ES2560868T3 - Alérgeno de calicreína de próstata novedoso - Google Patents

Abstract

Uso de calicreína canina, o una variante o fragmento de la misma que comparte epítopos por anticuerpos con la calicreína de tipo silvestre, para el diagnóstico in vitro de alergia de tipo I.

Description

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La reactividad de inmunotransferencia con muestras que contienen calicreína reducidas era considerablemente menor que con muestras no reducidas. Solo la preparación de calicreína urinaria purificada, que tenía una mayor concentración de calicreína que las otras preparaciones analizadas, dio lugar a una unión de IgE detectable a la banda de 18 kDa formada tras la reducción.

La observación de que la reactividad inmunitaria con calicreína urinaria purificada en análisis de inmunotransferencia estaba dirigida hacia la banda de proteína principal de 28 kDa servía para apoyar la validez de la prueba de ImmunoCAP de calicreína experimental, porque su unión a IgE no estaba causada por un contaminante de la preparación de proteína usada. Los resultados muestran adicionalmente que al menos algunos epítopos de unión a IgE en calicreína son sensibles a la reducción de la molécula, como se indica por la menor unión de anticuerpo a las subunidades de 10 y 18 kDa, en comparación con la molécula de 28 kDa no reducida.

EJEMPLO 8: Valoración de las propiedades de unión a IgE de una calicreína modificada o una variante o fragmento de calicreína (analito)

Se inmoviliza el analito en un soporte sólido tal como ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Suecia). Se incuban muestras séricas de al menos 3 pacientes humanos representativos sensibilizados ante la especie relevante y que muestran reactividad de IgE con calicreína de esa especie durante 3 h a temperatura ambiente con calicreína a una concentración final de 100 μg/ml y, en paralelo como controles negativos, con tampón solo y la proteína de unión a maltosa (MBP) de E. coli no alergénica. Se analiza entonces en las muestras la unión de IgE a pruebas de ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Suecia) portadoras de analito inmovilizado para estudiar si la preincubación con calicreína inhibe específicamente o reduce significativamente la unión de IgE.

EJEMPLO 9: Purificación de calicreína de orina canina por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC)

Se filtró una muestra combinada de orina canina a través de un filtro de 5 μm y un filtro de 0,45 μm bajo presión de nitrógeno. Se efectuaron todas las operaciones cromatográficas con un sistema ÅKTA Explorer 100 Air (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Suecia). Se intercambió el tampón de 4 alícuotas de 120 ml de orina canina filtrada usando una columna Sephadex G-25 (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Suecia) (volumen de columna 461 ml), con limpieza de la columna después de cada tanda. Tampón usado: fosfato de sodio 50 mM, (NH4)2SO4 1 M, 0,02 % de NaN3, pH= 7. Se filtró entonces la muestra (aproximadamente 505 ml) a través de un filtro de 0,45 μm y se aplicó a la columna de HIC (HiPrep Phenyl FF (high sub), 20 ml, GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Suecia). Los tampones usados para la separación por HIC fueron: A) fosfato de sodio 50 mM, (NH4)2SO4 1 M, 0,02 % de NaN3, pH= 7, y B) fosfato de sodio 50 mM, 0,02 % de NaN3, pH= 7. Se recogió la fracción de circulación (que contiene calicreína) en fracciones de 10 ml (Frac 950) a un caudal de 5 ml/min y se combinaron entonces las fracciones de circulación. Se eluyó el material adsorbido en un gradiente por etapas usando 100 % de tampón B.

Se analizaron las fracciones usando un ensayo de BCA (ácido bicinconínico), así como PAGE-SDS (muestras no reducidas, tinción con plata). La PAGE-SDS en condiciones no reductoras reveló que la calicreína se encontraba en las fracciones de circulación, que por tanto se combinaron para procesamiento adicional.

Se intercambió el tampón de 2 alícuotas de aproximadamente 125 ml y 1 alícuota de aproximadamente 87 ml de las fracciones de circulación de HIC combinadas con una columna Sephadex G-25 SF (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Suecia) por un tampón de composición fosfato de sodio 20 mM, 0,02 % de NaN3, pH= 8. Se concentró entonces el conjunto de calicreína (456 ml) en una celda Amicon (350 ml, filtro Millipore, PBCC, corte de 5000 kDa, diámetro 76 mm) hasta un volumen de aproximadamente 43 ml. Usando el ensayo de BCA, se determinó que la concentración de proteína en el conjunto final era de 0,9 mg/ml (en 43 ml= en total a 38,7 mg). La muestra aplicada a la columna de HIC contenía 101 mg de proteína, lo que procuraba una recuperación del 38 % de la calicreína después de la purificación por HIC.

Se valoró la pureza de la preparación de calicreína mediante filtración en gel analítica en una columna Superdex 75 HR 10/30 en un sistema XT10 purificador de ÅKTA. Para este experimento, el volumen de muestra era de 100 μl y el tampón era fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, 0,02 % de NaN3, pH= 7,4.

EJEMPLO 10: Identificación y caracterización de calicreína de orina canina mediante el uso de electroforesis y espectrometría de masas

Usando electroforesis, se compararon las siguientes muestras en el mismo gel, aplicando tinción con azul brillante de Coomasie coloidal (CBB):

1.

Un patrón marcador de peso molecular

2.

Orina canina

3.

Material eluido por HIC (reducido)

4.

Fracción de circulación de HIC (reducida)

5.

Fracción de circulación de HIC (no reducida) 9

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Claims (1)

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