ES2559865T3 - Anticuerpo monoclonal anti-VIH - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que reconoce el bucle V3 de la glucoproteína de la envuelta gp120 del virus del SIDA, que es cualquiera seleccionado de los siguientes anticuerpos: (a) un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 como la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H (VH), y que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 como la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L (VL); y (b) un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 como la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H (VH), y que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 como la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L (VL).

Description

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durante 1 hora. Después de lavar el resultado, se desarrolló el color usando sustrato de ALP, y después se midió la absorbancia (405 nm). El ELISA de péptido V3 se realizó en los 20 tipos de anticuerpos obtenidos. Como resultado, se encontró que 6 tipos de anticuerpos tenían reactividad con el péptido V3.

Por otra parte, CD4 soluble (sCD4; R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN) ejerce influencias completamente opuestas en un anticuerpo contra CD4bs y un anticuerpo contra CD4i. Es decir, la reactividad del anticuerpo contra CD4bs se suprime en presencia de sCD4. En contraste, la reactividad del anticuerpo contra CD4i con gp120 aumenta en presencia de sCD4. Utilizando esta propiedad, se clasificaron los anticuerpos monoclonales. Se preparó la “placa de gp120 capturada” por los mismos procedimientos que los mencionados anteriormente para el ELISA de captura de gp120. Se hicieron reaccionar anticuerpos monoclonales diluidos en serie en presencia o ausencia de sCD4 0,5 µg/ml durante 2 horas, y después se lavaron con un tampón de lavado de ELISA tres veces. Después de ello, los anticuerpos resultantes se dejaron reaccionar cada uno con 100 µl de anti-IgG humana-ALP durante 1 hora. Después de lavarlos, se desarrolló el color usando sustrato de ALP, y después se midió la absorbancia (405 nm). Como se muestra en la figura 1, todos los anticuerpos contra V3 incluyendo KD-247 usado como un control no estaban influidos por sCD4. La actividad de unión de cinco tipos de clones (0.5δ(3D6), 42F9, 49G2, 4E3 y 7B5) se suprimió en presencia de sCD4 (en donde b12 se usó como control). En contraste, la reactividad de cuatro tipo de clones (4C11, 4E9B, 5D6S, y 7E11) aumentó en presencia de sCD4 (en donde 17b se usó como control). Hubo cinco tipos de clones, que no mostraron reactividad en el ELISA de péptido V3 y no estuvieron influidos por sCD4. No se pudo confirmar que estos clones tuvieran especificidad de epítopo (otros epítopos).

