ES2561885T3 - ADN polimerasas de actividad mejorada - Google Patents

Abstract

ADN polimerasa que presenta una eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de inhibidores de polimerasa reducidas en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa presenta una identidad de secuencias de aminoácidos de por lo menos 80% respecto a una polimerasa seleccionada de entre el grupo que consiste de: (a) SEC ID nº 1, (b) SEC ID nº 2, (c) SEC ID nº 3, (d) SEC ID nº 4, (e) SEC ID nº 5, (f) SEC ID nº 6, (g) SEC ID nº 7, (h) SEC ID nº 32, (i) SEC ID nº 33, (j) SEC ID nº 34, (k) SEC ID nº 35, (l) SEC ID nº 36, y (m) SEC ID nº 37, y en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 709 de SEC ID nº 1 es cualquier aminoácido diferente de I, L o M, y en la que la ADN polimerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 709 de la SEC ID nº 1 es I, L o M.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCIÓN

ADN polimerasas de actividad mejorada Campo de la invención

La presente invención proporciona ADN polimerasas de actividad mejorada, incluyendo una eficiencia de transcripción inversa, tolerancia a no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la transcriptasa inversa (TI) incrementadas e inhibidores de polimerasa, así como la utilización de dichas polimerasas en diversas aplicaciones, incluyendo la extensión y amplificación de polinucleótidos de ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

Las ADN polimerasas son responsables de la replicación y mantenimiento del genoma, un papel que es crucial para transmitir con precisión la información genética de generación a generación. Las ADN polimerasas funcionan en las células como los enzimas responsables de la síntesis del ADN. Polimerizan los desoxirribonucleósidos trifosfato en presencia de un activador metálico, tal como Mg2+, en un orden dictado por el molde de ADN o molde polinucleótido que se copia. In vivo, las ADN polimerasas participan en un abanico de procesos de síntesis del ADN, incluyendo la replicación del ADN, la reparación del ADN, la recombinación y la amplificación génica. Durante cada proceso de síntesis de ADN, se copia el molde de ADN una vez o como máximo unas pocas veces, produciendo réplicas idénticas. En contraste, in vitro, la replicación del ADN puede repetirse muchas veces, tal como, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (ver, por ejemplo, la patente US n° 4.683.202).

En los estudios iniciales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se añadía la ADN polimerasa al inicio de cada ronda de replicación del ADN (ver la patente US n° 4.683.202, supra). Posteriormente se determinó que las ADN polimerasas termoestables podían obtenerse de bacterias que crecen a temperaturas elevadas, y que estos enzimas sólo necesitan añadirse una vez (ver las patentes US n° 4.889.818 y n° 4.965.188). A las elevadas temperaturas utilizadas durante la PCR, estos enzimas no resultan inactivados irreversiblemente. En consecuencia, pueden llevarse a cabo ciclos repetitivos de reacciones en cadena de polimerasa sin añadir enzimas frescos al inicio de cada proceso de adición sintética. Las ADN polimerasas, en particular las polimerasas termoestables, son la clave para un gran número de técnicas en estudios de ADN recombinante y en el diagnóstico médico de enfermedades. Para las aplicaciones diagnósticas en particular, una secuencia diana de ácidos nucleicos puede ser meramente una porción pequeña del ADN o ARN en cuestión, de manera que puede resultar difícil detectar la presencia de una secuencia diana de ácidos nucleicos sin la amplificación.

El patrón de pliegue global de las ADN polimerasas es similar al de la mano derecha humana y contiene tres subdominios diferentes de palma, dedos y pulgar (ver Beese et al., Science 260:352-355, 1993; Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995). Aunque la estructura de los subdominios de dedos y pulgar varían mucho entre polimerasas que difieren en el tamaño y en las funciones celulares, los subdominios de palma catalíticos son todos superponibles. Por ejemplo, el motivo A, que interactúa con el dNTP entrante y estabiliza el estado de transición durante la catálisis química, es superponible con una desviación promedio de aproximadamente un A entre la pol a de mamíferos y las ADN polimerasas de la familia procariótica de pol I (Wang et al., Cell 89:1087-1099, 1997). El motivo A se inicia estructuralmente en una cadena (3 antiparalela que contiene predominantemente residuos hidrofóbicos y continúa a una hélice a. La secuencia de aminoácidos primaria de los sitios activos de la ADN polimerasa se encuentra excepcionalmente conservada. En el caso del motivo A, por ejemplo, la secuencia DYSQIELR (SEC ID n° 22) se conserva en las polimerasas de organismos separados por muchos millones de años de evolución, entre ellos, por ejemplo, Thermus aquaticus, Chlamydia trachomatis y Escherichia coli.

Además, de estar bien conservado, el sitio activo de las ADN polimerasas también ha demostrado ser relativamente mutable, capaz de ajustarse a determinadas sustituciones de aminoácidos sin reducir significativamente la actividad de la ADN polimerasa (ver, por ejemplo, la patente US n° 6.602.695). Dichas ADN polimerasas mutantes puede ofrecer diversas ventajas selectivas en, por ejemplo, aplicaciones diagnósticas y de investigación que comprenden reacciones de síntesis de ácidos nucleicos.

Existen por lo menos dos etapas en el proceso enzimático de polimerización del ADN: 1) la incorporación del nucleótido entrante, y 2) la extensión del nucleótido de nueva incorporación. La "fidelidad" global de la ADN polimerasa generalmente se considera un conglomerado de dichas dos actividades enzimáticas, aunque las etapas son diferentes. Una ADN polimerasa puede incorporar erróneamente el nucleótido entrante pero, en el caso de que no se extienda eficientemente, se reducirá severamente la tasa de extensión y la formación global de producto sería mínima. Alternativamente, resulta posible disponer de una ADN polimerasa que incorpore erróneamente el nucleótido entrante y extender erróneamente con facilidad la no correspondencia de nueva formación. En este caso, la tasa de extensión global sería elevada, pero la fidelidad global sería baja. Un ejemplo de este tipo de enzima sería la ADN polimerasa ES 112 (ADN polimerasa E683R Z05; ver la patente US n° 7.179.590) al utilizar Mn2+ como el activador ión metálico divalente. El enzima presenta una eficiencia muy elevada debido a que, al contrario que las ADN polimerasas típicas que tienden a vacilar/detenerse al encontrarse con una no correspondencia, la ADN polimerasa ES 112 extiende con facilidad la no correspondencia. El fenotipo mostrado en ES 112 es más

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

pronunciado durante la etapa de transcripción inversa (TI), presumiblemente debido a efectos estructurales del heterodúplex de ARN/ADN frente al homodúplex de ADN/ADN. Un segundo ejemplo sería que la ADN polimerasa no Incorporase erróneamente con facilidad (incluso que fuese menos probable que Incorporarse erróneamente) pero presentase una capacidad incrementada de extender erróneamente una no correspondencia. En este caso, la fidelidad no se vería alterada significativamente para el producto global. En general, este tipo de enzima resulta más favorable para las reacciones de extensión que la característica de ES 112 en Mn2+ debido a que mejora la fidelidad del producto. Sin embargo, dicho atributo puede utilizarse para permitir la extensión incorrecta de un cebador oligonucleótido con no correspondencias, tal como el caso de la hibridación de un cebador oligonucleótido de una única con una diana con heterogeneidad de secuencia (por ejemplo dianas víricas), aunque la tasa de incorporación errónea normal o más baja permite completar la síntesis del ADN más allá del cebador oligonucleótido original. Un ejemplo de este tipo de ADN polimerasa es la ADN polimerasa Z05 D580G (ver la publicación de patente US n° 2009/0148891). A este tipo de actividad se la denomina "tolerante a las no correspondencias" debido a que es más tolerante a las no correspondencias en el cebador oligonucleótido. Aunque en los ejemplos anteriores se comentan reacciones de tipo extensión de cebador, la actividad puede ser más significativa en reacciones tales como la RT- PCR y la PCR, en la extensión de cebadores se produce repetidamente con frecuencia. Los datos sugieren que, aunque algunos enzimas como Z05 D580G son más "tolerantes" a las no correspondencias, también presentan una capacidad incrementada de extender los cebadores oligonucleótidos que contienen bases modificadas (por ejemplo bases modificadas con t-butil-bencilo) o en presencia de pigmentos que se unen al ADN, tales como SYBR verde I (ver la publicación de patente US n° 2009/028053).

La reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) es una técnica utilizada en muchas aplicaciones para detectar y/o cuantificar las dianas de ARN mediante amplificación. Con el fin de amplificar las dianas de ARN mediante PCR resulta necesario en primer lugar transcribir inversamente el molde de ARN en ADNc. Típicamente, los ensayos de RT-PCR se basan en una transcriptasa inversa no termoestable (ADN polimerasa dependiente de ARN) derivada de un organismo mesofílico, para la etapa inicial de síntesis de ADNc (TI). Se requiere una ADN polimerasa termoestable adicional para la amplificación del ADNc para tolerar las elevadas temperaturas requeridas para la desnaturalización de los ácidos nucleicos en la PCR. Existen varios beneficios potenciales de la utilización de ADN polimerasas termoactivas o termoestables manipuladas para llevar a cabo una transcripción inversa más eficiente de los ensayos de RT-PCR. Una actividad de transcriptasa inversa incrementada junto con la capacidad de utilizar temperaturas de incubación de transcripción inversa más altas, las cuales permiten relajar la estructura secundaria del molde de ARN, pueden resultar en una eficiencia de síntesis del ADNc y una sensibilidad del ensayo globalmente más elevadas. Una temperatura de incubación más alta también podría incrementar la especificidad al reducir el falso cebador en la etapa de transcripción inversa. Los enzimas con una eficiencia mejorada de transcripción inversa pueden simplificar el diseño de los ensayos al permitir tiempos de incubación de TI y/o una concentración de enzima reducidos. Al utilizar dUTP y UNG, los productos de extensión no específicos que contienen dUMP que se forman durante las condiciones de preparación no restrictivas resultan degradados por UNG y no pueden ser utilizados ni como cebadores ni como moldes. Al utilizar una transcriptasa inversa no termoestable (ADN polimerasa dependiente de ARN) derivada de un organismo mesofílico, no resulta posible utilizar las metodologías de dUTP y UNG (Myers T.W. et al., Amplification of RNA: High Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase, en: PCR Strategies, Innis M.A., Gelfand D.H. y Sninsky J.J., editores, Academic Press, San Diego, CA, 58-68, 1995). Sin embargo, la utilización de una ADN polimerasa termoactiva o termoestable de la invención para la etapa de transcripción inversa permite que la reacción sea completamente compatible con la utilización del sistema de prevención de contaminación cruzada de dUTP/uracil-N-glucosilasa (UNG) (Longo et al., Use of Uracil DNA Glycosylase to Control Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions, Gene 93:125-128, 1990). Además de proporcionar un control de la contaminación cruzada, la utilización de dUTP y UNG proporciona un "inicio en caliente" para reducir la amplificación no específica (Innis y Gelfand, supra, 1999).

Breve descripción resumida de la invención

En la presente memoria se proporcionan ADN polimerasas con actividades mejoradas, incluyendo una eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a las no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de los inhibidores de polimerasa incrementadas respecto a una polimerasa de control no modificada correspondiente, y métodos de preparación y utilización de estas ADN polimerasas. En la presente memoria la ADN polimerasa presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% respecto a una polimerasa seleccionada de entre el grupo que consiste de:

(a) SEC ID n° 1,

(b) SEC ID n° 2,

(c) SEC ID n° 3,

(d) SEC ID n° 4,

(e) SEC ID n° 5,

(f) SEC ID n° 6,

(g) SEC ID n° 7,

(h) SEC ID n° 32,

(i) SEC ID n° 33,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Q)SEC ID n° 34,

(k) SEC ID n° 35,

(l) SEC ID n° 36, y

(m) SEC ID n° 37,

y el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 709 de SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de I, L o M, y la ADN polimerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 709 de SEC ID n° 1 es I, L o M. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 709 de SEC ID n° 1 de la polimerasa mejorada se selecciona de entre G, A, V, R,

F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K o H.

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa con eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a las no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de los inhibidores de polimerasa incrementadas comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende:

Xi -X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-G-Y-V-X14-T-L,

en la que:

XI es A, D, S, E, R o Q,

X2 es W o Y,

X3 es cualquier aminoácido diferente de I, L o M,

X4 es E, A, Q, K, N o D,

X5 es K, G, R, Q, H o N,

X6 es T, V, M o I,

X7 es L, V o K,

Xa es E, S, A, D o Q,

X9 es E o F,

X10 es G o A,

XII es R o K,

X12 es K, R, E, T o Q,

Xi3es R, Ko H, y

X14 es E, R o T (SEC ID n° 8).

En algunas realizaciones, X3 se selecciona de entre G, A, W, P, S, T, F, Y, C, N, Q, D, E, K, V, R o H.

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa con eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a las no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de los inhibidores de polimerasa incrementadas comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende:

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-E-X10-X11-X12-X13-G-Y-V-X14-T-L,

en la que:

XI es A, D, o S,

X2 es W o Y,

X3 es cualquier residuo aminoácido diferente de I,

X4 es E, A, o Q,

X5 es K, G, R o Q,

X6 es T o V,

X7 es L o V,

Xa es E, S o A,

X10 es G o A,

XII es R o K,

X12 es K, R o E,

X13 es R o K, y

X14 es E o R (SEC ID n° 9).

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa con eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a las no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de los inhibidores de polimerasa incrementadas comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende:

A-W-X3-X4-X5-T- L-E-E-G-R-X12-X13-G-Y-V-E-T-L,

en la que:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

X3 es cualquier aminoácido diferente de I,

X4 es E o A,

X5 es K o G,

Xi2es K o R, y

Xi3es R o K(SEC ID n° 10).

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa con eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a las no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de los inhibidores de polimerasa incrementadas comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende:

A-W-X3-X4-X5-T-L-E-E-G-R-X12-X13-G-Y-V-E-T-L,

en la que:

X3es K, R, S, G, o A,

X4 es E o A,

X5 es K o G,

Xi2es K o R, y

X13 es R o K (SEC ID n° 11).

En algunas realizaciones, el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 580 de SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de D o E. En algunas realizaciones, el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 580 de SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de D. En algunas realizaciones, el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 580 de SEC ID n° 1 se selecciona de entre el grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K.

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa comprende además una mutación en uno o más aminoácidos correspondiente a una posición seleccionada de entre 580 y 588 de SEC ID n° 1. En algunas realizaciones, el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 580 de SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de D o E. En algunas realizaciones, el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 580 de la SEC ID n° 1 se selecciona de entre el grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K. En algunas realizaciones el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 588 de SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de I. En algunas realizaciones, el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 588 de SEC ID n° 1 se selecciona de entre L, V, G, A, S, M, F, W, P, R, K, T, C, Y, N, Q, D, E o H. En algunas realizaciones, el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 588 de la SEC ID n° 1 es T.

Diversas ADN polimerasas pueden mutarse según la presente invención. Resultan particularmente adecuadas las polimerasas termoestables, incluyendo las polimerasas termoestables de tipo salvaje o naturales de diversas especies de bacterias termofílicas, así como polimerasas termoestables sintéticas derivadas de dichos enzimas de tipo salvaje o naturales mediante sustitución, inserción o deleción de aminoácidos, u otra modificación. Entre las formas no modificadas ejemplares de polimerasa se incluyen, por ejemplo, la ADN polimerasa CS5, CS6 Z051) o una ADN polimerasa funcional que presenta una Identidad de secuencia de aminoácidos respecto a dicha ADN polimerasa de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%. Entre otras polimerasa no modificadas se Incluyen, por ejemplo, las ADN polimerasas de cualquiera de las especies de bacterias termofílicas siguientes (o de una ADN polimerasa funcional que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%, respecto a dicha polimerasa): Thermotoga marítima (SEC ID n° 34), Thermus aquaticus (SEC ID n° 2), Thermus thermophilus (SEC ID n° 6), Thermus flavus (SEC ID n° 4), Thermus filiformis (SEC ID n° 3), Thermus sp. sps17 (SEC ID n° 5), Thermus sp. Z05 (SEC ID n° 1), Thermotoga neopolitana (SEC ID n° 35), Thermosipho africanus (SEC ID n° 37), Thermus caldophilus (SEC ID n° 7), Deinococcus radiodurans (SEC ID n° 36), Bacillus stearothermophilus (SEC ID n° 36) o Bacillus caidotenax (SEC ID n° 37). Entre las polimerasas adecuadas se incluyen también las que presentan actividad de transcriptasa inversa (TI) y/o la capacidad de Incorporar nucleótldos no convencionales, tales como ribonucleótldos u otros nucleótidos 2'-modif¡cados.

Aunque las ADN polimerasas termoestables que presentan una actividad de transcripción Inversa eficiente resultan particularmente adecuadas para llevar a cabo la RT-PCR, especialmente la RT-PCR de un solo enzima, las ADN polimerasas termoactivas, pero no termoestables, que presentan una actividad de transcripción inversa eficiente también pueden mutarse según la presente Invención. Por ejemplo, los atributos de eficiencia de la transcriptasa inversa, tolerancia a no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de inhibidores de TI incrementadas son Importantes para la etapa de TI en una RT-PCR y esta etapa no es necesario que se lleve a cabo a temperaturas que inactivarían una ADN polimerasa termoactlva pero no termoestable. Tras la etapa de TI, podría añadirse una ADN polimerasa termoestable o podría ya estar Incluida en la mezcla de reacción para llevar a cabo la etapa de amplificación mediante PCR. Dicha segunda metodología resultaría especialmente favorecida por la utilización de una ADN polimerasa termoestable químicamente modificada (u otra tecnología HotStart para inactivar la ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

polimerasa termoestable) de manera que no se encontrase completamente activa durante la etapa de TI. Un ejemplo de una ADN polimerasa termoactiva pero no termoestable con una actividad eficiente de transcripción inversa es la ADN polimerasa de Carboxydothermus hydrogenoformans (Chy; SEC ID n° 48). Ver, por ejemplo, las patentes US n° 6.468.775 y n° 6.399.320.

