,01, en comparacion con la 15 maxima concentracion de ADH usada.

Figura 7 - Modulo de compresion de hidrogeles de oDex entrecruzados como una funcion del disolvente en el que se preparan. Se prepararon todos los hidrogeles con oDex (30% p/v) y 5% ADH. Los resultados se presentan como promedio 6 DE, n=3. ns: no significativo, p > 0,05; * p < 0,05, en comparacion con el disolvente en el que los hidrogeles se sintetizan normalmente (tampon fosfato 0,1 M, pH 6,0).

20 Figura 8 - Valores de absorbancia de MTT obtenidos tras 48 h de incubacion de celulas 3T3 en contacto directo con (A) diferentes concentraciones de agente de reticulacion (ADH) solo, y (B) diferentes concentraciones de dextrina oxidada sola. Los resultados se presentan como promedio ± DE, n=3. ** p < 0,01, en comparacion con el control T0 (24 h tras la siembra de las celulas).

Figura 9 - Valores de absorbancia de MTT obtenidos tras 48 h de incubacion de celulas 3T3 con productos de 25 degradacion (diluciones 1:1, 1:2 y 1:4) de hidrogeles de oDex (DO del 35% y al 40%). Los resultados se presentan como promedio ± DE, n=3. Ns: no significativo, p>0,05; *p<0,05; ** p < 0,01, en comparacion con el control T0.

Figura 10 - Evaluation morfologica de celulas 3T3 en contacto directo con hidrogeles de dextrina (DO del 35%), placas de cultivo de celulas TCPS (control), gel de agarosa (control negativo) y caucho de latex (control positivo). Aumento de 10x. Las sombras oscuras en el lado izquierdo muestran parte del disco de latex o hidrogel.

30 Figura 11 - Valores de absorbancia de MTT obtenidos tras 48 h de incubacion de celulas 3T3 en hidrogeles de oDex (DO del 35% y del 40%). Los resultados se presentan como promedio ± DE, n=3. ** p < 0,01, en comparacion con el control T0.

Figura 12 - Imagenes de crio-SEM a partir de una section transversal de hidrogel de oDex (A) antes y (B) despues de la inmersion en tampon PBS durante 24 horas y (C, D) hidrogel de oDex-nanogel. Las flechas muestran los 35 nanogeles de dextrina (oDex DO del 35%).

Figura 13 - Perfiles de perdida de masa y liberation acumulativa de nanogel de oDex, oDex-nanogel (1 mg/ml) y oDex-nanogel (3 mg/ml). Se muestran la media ± DE, n=6.

Descripcion detallada de la invencion

Los biomateriales estan presentes en un numero creciente de aplicaciones cllnicas, siendo una herramienta 40 fundamental en nuevas tecnologlas tales como ingenierla tisular, administration dirigida de productos farmaceuticos, medicina regenerativa, etc. La biocompatibilidad de biomateriales es un requisito principal. Idealmente, entre otras propiedades, un biomaterial debe ser no toxico, no inmunogenico, tener una interaction favorable con celulas y tejidos, a la luz de la aplicacion prevista. Para varias aplicaciones, tales como ingenierla tisular y administracion de farmacos, la biodegradabilidad y la eliminacion/excrecion completa son altamente deseables. La dextrina, aunque es 45 bastante abundante, barata y esta disponible en calidad medica, se ha considerado hasta la fecha como un material prometedor, pero por un numero restringido de cientlficos. De hecho, aunque parece reunir una biocompatibilidad excelente, con particular interes la elimination eficaz mediante los sistemas biologicos, debido a su bajo peso molecular y biodegradacion mediante amilasas. Esta invencion describe un hidrogel hecho de dextrina con propiedades interesantes para aplicaciones biomedicas que incluyen, pero no unicamente, la administracion de 50 productos farmaceuticos y regeneracion tisular. El simple hecho de que el hidrogel este hecho de dextrina

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representa una ventaja significativa.

Esta invencion se refiere a una formulacion novedosa de hidrogeles hechos de dextrina oxidada reticulada con dihidrazida de acido adlpico, que presenta la capacidad de encerrar dentro de su estructura porosa tridimensional polisacaridos, protelnas, nanogeles, micropartlculas o celulas, para regeneracion tisular y administracion de agentes bioactivos.

Se obtienen hidrogeles a base de dextrina a partir de procedimientos qulmicos mas sencillos, mas rapidos y mas economicos, en comparacion con otras formulaciones existentes, y no requieren ningun catalizador ni iniciador toxico para desencadenar la reaccion de entrecruzamiento. La propia dextrina garantiza propiedades superiores para estos hidrogeles, tales como la capacidad de aclararse de manera eficaz del cuerpo humano, debido a su bajo peso molecular y biodegradabilidad.

Oxidacion de dextrina

En el contexto de esta invencion, la dextrina, un pollmero derivado de manera natural, se usa como material de partida para producir hidrogeles. La dextrina es un pollmero sacarido que contiene glucosa unido mediante unidades de D-glucosa en a-1,4, que contienen pocos enlaces a-1,6 (< 5%), que tiene la misma formula general que el almidon, pero mas pequeno y menos complejo. En la presente invencion, se oxida una cadena de homopolisacarido de dextrina usando acido peryodico. El ion peryodato ataca uno de los grupos hidroxilo del diol vecino en residuos de dextrina, entre las posiciones C2-C3 del anillo de glucopiranosido (figura 1), rompiendo el enlace C-C y produciendo dos grupos aldehldo reactivos.

La cuantificacion de grupos aldehldo, es decir el grado de oxidacion (DO), puede realizarse usando el acido trinitrobencenosulfonico (tBC). Se sabe bien que los carbazatos reaccionan con aldehldos para formar carbazonas estables de una manera similar a la formation de hidrazonas, haciendo posible determinar el contenido en aldehldo de dextrina mediante analisis de espectroscopla de 1H-RMN.