Ejemplo 4: Actividad de unión a una envuelta funcional

Se ha sabido que el VIH-1 tiene una envuelta funcional que causa la fusión de membrana con células diana en partículas víricas y en las superficies de células crónicamente infectadas. Para estudiar si el anticuerpo producido es capaz o no de reconocer esta envuelta funcional, se examinó la actividad de unión del anticuerpo a la superficie celular de células infectadas crónicamente con VIH-1JR-FL (PM1/JR-FL) con un citómetro de flujo. Además, también se examinó si sCD4 tenía o no influencia en esta reactividad. Se colocaron células PM1/JR-FL (2 x 105) en un tubo de ensayo. Después de ello, se añadieron al tubo de ensayo 50 µl de sCD4 que se había diluido con un tampón de FACS (BSA al 2%, acida al 0,02% en PBS, pH 7,23) y ajustado a una concentración de 1 µg/ml, o 50 µl de solo el tampón de FACS. La mezcla se dejó reaccionar durante 15 minutos. Después de ello, 50 µl de anticuerpo monoclonal diluido en tampón de FACS a una concentración de 1 a 3 µg/ml se añadieron entonces a la mezcla de reacción, y la mezcla obtenida se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Lo resultante se lavó con un tampón de FACS dos veces, y 50 µl de anticuerpo anti-IgG humana unido a FITC (Sigma) diluido en un tampón de FACS a una proporción de 1:200 se añadieron después a lo resultante. La mezcla se incubó a 4ºC en un lugar oscuro durante 30 minutos. Después de ello, lo resultante se lavó con un tampón de FACS dos veces, y después se fijó con 0,5 ml de solución de fijación {paraformaldehído al 2% (p/v) en PBS}. La muestra fijada se analizó con FACScalibur (Beckton-Dickinson). Los datos incorporados se analizaron con Cell Quest (Beckton-Dickinson). Como se muestra en la figura 2, se encontró que los 5 tipos de anticuerpos contra V3L todos tenían una actividad de unión clara a la superficie de las células infectadas. Además, tal actividad de unión aumentaba en presencia de sCD4. Cuando se compararon con los cuatro clones, 1D9, 2F8, 3E4 y 3G8, 1C10(0.5γ) y 5G2 tenían reactividad fuerte en ausencia de sCD4. Entre los anticuerpos clasificados en CD4bs 3D6(0.5δ), 42F9 y 49G2 tenían una actividad de unión a la superficie de células infectadas. Sin embargo, 4E3 y 7B5 no tenían tal actividad de unión. A diferencia de la reacción con el monómero de gp120, en el caso de una envuelta funcional que consiste en un trímero, no se observó la inhibición de la unión de los anticuerpos contra CD4bs por sCD4. Por otra parte, con respecto a los anticuerpos contra Cd4i, los 4 tipos de anticuerpos todos tenían solo reactividad débil en ausencia de sCD4, pero en presencia de sCD4, tal reactividad aumentó hasta el nivel equivalente a la reactividad de un anticuerpo contra V3. Todos los 5 tipos de anticuerpos cuyos epítopos no se han identificado no tenían actividad de unión a la superficie de células infectadas.

Ejemplo 5: Purificación de anticuerpo neutralizante y estudios respecto a la actividad neutralizante

Con respecto a los 20 tipos de anticuerpos, su actividad de unión a la superficie celular, la cantidad de anticuerpo producido, y similar se tomaron en consideración. Como resultado, respecto a 15 tipos de anticuerpos, el número de células se aumentó, se recogió un sobrenadante de cultivo y después se filtró, y un anticuerpo monoclonal se purificó después usando una columna de proteína A o columna de proteína G (GE Healthcare). Se examinó la actividad neutralizante del anticuerpo monoclonal así purificado en virus VIH-1 pseudotipados a concentraciones de anticuerpo de 10 µg/ml y 2 µg/ml, usando las envueltas de 4 tipos de cepas de VIH-1 comúnmente usadas en laboratorios (figura 3). Para producir tal virus pseudotipado, el día antes de la transfección, se dispersaron células 293T en una placa de 100 mm recubierta de colágeno (IWAKI) a una concentración de células de 4 x 106, y se cultivaron a 37ºC durante la noche. Después de ello, 5 µg de pNL4-3-Luc-E-R-o 5 µg de pSG3ΔEnv (Li M. et. al, J. Virol.79, pp.10108-10125, 2005), 4,5 µg de un vector de expresión de la envuelta, y 0,5 µg de un vector pRSV-REV se introdujeron en el cultivo usando Effectene (QIAGEN), y la mezcla obtenida se cultivó después a 37ºC en CO2 al 5%. Veinticuatro horas después del inicio del cultivo, se recuperó un sobrenadante y después se pasó a través de un filtro de 0,2 µm. Después de ello, se dosificó y después se conservó a -80ºC. El virus pseudotipado obtenido se sometió a un kit de ELISA de antígeno p24 (ZeptoMetrix Co.) para medir la cantidad de antígeno p24. Se llevó a cabo un experimento de neutralización de una sola ronda usando el virus pseudotipado como sigue. El día antes del