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa presenta una identidad de secuencias de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%, respecto a una polimerasa seleccionada de entre el grupo que consiste de:

(a) una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05) (SEC ID n° 1),

(b) una ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID n° 2),

(c) una ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi) (SEC ID n° 3),

(d) una ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfi) (SEC ID n° 4),

(e) una ADN polimerasa de Thermus sp. sps17 (Sps17) (SEC ID n° 5),

(f) una ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID n° 6),

(g) una ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tea) (SEC ID n° 7), y

(h) una ADN polimerasa de Carboxydothermus hydrogenoformans (Chy) (SEC ID n° 48).

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa de Thermotoga. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la ADN polimerasa presenta una identidad de secuencias de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%, respecto a una polimerasa seleccionada de entre el grupo que consiste de:

(a) una ADN polimerasa de Thermotoga marítima (Tma) (SEC ID n° 34),

(b) una ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne) (SEC ID n° 35).

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa presenta una Identidad de secuencias de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%, respecto a SEC ID n° 1. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05) y el aminoácido en la posición 709 es cualquier aminoácido diferente de I. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 (es decir, SEC ID n° 1), y el aminoácido en la posición 709 es cualquier aminoácido diferente de I, L o M. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 709 se selecciona de entre G, A, V, R, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K o H. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05, y el aminoácido en la posición 709 es K, R, S, G o A. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 que comprende además una sustitución en la posición 580 y el aminoácido en la posición 580 es cualquier aminoácido diferente de D o E. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 580 es cualquier aminoácido diferente de D. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05 y el aminoácido en la posición 580 se selecciona de entre el grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K.

En algunas realizaciones, la polimerasa muíante presenta una eficiencia de transcripción inversa, tolerancia a no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y los inhibidores de polimerasa incrementadas en comparación con una ADN polimerasa de control en la que el aminoácido de la ADN polimerasa termoestable correspondiente a la posición 588 de la SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de I o V, y en la que la ADN polimerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa termoestable excepto en que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 588 de la SEC ID n° 1 es I o V. En algunas realizaciones, el aminoácido de la ADN polimerasa termoestable correspondiente a la posición 588 de SEC ID n° 1 se selecciona de entre G, A, W, P, S, T, F, Y, C, N, Q, D, E, K, R, L, M o H. En algunas realizaciones, la polimerasa comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende:

Pro-Asn-Leu-Gln-Asn-Xi-Pro-X2-X3-X4-X5-X6-Gly,

en el que:

Xi es lie (I) o Leu (L),

X2 es cualquier aminoácido diferente de lie (I) o Val (V),

X3 es Arg (R) o Lys (K),

X4es Thr(T), Ser (S) o Leu (L),

Xses Pro (P) o Glu (E), y

Xees Leu (L) o Glu (E) (SEC ID n° 29).

La polimerasa muíante o mejorada puede incluir otras modificaciones no de sustitución. Una de estas modificaciones es una modificación covalente térmicamente reversible que Inactiva el enzima pero que se revierte para activar el enzima con la Incubación a una temperatura elevada, tal como una temperatura utilizada típicamente para la extensión de polinucleótidos. Los reactivos ejemplares para dichas modificaciones térmicamente reversibles se describen en las patentes US n° 5.773, 258 y 5.677.152.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En algunas realizaciones, la actividad de la transcriptasa inversa se determina llevando a cabo una amplificación mediante RT-PCR en tiempo real y la detección de un transcrito del virus de la hepatitis C (VHC) generado a partir de las primeras 800 bases del genotipo del VHC Ib 5'NTR en pSP64 poli(A) (Promega). Dos o más mezclas de reacción pueden presentar números titulados de copias del transcrito del virus de la hepatitis C (VHC) (por ejemplo titulaciones 1:5, titulaciones 1:10, por ejemplo 10.000 copias, 1.000 copias, 100 copias, 10 copias, 1 copia, 0 copias en varias mezclas de reacción). La capacidad de transcriptasa inversa de una polimerasa de la invención puede compararse con la capacidad de transcriptasa inversa de una polimerasa de referencia (por ejemplo una polimerasa no modificada o natural), en una unidad de tiempo preseleccionada, tal como se indica en la presente memoria. Las polimerasas con una capacidad de transcriptasa inversa mejorada amplificarán el transcrito con una mayor eficiencia, o requerirán un menor número de ciclos de PCR para amplificar el transcrito (es decir, mostrarán un valor de Cp más bajo, tal como se calcula en la presente memoria), en comparación con una polimerasa natural o no modificada. Además, en algunas realizaciones, las polimerasas con una función de TI mejorada también presentarán una replicación mejorada de los moldes de ARN largos (por ejemplo de por lo menos 500, 1.000, 2.000 o 5.000 o más nucleótidos de longitud).

En diversos otros aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante codificante de una ADN polimerasa mutante o mejorada tal como se describe en la presente memoria, un vector que comprende el ácido nucleico recombinante y/o una célula huésped transformada con el vector. En determinadas realizaciones el vector es un vector de expresión. Las células huésped que comprenden dichos vectores de expresión resultan útiles en métodos de la invención para producir la polimerasa mutante o mejorada mediante el cultivo de las células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico recombinante. Las polimerasas de la invención pueden encontrarse contenidas en mezclas de reacción y/o kits. Las realizaciones de los ácidos nucleicos recombinantes, células huésped, vectores, vectores de expresión, mezclas de reacción y kits son tal como se han indicado anteriormente y se indican en la presente memoria.

En todavía otro aspecto, se proporciona un método para llevar a cabo la extensión de polinucleótidos. El método incluye generalmente poner en contacto una ADN polimerasa que presenta una eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de inhibidores de polimerasa incrementadas tal como se indica en la presente memoria, con un cebador, un molde polinucleótido y nucleósidos trifosfato bajo condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido. El molde polinucleótido puede ser, por ejemplo, un molde de ARN o ADN. En determinadas realizaciones, el molde polinucleótido es de ARN. Entre los nucleósidos trifosfato pueden incluirse nucleótidos no convencionales, tales como, por ejemplo, ribonucleótidos y/o nucleótidos marcados. Además, el cebador y/o molde puede incluir uno o más análogos de nucleótido. En algunas variaciones, el método de extensión de polinucleótido es un método para la amplificación de polinucleótidos que incluye poner en contacto la ADN polimerasa mutante o mejorada con una pareja de cebadores, el molde polinucleótido y los nucleósidos trifosfato bajo condiciones adecuadas para la amplificación del polinucleótido. La reacción de extensión de polinucleótido puede ser, por ejemplo, la PCR, la extensión isotérmica o la secuenciación (por ejemplo la reacción de secuenciación de 454). En determinadas realizaciones, el método de extensión del cebador comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El molde polinucleótido puede ser de cualquier tipo de muestra biológica.

Opcionalmente, la reacción de extensión de cebador comprende un inhibidor actual o potencial de una polimerasa de referencia o no modificada. El inhibidor puede inhibir la tasa de extensión de ácidos nucleicos y/o la eficiencia de transcripción inversa de una polimerasa de referencia o no modificada (de control). En algunas realizaciones, el inhibidor es hemoglobina o un producto de degradación de la misma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el producto de degradación de la hemoglobina es un producto de degradación heme, tal como hemina, hematoporfirina o bilirrubina. En algunas realizaciones, el inhibidor es quelante de hierro o un pigmento violeta. En otras realizaciones, el inhibidor es heparina o melanina. En determinadas realizaciones el inhibidor es un pigmento intercalante. En algunas realizaciones, el pigmento intercalante es [2-[N-bis-(3-dimetilaminopropil)-amino]-4-[2,3- dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metilidén]-1-phenyl-quinolinio]+. En algunas realizaciones, el pigmento intercalante es [2-[N-bis-(3-dimetilaminopropil)-N-propilamino]-4-[2,3-dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metilidén]- 1-phenyl-quinolinio]+. En algunas realizaciones, el pigmento intercalante es [2-[N-bis-(3-dimetilaminopropil)-N- propilamino]-4-[2,3-dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metilidén]-1-phenyl-quinolinio]+. En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas para la extensión comprenden Mg+ . En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas para la extensión comprenden Mn++.

La presente invención proporciona además un kit útil en dicho método de extensión de polinucleótidos. Generalmente, el kit incluye por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa mutante o mejorada tal como se indica en la presente memoria. En determinadas realizaciones, el kit incluye además uno o más recipientes adicionales que proporcionan uno o más reactivos adicionales. Por ejemplo, en variaciones específicas, el recipiente o recipientes adicionales proporcionan nucleósidos trifosfato, un tampón adecuado para la extensión de polinucleótidos y/o uno o más polinucleótidos cebadores o de sonda, hibridables bajo condiciones de extensión de polinucleótidos, con un molde polinucleótido predeterminado. El molde polinucleótido puede ser de cualquier tipo de muestra biológica.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se proporcionan además mezclas de reacción que comprenden las polimerasas de la Invención. Las mezclas de reacción pueden contener además un ácido nucleico molde (ADN y/o ARN), uno o más polinucleótidos cebadores o de sonda, nucleósidos trifosfato (incluyendo, por ejemplo, desoxlrrlbonucleósldos trifosfato, ribonucleósldos trifosfato, nucleósidos trifosfato marcados, nucleósidos trifosfato no convencionales), tampones, sales, mareajes (por ejemplo fluoróforos). En algunas realizaciones el polinucleótido de molde es de ARN. En algunas realizaciones, las mezclas de reacción comprenden un quelante de hierro o un pigmento violeta. En determinadas realizaciones, las mezclas de reacción comprenden hemoglobina o un producto de degradación de hemoglobina. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, entre los productos de degradación de la hemoglobina se incluyen productos de degradación heme, tales como hemina, hematina, hematoporflrlna y blllrrublna. En otras realizaciones, las mezclas de reacción comprenden heparina o una sal de la misma. Opclonalmente, la mezcla de reacción comprende un pigmento intercalante (incluyendo, aunque sin limitación, los Indicados anteriormente o en otros sitios de la presente memoria). En determinadas realizaciones, la mezcla de reacción contiene un ácido nucleico molde que se aísla a partir de la sangre. En otras realizaciones, el ácido nucleico de molde es ARN y la mezcla de reacción comprende heparina o una sal de la misma.

En la presente memoria se describen realizaciones adicionales de la invención.

Definiciones

A menos que se Indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la invención, sólo se describen métodos y materiales ejemplares. Para los fines de la presente invención se definen a continuación los términos siguientes.

Las formas singulares, tales como "un", "una", "el" y "la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Un "aminoácido" se refiere a cualquier unidad monomérica que puede incorporarse en un péptido, polipéptido o proteína. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido" Incluye los veinte alfa-aminoácidos naturales o genéticamente codificados, alanina (Ala o A), arglnlna (Arg o R), asparaglna (Asn o N), ácido aspártico (Asp o D), cisterna (Cys o C), glutamina (Gln o Q), ácido glutámico (Glu o E), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (lie o I), leucina (Leu o L), Usina (Lys o K), metionina (Met o M), fenilalanina (Phe o F), prollna (Pro o P), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), trlptófano (Trp o W), tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V). En los casos en que los "X" residuos no están definidos, estos deben definirse como "cualquier aminoácido". Las estructuras de estos veinte aminoácidos naturales se muestran en, por ejemplo, Stryer et al., Biochemistry, 5a ed., Freeman and Company, 2002. Algunos aminoácidos adicionales, tales como la selenocisteína y la pirrolisina, también pueden encontrarse codificados genéticamente (Stadtman, "Selenocysteine", Annu. Rev. Biochem. 65:83-100, 1996, e Ibba et al., "Genetic code: introducing pyrrolyslne", Curr. Blol. 12(13):R464-R466, 1996). El término "aminoácido" Incluye además aminoácidos no naturales, aminoácidos modificados (por ejemplo que presentan cadenas laterales y/o esqueletos modificados) y análogos de aminoácidos. Ver, por ejemplo, Zhang et al., "Selective incorporaron of 5- hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells", Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, 2004; Anderson et al., "An expanded genetic code wlth a functional quadruplet codon", Proc. Nati. Acad. Sel. U.S.A. 101(20):7566-7571 1, 2004; Ikeda et al., "Synthesls of a novel histidine analogue and its efficient incorporaron into a protein in vivo", Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706, 2003; Chin et al., "An Expanded Eukaryotic Genetic Code", Science 301(5635):964-967, 2003; James et al. "Klnetlc characterization of ribonuclease S mutants contalnlng photoisomerizable phenylazophenylalanlne resldues", Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, 2001; Kohrer et al., "Import of amber and ochre suppressortRNAs Into mammalian cells: A general approach to site-specific insertlon of amino acid analogues into proteins", Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315, 2001; Bacher et al., "Selection and Characterization of Escherlchla collVarlants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue", J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, 2001; Hamano-Takaku et al., "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amlno Acld Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine", J. Biol. Chem. 275(51 ):40324-40328, 2000, y Budlsa et al., "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutlcally active amlno aelds", Protein Sci. 10(7): 1281-1292.

A título ilustrativo adicional, un aminoácido es típicamente un ácido orgánico que incluye un grupo amino sustituido o no sustituido, un grupo carboxi sustituido o no sustituido, y una o más cadenas laterales o grupos, o análogos de cualquiera de dichos grupos. Entre las cadenas laterales ejemplares se incluyen, por ejemplo, tiol, seleno, sulfonilo, alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hldrazlna, daño, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocícllco, enona, ¡mina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina o cualquier combinación de dichos grupos. Entre otros aminoácidos representativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, aminoácidos que comprenden entrecruzantes fotoactivables, aminoácidos de unión a metales, aminoácidos de espín marcado, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos con nuevos grupos funcionales, aminoácidos que interactúan covalente o no covalentemente con otras moléculas, aminoácidos fotoenjaulados y/o fotoisomerizables, aminoácidos radioactivos, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glucosilados, otros aminoácidos modificados con carbohidratos, aminoácidos que comprenden

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos químicamente cortables y/o fotocortables, aminoácidos que contienen azúcares unidos mediante carbonos, aminoácidos redox activos, aminoácidos que contienen aminotioácido y aminoácidos que comprenden una o más fracciones tóxicas.

La expresión "muestra biológica" comprende una diversidad de tipos de muestra obtenidos de un organismo y que pueden utilizarse en un ensayo diagnóstico o de seguimiento. La expresión comprende orina, sedimento urinario, sangre, saliva y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, tales como espécimen de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos. La expresión comprende muestras que han sido manipuladas de cualquier manera tras su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, la solubilización, la sedimentación o el enriquecimiento en determinados componentes. La expresión comprende una muestra clínica e incluye además células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, líquidos biológicos y muestras de tejido.

El término "mutante", en el contexto de las ADN polimerasas de la presente invención, se refiere a un polipéptido, típicamente recombinante, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos respecto a una ADN polimerasa funcional correspondiente.

La expresión "forma no modificada", en el contexto de una polimerasa mutante, es una expresión utilizada en la presente memoria para los fines de definir una ADN polimerasa mutante de la presente invención: la expresión "forma no modificada" se refiere a una ADN polimerasa funcional que presenta la secuencia de aminoácidos de la polimerasa mutante excepto en una o más posiciones de aminoácidos especificadas como caracterizadoras de la polimerasa mutante. De esta manera, la referencia a una ADN polimerasa mutante en términos de (a) su forma no modificada y (b) una o más sustituciones de aminoácidos especificadas, se refiere a que, con la excepción de la sustitución o sustituciones de aminoácidos especificadas, la polimerasa mutante presenta una secuencia de aminoácidos idéntica a la forma no modificada en el motivo especificado. La "polimerasa no modificada" (y por lo tanto también la forma modificada que presenta una eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de TI y de inhibidores de polimerasa incrementadas) puede contener mutaciones adicionales para proporcionar la funcionalidad deseada, por ejemplo una incorporación mejorada de dideoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, análogos de ribonucleótido, nucleótidos marcados con pigmento, modulación de la actividad de nucleasa 5', modulación de la actividad de nucleasa (o correctora de errores) 3', o similar. De acuerdo con lo anterior, al llevar a cabo la presente invención tal como se describe en la presente memoria, la forma no modificada de una ADN polimerasa se encuentra predeterminada. La forma no modificada de una ADN polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa de tipo salvaje y/o una ADN polimerasa natural, o una ADN polimerasa que ya ha sido modificada deliberadamente. Una forma no modificada de la polimerasa preferentemente es una ADN polimerasa termoestable, tal como las ADN polimerasas de diversas bacterias termofílicas, así como variantes funcionales de las mismas que presentan identidad de secuencias sustancial respecto a una polimerasa termoestable de tipo salvaje o natural. Entre dichas variantes pueden incluirse, por ejemplo, ADN polimerasas quiméricas tales como, por ejemplo, las ADN polimerasas quiméricas descritas en las patentes US n° 6.228.628 y n° 7.148.049. En determinadas realizaciones, la forma no modificada de una polimerasa presenta actividad de transcriptasa inversa (TI).

