ES2561060T3

ES2561060T3 - Transferencia génica en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias mediante el uso de vectores de lentivíricos pseudotipados con una proteína espina de virus de ARN

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Publication number: ES2561060T3
Application number: ES06822478.1T
Authority: ES
Inventors: Katsuyuki Mitomo; Makoto Inoue; Hitoshi Iwasaki; Mamoru Hasegawa; Eric W Alton; Uta Griesenbach
Original assignee: ID Pharma Co Ltd
Current assignee: ID Pharma Co Ltd
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: EP1950307B1; SI1950307T1; CA2627485C; JP2013055941A; DK1950307T3; WO2007049752A1; US20160281109A1; CN101351557A; US20190225986A1; US10017784B2; ES2726176T3; CY1117307T1; US20150174198A1; EP1950307A1; JP2015126753A; JP5776662B2; PT1950307E; EP1950307A4; KR20080068098A; HUE028512T2

Abstract

Un vector del SIV recombinante para su uso en el tratamiento de la fibrosis quística mediante la introducción de un gen en un citoblasto epitelial de las vías respiratorias que no se ha sometido a pretratamiento o tratamiento de pre-acondicionamiento, en el que el vector (i) se somete a pseudotipado con proteínas espina de las glicoproteínas F y HN de la envuelta del virus Sendai, y (ii) comprende un gen exógeno en estado expresable, y además en el que dicho vector permite la integración de dicho gen exógeno en dicho citoblasto a fin de proporcionar una expresión de genes exógenos a largo plazo durante al menos 360 días.

Description

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Género Influenzavirus A. PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1+M2, NS1+NS2

Género Influenzavirus B. PB2, PB1, PA, HA, NP, NA+NB, M1+M2, NS1+NS2

5 Género Influenzavirus C. PB2, PB1, P3 (PA), SE (HA), NP, M, NS1+NS2

Género Thogotovirus. PB2, PB1, PA, GP-75 (THOV), GP-64 (DHOV), NP, M

[0045] Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de genes de la envuelta del virus de la gripe A que 10 pertenece al género Influenzavirus A de Orthomyxoviridae tienen números de acceso en la base de datos de la siguiente manera: NC_002017 para el gen HA y NC_002018 para el gen de NA.

[0046] Las secuencias de nucleótidos de genes de la envuelta del virus de la gripe B que pertenece al género Influenzavirus B tienen números de acceso de la siguiente manera: NC_002207 para el gen HA y NC_002209 para 15 el gen de NA.

[0047] La secuencia de nucleótidos de un gen de la envuelta del virus de la gripe C que pertenece al género Influenzavirus C tiene el número de acceso NC_006310 para el gen HE (precursor de hemaglutinina-esterasa) en la base de datos.

20 [0048] La secuencia de nucleótidos de un gen de la envuelta del virus de Dhori que pertenece al género Thogotovirus tiene el número de acceso NC_006506 para el gen GP-64 en la base de datos.

[0049] Además, la presente divulgación se refiere a vectores lentivíricos pseudotipados en los que los 25 ortomixovirus son virus de la gripe.

[0050] La presente divulgación también se refiere a vectores lentivíricos pseudotipados en los que los virus de ARN de la hebra no codificante son filovirus.

30 [0051] Filoviridae incluye los virus del género de tipo Marburg, y los virus del género de tipo Ébola. Los virus del género de tipo Marburg incluyen el virus de Marburg, y los virus del género de tipo Ébola incluyen la cepa Zaire, la cepa Reston, y la cepa Sudán del virus de la fiebre hemorrágica del Ébola. Cualquiera de las cepas mencionadas anteriormente se puede utilizar como virus de la fiebre hemorrágica del Ébola en la presente divulgación. Preferentemente se utiliza la cepa Zaire del virus de la fiebre hemorrágica del Ébola.

35 [0052] Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de genes que codifican proteínas víricas del virus de la fiebre hemorrágica del Ébola en la base de datos tienen los números de acceso NC_002549, L11365, AF086833, AF272001, U28077, U31033, y AY142960.