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experimento, se dispersaron células GHOST-hi5 o células TZM-bl en una placa de cultivo de fondo plano de 96 pocillos (Falcon) a una concentración de 2 x 104 células/200 µl. Cuando las células habían crecido aproximadamente al 70% de confluencia, se mezclaron 200-500 TCID50 de virus pseudotipado y el anticuerpo en cada concentración con DMEM que contenía suero fetal de ternera (SFT) al 10%, G418 0,1 mg/ml, higromicina-B 0,05 mg/ml, puromicina 5 µg/ml, y polibreno 20 µg/ml (en el caso de GOST-hi5), o contenía SFT al 10%, DEAE-dextrano 10 µg/ml (Pharmacia Biotech; en el caso de TZM-bl). La mezcla obtenida se dejó en reposo en hielo durante 15 minutos. Después de ello, 100 µl de la solución mezcla anticuerpo/virus se añadió a células diana, de las que se había eliminado la solución de cultivo, y la mezcla obtenida se incubó a 37ºC en CO2 al 5% durante 2 horas, de modo que el virus se adsorbió en las células diana. Después de ello, 100 µl del anteriormente mencionado DMEM que contenía antibióticos y similares se añadió además, y la mezcla se cultivó después a 37ºC en CO2 al 5% durante 2 días. Después de ello, se eliminó un sobrenadante, y el residuo se lavó después con PBS (pH 7,4) tres veces. A continuación, 30 µl de un tampón de lisis (Luc PGC50; TOYO INK MFG CO., LTD. (en el caso de GHOST-hi5)) diluido por un factor de 5 con PBS, o una solución de lisado (Applied Biosystems (en el caso de TZM-bl)), se añadió a lo resultante, y la mezcla obtenida se agitó durante 15 minutos. Después de ello, 20 µl de la solución de reacción se transfirieron a una placa usada para medida luminiscente (Coster 3912), y 100 µl de un sustrato de luciferasa (PicaGene; TOYO INK MFG CO., LTD.) se añadieron a la misma. Diez segundos después de la adición del sustrato de luciferasa, la intensidad de fluorescencia se midió con un luminómetro de microplaca TR477 (Applied Biosystems) (en el caso de GHOST-hi5). En el caso de las células TZM-bl, después de que se transfiriera la solución de reacción a la placa usada para la medida luminiscente, 100 µl de Galacto-Star (Applied Biosystems) diluido por un factor de 50 con un diluyente de tampón de reacción se añadió a la misma, y la mezcla obtenida se dejó después en reposo durante 1 hora en un lugar oscuro. Después de ello, la actividad β-galactosidasa se midió con el luminómetro de microplaca TR477. La actividad neutralizante se calculó según la expresión {1-(t-c)/(n-c)} x 100 (t: la intensidad de fluorescencia de una muestra; c: la intensidad de fluorescencia de fondo de células solo; n: el intensidad de fluorescencia de una muestra sin anticuerpos). El experimento se llevó a cabo en triplicado a la misma concentración de anticuerpo. Un experimento independiente se llevó a cabo repetidamente 2 o 3 veces cada uno.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 3. Casi todos los anticuerpos monoclonales examinados mostraron actividad neutralizante en la cepa SF162, que se sabe que tiene alta sensibilidad neutralizante. Por otra parte, respecto a las cepas 89.6 y JR-FL, que eran relativamente resistentes a la neutralización, los anticuerpos contra V3 {particularmente, 0.5γ(1C10) y 5G2} mostraron actividad neutralizante, pero los anticuerpos contra CD4bs y anticuerpos contra CD4i mostraron solo actividad neutralizante débil. Mientras tanto, los anticuerpos contra V3 no eran eficaces para IIIB en el que la secuencia de aminoácidos de la punta de V3 se diferencia de los de otros virus, pero algunos anticuerpos contra CD4bs y CD4i mostraron actividad neutralizante. Estos datos sugieren que la actividad neutralizante cruzada en varias cepas de VIH-1 en casos de tener los anticuerpos anteriormente mencionados está causada principalmente por la neutralización complementaria entre los anticuerpos contra V3 y los anticuerpos contra CD4bs. Entre los anticuerpos monoclonales anteriormente mencionados, los anticuerpos contra V3, 0.5γ(1C10) y 5G2, y los anticuerpo contra CD4bs, 0.5δ(3D6), 49G2 y 42F9, mostraron una fuerte actividad neutralizante. Se llevó a cabo un experimento de neutralización adicional.