El grado de oxidacion de oDex puede controlarse facilmente mediante la cantidad relativa de peryodato de sodio usada, posibilitando que los grupos aldehldo reactivos libres creen enlaces covalentes con moleculas de reticulation (por ejemplo ADH), as! como con peptidos de union por adhesion celular (por ejemplo, GRGDY) o incluso con farmacos especlficos para sistemas de administracion controlada.

Gelificacion - hidrogel de oDex/ADH

El grado de polimerizacion promedio de la dextrina es de aproximadamente 10-12. Cada molecula debe participar en dos enlaces distintos con diferentes moleculas para reticularse eficazmente. La formacion de mas de dos enlaces no implica necesariamente una potenciacion de las propiedades mecanicas de los hidrogeles (vease el ejemplo 2). La modification excesiva de la cadena polimerica original, que hace que este disponible un mayor numero de grupos oxidados reactivos puede ser perjudicial para la organization molecular de la nueva estructura polimerica, por medio de impedimento esterico por transposition. En la presente invencion, la dextrina oxidada presenta un DO de entre el 10-50%, preferiblemente entre el 25-35%, lo que significa de dos a tres residuos de glucosa oxidada en promedio por molecula de dextrina. DO superiores al 50% producen disoluciones muy viscosas que reaccionan inmediatamente con ADH, afectando a la buena homogenization, y dando como resultado hidrogeles mates y quebradizos.

Los grupos hidrazida en ADH reaccionan con los grupos aldehldo en oDex y forman una red de enlaces hidrazona hidrolizables (figura 3). Una vez que se escinden estos enlaces covalentes, la dextrina puede difundir facilmente a traves de tejidos humanos y eliminarse mediante aclaramiento renal, debido al bajo peso molecular, bastante por debajo del umbral renal (-40.000 Da). Por tanto, ademas de los enlaces glicosldicos que se producen de manera natural en la dextrina, los enlaces hidrazona proporcionan un nivel de control adicional sobre las propiedades mecanicas de estos hidrogeles. El porcentaje de dihidrazida de acido adlpico para producir los hidrogeles proporcionados por esta invencion se situa entre el 3-40%, preferiblemente entre el 3-10% (en razon molar de acido adlpico con respecto a residuos de dextrina oxidada). El ejemplo 2 muestra el estudio de la influencia de la concentration de acido adlpico sobre las propiedades mecanicas de los hidrogeles de oDex. Las concentraciones crecientes de agente de reticulacion dan como resultado reacciones de entrecruzamiento mas rapidas y, en consecuencia, una difusividad afectada del agente de entrecruzamiento a traves de la malla polimerica. Asl, una cantidad excesiva de ADH no producira una matriz polimerica homogenea con buenas propiedades mecanicas. Por otro lado, cantidades desmedidas de esta molecula homobifuncional en un estado no polimerizado pueden revelarse como citotoxicas. Por tanto, debe minimizarse la concentracion de ADH, y optimizarse segun la concentracion de pollmero y su DO.

En esta invencion, la concentracion de dextrina oxidada para la preparation de hidrogeles de oDex se situa entre el 5-40% (p/v), preferiblemente entre el 25-30% (p/v). Por encima de estas concentraciones, la solubilization de

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dextrina es impracticable, y por debajo de las mismas los tiempos de entrecruzamiento son demasiado altos (es decir, de mas de 24 h).

Se conoce bien que la reactividad de grupos hidrazida con aldehldos es optima a menores valores de pH. En condiciones acidas, los aldehldos se protonan y son mas susceptibles de ataque nucleofilo por los grupos hidrazida. Sin embargo, en condiciones de neutras a basicas, estan en vigor cineticas mas lentas y se requiere un intervalo de tiempo mas largo para que se complete la reaccion, produciendo un menor grado de entrecruzamiento funcional. No obstante, los hidrogeles a base de dextrina proporcionados en el presente documento pueden prepararse a pH fisiologico, sin comprometer sus propiedades mecanicas y gelificando en 1-30 min. Este periodo de tiempo adecuado permite la manipulacion e inyeccion sin prisas del hidrogel, y su ajuste apropiado en el defecto que pretende regenerarse o el sitio para la liberation controlada de farmaco. Estos hidrogeles no requieren ningun disolvente especial, todos sus componentes son solubles en agua a temperatura ambiente.

Perfiles de degradation de hidrogeles de oDex/ADH

Los hidrogeles de oDex experimentan hidrolisis y se degradan las uniones entrecruzadas con el tiempo. El hinchamiento aumentado a lo largo del tiempo es una consecuencia de la hidrolisis de los entrecruzamientos (enlaces hidrazona) en la red del hidrogel. Cuando se hidrolizan los entrecruzamientos en el hidrogel, la red se hincha y embebe mas agua, conduciendo a una hidrolisis adicional. Una vez que se rompen los enlaces, las dihidrazidas y la dextrina oxidada pueden difundir a traves de los tejidos y eliminarse por el organismo, gracias a sus bajos pesos moleculares, mediante lo cual los perfiles de biodegradation de los hidrogeles de dextrina son especialmente interesantes para aplicaciones biomedicas, en las que se requiere una bioabsorcion gradual del biomaterial implantado, especialmente en casos de regeneration tisular. El ejemplo 3 presenta estudios del perfil de degradacion realizados con hidrogeles de oDex/ADH proporcionados por esta invencion.