40 [0053] Además, la presente divulgación se refiere a vectores lentivíricos pseudotipados en los que el filovirus es el virus de la fiebre hemorrágica del Ébola.

[0054] La presente divulgación también se refiere a vectores lentivíricos pseudotipados en los que los virus de ARN de la hebra codificante son coronavirus.

45 [0055] Coronaviridae incluye el género Coronavirus y el género Torovirus. Ejemplos del género Coronavirus incluyen el virus del SARS, el virus de la bronquitis infecciosa, coronavirus humano, y el virus de la hepatitis murina, y ejemplos del género Torovirus incluyen torovirus equino y torovirus humano.

50 [0056] Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican las proteínas víricas del virus del SARS en la base de datos tienen los números de acceso NP_828851 para una proteína espina y NC_004718.

[0057] Además, la presente divulgación se refiere a vectores lentivíricos pseudotipados en los que el coronavirus es el virus del SARS.

55 [0058] La presente divulgación también se refiere a vectores lentivíricos pseudotipados en los que los virus de ADN son baculovirus. Dado que las proteínas espina de baculovirus tienen similitudes estructurales con las proteínas espina del virus D de la gripe tales como Thogoto, se ha sugerido que los baculovirus pueden infectar el epitelio de las vías respiratorias (Sinn, PL, Burnight, ER, Hickey, MA, Blissard, GW, y McCray, PB, Jr. Persistent

gene expression in mouse nasal epithelia following feline immunodeficiency virus-based vector gene transfer. J. Virol. (2005) 79: 12818-12827). Los baculovirus incluyen, por ejemplo, Autographa californica.

[0059] Por ejemplo, cuando los virus de ARN de la hebra no codificante son paramixovirus, los vectores

5 lentivíricos pseudotipados con proteínas espina del virus de ARN o virus de ADN comprenden preferentemente la proteína HN y la proteína F. Cuando los virus de ARN de la hebra no codificante son ortomixovirus, los vectores comprenden preferentemente no solo la proteína HA, sino también la proteína NA, la proteína GP88, o HE. Cuando los virus de ARN son coronavirus, los vectores comprenden preferentemente la proteína S. Cuando los virus de ARN son filovirus, los vectores comprenden preferentemente proteínas de la envuelta.

10 [0060] En la presente invención, se demostró que los vectores del virus de la inmunodeficiencia de simios pseudotipados que contienen las proteínas HN y F del virus Sendai muestran una alta eficiencia de transferencia génica en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias. Específicamente, los vectores lentivíricos de la presente invención incluyen vectores del virus de la inmunodeficiencia de simios pseudotipados que contienen las proteínas F

15 y HN. Además, los vectores del virus de la inmunodeficiencia de simios pseudotipados de la presente invención adicionalmente pueden contener la proteína M de paramixovirus.

[0061] El virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) fue descubierto como un tipo de virus del VIH derivado de mono. Junto con el VIH, el SIV forma el grupo de lentivirus de primates (E. Ido y M. Hayamizu, "Gene, Infection

20 and Pathogenicity of Simian Immunodeficiency Virus", Protein, Nucleic acid and Enzyme, Vol. 39, No. 8, p. 1425, 1994). Este grupo se divide en cuatro subgrupos:

(1) el subgrupo VIH-1: que incluye el VIH-1, el virus que causa el síndrome de la inmunodeficiencia humana

adquirida (sida), y el SIVcpz aislado de chimpancés; 25

(2) el subgrupo VIH-2: que incluye el SIVsmm aislado de mangabey gris (Cercocebus atys), el SIVmac aislado de monos rhesus (Macaca mulatta), y el VIH-2, que es menos patogénico en seres humanos (Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32, 1997);

30 (3) el subgrupo SIVagm: representado por SIVagm aislado de monos verdes africanos (Cercopithecus aethiops); y

(4) el subgrupo SIVmnd: representado por SIVmnd aislado de mandriles (Papio sphinx).