Ejemplo 6: Estudios respecto a la actividad neutralizante en 17 tipos de cepas víricas incluyendo cepas clínicamente aisladas

Se estudió la actividad neutralizante en 17 tipos de cepas víricas incluyendo cepas clínicamente aisladas (tabla 2). Para este experimento de neutralización, se aplicó el siguiente ensayo de MTT. Como método, 2 x 103 células PM1/CCR5 se infectaron con 100 TCID50 de virus en presencia del anticuerpo en cada concentración en una placa de microcultivo de fondo redondo de 96 pocillos, y las células se cultivaron después a 37ºC durante 7 días. Después de ello, se eliminaron 100 µl de una solución de cultivo de cada pocillo, y 10 µl de una solución de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) disuelta en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (7,5 mg/ml) se añadieron después a la misma. La mezcla obtenida se incubó a 37ºC durante 3 horas. Después de ello, 100 µl de isopropanol acidificado que contenía Triton X-100 al 4% (vol/vol) se añadieron a cada pocillo, de modo que se liberara cristal de formazán. Se midió la absorbancia (570 nm) con un lector de microplaca, y se calculó la tasa de supervivencia celular. Este experimento se repitió 2 o 3 veces. Se calculó la concentración de anticuerpo necesaria para inhibir el 50% de la infección del virus (CI50), y la concentración de anticuerpo correspondiente a tal CI50 se indicó con código de color.

Las actividades neutralizantes de anticuerpos en varias cepas de VIH-1 incluyendo cepas clínicamente aisladas se muestran en la tabla 2. La actividad del clon 5G2 era equivalente a la un anticuerpo KD-247 como estado de la técnica. Sin embargo, un anticuerpo anti-V3, 0.5γ(1C10) y los anticuerpo contra CD4bs, 0.5δ(3D6), y 49G2 mostraron una amplia gama de actividad neutralizante fuerte en VIH-1 de subtipo B (tipo occidental). Se debe indicar que las cepas, que no fueron neutralizadas por el anticuerpo contra V3 0.5γ(1C10), fueron neutralizadas por los anticuerpo contra CD4bs, 0.5δ(3D6), y 49G2. Es decir, se observó una neutralización complementaria.

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[Tabla 2] Tabla 2: Actividad neutralizante de anticuerpo monoclonales en 17 tipos de virus

Uso coRc

Subtipo KD247 Acm anti-V3 5G2 1C10 Acm contra Cd4bs 3D6 9G2 Acm contra CD4i 4C11

Cepas de laboratorio (virus CXCR4-trópico)

IIIB

X4 B >50 >50 >50 2 1,6 26

89.6

Dual B 4,2 14 0,12 >50 5,8 15

Cepas de laboratorio (virus CCR5-trópico)

SF162

R5 B 0,21 0,91 0,053 2,3 2,5 27

BaL

R5 B 3,8 5,8 0,25 >50 >50 37

JRFLwt

R5 B 12 37 2,9 >50 23 >50

JRFLGPER

R5 B >50 >50 28 1,2 ND ND

YU2

R5 B >50 >50 14 >50 >50 >50

MTA

R5 B 0,08 0,008 0,53 0,15 0,0 0,31

MOKW

R5 B 0,11 0,012 0,02 0,42 2,2 19

YKI

R5 B 0,5 1 0,01 2,4 1 0,1

YIS

R5 B >50 >50 0,59 2,3 1,8 >50

MIIS

R5 B >50 >50 >50 0,15 0,25 18

kKGO

R5 B >50 >50 0,32 >50 8,6 >50

KMT

X4 B >50 >50 24 24 >50 >50

Cepas clínicamente aisladas (Japón)

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Cepas clínicamente aisladas (África)

Cepas de VIH-2

ROD

X4 VIH-2 >50 >50 >50 >50 >50 >50

EHO

X4 VIH-2 >50 >50 >50 >50 >50 >50

Ejemplo 7: Aumento de la reactividad de anticuerpos contra V3 por al anticuerpo contra CD4bs 0.5δ

