ES2561667T3

ES2561667T3 - Genes sintéticos que codifican fragmentos de péptido de proteínas naturales de mielina para la inducción de la tolerancia oral, fragmento de ADN que comprende estos genes, medios para obtener estos péptidos en un sistema microbiano (bacteriano) y su aplicación médica

Info

Publication number: ES2561667T3
Application number: ES11176165.6T
Authority: ES
Inventors: M. Agnieszka Szczepankowska; Jacek Bardowski; Tamara Aleksandrzak-Piekarczyk; Kaja Kasarello; Andrzej W. Lipkowski; Barbara Kwiatkowska- Patzer
Original assignee: Instytut Biochemii I Biofizyki of PAN
Current assignee: Instytut Biochemii I Biofizyki of PAN
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2011-08-01
Publication date: 2016-02-29
Anticipated expiration: 2031-08-01
Also published as: PL392037A1; EP2436693A3; EP2436693B1; EP2436693A2; PL217128B1

Abstract

Gen sintético para su uso en la inducción de tolerancia oral en el tratamiento de la esclerosis múltiple, en el que el gen contiene el fragmento de nucleótidos MBP21-40 ATGGATCATGCTCGTCATGGTTTTTTACCACGTCATCGTGATACTGGTATTTTAGATTCA (fórmula 1), que codifica un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos MDHARHGFLPRHRDTGILDS (fórmula 1a), siendo dicho péptido un fragmento de una proteína natural de mielina.

Description

DESCRIPCIÓN

Genes sintéticos que codifican fragmentos de péptido de proteínas naturales de mielina para la inducción de la tolerancia oral, fragmento de ADN que comprende estos genes, medios para obtener estos péptidos en un sistema 5 microbiano (bacteriano) y su aplicación médica

Campo técnico

[0001] El tema de la invención es un gen sintético que codifica proteína de mielina de bajo peso molecular, 10 procedente de fragmentos de proteína de médula espinal, para su uso en la inducción especifica de tolerancia oral.

Estado de la técnica anterior

[0002] La esclerosis múltiple es una enfermedad destructiva del sistema nervioso central que afecta principalmente a 15 personas jóvenes, entre 20 y 40 años de edad. Los datos de incidencia indican que alrededor de 60.000 personas

padecen esta enfermedad en Polonia. Es una enfermedad autommunitaria, para la cual, hasta ahora, no hay tratamiento eficaz. Los fármacos ¡nmunomoduladores, tales como ¡nterferón y Copaxone, solo modifican la evolución de la enfermedad, reduciendo el número de crisis, pero después de 6 años de tratamiento, la discapacidad de las personas con esclerosis múltiple es la misma que sin tratamiento. Además, el tratamiento de esta enfermedad es 20 bastante caro, y el reembolso de los gastos médicos - infrecuente. De ahí la necesidad de investigación exhaustiva sobre nuevos métodos eficaces y económicamente rentables para el tratamiento de esta enfermedad inmunitaria crónica.

[0003] Las enfermedades autoinmunitarias se basan en un reconocimiento patológico por el sistema inmunitario de 25 las propias proteínas del organismo como antígenos extraños, lo cual, en consecuencia, conduce a la inducción de

mecanismos que eliminen estos antígenos. En la esclerosis múltiple, los fragmentos de proteínas de mielina del sistema nervioso central constituyen antígenos que los anticuerpos reconocen de forma patológica.

[0004] Se ha dado a conocer el mecanismo de tolerancia alimentaria, en el cual, se desensibiliza de forma 30 específica al sistema inmunitario con respecto a nutrientes alimentarios. Se ha propuesto usar este mecanismo para

la inducción de tolerancia a epítopos de proteínas en enfermedades autoinmunitarias, tales como reuma y esclerosis múltiple. Los propios estudios de los autores demuestran que los hidrolizados de la médula espinal de animales de granja, que contienen fragmentos de péptidos de mielina de bajo peso molecular, presentan una actividad que modula la evolución de la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en un modelo animal de esclerosis múltiple 35 (EM) (1).

[0005] El emprendimiento de estudios dirigidos al desarrollo de un método de producción de péptidos de mielina en bacterias acidolácticas se asoció con una serie de premisas: (i) la importante situación de la esclerosis múltiple entre las enfermedades que aparecen en Polonia; (ii) baja eficacia y elevados costes del tratamiento médico de esta

40 enfermedad; (iii) eficacia demostrada de los péptidos en la terapia de esta unidad de enfermedad; (iv) el papel documentado del intestino (tracto digestivo) en el sistema inmunitario del organismo; (v) resultados positivos previos del uso de bacterias acidolácticas como productoras de factores ¡nmunomoduladores (citocinas y antígenos), incluyendo vacunas orales; (vi) datos que indican que las bacterias intensifican el efecto de la tolerancia oral (2).