[0062] El SIV en la presente invención incluye todas las cepas y subtipos del SIV. Ejemplos de cepas del SIV 35 aislados incluyen SIVagm, SIVcpz, SIVmac, SIVmnd, SIVsm, SIVsnm y SIVsyk.

[0063] No hay información acerca de la patogenicidad del SIVagm y SIVmnd en hospedadores naturales (Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol., 18 (3-4), 255-9, 1989; M. Hayamizu, Nippon Rinsho, 47, 1, 1989). En particular, los informes de experimentos de infección sugieren que la

40 cepa TYO-1 del virus SIVagm no es patógena para macacos (Macaca facicularis) y monos rhesus (Macaca mulatta), además de sus hospedadores naturales (Ali, M. et al, Gene Therapy, 1 (6), 367-84, 1994; Honjo, S et al., J. Med. Primatol., 19 (1), 9-20, 1990). No hay información acerca de la infección, patogenicidad o actividad patógena del SIVagm en seres humanos. En general, los lentivirus de primates tienen una especificidad de especie estricta, y hay pocos informes de infecciones entre especies o patogénesis de hospedadores naturales. Cuando se produce la

45 infección entre especies, la frecuencia de aparición de la enfermedad suele ser baja, y el progreso de la enfermedad es lento (Novembre, F.J. et al., J. Virol., 71 (5), 4086-91, 1997). En consecuencia, preferentemente en la presente invención se usa el SIV derivado de la cepa agm. Además, se cree que los vectores víricos basados en la cepa TYO-1 del SIVagm son más seguros que los vectores basados en el VIH-1 u otros lentivirus, y por lo tanto se prefieren para su uso en la presente invención.

50 [0064] Los vectores del virus de la inmunodeficiencia de simios pseudotipados de la presente invención además pueden contener proteínas de la envuelta derivadas de otros virus. Por ejemplo, como dichas proteínas se prefieren las proteínas de la envuelta derivadas de virus que infectan las células humanas. Dichas proteínas incluyen, pero no se limitan en particular a, proteínas de la envuelta anfotrópicas retrovíricas. Por ejemplo, las

55 proteínas de la envuelta derivadas de la cepa 4070A del virus de la leucemia murina (MuLV) se pueden utilizar como proteínas de la envuelta anfotrópicas retrovíricas. Como alternativa, también se pueden utilizar proteínas de la envuelta derivadas de MuLV 10A1 (por ejemplo, pCL-10A1 (Imgenex) (Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)). Otros ejemplos incluyen la glicoproteína de la envuelta (GP) de la cepa Zaire del virus de la fiebre hemorrágica del Ébola y la proteína espina de la envuelta (proteína S) del virus del síndrome respiratorio agudo

severo (SARS) identificado como un nuevo tipo de coronavirus. Ejemplos de proteínas de la Herpesviridae incluyen las proteínas GB, GD GH y gp85 del virus del herpes simple, y las proteínas gp350 y gp220 del virus EB. Las proteínas de la Hepadnaviridae incluyen la proteína S del virus de la hepatitis B.

5 [0065] Los vectores del virus de la inmunodeficiencia de simios de la presente invención pueden contener una porción de una secuencia de ARN genómico derivado de otro retrovirus. En los vectores del virus de la inmunodeficiencia de simios de la presente invención también se incluyen vectores que comprenden una secuencia quimérica, que resulta de la sustitución de una porción del genoma del virus de la inmunodeficiencia de simios con, por ejemplo, una porción de la secuencia genómica de otros lentivirus tales como el virus de la inmunodeficiencia

10 humana (VIH), virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) (Poeschla, E. M. et al., Nature Medicine, 4 (3), 354-7, 1998)

o la artritis-encefalitis caprina virus (CAEV) (Mselli-Lakhal, L. et al., Arch. Virol., 143 (4), 681-95, 1998).

