ES2559059T3 - Xilanasas para pienso animal - Google Patents

Abstract

Uso en pienso para animales de una xilanasa con un porcentaje de identidad a los aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2 de al menos el 90%, siendo determinado el porcentaje de identidad por i) alineación de las dos secuencias de aminoácidos usando el programa Needle, con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura del espacio de 10, y una penalización por extensión de espacio de 0,5; ii) recuento del número de coincidencias exactas en el alineamiento; iii) división del número de coincidencias exactas por la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos, e iv) conversión del resultado de la división de iii) en un porcentaje.

Description

DESCRIPCIÓN

Xilanasas para pienso animal

Antecedentes de la invención 5

Campo de la invención

[0001] Esta invención se refiere al campo de pienso para animales.

10

[0002] Los granos de cereal son un componente importante del pienso para animales.

imagen1

Ellos contienen, entre otros, polisacáridos vegetales que pueden funcionar como componente nutricional principal en la dieta (por ejemplo, almidón), pero también varios polisacáridos no amiláceos (NSP) incluyendo, entre otros, arabinoxilanos.

En animales de granja mayor como aves y cerdos faltan las enzimas pertinentes en sus tractos digestivos para la 15 digestión del NSP.

Se conoce en la técnica el uso de xilanasas en el pienso para animales para mejorar la utilización del pienso.

[0003] La presente invención se refiere al uso en el pienso para animales de una xilanasa con un porcentaje de identidad a una xilanasa de Paenibacillus (aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2) de al menos el 90%. 20

La invención se define por las reivindicaciones.

Descripción de las técnicas relacionadas

[0004] WO 2006/083240 divulga en el ejemplo 6 el uso en el pienso de pollos de una xilanasa designada como 25 XylA1A.

La secuencia de aminoácidos de XylA1A corresponde a SEQ ID nº: 2 en WO 2006/083240, que es idéntico a la parte madura de UNIPROT:Q6TLP3 que se incluye en el presente listado de secuencias como SEQ ID nº: 9.

Según la entrada de la base de datos UniProt esta secuencia se deriva de una bacteria aislada de una muestra medioambiental. 30

El porcentaje de identidad de la xilanasa de SEQ ID nº: 9 a los aminoácidos 1-184 de SEQ ID nº: 4 está por debajo de 82,7%.

[0005] La xilanasa RONOZYME WX es una xilanasa conocida como monocomponente de pienso para animales derivada de Thermomyces lanuginosus y disponible comercialmente en DSM Nutritional Products, Wurmisweg 576, 35 CH-4303 Kaiseraugst, Suiza.

Esta xilanasa y su uso en el pienso para animales se describen también en WO 96/23062.

Esta xilanasa no tiene un peso molecular por debajo de 24 kDa.

[0006] Una xilanasa de Paenibacillus pabuli con la aminosecuencia de los aminoácidos 1- 182 de SEQ ID nº: 2 aquí, 40 y su uso en un proceso para preparar un producto a base de masa, se describen en WO 2005/079585.

[0007] La secuencia de aminoácidos de una xilanasa de Paenibacillus sp.

KCTC 8848P se entregó a la base de datos de Uniprot público con número de acceso UNIPROT:Q9F9B9, y se incluye en el presente listado de secuencias como SEQ ID nº: 4. 45

[0008] WO 97/13853 divulga (SEQ ID nº: 6) una xilanasa de Aspergillus niger que es idéntica excepto por un aminoácido a la secuencia de aminoácidos 1-188 de SEQ ID nº: 6 presente ("xyl II" de Aspergillus niger).

[0009] WO 2004/018662 divulga (como SEQ ID nº: 9 en WO 2004/018662) otra xilanasa de Aspergillus niger que es 50 idéntica a SEQ ID nº: 8 aquí ("xyl III" de Aspergillus niger).

[0010] Chesson et al, en J. Sci. Food Agric. 1997, 75, 289-295, informa de estudios de porosidad de la pared celular y del área de superficie disponible en paja de trigo y fracciones de grano de trigo.

55

[0011] Es objeto de la presente invención mejorar la solubilización y/o degradación de polisacáridos no amiláceos insolubles (NSP) tales como arabinoxilanos, con el propósito de mejorar el valor nutricional del pienso para animales, por ejemplo mediante la mejora del índice de transformación de alimento (FCR), el índice de crecimiento, y/o el aumento de peso.

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Resumen de la invención

[0012] La presente invención se refiere al uso en el pienso para animales de una xilanasa con un porcentaje de identidad a los aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2 de al menos el 90%, siendo el porcentaje de identidad determinado por i) alineación de las dos secuencias de aminoácidos que se utilizan el programa Needle, con el la 65 matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura del espacio de 10, y una penalización por extensión

de espacio de 0,5; ii) contar el número de coincidencias exactas en el alineamiento; iii) dividir el número de coincidencias exactas por la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos, e iv) convertir el resultado de la división de iii) en un porcentaje.

[0013] La invención también se refiere al uso de tal xilanasa en la preparación de una composición para usar en el 5 pienso para animales.

[0014] La invención además se refiere a una composición de pienso para animales que comprende tal xilanasa y (a) al menos una vitamina soluble de grasa; (b) al menos una vitamina soluble en agua; y/o (c) al menos un oligoelemento. 10

[0015] Además, la invención se refiere a tal composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende tal xilanasa, al igual que un método para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, donde tal xilanasa se añade al pienso.

15

[0016] Finalmente, la invención se refiere al uso de tal xilanasa para la solubilización y/o degradación de polisacáridos no amiláceos durante la digestión gástrica e intestinal; y para pretratamiento de pienso para animales o componentes de pienso para animales.

Descripción detallada de la invención 20

[0017] De aquí en adelante, la expresión "xilanasa de la invención" se refiere a una xilanasa para su uso según la invención, como se describe en este caso.

Clases de enzimas EC - Familias de glicósido de hidrolasa de las familias Bernardo Henrissat 25

[0018] Las enzimas se pueden clasificar basándose en el manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBBM, 1992), ver también el sitio ENZYME en Internet: http://www.expasy.ch/enzyme/.

ENZYME es un repositorio de información relativa a la nomenclatura de enzimas.

Es principalmente basado en las recomendaciones del Comité de Nomenclaturas (Nomenclature Comitee) de la 30 Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (International Union of Biochemistry and Molecular Biology o IUB-MB) y esta describe cada tipo de enzima caracterizada para que se les proporcione un número EC (Comisión Enzimática o Enzyme Comission) (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Esta nomenclatura enzimática IUB-MB se basa en su especificidad de sustrato y ocasionalmente en su mecanismo molecular; tal clasificación no refleja las características estructurales de estas enzimas. 35

[0019] Otra clasificación de determinadas enzimas de glicósido de hidrolasa, tal como endoglucanasa, xilanasa, galactanasa, mananasa, dextranasa y alfa-galactosidasa, han sido propuestas en familias basadas en similitudes de secuencias de aminoácidos hace años.

Ellos actualmente encajan en 90 familias diferentes: ver la página web CAZi(ModO) (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 40 (1999) Carbohydrate- Active Enzymes server en: http://afmb.cnrs-mrs.fr/-cazy/CAZY/index.html (papeles correspondientes: Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12 ; Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En 45 "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23).

Xilanasa

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[0020] Para los fines presentes, la xilanasa significa una proteína, o un polipéptido, con actividad de xilanasa.

[0021] La actividad de xilanasa se puede medir utilizando cualquier ensayo, donde se emplee un sustrato que incluya endo-enlaces 1,4-beta-D-xilosidicos en xilanos.

El PH y la temperatura de ensayo se deben adaptar a la xilanasa en cuestión. 55

Ejemplos de valores de PH de ensayo son 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o 11.

Ejemplos de temperatura de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70 o 80°C.

[0022] Los diferentes tipos de sustratos están disponibles para determinar la actividad de xilanasa por ejemplo tabletas Xylazyme de arabinoxilano reticulado (de MegaZyme), o dispersiones de polvo insoluble y soluciones de 60 arabinoxilano teñido de azo.

[0023] Para evaluar la xilanasa en el pienso, premezclas y muestras similares, la enzima es extraída a temperaturas que varían de 50°C hasta 70°C (con las temperaturas más altas usadas para las enzimas más termoestables) en un medio de extracción típicamente consistente en un tampón fosfato (0,1 M y un pH ajustado al pH óptimo de la 65 enzima en cuestión) durante un período de tiempo de 30 a 60 min. Un ensayo preferido de xilanasa es descrito en

ejemplo 4.

[0024] Todas mediciones se basan en principios de determinación espectrofotométrica a aproximadamente 590-600 nm.

La enzima o enzima extraída aplicable se incuba con una cantidad conocida de sustrato y la liberación de color se 5 mide con respecto a una curva estándar obtenida añadiendo cantidades conocidas de un estándar enzimático a una dieta de control similar sin enzima.

