ES2560105T3 - Vacunación con células inmuno-aisladas que producen un inmunomodulador - Google Patents
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Abstract
Un producto terapéutico, caracterizado por dos componentes: (a) un primer componente que comprende un antígeno, que comprende uno o más componentes de agentes infecciosos; y (b) un segundo componente que comprende una macrocápsula semipermeable que contiene células vivas modificadas genéticamente para que segreguen una molécula inmunoestimuladora GM-CSF.
Description
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DESCRIPCION
Vacunacion con celulas inmuno-aisladas que producen un inmunomodulador
La presente invencion se refiere a un nuevo metodo para proporcionar un coadyuvante activo o inmunomodulador, por ejemplo en el contexto de la inmunizacion en personas o en animales. De acuerdo con este metodo, un inmunomodulador, por ejemplo el GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos), es liberado de celulas encapsuladas inmunoprotegidas que producen esta protema. Este sistema esta particularmente bien adap- tado a la vacunacion por cuanto proporciona el inmunomodulador en una forma activa, de una manera continuada no inmunogenica, en la vecindad inmediata del antigeno o de los antfgenos de la vacuna. La estrategia de la invencion esta perfectamente adaptada tanto para la terapia del cancer como para la vacunacion contra agentes infeccio- sos.
Antecedentes de la invencion
En el campo de la vacunacion, las vacunas de primera generacion comprendfan tan solo el antigeno contra el que se deseaba una respuesta inmunitaria. Sin embargo, como en la mayor parte de los casos la presencia de un solo antigeno no es mas que debilmente eficaz, se desarrollo una segunda generacion de vacunas en la que la composicion de vacunacion incluye uno o mas coadyuvantes como inmunomoduladores para potenciar esta respuesta inmu- nitaria.
Se han publicado varias tecnicas diferentes para proporcionar el coadyuvante en el sitio de vacunacion, dependien- do del contexto de la inmunizacion.
En el contexto de las vacunas basadas en un antfgeno (al contrario que en las vacunas basadas en celulas), una tecnica ampliamente aplicable usada para proporcionar el coadyuvante necesario es simplemente combinar el antf- geno con el coadyuvante en la composicion de vacunacion. La composicion resultante es administrada directamente al sujeto, suministrando asf el antfgeno y el coadyuvante de una manera simultanea y co-localizada.
Sin embargo, este sencillo metodo no puede ser usado en todas las versiones de vacunacion. Por ejemplo, en la mayor parte de los canceres, los antfgenos utiles son frecuentemente desconocidos. Este es el caso para la mayona de los canceres comunes en las personas, tales como el cancer de pulmon, colon, estomago, linfoma o cerebro. Por consiguiente, se necesitan nuevas estrategias de inmunizacion tales como el metodo basado en celulas. La estrategia de inmunizacion que implica a vacunas basadas en celulas, en las que el antfgeno o los antfgenos contra los cuales ser requiere una respuesta inmunitaria es producido por celulas completas implantadas en un sujeto, necesita el uso de tecnicas mas elaboradas para asegurar el suministro eficiente del coadyuvante.
Una solucion en este tipo de contexto es inyectar directamente el inmunomodulador en el sitio de la vacunacion. El inmunomodulador puede ser “desnudo” o alternativamente puede ser administrado en una formulacion de liberacion lenta usando microesferas liposomicas pegiladas (solicitud de patente internacional WO 98/33520, presentada por Bynstryn). Esta estrategia esta sin embargo limitada por dificultades tecnicas y bioqmmicas, asf como por cierto grado de liberacion sistemica que induce toxicidades potenciales.
Un metodo alternativo que ha sido propuesto para salvar los problemas que surgen de la tecnica de inyeccion directa es el uso de “celulas circunstantes” para producir localmente los inmunomoduladores. De acuerdo con este metodo, se implantas celulas que producen el coadyuvante en las proximidades de la fuente de antfgeno, proporcionando asf una eficaz liberacion local de coadyuvante en el sitio de la vacuna. La eficacia de este metodo ha sido demostra- da en ratones en los que la vacuna es una mezcla de fibroblastos secretores de GM-CSF y celulas tumorales irra- diadas (Aruga et al., Cancer Research, 57, 1997, 3230-3237).
Sin embargo, ni siquiera este metodo esta totalmente libre de inconvenientes. En realidad, para la inmunizacion humana, es sabido que se requieren inmunizaciones multiples. Como las celulas circunstantes singenicas no son facilmente disponibles, se usan celulas alogenicas en la inmensa mayona de los casos. En consecuencia, despues de la primera inyeccion, las “celulas circunstantes” son reconocidas por el sistema inmunitario del hospedador (alo- rreconocimiento) y son rechazadas, impidiendo asf la posterior produccion de inmunomodulador. Ademas, el alorre- conocimiento de las “celulas circunstantes” pone en peligro la respuesta inmunitaria deseada contra la sustancia antigenica de la vacuna.
Con el fin de evitar este alorreconocimiento, el trabajo de Borrello et al. (Human Gene Therapy, 1999) ha descrito una estrategia en la que las celulas suministradoras del GM-CSF son una lmea celular, la K-562, que no logra ex- presar antfgenos HLA clase I o II, disminuyendo potencialmente la magnitud de las alorrespuestas generadas en inmunizaciones repetidas. Las celulas K-562, modificadas para segregar GM-CSF, no expresan moleculas del MHC en su superficie. Son HLA negativas. Sin embargo estas celulas son celulas cancerosas humanas y son altamente sensibles a potentes mecanismos de rechazo que ocurren sin la intervencion de las protemas HLA de clase I o II. Se sabe que al menos dos subtipos de linfocitos conocidos como celulas T y§ o linfocitos asesinos naturales (NK: Natural Killer) atacan y destruyen a las celulas extranas por mecanismos independientes del HLA de clase I o II. En rela- cion con la lmea de celulas K-562, se sabe que es muy sensible a las celulas NK y tambien a las celulas T y§ (J.
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Immunotherapy 2000 23: 536-548 Schilbach K. et al.) y por tanto se usan como control o testigo positivo para la actividad de las celulas NK.
Es por tanto probable que las celulas circunstantes K-562 inyectadas en el sitio de la vacuna sean destruidas eficaz y rapidamente por mecanismos citotoxicos no dependientes del MHC. Esto puede muy bien reducir de forma signifi- cativa la liberacion del inmunomodulador.
Ademas de ser muy sensibles a la destruccion rapida por las celulas NK, las celulas K-562 pueden expresar MHC de clase I al exponerlas a interferon y. Es posible que tal citocina pudiera estar presente o ser liberada en el sitio de vacunacion durante la primera inmunizacion o despues de inmunizaciones repetidas. Tal regulacion por exceso del MHC de clase I conducira tambien a una rapida destruccion de la celula a traves de la inmunidad celular clasica.
Por estas razones, el uso de celulas tales como las K-562 en la vacunacion trae consigo numerosos inconvenientes.
Otra solucion, ampliamente usada en el contexto de las vacunas basadas en celulas, por ejemplo en la terapia del cancer, es acoplar la produccion de antigeno y la liberacion de inmunomodulador, modificando por ingeniena geneti- ca la celula que es la fuente del antigeno, para que suministre tambien el inmunomodulador. Por ejemplo, en las vacunas del cancer, la fuente de antigeno es normalmente una celula tumoral entera. Esta celula puede modificarse por ingeniena genetica, por ejemplo mediante transfeccion, para que produzca al mismo tiempo el coadyuvante necesario. Se han publicados respuestas inmunitarias antitumorales potentes, espedficas y prolongadas en el mo- delo de ratones usando esta tecnica, que se apoya en vectores retrovirales como metodo de transferencia de genes para construir celulas tumorales que suministren GM-CSF.
En vista de los favorables resultados obtenidos en el modelo con ratones, los primeros experimentos con personas utilizaron la misma estrategia (Simons JW. et al. 1997 Cancer Research, 43 (11); Soiffer R. et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13141; Simons et al. 1999, Cancer Research, 59 (20)). Sin embargo, la tecnica demostro ser muy laboriosa y requerir mucho tiempo, porque las celulas del paciente, recolectadas quirurgicamente, necesitan ser expandidas in vitro para la infeccion retroviral, impidiendo un uso amplio del metodo.
Por tanto se ha propuesto el uso de otro vector viral para infectar las celulas tumorales para soslayar estas dificulta- des. Virus construidos por ingeniena genetica como los adenovirus pueden infectar las celulas tumorales muy efi- cazmente y con procedimientos mucho mas simples. Dado que los adenovirus pueden infectar celulas no en division, las celulas tumorales recolectadas pueden ser infectadas inmediatamente, evitando la larga y tediosa etapa de cultivo primario que se requiere cuando se usan vectores retrovirales.
El principal problema de los nuevos virus ensayados es que, en la mayor parte de los casos, algunas protemas vira- les seran expresadas en las celulas tumorales despues de la infeccion. Estas protemas virales son reconocidas con intensidad por el sistema inmunitario como agentes infecciosos extranos. Por consiguiente, el objetivo inicial de montar una respuesta inmunitaria contra antfgenos tumorales debiles es desviado hacia una protema viral. Esto tiene por resultado enmascarar la respuesta inmunitaria antitumoral. Tambien prepara al receptor contra la subsi- guiente inmunizacion que aumentara mas la destruccion de las celulas inyectadas. Estos dos mecanismos disminui- ran muy probablemente la eficacia del esquema de inmunizacion antitumoral.
Asf pues, mientras que el uso de celulas tumorales autologas construidas por ingeniena genetica como fuente com- binada de antfgeno y coadyuvante minimiza a priori el riesgo de una respuesta inmunitaria no deseable, la etapa de la propia infeccion viral da lugar a problemas significativos.
Con el fin de limitar los problemas que surgen de la infeccion viral de celulas autologas, se han desarrollado nuevas estrategias que no requieren celulas del paciente. De acuerdo con estas tecnicas, la fuente de antfgeno es propor- cionada por lmeas de celulas derivadas de otros pacientes con un tipo de cancer similar. El paciente es despues inmunizado con inyecciones repetidas de celulas tumorales alogenicas (de otra persona), secretoras de GM-CSF irradiadas.
Esta estrategia esta basada en la suposicion de que la lmea de celulas usada para la inmunizacion comparte algu- nos antfgenos relevantes con el propio tumor del paciente y que esos antfgenos comunes permitiran el desarrollo de una respuesta inmunitaria que reconocera las celulas tumorales del paciente y las destruira. Se ha publicado un ensayo clmico en fase I que usa tal estrategia (Jaffee E. et al. 2001 Journal of Clinical Oncology, 19(1)).
Sin embargo, el porcentaje de pacientes que muestran una respuesta inmunitaria es mucho mas bajo que en informes previos usando celulas autologas que segregan el mismo inmunomodulador (GM-CSF) (Soiffer et al.).