45 Estado de conocimiento actual

[0006] Las dianas reconocidas en el ataque sobre el sistema inmunitario en la esclerosis múltiple y en el modelo animal de encefalitis alérgica experimental (EAE) son las proteínas de mielina. Los principales componentes proteicos de la mielina son tres proteínas:

50

(i) proteína básica de mielina (MBP, de myelin basic protein), cuya secuencia de aminoácidos humana se representa mediante la fórmula 13 (3)

(ii) proteína proteolipídica (PLP, de proteolipid protein) cuya secuencia de aminoácidos humana se representa 55 mediante la fórmula 14 (4)

(iii) glicoprotefna mielínica oligodendrocitaria (MOG, de myelin-oligodendrocyte glycoprotein) cuya secuencia de aminoácidos humana se representa mediante la fórmula 15 (5).

60 [0007] Estudios realizados durante la última década ofrecen datos de que los fragmentos de péptidos, que son productos de la hidrólisis pardal de proteínas alimenticias, también tienen la capacidad de atravesar la barrera intestinal. Algunos péptidos cortos atraviesan esta barrera más fácilmente que los aminoácidos individuales. Para diferenciar los péptidos alimentarios que atraviesan la barrera hematointestinal de proteínas bacterianas y víricas ¡nvasoras, los organismos han desarrollado un sistema específico de presentación de antígenos alimentarios, como 65 resultado del cual se reduce la inmunogenicidad específica para ciertas secuencias de péptidos (y también para

2

otros componentes de nutrientes no peptídicos). Este fenómeno se ha denominado tolerancia oral.

[0008] La presente Invención se basa en nuestra propia investigación preliminar. La aplicación de una preparación de hidrolizado de médula espinal en una dosis seleccionada de forma arbitraria en ratas con EAE condujo a la

5 reducción de los síntomas Inflamatorios cuando se aplicaron tanto antes como después de la inducción de la EAE (6).

[0009] La explotación de bacterias acidolácticas como fábricas biológicas productoras de fragmentos de péptido de proteínas naturales de mlellna es de gran interés científico y práctico y presenta muchos aspectos médicos y

10 farmacológicos beneficiosos.

[0010] Las bacterias acidolácticas (BAL) constituyen un grupo grande y taxonómicamente variado de bacterias gramposltlvas. Una ventaja indiscutible de estas bacterias es su estado GRCS (Generalmente Reconocido Como Seguro), es decir, bacterias no patógenas y seguras para los seres humanos y los animales. Las bacterias

15 acidolácticas son un objeto significativo de usos biotecnológicos, así como básicas en la investigación aplicada. El uso biotecnológico de bacterias acidolácticas encuentra aplicación en diversas ramas de la industria (7) -alimentaria (p. ej., producción de productos de leche fermentada, comidas y alimentos, así como aditivos de alimentos), química (p. ej., producción de polímeros y enzimas) y farmacéutica (p. ej., preparación de probióticos, tales como Lakcid o Lactovaginal). En los últimos años se han puesto grandes esperanzas en el uso de estas bacterias en la producción 20 de alimentos funcionales, probióticos, así como fármacos en forma de vacunas orales (7, 8, 9). Con respecto a las últimas, las altas expectativas se asocian con la explotación de bacterias acidolácticas como vectores vacunales (10- 12). Asimismo, desde hace unos pocos años se ha observado un aumento en la investigación dirigida hacia la aplicación de bacterias acidolácticas a la producción de diferentes proteínas de significación terapéutica o profiláctica. Se han intentado usar bacterias acidolácticas en la profilaxis y el tratamiento de un síndrome conocido 25 como la enfermedad inflamatoria intestinal (Eli), la cual incluye también la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa.

[0011] El objetivo de los presentes inventores fue el desarrollo de un sistema biológico, basado en bacterias acidolácticas, para la producción de fragmento de péptido de proteínas naturales de mielina, para crear una preparación para la Inducción de tolerancia oral.

30

[0012] El fragmento de péptido de proteína natural de mlellna para su uso en la invención se seleccionó sobre la base de estudios propios, que indicaron que los pacientes con esclerosis múltiples se identifican con el antígeno HLA-DR2 que reconoce el fragmento 84-103 de la proteína MBP (13). También se identifican anticuerpos contra otros fragmentos de las tres proteínas principales (14, 15) y durante la progresión de la enfermedad aumenta el

35 número de antígenos reconocidos procedentes de las tres proteínas básicas de mielina. Las observaciones anteriores están conectadas muy probablemente con la disponibilidad de estas proteínas, así como de sus fragmentos, en los pacientes. La inmunogenicidad de los fragmentos de proteínas naturales de mielina seleccionados también se confirmó en modelos animales de EAE (16, 17, 18).

40 [0013] Inesperadamente, durante la ejecución de la invención se puso de manifiesto que es posible:

1. generar, mediante el método de PCR, genes sintéticos que codifiquen el fragmento seleccionado de péptido de proteína natural de mlellna.