Cuando no se dispone de un control del pienso, se añade una cantidad conocida de enzima a la muestra (enriquecimiento) y pueden calcularse la cantidad añadida de enzima a partir de las diferencias en la respuesta entre muestra enriquecida y no enriquecida. 10

[0025] En una forma de realización particular, la xilanasa es una enzima clasificada como EC 3.2.1.8 (ver el sitio ENZYME referido anteriormente).

El nombre oficial es endo-1,4-beta-xilanasa.

El nombre sistemático es 1,4-beta-D-xilan xilanohidrolasa. 15

Pueden utilizarse otros nombres, como endo-(1-4)-beta-xilanasa; (1-4)-beta-xilan 4-xilanohidrolasa; endo-1,4-xilanasa; xilanasa; beta-1,4-xilanasa; endo-1,4-xilanasa; endo-beta-1,4-xilanasa; endo-1,4-beta-D-xilanasa; 1,4-beta-xilan xilanohidrolasa; beta-xilanasa; beta-1,4-xilan xilanohidrolasa; endo-1,4-beta-xilanasa; beta-D-xilanasa.

La reacción catalizada es la endohidrólisis de enlaces en xilanos 1,4-beta-D-xilosidicos.

20

[0026] De acuerdo con el sitio web CAZy(ModO) referido anteriormente, las xilanasas actualmente se clasifican en cualquiera de las siguientes familias de hidrolasas de glicósido: 5, 8, 10, 11, 16, 43, o 62.

Por ejemplo, la familia GH 11 de glicósido de hidrolasa puede estar caracterizada de la siguiente manera:

Familia CAZy:

familia 11 de glicósido de hidrolasa

Actividades conocidas:

xilanasa (EC 3.2.1.8)

Mecanismo:

retención

Nucleófilo/base catalítico/a:

Glu (experimental)

Donante de protón catalítico:

Glu (experimental)

Estado de estructura 3D:

disponible (ver PDB)

Pliegue:

barril tipo remolino beta

Clan:

GH-C

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[0027] En particular, la xilanasa es i) una xilanasa de la familia glicósido de hidrolasa (GH) 5, 8, 10, 11, 16, 43, o 62, preferiblemente de la familia GH 10 u 11, más preferiblemente de la familia GH 11.

La expresión "de la familia glicósido hidrolasa NN" significa que la xilanasa en cuestión es o se puede clasificar en la familia GH "NN" (por ejemplo 10 u 11).

30

[0028] En otra forma de realización particular, la xilanasa de la invención se deriva de una xilanasa bacteriana, preferiblemente de una bacteria de (i) tipo de Firmicutes; (ii) la clase de Bacilli; (iii) orden de Bacillales; (iv) la familia de Paenibacillaceae; o (v) el género de Paenibacillus; incluso de forma más preferible de una bacteria de (vi) las especies de Paenibacillus pabuli, Paenibacillus polymyxa, o Paenibacillus sp.; de la forma más preferible de (vii) cepas de Paenibacillus pabuli, o Paenibacillus polymyxa. 35

[0029] La expresión "xilanasa derivada de una xilanasa bacterial (o Firmicutes, ..., o Paenibacillus pabuli)" como se ha usado anteriormente incluye cualquier xilanasa de tipo salvaje aislada de la bacteria en cuestión, al igual que variantes o fragmentos de las mismas que retienen actividad de xilanasa.

40

[0030] El término "variante" se refiere a una xilanasa que comprende una sustitución, eliminación, y/o inserción de uno o varios aminoácidos en comparación con la xilanasa específica.

La variante puede ser una variante natural (variante alélica), o preparada sintéticamente.

Preferiblemente los cambios aminoácidos son de naturaleza menor, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadores que significativamente no afectan al plegado y/o a la actividad de la proteína; pequeñas supresiones; 45 pequeñas extensiones terminales de aminos o carboxil, tal como un residuo de metionina aminoterminal; un pequeño péptido enlazador; o una pequeña extensión que facilita la purificación por carga de cambio de red u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0031] Un "fragmento" de una xilanasa específica tiene uno o varios aminoácidos eliminados del terminal amino y/o 50 carboxilo de la secuencia de aminoácidos de la xilanasa.

[0032] Para fines de las definiciones anteriores de variante y fragmento, el término "pequeño" al igual que el término "uno o más" se refieren a un máximo de 30 cambios en comparación con la xilanasa específica.

En formas de realización preferidas de cualquiera de estas definiciones, el número de cambios es menor de 30, 25, 55 20, 15, 10, o menor de 5.

[0033] Ejemplos de sustituciones conservadoras son el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina),

aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina).

Los intercambios que ocurren con mayor frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly al igual a la inversa. 5

[0034] Además de 20 aminoácidos estándar, aminoácidos no estándar (tal como 4- hidroxiprolina, lisina de 6-n-metilo, ácido de 2-aminoisobutírico, isovalina, y serina de alfa-metilo) se pueden sustituir por residuos de aminoácidos de un polipéptido tipo salvaje.

Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no se codifican por el código genético, y 10 aminoácidos no naturales se pueden sustituir para residuos de aminoácidos. "Aminoácidos no naturales" han sido modificados tras la síntesis de proteína, y/o tienen una estructura química en su(s) cadena(s) lateral(es) diferente(s) de los aminoácidos estándar.

Aminoácidos no naturales pueden sintetizarse químicamente, y preferiblemente, están disponibles comercialmente, e incluyen ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, dehidroprolina, 3- y 4-metilprolina, y 3,3-dimetilprolina. 15

[0035] Alternativamente, los cambios aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos se alteran.

Por ejemplo, los cambios aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares. 20

[0036] Los aminoácidos esenciales se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tal como una mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escaneado de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085 ).

En la última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina en cada residuo en la molécula, y las moléculas 25 mutantes resultantes se evalúan para actividad biológica (es decir, actividad de xilanasa) para identificar residuos de aminoácido que son críticos a la actividad de la molécula.

Ver también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica pueden también determinarse por análisis físico de estructura, como determinado por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica, o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con 30 mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo.

Ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312 ; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904 ; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. Las identidades en aminoácidos esenciales también pueden ser inferidas de análisis de identidades con polipéptidos que se relacionan con un polipéptido según la invención.

35

[0037] Sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples pueden realizarse y evaluarse usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o redistribución, seguidas de un procedimiento de selección pertinente, tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57 ; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156 ; WO 95/17413 ; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden usarse incluyen PCR con tendencia al error, presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837 patente 40 estadounidense nº. 5,223,409 ; WO 92/06204 ), y mutagénesis dirigida por región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145 ; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

[0038] Los métodos de mutagénesis/redistribución se pueden combinar con alto rendimiento, métodos de selección automatizados para detectar actividad de polipéptidos clonados mutagenizados expresados por células huésped. 45

Se pueden recuperar moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos de las células huésped y rápidamente secuenciadas según métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

50

[0039] En otra forma de realización particular, la xilanasa de la invención se deriva de una xilanasa fúngica.

La definición anterior de "derivada de" (en el contexto de xilanasas bacterianas) es aplicable por analogía también a xilanasas fúngicas.

Las xilanasas fúngicas incluyen levadura y xilanasas fúngicas filamentosas.

En formas de realización preferidas, la xilanasa se deriva de un hongo de (i) tipo Ascomycota; (ii) la clase 55 Pezizomycotina; (iii) la orden Eurotiomycetes; (iv) el suborden Eurotiales; (v) la familia Trichocomaceae, preferiblemente el mitospórico Trichocomaceae; incluso de forma más preferible de un hongo de (vi) género Aspergillus; de la forma más preferible de (VII) cepas de Aspergillus niger.

Se entiende que la definición de las especies anteriormente mencionadas incluye los estados perfectos e imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de especies 60 por el que son conocidas.

Expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.

[0040] Las cepas de las bacterias y hongos anteriormente mencionados son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivo, como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von 65 Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Agricultural

Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0041] Las preguntas acerca de la taxonomía pueden ser resueltas consultando una base de datos de taxonómica, tal como NCBI Taxonomy Browser que está disponible en la siguiente página web: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/. 5

No obstante, preferiblemente se hace referencia a los siguientes manuales: Dictionary of the Fungi, novena edición, editado por Kirk, P.M., P.F. Cannon, J.C. David & J.A. Stalpers, CAB Publishing, 2001 ; y Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, segunda edición (2005).

[0042] El término "una" como se utiliza en este caso en cualquier contexto significa "una o más", preferiblemente "al 10 menos una".

Este es el caso, por ejemplo, en su uso en la reivindicación 1 de "una" xilanasa como se especifica, que se considera equivalente a reivindicar el uso de "al menos una" o "una o más" de tales xilanasas.

[0043] El término polipéptido "maduro" o secuencia de aminoácidos madura se refiere a la parte de una secuencia 15 de aminoácidos que permanece tras cortar una parte de señal potencial de péptido y una parte de propéptido potencial.

Se puede observar alguna variación en las partes maduras de las enzimas, dependiendo de, entre otros, los huéspedes de expresión y las condiciones de fermentación.

Por ejemplo, la experiencia muestra que también pueden ocurrir truncamientos menores del terminal C durante el 20 proceso de secreción.