Se sabe que gp120 experimenta cambio conformacional después de unirse a una molécula de CD4. Por otra parte, no se ha llevado a cabo casi ningún estudio respecto a si el anticuerpo contra CD4bs induce o no tal cambio en la estructura tridimensional de gp120. Los presentes inventores han considerado la posibilidad de que el anticuerpo contra CD4bs cause un cambio en la estructura tridimensional de gp120 después de que se haya unido a gp120, de modo que cambie la reactividad de otros anticuerpos. Se preparó una “placa de gp120 capturada” mediante el método de ELISA de captura de gp120 anteriormente mencionado. Después de ello, 0.5δ(3D6) como un anticuerpo contra CD4bs, o un anticuerpo control (8D11), se dejaron reaccionar con la misma a una concentración de 5 µg/ml durante 15 minutos. Posteriormente, los anticuerpos unidos a biotina (Pierce, Rockford, IL), 1C10, 3E4, 3D6 y 4C11, se dejaron reaccionar con los mismos a cada concentración durante 2 horas. Después de ello, lo resultante se lavó con un tampón de lavado de ELISA, después se dejó reaccionar con avidina-ALP (Zymed) durante 1 hora, y después se añadió un sustrato para el desarrollo del color. Los resultados se muestran en la figura 4. La reactividad de los anticuerpos contra V3 biotinilados, 0.5γ(1C10) y 3E4, con gp120 aumentó significativamente en presencia de 0.5δ. Por otra parte, la reactividad de los anticuerpos biotinilados, 0.5δ(3D6) y 4C11, se suprimió en presencia de 0.5δ. Por tanto, se encontró que el anticuerpo contra CD4bs, 0.5δ, causa un cambio en la estructura tridimensional a gp120 por sí mismo, y que expande drásticamente la reactividad de los anticuerpos contra V3 (particularmente 0.5γ).

Ejemplo 8: Efecto neutralizante sinérgico mediante el uso combinado de 0.5δ y 0.5γ

Como se ha descrito anteriormente, 0.5δ aumenta la reactividad de 0.5γ. Por tanto, se estudió el efecto de combinación de 0.5δ y 0.5γ respecto a la actividad neutralizante. Al combinar 0.5δ y 0.5γ en varias concentraciones, se analizó su actividad neutralizante en una cepa JR-FL por un ensayo de MTT. Como se muestra en la figura 5, como resultado del uso combinado de los dos anticuerpos, se observó el aumento sinérgico de la actividad neutralizante. Para analizar tal efecto sinérgico, se aplicaron el método de análisis de Chow/Talaley et al., y el método de análisis tridimensional. Como resultado de la observación in vitro de tales anticuerpos, se asumió que una reacción de neutralización más fuerte podría suceder como resultado de la interacción del anticuerpo contra V3 con el anticuerpo contra CD4bs in vivo. Basándose en tales datos, se consideró que tanto el anticuerpo contra V3 como el anticuerpo contra Cd4bs que reaccionan con una amplia gama de cepas son necesarios para una reacción de anticuerpo neutralizante amplia y fuerte.

Ejemplo 9: Actividad neutralizante en paneles de virus estándar internacionales

Para evaluar los datos respecto al desarrollo de la vacuna contra el SIDA en base internacional, los virus que sirven como estándar se decoran de un instituto en los Estados Unidos (NIAID ARRP). Los datos de neutralización obtenidos usando los paneles de virus del subtipo (clado) B (Paneles de virus estándar B; SVPB) que consistían en 12 tipos de virus pseudotipados se muestran en la tabla 3. Como se muestra en tabla 3, 0,5γ(1C10) pudo suprimir el 5 50% o más del crecimiento de 7/12 virus a una concentración de 50 µg/ml, y también fue capaz de suprimir el 50% o más del crecimiento de 10/12 virus a una concentración de 150 µg/ml. Por otra parte, con respecto a los resultados de los anticuerpos del estado de la técnica, b12 suprimió el 50% o más del crecimiento de 8/12 virus, 2G12 suprimió el 50% o más del crecimiento de 6/12 virus, y 447-52D suprimió el 50% o más del crecimiento de 3/12 virus. Los datos de b12, 2G12 y 447-52D (447D) como anticuerpos del estado de la técnica se citaron en un artículo de estudio 10 (Li M. et. al, J. Virol. 79, pp. 10108-10125, 2005). Los datos de b12 y 2G12 solo existen hasta una concentración de 50 µg/ml, y los datos de 447-52D (447D) solo existen hasta una concentración de 25 µg/ml. Por tanto, estos anticuerpos del estado de la técnica no se pueden usar necesariamente para una simple comparación. Sin embargo, aparentemente diferenciándose de estos anticuerpos del estado de la técnica, se encuentra que 0,5γ(1C10) muestra una amplia actividad de neutralización. Además, b12 como un anticuerpo contra CD4bs tiene una amplia gama de