[0066] En retrovirus, también se puede modificar la LTR (repetición terminal larga). La LTR es una secuencia específica del retrovirus, que está presente en ambos extremos del genoma vírico. La LTR 5' sirve como promotor, 15 mejorando la transcripción provírica del ARNm. Por lo tanto, es posible mejorar la transcripción del ARNm del vector de transferencia de genes, mejorar la eficiencia de la encapsidación, y aumentar la titulación del vector si la parte que presenta la actividad promotora LTR 5' en el vector de transferencia génica está sustituida con otro promotor más fuerte que tenga actividad promotora. Además, por ejemplo, en el caso de lentivirus, la proteína vírica tat es conocida por mejorar la actividad de transcripción de LTR 5', y por lo tanto, la sustitución de LTR 5' con un promotor 20 independiente de la proteína tat permitirá la exclusión de tat de los vectores de encapsidación. Después de que se haya producido la transcripción inversa de los ARN de virus que han infectado o invadido las células, las LTR en ambos extremos se unen para formar una estructura circular cerrada, la integrasa vírica se acopla en el sitio de unión, y a continuación esta estructura se integra en los cromosomas celulares. Los ARNm províricos transcritos constan de la región que va desde el sitio de iniciación de la transcripción LTR 5' a la secuencia LTR 3' poliA situada

25 aguas abajo. La porción promotora LTR 5' no está encapsidada en el virus. Así, incluso si el promotor se sustituye con otra secuencia, la porción integrada en los cromosomas celulares diana permanece inalterada. Basándose en el hecho descrito anteriormente, se cree que la sustitución del promotor de LTR 5' proporciona un vector más seguro con una titulación más elevada. Así, la sustitución del promotor en el extremo 5’ de un vector de transferencia génica puede incrementar la titulación del vector encapsidable.

30 [0067] Se puede mejorar la seguridad en vectores del virus de la inmunodeficiencia de simios recombinante al impedir la transcripción del ARNm del vector de longitud completa. Esto se consigue usando un vector autoinactivante (vector SIN) preparado eliminando parcialmente la secuencia LTR 3’. El provirus del lentivirus que ha invadido los cromosomas de la célula diana tiene un extremo 5’ unido a la porción U3 de su LTR 3’. Así, la porción

35 U3 está localizada en el extremo 5’ en el vector de transferencia génica, y a partir de ese punto se transcribe el ARN completo del vector de transferencia génica. Si hay lentivirus o proteínas similares en las células diana, es posible que el vector de transferencia génica se vuelva a re-encapsidar e infectar otras células. También existe la posibilidad de que el promotor LTR 3’ puede expresar genes hospedadores localizados en el lado 3’ del genoma vírico (Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 475-585,

40 1997). Estos acontecimientos ya se consideran problemas de los vectores retrovíricos, y el vector SIN se desarrolló como forma de superar estos problemas (Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (10), 3194-8, 1986). Cuando la porción U3 de la LTR 3’ se elimina de un vector de transferencia génica, las células diana carecen de promotores de LTR 5’ y LTR 3’, impidiendo así la transcripción del ARN vírico de longitud completa y los genes del hospedador. Por otra parte, puesto que solo se transcriben los genes de interés a partir de promotores endógenos, cabe esperar

45 vectores muy seguros capaces de una alta expresión. Dichos vectores se prefieren en la presente invención. Los vectores SIN se pueden construir de acuerdo con métodos conocidos.

[0068] Un problema encontrado en terapia génica usando vectores víricos que tienen la secuencia LTR en su genoma, incluidos vectores retrovíricos, es una reducción gradual en la expresión de un gen introducido. Uno de los 50 factores puede ser que cuando dicho vector se integra en el genoma del hospedador, un mecanismo del hospedador metila la LTR para suprimir la expresión del gen introducido (Challita, P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2567, 1994). Una ventaja de los vectores sin es que la metilación de LTR apenas reduce el nivel de expresión génico. Esto se debe a que el vector pierde la mayoría de la secuencia LTR tras su integración en el genoma del hospedador. Se comprobó que un vector SIN preparado al sustituir otra secuencia promotora por la

55 región U3 de la LTR 3’ de un vector de transferencia génica mantiene una expresión estable durante más de dos meses después de la introducción en células de primate ES (documento WO 02/101057). Así, un vector SIN diseñado para auto-inactivarse por la modificación de la región U3 de la LTR es adecuado en particular en la presente invención.