2. clonar, en células de las cepas seleccionadas de bacterias acidolácticas grampositivas del género 45 Lactococcus, los genes recombinantes obtenidos en vectores de clonación adecuados;

3. expresar en bacterias acidolácticas seleccionadas (Lactococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus) genes que codifiquen fragmentos de péptido de proteínas naturales de mielina;

4. clonar genes que codifiquen fragmentos de péptido de proteínas naturales de mielina en células de bacterias gramnegatlvas (Escherichia col¡)\

50

optimizar la biosíntesls de péptidos de mielina en bacterias acidolácticas.

Resumen de la invención

55 [0014] Gen sintético para su uso en la inducción de tolerancia oral, en el que el gen contiene el fragmento de nucleótidos MBP21-40 ATGGATCATGCTCGTCATGGTTTTTTACCACGTCATCGTGATACTGGTATTTTAG ATTCA (fórmula 1), que codifica un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos MDHARHGFLPRHRDTGILDS (fórmula 1a), siendo dicho péptido un fragmento de una proteína natural de mielina.

60 [0015] El método para generar el gen que codifica un fragmento de péptido de proteína natural de mielina, de acuerdo con la invención, se basa en la síntesis mediante el método de PCR de un gen sintético que codifica un fragmento de péptido de proteínas naturales de mielina usando 2 cebadores complementarios ("LONG") presentados en la tabla 1, específicos para el péptido particular, cuya secuencia de nucleótidos se diseñó de modo que correspondiesen a los codones que aparecen preferentemente en bacterias de Lactococcus lactis. Además, se 65 divulgan las secuencias de nucleótidos de los cebadores "FLONG" (de forward LONG, LONG directos) para los

péptidos MBP85-97, PLP139-151 y PLP178-191, que se modificaron mediante la introducción de una secuencia correspondiente al codón de inicio de la traducción (ATG), justo antes de la secuencia que codifica el primer aminoácido de la secuencia original de péptido. Al mismo tiempo, los extremos 5' de los cebadores del "FLONG_péptido" contienen una secuencia adicional de RBS (sitio de unión al ribosoma, ribosome binding site), 5 típica de las bacterias de Lactococcus lactis, reconocida mediante la maquinaria de la traducción, y una secuencia "espadadora" (secuencia de ligamiento) localizada entre la región RBS y el codón de inicio de la traducción. Los cebadores "LONG" se usan como moldes para sintetizar mediante la técnica de PCR los genes sintéticos, usando cebadores cortos ("SHORT") homólogos a los extremos 5' de los cebadores "FLONG_péptido" y "RLONG_péptido", en los que los extremos 5' de los cebadores "SHORT" portan secuencias adicionales reconocidas mediante enzimas 10 de restricción específicas, preferentemente Salí (para el cebador SHORT directo) y Pstl (para el cebador SHORT inverso), mientras que los extremos 5' de los cebadores del "revSHORT_péptido" (de reverse SHORT, SHORT inversos) tienen una secuencia adicional repetida dos veces que corresponde al codón de terminación de la traducción (TAA) (tabla 2).

15 [0016] También se divulgan fragmentos de ADN obtenidos mediante la reacción de PCR mencionada anteriormente usando los cebadores "LONG" y "SHORT", cuyas secuencias de nucleótidos comprenden la secuencia de genes sintéticos de los péptidos seleccionados de proteínas naturales de mielina (secuencias subrayadas), de acuerdo con la invención, representadas mediante la fórmula 6, la fórmula 7, la fórmula 8, la fórmula 9 y la fórmula 10.

20 [0017] El método de clonación del fragmento de ADN generado que comprende el gen sintético, de acuerdo con la invención, se basa en someterlo a la digestión por enzimas de restricción, favorablemente Pstl y Salí, y, después, ligarlo con un vector de plásmido que se replica en células de bacterias acidolácticas, favorablemente en Lactococcus, en particular, con el vector plL253, digerido de antemano con las mismas enzimas de restricción, para obtener plásmidos recombinantes, en los que la orientación de los productos clonados de PCR (insertos) está de 25 acuerdo con la dirección de la transcripción dirigida desde el promotor interno presente en el vector, a fin de introducir el ADN recombinante mediante el método de electroporación dentro de células de cepas bacterianas, que se cultivan de una forma conocida. Las células que contienen el nuevo gen se aíslan a partir de la población del cultivo, favorablemente mediante el análisis de la presencia de insertos cuya longitud corresponda a la longitud de los fragmentos de ADN que comprenden los genes sintéticos esperados, en los transformantes obtenidos mediante 30 la técnica de PCR La coincidencia de las secuencias de nucleótidos de los genes clonados con la secuencia de nucleótidos del gen sintético se examina mediante la técnica de secuenciación de ADN.

[0018] En el método de clonación, es favorable usar como cepas bacterianas acidolácticas grampositivas en las que se introduce el ADN recombinante cepas de Lactococcus, p. ej., Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus lactis

35 IBB477 y Lactococcus lactis IBB360, cuya viabilidad en el Intestino de mamífero difiere, así como otros géneros de bacterias acidolácticas, preferentemente Lactobacillus y Bifidobacterium.