15 actividad neutralizante, pero es un anticuerpo especial que tiene una CDR3 de cadena pesada, larga que consiste en 18 aminoácidos, que con frecuencia se observa en autoanticuerpos (Saphire EO. et al., Science 239, pp. 11551159). Por otra parte, 0,5γ(1C10) tiene una CDR3 que consiste en 11 aminoácidos.

[Tabla 3] Tabla 3: Actividad neutralizante de anticuerpos monoclonales en panel vírico estándar B (CI50)

Panel estándarde viruspseudotipados

CI50 en células TZM-bl (µg/ml)

1C10

1C10

3D6 9G2 2F9 3E4 5G2 2F8 KD247 8D11 IgGb12* 2G12* 447D*

SVPB5SVPB6SVPB8SVPB11SVPB12SVPB13SVPB14SVPB15SVPB16SVPB17SVPB18

0,23 1,2 2,1 4,5 >50 10,1 >50 1,8 >50 1,4 2 1,1

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>150 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 0,2 2,1 >25

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>50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 1,2 >25

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82 >50 7,8 >50 - >50 >50 >50 >50 >50 0,4 >25

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110 >50 >50 >50 - >50 >50 >50 >50 1,9 >50 >25

10,5

>50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 0,1 >50 >25

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>150 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 0,5 >50 >25

6,1

>50 7,8 21 >50 >50 >50 >50 >50 0,7 >50 >25

4,5

>50 >50 >50 >50 50 >50 17 >50 >50 >50 >25

1,1

>50 >50 >50 >50 11,5 >50 28 >50 3,1 1,1 >25

Los datos se tomaron de Li M. et. al, J. Virol. 79, pp. 10108*-10125, 2005)

5 Ejemplo 10: Determinación de la secuencia génica del sitio de unión antígeno-anticuerpo del anticuerpo monoclonal

Los presentes inventores han determinado las secuencias génicas de los sitios de unión antígeno-anticuerpo de anticuerpos monoclonales neutralizantes (anti-V3: 0.5γ(1C10) y 5G2; CD4bs: 0.5δ(3D6), 42F9, 49G2). Los

10 resultados se muestran en las figuras 6 a 10, y las SEQ ID NO: 1 a 20 en la lista de secuencias. Como método, se

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extrajo ARN de cada línea celular, y se amplificaron VH y VL por PCR y después se identificaron según el método de Marks et al. (Marks, J. D. et. al., J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991).

SEQ ID NO: 1 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H (VH) de 0.5γ(1C10) SEQ ID NO: 2 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L (VL) de 0.5γ(1C10) SEQ ID NO: 3 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H (VH) de 5G2 SEQ ID NO: 4 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L (VL) de 5G2 SEQ ID NO: 5 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H (VH) de 0.5δ(3D6) SEQ ID NO: 6 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L (VL) de 0.5δ(3D6) SEQ ID NO: 7 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H (VH) de 42F9 SEQ ID NO: 8 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L (VL) de 42F9 SEQ ID NO: 9 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena H (VH) de 49G2 SEQ ID NO: 10 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena L (VL) de 49G2 SEQ ID NO: 11 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena H (VH) de 0.5γ(1C10) SEQ ID NO: 12 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena L (VL) de 0.5γ(1C10) SEQ ID NO: 13 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena H (VH) de 5G2 SEQ ID NO: 14 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena L (VL) de 5G2 SEQ ID NO: 15 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena H (VH) de 0.5δ(3D6) SEQ ID NO: 16 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena L (VL) de 0.5δ(3D6) SEQ ID NO: 17 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena H (VH) de 42F9 SEQ ID NO: 18 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena L (VL) de 42F9 SEQ ID NO: 19 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena H (VH) de 49G2 SEQ ID NO: 20 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena L (VL) de 49G2