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puede introducir en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias mediante la puesta en contacto de este vector con células epiteliales de las vías respiratorias de primates, incluidos humanos. La presente invención se refiere a métodos para la introducción de genes en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias, que comprenden la etapa de puesta en contacto de las células epiteliales de las vías respiratorias con los vectores de la presente invención. 5 La presente divulgación también se refiere a usos de vectores lentivíricos pseudotipados con proteínas espina de virus de ARN o ADN para la introducción de genes en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias, con la invención que se refiere al uso de vectores lentivíricos particulares pseudotipados con proteínas espina de virus de ARN como se describe en el presente documento. Los citoblastos epiteliales de las vías respiratorias seleccionadas para la introducción de genes no está limitado en particular, y por ejemplo, como citoblastos epiteliales de las vías

10 respiratorias también se pueden usar citoblastos derivados de médula ósea incluidos citoblastos mesenquimales que se pueden diferenciar en el epitelio deseado de las vías respiratorias de simio o ser humano.

[0085] Los citoblastos epiteliales de las vías respiratorias derivados de mono que se seleccionan para la transferencia de genes mediante los vectores lentivíricos pseudotipados de la presente invención no están limitadas

15 en particular, y sus ejemplos incluyen citoblastos epiteliales de las vías respiratorias de tití, citoblastos epiteliales de las vías respiratorias de mono rhesus, y citoblastos epiteliales de las vías respiratorias de macaco.

[0086] El procedimiento para la transferencia de genes en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias usando un vector lentivírico pseudotipado de la presente invención se realiza mediante un método que comprende la

20 etapa de puesta en contacto de las células epiteliales de las vías respiratorias con el vector. Por ejemplo, como se describe a continuación en los ejemplos, el vector se puede poner en contacto con las células mediante su administración en la cavidad nasal usando un catéter.

[0087] Los vectores lentivíricos pseudotipados de la presente invención tienen la ventaja de producir una

25 eficiencia de transferencia génica extremadamente elevada incluso sin pretratamiento, tal como lavado de la superficie celular antes de la puesta en contacto del vector.

[0088] La presente divulgación también se refiere a citoblastos epiteliales de las vías respiratorias introducidos con vectores lentivíricos de la presente invención pseudotipados con proteínas espina de virus de ARN

30 o ADN, y células producidas mediante proliferación y/o diferenciación de estas células.

[0089] Los citoblastos epiteliales de las vías respiratorias en las cuales se han introducido genes mediante el pseudotipado de vectores lentivíricos de la presente invención, y las células, tejidos, órganos y similares diferenciados de estos citoblastos de las vías respiratorias son útiles para evaluar y seleccionar los diversos tipos de

35 agentes terapéuticos. Mediante la transferencia génica en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias, por ejemplo, se pueden evaluar o se pueden seleccionar por sus efectos agentes terapéuticos o genes para realizar la diferenciación específica de tejidos o células, y en particular preferentemente tejidos o células derivadas de primates.

40 [0090] La presente divulgación también engloba citoblastos epiteliales de las vías respiratorias en los que se han introducido vectores lentivíricos pseudotipados de la presente invención, y células y tejidos diferenciados que se han diferenciado de los citoblastos epiteliales epiteliales de las vías respiratorias. Las células y tejidos diferenciados se pueden identificar en base a su marcador de expresión y características morfológicas específicas de los tejidos o células.

45 [0091] Por otra parte, al usar los vectores lentivíricos pseudotipados de la presente invención, los genes se pueden introducir y expresar eficazmente en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias durante un periodo prolongado. Específicamente, la presente invención se refiere a agentes para la transferencia de genes en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias, que comprenden como principio activo un vector lentivírico

50 pseudotipado de la presente invención. Por ejemplo, cuando se usan los agentes de transferencia génica anteriormente mencionados para citoblastos epiteliales de las vías respiratorias, como tejido de producción se pueden usar tejidos u órganos tales como los pulmones para proporcionar las proteínas necesarias para el tratamiento de la enfermedad.