La expresión "polimerasa termoestable" se refiere a un enzima que es estable frente al calor, es resistente al calor y conserva suficiente actividad para llevar a cabo reacciones posteriores de extensión de polinucleótido y no resulta irreversiblemente desnaturalizada (inactivada) tras someterla a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para desnaturalizar ácidos nucleicos de doble cadena. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de los ácidos nucleicos son bien conocidas de la técnica y se ejemplifican en, por ejemplo, las patentes US n° 4.683.202, n° 4.683.195 y n° 4.965.188. Tal como se utiliza en la presente memoria, una polimerasa termoestable resulta adecuada para la utilización en una reacción de ciclado térmico, tal como la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). La desnaturalización irreversible para los fines de la presente memoria se refiere a una pérdida permanente y completa de la actividad enzimática. Para una polimerasa termoestable, "actividad enzimática" se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos de la manera correcta para formar productos de extensión de polinucleótido que son complementarios a una cadena molde de ácidos nucleicos. Entre las ADN polimerasas termoestables procedentes de bacterias termofílicas se incluyen, por ejemplo, las ADN polimerasas de Thermotoga marítima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus species Sps17, Thermus species Z05, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho afrícanus

El término "termoactivo" se refiere a un enzima que mantiene las propiedades catalíticas a temperaturas utilizadas comúnmente para las etapas de transcripción inversa o hibridación/extensión en las reacciones de RT-PCR y/o PCR (es decir, 45°C a 80°C). Los enzimas termoestables son aquellos que no resultan irreversiblemente inactivados o desnaturalizados al someterlos a las temperaturas elevadas necesarias para la desnaturalización de los ácidos nucleicos. Los enzimas termoactivos pueden ser o no termoestables. Las ADN polimerasas termoactivas pueden ser dependientes de ADN o ARN de especies termofílicas o de especies mesofílicas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, Escheríchia coli, virus de la leucemia murina de Moloney y virus de la mioblastosis aviar.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tal como se utiliza en la presente memoria, una proteína "quimérica" se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos representa un producto de fusión de subsecuencias de las secuencias de aminoácidos de por lo menos dos proteínas diferentes. Una proteína quimérica típicamente no se produce mediante manipulación directa de las secuencias de aminoácidos sino que, por el contrario, se expresa a partir de un gen "quimérico" que codifica la secuencia de aminoácidos quimérica. En determinadas realizaciones, por ejemplo, una forma no modificada de una ADN polimerasa mutante de la presente invención es una proteína quimérica que consiste de una región aminoterminal (N-terminal) derivada de una ADN polimerasa de una especie de Thermus y una región carboxiterminal (C-termlnal) derivada de la ADN polimerasa Tma. La región N-terminal se refiere a una región que se extiende entre el extremo N-terminal (posición aminoácida 1) y un aminoácido interno. De manera similar, la región C-terminal se refiere a una región que se extiende desde un aminoácido interno y el extremo C-terminal.

El término "aptámero" se refiere a un ADN de cadena sencilla que reconoce y se une a la ADN polimerasa e inhibe eficientemente la actividad de la polimerasa, tal como se describe en la patente US n° 5.693.502. La utilización de aptámeros y dUTP/UNG en la RT-PCR también se comenta en, por ejemplo, Smith E.S. et al. (Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, en: PCR Primer: A Laboratory Manual, 2a edición, Dieffenbach C.W. y Dveksler G.S., editor, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York, 211-219, 2003).

En el contexto de las ADN polimerasas mutantes, "correspondencia" con otra secuencia (por ejemplo regiones, fragmentos, posiciones de nucleótidos o aminoácidos, o similares) se basa en la convención de numerar las posiciones de los nucleótidos o aminoácidos y posteriormente alinear las secuencias de manera que se maximice el porcentaje de identidad de las secuencias. Un aminoácido "correspondiente a la posición [X] de [secuencia específica]" se refiere a un aminoácido en un polipéptido de interés que se alinea con el aminoácido equivalente de una secuencia especificada. Generalmente, tal como se indica en la presente memoria, el aminoácido correspondiente a una posición de una polimerasa puede determinarse utilizando un algoritmo de alineación tal como BLAST, tal como se indica posteriormente. Debido a que no todas las posiciones dentro de una "región correspondiente" dada necesitan ser idénticas, las posiciones no correspondientes dentro de una región correspondiente pueden considerarse "posiciones correspondientes". De acuerdo con lo anteriormente expuesto, tal como se utiliza en la presente memoria, la referencia a una "posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido [X]" de una ADN polimerasa especificada se refiere a posiciones equivalentes, basadas en la alineación, en otras ADN polimerasas y homólogos y familias estructurales. En algunas realizaciones de la presente invención, la "correspondencia" de las posiciones de aminoácidos se determina con respecto a una región de la polimerasa que comprende uno o más motivos de SEC ID n° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 48. En el caso de que una secuencia de polipéptidos de una polimerasa difiera de SEC ID n° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 48 (por ejemplo por cambios en los aminoácidos o la adición o deleción de aminoácidos), puede ser que una mutación particular asociada a la actividad mejorada tal como se comenta en la presente memoria no se encontrará en el mismo número de posición que en SEC ID n° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 48. Lo anterior se ilustra en, por ejemplo, la Tabla 1.

El término "recombinante", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que ha sido modificada deliberadamente mediante métodos recombinantes. La expresión "ácido nucleico recombinante" en la presente memoria se refiere a un ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, mediante la manipulación de un ácido nucleico por parte de endonucleasas, para producir una forma no observada normalmente en la naturaleza. De esta manera, un ácido nucleico aislado de ADN polimerasa mutante, en una forma lineal, o un vector de expresión formando in vitro mediante el ligamiento de moléculas de ADN que normalmente no se encuentran unidas, se consideran ambas recombinantes para los fines de la presente invención. Se entiende que una vez se ha preparado un ácido nucleico recombinante y se ha reintroducido en una célula huésped, se replicará de manera no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped y no mediante manipulaciones in vitro\ sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez se han producido recombinantemente, aunque posteriormente se repliquen no recombinantemente, todavía se consideran recombinantes para los fines de la invención. Una "proteína recombinante" es una proteína generada utilizando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante tal como se ha ilustrado anteriormente.

Un ácido nucleico se encuentra “operablemente ligado” en el caso de que se encuentre en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o un intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecte a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se encuentre posicionado de manera que facilite la traducción.

La expresión "célula huésped" se refiere a organismos unicelulares tanto procarióticos como eucarióticos (por ejemplo bacterias, levaduras y actinomicetos) y células individuales de plantas o animales de orden superior cultivados en cultivo celular.

El término "vector" se refiere a un trozo de ADN, típicamente de doble cadena, en el que puede haberse insertado un trozo de ADN foráneo. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

polinucleótidas de "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula huésped. El ADN foráneo se define como ADN heterólogo, que es ADN no presente naturalmente en la célula huésped, que, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica un marcador seleccionable o cribable, o codifica para un transgén. El vector se utiliza para transportar el ADN foráneo o heterólogo al interior de una célula huésped adecuada. Una vez dentro de la célula huésped, el vector puede replicarse independientemente o concurrentemente con el ADN cromosómico del huésped, y pueden generarse varias copias del vector y su ADN insertado. Además, el vector puede contener además los elementos necesarios que permiten la transcripción del ADN insertado para formar una molécula de ARNm o de otro modo provocar la replicación del ADN insertado en múltiples copias de ARN. Algunos vectores de expresión adicionalmente contienen elementos de secuencia contiguos al ADN insertado que incrementan la semivida del ARNm expresado y/o permiten la traducción del ARNm en una molécula de proteína. De esta manera, pueden sintetizarse rápidamente muchas moléculas de ARNm y del polipéptido codificado por el ADN insertado.

El término "nucleótido", además de referirse a los monómeros ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos naturales, en la presente memoria se entenderá que se refiere a variantes estructurales relacionadas de los mismos, incluyendo derivados y análogos, que son funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el que se está utilizando el nucleótido (por ejemplo la hibridación con una base complementaria), a menos que el contexto Indique claramente lo contrario.

La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero que puede ser correspondiente de un ácido nucleico de ribosa (ARN) o un polímero ácido nucleico de desoxirribosa (ADN), o un análogo de los mismos. Lo anterior incluye polímeros de nucleótidos, tales como ARN y ADN, así como formas sintéticas, formas modificadas (por ejemplo química o bioquímicamente modificadas) de las mismas, y polímeros mixtos (por ejemplo subunidades de tanto ARN como ARN, entre otros). Entre las modificaciones ejemplares se incluyen metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas, tales como enlaces no cargados (por ejemplo metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos y similares), fracciones colgantes (por ejemplo polipéptidos), intercalantes (por ejemplo acridina, psoralén y similares), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos alfa-anoméricos y similares). También se encuentran incluidas moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada, mediante enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Típicamente, los monómeros nucleótidos se encuentran unidos mediante enlaces fosfodiéster, aunque las formas sintéticas de ácidos nucleicos pueden comprender otros enlaces (por ejemplo ácidos péptido-nucleicos tal como se indica en Nielsen etal. (Science 254:1497-1500, 1991). Un ácido nucleico puede ser o puede incluir, por ejemplo, un cromosoma o segmento cromosómico, un vector (por ejemplo un vector de expresión), un casete de expresión, un polímero de ADN o ARN desnudo, el producto de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un oligonucleótido, una sonda y un cebador. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, de cadena sencilla, de doble cadena o de triple cadena, y no se encuentra limitado a ninguna longitud en particular. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos opcionalmente comprende o codifica secuencias complementarlas, además de cualquier secuencia indicada explícitamente.

El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que Incluye por lo menos dos unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo nucleótidos). Un oligonucleótido típicamente Incluye entre aproximadamente seis y aproximadamente 175 unidades monoméricas de ácidos nucleicos, más típicamente entre aproximadamente ocho y aproximadamente 100 unidades monoméricas de ácidos nucleicos, y todavía más típicamente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35 o más unidades monoméricas de ácidos nucleicos). El tamaño exacto de un oligonucleótido depende de muchos factores, Incluyendo la función última o utilización del oligonucleótido. Los ollgonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, el aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicación o amplificación del ADN, la transcripción inversa, la clonación y la digestión de restricción de secuencias apropiadas, o la síntesis química directa mediante un método tal como el método de fosfotriéster de Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979), el método de fosfodiéster de Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979), el método de dietilfosforamidlta de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:1859- 1862, 1981); el método de triéster de Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981); los métodos de síntesis automatizada, o el método de soporte sólido de la patente US n° 4.458.066, u otros métodos conocidos por el experto en la materia.

El término "cebador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polinucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ácidos nucleicos dirigida por molde en caso de encontrarse bajo condiciones en que se Inicia la extensión del polinucleótido (por ejemplo bajo condiciones que comprenden la presencia de los nucleósldos trifosfato necesarios (tal como dicta el molde que se copla) y una polimerasa en un tampón apropiado y a una temperatura o ciclo o ciclos de temperatura adecuados (por ejemplo tal como en una reacción en cadena de polimerasa)). A título Ilustrativo adicional, los cebadores también pueden utilizarse en una diversidad de otros procedimientos de síntesis mediados por oligonucleótidos, incluyendo como iniciadores de la síntesis de ARN de novo y en procedimientos in vitro relacionados con la transcripción (por ejemplo la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (ABSAN), la amplificación mediada por la transcripción (AMT), etc.). Un cebador es típicamente un oligonucleótido de cadena sencilla (por ejemplo un oilgodesoxlrrlbonucleótido). La longitud apropiada de un cebador depende de la utilización pretendida del cebador, aunque típicamente se encuentra comprendida

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

entre 6 y 40 nucleótidos, más típicamente entre 15 y 35 nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas generalmente requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no debe reflejar necesariamente la secuencia exacta del molde, pero debe ser suficientemente complementario para hibridarse con un molde para que se produzca la elongación del cebador. En determinadas realizaciones, la expresión "pareja de cebadores" se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador de sentido 5' (en ocasiones denominado "directo") que se hibrida con el complemento del extremo 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que debe amplificarse, y un cebador antisentido 3' (en ocasiones denominado "inverso") que se hibrida con el extremo 3' de la secuencia que debe amplificarse (por ejemplo en el caso de que la secuencia diana se exprese como ARN o sea un ARN). Un cebador puede marcarse, si se desea, mediante la incorporación de un mareaje detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, entre los mareajes útiles se incluyen 32P, pigmentos fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (tales como los utilizados comúnmente en los ensayos de ELISA), biotina o haptenos y proteínas para los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales.

El término "convencional" o "natural" en referencia a bases de ácidos nucleicos, nucleósidos trifosfato o nucleótidos se refiere a aquellos presentes naturalmente en el polinucleótido que se describe (es decir, para el ADN son dATP, dGTP, dCTP y dTTP). Además, se utilizan frecuentemente dITP y 7-deaza-dGTP en lugar de dGTP, y 7-deaza-dATP puede utilizarse en lugar de dATP en reacciones de síntesis de ADN in vitro, tales como la secuenciación. Colectivamente pueden denominarse dNTP.

La expresión "no convencional" o "modificado" en referencia a una base de ácidos nucleicos, nucleósido o nucleótido incluye las modificaciones, derivaciones o análogos de bases convencionales, nucleósidos o nucleótidos que se observan naturalmente en un polinucleótido particular. Determinados nucleótidos no convencionales se encuentran modificados en la posición 2' del azúcar ribosa en comparación con los dNTP convencionales. De esta manera, aunque para el ARN los nucleótidos naturales son ribonucleótidos (es decir, ATP, GTP, CTP, UTP, colectivamente rNTP), debido a que estos nucleótidos presentan un grupo hidroxilo en la posición 2' del azúcar que, a título comparativo, se encuentra ausente en los dNTP, tal como se utiliza en la presente memoria, los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales como sustratos para las ADN polimerasas. Tal como se utiliza en la presente memoria, entre los nucleótidos no convencionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, compuestos utilizados como terminadores para la secuenciación de ácidos nucleicos. Entre los compuestos terminadores ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, compuestos que presentan una estructura de 2',3'-dideoxi y se denominan dideoxinucleósidos trifosfato. Los dideoxinucleósidos trifosfato ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se denominan colectivamente ddNTP. Entre los ejemplos adicionales de compuestos terminadores se incluyen análogos 2-PO4 de ribonucleótidos (ver, por ejemplo, las solicitudes publicadas de patente US n° 2005/0037991 y n° 2005/0037398). Entre otros nucleótidos no convencionales se incluyen los dNTP fosforioato ([a-S]dNTP), los dNTP 5’-[a]-borano, los dNTP [a]-met¡l-fosfonato y los ribonucleósidos trifosfato (rNTP). Las bases no convencionales pueden marcarse con isótopos radioactivos tales como 32P, 33P o 35S, mareajes fluorescentes, mareajes quimioluminiscentes, mareajes bioluminiscentes, mareajes haptenos tales como biotina, o mareajes enzimáticos tales como estreptavidina o avidina. Entre los mareajes fluorescentes pueden incluirse pigmentos con carga negativa, tales como pigmentos de la familia de la fluoresceína, o pigmentos de carga neutra, tales como pigmentos de la familia de la rodamina, o pigmentos con carga positiva, tales como los pigmentos de la familia de la cianina. Entre los pigmentos de la familia de la fluoresceína se incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Entre los pigmentos de la familia de la rodamina se incluyen rojo Texas, ROX, R110, R6Gy TAMRA. Diversos pigmentos o nucleótidos marcados con FAM, FIEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, rojo Texas y TAMRA son comercializados por Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) o Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR). Entre los pigmentos de la familia de la cianina se incluyen Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 y son comercializados por GE Flealthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad de secuencias" se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se observa una base de ácidos nucleicos o residuo aminoácido idéntico en ambas secuencias, rindiendo el número de posiciones correspondientes, dividiendo el número de posiciones correspondientes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el número por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias.

Los términos "idéntico" y porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" en el caso de que presenten un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos aminoácidos que son iguales (por ejemplo por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad en una región especificada), al comparar y alinear para la máxima correspondencia en una ventana de comparación o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante alineación manual e inspección visual. Las secuencias son "sustancialmente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

idénticas" entre sí en el caso de que sean por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50% o por lo menos 55% idénticas. Estas definiciones también se refieren al complemento de una secuencia de ensayo. Opclonalmente, la identidad existe en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótldos, o más típicamente en una región de 100 o 500 o 1.000 o más nucleótidos de longitud.

Las expresiones "similitud" o "porcentaje de similitud" en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan un porcentaje especificado de residuos aminoácidos que son ¡guales o similares según definen las sustituciones conservadoras de aminoácidos (por ejemplo una similitud de 60%, opcionalmente similares al 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% en una región especificada), al compararse y alinearse para la máxima correspondencia en una ventana de comparación o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguiente, o mediante alineación manual e inspección visual. Las secuencias son "sustancialmente similares" entre sí en el caso de que sean por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50% o por lo menos 55% similares entre sí. Opcionalmente, esta similitud existe en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos, o más típicamente en una región de por lo menos aproximadamente 100 a 500 o 1.000 o más aminoácidos de longitud.

Para la comparación entre secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con las que se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se fijan las coordenadas de la subsecuencia, en caso necesario, y se fijan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Habitualmente se utilizan los parámetros por defecto del programa, o pueden fijarse parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades o similitudes de secuencia para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de cualquiera de entre varias posiciones contiguas seleccionadas de entre el grupo que consiste de entre 20 y 600, habitualmente de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200, más habitualmente de entre aproximadamente 100 y aproximadamente 150, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas tras la alineación óptima de las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos de la técnica. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970), mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988), mediante implementaciones computerizadas de dichos algoritmos (por ejemplo GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete Wisconsin Genetlcs Software, Genetlcs Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols ¡n Molecular Biology (suplemento de 1995)).

Un ejemplo de un algoritmo que resulta adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y de similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales han sido descritos en Altschul et al. (Nuc. Aclds Res. 25:3389-402, 1977), y en Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990), respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis de BLAST se encuentra disponible públicamente a través del National Center for Blotechnology Information (
http://www.ncbl.nlm.nlh.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar las parejas de secuencias de alta puntuación (PAP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta que corresponden o satisfacen alguna puntuación umbral T de valor positivo estando alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos resultados Iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas de PAP más largas que las contengan. Los resultados de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda incrementarse la puntuación acumulada de alineación. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de premio para una pareja de residuos correspondientes, siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no correspondientes, siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los resultados de palabras en cada dirección se detiene en el caso de que: la puntuación acumulada de alineación caiga en una cantidad X respecto al valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada vaya a cero o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuaciones negativas, o se alcance el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra de 3 y un valor esperado (E) de 10, y la matriz de puntuaciones BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sel. USA 89:10915, 1989) alineaciones (B) de 50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El algoritmo BLAST realiza además un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlln y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se produzca por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia en el caso de que la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia sea inferior a aproximadamente 0,2, típicamente inferior a aproximadamente 0,01, y más típicamente inferiora aproximadamente 0,001.