WO 99/38954 se refiere a la inmunoterapia del cancer que se basa en la premisa de que la incapacidad del sistema inmune para rechazar los tumores que surgen espontaneamente esta relacionada con la incapacidad del sistema inmune para responder apropiadamente a los antfgenos tumorales. Se describe una lmea celular circunstante universal que es humana y, o bien carece de forma natural de antfgenos principales de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) y de antfgenos principales de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) o esta modificada para que carezca de antfgenos MHC-I y antfgenos MHC-II. Ademas, la lmea celular circunstante universal es modificada por la intro- duccion de una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica el factor
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estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF) operativamente unido a un promotor y expresa al menos aproximadamente 500ng GM-CSF/106 celulas/24 horas.
Cirone. P. et al (2001) Current Pharmaceutical Biotechnology, 2, 269-277 proporciona una revision de inmuno- aislamiento en oncologfa. El principio del enfoque de inmuno-aislamiento es una lmea celular no autologa modificada geneticamente para secretar un producto recombinante con potencial para la supresion de tumores.
Hasta ahora no se ha publicado ninguna tecnica que proporcione ni una fuente constante de inmunomodulador ni una respuesta inmunitaria eficiente, siendo al mismo tiempo sustancialmente libre de interacciones indeseables con el sistema inmunitario natural o adaptativo.
La presente invencion proporciona un nuevo metodo que soslaya los inconvenientes asociados con las estrategias anteriores. La invencion se basa en el inmunoaislamiento de celulas que producen coadyuvante mediante una barrera ffsica tal como una capsula.
La presente invencion proporciona un protocolo general para la vacunacion, llamado "Maxi-Vax", caracterizado por el suministro, en una estrecha proximidad, de antfgenos de celulas vivas modificadas por ingeniena genetica para que segreguen la citocina inmunoactivadora GM-CSF, estando estas celulas inmunoprotegidas por macro- o micro- encapsulacion con el fin de mantener un suministro del activador inmunologico prolongado in situ.
Un caso particular de la invencion utiliza la macroencapsulacion de celulas en capsulas de PES de fibra hueca, pero hay otras formas de encapsulacion, dentro de dispositivos o dentro de matrices de gel, que estan incluidas en la invencion.
Tambien se describe el uso de celulas cancerosas como antfgeno, con el proposito de inmunizar frente a antfgenos espedficos del cancer y establecer una respuesta inmunitaria sistemica protectora anti-celula tumoral. Este ultimo caso se denomina "Onco-Maxi-Vax".
Otro caso particular de la invencion se aplica a la vacunacion contra agentes infecciosos tales como virus (entre los que se incluyen el HIV y el virus de la hepatitis C).
Definiciones
En el contexto de la presente solicitud, los terminos que siguen se definen de la manera siguiente:
• Un inmunomodulador o un agente inmunomodulador es un compuesto o una composicion que puede poten- ciar, amplificar o reducir una respuesta inmunitaria contra un antfgeno o un inmunogeno.
• Un agente inmunoestimulador o un inmunoactivador es un inmunomodulador que potencia o amplifica esped- ficamente la respuesta inmunitaria contra un antfgeno o un inmunogeno. En el contexto de la presente invencion, la expresion "agente inmunostimulador" o "inmunoactivator" se usa como sinonimo del termino “coadyuvante”.
• Se considera que las celulas son inmunoaisladas si, cuando se introducen en un hospedador, estan protegidas ffsicamente contra la respuesta inmunitaria del hospedador, esto es, no hay una respuesta inmunitaria adquirida o natural significativa contra ningun componente de la celula, incluyendo los antfgenos de la superficie de la celu- la, protemas segregadas, etc., siempre y cuando no haya contacto ffsico entre las celulas y los efectores del sistema inmunitario. En consecuencia, no se observa en el organismo hospedador ningun anticuerpo ni respuesta inmunitaria contra la celula mediada por celulas.
En consecuencia, las celulas inmunoaisladas no son atacadas ni destruidas por la respuesta inmunitaria del hospedador, porque son indetectables por el sistema humano, que previene cualquier respuesta inmunitaria contra el, y porque estan protegidas ffsicamente contra cualquier respuesta inmunitaria.
• La encapsulacion es un medio particular de inmunoaislar celulas en un dispositivo que comprende una capsula, por ejemplo de un material plastico, que es no inmunogeno para el organismo hospedador. Los polfmeros prefe- ridos para la capsula son las fibras huecas de polietersulfona (PES) termoplastica (diametro externo: 720 pm; diametro interno: 524 pm, valores del peso molecular de corte (cut off): 32 y 80 kDa; Akzo Nobel Faster Ag, Wupperthal, Alemania) y polfmero AN-69 (copolfmero anionico de acrilonitrilo y metalisulfonato sodico, Hospal R&D Int, Meyzieu, Francia). Las capsulas pueden tener varias formas y tamanos.
La presente invencion se refiere a celulas encapsuladas que producen y segregan el inmunomodulador GM-CSF, para su uso en terapia y en vacunacion (preferiblemente con celulas cancerosas). Las celulas encapsuladas son modificadas por ingeniena genetica para que produzcan el inmunomodulador. Se refiere tambien a composiciones farmaceuticas, vacunas y kits que pueden ser usados en este contexto. Finalmente, se refiere a procedimientos para la vacunacion o el tratamiento de pacientes.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a celulas que producen un agente inmunomodulador y que estan ffsicamente inmunoaisladas. El agente inmunomodulador producido es GM-CSF.
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En el contexto de la terapia del cancer, el GM-CSF ha sido identificado como la citocina mas potente para activar la inmunidad antitumoral sistemica (Dranoff et al, 1993).
Con el fin de inducir una respuesta inmunitaria adecuada, puede ser muy ventajoso combinar varios agentes inmu- nomoduladores para estimular rutas diferentes. Una combinacion preferida es la asociacion de GM-CSF y FL. Otras combinaciones de 2 o mas agentes inmunomoduladores se contemplan tambien en la presente solicitud.
Aunque el papel principal de una celula inmunoaislada de la invencion es producir un agente inmunomodulador, puede desempenar otras funciones adicionales. Por ejemplo juega un papel en la deteccion de la magnitud de la localizacion de la respuesta inmunitaria esperada. Otra de las principales funciones adicionales es proporcionar el agente antigenico. De acuerdo con esta variante, la misma celula puede producir tanto el agente antigenico que dispara la respuesta y el agente inmunoestimulador que potencia la respuesta. Esto es particularmente ventajoso en el caso de la vacunacion basada en un antigeno, o la vacunacion basada en celulas en donde los antfgenos son segregados o liberados desde la membrana de la celula. Este metodo asegura que los agentes antigenicos y los agentes inmunoestimuladores estan co-localizados.
En el caso de la inmunizacion contra el cancer, las celulas inmunoaisladas de la invencion se eligen posiblemente entre celulas cancerosas que expresan TAA (antfgenos asociados a tumores), que preferentemente son espedficos del linaje y espedficos del tumor.
Como las celulas de la invencion son inmunoaisladas, el agente inmunomodulador producido es preferentemente soluble para que sea segregado y liberado. Otro tanto es el caso para los agentes antigenicos como el TAA.
De acuerdo con una variante particularmente preferida, la fuente de inmunomodulador, esto es, las celulas inmunoaisladas de la invencion, son disociadas de la fuente de agente antigenico. Por ejemplo, de acuerdo con esta variante, una primera celula o grupo de celulas constituye la fuente de antfgeno y una segunda celula o grupo de celulas inmunoaisladas constituye la fuente de coadyuvante.
Una forma preferida de inmunoaislar celulas es proporcionar una barrera ffsica que las “oculta” del sistema inmunita- rio general. Este objetivo puede conseguirse mediante un dispositivo de barrera. Se dispone de diferentes dispositi- vos de barrera, en particular microcapsulas y macrocapsulas. Las acciones de encerrar una celula o una poblacion de celulas en tal barrera se denominan en el presente texto como microencapsulacion y macroencapsulacion, res- pectivamente.
El inmunoaislamiento obvia las importantes desventajas asociadas con la implantacion de celulas libres. De hecho, el uso de celulas libres requiere generalmente farmacos inmunosupresores con el fin de protegerlas contra el sistema inmunitario del hospedador. Bloqueando mecanicamente los ataques inmunologicos, los dispositivos de barrera alrededor de celulas injertadas soslayan la necesidad de una terapia inmunosupresora. Ademas, las celulas pueden ser recuperadas facilmente despues de un rato, si es necesario. Esta ultima propiedad permite una liberacion con- mutable del agente inmunomodulador. Recuperando el dispositivo, la liberacion del agente se detiene, lo que evita la presencia no deseada de una molecula despues del final del proceso de inmunizacion. Las capsulas de la invencion pueden ser construidas espedficamente para que faciliten su retirada, por ejemplo mediante la incorporacion de una cuerda para facilitar su eliminacion.
El inmunoaislamiento soslaya tambien los importantes inconvenientes asociados con el uso de celulas HLA- negativas tales como la lmea de celulas K-562, que no puede expresar antfgenos HLA de clase I o II. Dado que las celulas encapsuladas estan totalmente protegidas contra el sistema inmunitario, no son destruidas por la inmunidad celular o innata, mientras que las celulas K-562 estan implicadas en el rechazo por inmunidad innata. La capacidad de las celulas encapsuladas para sobrevivir, para segregar protema durante un periodo de tiempo prolongado y para permitir inmunizaciones multiples, esta directamente unida a la barrera ffsica de la capsula. Ademas, no es probable que la cuantfa de la liberacion de GM-CSF en el paciente despues de implantar la capsula difiera de un individuo a otro, dependiendo de su inmunidad innata o de su inmunosupresion. En cambio, es probable que la estabilidad de la liberacion de GM-CSF vane significativamente no solo en cualquier paciente dado en la primera inmunizacion y en las siguientes, sino tambien de un paciente a otro, con la inyeccion de celulas K-562 secretoras de GM-CSF.
La propiedad principal del dispositivo de barrera es separar a las celulas vivas del sistema inmunitario del hospedador por medio de una membrana sintetica, permeable selectivamente, no-inmunogena.
Las celulas de la invencion son celulas vivas y preferentemente proporcionan el agente inmunomodulador escogido sobre una base de largo plazo. Por ejemplo, los resultados experimentales indicaron que las celulas encapsuladas, modificadas por ingeniena genetica para que segreguen GM-CSF, sf que liberan GM-CSF fuera de la capsula durante al menos quince dfas. Con este proposito, han de estar dotadas de todos los factores necesarios para su supervi- vencia, su crecimiento y la produccion del inmunomodulador de interes. Con el fin de permitir el intercambio libre de nutrientes, protemas, oxfgeno y sustancias bioterapeuticas entre el exterior y el interior, el dispositivo es preferentemente permeable selectivamente. Las moleculas pequenas pueden pasar por los poros, especialmente las molecu- las necesarias para la supervivencia de las celulas, mientras que las sustancias de peso molecular elevado, tales como los inmunocitos o los anticuerpos, son excluidas. Ademas excluye las celulas inflamatorias y de esta forma protege a las celulas encapsuladas del rechazo de tejido.