El término parte madura como se utiliza en este caso también se tiene en cuenta en tales truncamientos del terminal C, si los hay.

Mientras la parte de péptido maduro se puede identificar por programas informáticos conocidos en la técnica (por ejemplo SignaIP 3.0, ver J. D. Bendtsen et al, J. Mol. Biol., 340:783-795,2004), preferiblemente se identifica por 25 determinación del terminal N, y preferiblemente también el terminal C, de la enzima de xilanasa expresada y segregada, si es pertinente.

Por ejemplo, según nuestras observaciones, la parte madura de la xilanasa de SEQ ID nº: 2 son aminoácidos los 1-182 de la misma, y la parte madura de la xilanasa de SEQ ID nº: 4 son los aminoácidos 1-184 de la misma.

30

[0044] En una forma de realización particular, la xilanasa de la invención es aislada, es decir, queda esencialmente libre de otros polipéptidos de actividad enzimática, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% puro, preferiblemente al menos aproximadamente 40% puro, de forma más preferible aproximadamente 60%, puro incluso de forma más preferible aproximadamente 80% puro, de la forma más preferible aproximadamente 90% puro, e incluso de la forma más preferible aproximadamente 95% puro, como se determina en SDS-PAGE. 35

Como es generalmente conocido en la técnica, para usos de detección del gel se puede manchar el gel SDS con coloración Coomassie o plata.

Debe asegurarse que la sobrecarga no ocurre, por ejemplo, al comprobar la linearidad aplicando varias concentraciones en diferentes líneas del gel.

Tales preparaciones de polipéptidos son en particular obtenibles por métodos recombinantes de producción, 40 mientras que estos no se obtienen fácilmente y también están sujetos a una variación entre lotes mucho más alta cuando el polipéptido se produce por métodos de fermentación tradicional.

[0045] Los polipéptidos comprendidos en la composición de la invención también se purifican preferiblemente.

El término purificado se refiere a una preparación enriquecida con proteínas, donde una cantidad sustancial de bajos 45 componentes moleculares, nutrientes residuales típicos y minerales originados de la fermentación han sido quitados. Tal purificación puede por ejemplo producirse por métodos cromatográficos convencionales tal como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de exclusión por tamaño (ver por ejemplo Protein Purification, Principles, High Resolution Methods, and Applications. Editores: Jan-Christer Janson, Lars Rydén, VCH Publishers, 1989). El ejemplo 2 de WO 2005/079585 describe un procedimiento adecuado para la 50 purificación de Paenibacillus pabuli xilanasa, expresado a partir de Bacillus subtilis.

[0046] El uso de un polipéptido aislado y/o purificado según la invención es ventajoso.

Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente las enzimas que son esencialmente libres de interferencias o contaminantes otras enzimas. 55

Los términos dosificar correctamente se refieren en particular al objetivo de obtener resultados de pienso de animal consistente y constantemente, y la capacidad de optimizar la dosificación basada en el efecto deseado.

Identidad

60

[0047] La relación entre dos secuencias de aminoácidos es descrita por el parámetro "identidad".

[0048] En formas de realización particulares, el grado de identidad es al menos 90%, 95%, 97%, o al menos 99%.

En aún más formas de realización, el grado de identidad es al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 96%, o al menos 98%.

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[0049] La invención en particular se refiere al uso en el pienso para animales de una xilanasa con un porcentaje de

identidad a los aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2 de al menos 90%.

[0050] En todavía otras formas de realización particulares, la xilanasa de la invención comprende (preferiblemente tiene, o consiste de) una parte madura de cualquier la xilanasa de SEQ ID nº: 2, o una variante o fragmento de la misma que tiene actividad de xilanasa. 5

[0051] Para los objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina basándose en un alineamiento de las dos secuencias de aminoácidos realizado con el programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0.

El programa Needle implementa el algoritmo de alineamiento global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. 10 (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, penalización de abertura del espacio 10, y penalización por extensión de espacio 0,5.

[0052] El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de invención", por ejemplo, aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2 y una diferente ("secuencia ajena") se calcula como el 15 número de coincidencias exactas en un alineamiento de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la "secuencia ajena", el que sea más corto.

El resultado se expresa en porcentaje de identidad.

[0053] Una correspondencia exacta ocurre cuando la "secuencia de invención" y el "la secuencia ajena" tienen 20 residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones del solapamiento (en el ejemplo de alineamiento inferior a esta se representa por "|" ).

La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos en la secuencia (por ejemplo la longitud de aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2 es 182).

25

[0054] En el ejemplo de alineamiento puramente hipotético siguiente, el solapamiento es la secuencia de aminoácidos "HTWGER-NL" de secuencia 1; o la secuencia de aminoácidos "HGWGEDANL" de secuencia 2.

En el ejemplo un espacio se indica con un "-".

[0055] Ejemplo de alineamiento hipotético: 30

Secuencia 1:

Secuencia 2: HGWGEDANLAMNPS 14

[0056] En este ejemplo hipotético, el número de coincidencias exactas es 6. 35

La longitud de la secuencia más corta es 12.

Por consiguiente el grado de identidad de la secuencia 1 a la secuencia 2 es del 50%.

[0057] En una forma de realización particular, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido con o de aminoácidos 1 a 182 de SEQ ID nº: 2 se determina por i) alineación de dos secuencias de 40 aminoácidos que utilizan el programa Needle, con e a matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura del espacio de 10, y una penalización por extensión de espacio de 0,5; ii) recuento del número de coincidencias exactas en el alineamiento; iii) división del número de coincidencias exactas por la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos, e iv) conversión del resultado de la división de iii) en el porcentaje.

45

Pienso para animales

[0058] La presente invención se dirige también a métodos para el uso de la xilanasa de la invención en el pienso para animales, al igual que para composiciones y aditivos alimenticios que la comprenden.

50

[0059] El término animal incluye todos los animales, incluyendo a los seres humanos.

Ejemplos de animales son no rumiantes, y rumiantes.

Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras, y ganado bovino, por ejemplo vacas tales como ganado bovino para carne y vacas lecheras.

En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. 55

Animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo cerdos o puercos (incluyendo, pero no limitado a, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos, patos y pollos (incluyendo pero no limitado a pollos para de engorde, capas); pescados (incluyendo pero no limitado a salmones, truchas, tilapias, siluros y carpas); y crustáceos (incluyendo pero no limitado a gambas y cigalas).

60

[0060] En formas de realización particulares, la xilanasa de la invención es de uso en el pienso para (i) animales de no rumiantes; preferiblemente (ii) animales monogástricos; de forma más preferible (iii) cerdos, aves, pescados, y crustáceos; o, de la forma más preferible, (iv) cerdos y aves.

[0061] La xilanasa de la invención puede alimentar al animal antes, después, o simultáneamente con la dieta.

Lo último es preferido.

[0062] El término pienso, composición alimentaria, o dieta significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o 5 composición adecuada para, o destinado para su toma por un animal.

Más información acerca de composiciones de pienso para animales es descubierta más abajo.

[0063] Los granos de cereal son componentes importantes de pienso para animales.

Los granos de cereal contienen polisacáridos vegetales, algunos de los cuales, por ejemplo el almidón, pueden 10 funcionar como componentes nutricionales principales de la dieta.

Pero los granos de cereal también contienen varios tipos de polisacáridos no amiláceos (NSP), que no se pueden utilizar en animales no rumiantes como aves y cerdos.

[0064] Ejemplos de NSP son xilanas, arabinoxilanos, beta-glucanos, y celulosa. 15

El tipo y cantidad de NSP varían de cereal a cereal.

Los siguientes son ejemplos de contenido NSP aproximado (%, p/p, sustancia seca) de granos de cereal varios: arroz perlado 1%, sorgo 5%, maíz 8%, trigo 11%, centeno 13%, triticale 16%, y cebada 17%.

Para trigo, triticale y maíz, los arabinoxilanos tiene un contenido mayor al 50% del NSP, mientras que para cebada, sorgo, centeno y arroz, los arabinoxilanos contienen aproximadamente un 25-45% del NSP, es decir todavía una 20 cantidad sustancial.

[0065] Se hace una distinción entre polisacáridos solubles e insolubles en arabinoxilanos y beta-glucanos.

Los términos soluble e insoluble se conocen en la técnica y se refieren a solubilidad/insolubilidad en agua, en particular a la forma (soluble/insoluble) de estos polisacáridos a) bajo condiciones digestivas, b) bajo condiciones 25 intestinales (en el intestino delgado), o preferiblemente c) después de un procedimiento in vitro como se perfila en el ejemplo 1 (es decir, 1.5 horas a pH 3.0 y 40°C en presencia de pepsina, y 4.5 horas a pH 6.8 y 40°C en presencia de pancreatina).

[0066] Los arabinoxilanos insolubles se asocian con la encapsulación de nutrientes como almidón y proteínas. 30

Esta encapsulación permite pasar nutrientes valiosos de la digestión.

Cuando los arabinoxilanos insolubles también son digeridas o solubilizadas, ocurre una exposición mejorada de los nutrientes.