La expresión "eficiencia de transcripción inversa" se refiere a la fracción de moléculas de ARN que son transcritas inversamente como ADNc en una reacción dada de transcripción inversa. En determinadas realizaciones, las ADN pollmerasas mutantes de la Invención presentan eficiencias de transcripción inversa mejoradas respecto a las formas no modificadas de dichas ADN polimerasas. Es decir, dichas ADN polimerasas mutantes transcriben inversamente una fracción más elevada de moldes de ARN que sus formas no modificadas bajo un conjunto particular de condiciones de reacción. La eficiencia de la transcripción Inversa puede medirse, por ejemplo, mediante la medición del punto de cruce (Pe) de una reacción de PCR con un molde de ARN y comparando el valor de Pe con un valor de Pe de una reacción de control en la que un molde de ADN de la misma secuencia (excepto en que las U han sido sustituidas porT) ha sido amplificado, en el que las amplificaciones del ARN y del ADN utilizan un conjunto común de cebadores y la misma polimerasa, por ejemplo tal como se Indica en los ejemplos. Una pollmerasa de ensayo presenta una eficiencia de TI mejorada en el caso de que la pollmerasa de ensayo presente un valor de Pe reducido en comparación con una polimerasa de control en el caso de que se utilice ARN como molde, pero que presenta un valor de Pe sustanclalmente no modificado respecto a la pollmerasa de control en el caso de que se utilice ADN como molde. En algunas realizaciones una polimerasa de la Invención presenta una eficiencia de TI mejorada, de manera que la Pe es por lo menos una, dos, tres, cuatro o cinco unidades inferior a la pollmerasa de control correspondiente en el molde de ARN.

La expresión "tolerancia a las no correspondencias" se refiere a la capacidad de una polimerasa de tolerar una secuencia que contiene una no correspondencia durante la extensión de un ácido nucleico (por ejemplo un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente del molde mediante la unión (por ejemplo covalente) de uno o más nucleótidos al ácido nucleico. La expresión "tolerancia a las no correspondencias 3"' se refiere a la capacidad de una polimerasa de tolerar una secuencia (prácticamente complementaria) que contiene una no correspondencia en la que el ácido nucleico que debe extenderse (por ejemplo un cebador u otro oligonucleótido) presenta una no correspondencia respecto a su molde en el nucleótido 3'-terminal del cebador. Las no correspondencias respecto al molde también pueden estar localizadas en el penúltimo nucleótido 3' del cebador, o en otra posición en la secuencia del cebador.

La expresión "discriminación de las no correspondencias" se refiere a la capacidad de una polimerasa de distinguir una secuencia totalmente complementaria de una secuencia que contiene una no correspondencia durante la extensión de un ácido nucleico (por ejemplo un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente del molde mediante la unión (por ejemplo covalente) de uno o más nucleótidos al ácido nucleico. La expresión "discriminación de no correspondencias 3"' se refiere a la capacidad de una polimerasa de distinguir una secuencia totalmente complementaria de una secuencia (prácticamente complementaria) que contiene una no correspondencia en la que el ácido nucleico que debe extenderse (por ejemplo un cebador u otro oligonucleótido) presenta una no correspondencia en el nucleótido 3'-terminal del ácido nucleico en comparación con el molde con el que se híbrida el ácido nucleico. La expresión "no correspondencia" se refiere a la existencia de uno o más desapareamientos de bases (o "oposiciones no complementarias de bases") dentro de un tramo de secuencias formadoras de dúplex (o potencialmente formadoras de dúplex) de otro modo complementarias.

La expresión "valor Pe" o valor de "punto de cruce" se refiere a un valor que permite la cuantificación de los ácidos nucleicos diana de entrada. El valor Cp puede determinarse según el método de máximo de segunda derivada (Van Luu-The et al., "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction", BioTechniques, vol. 38, n° 2, febrero de 2005, páginas 287-293). En el método de la segunda derivada, un valor de Cp corresponde al primer pico de una curva de segunda derivada. Este pico corresponde al inicio de una fase log-lineal. El método de segunda derivada calcula un valor de segunda derivada de la curva de intensidad de fluorescencia en tiempo real y únicamente se obtiene un valor. El método de Pe original se basa en una aproximación diferenciable definida localmente de los valores de intensidad, por ejemplo mediante una función polinómica. A continuación se calcula la tercera derivada. El valor de Cp es la raíz más pequeña de la tercera derivada. El valor de Cp también puede determinarse utilizando el método de punto de ajuste, en el que se determina el valor de Cp como la intersección de una línea paralela a la línea umbral en la región log-lineal (Van Luu-The et al., BioTechniques, vol. 38, n° 2, febrero de 2005, páginas 287-293). El valor de Pe proporcionado por el instrumento LightCycler ofrecido por Roche mediante el cálculo según el método del máximo de la segunda derivada.

La expresión "eficiencia de PCR" se refiere a una indicación de la eficiencia de amplificación ciclo a ciclo. La eficiencia de la PCR se calcula para cada condición utilizando la ecuación: % de eficiencia de la PCR = (io('pendiente)- 1) x 100, en la que la pendiente se calcula mediante regresión lineal con el log número de copia representado en el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

eje y, y representado en el eje x. La eficiencia de la PCR puede medirse utilizando un molde de cebador perfectamente correspondiente o con una o más no correspondencias.

La expresión "tasa de extensión de ácidos nucleicos" se refiere a la tasa a la que un biocatalizador (por ejemplo un enzima, tal como una polimerasa, ligasa o similar) extiende un ácido nucleico (por ejemplo un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente o independiente del molde mediante la unión (por ejemplo covalentemente) de uno o más nucleótidos al ácido nucleico. A título ilustrativo, determinadas ADN polimerasas mutantes descritas en la presente memoria presentan tasas de extensión de ácidos nucleicos mejoradas respecto a las formas no modificadas de dichas ADN polimerasas, de manera que pueden extender cebadores a tasas más altas que dichas formas no modificadas bajo un conjunto dado de condiciones de reacción.

La expresión "tolerancia de la TI e inhibidores de la polimerasa" se refiere a la capacidad de una polimerasa de mantener la actividad (actividad de polimerasa o de transcripción inversa) en presencia de una cantidad de un inhibidor que inhibiría la actividad de polimerasa o la actividad de transcripción inversa de una polimerasa de control. En algunas realizaciones, la polimerasa mejorada es capaz de actividad de polimerasa o de transcripción inversa en presencia de una cantidad del inhibidor que esencialmente eliminaría la actividad de la polimerasa de control. Una "polimerasa de control" se refiere a una polimerasa que comprende una isoleucina (I) correspondiente a la posición 709 de SEC ID n° 1 pero que, de otro modo, es idéntica a la polimerasa mejorada.

La expresión "sonda de nucleasa 5"' se refiere a un oligonucleótido que comprende por lo menos una fracción de mareaje emisora de luz y que se utiliza en una reacción de nucleasa 5' para llevar a cabo la detección del ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, por ejemplo, una sonda de nucleasa 5' incluye únicamente una sola fracción emisora de luz (por ejemplo un pigmento fluorescente, etc.). En determinadas realizaciones, una sonda de nucleasa 5' incluye regiones de autocomplementariedad de manera que las sondas son capaces de formar estructuras de horquilla bajo condiciones seleccionadas. A título ilustrativo adicional, en algunas realizaciones una sonda de nucleasa 5' comprende por lo menos dos fracciones de mareaje y emite radiación de intensidad creciente después de que uno de los dos mareajes se escinda o de otro modo se separe del oligonucleótido. En determinadas realizaciones, se marca una sonda de nucleasa 5' con dos pigmentos fluorescentes diferentes, por ejemplo un pigmento informador en el extremo 5' y el pigmento o fracción inhibidor en el extremo 3'. En algunas realizaciones, las sondas de nucleasa 5' se marcan en una o más posiciones aparte de, o además de, las posiciones terminales. En el caso de que la sonda se encuentre intacta, la transferencia de energía típicamente ocurre entre los dos fluoróforos, de manera que la emisión fluorescente del pigmento informador resulta inhibida por lo menos en parte. Durante una etapa de extensión de una reacción en cadena de polimerasa, por ejemplo, una sonda de nucleasa 5' unida a un ácido nucleico molde se escinde por la actividad de nucleasas 5' a 3' de, por ejemplo, una polimerasa Taq u otra polimerasa que presente dicha actividad, de manera que la emisión fluorescente del pigmento Informador ya no se encuentra inhibida. También se describen sondas de nucleasa 5' ejemplares en, por ejemplo, las patentes US n° 5.210.015, n° 5.994.056 y n° 6.171.785. En otras realizaciones, una sonda de nucleasa 5' puede marcarse con dos o más pigmentos informadores diferentes y un pigmento o fracción inhibidora 3'-termlnal.

El término "FRET" o "transferencia de energía de resonancia fluorescente" o "transferencia de energía de resonancia de Foerster" se refiere a una transferencia de energía entre por lo menos dos cromóforos, un cromóforo donante y un cromóforo aceptor (denominado inhibidor). El donante típicamente transfiere la energía al aceptor cuando el donante es excitado por radiación lumínica de una longitud de onda adecuada. El aceptor típicamente reemlte la energía transferida en forma de radiación lumínica con una longitud de onda diferente. En el caso de que el aceptor sea un inhibidor "oscuro", disipa la energía transferida en una forma que no es luz. Que un fluoróforo particular actúe como donante o aceptor depende de las propiedades del otro elemento de la pareja FRET. Entre las parejas de donante-aceptor utilizadas comúnmente se incluyen la pareja FAM-TAMRA. Son inhibidores utilizados comúnmente, DABCILO y TAMRA. Entre los inhibidores oscuros utilizados comúnmente se incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), lowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, lowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra una alineación de secuencias de aminoácidos de una región del dominio de polimerasa de ADN polimerasas ejemplares de diversas especies de bacterias: Thermus especie Z05 (Z05) (SEC ID n° 12), Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID n° 13), Thermus filiformus (Tfi) (SEC ID n° 14), Thermus flavus (Tfl) (SEC ID n° 15), Thermus species sps17 (Sps17) (SEC ID n° 16), Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID n° 17), Thermus caldophilus (Tea) (SEC ID n° 18), Thermotoga marítima (Tma) (SEC ID n° 19), Thermotoga neopoütana (Tne) (SEC ID n° 20), Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID n° 21), Deinococcus radiodurans (Dra) (SEC ID n° 23), Bacillus stearo- thermophilus (Bst) (SEC ID n° 24) y Bacillus caidotenax (Boa) (SEC ID n° 25). Además, las regiones polipeptídicas mostradas comprenden el motivo de aminoácidos X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-G-Y-V-X14-T-L (SEC ID n° 26), las posiciones variables del cual se definen adicionalmente en la presente memoria. Este motivo se subraya en negrita para cada secuencia de polimerasa. Las posiciones de aminoácidos que pueden mutar según la presente invención se indican con un asterisco (*). Los huecos en las alineaciones se indican con un punto (.).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La figura 2 proporciona las identidades de secuencia entre los enzimas ADN polimerasa I siguientes: ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05), ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi), ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl), ADN polimerasa sps17 de Thermus sp. (Sps17), ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tea), ADN polimerasa de Deinococcus radiodurans (Dra), ADN polimerasa de Thermotoga marítima (Tma), ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne), ADN polimerasa de Thermosipho afrícanus (Taf), ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Bst) y ADN polimerasa de Bacillus caidotenax (Boa). (A) identidades de secuencia a lo largo del enzima polimerasa I entero (correspondiente a los aminoácidos 1 a 834 de Z05), y (B) identidades de secuencia a lo largo del subdominio de polimerasa correspondiente a los aminoácidos 420 a 834 de Z05.

La figura 3 proporciona las identidades de secuencia entre los enzimas ADN polimerasa I de Thermus sp. siguientes: ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (Z05), ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi), ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl), ADN polimerasa Sps17 de Thermus sp., ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) y ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tea). (A) identidades de secuencia a lo largo del enzima polimerasa I entero (correspondiente a los aminoácidos 1 a 834 de Z05), y (B) identidades de secuencia a lo largo del subdominio de polimerasa correspondiente a los aminoácidos 420 a 834 de Z05.

Descripción detallada

La presente invención proporciona ADN polimerasas mejoradas en las que se uno o más aminoácidos en el dominio de polimerasa han mutado respecto a una ADN polimerasa funcional. Las ADN polimerasas de la invención son enzimas activos que presentan una eficiencia incrementada de transcriptasa inversa (por ejemplo en presencia de cationes divalentes Mn2+ y Mg2+) respecto a la forma no modificada de la polimerasa y/o una tolerancia a no correspondencias, tasa de extensión y tolerancia de TI e inhibidores de polimerasa incrementadas. En determinadas realizaciones, las ADN polimerasas mutantes pueden utilizarse a concentraciones más bajas para un rendimiento superior o equivalente al de los enzimas parentales.

Las ADN polimerasas que llevan a cabo más eficientemente la transcripción inversa resultan útiles en, por ejemplo, una diversidad de aplicaciones que implican ensayos con RT-PCR para la detección y/o la cuantificación de dianas de ARN. Por lo tanto, las ADN polimerasas resultan útiles en una diversidad de aplicaciones que implican la extensión de polinucleótidos, así como la transcripción o la amplificación de moldes polinucleótidos, Incluyendo, por ejemplo, aplicaciones en estudios de ADN recombinante y el diagnóstico médico de enfermedades. Las ADN polimerasas mutantes también resultan particularmente útiles gracias a su tolerancia a las no correspondencias, para la detección de dianas que posiblemente presentan secuencias variables (por ejemplo dianas víricas o cáncer y otros marcadores genéticos de enfermedad).

Las ADN polimerasas de la Invención pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente:

Xi -X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-Gly-T yr-Val-Xi 4-Thr-Leu

(también denominados en la presente memoria con el código de una letra: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12- X13-G-Y-V-X14-T-L) (SEC ID n° 8), en el que:

XI es Ala (A), Asp (D), Ser (S), Glu (E), Arg (R) o Gln (Q),

X2 es Trp (W) o Tyr (Y),

X3 es cualquier aminoácido diferente de lie (I), Leu(L) o Met (M),

X4 es Glu (E), Ala (A), Gln (Q), Lys (K), Asn (N) o Asp (D),

X5 es Lys (K), Gly (G), Arg (R), Gln (Q), Hls (H) o Asn (N),

Xe es Thr (T), Val (V), Met (M) o lie (I),

X7 es Leu (L), Val (V) o Lys (K),

Xs es Glu (E), Ser (S), Ala (A), Asp (D) o Gln (Q),

Xg es Glu (E) o Phe (F),

X10 es Gly (G) o Ala (A),

XII es Arg (R) o Lys (K),

X12 es Lys (K), Arg (R), Glu (E), Thr (T) o Gln (Q),

X13 es Arg (R), Lys (K) o His (H), y X14 es Glu (E), Arg (R) o Thr (T).

En algunas realizaciones, X3 se selecciona de entre G, A, W, P, S, T, F, Y, C, N, Q, D, E, K, V, R o H.

En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la Invención pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente:

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-GI u-Xi 0-X11-X12-X13-G ly-T yr-Val-Xai 4-Thr-Leu

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(también denominado en la presente memoria con el código de una letra: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-EX10-X11-X12-X13- G-Y-V-X14-T-L) (SEC ID n° 9), en el que:

XI es Ala (A), Asp (D) o Ser (S),

X2 es Trp (W) o Tyr (Y),

X3 es cualquier aminoácido diferente de lie (I),

X4 es Glu (E), Ala (A) o Gln (Q),

X5 es Lys (K), Gly (G), Arg (R) o Gln (Q),

X6 es Thr (T) o Val (V),

X7 es Leu (L) o Val (V),

X8es Glu(E), Ser (S) o Ala (A),

X10 es Gly (G) o Ala (A),

XII es Arg (R) o Lys (K),

X12 es Lys (K), Arg (R) o Glu (E),

X13 es Arg (R) o Lys (K), y X14 es Glu (E) o Arg (R).

En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la invención pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente:

Ala-Trp-X3-X4-X5-Thr-Leu-Glu-Glu-Gly-Arg-Xi2-Xi3-Gly-Tyr-Val-Glu-Thr-Leu

(también denominado en la presente memoria con el código de una letra: A-W-X3-X4-X5-T-L-E-E-G-R-X12-X13-G-Y-V- E-T-L) (SEC ID n° 10), en el que:

X3 es cualquier aminoácido diferente de lie (I),

X4 es Glu (E) o Ala (A),

X5 es Lys (K) o Gly (G),

X12 es Lys (K) o Arg (R), y X13 es Arg (R) o Lys (K).

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa que comprende el motivo de SEC ID n° 9 o SEC ID n° 10 no es SEC ID n° 2. En algunas realizaciones, el aminoácido correspondiente a la posición X3 de SEC ID n° 9 o SEC ID n° 10 es cualquier aminoácido diferente de Leu (L).

En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la invención pueden caracterizarse porque presentan el motivo siguiente:

Ala-Trp-X3-X4-X5-Thr-Leu-Glu-Glu-Gly-Arg-Xi2-Xi3-Gly-Tyr-Val-Glu-Thr-Leu

(también denominado en la presente memoria con el código de una letra: A-W-X3-X4-X5-T-L-E-E-G-R-X12-X13-G-Y-V- E-T-L) (SEC ID n° 11), en el que:

X3 es Lys (K), Arg (R), Ser (S), Gly (G) o Ala (A),

X4 es Glu (E) o Ala (A),

X5 es Lys (K) o Gly (G),

X12 es Lys (K) o Arg (R), y X13 es Arg (R) o Lys (K).