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En cambio, los agentes inmunomoduladores producidos por las celulas de la invencion pueden ser suministrados a traves de los poros al medio exterior. El diametro de los poros se elige preferentemente en un intervalo tal que se les permita cruzar la barrera a las moleculas pequenas o protemas e inmunomoduladores, y no asf a las mayores, como las inmunoglobulinas, con el fin de que el dispositivo conserve su propiedad inmunoprotectora.
Ya se han realizado ensayos clmicos que demuestran que tal inmunoaislamiento, usando capsulas, es muy eficaz, permitiendo la supervivencia de las celulas no solo alogenicas sino tambien xenogenicas (de otras especies) durante muchos meses sin rechazo inmunitario. La eficacia del inmunoaislamiento tisico mediante una capsula ha sido vali- dada por anteriores ensayos clmicos.
La macroencapsulacion hace uso de macrocapsulas preformadas, unidades inicialmente vadas que se cargan con una matriz y todas las celulas que se necesitan para el tratamiento. La matriz es preferentemente un polfmero, por ejemplo poli(alcohol vimlico) o un biopolfmero como el alginato. La matriz asegura una buena ordenacion de las celulas dentro de la capsula, concretamente una distribucion homogenea, y previene la aglutinacion en las paredes. Las macrocapsulas son mas duraderas y robustas que las microcapsulas, pueden contener refuerzos internos, pueden ser ensayadas en cuanto a la integridad del sellado antes de la implantacion, y pueden ser disenadas para que sean recargables en el cuerpo. Tambien pueden recuperarse facilmente.
Los potimeros preferidos para la capsula son las fibras huecas de polietersulfona (PES) termoplastica (diametro externo: 720 pm; diametro interno: 524 pm, valores de corte de peso molecular: 32 y 80 kDa; Akzo Nobel Faster AG, Wupperthal, Alemania) y potimero AN-69 (copolfmero anionico de acrilonitrilo y metalisulfonato sodico, Hospal R&D Int, Meyzieu, Francia).
Las macrocapsulas pueden tener varios tamanos en el intervalo de unos cuantos micrometros a tres o cuatro centimetres. Dependiendo del tamano de la capsula y del tamano de las celulas, pueden cargarse tantas como 200.000 celulas en un dispositivo de 1 cm.
Los dispositivos de la invencion son macrocapsulas. De acuerdo con la presente solicitud, las celulas de la invencion producen un agente inmunomodulador. O bien las celulas producen naturalmente el agente, o este objetivo se logra modificando las celulas. En un caso preferido, las celulas son modificadas geneticamente para que expresen el agente inmunomodulador. Esto es particularmente conveniente por muchas razones.
Modificando una celula que normalmente no produce el agente inmunomodulador, el uso de celulas de la invencion no esta limitado a aquellas que lo producen naturalmente. Es particularmente ventajoso que los agentes no esten limitados a los de origen natural. Como se sabe que las protemas mutadas a veces ejercen actividades mejoradas, es muy ventajoso usar esta version modificada de la protema en vez de la de tipo silvestre. Tambien es a veces conveniente clonar la version soluble de una protema membranosa, con el fin de lograr su secrecion.
Ademas, modificando geneticamente las celulas de la invencion, es tambien posible controlar el nivel de expresion del agente inmunomodulador. Una situacion particularmente atractiva es la sobreexpresion del agente clonando su secuencia bajo el control de un promotor del que se sabe que es muy fuerte en la celula usada. Las celulas modificadas se convierten en factorias modificadas por ingenieria genetica que producen altos niveles de agente inmunomodulador. El promotor puede escogerse de acuerdo con su actividad, de forma que tenga un nivel de expresion de inmunomodulador controlado. De acuerdo con otra realizacion, pueden usarse celulas que contengan naturalmente el gen del agente inmunomodulador, siendo dicho gen transcripcionalmente silencioso en esa celula particular. La transcripcion puede ser activada por insercion de secuencias reguladoras apropiadas, por ejemplo por recombina- cion homologa. Tambien pueden usarse secuencias reguladoras inducibles que responden a estimulos espedficos tales como sustancias, la luz, etc.
De acuerdo con la invencion, las celulas secretoras de agente inmunomodulador segregan mas de 10 ng/106 celu- las/24 horas de agente inmunomodulador. Las celulas de la invencion preferidas segregan una cantidad de agente inmunomodulador igual o superior a 100 ng/106 celulas/24 horas, preferentemente mas de 500 ng/106 celulas/24 horas. Si es necesario, pueden implantarse varias capsulas al mismo tiempo.
En consecuencia, una celula de la invencion segrega mas de 10 x 10-15 g de agente inmunomodulador cada 24 horas, preferentemente mas de 100 x 10-15 g/24 horas de agente inmunomodulador. Una celula de la invencion segrega por ejemplo entre 80 y 960 x 10-15 g/24 horas, preferentemente mas de 500 x 10-15 g/24 horas de agente in- munomodulador.
En lo concerniente a la mejor forma de modificar geneticamente las celulas de la invencion, hay metodos y protoco- los bien conocidos por los expertos en la tecnica. Los metodos particularmente preferidos hacen uso de plasmidos construidos por ingeniena genetica introducidos por transfeccion y virus introducidos por infeccion. Los retrovirus estan bien adaptados en el contexto de la presente invencion porque pueden ser modificados por ingeniena genetica para introducir un gen que codifica el agente inmunomodulador en el genoma de la celula hospedadora.
Como se menciono anteriormente, las celulas de la invencion no estan limitadas a las celulas que producen de forma natural un agente inmunomodulador de interes. Puede usarse toda clase de celulas, y en particular se prefieren celulas que sean faciles de transducir o de transfectar, y de cultivar y propagar. No es necesario usar celulas tumo-
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rales como productor de inmunomodulador circunstante. Basandose en la bibliograffa medica, pueden usarse dife- rentes tipos de celula para producir por ejemplo citocinas. Estas incluyen fibroblastos no tumorales inmortalizados, mioblastos o celulas tumorales. Las celulas de la invencion son ventajosamente celulas endoteliales o fibroblastos.
Las celulas particularmente preferidas son en general lmeas de celulas inmortales. As^ es posible modificar geneti- camente una lmea de celulas solo una vez y usar celulas a partir de la misma para todas las aplicaciones de la presente invencion. Como las celulas son inmunoaisladas, no estan en peligro ante el sistema inmunitario del hospeda- dor, pero tampoco ponen en peligro a las otras celulas vecinas.
Otra ventaja particularmente interesante es que las celulas no son necesariamente autologas con respecto al hos- pedador. Es mas facil emplear celulas alogenicas o heterologas, tambien puede ser ventajoso usar celulas animales no humanas, sin perjuicio gracias al dispositivo de barrera.
El inmunoaislamiento de las celulas es por tanto mas ventajoso que en los sistemas anteriores porque las fuentes de agente inmunomodulador pueden considerarse como "universales" y no limitadas a un unico individuo.
Las celulas de la invencion son vivas. Esto asegura que el inmunomodulador es producido de una manera continua, durante al menos varios dfas e incluso mas, si es necesario. En experimentos previos utilizando la encapsulacion, celulas encapsuladas construidas para segregar una protema han sido implantadas en pacientes durante semanas o meses. Esta liberacion de duracion prolongada resuelve el problema comun de la corta vida mitad de los inmunomo- duladores.
De acuerdo con un programa de inmunizacion preferido, las celulas de la invencion se implantan durante algunos dfas, preferentemente menos de 12 dfas, por ejemplo entre 4 y 10 dfas, por ejemplo entre 5 y 7 dfas. La implanta- cion de celulas encapsuladas por un periodo de tiempo tan breve no dara lugar a una acusada fibrosis, inducida por la liberacion del agente inmunomodulador. La inflamacion, en el sitio de la vacunacion, alrededor de la capsula, no inducira un descenso de la viabilidad de las celulas dentro de la capsula, y por tanto no impedira la produccion y liberacion de agente inmunomodulador en ese marco de tiempo.
Preferentemente, la capsula que contiene las celulas es irradiada, por ejemplo con rayos X, antes de la implantacion. En primer lugar, esta irradiacion asegura que, incluso aunque tenga lugar la rotura de la capsula, las celulas ence- rradas no son capaces de propagarse. En segundo lugar, esta irradiacion asegura que la secrecion del agente inmunomodulador se detendra despues de aproximadamente 10 dfas, debido a la muerte celular inducida por la irra- diacion. Esto puede ser ventajoso si el agente inmunomodulador segregado generase una respuesta inflamatoria violenta. Espedficamente, la implantacion subcutanea de celulas secretoras de GM-CSF, encapsuladas o no, podna inducir necrosis cutanea si se implantan durante un periodo de mas de 15 dfas a un mes. La irradiacion de la capsu- la o de las celulas antes de la implantacion no impide la subsiguiente recuperacion de la capsula.
En una realizacion, se usan celulas de la invencion en el contexto de la terapia del cancer. Este producto ha sido denominado "Onco-Maxi Vax". El Onco-Maxi-Vax es un producto terapeutico (vacuna) hecho de dos componentes que estan ffsicamente en estrecha proximidad durante la inmunizacion.
El primer componente del sistema Onco-Maxi-Vax es la fuente de antfgenos tumorales, esta carga antigenica esta hecha de celulas irradiadas recogidas del paciente al que se ha de tratar, este componente es espedfico para cada paciente. Con el fin de asegurar la maxima exposicion al antfgeno, la fuente de antfgeno se hace de las propias celulas tumorales de cada paciente. Estas se recolectan quirurgicamente o endoscopicamente del paciente, se digie- ren con el fin de obtener una suspension de celulas, y despues se irradian a 10000 Rad antes de almacenarse en partes almuotas en nitrogeno lfquido. La irradiacion es una medida de seguridad para prevenir cualquier crecimiento de las celulas tumorales que seran reinyectadas a los pacientes. Este procedimiento ha sido ya realizado con seguridad. Este componente del sistema Onco-Maxi-Vax es unico para cada paciente, ya que sera recogido de cada individuo y usado en combinacion con el segundo componente de la vacuna.
El segundo componente de la vacuna Onco-Maxi-Vax es comun (o "universal") a todos los pacientes, es el suminis- trador de inmunomodulador. Esta compuesto o bien de una capsula grande (macroencapsulacion) o de pequenas capsulas (microencapsulacion) que contiene celulas vivas. La capsula o las capsulas se requieren para inmunoaislar las celulas humanas alogenicas. La capsula o capsulas son semipermeables. Permite la supervivencia de las celulas en el interior por migraciones de nutrientes y evita la exposicion de las celulas a un entorno que normalmente las destruina.