Biocompatibilidad

La biocompatibilidad de los hidrogeles constituye una cuestion de suma importancia en la perspectiva de su aplicacion farmaceutica o biomedica. Se considera que un material es biocompatible cuando verifica un complejo y amplio conjunto de condiciones (norma ISO 10993, 1992), incluyendo la ausencia de citotoxicidad y la no estimulacion de una respuesta inflamatoria agravada. Generalmente, los hidrogeles presentan buena biocompatibilidad. La determination del potencial citotoxico de los materiales puede ser cualitativa y/o cuantitativa (norma ISO 10993-5, 1992). La evaluation cualitativa se basa en la observation microscopica de celulas, que tiene como objetivo sacar conclusiones sobre su morfologla general, vacuolization, adhesion celular y lisis de membrana. La evaluacion cuantitativa se basa a su vez en Indices de mortalidad, crecimiento, inhibition y proliferation celular, o formation de colonias. El ejemplo 4 proporciona los estudios de biocompatibilidad in vitro de hidrogeles de oDex, que se aplican a ambos metodos de evaluacion mencionados anteriormente. Los hidrogeles a base de dextrina proporcionados por la presente invention no son toxicos. Las celulas se adhieren y proliferan a lo largo de su superficie de contacto, permitiendo la perspectiva de una buena interaction tejido-hidrogel in vivo.

Hidrogel DexOx/ADH -moleculas bioactivas y celulas

Las propiedades mecanicas de los hidrogeles (modulo de compresion) as! como su interaccion con celulas y tejidos, in vivo, pueden verse favorecidas por la inclusion de protelnas (el 0-20% de la composition de los hidrogeles, en peso seco) y polisacaridos (el 0-20% de la composicion de los hidrogeles, en peso seco) en la formulation inicial. Es probable que la mayor densidad obtenida, asociada a efectos de entrecruzamiento, mejore la estabilidad en presencia de tension mecanica. Las protelnas tales como colageno, fibronectina, caselna, entre otros, pueden alterar la densidad de los hidrogeles, estableciendo enlaces con grupos oxidados no reticulados a traves de grupos de amina. Por otro lado, las protelnas (por ejemplo, colageno y fibronectina) presentan secuencias peptldicas (por ejemplo, RGD), que promueven una adhesion celular mas eficaz, lo que puede ser necesario para potenciar la viabilidad y proliferacion de celulas incorporadas en el hidrogel, para fomentar los mecanismos de regeneracion tisular, por ejemplo, a traves de la administration de factores de crecimiento. El uso de polisacaridos tales como quitosano o acido hialuronico, entre otros, permiten la variation de la carga de superficie de los hidrogeles, haciendo que sea positiva o negativa, respectivamente. Adicionalmente, la selection del peso molecular de los polisacaridos usados (degradables para los casos mencionados) permite la modulation de las propiedades mecanicas de los hidrogeles y perfiles de degradacion.

Hidrogel DexOx/ADH - Nanogel

La incorporation de nanogeles, compuestos por dextrina modificada, manano, quitosano o acido hialuronico, pero no exclusivamente, obtenidos mediante autoensamblaje a traves de los restos hidrofobos injertados, permiten la incorporacion en el hidrogel de una fase hidrofoba nanodispersada, constituida por nucleos hidrofobos que permiten la disolucion de productos farmaceuticos escasamente solubles en agua. La incorporacion del nanogel en el hidrogel se lleva a cabo mezclando el nanogel con la dextrina oxidada, antes de la adicion de ADH (vease el ejemplo 5). El

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nanogel puede cargarse previamente con productos farmaceuticos (por ejemplo estatinas, farmacos antiinflamatorios o, practicamente, cualquier molecula hidrofoba). El uso del nanogel permite, de manera facil, la incorporacion de moleculas que, siendo escasamente solubles en agua, apenas se incorporarlan en el entorno hidratado de un hidrogel. Por otro lado, la nanofase de los nucleos hidrofobos actua como sistema de liberacion controlada. La liberacion esta controlada, en este sistema, no solo por la transferencia de masa mediante difusion y la velocidad de degradacion del gel. El uso de nanogeles con diferentes dimensiones (10-10000 nm, segun el polisacarido usado), permite un control adicional sobre la liberacion de los productos farmaceuticos.

Las partlculas de nanogel pueden actuar como deposito de farmaco desde el que puede activarse la liberacion mediante un estlmulo (al que son sensibles), o simplemente liberarse de manera controlada por difusion. Puede obtenerse la difusion simultanea de moleculas de diferente naturaleza desde la misma plataforma, anadiendo dos (o mas) poblaciones diferentes de nanogeles cargados con diferentes farmacos en la misma matriz de hidrogel, en la que la velocidad de liberacion de cada soluto esta controlada mediante la interaction entre el hidrogel y los nanogeles. La principal ventaja reside en la mejora del perfil de liberacion cinetica del farmaco, ya que la fase de hidrogel proporciona una barrera frente a la difusion adicional que modera o elimina la liberacion por estallido inicial tlpica observada en sistemas de administration de farmacos de hidrogel o nanogel.

Ejemplos

A continuation en el presente documento, se describe la presente invention con mas detalle y especlficamente con referencia a los ejemplos, que sin embargo no pretenden limitar la presente invencion.

Ejemplo 1 - Hidrogel de oDEx/ADH

Oxidation de la dextrina. Se oxidaron disoluciones acuosas de dextrina (al 2% p/v) con una disolucion de m- peryodato (Panreac) de 2 ml, cuya concentration vario segun el grado de oxidacion teorico (DOt) deseado. Se envolvieron los matraces en papel de aluminio y se agito la reaction durante 20 h a temperatura ambiente, tras lo cual se anadio gota a gota una cantidad equimolar de dietilenglicol para reducir cualquier cantidad de peryodato sin reaccionar. Se dializo la disolucion resultante durante 3 dlas frente a agua, usando una membrana de dialisis con un MWCO de 1000 Da, y luego se liofilizo durante 10 dlas (figura 1).