55 [0092] Por otra parte, puesto que los vectores lentivíricos pseudotipados de la presente invención pueden introducir genes en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias durante periodos de tiempo prolongados como se ha descrito anteriormente, se pueden aplicar a terapia génica de enfermedades respiratorias genéticas de primates incluidos seres humanos. Específicamente, la presente divulgación se refiere a agentes terapéuticos para enfermedades respiratorias genéticas que comprenden un vector vírico pseudotipado de la presente invención como

principio activo.

[0093] La presente divulgación también se refiere a métodos para prevenir o tratar enfermedades respiratorias genéticas, que comprenden la etapa de administración de un vector lentivírico pseudotipado de la 5 presente invención a individuos (por ejemplo, pacientes), con la presente invención que se refiere a la fibrosis quística. Los "individuos" en los métodos preventivos o terapéuticos de la presente invención preferentemente son, por ejemplo, primates incluidos seres humanos, pero pueden ser animales no humanos. En la presente invención, la "administración a individuos" se puede realizar, por ejemplo, mediante la puesta en contacto de un vector lentivírico pseudotipado de la presente invención con células epiteliales de las vías respiratorias. Como se describe a

10 continuación en los ejemplos, el contacto se puede conseguir mediante la administración del vector a la cavidad nasal usando un catéter.

[0094] Por otra parte, la presente divulgación se refiere a usos de vectores lentivíricos pseudotipados de la presente invención para la producción de agentes terapéuticos para enfermedades respiratorias genéticas. La 15 enfermedad respiratoria genética seleccionada de la presente invención es la fibrosis quística.

[0095] Para el tratamiento de la enfermedad también se pueden utilizar células, tejidos, y órganos diferenciados de los citoblastos epiteliales de las vías respiratorias en los que se han introducido genes. Por ejemplo, para enfermedades que se desarrollan debido a deficiencia o falta de un gen, se puede realizar el 20 tratamiento que complementa la deficiencia del gen o la falta de enzimas sistémicas en circulación, factores de crecimiento, y similares, introduciendo el gen en un cromosoma de citoblastos de las vías respiratorias y trasplantando estas células en el cuerpo. Dichas enfermedades no están limitadas en particular. Por otra parte, en terapia génica relacionada con el trasplante de órganos, un antígeno histocompatible de un donador animal no humano se puede convertir en tipo humano. Por consiguiente, se pueden llevar a cabo aplicaciones que

25 incrementen la tasa de éxito del xenotrasplante.

[0096] Cuando los citoblastos epiteliales de las vías respiratorias en las que se ha introducido un gen usando un vector lentivírico pseudotipado de esta invención proceden de mono, los citoblastos epiteliales de las vías respiratorias se pueden trasplantar en monos modelo de enfermedad para proporcionar un sistema útil como modelo 30 de tratamiento de la enfermedad humana. Se conocen muchos monos modelo de enfermedad para diversas enfermedades humanas. Por ejemplo, los monos modelo para la enfermedad de Parkinson humana se pueden producir de forma artificial; muchos monos diabéticos de forma natural se crían como modelos precisos de la diabetes humana; y la infección por SIV en monos se sabe que sirve como modelo preciso de la infección del VIH en humanos. Para estas enfermedades, es sumamente útil un sistema en el que se trasplantan citoblastos epiteliales

35 de las vías respiratorias de simios en monos modelo de enfermedad como ensayo preclínico, antes de la aplicación clínica de los citoblastos epiteliales de las vías respiratorias humanas.

Ejemplos

40 [0097] A continuación se describe específicamente la presente invención con referencia a los ejemplos, pero no se debe interpretar como limitada a los mismos.