En el sistema Onco-Maxi-Vax, las celulas a encapsular son modificadas por ingeniena genetica para que segreguen moleculas inmunoestimuladoras. Deben considerarse como un biorreactor inmunoaislado que produce y libera, en el sitio de la vacunacion, intensas senales inmunoestimuladoras. Hasta ahora el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos (Granulocyte-Macrophage Colony- Stimulating Factor (GM-CSF)) es probablemente la molecula inmunoestimuladora mas potente para la respuesta inmunitaria antitumoral. A causa de las propiedades bioqmmicas el GM-CSF necesita ser producido localmente en el sitio de la vacuna para obtener una liberacion retar- dada de la protema durante un tiempo de al menos cinco a siete dfas. Inicialmente las celulas encapsuladas son modificadas por ingeniena genetica para que segreguen GM-CSF solo. Dependiendo de estudios de sinergismp,
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pueden anadirse sin dificultad otras moleculas inmunomoduladoras (otras citocinas tales como IL-12, IL-15, IL-4, Interferon gamma, quimiocinas o factores de crecimiento dendntico).
Para maximizar la seguridad, la capsula usada en la macroencapsulacion es recuperable y las celulas que contiene son irradiadas antes de la implantacion. Experimentos previos han demostrado que la irradiacion de celulas produc- toras de GM-CSF no impide la produccion y la liberacion de la protema.
Los dos componentes de la vacuna Onco-Maxi-Vax se ponen bajo la piel del paciente en estrecha proximidad o en contacto. Son implantados en sitios distantes del tumor primario o la metastasis con el fin de realizar la vacunacion en una localizacion inmunologicamente no alterada.
De cinco a siete dfas despues de la implantacion, la capsula se retira usando, por ejemplo, una cuerda especialmen- te disenada unida a la misma. Las celulas tumorales autologas irradiadas inyectadas como componente de la Onco- Maxi-Vax son procesadas progresivamente y eliminadas del sistema inmunitario del paciente, por mecanismos natu- rales.
El tratamiento de vacunacion con Onco-Maxi-Vax comprende inmunizaciones repetidas en intervalos de dos a tres semanas en sitios diferentes, normalmente subcutaneo. El numero total de vacunaciones, aunque ajustable, es preferentemente un mmimo de cinco.
La dosis de celulas autologas se ajusta a la cantidad de celulas recolectadas de los pacientes. Se recomienda tener alrededor de 107 a 108 celulas por inmunizacion. Cuando esta dosificacion no puede repetirse 5 veces, la dosis de celulas tumorales autologas se reduce en consecuencia.
El numero ideal de celulas a encapsular depende de la cantidad de agente inmunomodulador tal como GM-CSF que se requiere en el sitio de vacunacion. En estudios previos, las celulas autologas productoras de GM-CSF liberaban entre 80 y 960 ng/106 celulas/24 hr. La liberacion entre 500 y 1000 ng/24 hr se considera un objetivo razonable.
De acuerdo con la invencion, el agente inmunomodulador tal como las celulas secretoras de GM-CSF segregan mas de 10 ng/106 celulas/24 horas de agente inmunomodulador. Las celulas preferidas de la invencion segregan una cantidad de GM-CSF igual o superior 100 ng/106 celulas/24 horas, preferentemente mas de 500 ng/106 celulas/24 horas. Si es necesario, pueden implantarse varias capsulas al mismo tiempo. La cantidad total de agente inmuno- modulador suministrado, especialmente GM-CSF, ha de ser al menos 1 microgramo por 24 horas en el sitio de va- cunacion.
En consecuencia, una celula de la invencion segrega mas de 10 x 10-15 g de agente inmunomodulador cada 24 h, preferentemente mas de 100 x 10'15 g/24 horas de agente inmunomodulador. Una celula de la invencion segrega por ejemplo entre 80 y 960 x 10'15 g/24 horas, preferentemente mas de 500 x 10'15 g/24 horas de agente inmunomodula- dor.
La capsula segun la invencion puede contener entre 2 x 105 celulas y 2, 3, 4 o 5 x 107 celulas, preferentemente mas de 107 celulas por capsula, por ejemplo 2 x 107 celulas por capsula.
Esta inmunizacion antitumoral se realiza para una amplia gama de tipos de tumor. Como se discutio anteriormente, las celulas encapsuladas son identicas para cada paciente. Solamente en pacientes con celulas tumorales que pueden ser recolectadas de un tumor primario solido, una metastasis o de fluido que contiene celulas tumorales (pleural, peritoneal, medula osea o sangre), es posible generar el producto de vacuna completo.
En oncologfa clmica, la mayona de los pacientes presentan un tumor primario o una lesion metastasica. Notodos los tumores o metastasis son igualmente faciles de procesar. Por consiguiente, el tipo de tumor que sera ensayado necesita cumplir varios criterios en terminos de viabilidad. Los canceres que es probable que tengan un tumor primario que pueda ser recolectado son:
- Tumor del Sistema Nervioso Central tal como el glioblastoma
- Tumor de pulmon (cancer de pulmon de celulas no pequenas)
- Tumor de prostata
- Carcinoma gastrico
- Carcinoma de mama
- Linfoma
- Carcinoma pancreatico
- Hepatocarcinoma (tumor de hngado)
- Carcinoma de colon
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- Carcinoma de celulas renales
- Carcinoma de ovario
- Carcinoma uterino
- Sarcoma (tejido blando)
- Leucemia (ganglio linfatico o sangre)
- Mieloma multiple (sangre, medula osea, ganglio linfatico, tejido blando)
Los canceres que es probable que tengan metastasis que pueden ser recolectadas son dependientes de la localiza- cion de la metastasis. Por razones tecnicas, es mas diffcil recolectar metastasis oseas que de otras localizaciones.
Estos canceres pueden ser, por ejemplo:
- Carcinoma de cabeza y cuello (metastasis de ganglios linfaticos)
- Cancer de pulmon (metastasis de pulmon, hugado, tejido blando, cerebro, adrenal)
- Prostata (metastasis no osea)
- Carcinoma de mama (pulmon, hugado, tejido blando, fluido pleural)
- Carcinoma gastrico (hugado)
- Carcinoma pancreatico (hugado)
- Carcinoma de colon (hugado)
- Melanoma (pulmon, ganglios linfaticos, tejido blando, hngado,cerebro)
- Carcinoma de celulas renales (pulmon, hugado)
- Carcinoma de ovario (fluido peritoneal o pleural, Mgado)
- Tumores germinales (pulmon)
- Carcinoma de vejiga (hugado, ganglios linfaticos).
Ademas de estos requisitos, los pacientes a enrolar en un estudio en fase I tienen que haber fracasado o rehusado el tratamiento estandar para el tipo de su cancer y el estadiaje de su tumor.
En relacion con este aspecto, los siguientes tumores podnan sertratados preferentemente con Onco-Maxi-Vax Fase I despues del tratamiento especificado:
Tumor del CNS (glioblastoma): Recidiva despues de cirugfa +/- radioquimioterapia;
Tumor de cabeza y cuello: Enfermedad metastasica despues de cirugfa +/- radioquimioterapia;
Cancer de pulmon: NSCLC/Mesotelioma: Enfermedad metastasica de primera lmea o despues de la progresion posterior a quimioterapia;
Cancer de pulmon de celulas pequenas: En pacientes metastasicos despues de la primera lmea de quimioterapia para la enfermedad localizada o bien extendida;
Cancer de mama/ovario: Despues de dos lmeas de quimioterapia para enfermedad metastasica;
Carcinoma de esofago/gastrico/colon/vejiga, cancer uterino: Metastasico, que progresa despues de una lmea de quimioterapia;
Cancer pancreatico/hepato-celular: Posterior a cirugfa cuando es incompleta o con metastasis loco-regional o distan- te;
Carcinoma de celulas renales/Melanoma: primera lmea de enfermedad metastasica;
Linfoma/mieloma multiple/leucemia: Progresion a pesar del regimen de quimioterapia multiple en enfermedad avan- zada, no tratable con la terapia reconocida actualmente disponible (reinfusion de medula osea autologa, anticuer- pos);
Sarcoma, tumores germinales: Enfermedad progresiva despues de multiples regfmenes de quimioterapia;
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Cancer de prostata: despues del fracaso de la terapia hormonal y cuando puede recolectarse la metastasis (tngado, ganglios linfaticos, otros).
Con el fin de evaluar la respuesta potencial usando criterios radiologicos clasicos, los pacientes han de tener enfer- medad medible o enfermedad evaluable. El periodo de seguimiento es hasta la progresion de la enfermedad. El seguimiento incluye estudios radiologicos principalmente con escaner CT para registrar cualquier cambio en el vo- lumen del tumor.
La toxicidad y la viabilidad se registran durante el periodo de inmunizacion y tambien durante el periodo de seguimiento mediante visita bisemanal al Centro de Oncologfa, y la evaluacion por un oncologo.
Los marcadores tumorales serologicos tales como CA 153, CA19-9, CEA, AFP, NSE, CA 125, son controlados cuando son elevados antes de la vacunacion.
Siempre que sea posible, se intenta la reseccion quirurgica de la metastasis con el fin de documentar cualquier cambio en la estructura del tumor. Esta bien descrito que la evaluacion clasica del tumor por medida bidimensional puede no ser el mejor metodo de evaluacion para establecer la eficacia potencial del tratamiento de inmunizacion. La destruccion de las celulas tumorales puede ser muy eficiente y estas pueden ser reemplazadas por celulas fibro- sas o inflamatorias sin cambios de tamano detectables en el examen radiologico. La actividad metabolica que evalua el escaner PET puede ser de relevancia en este estudio. El analisis de una lesion tumoral posterior a la inmunizacion es de gran interes para los analisis inmunologicos tales como la caracterizacion del antfgeno tumoral potencial sena- lado como diana por el tratamiento.
En otra realizacion preferida, las celulas de la invencion se usan en el contexto de la inmunizacion contra varias enfermedades infecciosas. Este producto de la invencion puede asf llamarse "lA-Maxi Vax" (agente infeccioso).
De modo similar al del metodo Onco-Maxi-vax, el "lA-Maxi-Vax" es un producto terapeutico (vacuna) hecho de dos componentes que estan ffsicamente en estrecha proximidad durante la inmunizacion.
Un componente representa la fuente de antfgeno o antfgenos. Para esta vacunacion anti-infecciosa, el antfgeno comprende uno o mas componentes de los agentes infecciosos. Por consiguiente todos los pacientes con una infec- cion espedfica seran tratados con el mismo producto. Muchos componentes de antfgeno conocidos han sido descri- tos en enfermedades infecciosas causadas por agentes patogenos virales, bacterianos o parasitos, y actualmente son usados para estrategias de inmunizacion. Estos antfgenos pueden ser usados como patogenos inactivados, lisados de agentes infecciosos, extractos de protema, protemas recombinantes, peptidos, DNA u otras formas. En algunas condiciones dependientes del agente infeccioso o de la condicion medica del hospedador, la inmunizacion es debil o no protectora, dando lugar a una morbilidad o mortalidad significativas.
El HIV es un ejemplo de fracaso en la erradicacion natural de un patogeno viral.
La inmunosupresion despues del trasplante de medula osea es un ejemplo en el que la infeccion por CMV, usual- mente benigna, puede ser potencialmente mortal.