Determination de grupos aldehldo mediante analisis de 1H-RMN. Se define el grado de oxidacion (DO) de oDex como el numero de residuos oxidados por 100 residuos de glucosa, cuantificado usando el carbazato de terc-butilo (tBC). Se disolvio oDex en tampon fosfato pH 6,0, 0,1 M (1 ml, 1% p/v), posteriormente se disolvio un exceso de 5 veces de tBC en el mismo tampon (1 ml) y se anadio por separado. Se permitio que la mezcla reaccionara durante 24 h a temperatura ambiente. Entonces se retiro el tBC de bajo peso molecular en exceso usando un sistema de columna de desalacion PD-10 y se liofilizo el filtrado durante 48 h. Despues de eso, se disolvio el producto resultante en agua deuterada (D2O) (7,5 mg/ml) y se analizo mediante 1H-RMN. Se uso el espectro de 1H-RMN para determinar el DO calculado como una proportion del area de pico en los espectros de RMN segun la ecuacion 1.

DO (%) = (X/Y) x 100 (ec. 1)

donde, X es la integral promedio a 8 7,3 ppm correspondiente a los protones conectados a los carbonos que se modificaron con tBC e Y es la integral promedio de los protones anomericos a 8 4,8 ppm y 8 5,4 ppm

Preparation de hidrogeles oDex-ADH. Se disolvio oDex en tampon fosfato pH 6,0, 0,1 M (al 30% p/v) a temperatura ambiente y se anadio una disolucion de dihidrazida de acido adlpico (ADH) (preparada por separado) a diferentes concentraciones (al 5%, al 15% y al 30% en base molar, teniendo en cuenta el numero de residuos de glucosa en la dextrina original). Se permitio que avanzase la reaccion de entrecruzamiento durante 2 h. Se considero el material gelificado cuando se detuvo el deslizamiento a lo largo de una superficie inclinada 90°.

La figura 2 representa un espectro de 1H-RMN tlpico obtenido para la dextrina oxidada al 25% (oDex al 25%). Los picos entre 8 4,0 y 8 3,4 ppm se asignan a protones en las posiciones 2, 3, 4, 5 y 6, mientras que el pico a 8 5,4 ppm se atribuye al proton anomerico de la unidad de glucosa. El espectro tambien muestra un pequeno pico a 8 5,3 ppm correspondiente al proton anomerico en la dextrina con uniones a-1,6. Los tres picos entre 8 7,4 y 8 7,2 ppm se asignan al proton unido al carbono que se modifico con tBC, y el singlete a 8 1,5 ppm se asigno a tBC.

Para evaluar el perfil de gelificacion de hidrogeles de oDex, se accedio a la solubilidad de oDex. Se prepararon varias disoluciones de pollmero de oDex con diferentes concentraciones en tampon fosfato pH 6,0. Se observo que las disoluciones superiores al 30% (p/v) eran extremadamente viscosas y practicamente imposibles de homogeneizar. Asl, se considero esta concentracion como el umbral de la solubilidad de oDex en tampon fosfato pH 6,0, y se aplico mas adelante en la slntesis de todos los hidrogeles de oDex. A continuacion, se sometio oDex a entrecruzamiento con diversas concentraciones de dihidrazida adlpica (figura 3). Se produjeron inicialmente doce muestras de hidrogel con DO que variaban entre el 25% y el 50% y concentraciones de ADH de entre el 5% y el

30% (en razon molar, teniendo en cuenta el numero de residuos de glucosa en la dextrina original).

La figura 4 muestra los periodos de gelificacion aproximados obtenidos. Tal como se esperaba, los tiempos de entrecruzamiento disminuyen con DO crecientes, as! como con cantidades crecientes de agente de reticulacion. Se hallo que DO superiores al 40% producen disoluciones muy viscosas que reaccionan inmediatamente con ADH, 5 afectando la buena homogenizacion, y dando como resultado hidrogeles mates y quebradizos. A traves del control del DO y las concentraciones ADH, es posible por tanto un buen control sobre el tiempo de gelificacion, haciendo que este hidrogel sea adecuado como sistema inyectable.

Ejemplo 2 - Propiedades mecanicas

Se evaluaron las propiedades mecanicas de hidrogeles de dextrina entrecruzados usando una maquina de ensayos 10 mecanicos, el instrumento de ensayos Shimadzu-AG-IS 1 kN. Se coloco cada disco de hidrogel (area superficial = 133 mm2) entre dos placas circunferenciales metalicas paralelas, de modo que la fuerza de compresion fuese uniforme a lo largo de la muestra, y se comprimio a temperatura ambiente con una velocidad de deformacion constante de 0,5 mm min-1. El modulo de compresion de los hidrogeles es directamente proporcional a la densidad de entrecruzamientos intermoleculares. Asl, se evaluo la influencia de la concentracion de ADH, el DO y tambien el 15 tipo de disolvente usado sobre la extension de entrecruzamiento intermolecular, cuantificando el modulo de compresion de los hidrogeles de oDex.

La figura 5 presenta una curva de compresion tlpica para los hidrogeles de oDex, a partir de la que se determino el modulo de compresion, usando la ecuacion 2:

Modulo de compresion (KPa) = (tension max. / area superficial) x 10-3 (ec. 2)

20 Para cada condicion, se analizaron muestras por triplicado; los valores facilitados en las figuras 6 y 7 representan la media y la desviacion estandar.