[0067] En una forma de realización particular, la xilanasa de la invención es capaz de solubilizar polisacáridos de 35 fibra como NSP.

Por consiguiente, la invención se refiere al uso de una xilanasa de la invención para la solubilización de (de otra manera insoluble) polisacáridos no amiláceos durante la digestión gástrica e intestinal.

Los polisacáridos no amiláceos preferidos son los arabinoxilanos (polisacáridos arabinoxilanos).

40

[0068] El término polisacárido se conoce en la técnica para designar los sacáridos con 10 o más monosacáridos (ver por ejemplo Food Chemistry, tercera edición, Springer Verlag, ISBN 3-540-40817-7, Belitz, Grosch, Schieberle (editores), sección 4.3.1 en p. 294), en otras palabras, con un grado de polimerización (DP) de al menos 10.

[0069] Los polisacáridos con un DP de al menos 10 se pueden distinguir de los oligosacáridos con un DP por debajo 45 de 10 como se conoce en la técnica, por ejemplo por filtración de gel en Biogel P-2 en sobrenadantes obtenidos después de precipitación de etanol al 80% (ver "The Uppsala method for rapid analysis of total dietary fiber" por Theander et al, en particular la fig. 2 en p. 277, en New Developments in Dietary Fiber, Furda and Brine (editores), Plenum Press, 1990, p. 273-281).

50

[0070] En particular, la xilanasa de la invención es capaz de reducir la cantidad de xilanas insolubles y arabinoxilanos en un modelo in vitro que imita los pasos de digestión intestinal gástrica y pequeñas etapas en la digestión monogastrica, como se describe en los ejemplos 1, 2, y 5 aquí.

Preferiblemente, la cantidad de residual (es decir, tras la incubación con xilanasa) de arabinoxilanos insolubles no es más alta que 85% (p/p), de forma más preferible no mayor que 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 55 o 70% (p/p) con respecto a un control sin añadir enzima de xilanasa (100%).

Este corresponde a una reducción de la cantidad de arabinoxilanos insolubles de al menos 15%, preferiblemente al menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o al menos 30% (p/p) con respecto a un control sin añadir enzima de xilanasa (0%).

60

[0071] En todavía otras formas de realización particulares, las condiciones del modelo in vitro son: sustrato (i) (dieta): 0,35 g de trigo, 0,21 g de cebada, 0,13 g de harina de soja, y 0,11 g de salvado de trigo, proporcionado como una dieta premezclada, molido para pasar un tamiz de 0,5 mm; (ii) una fase de incubación gástrica en la que la dieta se incuba con 0,1 ml de la xilanasa a evaluar junto con 4,1 ml 0,072 M HCl durante 1,5 horas y con 0,5 ml 0,072 M HCl/pepsina (Sigma P-7000,3000 U/g dieta) durante 1 hora (es decir 30 min premezcla de sustrato HCI) a pH 3,0 y 65 40°C; (iii) una fase de incubación intestinal posterior con 0,9 ml 0,215M NaOH más 0,4 ml 1M NaHCO3 y

pancreatina 8 mg/g dieta durante 4 horas (Sigma P-7545) a pH 6,8-7,0 y 40°C; seguida por (iv) una determinación de la cantidad de arabinoxilano insoluble residual, por ejemplo utilizando el método de Uppsala, como se describe en los ejemplos 1 y 5.

[0072] La invención también se refiere al uso de una xilanasa de la invención para la degradación de polisacáridos 5 no amiláceos durante la digestión gástrica e intestinal.

Los polisacáridos no amiláceos preferidos son polisacáridos de fibra, en particular arabinoxilanos (polisacáridos arabinoxilanos).

[0073] En particular, la xilanasa de la invención esta capaz de degradar polisacáridos xilanos y arabinoxilanos en un 10 modelo in vitro que imita las fases de digestión gástrica e intestinal en digestión monogástrica, como se describe en el ejemplo 5 aquí.

Preferiblemente, la cantidad arabinoxilanos totales residuales (es decir, tras la incubación con xilanasa) no es más alta que 94% (p/p), de forma más preferible no mayor que 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, o 80% (p/p) con respecto a un control sin añadir enzima de xilanasa (100%). 15

[0074] En todavía otras formas de realización particulares, las condiciones del modelo in vitro son: sustrato (i) (dieta): 0,35 g de trigo, 0,21 g de cebada, 0,13 g de harina de soja, y 0,11 g de salvado de trigo, proporcionado como una dieta premezclada, molido para a pasar por un tamiz de 0,5 mm; (ii) una fase de incubación gástrica en que la dieta que se incuba con 0,1 ml de la xilanasa a evaluar junto con 4,1 ml 0,072 M HCl durante 1,5 horas y con 0,5 ml 0,072 20 M HCl/pepsina (Sigma P-7000,3000 U/g dieta) durante 1 hora (es decir 30 min premezcla de sustrato HCI) a pH 3,0 y 40°C; (iii) una fase de incubación intestinal posterior con 0,9 ml 0,215M NaOH más 0,4 ml 1M NaHCO3 y pancreatina 8 mg/g dieta durante 4 horas (Sigma P-7545) a pH 6,8-7,0 y 40°C; seguida por (iv) una determinación de la cantidad de arabinoxilano total residual, por ejemplo utilizando el método de Uppsala, como se describe en el ejemplo 5. 25

[0075] La dosificación de la xilanasa de la invención se puede optimizar utilizando simple métodos de ensayo-error como se conoce en la técnica. Las diferentes xilanasas pueden tener rangos de dosificación óptima diferente.

Ejemplos de rangos de dosificación adecuada son: 0,1-500 mg proteína enzimática (EP)/kg dieta (sustrato); preferiblemente 0,2-400, 0,3-300, 0,4-200, o 0,5-100 mg EP/kg dieta. 30

Otros rangos de dosificación preferida son 0,6-90, 0,7-80, 0,7-70, 1-70, 2-70, 3-70, 4-70, 5-70, 6-70, o 7-70, todo en mg EP/kg dieta.

Todavía otras dosificaciones de enzima preferida son de 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 10-90, 10-80, o 10-70, todo en mg EP/kg dieta.

La cantidad de proteína enzimática (EP) de xilanasa se puede determinar como se describe en el ejemplo 1. 35

[0076] Para determinar los mg de proteína enzimática de xilanasa por kg de pienso, la xilanasa se purifica de la composición alimentaria, y la actividad específica de la xilanasa purificada se determina usando un ensayo pertinente.

La actividad de xilanasa de la composición alimentaria como se determina también usando el mismo ensayo, y 40 basada en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de la proteína enzimática de xilanasa por kg de pienso.

[0077] Los mismos principios pueden determinar los mg de proteína enzimática de xilanasa en aditivos alimenticios.

Por supuesto, si una muestra de la xilanasa usada para preparar el aditivo de pienso o el pienso están disponibles, 45 la actividad específica se determina con esta muestra (no se necesita purificar la xilanasa de la composición alimentaria o del aditivo).

[0078] El término mejorar el valor nutricional del pienso para animales significa la mejora de la disponibilidad de nutrientes, por lo cual el índice de crecimiento, aumento de peso, y/o conversión de pienso (es decir el peso del 50 pienso ingerida con respecto al aumento de peso) del animal es/son mejorada/s.

[0079] La xilanasa se puede añadir al pienso en cualquier forma, siendo esta como una xilanasa purificada y/o aislada, o en la mezcla con otros componentes destinados a añadirse al pienso para animales, es decir en forma de aditivos de pienso, tal como las premezclas denominadas como pienso para animales. 55

[0080] En otro aspecto la presente invención se refiere a composiciones para usar en pienso para animales, tal como pienso para animales, y aditivos de pienso para animales, por ejemplo premezclas.

[0081] Además de la xilanasa de la invención, los aditivos de pienso de la invención contienen al menos una 60 vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o al menos un oligoelemento.

Los macrominerales normalmente también se incluyen en aditivos alimenticios.

[0082] Además, los ingredientes opcionales de aditivo alimenticio son agentes colorantes, por ejemplo carotenoides tal como beta-caroteno, astaxantina, y luteína; compuestos de aroma; estabilizadores; péptidos antimicrobianos; 65 ácidos grasos poliinsaturados; especies generadoras de oxígeno reactivo; y/o a mínimo otra enzima seleccionada de

entre otra xilanasa (EC 3,2,1,8); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

[0083] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMPs) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, y Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas, y Estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, al igual que 5 variantes o fragmentos de las anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

[0084] Ejemplos de polipéptidos fungicidas (AFPs) son el Aspergillus giganteus, y péptidos de Aspergillus niger, al igual que variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad fúngica, como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384. 10

[0085] Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18; C20 y C22, tal como ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gamma-linolénico.

[0086] Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son productos químicos tales como perborato, 15 persulfato, o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

[0087] Por lo general las grasas y las vitaminas hidrosolubles, al igual que los oligoelementos forman parte de una premezcla así llamada para ser añadida al pienso, mientras que los macrominerales normalmente se añaden al pienso. 20

Una premezcla enriquecida con una xilanasa de la invención es un ejemplo de un aditivo de pienso de la invención.