El primer componente de la vacuna comprende una combinacion del antfgeno o una mezcla de antfgenos. Las celulas circunstantes encapsuladas de la invencion que liberan localmente, en el sitio de vacunacion, una senal inmu- nomoduladora muy potente, constituyen el segundo componente de la vacuna.
El segundo componente de la vacuna es el mismo ("universal") para todos los pacientes. Esta hecho de una capsula semipermeable (macro o micro) que contiene celulas vivas. La capsula se requiere para inmunoaislar las celulas humanas alogenicas. Permite la supervivencia de las celulas en el interior por migraciones de nutrientes y evita la exposicion de las celulas a un entorno que normalmente las destruina.
Las celulas a encapsular son modificadas por ingeniena genetica para que segreguen moleculas inmunoestimulado- ras. Hasta ahora el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos (Granulocyte-Macrophage Colony- Stimulating Factor (GM-CSF)) es probablemente una de las moleculas inmunoestimuladoras mas potentes para reforzar la respuesta inmunitaria. Se ha demostrado que el GM-CSF aumenta la inmunidad contra varios agentes parasitos o virales. A causa de las propiedades bioqmmicas el GM-CSF necesita ser producido localmente en el sitio de la vacuna para obtener una liberacion retardada de la protema durante un tiempo de al menos cinco a siete dfas. Inicialmente las celulas encapsuladas son modificadas por ingeniena genetica para que segreguen GM-CSF solo. Dependiendo de estudios sinergicos, podnan anadirse facilmente otras moleculas inmunomoduladoras (otras citoci- nas tales como IL-12, IL-15, IL-4, Interferon gamma, quimiocinas o factores de crecimiento dendntico).
Para maximizar la seguridad, la capsula es recuperable y las celulas que contiene son irradiadas antes de la implan- tacion. Experimentos previos han demostrado que la irradiacion de celulas productoras de GM-CSF no impide la produccion y la liberacion de la protema.
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Los dos componentes de la vacuna para el agente infeccioso se ponen bajo la piel del paciente en estrecha proximi- dad o en contacto. Puede ser beneficioso hacer la administracion secuencial de los dos componentes, siendo prime- ro implantada la capsula, seguida por el estfmulo antigenico.
De cinco a siete dfas despues de la implantacion, la capsula se retira usando, por ejemplo, una cuerda especialmen- te disenada unida a la misma.
El tratamiento de vacunacion con “lA-Maxi-Vax” comprende inmunizaciones repetidas en intervalos de dos a tres semanas en sitios diferentes, siempre subcutaneos. El numero total de vacunaciones depende del protocolo y las dosis y ha de ajustarse en cada caso en particular.
El "lA-Maxi-Vax" se dirige de forma no exhaustiva a las condiciones siguientes:
* Infecciones virales:
Objetivo: Pacientes de HIV en varios estadios de su enfermedad (en el estadio inicial pueden ser mejores candidatos, con un sistema inmunitario mas fuerte).
Objetivo: Infeccion con CMV en una condicion espedfica (anterior o posterior al transplante de un organo). Objetivo: infeccion de herpes recurrente.
Hepatitis B o virus de Epstein Bar.
Hepatitis C.
* Infecciones bacterianas tales como:
Objetivo: Infeccion micobacteriana en una poblacion espedfica tal como los pacientes de HIV.
Objetivo: Elicobacter pylori. El E. pylori es el agente causante en la mayona de las ulceras de estomago o gastritis.
* Infecciones parasitarias tales como Malaria, Toxoplasma, Neumocistis.
De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas, vacunas y kits que comprenden celulas que producen el agente inmunomodulador GM-CSF y que estan inmunoaisladas ffsicamen- te.
Todos estos productos estan particularmente bien adaptados para la produccion industrial porque son faciles de producir en grandes cantidades gracias a la caractenstica “universal” del dispositivo. Como las celulas estan inmunoaisladas, las mismas celulas encapsuladas son adecuadas para todos los pacientes. Esta caractenstica “universal” es particularmente interesante para la terapia del cancer, en la que se requieren multiples inyecciones de la vacuna o de la composicion farmaceutica.
Una composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion comprende celulas inmunoaisladas que producen el inmunomodulador GM-CSF combinado con un veldculo aceptable fisiologicamente. La densidad de celulas de la invencion a incorporar en la composicion ha de ser definida para cada caso diferente. En particular, la densidad de celulas a incorporar es funcion de la dosis de inmunomodulador requerida. Los ejemplos de vehmulos adecuados aceptables fisiologicamente consistinan en un dispositivo que cumpliese las siguientes necesidades: no toxico (local y sistemico), inmunoaislamiento eficiente, permeable permitiendo la liberacion mantenida del inmunomodulator. Una macro o microcapsula hecha de PES o aH-69 satisfacen estos requisitos asf como los productos desarrollados por Theracytes Inc.
Una composicion de vacuna de la presente invencion comprende celulas inmunoaisladas que producen un inmunomodulador combinado con un componente antigenico. Este segundo componente de la vacuna representa la mole- cula contra la cual se espera una reaccion de inmunizacion. El primero segrega el inmunomodulador necesario para potenciar el proceso de inmunizacion. El componente antigenico puede estar representado por una protema, por ejemplo una protema viral que se sabe que es inmunogena, o por una celula completa que expresa antfgenos en su superficie, o por un extracto que contiene varias sustancias antigenicas. En el contexto del cancer, el componente antigenico es preferentemente una celula tumoral (vacuna terapeutica). Se sabe que las celulas tumorales expresan en su superficie antfgenos asociados al tumor contra los cuales se desea una respuesta inmunitaria.
Cuando se usan celulas tumorales, como en el contexto del cancer, las celulas tumorales son preferentemente irra- diadas antes de su incorporacion en una composicion. La irradiacion es una medida de seguridad con el fin de evitar cualquier posible desarrollo de celulas tumorales que seran reinyectadas en los pacientes. Ademas de la seguridad,
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la irradiacion puede ser una forma muy buena de permitir la liberacion de determinates antigenicos potencialmente utiles.
En el contexto de la vacunacion contra agentes infecciosos, el componente antigenico es preferentemente del agen- te contra el cual se desea una respuesta inmunitaria, por ejemplo de un virus. Los virus preferidos son los de la Hepatitis C y el HIV.
La presente invencion proporciona tambien kits que comprenden celulas inmunoaisladas que producen un inmuno- modulador combinado con un componente antigenico. El primer componente del kit segrega el inmunomodulador necesario para potenciar el proceso de inmunizacion contra el segundo componente antigenico.
Como ya se ha mencionado para la composicion de la vacuna, el componente antigenico de un kit de acuerdo con la presente invencion comprende preferentemente una celula que produce, segrega o libera un antigeno. Alternativa- mente, el componente antigenico puede ser una molecula, por ejemplo una protema, o un extracto celular.
En el contexto del cancer, el componente antigenico del kit es preferentemente una celula tumoral. Preferentemente se adoptan las mismas medidas de seguridad irradiando la celula tumoral antes de su empleo.
De acuerdo con la presente invencion, el kit se usara generalmente para la implantacion en el cuerpo humano. Por esta razon, se imponen muchas reservas a las propiedades del kit. En particular, este kit ha de ser disenado para que sea lo mas pequeno posible. Tambien ha de ser biocompatible. Un kit de acuerdo con la invencion puede po- nerse durante un tiempo tan largo como varias semanas o meses. El kit ha de ser seguro a lo largo de la duracion de este periodo. En particular, en muchos usos del kit, el dispositivo de encapsulacion necesita ser sellado.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente solicitud, la invencion incluye usos de celulas inmunoaisladas que producen el agente inmunomodulador GM-CSF, y usos de composiciones farmaceuticas, vacunas y kits como se describieron antes, en el terreno terapeutico, asf como en el campo de la vacunacion.
La invencion se refiere en particular a un procedimiento para vacunar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento. Este procedimiento comprende la administracion de una composicion que comprende celulas de la invencion. El sujeto es preferentemente un paciente humano, pero tambien pueden ser animales. Un sujeto puede estar en necesidad de vacunacion por distintas razones, porque es preferible una inmunizacion preventiva, al igual que para una enfermedad benigna, o es necesaria por ejemplo en el caso de epidemias graves.
En un caso de vacunacion preferido, se produce la respuesta inmunitaria contra un componente antigenico particular. En este caso predominante, el procedimiento de la invencion comprende tambien la etapa de administrar el componente antigenico al sujeto.
Un paciente puede ser vacunado preventivamente porque tarde o temprano va a estar en contacto con el componente antigenico. Tambien puede ser inmunizado terapeuticamente mediante el procedimiento de la invencion porque ya esta en contacto con el componente antigenico pero no puede generar por sf mismo una respuesta inmunitaria adecuada.
Cuando el procedimiento comprende la administracion de celulas de la invencion y de un componente antigenico, se contemplan protocolos diferentes. Ambas administraciones pueden hacerse al mismo tiempo, o pueden hacerse por separado o secuencialmente. Puede ser muy ventajoso separar temporalmente las administraciones. De hecho, las celulas de la invencion, gracias a su dispositivo de barrera, tienen un efecto prolongado. Por el contrario, es probable que los componentes antigenicos inyectados sean procesados y eliminados muy rapidamente por el sistema inmuni- tario del hospedador. En tal caso, cuando las administraciones son separadas, la administracion del componente antigenico puede repetirse aunque hay una administracion unica de celulas de la invencion.
El agente antigenico y el inmunomodulador deben estar preferentemente co-localizados para que produzcan un efecto optimizado.
Preferentemente, para un proceso de inmunizacion optimizado, la administracion se repite varias veces, preferentemente se repiten las administraciones de celulas de la invencion asf como de componente antigenico. En un caso preferido, la administracion se repite mas de dos veces, preferentemente entre 3 y 6 veces, preferentemente 5 ve- ces.
Es crucial que las inmunizaciones repetidas no generen una respuesta inmunitaria aumentada contra el inmunomodulador o sus medios de suministro, con el riesgo de anular los beneficios de las inmunizaciones repetidas o generar una respuesta inmunitaria peligrosa. El dispositivo de inmunoaislamiento de las celulas que producen el inmunomodulador, como se propone en la presente solicitud, evita estos problemas. Representa una ventaja tecnica sobre los sistemas desarrollados en la tecnica anterior.
Como se discutio anteriormente, cuando se usa el procedimiento de vacunacion de la invencion en el campo del cancer, el componente antigenico es preferentemente una celula tumoral completa, mejor si ha sido irradiada. Dado que es sabido que algunos antfgenos estan presentes en muchos tumores del mismo linaje, las celulas tumorales
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usadas pueden ser unas alogenicas. Sin embargo, las celulas tumorales son preferentemente autologas con respec- to al paciente.
Preferentemente, las celulas tumorales, que son la fuente de componente antigenico, y las celulas inmunoaisladas, que son la fuente del componente inmunomodulador, son distintas. Esta situacion es ventajosa sobre los sistemas anteriores que acoplan a ambos, porque las celulas tumorales no necesitan ser manipuladas, excepto en las etapas de recoleccion e irradiacion, al contrario que soluciones anteriores que requieren la manipulacion genetica de las celulas tumorales.