Este motivo se encuentra presente en el dominio de "dedos" de muchas ADN polimerasas dependientes de ADN de familia A, particularmente las ADN polimerasas termoestables de bacterias termofílicas (Li et al., EMBO J. 17:7514- 7525, 1998). Por ejemplo, la figura 1 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de una región del dominio de "dedos" de las ADN polimerasas de varias especies de bacteria: Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Thermosipho africanus, Thermotoga marítima, Thermotoga neopolitana, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus filiformus, Thermus flavus, Thermus sp. sps17, Thermus sp. Z05 y Thermus thermophilus. Tal como se muestra, la secuencia nativa correspondiente al motivo anteriormente indicado se encuentra presente en cada una de dichas polimerasas, indicando una función conservada de esta región de la polimerasa. La figura 2 proporciona identidades de secuencia entre dichas ADN polimerasas.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una polimerasa que comprende SEC ID n° 8, 9, 10 o 11, que presenta la actividad y/o las características mejoradas indicadas en la presente memoria, y en la que la ADN polimerasa de otro modo es una ADN polimerasa de tipo salvaje o natural, tal como, por ejemplo, una polimerasa de cualquiera de las especies de bacterias termofílicas listadas anteriormente, o es sustancialmente idéntica a dicha ADN polimerasa de tipo salvaje o natural. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la polimerasa de la invención comprende SEC ID n° 8, 9, 10 o 11 y es idéntica por lo menos al 80%, 85%, 90% o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

95% respecto a SEC ID n° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 48. En una variación, la forma no modificada de la polimerasa es una especie del género Thermus. En otras realizaciones de la invención, la polimerasa no modificada es de una especie termofílica diferente de Thermus, por ejemplo Thermotoga. Se encuentran disponibles las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos completa para numerosas ADN polimerasas termoestables. Cada una de las secuencias de Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID n° 2), Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID n° 6), Thermus sp. Z05 (SEC ID n° 1), Thermus species Sps17 (SEC ID n° 5), Thermotoga marítima (Tma) (SEC ID n° 2) y Thermosipho afrícanus (Taf) (SEC ID n° 33) han sido publicadas en la solicitud publicada de patente internacional PCT n°WO 92/06200. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermus flavus (SEC ID n° 4) ha sido publicada en Akhmetzjanov y Vakhitov (Nucleic Acids Research 20:5839, 1992). La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus caldophilus (SEC ID n° 7) se encuentra en EMBL/GenBank n° de acceso U62584. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus filiformis (SEC ID n° 3) puede recuperarse del depósito n° 42380 de la ATCC utilizando, por ejemplo, los métodos proporcionados en la patente US n° 4.889.818, así como la información de secuencia proporcionada en la Tabla 1. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana (SEC ID n° 35) es de la base de datos de patentes GeneSeq n° R98144 y del documento n° PCT WO 97/09451. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Bacillus caldotenax (SEC ID n° 37) se describe en, por ejemplo, Uemori et al. (J Blochem (Tokyo) 113(3):401 -410, 1993; ver también el n° de acceso de la base de datos Swiss-Prot Q04957 y los n° de acceso de GenBank D12982 y BAA02361). Los ejemplos de formas no modificadas de ADN polimerasas que pueden modificarse tal como se indica en la presente memoria también se describen en, por ejemplo, las patentes US n° 6.228.628, n° 6.346.379, n° 7.030.220, n° 6.881.559, n° 6.794.177 y n° 6.468.775, y las patentes US n°

7.148.049, n° 7.179.590, n° 7.410.782 y n° 7.378.262. También se proporcionan secuencias representativas de polimerasas de longitud completa en el listado de secuencias.

También pueden experimentar las mutaciones indicadas en la presente memoria las ADN polimerasas funcionales que han sido previamente modificadas (por ejemplo mediante sustitución, adición o deleción de aminoácidos). En algunas realizaciones, dichas polimerasas modificadas funcionales conservan el motivo de aminoácidos de SEC ID n° 8 (o un motivo de SEC ID n° 9, 10 o 11) y comprenden además el motivo de aminoácidos de SEC ID n° 38. De esta manera, entre las ADN polimerasas no modificadas adecuadas se incluyen además variantes funcionales de polimerasas de tipo salvaje o naturales. Dichas variantes típicamente presentan una identidad o similitud de secuencias sustancial respecto a la polimerasa de tipo salvaje o natural, típicamente una identidad de secuencias de por lo menos 80%, y más típicamente una identidad de secuencias de por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.

En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención, además de presentar un dominio de polimerasa que comprende SEC ID n° 8, 9, 10 o 11, también comprende un dominio de nucleasa (por ejemplo correspondiente a las posiciones 1 a 291 de Z05).

En algunas realizaciones, una polimerasa de la invención es una polimerasa quimérica, es decir, comprende regiones polipeptídicas de dos o más enzimas. Se describen ejemplos de dichas ADN polimerasas quiméricas en, por ejemplo, la patente US n° 6.228.628. Resultan particularmente adecuadas las ADN polimerasas de familia CS quiméricas, que incluyen las polimerasas CS5 (SEC ID n° 27) y CS6 (SEC ID n° 28) y variantes de las mismas que presentan una identidad o similitud de secuencia sustancial con la SEC ID n° 27 o la SEC ID n° 28 (típicamente una identidad de secuencia de por lo menos 80% y más típicamente de por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencias de aminoácidos) y de esta manera pueden modificarse para contener SEC ID n° 8. Las ADN polimerasas CS5 y CS6 son enzimas quiméricos derivados de las ADN polimerasas de Thermus sp. Z05 y de Thermotoga marítima (Tma). Comprenden el dominio N-terminal de nucleasa 5' del enzima de Thermus y la exonucleasa 3'-5' C-terminal y los dominios de polimerasa del enzima Tma. Estos enzimas presentan una actividad de transcriptasa inversa eficiente, pueden extender cebadores que contienen análogos de nucleótidos y pueden incorporar dNTP, dUTP, dITP alfa-fosforotioato y también dNTP marcados con pigmentos de la familia de la fluoresceína y la clanina. Las polimerasas CS5 y CS6 también son enzimas de PCR activados por Mg2+ eficientes. Las polimerasas quiméricas CS5 y CS6 se describen adicionalmente en, por ejemplo, la patente US n°

7.148.049.

En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos individuales. Las ADN polimerasas proporcionadas en la presente memoria pueden comprender una o más sustituciones en el sitio activo respecto a la polimerasa no modificada. En algunas realizaciones, la sustitución o sustituciones de aminoácidos comprenden por lo menos X3 del motivo indicado en SEC ID n° 8 (o un motivo de SEC ID n° 9, n° 10 o n° 11). La sustitución de aminoácido en dicha posición confiere una eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a las no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI e inhibidores de polimerasa incrementadas, rindiendo una ADN polimerasa muíante con una eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a las no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de inhibidores de polimerasa incrementadas respecto a la polimerasa no modificada. Típicamente, el aminoácido en la posición X3 se sustituye con un aminoácido que no corresponde a la secuencia nativa dentro del motivo indicado en SEC ID n° 8 (o un motivo de SEC ID n° 9, n° 10 o n° 11). De esta manera, el aminoácido en la posición X3, en caso de sustituirse, no es lie (I), Leu (L) o Met (M), ya que estas posiciones ocurren en las polimerasas naturales. Ver, por ejemplo, la figura 1. En determinadas realizaciones, entre las sustituciones de aminoácidos se incluyen G, A, W, P, S, T, F, Y, C, N, Q, D, E, K, V, R o H en la posición X3. En determinadas realizaciones, entre las sustituciones de aminoácidos se incluyen lisina (K), arginina (R), serina (S),

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

glicina (G) o alanina (A) en la posición X3. Pueden determinarse otra u otras sustituciones de aminoácidos adecuadas en uno o más de los sitios identificados, utilizando, por ejemplo, métodos conocidos de mutagénesis dirigida a sitio y la determinación del rendimiento de extensión de polinucleótido en ensayos descritos adicionalmente en la presente memoria o de otro modo conocidos por el experto en la materia.

En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención comprende SEC ID n° 8, n° 9, n° 10 o n° 11 y comprende además uno o más cambios de aminoácidos adicionales (por ejemplo la sustitución, adición o deleción de aminoácidos) respecto a una polimerasa nativa. En algunas realizaciones, dichas polimerasas contienen el motivo de aminoácidos de SEC ID n° 8 (o un motivo de SEC ID n° 9, 10 o 11) y comprenden además el motivo de aminoácidos de SEC ID n° 38 (correspondiente a la mutación D580X de Z05 (SEC ID n° 1) siguiente:

Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-Xy-Xs-Pro-Asn-Leu-GIn-Asn

(también denominada en la presente memoria en el código de una letra como:

T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N) (SEC ID n° 38), en la que:

X7 es Ser (S) o Thr (T), y

Xs es cualquier aminoácido diferente de Asp (D) o Glu (E)

La mutación caracterizada por SEC ID n° 38 se comenta en mayor detalle en, por ejemplo, la publicación de patente US n° 2009/0148891. Dichas polimerasas variantes funcionales típicamente presentan una identidad o similitud de secuencia sustancial con la polimerasa de tipo salvaje o natural (por ejemplo SEC ID n° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 48), típicamente una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% y más típicamente de por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.

En algunas realizaciones, la polimerasa de la invención comprende SEC ID n° 8, n° 9, n° 10 o n° 11 y comprende además uno o más cambios de aminoácidos adicionales (por ejemplo la sustitución, adición o deleción de aminoácidos) respecto a una polimerasa nativa. En algunas realizaciones, dichas polimerasas conservan el motivo de aminoácidos de SEC ID n° 8 (o un motivo de SEC ID n° 9, n° 10 o n° 11) y comprenden además el motivo de aminoácidos de SEC ID n° 29 (correspondiente a la mutación I588X de Z05 (SEC ID n° 1)) siguiente:

Pro-Asn-Leu-Gln-Asn-Xi-Pro-X2-X3-X4-Xs-X6-Gly

(también denominado en la presente memoria con el código de una letra: P-N-L-Q-N-X1-P-X2-X3-X4-X5-X6-G) (SEC ID n° 29), en el que:

X1 es lie (I), o Leu (L),

X2es cualquier aminoácido diferente de lie (I) o Val (V),

X3 es Arg (R) o Lys (K),

X4 es Thr (T), Ser (S) o Leu (L),

Xses Pro (P) o Glu (E), y Xees Leu (L) o Glu (E).

En algunas realizaciones, dichas polimerasas variantes funcionales típicamente presentan una identidad o similitud de secuencias sustancial respecto a la polimerasa de tipo salvaje o natural (por ejemplo SEC ID n° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 48), típicamente una identidad de secuencias de aminoácidos de por lo menos 80% y más típicamente de por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa de la invención comprende una sustitución de aminoácido en la posición X3 (por ejemplo tal como en un motivo seleccionado de entre SEC ID n° 8, n° 9, n° 10 o n° 11) y comprende una sustitución de aminoácido correspondiente a SEC ID n° 38 y SEC ID n° 29.

Pueden determinarse otra u otras sustituciones de aminoácidos adecuadas en uno o más de los sitios identificados, utilizando, por ejemplo, métodos conocidos de mutagénesis dirigida a sitio y la determinación del rendimiento de extensión de polinucleótido en ensayos descritos adicionalmente en la presente memoria o de otro modo conocidos por el experto en la materia, por ejemplo sustituciones de aminoácidos descritos en la solicitudes publicadas de patente US n° 2009/0148891 y n° 2009/0280539.

Debido a que la longitud exacta de las ADN polimerasas varía, las posiciones aminoácidas exactas correspondientes a cada uno de X3 (por ejemplo de SEC ID n° 8, n° 9, n° 10 y n° 11), Xs(de SEC ID n° 38) y X2 (de SEC ID n° 29) puede variar dependiendo de la polimerasa mutante particular utilizada. Los programas de alineación de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos se encuentran disponibles fácilmente (ver, por ejemplo, los indicados supra) y, dados los motivos particulares identificados en la presente memoria, sirven para ayudar en la identificación de los aminoácidos exactos (y codones correspondientes) para la modificación según la presente invención. Las posiciones correspondientes a cada uno de X3, X8 y X2 se muestran en la Tabla 1 de ADN polimerasas termoestables quiméricas representativas y ADN polimerasas termoestables de especies termofílicas ejemplares.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 1. Posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de motivo X3 de SEC ID n° 8, n° 9, n° 10 y n°

11), Xs(de SEC ID n° 38) y X2(de SEC ID n° 29) en las polimerasas ejemplares.

Oraanismo 0 secuencia auimérica

Posición de aminoácido

Consenso (SEC ID n° )

x3 x8 (de SEC ID n° 38) x2 (de SEC ID n° 29)

T. thermophilus (6)

709 580 588

T. caldophilus (7)

709 580 588

T. sp. Z05 (1)

709 580 588

T. aquaticus (2)

707 578 586

T. flavus (4)

706 577 585

T. filiformis (3)

705 576 584

T. sp. sps17 (5)

705 576 584

T. marítima (34)

770 640 648

T. neapolitana (35)

770 640 648

T. africanus (33)

769 639 647

B. caldotenax (37)

751 621 629

B. stearothermophilus (36)

750 620 628

CS5 (27)

770 640 648

CS6 (28)

770 640 648

En algunas realizaciones, la ADN polimerasa de la presente Invención se deriva de la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. (SEC ID n° 1) o una variante de la misma (por ejemplo portadora de la mutación D580G o similar). Tal como se ha Indicado anteriormente, en la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp., la posición X3 corresponde a la isoleuclna (I) en la posición 709 y la posición X8 corresponde al aspartato (D) en la posición 580. De esta manera, en determinadas variaciones de la invención, la polimerasa muíante comprende por lo menos una sustitución de aminoácido, respecto a la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. en 1709 y/o D580. De esta manera, típicamente el aminoácido en la posición 709 no es I. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 709 se selecciona de entre G, A, V, L, R, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K o H. En determinadas realizaciones, el residuo aminoácido en la posición 709 es K, R, S, G o A. En determinadas realizaciones, los residuos de aminoácidos en la posición D580 pueden seleccionarse de entre leuclna (L), glicina (G), treonlna (T), glutamina (Q), alanina (A), serina (S), asparaglna (R), arginina (R) y Usina (K). Además, en determinadas realizaciones, el aminoácido en la posición 588 de SEC ID n°. 1 es cualquier aminoácido diferente de I. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 588 de SEC ID n° 1 se selecciona de entre L, V, G, A, S, M, F, W, P, R, K, T, C, Y, N, Q, D, E o H. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 588 de SEC ID n° 1 es T.

Entre las ADN polimerasas Z05 de Thermus sp. mutantes se Incluyen las que comprenden la sustitución o sustituciones de aminoácidos I709K (o I709R, I709S, I709G, I709A) y/o I588T y/o D580G. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. muíante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos I709K (o I709R, I709S, I709G, I709A), I588T y/o D580G. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos I709K y D580G o I709R y D580G, I709S y D580G, I709G y D580G, o I709A y D580G. En algunas realizaciones, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos I709K y I588T, o I709R y I588T, I709S e I588T, I709G e I588T, I709G e I588T, o I709A e I588T. En determinadas realizaciones, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos seleccionadas independientemente de entre I709K, I588T y/o D580G. En determinadas realizaciones, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos seleccionadas independientemente de entre I709R, I588T y/o D580G. En determinadas realizaciones, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos seleccionadas independientemente de entre I709S, I588T y/o D580G. En determinadas realizaciones, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos seleccionadas independientemente de entre I709G, I588T y/o D580G. En determinadas realizaciones, la ADN polimerasa Z05 de Thermus sp. mutante comprende, por ejemplo, las sustituciones de residuos aminoácidos seleccionadas Independientemente de entre I709A, I588T y/o D580G.

Además de la mutación de los motivos de SEC ID n° 8, n° 9, n° 10, n° 11, n° 29 y n° 38 tal como se indica en la presente memoria, las ADN polimerasas de la presente Invención también pueden incluir otra u otras modificaciones no de sustitución. Entre dichas modificaciones pueden incluirse, por ejemplo, modificaciones covalentes que es conocido de la técnica que confieren una ventaja adicional en aplicaciones que comprenden la extensión de polinucleótidos. Por ejemplo, una de estas modificaciones es una modificación covalente térmicamente reversible que Inactiva el enzima pero que se revierte para activar el enzima con la Incubación a una temperatura elevada, tal como una temperatura utilizada típicamente en la extensión de polinucleótidos. Los reactivos ejemplares para dichas modificaciones térmicamente reversibles se describen en las patentes US n° 5.773, 258 y 5.677.152.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las ADN polimerasas de la presente invención pueden construirse mutando las secuencias de ADN que codifican la polimerasa no modificada correspondiente (por ejemplo una polimerasa de tipo salvaje o una variante correspondiente a partir de la que se deriva la polimerasa de la invención), tal como mediante la utilización de técnicas comúnmente denominadas mutagénesis dirigida a sitio. Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la forma no modificada de la polimerasa pueden mutarse mediante una diversidad de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas por el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand y J. J. Sninsky editores, 1995, Academic Press, San Diego, CA), capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky y T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990).

A título de ejemplo no limitativo, el sistema de dos cebadores, utilizado en el kit de mutagénesis dirigida a sitio Transformer de Clontech, puede utilizarse para introducir mutantes dirigidos a sitio en un polinucleótido codificante de una forma no modificada de la polimerasa. Tras la desnaturalización del plásmido diana en este sistema, se hibridan simultáneamente dos cebadores con el plásmido: uno de estos cebadores contiene la mutación dirigida a sitio deseada; el otro contiene una mutación en otro punto en el plásmido que resulta en la eliminación de un sitio de restricción. A continuación, se lleva a cabo la síntesis de segunda cadena, ligando estrechamente dichas dos mutaciones, y los plásmidos resultantes se transforman en una cepa mutS de E. coli. Se aísla el ADN plasmídico a partir de las bacterias transformadas, cortadas con el enzima de restricción relevante (linearizando de esta manera los plásmidos no mutados) y después se transforma nuevamente en E. coli. Este sistema permite la generación de mutaciones directamente en un plásmido de expresión, sin la necesidad de subclonación o la generación de fagémidos de cadena sencilla. El ligamiento estrecho de las dos mutaciones y la posterior linearización de plásmidos no mutados resulta en una elevada eficiencia de mutación y permite un cribado mínimo. Tras la síntesis del cebador inicial de sitio de restricción, este método requiere la utilización de únicamente un nuevo tipo de cebador por cada sitio de mutación. En lugar de preparar cada muíante posicional por separado, puede sintetizarse un juego de cebadores oligonucleótidos "diseñados degenerados" con el fin de introducir todas las mutaciones deseadas en un sitio dado simultáneamente. Los transformantes pueden cribarse mediante secuenciación del ADN plasmídico pasando por la región mutagenizada con el fin de identificar y separar los clones mutantes. Cada ADN muíante seguidamente puede cortarse y analizarse mediante electroforesis, tal como, por ejemplo, en un gel Mutation Detection Enhancement gel [gel de detección mejorada de mutaciones] (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) para confirmar que no se han producido otras alteraciones en la secuencia (mediante comparación del desplazamiento de las bandas con el control no mutagenizado). Alternativamente, puede secuenciarse la región de ADN entera para confirmar que no se han producido sucesos de mutación adicionales en el exterior de la región diana.