Ejemplo 1

45 Construcción de plásmidos de expresión de proteínas de la cápsida del virus Sendai

(1) Construcción del plásmido de expresión de HN sustituido con el dominio citoplasmático

[0098] Se construyó un plásmido de expresión de HN, en el que se sustituyó el dominio citoplasmático de la

50 proteína HN con el dominio citoplasmático de la proteína de la envuelta del SIV (Fig. 1). Después de hibridar tres grupos de oligonucleótidos sintéticos (Xho+Xma/Xma-XhoI, Xma+131/135-Xma, 132+Bam/Bam-136), se incorporaron a su vez al sitio XhoI-BamHI de pBluescript KS+. Se incorporaron un fragmento sintético purificado ligado al oligonucleótido obtenido por digestión del plásmido recombinante anteriormente mencionado con XhoI y DraIII y un fragmento purificado que comprende el lado 3' de la proteína HN obtenido mediante digestión del

55 plásmido de expresión de la proteína HN, pCAGGS-HN, con DraIII y Bsu36I en el sitio XhoI-Bsu36I de pCAGGS (Gene, vol. 108, pp.193-200, 1991). El plásmido obtenido por el método anteriormente mencionado se utilizó como plásmido de expresión de HN sustituido con el dominio citoplasmático del SIV, pCAGGS-SIVct/HN.

(2) Construcción del plásmido de expresión de HN añadido al dominio citoplasmático del SIV

[0099] Se construyó un plásmido de expresión de HN, en el que el dominio citoplasmático de proteína de la envuelta del SIV se añadió a la proteína HN (Fig. 2). Se amplificó una región que contiene el dominio citoplasmático de la proteína de la envuelta del SIV y una porción de la proteína HN por PCR usando los cebadores FSIVhn y 5 RhnSIV, y usando como molde el plásmido de expresión de la proteína HN sustituido con el dominio citoplasmático mencionado anteriormente. Después de digerir el fragmento amplificado con XhoI y AccI, el fragmento se incorporó al sitio XhoI-AccI del pBluescript KS+ (Stratagene) preparado en (1) anterior, en el que se habían insertado los tres grupos de oligonucleótidos sintéticos, para reemplazar con el fragmento que contiene el dominio citoplasmático de la envuelta del SIV. Se incorporaron un fragmento sintético purificado ligado al oligonucleótido obtenido por digestión

10 del plásmido recombinante anteriormente mencionado con XhoI y DraIII y un fragmento que comprende el lado 3' de la proteína HN obtenido mediante digestión del plásmido de expresión de la proteína HN, pCAGGS-HN, con DraIII y Bsu36I al sitio XhoI-Bsu36I de pCAGGS (Gene, vol. 108, pp.193-200, 1.991). El plásmido obtenido por el método anteriormente mencionado se utilizó como plásmido de expresión de HN añadido al dominio citoplasmático del SIV, pCAGGS-SIVct+HN.

15

(3) Construcción del plásmido de expresión de la proteína F con supresión del dominio citoplasmático

[0100] Se construyeron plásmidos de expresión de la proteína F, cada uno de los cuales contenía los primeros 27, 14, o 4 restos desde el extremo 5' de los aminoácidos del dominio citoplasmático de la proteína F y por 20 lo tanto carecían de 15, 28, o 38 restos de aminoácidos, respectivamente (Fig. 3). Cada uno de los fragmentos que carecen de los 15, 28, y 38 aminoácidos, respectivamente, se amplificó por PCR utilizando pares de cebadores, XhFF y NotF1650, NotF1611 y NotF1581, y usando como molde el plásmido pBluescript KS+/SmaI/F, en el que la región completa para la proteína F se había insertado en el sitio SmaI de pBluescript KS+ (Stratagene). Los fragmentos amplificados se digirieron con XhoI y NotI, y a continuación cada uno se insertó en el sitio XhoI-NotI del

25 plásmido que se había construido a partir de pCAGGS (Gene, vol.108, pp.193-200, 1991) mediante la inserción de un enlazador XhoI/NotI en el sitio EcoRI para construir plásmidos (supresión de 15 aminoácidos: pCAGGS-Fct27; deleción de 28 aminoácidos: pCAGGS-Fct14; deleción de 38 aminoácidos: pCAGGS-Fct4). Se usó pCAGGS-Fct4 como vector del SIV para el pseudotipado.