El modo de administracion de las celulas de la invencion, de acuerdo con el presente procedimiento, se elige para que sea el mas eficaz. En particular, el modo se adapta a la localizacion deseada para las celulas y el componente antigenico. Una localizacion preferida es la subcutanea porque esta zona es rica en celulas dendnticas. La administracion puede hacerse intradermicamente. Tambien se prefieren otras localizaciones que podnan favorecer la res- puesta inmunitaria esperada.
De acuerdo con la invencion, las celulas secretoras de inmunomodulador se cargan en una capsula, que se ha de implantar. En una realizacion preferida, la capsula se retira al cabo de 2 a 7 dfas, preferentemente de 5 a 7 dfas.
La invencion se refiere tambien a un procedimiento para tratar a un paciente que padece cancer. Los canceres y estados particularmente bien adaptados se describieron con detalle anteriormente. Este procedimiento comprende la administracion de una composicion que contiene celulas inmunoaisladas que producen un agente inmunomodulador. De acuerdo con la presente invencion, las celulas inmunoaisladas pueden ser autologas o alogenicas, y en particular pueden ser celulas tumorales autologas.
La composicion administrada puede ser inyectada, ingerida, implantada, aplicada, o para cualquier otro medio de administracion. La composicion puede comprender cualquier aditivo farmaceutico necesario para la superviviencia de las celulas y para el exito de la administracion o implantacion. La composicion puede contener tambien un componente antigenico que es generalmente celulas tumorales completas irradiadas. Preferentemente se administra en un sitio distante de la localizacion del tumor, donde se supone que no ha tenido lugar ninguna respuesta inmunitaria previa. Sin embargo, la composicion puede ser administrada en la proximidad de celulas tumorales del paciente que se ha de tratar.
En el contexto de la presente invencion, celulas inmunoaisladas que producen o segregan un agente inmunomodulador, como se describio antes, se usan en terapia, en particular en la terapia del cancer. Estas celulas son tambien usadas posiblemente en el campo de la vacunacion.
Otro uso que esta perfectamente adaptado a las celulas de la invencion es en la preparacion de un coadyuvante. En este caso particular, la funcion del coadyuvante es potenciar una respuesta inmunitaria que se considera demasiado debil. Si es asf, el agente inmunomodulador producido por las celulas inmunoaisladas de la invencion es un inmu- noestimulador.
Otro uso es en la elaboracion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento del cancer. Las caractensticas de tal aplicacion han sido ya bien documentadas anteriormente.
Se han descrito antes kits que comprenden celulas de la invencion. La presente solicitud contempla tambien el uso de uno de estos kits para la preparacion de una vacuna.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: Protocolo clmico de inmunizacion para Onco-Maxi-Vax.
El tratamiento de vacunacion con Onco-Maxi-Vax comprende inmunizaciones repetidas. La inmunizacion se repite en intervalos de dos semanas en sitios diferentes, siempre subcutanea. El numero total de vacunaciones es un mf- nimo de cinco.
A: cirugfa, recoleccion de celulas y procesamiento de las propias celulas de los pacientes.
j: Inmunizacion con Onco-Maxi-Vax: celulas productoras de GM-CSF encapsuladas irradiadas, y celulas tumorales autologas irradiadas.
Figura 2: Inmunidad protectora contra tumores de tipo silvestre provocada por varias celulas tumorales irradiadas, secretoras de citocina.
Esta figura compara la eficacia de varias moleculas inmunomoduladoras en el modelo de vacunacion de ratones. Cada bloque representa el porcentaje de ratones que sobreviven a una provocacion de tumor despues de la vacu- nacion con celulas tumorales irradiadas que producen la molecula descrita.
Todos los ratones vacunados con celulas tumorales irradiadas secretoras de GM-CSF estan protegidos. El 25% de los ratones vacunados con celulas tumorales irradiadas secretoras de FLT3-L estan protegidos.
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Figura 3: Liberacion de GM-CSF desde celulas Renca secretoras de GM-CSF encapsuladas, no irradiadas.
Esta tabla muestra un analisis de la secrecion de GM-CSF fuera de la capsula para varios valores del tiempo, por celulas Renca secretoras de GM-CSF encapsuladas. La liberacion de GM-CSF se expresa en ng/capsula/24h.
La medida de la liberacion in-vitro de GM-CSF murino desde la capsula que contiene celulas secretoras de GM-CSF se lleva a cabo los dfas 4, 7, 11, 14 y 21 posteriores a la carga de las celulas en la capsula. Esto se realiza con anti- cuerpos monoclonales estandar contra GM-CSF murino en ensayos de inmunoabsorbente ligado a una enzima (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assays: ELISA) (R&D systems). Se evaluan las cantidades de protema liberada, asf como la reproducibilidad de una capsula a otra.
Figura 4: Supervivencia a los 50 dfas despues de la provocacion con B16WT.
Este grafico muestra la supervivencia a los 50 dfas, de ratones inmunizados el dfa -7 con
• solamente celulas Renca secretoras de GM-CSF encapsuladas irradiadas (grupo 1),
• o bien celulas Renca secretoras de GM-CSF encapsuladas irradiadas, mas celulas de melanoma B16 wt irradiadas (grupo 2),
• o bien celulas de melanoma B16 wt no encapsuladas irradiadas modificadas por ingeniena geneti- ca para segregar GM-CSF (grupo 3).
El grafico representa el valor medio sobre 5 ratones por grupo.
Figura 5: Supervivencia de ratones despues de la provocacion con B16WT.
Las condiciones experimentales son identicas a las condiciones especificadas en la figura 4 y expuestas en el ejem- plo 4.
Ejemplos detallados.
Ejemplo 1: Prueba de la secrecion de GM-CSF humano liberado por varias lmeas de celulas despues de la transfec- cion.
Este ejemplo muestra la capacidad de diferentes lmeas de celulas para segregar GM-CSF humano habiendo sido o no irradiadas.
Metodos de transfeccion.
El cDNA de GM-CSF humano fue clonado en un vector retroviral (MFG) como se describe en la bibliograffa (Danos Olivier y Mulligan Richard 1988 PNAS Vol. 85 p 6460-64; Jaffe Elizabeth et al. 1993 Cancer Research Vol. 53 p 2221-26).
El GM-CSF humano se inserta en marco en el vector retroviral. La construccion MFG-hGM-CSF fue secuenciada con el fin de asegurar la correcta clonacion en marco.
Usando la tecnica de transfeccion transitoria con lipofectamina, la construccion MFG-hGM-CSF fue transfectada en celulas 293-gpg como se describe en la bibliograffa (Ory Daniel et al. 1996 PNAS Vol. 93 p 11400-06). Con la ade- cuada seleccion, estas celulas producen partmulas retrovirales seudotipadas que contienen el gen de hGM-CSF. Estas partmulas virales son deficitarias de replicacion pero pueden infectar una amplia gama de celulas de marnffe- ros.
El sobrenadante de las celulas 293-gpg transfectadas se usa para infectar celulas en division. Esto se realiza con polibreno y no se realiza seleccion. Por consiguiente se usa la poblacion celular completa para analisis subsiguiente.
Pruebas de secrecion.
Las celulas infectadas se ensayan despues en relacion con su capacidad para segregar GM-CSF humano.
Se realiza un ELISA clasico para medir la cantidad de GM-CSF en el sobrenadante de los diversos tipos de celula ensayados.
Se ensayaron lmeas de celulas murinas y humanas en relacion con su capacidad para segregar GM-CSF humano en distintos momentos, y tambien despues de la irradiacion con 3500 rads. Las distintas lmeas de celulas ensayadas son las siguientes:
• Renca: lmea de celulas de cancer renal murino de base Balb/c.
• B16 F10: lmea de celulas de melanoma de base C57BL/6.
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• Lmea de celulas A: fibroblastos tumorigenicos humanos.
• Lmea de celulas B: fibroblastos humanos inmortalizados.
Se ponen 106 celulas en una placa de cultivo. Al cabo de 48 horas el sobrenadante se recolecta y se filtra por 0,2u, y se congela a -20°C. Para el ensayo ELISA los anticuerpos y los patrones de protema se adquieren de R&D System.
Tambien se ensayan celulas no transfectadas como control o testigo negativo.
Resultados:
Los resultados se expresan en ng de h-GM-CSF por cada 106 celulas a las 48 horas.
- no irradiacion irradiacion
- Renca wt
- 0 0
- B16 wt
- 0 0
- Renca h-GM-CSF
- 23400 9300
- B16-h-GM-CSF
- 37650
- Lmea de celulas A
- 0,9
- Lmea de celulas A h-GM-CSF
- 18600 14900
- Lmea de celulas A
- 1,2
- Lmea de celulas B h-GM-CSF
- 6300 2950
- Solo medio
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Las lmeas de celulas de cancer murinas y las lmeas de celulas de fibroblastos humanos pueden segregar grandes cantidades de GM-CSF humano durante un prolongado periodo de tiempo, in vitro. No se ha observado disminucion en la produccion con el tiempo (al menos tres semanas despues de la infeccion, para las celulas no irradiadas).
En su conjunto, estos resultados experimentales indican que los fibroblastos humanos pueden segregar un elevado nivel de GM-CSF humano durante varios dfas, sin que se presenten toxicidades para las celulas evidentes. Por tanto son buenos candidatos para la aplicacion clmica como se sugiere en el metodo Maxi-Vax, esto es, celulas alogeni- cas inmunoprotegidas encapsuladas que liberan inmunomodulador en el sitio de vacunacion.
Ejemplo 2: Protocolo experimental que evalua la eficacia de Onco-Maxi-Vax. Celulas tumorales autologas irradiadas + celulas productoras de GM encapsuladas. Desarrollo pre-clmico en el modelo de raton.
Este ejemplo concierne a la reproduccion, usando Onco-Maxi Vax, de la eficacia de vacunacion observada en el sistema clasico, cuando el GM-CSF es producido por las celulas tumorales irradiadas, tanto en ratones de tipo sil- vestre como en ratones deficitarios de GM-CSF. Tambien permite la documentacion de cualquier nueva toxicidad relacionada con el uso de la capsula, su manipulacion o las celulas que contiene.
Ademas, se lleva a cabo la caracterizacion de la respuesta por tecnicas estandar tecnicas (histologfa del sitio de al vacuna, perfil de citocinas, tincion de celulas dendnticas en el sitio de vacunacion).
Diseno experimental.
A) Medida de la liberacion de GM-CSF murino in-vitro desde la capsula que contiene celulas secretoras de GM-CSF.
Esto se realiza con anticuerpos monoclonales estandar contra GM-CSF murino en ensayos ELISA (R&D systems). Se evaluan las cantidades de protema liberadas asf como la reproducibilidad de unas capsulas a otras, y los resultados se muestran en la figura 3.
B) Comparacion directa de los dos procedimientos de inmunizacion:
El grupo testigo negativo: Vacunacion con celulas de melanoma B16 irradiadas, no manipuladas de tipo silvestre (Wild-Type) (B16 WT).