[0088] En un particular, el aditivo de pienso está pensado para incluirse (o prescrito para ser incluido) en dietas o pienso de animales a niveles de 0,01 a 10,0%; más particularmente 0,05 a 5,0%; o 0,2 a 1,0% (% significa g de aditivo por 100 g de pienso). 25

Esto es así en particular para premezclas.

[0089] Los siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo vitamina K3. 30

Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato.

Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio, y cobalto.

Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

35

[0090] Los requisitos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves y lechones/cerdos) se enumeran en la tabla de WO 01/58275.

El requisito nutricional significa que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas.

40

[0091] En la alternativa, el aditivo de pienso de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A de WO 01/58275.

Al menos uno significa cualquiera de, uno o varios de, uno, o dos, o tres, o cuatro etcétera hasta trece, o hasta quince componentes individuales.

Más específicamente, al menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en tal cantidad 45 para proporcionar una concentración en pienso en la gama indicada en la columna cuatro, o en la columna cinco, o en la columna seis de Tabla A.

[0092] La presente invención también se refiere a composiciones de pienso para animales.

Las composiciones de pienso para animales o dietas tienen un contenido relativamente alto de proteína. 50

Dietas de aves o cerdos se pueden caracterizar como se indica en la Tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3.

Dietas de pescado se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además tales dietas de pescado normalmente tienen un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg.

[0093] WO 01/58275 corresponde a patente estadounidense nº 6,960,462. 55

[0094] Una composición de pienso para animales según la invención tiene un contenido bruto de proteína de 50- 800 g/kg (preferiblemente 50-600 g/kg, de forma más preferible 60-500 g/kg, incluso de forma más preferible 70-500, y de la forma más preferible 80-400 g/kg) y comprende además al menos una xilanasa como se reivindica aquí.

En formas de realización preferidas adicionales, el contenido bruto de proteína es 150-800, 160-800, 170-800, 180-60 800, 190-800, o 200-800 - todo en g/kg (material seco).

[0095] Además, o en alternativa (al contenido bruto de proteína indicado anteriormente), la composición de pienso para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-65 100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1- 150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

[0096] En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina es dentro de cualquiera de los rangos 2, 3,4 o 5 en la Tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).

5

[0097] La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir, proteína cruda (g/kg) = N (g/kg) x 6,25.

El contenido de nitrógeno se determina por el método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14 edición, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

10

[0098] La energía metabolizable se puede calcular basándose en la publicación NRC Nutrient requirements in swine, novena edición revisada 1988, subcomité de nutrición porcina, comité de nutrición animal, junta de agricultura, consejo de investigación nacional. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6 , y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. 15

[0099] El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas completas para animales se calcula basándose en tablas de alimentación tal como Veevoedertabel 1997, gegevens sobre chemische samenstelling, verteerbaarheid ene voederwaarde camioneta voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6,8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7. 20

[0100] En formas de realización particulares, la composición de pienso para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-25% de harina de pescado; y/o 0-25% de harina de carne y hueso; y/o 0-20% de suero de leche. 25

[0101] Las dietas para animales pueden por ejemplo ser fabricadas como pienso en puré (no granulado) o pienso granulado.

Típicamente, los materiales de pienso molidos se mezclan y se añaden cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales según las especificaciones para las especies en cuestión. 30

Se pueden adicionar enzimas como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas.

Por ejemplo, una formulación enzimática sólida normalmente se añade antes o durante el paso de mezcla; y una preparación enzimática líquida se añade normalmente después del paso de granulación.

La enzima también se puede incorporar en un aditivo de pienso o premezcla, como se ha descrito anteriormente.

35

Formas de realización particulares adicionales

[0102] Estas son formas de realización particulares adicionales de la invención:

El uso en el pienso para animales de una xilanasa con un peso molecular SDS-PAGE por debajo de 24 kDa, donde la xilanasa tiene un grado de identidad a los aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2 de al menos 40 90%.

La xilanasa también puede tener un porcentaje de identidad a cualquiera de los aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2.

En formas de realización particulares, el grado de identidad es al menos 90%, 95%, 97%, o al menos 99%.

La xilanasa puede ser una xilanasa bacteriana, preferiblemente obtenible de una cepa bacteriana del 45 género Paenibacillus, o una variante, o fragmento de lo mismo.

[0103] La invención además se refiere al uso de tal xilanasa en la preparación de una composición para usar en pienso para animales, al igual que composiciones que comprenden tal xilanasa y (a) al menos una vitamina soluble de grasa, (b) al menos una vitamina soluble en agua, y/o (c) al menos un oligoelemento. 50

[0104] La invención también se refiere a una composición de pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende tal xilanasa, al igual que un método para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, donde tal xilanasa se añade al pienso.

55

[0105] La invención también se refiere al uso de una xilanasa tal y como se ha definido anteriormente en la preparación de una composición para usar en el pienso para animales.

[0106] La invención también se refiere a una composición que comprende una xilanasa tal y como se ha definido anteriormente, y (a) al menos una vitamina soluble de grasa; (b) al menos una vitamina soluble en agua; y/o (c) al 60 menos un oligoelemento.

La composición preferiblemente comprende además al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: otra xilanasa, y/o beta-glucanasa.

La composición es preferiblemente un aditivo de pienso.

65

[0107] La invención también se refiere a una composición de pienso para animales con un contenido bruto de

proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende una xilanasa tal y como se ha definido anteriormente.

[0108] La invención también se refiere a un método para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, donde una xilanasa tal y como se ha definido anteriormente, o una composición tal y como se ha definido anteriormente, se añade al pienso. 5

[0109] La invención también se refiere al uso de una xilanasa tal y como se ha definido anteriormente para pretratar el pienso para animales o componentes de pienso para animales.

Peso molecular 10

[0110] La xilanasa puede tener un PM por debajo de 24 kDa.

En formas de realización particulares, el PM está por debajo de 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, o por debajo de 10 kDa.

En formas de realización alternativas, el PM está por debajo de 30, 29, 28, 27, 26, o 25 kDa. 15

[0111] La xilanasa también puede tener un PM por debajo de 24000 Da.

En formas de realización particulares, el PM está por debajo de 23000, 22000, 21000, 20000, 19000, 18000, 17000, 16000, 15000, 14000, 13000, 12000, 11000, o por debajo de 10000 Da.

En formas de realización alternativas, el PM está por debajo de 30000, 29000, 28000, 27000, 26000, o 25000 Da. 20

[0112] En una forma de realización particular, el PM indicado de la xilanasa incluye glicosilación, si lo hay.

En la alternativa, el PM de la xilanasa excluye glicosilación.

[0113] El PM se puede determinar por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacriamida con dodecilsulfato sódico), 25 que es un método útil, bien conocido en la técnica, de un peso molecular (MW) determinado de proteínas.

[0114] Un protocolo adecuado para determinar el peso molecular por SDS-PAGE es descubierto en el ejemplo 3.

En formas de realización alternativas, el experimento de ejemplo 3 es realizado: (i) con un 10% gel Bis-Tris gel con tampón de desplazamiento MOPS; (ii) utilizando la escalera BenchMark Ladder (catálogo. nº 10747-012) 30 comercialmente disponible en Invitrogen/Novex y que incluye proteínas a 20,25 y 30kDa; y/o (iii) con tricina y geles de trisglicina también disponibles en Invitrogen/Novex.

Ejemplo 3 es un SDS-PAGE de un sobrenadante de fermentación, y no hay duda de que la banda representa la xilanasa (sólo una banda mayor; del tamaño previsto).

Pero en caso de duda, la xilanasa puede deber ser purificada a una extensión más alta, o, si se tiene un anticuerpo 35 se podría hacer un western blot, o se podrían cortar las bandas en cuestión y tener una secuencia terminal N determinada y estas podrían identificar la xilanasa.

[0115] En la alternativa, el peso molecular de la xilanasa se puede calcular como la suma de las masas atómicas de todos los átomos de una molécula de la xilanasa. 40

Con este fin se usan las masas isotópicas medias de aminoácidos en la proteína madura y la masa isotópica media de una molécula de agua.

Los pesos moleculares se pueden derivar del 1997 IUPAC standard atomic weights.

Están disponibles programas para calcular el PM de las proteínas, por ejemplo, en el siguiente sitio web: http: //www.expasy.org/tools/pi_tool.html (véase también Gasteiger et al, in John M. Walker (ed): The Proteomics 45 Protocols Handbook, Humana Press (2005), pp. 571-607).

[0116] En otra alternativa más, el PM de la xilanasa se puede medir usando una espectrometría de masas, por ejemplo Maldi-TOF, que también es bien conocida en la técnica.

50

[0117] La glicosilación es un fenómeno donde los sacáridos se fijan a las proteínas.

La glicosilación solo se observa cuando expresa proteínas en eucariotas tales como hongos y plantas transgénicas, pero no en procariotas tales como bacterias.