(Discusión)

Estos nuevos anticuerpos monoclonales todos muestran una amplia gama de fuerte actividad neutralizante en los virus de subtipo (clado) B. En particular, 0.5γ(1C10) se considera que es el mayor nivel de anticuerpo que se puede usar actualmente. Estos anticuerpos no solo desempeñan un papel importante en el desarrollo de vacunas, sino que los anticuerpo, los fragmentos de los mismos, o moléculas producidas basadas en los genes de los mismos también se pueden usar para la prevención y/o tratamiento de SIDA/infección por VIH.

Ejemplo 11: Estudios respecto a la actividad neutralizante en varios tipos de cepas víricas

Como con los paneles de virus de subtipo (clado) B (SVPB), también se han suministrado paneles de virus del subtipo C. Como se muestra en la figura 11, cuando se compara con un anticuerpo control, los anticuerpos contra CD4bs, 0.5δ(3D6), 49G2 y 42F9, mostraron una actividad neutralizante clara en dos virus (SVPC13 y SVPC15) entre los paneles de virus de subtipo C. Además, estos anticuerpos contra CD4bs mostraron actividad neutralizante también en virus de subtipo AE, 93TH976.17 y 93TH966.8. Los tres anticuerpos contra CD4bs anteriores mostraron una actividad neutralizante en virus diferentes de los virus del subtipo B. Por tanto, se considera que son importantes para los estudios de neutralización de clado cruzada por anticuerpos.

Los resultados se muestran en la figura 11. Los anticuerpos de la presente invención, 0.5δ(3D6), 49G2 y 42F9, mostraron una actividad inhibidora en los SVPC13, SVPC15, 93TH976.17 y 93TH966.8 examinados.

Ejemplo 12: Uso combinado de inhibidor de CCR5 y anticuerpo de la presente invención

Después de que gp120 se haya unido a CD4, V3 se une a un correceptor (CCR5 o CXCR4), de modo que el virus invade la célula. Se considera que V3 que sirve como epítopo de 0.5γ o 5G2 y un inhibidor de CCR5 (maraviroc, MVC) que sirve como un equivalente de unión al mismo son una combinación importante incluso desde el punto de vista de aplicación clínica. Por tanto, se examinó la actividad de neutralización de la combinación de anticuerpo contra V3 y el inhibidor de CCR5 (MVC) en la cepa JR-FL por un ensayo de MTT. Como se muestra en la figura 12, se observó que el aumento sinérgico de la actividad neutralizante se obtuvo por el uso combinado del anticuerpo contra V3 con MVC. Para el análisis de tal efecto sinérgico, se aplicó un método de análisis tridimensional. Como resultado de tal observación in vitro, se asume que el anticuerpo contra V3 interacciona con el inhibidor de CCR5, de modo que se produce una efecto supresor del virus más fuerte. Basándose en estos datos, se considera que el uso combinado del anticuerpo contra V3 con el inhibidor de CCR5 puede aumentar los efectos terapéuticos, cuando se administran clínicamente.

Los resultados se muestran en la figura 12. Mediante el uso combinado del anticuerpo de la presente invención 0.5γ(1C10) o 5G2, con el inhibidor de CCR5, se observó un efecto inhibitorio sinérgico en VIH-1JRFL.

Aplicabilidad industrial

El tratamiento actual de la infección por VIH (es decir, una terapia multifármaco que usa agentes antivirales; TARGA (terapia anti-retroviral de gran eficacia)) es capaz de suprimir el crecimiento del virus, pero no es capaz de curar la

Claims (1)

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