[0019] El método de producción de los péptidos seleccionados en un sistema bacteriano se basa en la expresión de genes sintéticos de los péptidos seleccionados en células de cepas de bacterias acidolácticas, en particular,

40 Lactococcus, mediante su cultivo en un medio conocido específico para bacterias acidolácticas, preferentemente en medio M17 o en medio definido MQD (medio químicamente definido) complementado con azúcar, favorablemente glucosa o celobiosa, a una concentración no inferior al 0,5 %, o en leche, suero lácteo u otro medio adecuado, a una temperatura que oscila entre 20 °C- 30°C, preferentemente a 30 °C.

45 [0020] El método de clonación de los genes sintéticos de los péptidos de mielina seleccionados en bacterias gramnegativas, favorablemente, la especie Escherichia coli, se basa en el ligamiento del gen sintético amplificado usando cebadores 'SHORT' específicos (tabla 2) con el vector, preferentemente con un plásmido pGEMT-Easy disponible en el mercado, u otro vector que se replique en células bacterianas gramnegativas, favorablemente, de la especie Escherichia coli, para obtener plásmidos recombinantes. El ADN recomblnante se Introduce mediante un 50 método conocido, p. ej., electroporación, en células de cepas bacterianas, que se cultivan después de una forma conocida. Las células que contienen el nuevo gen se aíslan a partir de la población cultivada, favorablemente mediante el análisis de la presencia de insertos cuya longitud corresponda a la longitud de los fragmentos de ADN que comprenden los genes esperados, en los transformantes obtenidos mediante la técnica de PCR. La coincidencia de las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN clonados con las secuencias de nucleótidos de los 55 genes sintéticos se examina mediante la técnica de secuenciación de ADN.

[0021] En el método de clonación es favorable usar como cepas bacterianas gramnegativas en las que se introduce el ADN recombinante, bacterias de la especie Escherichia coli, favorablemente la cepa TG1.

60 [0022] El método de optimización de la expresión de los genes sintéticos de los fragmentos de péptido de proteína natural de mielina seleccionados, se basa favorablemente en la sustitución del promotor constitutivo interno del vector de plásmido, que se replica en células de L. lactis, por un promotor regulado, favorablemente por la reglón promotora de un gen procedente del genoma de las bacterias de L. lactis u otras especies, o del genoma de un bacteriófago, preferentemente por la región promotora del gen ptcB, involucrado en el catabolismo del azúcar en las 65 bacterias acidolácticas del género Lactococcus, el cual se regula mediante la presencia en el medio de diversos

azúcares, tales como: celobiosa, galactosa, salicina, esculina, glucosa.

[0023] El método de optimización de la producción de péptidos en un sistema bacteriano, se basa favorablemente en el cultivo de células que portan el vector de plásmido recomblnante (con el gen sintético clonado y una reglón

5 promotora adecuada, favorablemente, el promotor del gen ptcB del genoma de bacterias de Lactococcus) en un medio conocido específico para bacterias acidolácticas, preferentemente en medio definido MQD (medio químicamente definido), complementado con azúcar, favorablemente glucosa o celobiosa, a una concentración de > 0,5 %, o en leche, suero lácteo u otro medio adecuado, a una temperatura que oscila entre 20 °C- 30°C, preferentemente a 30 °C.

10

[0024] La secuencia de nucleótidos de la región promotora del gen ptcB, que comprende la región -10 y -35, representada por la fórmula 11, también se divulga para optimizar la producción del gen sintético que codifica el fragmento de péptido de proteína natural de mielina, de acuerdo con la invención.

15 [0025] El método de producción de la secuencia de nucleótido de la región promotora del gen L. lactisptcB, así como el método de sustitución del promotor constitutivo interno de un vector de plásmido que se replica en L. lactis por la región promotora del gen L. lactisptcB de L. lactis, se basa en la amplificación mediante la reacción de PCR de la región promotora del gen ptcB usando ADN cromosómico de la cepa IL 1403 de L. lactis como molde y el par de cebadores (ptcBfor y ptcBrev), cuyas secuencias son complementarias a las secuencias de ADN adyacentes a la 20 región del promotor del gen ptcB cromosómico y están modificados de modo que sus extremos 5' contienen secuencias reconocidas por endonucleasas de restricción específicas, preferentemente Vspl (para el cebador ptcBfor) y Ncil (para el cebador ptcBrev) (tabla 3). Como resultado de la reacción de PCR, usando dichos cebadores diseñados, se obtiene un fragmento de ADN cuya secuencia de nucleótidos se representa mediante la fórmula 12, que comprende la secuencia de la región promotora del gen ptcB (subrayada).