Hay varios tipos de glicosilación: glicosilación N-enlazada al nitrógeno amídico de cadenas laterales de asparagina, y la glicosilación O-enlazada al oxígeno de hidroxil de serina y cadenas laterales de treonina. 55

Por ejemplo, las glicoproteínas maduras pueden contener una variedad de oligosacáridos N-enlazados de oligomanosa que contienen entre 5 y 9 residuos de manosa.

[0118] Obviamente, cuando un peso molecular es calculado basándose en la secuencia de proteína, no responde a los efectos de modificaciones postraduccionales tal como glicosilación. 60

[0119] Pero la glicosilación produce la migración de proteínas en un gel SDS-PAGE, y es también observada por espectrometría de masas (MALDI-TOF).

Por lo tanto, si se quiere excluir el efecto de glicosilación en estos métodos, la xilanasa puede ser primero deglicosilada. 65

Equipos de desglicosilación se conocen bien en la técnica y son útiles para este propósito, por ejemplo Enzymatic

CarboRelease™ Kit (catálogo nº. KE-DG01, que está disponible comercialmente en QA-Bio, LLC, 73 Sutton Place West, Palm Desert, CA 92211, Estados Unidos).

Este equipo incluye las enzimas, controles, y reactivos requeridos para eliminar todos oligosacáridos N-enlazados y muchos azúcares O-enlazados.

Las siguientes enzimas de desglicosilación se incluyen en el equipo: PNGase F (Chryseobacterium 5 meningosepticum), O-Glycosidase (Streptococcus pneumoniae), Sialidase (Arthrobacter ureafaciens), beta-Galactosidase (Streptococcus pneumonia), Glucosaminidase (Streptococcus, neumonía).

[0120] El peso molecular de una proteína por supuesto depende del número al igual que la composición de sustancia química exacta de sus aminoácidos constituyentes. 10

Como una aproximación del PM, uno puede elegir referirse solo al número de aminoácidos.

En consecuencia, la xilanasa en lugar de tener una limitación de su peso molecular puede tener una secuencia de aminoácidos madura que consiste en menos de 220 residuos aminoácidos.

En formas de realización particulares de este aspecto, el número de aminoácidos es menor de 215, 210, 200, o menor de 195; preferiblemente menor de 194, 193, 192, 191, o menor de 190; incluso de forma más preferible 15 menor de 189, 188, 187, 186, 185, 184, o menor de 183.

[0121] En formas de realización particulares, (i) la xilanasa de la invención se usa como única xilanasa; (ii) la xilanasa no es un 23 kDa GH11 xynA de Bacillus subtilis; (iii) la xilanasa no es una parte madura de la xilanasa con secuencia SWISSPROT:P18429; (iv) la xilanasa no es una xilanasa contenida en el producto Belfeed B 1100 Pf o 20 ML (disponible comercialmente en BelFeed, Bélgica, ver: http://www.agrimex.be).

Ejemplos

[0122] Los productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de al menos grado 25 reactivo.

Ejemplo 1: prueba in vitro de xilanasas - solubilización de NSP

[0123] El propósito del corriente estudio fue comprobar la eficacia de varias xilanasas en lo que respecta a su 30 solubilidad de polisacáridos no amiláceos (NSP).

Xilanasas

[0124] Las siguientes xilanasas fueron evaluadas: 35

La xilanasa RONOZYME WX, una xilanasa de pienso para animales de monocomponente conocido derivada de Thermomyces lanuginosus y disponible comercialmente en DSM Nutritional Products, Wurmisweg 576; CH-4303 Kaiseraugst, Suiza (esta xilanasa es también descrita en WO 96/23062);

Una xilanasa de Paenibacillus pabuli con la aminosecuencia de aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2 y descrita en WO 2005/079585; 40

Una xilanasa de Paenibacillus sp. (polymyxa) con la aminosecuencia de aminoácidos 1- 184 de SEQ ID nº: 4 (UNIPROT:Q9F9B9);

Una xilanasa ("xyl II") de Aspergillus niger con la aminosecuencia de aminoácidos 1-188 de SEQ ID nº: 6 (muy similar a la xilanasa con SEQ ID nº: 6 en WO 97/13853); y

La parte madura (excluyendo el péptido de señal y el polipéptido, si los hay) de otra xilanasa ("xyl III") de 45 Aspergillus niger, la secuencia de aminoácidos completa de estos es SEQ ID nº: 8 aquí (idéntica a la xilanasa con SEQ ID nº: 9 en WO 2004/018662).

[0125] Las dos xilanasas bacterianas fueron expresadas en el Bacillus subtilis, y las dos xilanasas de Aspergillus fueron expresadas en el Aspergillus oryzae como se conoce en el la técnica. Las cepas de expresión fueron 50 fermentadas y los sobrenadantes que contienen xilanasa usados en los siguientes experimentos, salvo la xilanasa Paenibacillus pabuli que ha sido además purificada usando procedimientos estándar.

El contenido de proteína enzimática de los sobrenadantes de xilanasa fue estimada basándose en geles SDS, mientras que el contenido de proteína enzimática de la xilanasa purificada Paenibacillus pabuli fue determinada como se describe abajo. 55

[0126] El estudio fue focalizado en la cuantificación del contenido de arabinoxilano insoluble después de la incubación in vitro en un procedimiento que imita los pasos de digestión gástrica y pequeñas fases de digestión intestinal en la digestión monogástrica.

En el sistema in vitro se incubaron hasta 60 tubos de ensayo con HCI/pepsina en un sustrato de interés (simulando 60 la digestión gástrica), y posteriormente con pancreatina (simulando digestión intestinal).

Tres tubos de ensayo fueron usados para cada tratamiento incluido.

Al final de la fase de incubación intestinal las muestras de la digestión in vitro se quitaron y analizaron por NSP insoluble.

65

[0127] Un perfil del procedimiento in vitro se muestra en el siguiente diagrama donde pH y temperatura indican los

puntos establecidos respectivamente (valores objetivo).

Perfil de procedimiento de digestión in vitro

[0128] 5

pH Temperatura Tiempo Fase de digestión simulada

0.8 g sustrato, 4.1 ml HCl (0.072 M)

3.0 40°C t=0 minutos Mezclado

0.5 ml HCl (0.072 M) / pepsina (3000 U/g sustrato), 0.1 ml solución enzimática

3.0 40°C t=30 minutos Digestión gástrica

0.5 ml HCl (0.072 M) / pepsina (3000 U/g sustrato), 0.1 ml solución enzimática

6.8 40°C t=1,5 horas Digestión intestinal

0.4 ml NaHCO3 (1M) / pancreatina (8 mg/g dieta)

6.8 40°C t=2,0 horas Digestión intestinal

Terminar incubación

6.8 40°C t=6,0 horas

Condiciones

[0129] 10

Sustrato:

0.35 g trigo, 0.21 g cebada, 0.13 g harina de soja, y 0.11 de salvado de trigo, proporcionado como una dieta premezclada, que ha sido molida para pasar por un tamiz de 0.5 mm

pH:

fase estomacal = pH 3.0 / fase intestinal = pH 6.8-7.0

HCI:

.072 M durante 1.5 horas (es decir 30 minutos premezclando el sustrato de HCl)

Pepsina:

3000 U /g dieta durante 1 hora (Sigma P-7000)

Pancreatina:

8 mg/g dieta durante 4 horas (Sigma P-7545)

Temperatura:

40°C

Réplicas:

3

Soluciones

[0130]

0.215 M NaOH 15

0.072 M HCl

0.072 M HCl que contiene 6000 U de pepsina por 5 ml

1 M NaHCO3 que contiene 16 mg de pancreatina por ml

100 mM tampón NaAc, pH 5.0

20

Determinaciones de proteína enzimática

[0131] La cantidad de proteína enzimática de xilanasa (EP) se calcula basándose en valores A280 y las secuencias de aminoácidos (composiciones de aminoácido) utilizando los principios perfilados en S.C.Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182,319-326; (1989). 25

Procedimiento experimental para modelo in vitro

[0132] El procedimiento experimental se realizó de acuerdo con el anterior perfil. El pH fue medido en un tiempo entre 1, 2,5, y 5,5 horas. 30

Las incubaciones se terminaron después de 6 horas y las muestras fueron quitadas y colocadas en el hielo antes de la centrifugación (10000 x g, 10 min, 4°C).

Los sobrenadantes fueron descartados y el residuo granulado lavado una vez con 100 mM de tampón acetato (pH 5,0).

35

Análisis

[0133] El análisis de los residuos NSP se realizó de acuerdo a Theander et al (1995): Total dietary fiber determined as neutral sugar residues, uronic acid residues, and Klason lignin (the Uppsala method): Collaborative study, in J. AOAC Int. vol. 78, nº 4, págs. 1030-1044, excepto que la celulosa no fue analizada en el presente ejemplo. 40

En resumen, el almidón en la muestra se quita por un procedimiento de digestión enzimática con alfa-amilasa y amiloglucosidasa.

Los polisacáridos no amiláceos son luego precipitados con 80% etanol e hidrolizados a 125°C en 0,4 M de ácido sulfúrico.