30 (4) Construcción del plásmido de expresión de la proteína F con supresión del dominio citoplasmático al que se añadió el dominio citoplasmático del SIV

[0101] Se construyeron plásmidos (Fig. 4) mediante la adición de los primeros 11 aminoácidos del extremo 5' del dominio citoplasmático del SIV (SIVct11) a plásmidos de expresión de la proteína F con supresión del dominio 35 citoplasmático (los números de los aminoácidos en el dominio citoplasmático de la proteína F son los mismos que los de los plásmidos preparados en (3) anterior). Los fragmentos correspondientes a los tres tipos descritos anteriormente que carecen de los aminoácidos, pero que contienen el dominio citoplasmático del SIV añadido se amplificados por PCR utilizando los pares de cebadores XhFF y SA-F1650, y SA-F1611 y SA-F1581, y utilizando como molde el plásmido pBluescript KS+/SmaI/F, en el que se había insertado la región completa de la proteína F 40 en el sitio SmaI de pBluescript KS+ (Stratagene). Se digirieron los fragmentos amplificados con XhoI y NotI, y a continuación cada uno de ellos se insertó en el sitio XhoI-NotI del plásmido que se había construido a partir de pCAGGS (Gene, vol.108, pp.193-200, 1991) mediante la inserción de un enlazador XhoI/NotI en el sitio EcoRI para construir plásmidos (adición del SIVct11 + deleción de 15 aminoácidos: pCAGGS-Fct27/SIVct11; adición del SIVct11

+ deleción de 28 aminoácidos: pCAGGS-Fct14/SIVct11; y adición del SIVct11 + deleción de 38 aminoácidos: 45 pCAGGS-Fct4/SIVct11).

[0102] Las secuencias de nucleótidos de los cebadores utilizados en los ejemplos se enumeran a continuación.

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[0103] Como resultado, aunque fue imposible el pseudotipado del SIV con proteínas de origen natural de la envuelta, la fusión del dominio citoplasmático (F) y la modificación mediante hemaglutinina-neuraminidasa (HN)

5 permitió un pseudotipado eficiente. Se produjo un vector del SIV pseudotipado con SeVF/HN que contiene el gen de la GFP mediante transfección transitoria en células 293T, y esto se concentró por centrifugación usando técnicas utilizadas en general para vectores de pseudotipado de VSG-G.

Ejemplo 2

10 Transferencia génica en células epiteliales de la cavidad nasal de ratón usando el vector del SIV pseudotipado con F/HN

[0104] Se administró un vector del SIV pseudotipado con F/HN que lleva eGFP usando un catéter delgado en

15 la cavidad nasal de un ratón, fosa nasal izquierda, sin preacondicionamiento, (n = 3, 4 x 108 TU por animal; 100 µl). La duración de la expresión de los transgenes se produjo del día 3 al día 360, y se realizó un análisis anatómico de las secciones de la cavidad nasal de ratón según el método de Mery et al. (Mery et al. Toxicol. Pathol. Vol. 22, p. 353 -372, 1994). La expresión de la GFP se evaluó en secciones de la cavidad nasal ubicadas de 1 a 4 mm (secciones correspondiente a distancias de 1, 2, 3, y 4 mm) desde la punta del hueso nasal del ratón.

20 [0105] Como resultado, sin preacondicionamiento en las células epiteliales de las vías respiratorias, se observó una transfección eficiente y una expresión continua de la GFP durante al menos 160 días. Se comprobó que la expresión de eGFP se mantenía incluso el día 220 y el día 360. Puesto que el tiempo de supervivencia de las células epiteliales de la cavidad nasal del ratón es de 90 días o inferior (Borthwick et al. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.

25 Vol. 24, pp. 662-670, 2001), estos resultados sugieren como evidencia indirecta que el gen ha sido introducido en citoblastos del tejido de las vías respiratorias de la cavidad nasal (Figs. 5 a 7).

[0106] Además, como se muestra en Fig. 8, los citoblastos permanecen en sus nichos cuando los citoblastos están presentes en nichos tales como la glándula submucosa (derecha) y cuando los citoblastos se encuentran

Claims

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