25

[0026] el producto obtenido de esta manera se somete a digestión mediante enzimas de restricción, preferentemente Vspl y Ncil, y después se liga con los vectores recombinantes que portan el gen sintético que codifica el fragmento de péptido de proteína natural de mielina seleccionado, del que se eliminó la región promotora original (p. ej., mediante digestión usando las mismas restrictasas). El ADN recombinante se introduce mediante el método de

30 electroporación dentro de células de cepas bacterianas que después se cultivan mediante métodos conocidos. Las células que contienen la nueva región promotora se aíslan a partir de la población cultivada, favorablemente mediante el análisis de la presencia de fragmentos de ADN cuya longitud esperada corresponda a la longitud de la región promotora del gen ptcB seleccionada, en los transformantes obtenidos mediante la técnica de PCR. La coincidencia de las secuencias de nucleótidos del fragmento de ADN clonado con la secuencia de nucleótidos de la 35 región promotora del gen ptcB se examina mediante la técnica de secuenciación de ADN.

[0027] También se divulga la aplicación de bacterias productoras de un fragmento de péptido de proteína natural de mielina de acuerdo con la invención, para la inducción de tolerancia oral.

40 [0028] Aplicación de la secuencia de nucleótidos de la región promotora del gen ptcB, que comprende la región -10 y -35, representada mediante la fórmula 11, para optimizar la producción un de gen sintético que codifica un fragmento de péptido de proteína natural de mielina de acuerdo con la invención, para la inducción de tolerancia oral.

[0029] Se espera que las bacterias productoras del fragmento de péptido de proteína natural de mielina, de acuerdo 45 con la invención, inducirán tolerancia oral, como se describe en la bibliografía que se refiere a la administración oral de mezcla de péptido en la forma del hidrolizado de médula espinal de animal, publicada como resultado de estudios propios (1, 6).

Descripción de las realizaciones

50

Materiales y métodos

Cepas bacterianas, condiciones de cultivo v plásmidos usados

55 [0030] Las cepas bacterianas y los plásmidos usados en los estudios actuales se presentan en la tabla 4. Las cepas de Lactococcus lactis se cultivaron en medio M17 (Oxoid, Anglia) complementado con glucosa al 0,5 %, o en medio definido MQD (medio químicamente definido) complementado con glucosa o celobiosa (0,5 %-1 %) a una temperatura entre 20 °C-30 °C. Las cepas de Escherichia coli se cultivaron en medio de Luria-Bertani (LB), a una temperatura de 37 °C. Cuando fue necesario, a efectos de selección, se usaron los siguientes antibióticos: 5 pg mi'1 60 de eritromicina para L. lactis y 100 pg mi'1 de ampicilina para E. coli.

A continuación se presentan ejemplos de la ejecución de la invención.

Ejemplo Ejemplo I.

5 [0031] Los genes sintéticos se sintetizaron mediante el método de PCR usando para cada péptido dos cebadores complementarios (for/rev"LONG") como molde, y 2 cebadores cortos (for/rev"SHORT") homólogos, respectivamente, a los extremos de las secuencias de los cebadores "LONG" (tabla 1). Como resultado de las reacciones de amplificación por PCR, se obtuvieron productos de la longitud esperada, los cuales se digirieron después mediante las enzimas Salí y Pstl y se ligaron con un plásmido que se replica en las células bacterianas de Lactococcus - 10 plL253, digerido de antemano con las mismas enzimas. Posteriormente, las dos moléculas de ADN se recombinaron entre sí y se introdujeron mediante el método de electroporación en las células de las cepas seleccionadas de Lactococcus lactis, las cuales se cultivaron en medio agar M17 sólido complementado con glucosa al 0,5 % y eritromicina a una concentración final de 5 pg mi"1, y las células que contenían los genes sintéticos esperados se aislaron a partir de la población cultivada mediante el método de PCR usando cebadores específicos. La 15 coincidencia de las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN clonados con las secuencias de nucleótidos de los genes sintéticos se examinó mediante la técnica de secuenciación de ADN.

[0032] Los plásmidos recombinantes apropiados resultantes se aislaron a partir de las células bacterianas de Lactococcus usando un método conocido y se introdujeron mediante electroporación dentro de células de otras

20 bacterias acidolácticas, p. ej., Bifidobacterium y Lactobacillus.

[0033] Las células de las cepas de L. lactic se transformaron usando una técnica de electroporación conocida (19). Las células de Bifidobacterium y Lactobacillus se transformaron usando una técnica de electroporación conocida, según procedimientos establecidos previamente (20, 21).

25

[0034] Otras técnicas de biología molecular usadas en el ejemplo estaban de acuerdo con la metodología convencional (22).

Tabla 1

30

[0035] Secuencia de los cebadores ("LONG") usados como moldes para la amplificación de los genes sintéticos de neuropéptido.