La concentracion creciente de ADH dio como resultado un aumento en el modulo de compresion de hidrogeles de oDex entrecruzados (figura 6A), lo que sugiere el establecimiento de un numero creciente de enlaces intermoleculares ya que estan disponibles para reaccionar mas grupos hidrazida. Se notifico la misma tendencia por 25 Maia et al. (2005) con hidrogeles de dextrano y por Bouhadir et al. (1999) con hidrogeles de poli(aldehldo- guluronato), revelando los primeros una fuerza de compresion inferior incluso con mayores concentraciones de agente de reticulacion. De hecho, el maximo modulo de compresion obtenido con hidrogeles de guluronato fue de 560 KPa, con ADH 150 mM, mientras que con aproximadamente 130 mM (equivalente al 10% en razon molar) se registro un modulo de compresion de 600 KPa para hidrogeles de oDex al 35%. Por tanto, los hidrogeles de dextrina 30 parecen tener mejores propiedades mecanicas.

Se evaluo la influencia del grado de oxidacion sobre los entrecruzamientos intermoleculares, y no se identifico una relacion de proporcionalidad directa entre el modulo de compresion y el DO. Los hidrogeles de oDex de DO del 25% revelaron la maxima fuerza de compresion (aproximadamente de 533 KPa), aunque no hubo ninguna diferencia significativa (p>0,05) con relacion a hidrogeles de oDex de mayor DO (figura 6B).

35 Los hidrogeles inyectables deben poder proseguir su procedimiento de polimerizacion in situ, lo que significa que los llquidos intersticiales y/o la sangre no deben interferir en el mismo, por ejemplo mediante la influencia del pH del medio. Ademas, las condiciones intrlnsecas necesarias para la formacion del hidrogel no deben ser nocivas para los tejidos circundantes. Asl, se evaluo la influencia del pH sobre la densidad de enlaces intermoleculares midiendo el modulo de compresion de diversos hidrogeles de oDex preparados en cuatro disolventes diferentes: agua dd 40 (aproximadamente pH 5,77), tampon fosfato 0,1 M (pH 6,0), PbS (pH 7,4) y cDMEM (aproximadamente pH 7,5), respectivamente. Se muestran los resultados en la figura 7. De hecho, se conoce bien que la reactividad de grupos hidrazida con aldehldos es optima a menores valores de pH. En condiciones acidas, los aldehldos se protonan y son mas susceptibles de ataque nucleofilo por los grupos hidrazida. Sin embargo, en condiciones de neutras a basicas, estan en vigor cineticas mas lentas y se requiere un intervalo de tiempo mas largo para que se complete la reaccion, 45 produciendo un menor grado de entrecruzamiento funcional. Una posible explicacion de los bajos valores del modulo de compresion (58 KPa) de hidrogeles preparados en cDMEM, podrla asignarse a la presencia de aminoacidos en disolucion, que podrlan estar interaccionando con grupos aldehldo en oDex, tras la hidrolisis de enlaces hidrazona. p

Ejemplo 3 - Biocompatibilidad

Se evaluo la citotoxicidad celular para disoluciones de macromonomeros no entrecruzados, hidrogeles 50 entrecruzados y extractos de degradacion de hidrogeles usando los ensayos Live and Dead® y MTT, tal como se describe a continuacion.

Cultivo de fibroblastos embrionarios de raton 3T3. Se hicieron crecer fibroblastos embrionarios de raton 3T3 (ATCC

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CCL-164) en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (Sigma) complementado con suero de ternero recien nacido al 10% (Invitrogen, R.U.) y penicilina/estreptavidina 1 pg/ml (medio completo DMEM) a 37°C en el 95% de aire humidificado que contiene el 5% de CO2. A una confluencia del 80%, se recogieron los fibroblastos 3T3 con tripsina- EDTA al 0,05% (p/v) y se subcultivaron en el mismo medio.

Ensayo Live and Dead. Se uso el kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD® para celulas de mamlfero (Invitrogen, R.U.) para determinar la viabilidad celular. Este kit proporciona un ensayo de viabilidad celular mediante fluorescencia de dos colores, basandose en la determinacion simultanea de las celulas vivas y muertas con dos sondas que miden la actividad esterasa intracelular y la integridad de la membrana plasmatica.

Se sembraron fibroblastos embrionarios de raton 3T3 (5 x 104 celulas/pocillo) en una placa de poliestireno de 6 pocillos (Orange Scientific) y se incubaron a 37°C, el 5% de CO2 durante 24 horas. Entonces, se retiro el medio de cultivo y se colocaron discos de hidrogel (0 4mm, grosor de 2 mm) en los pocillos, en contacto directo con las celulas. A intervalos de tiempo regulares, se anadieron 200 ml de una disolucion de calcelna AM 2 pM y homodlmero-1 de etidio 4 pM, en PBS esteril, a los pocillos, se incubaron durante de 30 a 45 minutos a 37°C, el 5% de CO2 (tal como indica el fabricante) y se visualizaron en un microscopio de fluorescencia. Se usaron discos de latex y gel de agar (Farmacopea de los Ee.UU.) como controles positivos y negativos, respectivamente.

MTT. Se determino la viabilidad de las celulas de fibroblasto 3T3 usando el ensayo de bromuro de 3-[4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma-Aldrich, EE.UU.). El ensayo MTT mide con precision la actividad de celulas vivas mediante la actividad deshidrogenasa mitocondrial. Las deshidrogenasas mitocondriales de celulas viables escinden el anillo de tetrazolio, produciendo cristales de MTT-formazan de color purpura que pueden disolverse en DMSO, dando como resultado una disolucion de color purpura que se mide de manera espectrofotometrica. El aumento del numero de celulas da como resultado un aumento de la absorbancia.

Tambien se evaluo la adhesion de los fibroblastos a hidrogeles de oDex, mediante el ensayo MTT. Para este ensayo, se formaron hidrogeles de oDex en el fondo de los pocillos de una placa de cultivo de poliestireno de 96 pocillos. Tras 2 h de polimerizacion, se lavaron los hidrogeles de oDex con PBS y tres veces con cDMEM. Entonces, se anadieron celulas de fibroblastos 3T3 (3x103 celulas/pocillo) a cada pocillo. Se renovo el medio de cultivo cada 2 dlas. Para los ensayos de control, se hicieron celulas directamente en el fondo de los pocillos. Tras 48 h, se lavaron cuidadosamente los hidrogeles tres veces con PBS, para retirar las celulas flotantes, y se desprendio la capa celular antes de llevar a cabo el ensayo MTT.