Los azúcares neutros liberados se cuantifican por cromatografía de gas-líquido como acetatos de alditol, y su 45 contenido se calcula con respecto a un estándar interno y teniendo en cuenta el peso de la muestra original.

[0134] La Tabla 1 inferior muestra el contenido (% de sustancia seca) de residuos de arabinosa, xilosa y

arabinoxilano (suma de arabinosa y xilosa) en el pienso después de la incubación in vitro con las xilanasas varias.

El control se realiza sin añadir xilanasa.

Tabla 1

5

Muestra de xilanasa

Dosificación enzimática (mg EP/kg dieta)

0

12,5 12,5 12,5 12,5 12,5

Control RONOZYME WX P. pabuli P. polymyxa A. niger xyl II A. niger xyl III

Residuos de arabinosa Desviación típica Reducción relativa

2.67a 0.20 100 2.32bd 0,11 87 2.11bc 1,04 79 2.18bcd 0,11 82 2.35d 0,15 88 2.68a 0,08 100

Residuos de xilosa Desviación típica Reducción relativa

4,54ª 0,27 100 3,48b 0,16 77 2,93c 0,05 65 2,98c 0,14 66 3,82d 0,22 84 4,56ª 0,20 100

Arabinoxila insoluble Desviación típica Reducción relativa

7,21ª 0,46 100 5,80b 0,27 80 5,04c 0,09 70 5,16c 0,25 72 1,16bd 0,38 85 7,25ª 0,28 100

abcd: significa dentro de una fila que no comparte un superíndice de letra común difiriendo de la significación estadística (P<0,05).

[0135] En la Tabla 1 parece que, sorprendentemente, las xilanasas P. pabuli y P. polymyxa son, según las estadísticas, significativamente mejores en lo que se refiere a la solubilización de polisacáridos de fibra insoluble (NSP) en comparación con 1) el control sin añadir xilanasa, 2) la xilanasa de pienso para animales conocida como RONOZYME WX, al igual que 3) las dos xilanasas A. niger. 10

Ejemplo 2: efecto de respuesta de dosis

[0136] La xilanasa Paenibacillus pabuli fue evaluada en dosificaciones varias en un experimento in vitro como se describe en el ejemplo 1. 15

[0137] La Tabla 2 inferior muestra el contenido (% de peso fresco) de los residuos de arabinosa, xilosa y arabinoxilano (suma de arabinosa y xilosa) insolubles en el pienso después de la incubación in vitro con esta xilanasa en varias dosificaciones.

El control se realiza sin añadir xilanasa. 20

Tabla 2

Muestra

Control Xilanasa P. pabuli

Dosificación enzimática (mg EP/kg dieta)

0 0,7 7,0 70

Residuos de arabinosa Desviación típica Reducción relativa

1,99a 0,018 100 1,91ab 0,043 96 1,82b 0,084 91 1,68c 0,053 84

Residuos de xilosa Desviación típica Reducción relativa

3,26a 0,065 100 3,00b 0,062 92 2,64c 0,144 81 2,05d 0,066 63

Arabinoxilano Desviación típica Reducción relativa

5,25a 0,082 100 4,91b 0,104 94 4,46c 0.228 85 3,73d 0,119 71

abcd: significa dentro de una fila que no comparte un superíndice de letra común difiriendo de la significación estadística (P<0.05).

[0138] En la Tabla 2 parece que hay un efecto respuesta a la dosis claro y estadísticamente significativo de la 25 xilanasa Paenibacillus pabuli en la solubilización de polisacáridos de fibra insoluble (NSP).

Ejemplo 3: determinación del peso molecular

[0139] Un huésped transformado de Aspergillus oryzae que expresa la xilanasa de aminoácidos 1-188 de SEQ ID nº: 30 6 fue fermentado durante cuatro días en matraces de agitación de 500 ml disipados con 100 ml YP+2%G medio (10g de extracto de levadura, 20g de peptona, agua hasta 1L, autoclave a 121°C, 20 minutos, añadir 100ml de solución de glucosa estéril al 20%) a 30°C y 200 r.p.m.

La solución de fermentación fue filtrada a través de un filtro unitario de 0.22 um (micrómetro) que proporciona un sobrenadante. 35

[0140] 10 ul (microlitros) del sobrenadante fueron mezclados con 10ul NuPAGE® LDS del tampón de muestra (4X)

(disponible en Invitrogen, catálogo nº. NP0007), 2ul 1% EDTA, 2ul 6% PMSF, 4ul 0.5M DTT, y 2 ul H2O, a un volumen total de 20ul.

[0141] La muestra de 20 ul fue calentada a 99°C durante 3 minutos y se le aplicó un gel SDS-PAGE de tipo NuPAGE® Novex 10 % Bis-Tris 1 mm en geles, disponibles en Invitrogen (catálogo nº. NP0301 BOX). 5

Tampón de desplazamiento: cámara de tampón superior, 200ml 1 X tampón de desplazamiento NuPAGE® MES SDS (catálogo nº. NP0002) que contiene 500ul de antioxidante NuPAGE® (catálogo nº. NP0005).

Cámara de tampón inferior, 600ml 1 X tampón de desplazamiento NuPAGE® MES SDS.

Condiciones de operación: dos fases, concretamente 30 minutos 50mAmp, y 20 minutos 100mAmp.

Colorante: Simply Blue Stain™ de Invitrogen (catálogo nº. LC6065). 10

Enjuague: 3 veces durante 5 minutos en agua desionizada, aproximadamente 100ml cada vez.

Colorante: cubrir el gel con solución colorante Simply Blue.

Colorar durante al menos una hora a temperatura ambiente.

Decolorar: descartar el colorante y lavar el gel en agua desionizada.

Marcador PM: Amersham's Low Molecular Weight Calibration Kit de SDS Electrophoresis (código de 15 producto 17-0446-01).

[0142] Se juzga el peso molecular de xyl II, xilanasa de Aspergillus niger por debajo de 24 kDa, a partir del gel SDS-PAGE.

20

Ejemplo 4: determinación de actividad de xilanasa

[0143] Este ensayo es un ejemplo de un ensayo de xilanasa.

Es especialmente adecuado para la determinación de la actividad de xilanasas Paenibacillus de la presente invención. 25

Sustrato: 0.2% de arabinoxilano AZCL de trigo (Megazyme) en 0.2 M tampón de Na-fosfato pH 6.0 + 0.01% Triton-x-100.

Estándar: estándar de Bio-Feed Wheat FXU (como el lote 43-1195, que está disponible por solicitud en Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca).

Dilución: en 0.01% Triton-x-100. 30

FXU/ml: 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,40.

Método: se precalientan 900 ul (microlitros) de sustrato a 37°C en un termomezclador. Se añaden 100 ul de muestra.

Incubar durante 15 minutos a 37°C a velocidad máxima.

Enfriar en hielo durante 2 minutos. Girar 1 minuto a 20000 x G. 2 x 200 ul de sobrenadante se transfieren a 35 una micro placa de laboratorio.

Se mide el extremo OD 590 nm.

Ejemplo 5: solubilización y degradación total de NSP in vitro

40

[0144] El propósito del corriente estudio era comparar de la eficacia de una xilanasa de la invención con una xilanasa homóloga conocida en el pienso animal, referente a la solubilización y degradación total de la xilanasa de polisacáridos no amiláceos (NSP).

Xilanasas 45

[0145] Las siguientes xilanasas fueron evaluadas:

La xilanasa RONOZYME WX y una xilanasa de la invención de Paenibacillus pabuli (ambas descritas en el ejemplo 1), y una xilanasa comparativa con la secuencia de aminoácidos 1-185 de SEQ ID nº: 9 (Swissprot Q6TLP3).

50

[0146] La xilanasa comparativa se expresó a partir de un gen sintético en una cepa débil de proteasa de Bacillus subtilis.

Un caldo de cultivo que contiene xilanasa se preparó por fermentación de la misma, y la xilanasa fue purificada utilizando procedimientos estándar.

Para inactivar posibles proteasas, el caldo de cultivo filtrado, añadido el mismo volumen de 50mM de ácido acético 55 pH 4.0 y ajustado al pH 4.0 con 50% de ácido acético, fue incubado durante 30 minutos a 37°C en matraces de agitado de 500 mL con 250 mL en un baño maría.

La solución fue mezclada suavemente con un agitador magnético durante la incubación.

Tras la incubación, la solución fue centrifugada durante 30 minutos a 12,000 g y el sobrenadante fue separado del granulado. 60

La actividad de proteasa fue medida de la siguiente manera: sustrato N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNitroanilid (Sigma; S7388), tampón de ensayo: 100mM HEPES pH7.5 (0.01% Tritón X-100), diluciones enzimáticas en 0.01% Tritón X-100, y lectura OD405 después de 10 minutos a 25°C.

[0147] La xilanasa resultante era sustancialmente pura (una banda en un gel SDS) y tienen un peso molecular de 65 aproximadamente 22kDa (por SDS-PAGE).