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El grupo testigo positivo: La tecnica estandar usada en el laboratorio: Vacunacion con celulas de melanoma B16 secretoras de GM-CSF irradiadas (B16-GM).
El grupo de investigacion: Vacunacion con celulas de melanoma B16 irradiadas no manipuladas (B16 WT) en estre- cho contacto con una capsula implantada subcutaneamente que contiene celulas que liberan GM-CSF murino.
La vacuna combina celulas de melanoma B16 de tipo silvestre irradiadas inyectadas en estrecho contacto con una macrocapsula hecha de PES (polietersulfona). Esta capsula contiene 200.000 celulas Renca construidas retroviral- mente para que segreguen GM-CSF. Las celulas encapsuladas se mezclan con una matriz basada en colageno.
Las celulas B16 GM y las Renca GM se generan usando la misma tecnica de transfeccion. De forma resumida, el cDNA de GM-CSF murino fue insertado en el vector retroviral MFG. Las partfculas retrovirales que contienen el cDNA mGM-CSF fueron obtenidas despues de la transfeccion con lipofectamina de celulas 293-CPG. Estas partfcu- las retrovirales no replicativas infecciosas, fueron recolectadas, centrifugadas, concentradas y usadas para infectar las celulas B16 y Renca, respectivamente. La cantidad de GM-CSF liberada por B16-GM y Renca-GM se mide por una tecnica Elisa estandar.
Tres grupos adicionales para estudiar el efecto potencial de la propia capsula.
a) El grupo testigo positivo + capsula que contiene celulas no secretoras, para comprobar si la capsula ha- ce disminuir el efecto.
b) El grupo testigo negativo + capsula que contiene celulas no secretoras, para comprobar si la capsula tie- ne un efecto por sf misma, sin GM-CSF.
c) Vacunacion con solamente celulas que segregan GM encapsuladas, para comprobar si GM-CSF + celulas alogenicas tienen algun efecto.
Estos tres grupos adicionales aseguran que el efecto observado con la rama de investigacion es dependiente de GM-CSF y espedfico del tumor.
Protocolo
Ratones: cepa C57B1/6 de al menos 8 semanas de edad.
Celulas: Cultivo en medio DMEM con 10% de suero de ternera inactivado + penicilina y estreptomicina. La recolec- cion desde las placas de cultivo de las celulas se realiza de una a dos horas antes de la inyeccion. Las celulas adhe- rentes B16 WT y B16 GM se lavan con PBS x1, se despegan con Tripsina EDTA (Life tech) y despues se lavan x 3 en HBSS. Las celulas se cuentan despues y se resuspenden en HBSS a la concentracion descrita.
Renca GM y Renca Wt son las celulas cargadas en las capsulas. Estas celulas se cultivan en el mismo medio DMEM que antes.
D^a 0: Vacunacion:
Se recolectan B16-WT o B16 GM, se resuspenden a la concentracion de 2 x 106/ml y se irradian a 3500 rad. Las capsulas se implantan subcutaneamente en el abdomen en los grupos apropiados despues de la irradiacion (3500 rad).La vacunacion se realiza subcutaneamente con 1 x 106 celulas en 500 pl en el abdomen. Grupos con la capsula y las celulas B16 co-inyeccion, las celulas se inyectan en estrecho contacto con la capsula. Se usa una anestesia superficial para asegurar la reproducibilidad del procedimiento.
D^a 7: Provocacion:
Se recolectan B16 WT de las placas de cultivo y se resuspenden a una concentracion de 1 x 106/ml.
La inyeccion de 5 x 105 celulas en 500 pl se realiza en el lomo superior.
Se usa anestesia superficial para asegurar la reproducibilidad del procedimiento.
Seguimiento.
Los animales son comprobados diariamente para observar si hay crecimiento de tumores. Se toma nota del dfa que se hace visible un tumor. Los animales son sacrificados cuando el tumor es mayor que 1 cm o se ulcera. Se toma nota del dfa del sacrificio. Los animales libres de tumores se observan hasta el dfa 80 para un potencial crecimiento tardfo del tumor.
Este modelo ha sido bien descrito en el pasado y los ratones que no desarrollan tumor en el sitio subcutaneo de provocacion no desarrollaran metastasis distantes.
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Los ratones libres de tumores el dfa 80 tienen una inmunidad anti-tumoral espedfica de larga duracion siempre y cuando los grupos testigo den los resultados que permitan la validacion de los experimentos.
Resultados preliminares:
Evaluacion de la toxicidad de la liberacion prolongada de GM-CSF por las celulas encapsuladas y por la propia cap- sula bajo la piel.
Esto se evalua mediante el analisis de ratones con capsula implantada que contiene un numero creciente de celulas secretoras de GM irradiadas. El efecto de la capsula vada tambien es analizado. Esto se lleva a cabo mediante la observacion del animal en relacion con cualquier toxicidad local o sistemica. El nivel en suero de GM-CSF se analiza mediante ELISA. El analisis histologico se lleva a cabo en el sitio de la vacunacion. Esta evaluacion de la toxicidad se realiza con dos ratones por grupo.
Ejemplo 3: Protocolo para la preparacion de "Onco-Maxi-Vax" para su uso en personas.
Este ejemplo concierne a la preparacion de Onco-Maxi Vax, para la vacunacion de un paciente humano. El protocolo da informacion detallada relativa a la preparacion de la carga antigenica, la generacion del agente suministrador de citocina inmunoaislada y la inmunizacion con los dos componentes del Onco-Maxi-Vax.
Cada etapa de la preparacion de la vacuna para los dos componentes (celulas autologas irradiadas y celulas pro- ductoras de GM-CSf encapsuladas) y las inmunizaciones se realizan de acuerdo con directrices GMP clmicas.
1) Recoleccion de celulas tumorales autologas (carga antigenica)
Se recolecta quirurgicamente una masa tumoral (lesion primaria o metastasis) del paciente que ha de ser tratado. Se lleva a cabo un examen patologico estandar en una porcion de la masa con el fin de confirmar la naturaleza maligna del material recolectado. Despues se procesa con el fin de obtener una suspension de celulas individuales. Esto se realiza por metodos tanto mecanicos como enzimaticos.
En primer lugar la masa tumoral se corta en piezas mas pequenas usando un microscopio de diseccion, despues se pone el tumor en una bolsa esteril con una solucion esteril que contiene varias enzimas (colagenasa). La bolsa se introduce en un mezclador de celulas (Stomacher Lab System) que procesa el producto formando una suspension de celulas. La combinacion de las actividades enzimatica y mecanica a 37°C durante unas pocas horas permite la eficiente disociacion de la matriz extracelular del tumor y la convierte en suspension de celulas individuales.
Esto se realiza en solucion libre de suero.
Las celulas se lavan despues tres veces con HBSS usando una centnfuga refrigerada (Sorvall) 4°C, 5 minutos, 700 rpm, y se resuspenden en HBSS. Despues se cuentan las celulas usando solucion de azul de tripano (Fluka) y una camara de Neubauer.
Las celulas se resuspenden a una concentracion elegida, se irradian a 10000 rads en un irradiador dedicado a uso clmico, se distribuye en alfcuotas y se congela en medio de congelacion que contiene 10% de DMSO.
2) Agente suministrador de citocina inmunoaislada. a) Generacion de celulas productoras de GM-CSF.
Las celulas a introducir en las capsulas son alogenicas (obtenidas de una lmea de celulas humanas). Con el fin de evitar una toxicidad imprevista, se usaron lmeas de celulas que han sido ya aprobadas en protocolos clmicos, tales como mioblastos o fibroblastos inmortalizados. Estas celulas son en primer lugar transfectadas establemente con cDNA de GM-CSF humano.
Pueden usarse dos metodos de transfeccion: transfeccion retroviral y electroporacion. Para la transfeccion retroviral, se inserta cDNA de hGM-CSF en marco en el vector retroviral MFG y la transcripcion es impulsada por el LTR del virus. El plasmido no contiene ningun marcador de seleccion ni gen de resistencia a un antibiotico.
Para la transfeccion por electroporacion, el cDNA del hGM-CSF esta bajo el promotor de CMV y el plasmido contiene un marcador selectivo (tal como un gen de resistencia a un antibiotico).
La invencion por tanto incluye el uso de diferentes tipos de celulas para la transfeccion y de diferentes plasmidos de GM-CSF. Esto deja mas flexibilidad con respecto a las reglamentaciones de organismos sanitarios locales.
Las celulas productoras de citocina se cultivan en medio libre de suero a 37°C con 5% de CO2, usando tecnicas estandar. La recoleccion se lleva a cabo de la forma siguiente: se elimina el sobrenadante de las celulas adherentes confluentes en una placa de cultivo de 10 cm, y las celulas se lavan una vez, durante 5 minutos a 37°C, con 5 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) autoclavada. Despues se elimina el PBS y se anaden 2 ml de Tripsina-
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EDTA el 0,5% (Life Technologies N° 25300054), y las celulas se incuban durante cuatro minutos a 37°C. La tripsi- na/EDTA permite que se despeguen las celulas tumorales adherentes. Las celulas se recolectan entonces con una pipeta de 2 ml y se diluyen en 5 ml de solucion salina equilibrada de Hank (HBSS Life Technologies N° 24020091). Las celulas se lavan tres veces con HBSS usando una centnfuga refrigerada (Sorvall) a 4°C, 5 minutos, a 700 rpm) y se resuspenden en HBSS. Despues se cuentan las celulas usando solucion de azul de tripano (Fluka) y una camara de Neubauer.
La cantidad de hGM-CSF producido y segregado por las celulas se evalua mediante Elisa (R&D system y kits de Pharmingen) en el sobrenadante de las celulas filtrado. Este analisis permite la seleccion de la mejor lmea de celulas productoras de citocina.
b) Inmunoaislamiento de celulas productoras de citocina.
Con el fin de asegurar la liberacion sostenida de citocina por las celulas alogenicas y permitir la inmunizacion repeti- da, es necesario inmunoaislar las celulas productoras de citocina del sistema inmunitario del receptor. Esto se lleva a cabo por macro encapsulacion o bien por microencapsulacion.
Las celulas productoras de citocina se cargan en macrocapsulas o se embuten en microcapsulas. Las capsulas pueden estar hechas de varios polfmeros con varios tamanos y poros, tales como las capsulas de PES y TF10/10, con y sin matriz de PVA (poli(alcohol vimlico)). La capsula se carga con la suspension de celulas a razon de 10,5 ul/min. El sellado de la capsula se obtiene mediante una cola de polfmero, pero tambien puede hacerse calentando o mediante puntos quirurgicos. El analisis del sobrenadante de las celulas encapsuladas que contienen celulas secre- toras de GM-CSF indico que se consigue una liberacion estable continua de GM-CSF durante al menos quince dfas despues de la carga, con niveles de citocina que son de aproximadamente 70 ng/105 celulas/24 hrs.
3) Inmunizacion:
La inmunizacion con Onco-Maxi-Vax requiere la inyeccion subcutanea en estrecho contacto de los dos componentes de la vacuna.