Tabla 1

Nombre del neuropéptido: Nombre del cebador Secuencia del cebador (directo/inverso)

MBP21-40: FLON G_ MPB21 5* GAGTATTTCTATGGATCATGCTCGTCATG GTTTTTTACCACGT CAT CGT G ATACT GGT ATTTTAGATTCA 3’

RLON G_ MPB21: 5* TGAATCTAAAATACCAGTATCACGATGAC GT GGTAAAAAACCAT G ACGAGCATG AT CC ATAGAAATACTC 3’

MOG35-55: FLON G_ MOG35 “51 GTATTT CTAT GGAAGTTGG AT GGTAT CGT T CACCATTTT CACGT GTT GTTCATTTATAT CGTAATGG 3’

RLON G_ MOG35: 5’ CCATTACGATATAAATGAACAACACGTGA AAAT G GT G AACG ATACC AT CCAACTT CCT AGAAATAC 3’

MBP85-97: FLON G_ MPB85 5' GTATTT CTATGCCAGG AT C ACGT CCAC AT TTAATTCGTTTATTTT CACGT 3’

RLON G_ MPB85: 5’ ACGTGAAAATAAACGAATTAAATGTGGAC GTGATCCTGGCATAGAAATAC 3’

PLP139-151: FLON G_ PLP139 b’ GT ATTT CTATGCATT CATTAGGAAAATGGT TAG GACATCCAGATAAATTT 3’

: RLON G_ PLP139 5’ AAATTT ATCTGGAT GT CCT AACCATTTT CC TAATGAATGCATAGAAATAC 3’

PLP178-191: FLON G_ PLP17 8 5‘ GT ATTT CTATG AAT AC ATGG AC AAC AT GT C AATCAATTGCTTTTCCATC 3'

RLON G_ PLP17 8: 5’ GAT G G AAAAGC AATT G ATT G ACAT G TTGT CCATGTATTCATAGAAATAC 3’

Ejemplo II.

[0036] La producción de los péptidos seleccionados en células de bacterias acidolácticas se basó en la expresión de 5 genes sintéticos en las células bacterianas mediante su cultivo en medio definido MQD (medio químicamente

definido), complementado con celobiosa a una concentración no inferior al 0,5 %, a una temperatura que oscilaba entre 20 °C- 30°C, preferentemente a 30 °C, hasta alcanzar una densidad óptica de DO 6003 0,6.

Ejemplo III.

10

[0037] Los estudios sobre la expresión de los genes sintéticos de los péptidos seleccionados de mielina a nivel de transcripción se llevaron a cabo usando el método de RT-PCR. El ARN total se aisló a partir de cepas bacterianas portadoras de los plásmidos recombinantes y, después de tratamiento específico, se sometió a la reacción de transcripción inversa usando cebadores inversos (revSHORT_péptido) complementarios al extremo 3' de la cadena

15 que codifica el gen sintético (tabla 2). El ADNc obtenido se sometió a continuación a amplificación mediante la técnica de PCR clásica usando dos pares de cebadores (forSHORTUniv y revSHORT_péptido) (tabla 2). Como resultado del experimento, se obtuvieron dos fragmentos de ADN cuya longitud correspondió a la longitud de cada uno de los genes.

20 Tabla 2

[0038] Secuencia de los cebadores ('SHORT') usados para la amplificación de genes sintéticos de neuropéptido.

Tabla 2

Nombre del neuropéptido: Nombre del cebador Secuencia del cebador

Cebador directo universal: ForSHORTUniv 5’ ACGCGTCGACAAGG AGT ATTTCT A TG 3'

Nombre del neuropéptido: Nombre del cebador Secuencia del cebador

MBP21-40: RevSHORT_ MBP21 5’ AACTGCAGTTATTATGAATCTAAAA TACCAG 3’

MOG35-55: revSHORT_ MOG35 5‘ AACT GC AGTT ATT ATTTT C CATT AC GATA 3’

MBP85-97: revSHORT_ MBP85 5’ AACTGCAGTTATTAACGTG AAAATA AACG 3’

PLP139-151: revSHORT_ PLP139 51 AACTGCAGTTATTAAAATTTATCTG G 3’

PLP178-191: revSHORT_ PLP178 5’AACTGCAGTTATTAT i i igatgga AAAGC 3'

Ejemplo IV.

[0039] Los estudios sobre la expresión de los genes sintéticos de los péptidos seleccionados de mielina a nivel de 5 traducción se llevaron a cabo mediante el método de inmunoransferencia, usando extractos de proteína obtenidos

mediante métodos conocidos a partir de cultivos de células bacterianas portadoras de los plásmidos recombinantes, suspendidas en tampón PBS, pH 7,4, y anticuerpos específicos adecuados disponibles en el mercado.

Ejemplo V.

10

[0040] La región promotora del gen ptcB se amplificó mediante el método de PCR usando ADN genómico de la cepa IL 1403 de L. lactis como molde, y cebadores específicos (tabla 3). Como resultado de la amplificación por PCR, se obtuvo un producto de longitud esperada, el cual se digirió a continuación con las enzimas Ncil y Vspl y se ligó con el plásmido plL253, que se replica en las células de la bacteria Lactococcus, digerido de antemano con las mismas

15 enzimas. El ADN recombinante se introdujo mediante electroporación dentro de células de la cepa de L. lactis, las cuales se cultivaron en medio agar M17 sólido complementado con glucosa al 0,5 % y eritromicina a una concentración final de 5 pg mi'1, y, a partir de la población de células cultivadas, se aislaron las células que contenían la región promotora del gen ptcB usando el método de PCR y cebadores específicos.