Pueden generarse de diversas maneras ADN polimerasas con más de una sustitución de aminoácido. En el caso de los aminoácidos situados muy próximos entre sí en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica para la totalidad de las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, en el caso de que los aminoácidos se encuentren situados a cierta distancia unos de otros (separados por más de diez aminoácidos, por ejemplo), resulta más difícil generar un único oligonucleótido que codifique para todos los cambios deseados. En su lugar, puede utilizarse dos métodos alternativos. En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido que debe sustituirse. A continuación, los oligonucleótidos se hibridan con el ADN molde de cadena sencilla simultáneamente y la segunda cadena del ADN que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Un método alternativo incluye dos o más rondas de mutagénesis para producir el muíante deseado. La primera ronda es tal como se ha indicado para los mutantes únicos: el ADN codificante de la polimerasa no modificada se utiliza para el molde, un oligonucleótido codificante de la primera o primeras sustituciones de aminoácidos deseadas se híbrida con dicho molde y seguidamente se genera la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado que se ha producido en la primera ronda de mutagénesis a modo de molde. De esta manera, este molde ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido codificante de la sustitución o sustituciones de aminoácidos deseadas adicionales seguidamente se híbrida con dicho molde y la cadena de ADN resultante ahora codifica mutaciones procedentes de tanto la primera como la segunda rondas de mutagénesis. Este ADN resultante puede utilizarse como molde en una tercera ronda de mutagénesis, y de esta manera sucesivamente. Alternativamente, puede utilizarse el método de mutagénesis multisitio de Seyfang y Jin (Anal. Biochem. 324:285-291, 2004).

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la invención proporciona además ácidos nucleicos recombinantes codificantes de cualquiera de las ADN polimerasas de la presente invención. Utilizando un ácido nucleico de la presente invención, codificante de una ADN polimerasa, puede generarse una diversidad de vectores. Cualquier vector que contenga replicón y secuencias de control que se derivan de una especie compatible con la célula huésped puede utilizarse en la práctica de la invención. Generalmente, entre los vectores de expresión se incluyen regiones de ácidos nucleicos reguladoras de la transcripción y de la traducción operablemente ligadas con el ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Además, el vector puede contener un elemento retrorregulador positivo (ERP) para incrementar la semivida del ARNm transcrito (ver Gelfand et al., patente US n° 4.666.848). Las regiones de ácidos nucleicos reguladoras de transcripción y traducción

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

generalmente resultarán apropiadas para la célula huésped utilizada para expresar la polimerasa. Se conocen de la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados, y secuencias reguladoras adecuadas, para una diversidad de células huésped. En general, entre las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluirse, por ejemplo, secuencias de promotor, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y parada transcripcional, secuencias de inicio y parada traduccional y secuencias intensificadoras o activadoras. En realizaciones típicas, entre las secuencias reguladoras se incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada transcripcional. Entre los vectores típicamente también se incluye una región policonectora que contiene varios sitios de restricción para la inserción de ADN foráneo. En determinadas realizaciones, se utilizan "señalizadores de fusión" para facilitar la purificación y, si se desea, la eliminación posterior de la secuencia de etiqueta/señalizadora, por ejemplo una "etiqueta de His". Sin embargo, éstas generalmente no resultan necesarias al purificar una proteína termoactiva y/o termoestable a partir de un huésped mesofílico (por ejemplo E coli), en el que puede utilizarse una "etapa térmica". La construcción de vectores adecuados que contiene ADN codificante de secuencias replicación, secuencias reguladoras, genes de selección fenotípica y las polimerasas de interés se prepara utilizando procedimientos estándares de ADN recombinante. Los plásmidos aislados, vectores víricos y fragmentos de ADN se cortan, adaptan y ligan entre sí en un orden específico para generar los vectores deseados, tal como es bien conocido de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Coid Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2a ed. 1989)).

En determinadas realizaciones, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de las células huésped transformadas. Los genes de selección son bien conocidos de la técnica y varían según la célula huésped utilizada. Entre los genes de selección adecuados pueden incluirse, por ejemplo, genes codificantes de la resistencia a ampicilina y/o a tetraciclina, que permite que las células transformadas con estos vectores crezcan en presencia de estos antibióticos.

En un aspecto de la presente Invención, se introduce en una célula un ácido nucleico codificante de una ADN polimerasa, solo o en combinación con un vector. Por "se introduce en" o equivalentes gramaticales en la presente memoria se hace referencia a que los ácidos nucleicos entran en las células de una manera adecuada para la integración, amplificación y/o expresión posteriores del ácido nucleico. El método de introducción está dictado en gran medida por el tipo celular diana. Entre los métodos ejemplares se incluyen la precipitación con CaP04, la fusión de liposomas, Lipofectin®, la electroporación, la infección vírica y similares.

En algunas realizaciones se utilizan típicamente procarlotas como células huésped para las etapas de clonación Iniciales de la presente invención. Resultan particularmente útiles para la producción rápida de grandes cantidades de ADN, para la producción de ADN molde de cadena sencilla utilizado para la mutagénesis dirigida a sitio, para el cribado de muchos mutantes simultáneamente y para la secuenciación de ADN de los mutantes generados. Entre las células huésped procarióticas adecuadas se Incluyen E. coli K12 cepa 94 (ATCC n° 31.446), £. coli cepa W3110 (ATCC n° 27.325), E. coli K12 cepa DG116 (ATCC n° 53.606) y E. co//X1776

(ATCC n° 31.537) y E. coli B; sin embargo, pueden utilizarse como huésped muchas otras cepas de E. coli, tales como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 y muchas otras especies y géneros de procariotas, Incluyendo bacilos tales como Bacillus subtilis, otras enterobacterláceas, tales como Salmonella typhimurium o Serrada márceseos, y diversas especies de Pseudomonas. Las células huésped procarióticas u otras células huésped con paredes celulares rígidas se transforman típicamente utilizando el método de cloruro de calcio tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., supra. Alternativamente, puede utilizarse la electroporación para la transformación de estas células. Las técnicas de transformación de procarlotas se describen en, por ejemplo, Dower, en Genetic Engineering, Principies and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol. 204:63, 1991. Entre los plásmidos utilizados típicamente para la transformación de E. coli se Incluyen pBR322, pUCI8, pUCI9, pUC118, pUC119 y Bluescrlpt M13, la totalidad de los cuales se describe en las secciones 1.12-1.20 de Sambrook et al., supra. Sin embargo, también se encuentran disponibles otros muchos vectores adecuados.

Las ADN polimerasas de la presente Invención típicamente se producen mediante cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa, bajo condiciones apropiadas para Inducir o causar la expresión de la ADN polimerasa. Los métodos de cultivo de células huésped transformadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de proteínas son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Entre las células huésped adecuadas para la producción de las polimerasas de vectores plasmídlcos que contiene promotor pL lambda se incluyen E. coli cepa DG116 (ATCC n° 53606) (ver la patente US n° 5.079.352 y Lawyer F.C. et al., PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993). Tras la expresión, la polimerasa puede ser recolectada y aislada. Los métodos para purificar la ADN polimerasa termoestable se describen en, por ejemplo, Lawyer et al., supra. Una vez purificada, puede someterse a ensayo la capacidad de las ADN polimerasas de presentar una eficiencia de TI mejorada, y de una tolerancia a no correspondencias, una tasa de extensión y/o una tolerancia de la TI y de inhibidores de polimerasa mejoradas (por ejemplo tal como se Indica en los ejemplos).

Las ADN polimerasas mejoradas de la presente Invención pueden utilizarse con cualquier fin en el que dicha actividad enzimática resulte necesaria o deseada. De acuerdo con lo anterior, en otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos de extensión de polinucleótidos (por ejemplo PCR), utilizando las polimerasas. Las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

condiciones adecuadas para la extensión de polinucleótidos son conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra\ ver también Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4a ed., John Wiley & Sons 1999). Generalmente se híbrida un cebador con un ácido nucleico diana para formar un complejo de cebador-molde. El complejo de cebador-molde se pone en contacto con la ADN polimerasa y nucleósidos trifosfato en un medio adecuado para permitir la adición de uno o más nucleótidos al extremo 3' del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido complementario al ácido nucleico diana. El cebador puede incluir, por ejemplo, uno o más análogos de nucleótido. Además, los nucleósidos trifosfato pueden ser nucleótidos convencionales, nucleótidos no convencionales (por ejemplo ribonucleótidos o nucleótidos marcados) o una mezcla de los mismos. En algunas variaciones, la reacción de extensión de polinucleótido comprende la amplificación de un ácido nucleico diana. Las condiciones adecuadas para la amplificación de ácidos nucleicos utilizando una ADN polimerasa y una pareja de cebadores también son conocidas de la técnica (por ejemplo los métodos de amplificación por PCR). (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra\ Ausubel et al., supra\ PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis et al., editores, Academic Press 1999)). En otras realizaciones no mutuamente excluyentes, la reacción de extensión de polinucleótido comprende la transcripción inversa de un molde de ARN (por ejemplo RT-PCR). En algunas realizaciones, las polimerasas mejoradas encuentran utilidad en la secuenciación de 454 (Margulies M. et al., Nature 437:376-380, 2005).

Opcionalmente, la reacción de extensión de cebador comprende un inhibidor actual o potencial de una polimerasa de referencia o no modificada. El inhibidor puede inhibir, por ejemplo, la tasa de extensión de ácidos nucleicos y/o la eficiencia de transcripción inversa de una polimerasa de referencia o no modificada (de control). En algunas realizaciones, el inhibidor es hemoglobina o un producto de degradación de la misma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el producto de degradación de la hemoglobina es un producto de degradación heme, tal como hemina, hematoporfiriña o bilirrubina. En algunas realizaciones, el inhibidor es quelante de hierro o un pigmento violeta. En otras realizaciones, el inhibidor es la heparina. En determinadas realizaciones el inhibidor es un pigmento intercalante. En determinadas realizaciones, el inhibidor es la melanina, que ha sido descrita como un inhibidor de polimerasa. Ver, por ejemplo, Ekhardt et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 271(3):726-30, 2000.

Las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de moldes polinucleótidos aislados a partir de muestras que comprenden inhibidores de polimerasa, por ejemplo de sangre. Por ejemplo, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de hemoglobina, un componente mayor de la sangre, o en presencia de un producto de degradación de la hemoglobina. La hemoglobina puede degradarse en diversos productos de degradación del grupo heme, tales como hemina, hematina, hematoporfirina y bilirrubina. De esta manera, en determinadas realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de productos de degradación de la hemoglobina, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, hemina, hematina, hematoporfirina y bilirrubina. En determinadas realizaciones el producto de degradación de la hemoglobina es la hemina. En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de entre aproximadamente 0,5 y 20,0 mM, entre aproximadamente 0,5 y 10,0 mM, entre aproximadamente 0,5 y 5,0 mM, entre aproximadamente 1,0 y 10,0 mM, entre aproximadamente 1,0 y 5,0 mM, entre aproximadamente 2,0 y 5,0 mM, o entre aproximadamente 2,0 y 3,0 mM de hemina. En otras realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de por lo menos aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 20,0 o superior a 20 mM de hemina. Entre los productos de degradación de la hemoglobina se incluyen quelantes de hierro y pigmentos violeta. De esta manera, en algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de quelantes de hierro y/o pigmentos violeta. En otras realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de cantidades de productos de degradación de la hemoglobina que inhibirían la extensión del mismo molde por una ADN polimerasa de referencia o de control.

Las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de heparina. La heparina se encuentra comúnmente presente como anticoagulante en muestras aisladas a partir de sangre. En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de entre aproximadamente 1,0 y 400 ng/ml, entre 1,0 y 300 ng/ml, entre 1,0 y 200 ng/ml, entre 5,0 y 400 ng/ml, entre 5,0 y 300 ng/ml, entre 5,0 y 200 ng/ml, entre 10,0 y 400 ng/ml, entre 10,0 y 300 ng/ml o entre 10,0 y 200 ng/ml de heparina. En algunas realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de por lo menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ng/ml o más de 400 ng/ml de heparina. En otras realizaciones, las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para extender moldes en presencia de cantidades de heparina que inhibirían la extensión del mismo molde por una ADN polimerasa de referencia o de control.

En algunas realizaciones, se utiliza una polimerasa mejorada de la invención en una reacción de transcripción inversa. En algunas realizaciones, la reacción de transcripción inversa se lleva a cabo en una mezcla que contiene el molde de ARN, uno o más cebadores y una ADN polimerasa termoestable de la invención. La mezcla de reacción típicamente contiene la totalidad de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP) estándares y un tampón que contiene un catión divalente y un catión monovalente. Entre los cationes ejemplares se incluyen Mg2+, aunque otros cationes, tales como Mn2+ o Co2+ pueden activar las ADN polimerasas. En otras realizaciones, la reacción de transcripción inversa se lleva a cabo con una ADN polimerasa termoactiva de la invención. En realizaciones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

particulares, la polimerasa mejorada de la invención permite una amplificación más eficiente de los moldes de ARN sin comprometer la amplificación eficiente de un molde de ADN en presencia de Mn2+ o Mg2+, tal como se indica en los ejemplos.

La actividad de TI más eficiente en las ADN polimerasas termoestables se ha alcanzado utilizando Mn2+ como el activador ión metálico divalente. Sin embargo, es bien conocido que en caso de encontrarse presente Mn2+ en las reacciones, la fidelidad de las ADN polimerasas es más baja. A menos que se intente generar mutaciones, generalmente se favorece el mantenimiento de una fidelidad más elevada. Afortunadamente, la mayoría de las aplicaciones convencionales de secuenciación, PCR y RT-PCR, no requieren condiciones de alta fidelidad porque los sistemas de detección generalmente se centran en una población de productos. Con la llegada de la secuenciación de nueva generación, PCR digital, etc., la fidelidad del producto resulta más importante y los métodos que permiten una síntesis de ADN de fidelidad más alta resultan críticos. Conseguir una actividad de TI eficiente utilizando Mg2+ como el activador ión metálico divalente es una manera excelente de incrementar sustancialmente la fidelidad de la ADN polimerasa y permite una copia más fiable del ácido nucleico diana.

Debido a que las polimerasas descritas en la presente memoria también pueden presentar una tolerancia a no correspondencias incrementada, las polimerasas encuentran utilidad en métodos en los que es probable la variación del molde diana y sin embargo se desea la amplificación del molde con independencia de la variación en el molde diana. Entre los ejemplos de este tipo de molde pueden incluirse, por ejemplo, secuencias víricas, bacterianas o de otros patógenos. En muchas realizaciones resulta deseable determinar simplemente si un individuo (humano o animal no humano) presenta una infección vírica u otra, con independencia de la variante vírica exacta que ha infectado al individuo. A título de ejemplo, puede utilizarse una pareja de cebadores para amplificar el VHC utilizando una polimerasa de la invención y detectar la presencia del VHC aunque el virus particular que infecta el individuo presente una mutación que resulte en una no correspondencia en el sitio de hibridación del cebador.

Los ácidos nucleicos diana pueden ser de origen biológico o de otra origen sintético. La diana puede ser, por ejemplo, de ADN o ARN. Generalmente, en el caso de que se generen amplicones, estos estarán compuestos de ADN, aunque también pueden incorporarse en el amplicón ribonucleótidos o nucleótidos sintéticos. En el caso de que se desee detectar un ARN, el procedimiento de amplificación típicamente implicará la utilización de transcripción inversa, incluyendo, por ejemplo, la PCR de transcripción inversa (RT-PCR).

Entre las secuencias diana específicas pueden incluirse, por ejemplo, ácidos nucleicos víricos (por ejemplo el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), citomegalovirus (CMV), virus parvo B19, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis C (VHC), virus del papiloma humano (VPH), virus de la encefalitis japonesa (VEJ), virus del Nilo Occidental (VNO), virus de la encefalitis de San Luís (VCSL), virus de la encefalitis del valle Murray y virus Kunjin), ácidos nucleicos bacterianos (por ejemplo S. aureus, Neisseria meningitidis, Plasmodium falciparum, Chlamydia murídarum, Chlamydia trachomatis), micobacterias, ácidos nucleicos fúngicos o ácidos nucleicos de animales o plantas. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos diana son ácidos nucleicos animales (por ejemplo humanos) o se derivan de una muestra animal (por ejemplo humana) (es decir, pueden encontrarse presentes ácidos nucleicos de organismos víricos u otros organismos patogénicos en una muestra procedente de una biopsia animal, muestra de sangre, muestra de orina, muestra fecal, saliva, etc.). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos diana son, por ejemplo, regiones genéticas humanas que pueden incluir variantes asociadas a enfermedad (por ejemplo cáncer, diabetes, etc.). Debido a que en algunas realizaciones, las polimerasas de la invención presentan tolerancia a las no correspondencias, dichos enzimas resultan particularmente útiles, por ejemplo en el caso de que podría encontrarse presente una diversidad de secuencias relacionadas dentro de una secuencia diana. A título de ejemplo, la invención puede utilizarse para detectar patógenos víricos, en la que los patógenos víricos presentan una variación suficiente en sus genomas para dificultar o imposibilitar el diseño de un único grupo o de un grupo pequeño de cebadores que amplifiquen la mayoría o todos los posibles genomas víricos o en marcadores genéticos del cáncer o de otras enfermedades en los que la variación de la secuencia es conocida o es probable que ocurra.

Entre otros métodos para detectar productos de extensión o productos de amplificación utilizando las polimerasas mejoradas descritas en la presente memoria se incluyen la utilización de pigmentos de unión a nucleótidos de doble cadena fluorescentes o pigmentos intercalantes de nucleótidos de doble cadena fluorescentes. Entre los ejemplos de pigmentos de unión a ADN de doble cadena fluorescentes se incluyen verde SYBR (Molecular Probes). Los pigmentos de unión a ADN de doble cadena pueden utilizarse conjuntamente con el análisis de curvas de fusión para medir los productos de extensión de cebadores y/o los productos de amplificación. El análisis de curvas de fusión puede llevarse a cabo en un instrumento de PCR en tiempo real, tal como el instrumento ABI 5700/7000 (formato de 96 pocilios) o ABI 7900 (formato de 384 pocilios) con software incorporado (SDS 2.1). Alternativamente, el análisis de curvas de fusión puede llevarse a cabo como un análisis de punto final. Se describen métodos ejemplares de análisis de punto de fusión en la publicación de patente US n° 2006/0172324.