La capsula que contiene las celulas productoras de citocina se pone en el tejido subcutaneo usando una pequena incision de la piel bajo anestesia local. La piel se cierra con cinta quirurgica.
Las celulas tumorales irradiadas procedentes del paciente (= carga antigenica) se descongelan, se lavan dos veces con solucion esteril de NaCl al 0,9%, y despues se inyectan, subcutaneamente, en las proximidades inmediatas de la capsula, usando una aguja del calibre 24.
La vacunacion se repite cada dos semanas cuatro veces (y mas si se dispone de celulas tumorales autologas sufi- cientes). El sitio de vacunacion es diferente en cada inmunizacion (pared abdominal, extremidades superiores, mus- los, torax, etc).
Ejemplo 4: Onco-Maxi-Vax. Celulas tumorales autologas irradiadas + Celulas productoras de GM encapsuladas. Resultados in vivo en el modelo de ratones que indican la supervivencia a los 50 dfas despues de la provocacion con B16WT.
Este ejemplo concierne a datos in vivo en ratones, que estan protegidos de la muerte inducida por la lmea de celulas tumorales de melanoma B16.
Protocolo
Ratones: Cepa C57B1/6 de al menos 8 semanas de edad.
Celulas: Cultivo en medio DMEM con 10% de suero de ternera inactivado + penicilina y estreptomicina. La recolec- cion desde las placas de cultivo de las celulas se realiza de una a dos horas antes de la inyeccion. Las celulas adherentes B16 WT y B16 GM se lavan con PBS x1, se despegan con Tripsina EDTA (Life tech) y despues se lavan x 3 en HBSS. Las celulas se cuentan despues y se resuspenden en HBSS a razon de 2 x 106 celulas/ml para la vacuna- cion y 4 x 105 celulas/ml para provocacion del tumor.
Renca GM (celulas Renca que segregan GM-CSF) son las celulas cargadas en las capsulas. Las capsulas eran capsulas de PES con matriz de PVA (poli(alcohol vimlico)). Estas celulas se cultivan en el mismo medio DMEM que antes.
Se inmunizan tres grupos de 5 ratones C57BL/6.
Grupo 1 (grupo de control negativo): Los ratones son tratados con solamente celulas Renca secretoras de GM-CSF encapsuladas irradiadas (no celulas de melanoma B16).
Grupo 2 (grupo de estudio). Los ratones son inmunizados con las mismas celulas Renca-GM-CSF irradiadas encapsuladas mas celulas de melanoma B 16 wt irradiadas.
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Grupo 3 (grupo de control positivo). Los ratones son inmunizados celulas de melanoma B16 irradiadas, no encapsu- ladas modificadas por ingeniena genetica para que segreguen GM-CSF.
Los ratones fueron inmunizados con solamente la capsula irradiada (grupo 1), o bien con capsula + B16wt irradiada (grupo 2), o bien con B16-GM-CSF irradiada (grupo 3) el dfa -7. Cada capsula conteniendo 105 de celulas Renca que segregan GM-CSF, fue irradiada (3500 rad) antes de la implantacion. A los ratones de los grupos 1 y 2 se les implantaron 2 capsulas a cada uno, puestas subcutaneamente en forma de V en el abdomen. Al cabo de 3 horas, los grupos 2 y 3 fueron inyectados con celulas B16 irradiadas, 106 celulas B16 wt para el grupo 2, y 106 celulas B16- GM-CSF para el grupo 3, subcutaneamente entre las dos capsulas.
El dfa 0, todos los ratones fueron provocados con 2 x 105 celulas B16 wt vivas en el lomo superior.
Los ratones con tumores en desarrollo mayores que 1 cm o que muestran ulceracion del tumor fueron sacrificados. Todos estos fueron relacionados con tumor. Los ratones no sacrificados permanecieron libres de tumores. La super- vivencia representa el porcentaje de ratones libres de tumores en cada grupo.
Este experimento con animales indica una eficacia muy buena de las celulas secretoras de GM-CSF encapsuladas, en la supervivencia a los 50 dfas (vease la figura 4).
Este experimento se repitio y los resultados se muestran en la figura 5 con una representacion grafica diferente. Este segundo experimento ilustra tambien la eficacia de la vacunacion con celulas secretoras de GM-CSF encapsuladas sobre la supervivencia, de mas de dos meses.
Resumen de caracteristicas
Esta invencion abarca una celula que produce al menos un agente inmunomodulador, siendo dicha celula-inmuno aislada. El agente inmunomodulador puede ser un agente inmunoestimulador o una citoquina tal como GM-CSF o FL. La celula puede producir otro agente inmunomodulador o producir tambien un agente antigenico. El agente in- munomodulador producido se puede segregar.
La celula esta inmuno-aislada y esto se puede lograr mediante un dispositivo de barrera, que puede ser permeable selectivamente, y puede ser permeable selectivamente a moleculas con un peso molecular menor que 280 kDa. Alternativamente, el inmuno-aislamiento se puede lograr mediante microencapsulacion o mediante microencapsula- cion.
La celula puede ser modificada geneticamente para expresar el agente inmunomodulador. La modificacion genetica puede lograrse mediante transfeccion por un plasmido o infeccion por un virus.
La celula puede ser una lmea celular humana establecida, por ejemplo un fibroblasto o una lmea de celulas epitelia- les. La celula puede ser inmortal o inmortalizada. La celula puede ser no tumoral. La celula puede ser de origen mairnfero. La celula puede ser humana. La celula puede irradiarse.
La celula puede searegar entre 80 y 960x10'15g/24h de agente inmunomodulador. Alternativamente, la celula segre- ga mas de 10x10'l5g/24h, preferiblemente mas de 100x10'15g/24h de agente inmunomodulador.
Una composicion farmaceutica puede comprender una celula como se describio anteriormente y un vehmulo fisiolo- gicamente aceptable.
Una composicion de vacuna puede comprender una celula como se describio antes y un componente antigenico. Th componente antigenico puede ser una celula tumoral, tambien la celula tumoral puede ser irradiada. El componente antigenico puede ser de un agente infeccioso, como un virus, tal como la hepatitis C o el VIH.
Un kit puede comprender una celula como se describio antes y un componente antigenico. El componente antigeni- co puede comprender una celula que produce o libera uno o varios antfgenos. La celula que produce o libera uno o varios antfgenos puede ser una celula tumoral y la celula tumoral puede irradiarse. El componente antigenico puede ser de un agente infeccioso y el agente infeccioso puede ser un virus. El kit puede ser biocompatible. El kit se puede insertar en el cuerpo humano.
Una capsula puede contener al menos una celula que produce un inmunomodulador, tal como GM-CSF. La capsula tambien puede contener una matriz de polfmero. La capsula puede disenarse para ser extrafble despues de la inser- cion. La capsula puede irradiarse.
Las celulas como se describio anteriormente se pueden usar en terapia o la vacunacion.
Las celulas como se describio antes pueden utilizarse para la fabricacion de un adyuvante para aumentar la res- puesta inmune, o para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion del cancer. Un kit como se describio antes se puede utilizar para la fabricacion de una vacuna. La vacuna puede ser implantada y retirada posteriormente. La extraccion puede llevarse a cabo entre 2 y 7 dfas despues de la implantacion, preferiblemente entre 5 y 7 dfas. Preferiblemente, las celulas son irradiadas.
Claims (21)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un producto terapeutico, caracterizado por dos componentes:(a) un primer componente que comprende un antigeno, que comprende uno o mas componentes de agentes in- fecciosos; y(b) un segundo componente que comprende una macrocapsula semipermeable que contiene celulas vivas modi- ficadas geneticamente para que segreguen una molecula inmunoestimuladora gM-CSF.
- 2. El producto terapeutico de la reivindicacion 1, en el que la macrocapsula es extrafole.
- 3. El producto terapeutico de la reivindicacion 1 o 2, en el que las celulas de la macrocapsula son irradiadas antes de la implantacion.
- 4. El producto terapeutico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas encapsuladas segregan otra molecula inmunoestimuladora.
- 5. El producto terapeutico de la reivindicacion 4, en el que la otra molecula inmunoestimuladora se elige de IL-12, IL- 15, lL-4, interferon gamma, quimiocinas o factores de crecimiento de celulas dendnticas, IL-3, IL-9, IL-1 , IL-2, IL-7, receptores transmembrana de IFNy, SCR (Factor de Celula Troncal) soluble o membranoso, FL (Ligando de FIt3) o G-CSF, o combinaciones de los mismos.
- 6. El producto terapeutico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el antfgeno es de un virus, una bacteria o un patogeno parasitario.
- 7. El producto terapeutico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el antfgeno es un patogeno inactivado, un lisado de agente infeccioso, extracto de protema, portema recombinante, peptido o ADN.
- 8. Un producto terapeutico caracterizado por dos componentes:(a) un primer componente que comprende un antfgeno, que comprende uno o mas componentes de agentes in- fecciosos; y(b) un segundo componente que comprende una macrocapsula semipermeable que contiene celulas vivas gene- ticamente modificadas para segregar la molecula inmunoestimuladora GM-CSF,para uso en inmunizacion contra una enfermedad infecciosa.
- 9. El producto terapeutico para el uso de la reivindicacion 8, que comprende ademas las caractensticas de las reivindicaciones 2 a 7.
- 10. El producto terapeutico para el uso de la reivindicacion 8 o 9, en el que los dos componentes se administran secuencialmente bajo la piel en estrecha proximidad o contacto, implantandose primero la capsula, seguido del es- tfmulo antigenico.
- 11. El producto terapeutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el segundo componente se implanta durante menos de 12 dfas.
- 12. El producto terapeutico para el uso de la reivindicacion 11, en el que el segundo componente se implanta durante entre 4 y 10 dfas.
- 13. El producto terapeutico para el uso de la reivindicacion 12, en el que el segundo componente se implanta durante 5 a 7 dfas.
- 14. El producto terapeutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que la inmunizacion comprende inmunizaciones repetidas a intervalos de dos a tres semanas en sitios diferentes, siempre subcutaneas.
- 15. El producto terapeutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para uso en vacunacion preventiva.
- 16. El producto terapeutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para uso en vacunacion terapeutica.
- 17. El producto terapeutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para uso en el tratamiento de infecciones vmcas.
- 18. El producto terepeutico para el uso de la reivindicacion 17, en el que la infeccion vmca se selecciona de VIH, CMV, infecciones herpes recurrentes, Hepatitis B o virus Epstein-Bar y Hepatitis C.
- 19. El producto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para uso en el tratamiento de infeccio- nes bacterianas.
- 20. El producto terapeutico para el uso de la reivindicacion 19, en el que la infeccion bacteriana se selecciona de infeccion micobacteriana y Helicobacter pylori.5 21. El producto terapeutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, para uso en el tratamientode infecciones parasitarias.
- 22. El producto terapeutico para el uso de la reivindicacion 21, en el que la infeccion parasitaria se selecciona de malaria, toxoplasma y Pneumocystis.10
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