Tambien se evaluo la biocompatibilidad de los extractos de degradacion de hidrogeles. En pocas palabras, se sembraron celulas de fibroblastos 3T3 (5x102 celulas/pocillo) en una placa de poliestireno de 96 pocillos y se expusieron a extractos de degradacion de hidrogeles (200 pl; diluciones 1:1, 1:2 y 1:4) obtenidos por separado a partir de tres hidrogeles de oDex (DO del 40%). Tras 48 h de incubacion a 37°C, se evaluo la citotoxicidad de los extractos usando el ensayo MTT. Ademas, tambien se sometieron a prueba la dextrina oxidada y ADH solos para determinar su potencial citotoxico. Brevemente, se expusieron las celulas 3T3 (5x102 celulas/pocillo) sembradas en una placa de poliestireno de 96 pocillos a concentraciones crecientes de estos componentes durante 48 h a 37°C, tras lo cual se evaluo la citotoxicidad usando el ensayo MTT. Se esterilizo en primer lugar la dextrina oxidada mediante el proceso de esterilizacion con oxido de etileno (ETO). Se realizaron todas las mediciones de biocompatibilidad por triplicado o mas y los resultados facilitados son la media.

Las figuras 8A y 8B representan los valores de absorbancia de MTT obtenidos tras una incubacion durante 48 horas con diferentes concentraciones de ADH y oDex, respectivamente. Tras una incubacion durante 48 horas, mayores concentraciones de ADH (al 2-4% p/v) inducen muerte celular. Sin embargo, cuando la cantidad de ADH usada para formar los hidrogeles de oDex (al 5% en base molar que corresponde al 1% p/v) se incuba con fibroblastos 3T3, no se observa ninguna diferencia significativa en los valores de absorbancia de MTT. Adicionalmente, oDex no induce muerte celular, aunque no se observa proliferacion en presencia del material. En conjunto, los resultados apuntan a un alto nivel de compatibilidad de la cantidad de ADH y oDex usada para la production del hidrogel de oDex.

Los productos de la degradacion de los hidrogeles pueden ser potencialmente citotoxicos; con el fin de evaluar su toxicidad, los extractos obtenidos durante la degradacion del hidrogel de oDex se incubaron con fibroblastos embrionarios de celulas 3T3 de raton y se uso el ensayo MTT para medir la viabilidad celular de fibroblastos 3T3. Se muestran los resultados en la figura 9.

Se observa muerte celular cuando los productos de degradacion de oDex estan en contacto directo con celulas, aunque este efecto se atenua a medida que se diluyen los productos de degradacion. En los pocillos en los que se usan los productos de degradacion (dilution 1:1), se observo la sedimentation de estos productos de degradacion. Este hecho sugiere que la muerte celular podrla estar provocada por la presion mecanica o por la oxigenacion y difusion de nutrientes disminuidas provocadas por la sedimentacion de los productos. Para evaluar la citotoxicidad de oDex, tambien se realizo el ensayo Live and Dead®. Se colocaron hidrogeles de oDex (DO del 35%) en contacto directo con celulas y se usaron discos de latex y geles de agar como controles positivos y negativos,

respectivamente. Tal como se esperaba, los discos de latex revelaron alta toxicidad, para celulas son principalmente de color rojo (celulas muertas). Al contrario, con discos de agar e hidrogeles de oDex, la mayona de las celulas estan vivas (celulas verdes). Tal como ilustra la figura 10, los hidrogeles de oDex no inhiben la proliferacion celular. Aunque el numero de celulas es inferior en comparacion con los pocillos de control, las celulas son adherentes y 5 conservan la morfologia tipica de fibroblastos.

Para evaluar los efectos de los hidrogeles de oDex sobre la adhesion de fibroblastos embrionarios de raton 3T3, se formaron hidrogeles de oDex (DO del 35% y el 40%) en el fondo de pocillos de poliestireno y entonces se sembraron las celulas. Se usaron pocillos de poliestireno como control. Se evaluo la adhesion celular con la prueba de MTT (bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). Tal como se observa en la figura 11, tras una incubacion 10 durante 48 horas, el numero de celulas adheridas es significativamente mayor en ambos hidrogeles de oDex en comparacion con el control (pocillos de poliestireno). Esto es un resultado algo inesperado y bastante interesante, puesto que en otros hidrogeles de dextrina desarrollados en este laboratorio, no se observo una proliferacion mejorada en comparacion con poliestireno.

Ejemplo 4 - Hidrogel de oDEx/ADH - nanogel de dextrina

15 Se preparo nanogel de dextrina: se obtuvieron las nanoparticulas de hidrogel autoensambladas disolviendo la dextrina liofilizada con grupos acrilato injertados (VA), sustituida con 1-hexadecanetiol (C16) hidrofobo (dextrina- VMA-SC16) en PBS. Se obtuvo la disolucion tras aproximadamente 16 horas a temperatura ambiente, con agitacion. Se confirmo la formacion del nanogel mediante dispersion de luz dinamica. Se disolvio oDex, DO del 35%, (al 30% p/v) en PBS (oDex) o en una suspension de nanogel (oDex-nanogel) durante aproximadamente 16 horas a 20 temperatura ambiente. Entonces, se mezclaron las suspensiones de oDex con el 5% (en base molar teniendo en cuenta el numero de residuos de glucosa en la dextrina original) dihidrazida de acido adipico con la punta de la pipeta. Se permitio que avanzase el entrecruzamiento a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas.