En otro aspecto de la presente invención se proporcionan kits para la utilización en métodos de extensión de cebador descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el kit se encuentra compartimentalizado para facilitar el uso y contiene por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa mejorada según la presente invención. También puede incluirse uno o más recipientes adicionales que proporcionan uno o más

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

reactivos adicionales. En algunas realizaciones, el kit puede Incluir además un tubo de recolección de sangre, un recipiente o una unidad que comprende heparina o una sal del mismo, o que libera heparina en solución. La unidad de recolección de sangre puede ser un tubo heparlnlzado. Dichos recipientes adicionales pueden Incluir cualesquiera reactivos u otros elementos reconocidos por el experto en la materia para la utilización en procedimientos de extensión de cebador según los métodos descritos anteriormente, incluyendo reactivos para la utilización en, por ejemplo, procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenclación de ADN o procedimientos de mareaje de ADN. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el kit Incluye además un recipiente que proporcionar un cebador de sentido 5' hibridable, bajo condiciones de extensión de cebador, a un polinucleótldo molde predeterminado, o una pareja de cebadores que comprende el cebador de sentido 5' y un cebador antisentido 3' correspondiente. En otras variaciones no mutuamente excluyentes, el kit incluye uno o más recipientes que proporcionan nucleósidos trifosfato (convencionales y/o no convencionales). En realizaciones específicas, el kit incluye dNTP alfa-fosforotioato, dUTP, dITP y/o dNTP marcados tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de los pigmentos de la familia de la fluoresceína o de la cianina. En todavía otras realizaciones no mutuamente excluyentes, el kit incluye uno o más recipientes que proporcionan un tampón adecuado para una reacción de extensión de cebador.

En otro aspecto de la presente invención se proporcionan mezclas de reacción que comprenden las polimerasas con una eficiencia incrementada de transcriptasa inversa, tolerancia a las no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia a la TI e inhibidores de polimerasa tales como los descritos en la presente memoria. Las mezclas de reacción pueden comprender además reactivos para la utilización en, por ejemplo, procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo PCR y RT-PCR), procedimientos de secuenciación del ADN o procedimientos de mareaje del ADN. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las mezclas de reacción comprenden un tampón adecuado para una reacción de extensión de cebadores. Las mezclas de reacción pueden contener además un ácido nucleico molde (ADN y/o ARN), uno o más polinucleótidos cebadores o de sonda, nucleósidos trifosfato (incluyendo, por ejemplo, desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos marcados, nucleótidos no convencionales), sales (por ejemplo Mn2+, Mg2+) y mareajes (por ejemplo fluoróforos). En algunas realizaciones, las mezclas de reacción contienen un cebador de sentido 5' hibridable, bajo condiciones de extensión de cebador, a un polinucleótido molde predeterminado, o una pareja de cebadores que comprende el cebador de sentido 5' y un cebador antisentido 3' correspondiente. En algunas realizaciones las mezclas de reacción contienen dNTP alfa- fosforotioato, dUTP, dITP y/o dNTP marcados tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de los pigmentos fluoresceína o cianina. En algunas realizaciones, las mezclas de reacción comprenden un quelante de hierro o un pigmento violeta. En determinadas realizaciones, las mezclas de reacción comprenden hemoglobina o un producto de degradación de hemoglobina. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, entre los productos de degradación de la hemoglobina se incluyen productos de degradación heme, tales como hemina, hematina, hematoporfirina y bilirrubina. En otras realizaciones, las mezclas de reacción comprenden heparina o una sal de la misma. En determinadas realizaciones, la mezcla de reacción contiene un ácido nucleico molde que se aísla a partir de la sangre. En otras realizaciones, el ácido nucleico de molde es ARN y la mezcla de reacción comprende heparina o una sal de la misma.

EJEMPLOS

Los ejemplos siguientes se ofrecen a título ilustrativo, aunque no limitativo, de la invención reivindicada.

Ejemplo 1: generación de bibliotecas

Brevemente, las etapas en el presente procedimiento de cribado incluye la generación de una biblioteca, la expresión y purificación parcial de los enzimas mutantes, el cribado de los enzimas para las propiedades deseadas, la secuenciación del ADN, la purificación clonal y la caracterización adicional de los mutantes candidatos seleccionados. Se describe en mayor detalle cada una de estas etapas a continuación.

Generación de biblioteca clonal: un ácido nucleico codificante del dominio de polimerasa de la ADN polimerasa Z05 D580G se sometió a PCR con tendencia a errores (mutagénica) entre los sitios de restricción Blp I y Bgl II de un plásmido que incluía esta secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia amplificada se proporciona como SEC ID n° 39. Los cebadores utilizados para ello se proporcionan a continuación:

Cebador directo: 5’-CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3’ (SEC ID n° 30) y

Cebador inverso: 5’-ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA-3’ (SEC ID n° 31)

Se llevó a cabo una PCR utilizando un abanico de concentraciones de Mg2+ de entre 1,8 y 3,6 mM con el fin de generar bibliotecas con un rango de tasas de mutación. Las condiciones de tampón fueron bicina 50 mM, pH 8,2, KOAc 115 mM, glicerol al 8% p/v y 0,2 mM de cada dNTP. Se utilizó el enzima de PCR de inicio en caliente GeneAmp® AccuRT a razón de 0,15 U/pl. Partiendo de 5x105 copias de ADN plasmídico Z05 D580G linearizado por cada volumen de reacción de 50 pl, las reacciones se desnaturalizaron utilizando una temperatura de 94°C durante 60 segundos, seguido de 30 ciclos de amplificación utilizando una temperatura de desnaturalización de 94°C durante 15 segundos, una temperatura de hibridación de 60°C durante 15 segundos, una temperatura de extensión de 72°C durante 120 segundos y seguido de una extensión final a una temperatura de 72°C durante 5 minutos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El amplicón resultante se purificó con un kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA) y se cortó con Blp I y Bgl II y después se purificó nuevamente con un kit de purificación por PCR QIAquick. Se preparó un vector plasmídico Z05 D580G mediante corte con los mismos dos enzimas de restricción y con tratamiento con fosfatasa alcalina, recombinante (RAS, n° de cat. 03359123001) y se purificó con un kit de purificación por PCR QIAquick. El vector cortado y el inserto mutado se mezclaron en una proporción de 1:3 y se trataron con ADN ligasa de T4 durante 5 minutos a temperatura ambiente (kit NEB Quick Ligation™). Las ligaciones se purificaron con un kit de purificación por PCR QIAquick y se transformaron en una cepa huésped E. coli mediante electroporación.

Se sembraron alícuotas de los cultivos expresados en medio selectivo con ampicilina con el fin de determinar el número de transformantes únicos en cada transformación. Las transformaciones se almacenaron a una temperatura de entre -70°C y -80°C en presencia de glicerol como crioprotector.

A continuación, se extendió cada biblioteca sobre placas de agar selectivas con ampicilina de gran formato. Se transfirieron las colonias individuales a placas de 384 pocilios que contenían caldo de Luria 2X con ampicilina y glicerol al 10% p/v utilizando un recolector de colonias automático (QPix2, Genetic Ltd.). Estas placas se incubaron durante la noche a 30°C para permitir el crecimiento de los cultivos y después se almacenaron a una temperatura de entre -70°C y -80°C. Se añadió suficientemente poco glicerol al caldo Luria 2X para permitir el crecimiento del cultivo aunque suficiente para proporcionar crioprotección. Se prepararon varios miles de colonias a varios niveles de mutagénesis (Mg2+) de esta manera, para su uso posterior.

Preparación de biblioteca de extractos: parte 1 - Fermentación: a partir de las bibliotecas clónales indicadas anteriormente, se preparó una biblioteca correspondiente de extractos parcialmente purificados adecuados para fines de cribado. La primera etapa de este procedimiento era preparar cultivos de expresión a pequeña escala de cada clon. Estos cultivos se cultivaron en formato de 96 pocilios; por lo tanto, había 4 placas de cultivo de expresión por cada placa de biblioteca de 384 pocilios. Se transfirieron 0,5 pl de cada pocilio de la placa de biblioteca clonal a un pocilio de una placa de inoculo de 96 pocilios, que contenían 150 pl de medio A (ver la Tabla 3, posteriormente). Esta placa de inoculo se agitó durante la noche a 1.150 rpm a 30°C en una placa incubadora/agitador ¡EMS (ThermoElectron). A continuación, dichos cultivos de inoculo se utilizaron para inocular el mismo medio, esta vez inoculando 20 pl en 250 pl de medio A en placas de 96 pocilios de gran formato (Nunc n° 267334). Estas placas se incubaron durante la noche a 37°C bajo agitación. El plásmido de expresión contenía elementos de control transcripcional que permiten la expresión a 37°C pero no a 30°C. Tras la incubación durante la noche, los cultivos expresaron la proteína del clon hasta típicamente 1-10% del total de proteínas celulares. Las células de estos cultivos se recolectaron mediante centrifugación. Estas células se congelaron (-20°C) o se procesaron inmediatamente, tal como se indica posteriormente.

Tabla 2. Medio A (esterilizado mediante filtración antes de la

Componente

Concentración

MgS04-7H20

0,2 g/l

Ácido cítrico-H2O

2 g/l

K2HPO4

10 g/l

NaNH4P04-4H20

3,5 g/l

MgS04

2 mM

Ácidos casamino

2,5 g/l

Glucosa

2 g/l

Tiamina-HCI

10 mg/l

Ampicilina

100 mg/l

utilización)

Preparación de biblioteca de extractos Parte 2 - Extracción: se resuspendieron los pellets celulares de la etapa de fermentación en 25 pl de tampón de lisis (Tabla 3, posteriormente) y se transfirieron a placas de termociclador de 384 pocilios y se sellaron. Observar que el tampón contenía lisozima para ayudar en la lisis celular y ADNasa para eliminar el ADN del extracto. Para lisar las células, las placas se incubaron a 37°C durante 15 minutos, se congelaron durante la noche a -20°C y se incubaron nuevamente a 37°C durante 15 minutos. Se añadió sulfato amónico (1,5 pl de una solución 2 M) y las placas se incubaron a 75°C durante 15 minutos con el fin de precipitar e inactivar las proteínas contaminantes, incluyendo las nucleasas añadidas exógenamente. Las placas se centrifugaron a 3.000xg durante 15 minutos a 4°C y los sobrenadantes se transfirieron a una nueva placa para termociclador de 384 pocilios. Estas placas de extractos se congelaron a -20°C para el uso posterior en los cribados. Cada pocilio contenía aproximadamente 0,5 a 3 mM del enzima polimerasa muíante de la biblioteca.

Tabla 3. Tampón de lisis

Componente

Concentración 0 porcentaje

Tris, pH 7,5

50 mM

EDTA

1 mM

MgCI2

6 mM

Tween 20

0.5% v/v

5

10

15

20

25

30

35

40

Lisozima (de polvos)

1 mg/mL

ADNasa I

0,05 unidades/pl

Ejemplo 2: identificación de ADN polimerasas mutantes con eficiencia incrementada de transcripción inversa

Cribado de bibliotecas de extractos para una eficiencia mejorada de transcripción inversa: la biblioteca de extractos se cribó mediante comparación de los valores de Pe (punto de cruce) de curvas de crecimiento generadas con actividad de 5-nucleasa fluorescente (TaqMan) de extractos enzimáticos en bruto en un sistema de RT-PCR de una amplificación de un amplicón de 240 pares de bases del transcrito JP2-5 del virus de la hepatitis C (VHC), que contenía las primeras 800 bases del genotipo del VHC Ib 5'NTR en pSP64 poli(A) (Promega).

Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador cinético Roche LC480 en formato de 384 pocilios, conteniendo cada pocilio 1,5 pl de un extracto de enzima individual diluido 5 veces con tampón que contenía Tris- HCI 20 mM, pH 8, KCI 100 mM, EDTA 0,1 mM y Tween-20 al 0,1% añadido a 18,5 pl de la mezcla maestra de RT- PCR en la Tabla 4. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: 1 minuto a 65°C (etapa de "TI"); 5 ciclos de 94°C durante 15 segundos seguidos de 60°C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91°C durante 15 segundos seguido de 60°C durante 30 segundos.

Tabla 4. Mezcla maestra de RT-PCR

Componente

Concentración

Tricina, pH 8,3

50 mM

KOAc

100 mM

Glicerol

5% (v/v)

DMSO

2 % (v/v)

Cebador 1

200 nM

Cebador 2

200 nM

Sonda TaqMan

75 nM

Aptámero

200 nM

dATP

200 nM

dCTP

200 nM

dGTP

200 uM

dUTP

400 uM

UNG

0,04 unidades/pl

Diana de ARN

5000 copias/pl

Mn(OAc)2

2,1 mM

Se cribaron aproximadamente 5.000 clones utilizando el protocolo anteriormente indicado. Se seleccionaron veintiún clones del grupo original para un nuevo cribado basado en los valores más tempranos de punto de cruce (Pe) y los valores de saturación fluorescencia superiores a un valor de corte arbitrario calculados mediante el método de cuant. abs./max. de 2a derivada. Los pocilios de cultivo correspondientes a los mejores extractos se introdujeron en medio de crecimiento fresco y se cultivaron nuevamente para producir nuevas placas de cultivo que contuviesen los mejores mutantes, así como varios cultivos de Z05 D580X parentales (X=G, K y R) que se utilizarían para la comparación. A continuación, se utilizaron estas placas de cultivo para preparar extractos en bruto frescos que se cuantificaron y cribaron nuevamente a una concentración de 20 nM con las mismas condiciones de mezcla maestra indicadas en la Tabla 1. La Tabla 5 muestra los valores de Pe obtenidos del incremento de la señal de FAM debido al corte de la sonda TaqMan. Los resultados demuestran que la polimerasa expresada por el clon 0813-L15 amplifica la diana de ARN con una eficiencia más alta que la Z05 D580G parental.

Tabla 5. Valores de Pe obtenidos con las polimerasas mutantes que amplifican un molde de ARN.

Clon

Pe media

0813-L15

18,5

Z05 D580R

24,0

Z05 D580K

24,5

Z05 D580G

27,5

La secuencia de ADN de la región mutada del gen de polimerasa se secuenció para determinar la mutación o mutaciones que se encontraban presentes en cualquiera de los clones individuales. Se seleccionó el clon 0815-L15 para ensayos posteriores, por lo que se expresó en un matraz de cultivo la proteína polimerasa mutante, se purificó hasta la homogeneidad y se cuantificó.

Utilización del mutante Z05 D580G en RT-PCR basada en Mn2*: los resultados de la secuenciación revelaron que la polimerasa que expresaba el clon 0813-L15 portaba las mutaciones I709K y A803S además de la mutación D580G parental. Se comparó el mutante Z05 D580G_I709K_A803S (0813-L15) purificado con el Z05 D580G parental en una RT-PCR TaqMan basada en Mn2+. Se midieron las eficiencias de transcripción inversa y de la PCR mediante la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

comparación de los valores de Pe de las amplificaciones del transcrito de ARN JP2-5 y el plásmido lineal de ADN pJP2-5 se digirió con la endonucleasa de restricción EcoRI. Los ollgonucleótldos y las condiciones de la mezcla maestra (Tabla 1) eran las mismas que la utilizadas en el cribado original. Cada reacción presentaba 100.000 copias del transcrito JP2-5, 100.000 coplas del ADN del plásmido lineal pJP2-5 o 1.000 copias del ADN del plásmido lineal pJP2-5. Todas las dianas se amplificaron con el Cebador 1 y el Cebador 2, tal como se ha indicado anteriormente, en reacciones por duplicado con el fin de generar un amplicón de 240 pares de bases. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un ciclador térmico Roche Light Cycler480 con un volumen de reacción de 15 pl. Se calcularon los puntos de cruce (Pe) mediante el método de cuant. abs/max. de 2a derivada y se promediaron. Las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando un abanico de concentraciones de ADN polimerasa entre 2,5 nM y 30 nM. Las condiciones del termociclado fueron: 1 minuto a 65°C (etapa de "TI"); 5 ciclos de 94°C durante 15 segundos seguidos de 60°C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91°C durante 15 segundos seguido de 60°C durante 30 segundos. La Tabla 6 muestra los valores de Pe obtenidos del incremento de señal fluorescente debido al corte de la sonda TaqMan bajo una condición de 20 nM de enzima.

Tabla 6. Valores de Cp obtenidos con las polimerasas mutantes al amplificar moldes de ARN y ADN en presencia de

Mn2+.

Enzima

Pe 105 copias de ARN Pe 105 copias de ADN Pe lO0 copias de ADN

Z05 D580G

31,6 19,7 27,5

Z05 D580G I709K A803S

20,3 18,9 26,6

Los resultados indican que el muíante Z05 D580G_I709K_A803S permiten una amplificación más eficiente de una diana de ARN sin comprometer la eficiencia de la PCR en una diana de ADN, en comparación con el enzima parental.

Utilización del mutante Z05 D580G en RT-PCR basada en Mn2*: también se comparó el mutante Z05 D580G_I709K_A803S purificado con el Z05 D580G parental para la capacidad de realizar la RT-PCR TaqMan en presencia de Mg2+. Las condiciones de mezcla maestra utilizadas eran idénticas a las Indicadas en la Tabla 1, excepto en que se modificó la concentración de KOAc entre 20 mM y 160 mM y se sustituyó Mn(OAc)2 por Mg(OAc)2 2,1 mM. Cada reacción presentaba 30 nM de enzima y 100.000 copias de transcrito JP2-5, 100.000 copias de ADN de plásmido lineal pJP2-5 o 1.000 copias de ADN de plásmido lineal pJP2-5. Se amplificaron todas las dianas con el mismo conjunto de cebadores en reacciones por duplicado con el fin de generar un amplicón de 240 pares de bases. Se determinaron las eficiencias de PCR y de RT-PCR mediante la comparación de los valores de Pe de ADN y ARN. Todas las reacciones se realizaron en un ciclador térmico Roche Light Cycler 480 con un volumen de reacción de 15 pl. Se calcularon los puntos de cruce (Pe) mediante el método de cuant. abs/max. de 2a derivada y se promediaron los valores de Pe. Las condiciones del termociclado fueron: 65°C durante 5 minutos, 70°C - 5 minutos y 75°C - 5 minutos (etapa de "TI" de tres temperaturas); 5 ciclos de 94°C durante 15 segundos seguidos de 62°C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91°C durante 15 segundos seguido de 62°C durante 30 segundos. La Tabla 7 muestra los valores de Pe obtenidos del incremento de señal fluorescente debido al corte de la sonda TaqMan bajo una condición de 40 nM KOAc.