20 [0041] Las células de las cepas de L. lactic se transformaron usando la técnica de electroporación (19).

[0042] Otras técnicas de biología molecular usadas en el ejemplo estaban de acuerdo con la metodología convencional (22).

25 Tabla 3

[0043] Secuencia de los cebadores usados para la amplificación de la región promotora del gen ptcB.

Tabla 3

Nombre del cebador: Secuencia del cebador

ptcBfor: 5‘ GCGATTAATGTCGCCTAAAGGTTGC 3’

Nombre del cebador: Secuencia del cebador

ptcBrev: 5‘ AATCCCGG CGTTTTATAATTTAACG TTC 3'

Ejemplo VI.

[0044] Los genes de péptido sintéticos se amplificaron mediante el método de PCR usando cebadores específicos 5 'SHORT' (tabla 2) y después se ligaron con un vector que se replica en las células de bacterias de Escherichia coli -

pGEMT-Easy. El ADN recombinante se introdujo mediante el método de electroporación dentro de células de la cepa de E. coli, las cuales se cultivaron en medio agar LB complementado con ampicilina a una concentración final de 100 pg mi'1, y, a partir de la población de células cultivadas, se aislaron las células que contenían los genes sintéticos esperados usando el método de PCR y cebadores específicos. La coincidencia de las secuencias de nucleótidos de 10 los fragmentos de ADN clonados con las secuencias de nucleótidos de los genes sintéticos se examinó mediante la técnica de secuenclaclón de ADN.

[0045] Las células de E. coli se transformaron usando la técnica de electroporación (22).

15 [0046] Otras técnicas de biología molecular usadas en los ejemplos estaban de acuerdo con la metodología

convencional (22).

Ejemplo Vil.

20 [0047] La estructura de la secuencia de nucleótidos de los genes sintéticos de los péptidos de mielina seleccionados, así como la de la reglón promotora del gen ptcB, de acuerdo con la invención, se confirmó mediante secuenclación de los fragmentos de ADN usando el equipo de reactivos BlgDye Terminator (Promega, EE.UU.) y el aparato de secuenclaclón ABI377 (Applied Biosystem, EE.UU.), y los plásmldos recombinantes como moldes, así como cebadores complementarlos a los extremos de cada uno de los Insertos. Las secuencias de nucleótidos 25 obtenidas se analizaron usando el programa BLAST (23).

Tabla 4

Cepas y plásmidos 30

[0048]

Tabla 4

Cepa: genotipo origen

Lactococcus lactis

IL1403: Cepa de laboratorio sin plásmido (24)

IBB360: Cepa con posibles propiedades autolíticas Colección J. Bardowski-IBB PAN

IBB477: Cepa con posibles propiedades adhesivas, Te' Colección J. Zycka- Krzesinska- IBB PAN

Bifidobacterium

Bifidobacterium pseudocatenulatum M115: Aislado de intestino humano; sin plásmido Colección IPLA Laboratory

Lactobacillus

Lactobacillus piantarum NCFB1193 Colección NCFB

Escherichia coli

TG1: supE Q(hsdM-mcrB)(rk-mk-McrB -)th¡ Q(lac-proAB)F’[traD36 laclq lacZ QM15 proA+B+j (25)

Plásmido

pl L253: Eryr, vector para la clonación de genes en bacterias de Lactococcus (26)

plL253_p [ptcB]: Eryr, vector para la clonación de genes en bacterias de Lactococcus, con región promotora regulada del gen ptcB Este trabajo

pGEMT-Easy: AmpK, vector para la clonación de genes en bacterias de Escherichia Promega

Cepa____________________

Lactococcus lactis_________

* Eryr - resistencia a eritromicina Ampr - resistencia a ampicilina

genotipo

origen

Texto libre de listado de secuencias

MBP21-40:

5

[0049]

ATGGAT CATGCTCGT CATGGTTTTTT ACCACGTC AT CGT G ATACTGGT ATTTTAGATTCA

10 fórmula 1

MDHARHGFLPRHRDTGILDS fórmula 1a

MOG35-55:

15

[0050]

ATGG AAGTT G G AT GGTATCGTT C ACC ATTTT C ACGT GTTGTT C ATTTA TATCGTAATGGAAAA

20 fórmula 2

MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK fórmula 2a

MBP85-97:

25

[0051] CCAGGATCACGTCCACATTTAATTCGTTTATTTTCACGT fórmula 3

30 [0052] PGSRPHLIRLFSR fórmula 3a

PLP139-151:

35

[0053] CATTCATTAGGAAAATGGTTAGGACATCCAGATAAATTT fórmula 4

40 [0054] HSLGKWLGHPDKF

fórmula 4a

PLP178-191:

ATGAATACATGGACAACATGTCAATCAATTGCTTTTCCATCAAAA 45 fórmula 5

NTWTTCQSIAFPSK fórmula 5a

Fragmento de ADN que contiene el gen sintético del péptido MBP 21-40

5’ACGCGTCGACAAGGAGTATTTCTATGGATCATGCTCGTCATGGTTTT TTACCACGT C AT CGTG ATACT GGTATTTTAG ATT CATAATAACT GCAGT T3’

fórmula 6

5 Fragmento de ADN que contiene el gen sintético del péptido MOG35-55

[0056]

5’ACGCGTCGACAAGGAGTATTTCTATGGAAGTTGGATGGTATCGTTC ACCATTTTC ACGT GTT GTT C ATTTATAT CGTAAT GG AAAATAATAACT G CAGTT3’

10 fórmula 7

Fragmento de ADN que contiene el gen sintético del péptido MBP85-97

[0057]

15

5’ACGCGTCG ACAAGGAGTATTTCTATGCC AGG ATCACGTCCACATTT AATTCGTTTATTTTCACGTTAATAACTGCAGTT3'

fórmula 8

20 Fragmento de ADN que contiene el gen sintético del péptido PLP139-151

[0058]

5’ACGCGTCGACAAGGAGTATTTCTATGCATTCATTAGGAAAATGGTTA

GGACATCCAGATAAATTTTAATAACTGCAGTT3’

25

fórmula 9

Fragmento de ADN que contiene el gen sintético del péptido PLP178-191 30 [0059]

5’ACGCGTCG ACAAGGAGTATTTCT AT GAAT ACAT GGACAACATGT CA AT CAATT GCTTTT CCAT CAAAAT AAT AACT GCAGTT3’

fórmula 10

región promotora del gen ptcB [0060]

gtcgcctaaaggttgctataaagcgaaaaataaactaattaacaaatt

ATATAAAGCACTTTCAAAAAATAGATAACGCTTGCATTATGAAAATGAA AACGTTATAATT ATTTTTATAAAGAACG TTAAATTATAAAACG

fórmula 11

5 Fragmento de ADN que contiene la región promotora del gen ptcB [0061]

GCG ATTAAT GT CGCCT AAAG GTT GCTAT AAAGCG AAAAATAAACTAAT TAACAAATTATATAAAGCACTTTCAAAAAATAGATAACGCTTGCATTAT G AAAATG AAAACGTTAT AATTATTTTTAT AAAG AACGTTAAATTAT AAAA

CGCCGGGATT

10

fórmula 12 MBP

15 [0062]

MGNHAGKRELNAEKASTNSETNRGESEKKRNLGELSRTTSEDNEVFGE

ADANQNNGTSSQDTAVTDSKRTADPKNAWQDAHPADPGSRPHLIRLFS

RDAPGREDNTFKDRPSESDELQTIQEDSAATSESLDVMASQKRPSQRH

GSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDTGILDSIGRFFGGDRGAPKRGSGK

DSHHPARTAHYGSLPQKSHGRTQDENPWHFFKNIVTPRTPPPSQGKG

rglslsrfswgaegqrpgfgyggrasdyksahkgfkgvdaqgtlskif

KLGGRDSRSGSPMARR

fórmula 13

20

PLP

[0063]

GLLECCARCLVGARFASLVATGLCFFGVALFCGCGHEALTGTEKLIETYF

SKNYQDYEYLINVIHAFQYVIYGTASFFFLYGALLLAEGFYTTGAVRQIFG

dyktticgkglsatvtggqkgrgsrgqhqahslervchclgkwlghp

DKFVGITYALTWWLLVFACSAVPVYIYFNTWTTCQSIAFPSKTSASIGSL

CADARMYGVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQMTFHLFIAAFVGAAA

TLVSLLTFMIAATYNFAVLKLMGRGTKF

fórmula 14 MOG 5 [0064]

MASLSRPSLPSCLCSFLLLLLLQVSSSYAGQFRVIGPRHPIRALVGDEVEL

PCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRWHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRT

ELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDPF

YWVSPGVLVLLAVLPVLLLQITVGLVFLCLQYRLRGKLRAEIENLHRTFDP

HFLRVPCWKITLFVIVPVLGPLVALIICYNWLHRRLAGQFLEELRNPF

fórmula 15

10

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20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Gen sintético para su uso en la inducción de tolerancia oral en el tratamiento de la esclerosis múltiple, en el que el gen contiene el fragmento de nucleótidos MBP21-40

5 ATGGATCATGCTCGTCATGGTTTTTTACCACGTCATCGTGATACTGGTATTTTAGATTCA (fórmula 1), que codifica un péptldo que consiste en la secuencia de aminoácidos MDHARHGFLPRHRDTGILDS (fórmula 1a), siendo dicho péptido un fragmento de una proteína natural de mielina.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

* WO 2006123230 A [0065]

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción

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