Ejemplo 5 - Perfil de degradacion de hidrogel de ODEX/ADH y liberacion de nanogel de dextrina/FITC

Tras prepararse y pesarse (Wi), se sumergieron los hidrogeles en PBS o DMEM, y se incubaron a 37°C. A intervalos 25 regulares, se retiraron de las disoluciones, se secaron con papel de filtro, se pesaron (Wt) y se devolvieron al mismo recipiente. Se reemplazo la disolucion tampon en cada medicion y se almaceno la antigua para analisis adicional. Se determino el porcentaje de perdida de masa usando la ecuacion (ecuacion 3):

Perdida de masa (%) = 100 - [(Wt / Wi) x 100] (ec. 3)

Preparacion de nanogel de dextrina marcado con FITC. FITC es una sonda fluorescente usada comunmente en 30 estudios biologicos, debido a su biocompatibilidad. Para obtener nanogeles marcados con FITC, se formo una disolucion de nanogel (preparado tal como se describe a continuation en el ejemplo 6 y en Gonpalves et al., 2007) disolviendo 10 mg de dextrina-VMA-SC16 en 1,3 ml de tampon fosfato de sodio 0,1 M pH 7 y se agito durante 30 min. Simultaneamente, se preparo una disolucion de fluoresceina disolviendo 5 mg de SAMSA [(5-(2-(y -3)-S- (acetilmercapto)succinoil)amino)fluorescema, Invitrogen] en 0,5 ml de NaOH 0,1 M y se agito durante 15 min. 35 Entonces, se anadieron 7 ml de HCl 6 M y 0,1 ml de tampon NaPO4 0,5 M pH 7 y se agito durante 10 min. Finalmente, se mezclaron la disolucion de nanogel y la disolucion de fluoresceina y se agitaron durante 30 min. Se separo el FITC no unido usando una columna Sephadex G25 PD10 (Amersham Biosciences) equilibrada con PBS, y se eluyo el nanogel marcado (nanogel/FITC) con PBS.

Evaluation de la liberacion de nanogel de dextrina/FITC. Se obtuvo el hidrogel de oDex-nanogel/FITC tal como se 40 describio previamente (preparacion del hidrogel de oDex-nanogel). Se evaluo la liberacion de nanogel/FITC desde los hidrogeles de oDex-nanogel mediante fluorimetna. Se midio la intensidad de fluorescencia del PBS retirado de los hidrogeles, a intervalos regulares, usando un espectrofluorimetro (Fluorolog Horiba Jobin Yvon). Se recogieron los espectros de fluorescencia usando una longitud de onda de excitation de 460 nm y registrando la emision entre 470 y 600 nm a intervalos de 1 nm. Se ajusto la anchura de rendija a 6,0 nm para la excitacion y la emision. Se midio 45 la intensidad de fluorescencia al maximo del pico obtenido (520 nm). Se obtuvo el porcentaje de nanogel/FITC liberado del hidrogel de oDex-nanogel mediante la ecuacion 4:

Liberacion de nanogel/FITC (%) = [nanogel/FITC]det / [nanogel/FITC]tot x 100 (ec. 4)

donde, [nanogel/FITC]det es la intensidad de fluorescencia detectada en el PBS recogido al tiempo determinado y [nanogel/FITC]tot es la intensidad de fluorescencia del nanogel/FITC total incorporado en el hidrogel de oDex.

50 Dependiendo de la estructura quimica del esqueleto del polimero, puede producirse la degradacion del hidrogel mediante erosion o bien superficial o bien volumetrica. La erosion superficial tiene lugar cuando la velocidad de erosion supera la velocidad de permeation de agua en el volumen del polimero. La erosion volumetrica se produce cuando permean moleculas de agua en el volumen de la matriz a una velocidad mas rapida que la erosion,

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mostrando por tanto una cinetica de degradacion/erosion compleja. En hidrogeles de oDex, la degradacion se produce principalmente mediante erosion volumetrica y se caracteriza por un perfil de degradacion no lineal acompanado por un tamano de poro creciente, tal como se observa en las figuras 13A y 13B. La variacion en el tamano de poro durante la degradacion de la red del hidrogel es importante puesto que afecta al hinchamiento del hidrogel, la difusion de moleculas, y el suministro de celulas cuando se usan los hidrogeles para encapsulacion celular.

Este ejemplo tambien muestra los estudios sobre el perfil de liberacion de nanogeles de dextrina embebidos en hidrogeles de oDex/ADH (figura 13). Se producen nanogeles de dextrina segun el ejemplo 6, y tienen un perfil de degradacion similar a los hidrogeles de oDex/ADH.

La morfologla de los hidrogeles de oDex (examinada mediante crio-SEM - figura 12) presenta una estructura porosa continua, con un diametro de aproximadamente 1 pm. Con un mayor aumento, pueden observarse las partlculas de nanogel presentes en el hidrogel de oDex-nanogel. No son perceptibles diferencias morfologicas obvias en comparacion con las formulaciones de oDex y oDex-nanogel. Todos los hidrogeles tienen una morfologla al azar y estructura porosa similar y los nanogeles incorporados no tuvieron una influencia significativa sobre la morfologla de la red del hidrogel de oDex.