[0148] El contenido de proteína enzimática de la xilanasa comercial se estimó en base a geles SDS, mientras que el contenido de proteína enzimática de la xilanasa purificada Paenibacillus pabuli y la xilanasa comparativa se determinó como se describe en el ejemplo 1.

5

Procedimiento experimental para modelo in vitro

[0149] El estudio fue focalizado en la cuantificación de insoluble al igual que el contenido de arabinoxilano total después de la incubación in vitro en un procedimiento de digestión monogástrica como se describe en el ejemplo 1 (ver: perfil de procedimiento de digestión in vitro, condiciones, soluciones, y determinaciones de proteína 10 enzimática).

[0150] Para determinar los arabinoxilanos insolubles, el pH fue medido durante 1, 2,5, y 5,5 horas.

Se terminaron las incubaciones después de 6 horas y las muestras fueron quitadas y colocadas en hielo antes del centrifugado (10000 x g, 10 minutos, 4°C). 15

Los sobrenadantes fueron descartados y el residuo granulado insoluble fue lavado una vez con un tampón de acetato (pH 5.0 y 100 mM).

[0151] Para determinar el total de arabinoxilanos se midió el pH durante 1, 2,5, y 5,5 horas.

Las incubaciones terminaron después de 6 horas. 20

Se añadió etanol absoluto para obtener una concentración de 80% de etanol en la muestra para precipitar todos los polisacáridos de un grado de polimerización (DP) mayor de 10 (DP>10).

Las muestras fueron luego enfriadas (4°C) en hielo antes del centrifugado (10000 x g, 10 minutos, 4°C).

Los sobrenadantes fueron descartados y el residuo granulado lavado una vez con 80% de etanol.

25

Análisis

[0152] El análisis de arabinoxilano NSPen el residuo granulado fue realizado de acuerdo con Theander et al, como se describe en el ejemplo 1.

Los polisacáridos (DP>10) se hidrolizan en ácido sulfúrico junto con un estándar interno (mioinositol) y azúcares 30 neutros liberados (arabinosa+xilosa) cuantificados.

Resultados

[0153] La Tabla 3 muestra el contenido de sustancia seca (%) de residuos de arabinosa+xilosa insolubles 35 (arabinoxilano) en el pienso, es decir, arabinoxilano NSP que es insoluble después de la incubación in vitro con las xilanasas.

[0154] La Tabla 4 muestra el contenido de sustancia en seco (%) de los residuos totales de arabinosa+xilosa (arabinoxilano) en el pienso, es decir, la suma de arabinoxilano NSP insoluble y soluble. 40

[0155] En ambas Tablas el control se realiza sin añadir xilanasa.

Tabla 3

Muestra de xilanasa

Dosificación de enzima (mg EP/kg dieta)

0

5 5 20 5 20

Control

RONOZYME WX P. pabuli P. pabuli Q6TLP3 Q6TLP 3

Arabinoxilano total Desviación típica Reducción relativa

7,34a 0,42 100 6,89b 0,076 94 5,78de 0,22 79 5,51e 0,20 75 6,36c 0,05 87 6,00cd 0,14 82

abcde: significa dentro de una fila que no comparte un superíndice de letra común difiriendo de la significación estadística (P<0.05).

45

Tabla 4

Muestra de xilanasa

Dosificación de enzima (mg EP/kg dieta)

0

5 5 20 5 20

Control

RONOZYME WX P. pabuli P. pabuli Q6TLP3 Q6TLP 3

Arabinoxilano total Desviación típica Reducción relativa

7,94a 0,16 100 8,17a 0,26 103 7,48cd 0,072 99 7,32d 0,25 92 7,82abc 0,31 98 7,57bcd 0,11 95

abcd: significa dentro de una fila que no comparte un superíndice de letra común difiriendo de la significación estadística (P<0.05).

[0156] En la Tabla 3 parece que, sorprendentemente, la xilanasa P. pabuli es, según las estadísticas, significativamente mejor con respecto a la capacidad para solubilizar la fracción de arabinoxilano en comparación

con 1) el control sin añadir xilanasa, 2) la xilanasa de pienso para animales comercializada por RONOZYME WX, al igual que 3) la xilanasa comparativa Q6TLP3.

[0157] El contenido de arabinoxilanos solubles irán al sobrenadante después de centrifugar las mezclas de incubación in vitro, y no se incluirán por lo tanto en la determinación de arabinoxilanos insolubles. 5

[0158] El contenido total de arabinoxilano (Tabla 4) incluye el contenido de arabinoxilanos insolubles al igual que el contenido de arabinoxilanos solubles.

[0159] Las diferencias entre los valores correspondientes a las Tablas 3 y 4 son indicativos de la cantidad de NSP 10 que ha sido degradada a oligómeros menores que DP 10 por las xilanasas durante la incubación in vitro.

[0160] Claramente, las xilanasas investigadas son más eficaces en la solubilización de la fracción de arabinoxilano (Tabla 3) que las que están en degradación total (Tabla 4).

Este es una característica típica de xilanasas de la familia 11. 15

En la Tabla 4 todavía parece que la xilanasa P. pabuli a 5 mg EP/kg dieta es también significativamente mejor con respecto a la capacidad para degradar la fracción de arabinoxilano en comparación con 1) el control sin añadir xilanasa, y 2) la xilanasa de pienso para animales conocida como RONOZYME WX, y es 3) numéricamente más eficaz (4%) que la xilanasa comparativa Q6TLP3.

20

Ejemplo 6: pienso para animales y composiciones de aditivo de pienso

[0161] Una formulación de la xilanasa Paenibacillus pabuli de SEQ ID nº: 2 que contiene 0,050 g de proteína enzimática de xilanasa se añade a la premezcla siguiente (por kilo de premezcla):

25

500000

IE Vitamina A

1000000

IE Vitamina D3

13333

mg Vitamina E

1000

mg Vitamina K3

750

mg Vitamina B1

2500

mg Vitamina B2

1500

mg Vitamina B6

7666

mcg Vitamina B12

12333

mg Niacina

33333

mcg Biotina

300

mg Ácido fólico

3000

mg Ca-D-pantotenato

1666

mg Cu

16666

mg Fe

16666

mg Zn

23333

mg Mn

133

mg Co

66

mg I

66

mg Se

5,8

% Calcio

25

% Sodio

Pienso para animales

[0162] Este es un ejemplo de un pienso para animales (pienso de engorde) comprendiendo 0,5 mg/kg (0,5 ppm) de la xilanasa Paenibacillus pabuli de SEQ ID nº: 2 (calculado como proteína de enzima de xilanasa): 30

65. 00 % trigo

32. 35% harina de soja (50% proteína cruda, CP)

1.0% aceite de soja

0.2 %DL-Metionina

0.22% DCP (fosfato dicálcico) 35

0.76% CaCO3 (carbonato cálcico)

0.32% arena

0.15% NaCl (cloruro sódico)

1 % de la premezcla anterior

40

[0163] Los ingredientes son mezclados, y el pienso se granula en la temperatura deseada, por ejemplo 70°C.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso en pienso para animales de una xilanasa con un porcentaje de identidad a los aminoácidos 1-182 de SEQ ID nº: 2 de al menos el 90%, siendo determinado el porcentaje de identidad por i) alineación de las dos secuencias de aminoácidos usando el programa Needle, con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura del 5 espacio de 10, y una penalización por extensión de espacio de 0,5; ii) recuento del número de coincidencias exactas en el alineamiento; iii) división del número de coincidencias exactas por la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos, e iv) conversión del resultado de la división de iii) en un porcentaje.
2. 2. Uso según la reivindicación 1 de una xilanasa tal y como se define en la reivindicación 1 en la preparación de una 10 composición para usar en pienso para animales.
3. 3. Uso según la reivindicación 1 de una xilanasa tal y como se define en la reivindicación 1 para la solubilización de polisacáridos no amiláceos durante la digestión gástrica e intestinal.

   15
4. 4. Uso según la reivindicación 1 de una xilanasa tal y como se define en la reivindicación 1 para la degradación de polisacáridos no amiláceos durante la digestión gástrica e intestinal.
5. 5. Uso según la reivindicación 1 de una xilanasa tal y como se define en la reivindicación 1 para el pretratamiento de pienso para animales o de los componentes de pienso para animales. 20
6. 6. Composición de pienso para animales que comprende una xilanasa tal y como se define en la reivindicación 1, y

   (a) al menos una vitamina soluble en grasa;

   (b) al menos una vitamina soluble en agua; y/o

   (c) al menos un oligoelemento. 25
7. 7. Composición de pienso de la reivindicación 6 que comprende además al menos una enzima seleccionada entre el siguiente grupo de enzimas: otra xilanasa, y/o beta-glucanasa.
8. 8. Composición de pienso para animales de cualquiera de las reivindicaciones 6-7 que es un aditivo de pienso. 30
9. 9. Composición de pienso para animales de las reivindicaciones 6 a 8 con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprende una xilanasa tal y como se define en la reivindicación 1.
10. 10. Método para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, donde se añade al pienso una xilanasa tal y 35 como se define en la reivindicación 1, o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 6-8.