A pesar de sus muchas propiedades favorables, los hidrogeles tambien tienen algunas limitaciones. La baja resistencia a la traccion limita su uso en aplicaciones de soporte de carga y, como consecuencia, puede producirse la disolucion prematura o el flujo de salida del hidrogel del sitio local seleccionado como diana. Con respecto a la administracion de farmacos, el inconveniente mas importante de los hidrogeles esta relacionado con la cantidad y homogeneidad de carga de farmaco, que pueden estar limitadas, especialmente en el caso de farmacos hidrofobos; por otro lado, el alto contenido en agua y los grandes poros con frecuencia dan como resultado una liberacion de farmaco relativamente rapida. Con el fin de superar estas limitaciones, puede usarse el nanogel de dextrina tambien proporcionado por esta invencion para producir un nuevo hidrogel bidimensional. Puesto que este nanogel se obtiene mediante autoensamblaje de moleculas anflfilas, y se ha mostrado que incorporan y estabilizan tanto protelnas como pequenos productos farmaceuticos hidrofobos, la presencia de la nanofase puede ser util para el desarrollo del material como sistema de liberacion controlada de farmacos.

Segun los estudios de perdida de masa realizados, la velocidad de degradacion del hidrogel de oDex es diferente de la hallada en hidrogeles de oDex-nanogel. En aproximadamente 25 dlas, la red del hidrogel de oDex se solubiliza por completo, por otro lado en este momento solo se observo una perdida de masa de aproximadamente el 70% en hidrogeles de oDex-nanogel. Sin embargo, solo se observa una ligera perdida de masa en comparacion con las dos formulaciones con diferentes cantidades de nanogel. La velocidad de degradacion mas lenta observada en presencia del nanogel puede asignarse a una reticulacion adicional de la red del hidrogel.

Simultaneamente, se evaluo la liberacion del nanogel (marcado previamente con FITC) de los hidrogeles de oDex- nanogel mediante fluorimetrla. Se libero gradualmente el nanogel a lo largo del tiempo, siendo analogo a la degradacion del hidrogel. El material compuesto de hidrogel de oDex-nanogel podrla ser util para superar el fenomeno de liberacion por estallido inicial observado a menudo en los sistemas de administracion de farmacos de nanogel ya que permite la liberacion lenta y controlada del nanogel.

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Las siguientes reivindicaciones exponen una realizacion particular de la invencion.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Formulaciones de hidrogel de dextrina oxidada reticulada con dihidrazida de acido adlpico que comprende la siguiente estructura:

imagen1

que presenta la capacidad de incorporacion dentro de su poro tridimensional, en las que dicha dextrina tiene un peso molecular de entre 1200 y 8000 Da.
2. Hidrogel segun la reivindicacion anterior, en el que incluye polisacaridos, protelnas, nanogeles, nanopartlculas, materiales granulares, moleculas bioactivas y celulas.
3. Hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las protelnas son colageno, fibronectina, caselna.
4. Hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las protelnas estan incluidas en un porcentaje de entre el 0-20 de la composicion de hidrogel, en peso seco.
5. Hidrogel segun las reivindicaciones 1-2, en el que los polisacaridos son quitosano, acido hialuronico.
6. Hidrogel segun las reivindicaciones 1-2 y 5, en el que los polisacaridos estan incluidos en un porcentaje de entre

el 0-20 de la composicion de hidrogel, en peso seco.
7. Hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es inyectable.
8. Hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se obtiene a partir de una dextrina con

un grado de oxidacion de entre el 10-50%, preferiblemente entre el 25-35%.
9. Hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que presenta una estructura porosa continua, con un diametro de 1 pm.
10. Metodo de produccion de la formulacion de hidrogel descrita en las reivindicaciones anteriores, que comprende las siguientes etapas:

a) oxidar la dextrina con acido peryodico;

b) eliminar el peryodato sin reaccionar;

c) gelificar mediante la adicion de un agente de reticulacion, tal como dihidrazida de acido adlpico, preferentemente a un pH en el intervalo de 5,0-7,5.
11. Metodo segun la reivindicacion anterior, en el que el porcentaje de dihidrazida de acido adlpico usado es de entre el 3-40%, preferiblemente entre el 3-10%, en base molar en relacion con los residuos de glucosa.
12. Metodo segun las reivindicaciones 10-11, en el que la concentracion de dextrina oxidada es de entre el 5-40% (p/v), preferiblemente entre el 25-30% (p/v).
13. Metodo segun las reivindicaciones 10-12, en el que el periodo de gelificacion es de desde 1 hasta 30 minutos.
14. Metodo segun las reivindicaciones 10-14, en el que se incorpora un nanogel o una nanopartlcula en el hidrogel,

en el que las dimensiones del nanogel o la nanopartlcula son de entre 10-10000 nm.
15. Metodo segun las reivindicaciones 10-14, en el que la incorporation del nanogel o la nanopartlcula en el hidrogel se lleva a cabo mezclando el nanogel o la nanopartlcula con la dextrina oxidada, antes de la adicion de ADH.

5 16. Metodo segun las reivindicaciones 10-15, en el que el nanogel o la nanopartlcula se incorpora en una proportion

del 1-25% del peso de dextrina.
17. Metodo segun las reivindicaciones anteriores 14-16, en el que el nanogel o la nanopartlcula se carga previamente con productos farmaceuticos.
18. Biomaterial que comprende el hidrogel descrito en las reivindicaciones 1-9 y obtenido mediante el metodo 10 descrito en las reivindicaciones 10-17.
19. Sustituto de hueso sintetico que comprende el hidrogel descrito en las reivindicaciones 1-9 y obtenido mediante el metodo descrito en las reivindicaciones 10-17.
20. Sistema para la administration controlada de farmacos que comprende el hidrogel descrito en las reivindicaciones 1-9 y obtenido mediante el metodo descrito en las reivindicaciones 10-17.

15 21. Implante oseo o relleno oseo que comprende un hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y

obtenido mediante el metodo descrito en las reivindicaciones 10-17.
22. Composition que comprende un hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y obtenido mediante el metodo descrito en las reivindicaciones 10-17.
23. Protesis medica que comprende un hidrogel segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y obtenido 20 mediante el metodo descrito en las reivindicaciones 10-17.