Tabla 7. Valores de Cp obtenidos con las polimerasas mutantes al amplificar moldes de ARN y ADN en presencia de

,________________________ ___________m£____________________,_____________________,

Enzima

Pe 10° copias de ARN Pe 105 copias de ADN Pe 103 copias de ADN

Z05 D580G

28,4 18,5 24,7

Z05 D580G I709K A803S

20,6 17,8 23,8

Los resultados indican que el mutante Z05 D580G_I709K_A803S llevan a cabo la RT-PCR basada en Mg2+ con una eficiencia significativamente mayor que Z05 D580G bajo estas condiciones.

Determinación de la mutación o mutaciones que confieren un fenotipo: la polimerasa expresada por el clon 0815-L15 mostraba la mayor mejora en la amplificación del ARN respecto al Z05 D580G parental en el cribado de RT-PCR. El clon 0815-L15 expresaba una polimerasa doble mutante que portaba las mutaciones I709K y A803 además de la mutación D580G parental. Basándose en la naturaleza del cambio de aminoácido y la proximidad de A803S al extremo C-terminal de la proteína, los presentes Inventores predijeron que la mutación I709K era responsable del fenotipo observado. Se construyó un mutante Z05 D580GJ709K mediante mutagénesis dirigida a sitio basada en PCR, se purificó, se cuantificó y se comparó con 0815-L15 (Z05 D580G_I709K_A803S) en RT-PCR TaqMan activada por Mg2+ con concentraciones variables de KOAc de entre 20 mM y 160 mM y 30 nM de enzima. Las condiciones de mezcla maestra utilizadas eran Idénticas a las indicadas anteriormente, en la Tabla 1, excepto en que se sustituyó Mn(OAc)2 por Mg(OAc)2 2,1 mM. Cada reacción presentaba 100.000 copias de transcrito JP2-5, 100.000 copias de ADN de plásmido lineal pJP2-5 o 1.000 coplas de ADN de plásmido lineal pJP2-5. Se amplificaron todas las dianas con el mismo conjunto de cebadores en reacciones por duplicado con el fin de generar un amplicón de 240 pares de bases. Se determinaron las eficiencias de PCR y de RT-PCR mediante la comparación de los valores de Pe de ADN y ARN. Todas las reacciones se realizaron en un ciclador térmico Roche Light Cycler 480 con un volumen de reacción de 15 pl. Se calcularon los puntos de cruce (Pe) mediante el método de cuant.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

abs/max. de 2a derivada y se promediaron los valores de Pe. Las condiciones del termoclclado fueron: 2 minutos a 50°C (etapa de "UNG"); 65°C durante 5 minutos, 68°C - 5 minutos y 72°C - 5 minutos (etapa de "TI" de tres temperaturas); 5 ciclos de 94°C durante 15 segundos seguidos de 62°C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91°C durante 15 segundos seguido de 62°C durante 30 segundos. La Tabla 8 muestra los valores de Pe obtenidos del Incremento de señal fluorescente debido al corte de la sonda TaqMan bajo una condición de 60 nM de KOAc.

Tabla 8. Valores de Pe obtenidos con las polimerasas mutantes para amplificar moldes de ARN y ADN.

Enzima

Pe 10a copias de ARN Pe 10a copias de ADN Pe 10a copias de ADN

Z05 D580G

29,2 17,0 23,0

Z05 D580G I709K A803S

19,3 16,6 22,6

Z05D580G I709K

19,0 16,7 22,5

Z05 D580GJ709K y Z05 D580G_I709K_A803S presentan valores de Pe similares tanto en dianas de ARN como de ADN, demostrando que la mutación I709K confiere la mejora observada en el rendimiento de la RT-PCR.

Diversas sustituciones de aminoácidos en la posición I709: se examinó el efecto de diversas sustituciones en la posición I709 sobre la eficiencia de la RT-PCR TaqMan basada en Mg2+ de la ADN pollmerasa de Z05 D580G. En primer lugar se crearon las mutaciones en la ADN polimerasa de Z05 D580G utilizando una técnica de mutagénesis dirigida a sitio basada en PCR y los enzimas mutantes fueron purificados y cuantlflcados. Se compararon los mutantes Z05D580GJ709 K (Usina), A (alanina), G (glicina), S (serina), R (arginina), L (leucina) y D (ácido aspártico) con el Z05 D580G parental en una RT-PCR TaqMan activada por Mg2+ con concentraciones variables de KOAc, de entre 20 mM y 160 mM, y 10 nM de enzima. Las condiciones de mezcla maestra fueron las mismas a las Indicadas anteriormente, en la Tabla 1, excepto en que se utilizó Mg(OAc)2 2,0 mM. Cada reacción presentaba 100.000 copias del transcrito JP2-5, 100.000 coplas del ADN del plásmido lineal pJP2-5 o 1.000 coplas del ADN del plásmldo lineal pJP2-5. Se amplificaron todas las dianas con el mismo conjunto de cebadores en reacciones por duplicado con el fin de generar un amplicón de 240 pares de bases. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un ciclador térmico Roche Light eyeler 480 con un volumen de reacción de 15 pl. Se calcularon los puntos de cruce (Pe) mediante el método de cuant. abs/max. de 2a derivada y se promediaron los valores de Pe. Las condiciones del termociclado fueron: 3 minutos a 50°C (etapa de "UNG"); 65°C durante 5 minutos, 68°C - 5 minutos y 72°C - 5 minutos (etapa de "TI" de tres temperaturas); 5 ciclos de 95°C durante 15 segundos seguidos de 62°C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91°C durante 15 segundos seguido de 62°C durante 30 segundos. La Tabla 9 muestra los valores de Pe obtenidos del incremento de señal fluorescente debido al corte de la sonda TaqMan bajo una condición de 80 nM de KOAc.

Tabla 9. Valores de Pe obtenidos con las polimerasas que presentan diversas sustituciones en la posición I709 para ____________________________ amplificar moldes de ARN y ADN._______________________________

Enzima

Pe 10a copias de ARN Pe 10a copias de ADN Pe 10a copias de ADN

Z05 D580G

35,0 17,7 23,8

Z05D580G I709K

20,2 17,6 23,6

Z05D580G I709R

21,3 17,4 23,2

Z05D580G I709S

27,6 16,8 22,8

Z05D580G I709G

19,2 16,4 22,5

Z05D580G I709L

34,2 17,2 23,3

Z05D580G I709D

NS NS NS

Z05D580G I709A

28,4 17,1 23,1

NS=no se generaron mediante TaqMan curvas de crecimiento

El presente ejemplo demuestra que varias sustituciones de aminoácidos en la posición 709 de la ADN polimerasa de Z05 D580G resultan en una amplificación más eficiente de las dianas de ARN.

Ejemplo 3: cribado de bibliotecas de extractos para una tolerancia mejorada a las no correspondencias del cebador 3\

Se cribó la biblioteca de extractos del Ejemplo 1 para una tolerancia mejorada a las no correspondencias del cebador 3' mediante la comparación de la fluorescencia final tras la extensión por un enzima de un cebador (DG48, SEC ID n° 40, Tabla 10) perfectamente correspondiente con la secuencia del cebador M13mp18 vs. la fluorescencia final de un cebador (FR744, SEC ID n° 42, Tabla 10) con una no correspondencia 3' A:A.

Correspondencia perfecta de DG48:

5-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC-3’ (SEC ID n°40)

No correspondencia A:A de FR744:

5-GGGAAGGGCGAT CGGT GCGGGCCT CTT CGCA-3’ (SEC ID n° 42)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Los extractos de enzima anteriormente indicados se diluyeron 10 veces para las reacciones de extensión de cebador mediante la combinación de 2,5 pl de extracto con 22,5 pl de un tampón que contenía Tris-HCI 20 mM, pH 8, KCI 100 mM, EDTA 0,1 mM y Tween-20 al 0,2% en una placa para termociclador de 384 pocilios, tapando y calentando durante 10 minutos a 90°C. Las reacciones de control con cebador de correspondencia perfecta combinaban 0,5 pl del extracto diluido con 15 pl de mezcla maestra en placas para PCR de 384 pocilios. Se realizó un seguimiento de la extensión del molde con cebadores cada 15 segundos en un ciclador térmico cinético modificado utilizando una cámara CCD (ver Watson, supra). La mezcla maestra contenía 1 nM de molde de cebador ya cebado, tricina 25 mM, pH 8,3, KOAc 100 mM, 0,6X SYBR verde I, 200 mM de cada dNTP, 100 nM de aptámero y Mg(OAc)2 2,5 mM. Con el fin de distinguir la fluorescencia derivada de la extensión de la fluorescencia de fondo, se incluyeron pocilios en paralelo en el experimento en los que se había bloqueado la extensión de la cadena del cebador omitiendo los nucleótidos de la mezcla maestra de reacción. Las reacciones con el cebador con no correspondencia 3' (FR744, SEC ID n° 42) se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente, excepto en que se añadió 1,0 pl del extracto diluido a cada reacción.

Se cribaron aproximadamente 5.700 extractos mutantes utilizando el protocolo anteriormente indicado. Los clones se seleccionaron basándose en la fluorescencia máxima respecto a la línea de base de partida tras 1 minuto de extensión a 40°C seguido de 8,5 minutos de extensión a 64°C. Basándose en estos criterios se seleccionó un número relativamente reducido de extractos para la purificación y el ensayo adicional. En primer lugar se inocularon en estría en placas de agar selectivo para garantizar la pureza clonal y la secuencia de ADN de la región mutada del gen de polimerasa se secuenció para determinar la mutación o mutaciones que se encontraban presentes en cualquiera de los clones individuales. En paralelo con lo anterior, se expresó la proteína polimerasa muíante en matraz de cultivo, se purificó hasta la homogeneidad y se cuantificó.

Ejemplo 4: extensión de cebador de una diversidad de no correspondencias 3' respecto a un molde de M13

El presente ejemplo demuestra que las sustituciones en las posiciones 588 y 709 resultan en una polimerasa que presenta una eficiencia mejorada de extensión de un molde con cebadores con no correspondencias 3'.

Se comparó Z05 D580G I588T I709K purificado con el enzima parental Z05 D580G en la extensión de cebadores de una diversidad de no correspondencias 3' del cebador respecto a un molde M13mp18. Se listan los moldes y cebadores a continuación, en la Tabla 10:

Tabla 10. Cebadores utilizados para extender un molde de M13mp18.

Nombre

Descripción Secuencia (5'-3') SEC ID n°

M13mp18

Molde

DG48

Correspondencia perfecta GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC 40

FR743

No correspondencia T:G GGGAAGGGCGATCGGT GCGGGCCT CTTCGT 41

FR744

No correspondencia A:A GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCA 42

FR745

No correspondencia A:C GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCA 43

FR750

No correspondencia T:T GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTT 44

FR751

No correspondencia C:T GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTC 45

FR752

No correspondencia C:C GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCC 46

FR753

No correspondencia T:C GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCT 47

Los cebadores se prehibridaron con un molde M13mp18 en una proporción de cebadormolde de 10:1 y se añadieron a reacciones de extensión a una concentración final de 1 nM con 5 nM de enzima y tricina 25 mM, pH 8,3, KOAc 100 mM, 0,6X SYBR verde I, 200 mM de cada dNTP, 100 nM de aptámero y Mg(OAc)2 2,5 mM. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado con extensión del molde cebador monitorizado cada 15 segundos en un ciclador térmico cinético modificado utilizando una cámara de CCD (ver Watson, supra). Se promediaron las réplicas y se calculó la pendiente máxima para cada condición como el cambio de la fluorescencia con el tiempo. Se muestran los resultados en la Tabla 11, a continuación.

Tabla 11. Tasas de extensión de la polimerasa mutante de los cebadores no correspondientes.

Enzima

Cebador sin no correspondencias Cebadores con no correspondencias

DG48 FR743 FR744 FR745 FR750 FR751 FR752 FR753

C:G T:G A:A A:C T:T C:T C:C T:C

ZOS D580G

6,1 4,8 0,3 1,5 0,3 1,2 0,3 0,5

ZOS-D I588T I709K

13,3 14,0 0,5 9,4 3,7 15,6 0,7 7,2

El presente ejemplo demuestra que Z05 D580G I588T I709K es aproximadamente dos veces más rápido en la extensión de un molde de cebador perfectamente correspondiente que el enzima parental Z05 D580G y aproximadamente dos a 10 veces más rápido en la extensión de los moldes de cebador con no correspondencias 3' según la no correspondencia 3' terminal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 5: amplificación de plásmido molde BRAF mutante en un fondo de molde aenómico humano BRAF de tipo salvaje utilizando polimerasas mutantes.

El presente ejemplo demuestra que las mutaciones 588 y 709 resultan en una polimerasa que presenta una tolerancia mejorada a las no correspondencias en comparación con el enzima parental.

Se comparó Z05 D580G I588T I709K con el enzima Z05 D580G parental en una PCR TaqMan para la tolerancia mejorada a no correspondencias de una diana BRAF V600E mutante en un fondo de ADN genómico humano de tipo salvaje.

El cebador directo era perfectamente correspondiente con la secuencia mutante y presentaba una única no correspondencia A:A 3' respecto a la secuencia de tipo salvaje. Las reacciones presentaba 10.000 copias (33 ng) de ADN genómico de línea celular humana de tipo salvaje o bien 100 o 10.000 copias de un plásmido linearizado que contenía la secuencia mutante BRAF V600R en un volumen final de 16 pl. Para considerar los diferentes óptimos salinos de los enzimas, se llevaron a cabo amplificaciones utilizando un rango de concentraciones de KCI, de 40 a 145 mM. Las condiciones del tampón fueron Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, MgCh 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 0,02 U/ml de UNG y 200 nM de aptámero. Los cebadores directo e inverso se encontraban a una concentración de 100 nM y la sonda TaqMan, de 25 nM. Todas las ADN polimerasas se sometieron a ensayo a 20 nM y se añadió tampón de almacenamiento de enzima al 2% (v/v) (glicerol al 50% v/v, KC1100 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Tween-20 al 0,5%). Las reacciones se llevaron a cabo en un ciclador térmico LightCycler 480 de Roche y se desnaturalizaron utilizando una temperatura de 95°C durante 60 segundos, seguido de 99 ciclos de amplificación, utilizando una temperatura de desnaturalización de 92°C durante 10 segundos y una temperatura de hibridación de 62°C durante 30 segundos.

Las reacciones se llevaron a cabo por duplicado, se calcularon los puntos de cruce ("Pe") mediante el método de cuant. abs./max. de 2a derivada y se calcularon los promedios de los Pe. Los valores promedio de Pe se muestran en la Tabla 12, así como la eficiencia calculada de la PCR a la concentración de KCI para cada enzima que resultaba en el Pe más temprano de mutante de número de copia elevado. El valor de delta Pe de copia elevada es igual a la diferencia entre los valores promedio de Pe de las reacciones con 10.000 copias de diana genómica de tipo salvaje con no correspondencia 3' y los valores promedio de Pe de las reacciones con 10.000 copias de diana plasmídica perfectamente correspondiente.

Tabla 12. Valores de Pe de polimerasas mutantes utilizando un cebador con no correspondencia 3'.

Enzima

KCL óptimo (mM) Pe tipo salvaje 10.000 copias Pe plásmido mutante 100 coplas Pe plásmido mutante 10.000 coplas Eficiencia de la PCR (%) APc de copia elevada

Z05 D580G

100 32,5 33,1 26,9 109 5,7

Z05 D580G I588T I709K

100 30,0 33,2 26,6 100 3,4

El presente ejemplo demuestra que Z05 D580G I588T I709K resultan en una mejora de 2,3 ciclos en el APc de copla elevada, demostrando una tolerancia mejorada de una no correspondencia A:A 3'-terminal en el presente sistema de PCR.

Ejemplo 6: las polimerasa mutantes presentan una actividad mejorada en presencia de inhibidores.

El presente ejemplo demuestra que la mutación I709K resulta en una eficiencia mejorada de RT-PCR en presencia de inhibidores conocidos de las ADN polimerasas.

Hemina

La hemoglobina, un componente crítico de la sangre, puede degradarse en diversos productos de degradación del grupo heme, tales como hemina, hematina, hematoporfirina y finalmente bilirrubina. Debido a que dichas moléculas son tanto quelantes del hierro como pigmentos violeta, podrían utilizar varios mecanismos para inhibir la actividad de la polimerasa y/o de la transcriptasa inversa.

Se utilizó un sistema modelo con un transcrito de ARN del VHC para determinar los efectos de inhibición de la hemina en la RT-PCR utilizando las polimerasas de Z05, Z05 D580G y Z05D580G I709K. Se sometieron a ensayo bajo condiciones de RT-PCR, 45 U de ADN pol Z05, Z05 D580G o Z05 D580G I709K (KOAc 120 mM, Mn2+ 3,3 mM, tricina 60 mM; 50 pl en total) amplificando 1.000 copias de un transcrito de ARN del VHC con y sin adición de 2,5 pM de hemina (exceso molar de 40 veces respecto a la ADN pol.). Se llevaron a cabo estas reacciones en un instrumento de PCR en tiempo real Roche LightCycler 480 con una etapa de TI de 12 minutos seguida de 50 ciclos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de desnaturalización y extensión. Se detectó la fluorescencia en tiempo real en los canales JA270 y CY5.5 durante los últimos 50 ciclos. Los valores de Pe (punto de cruce) de las curvas de crecimiento generadas por la actividad fluorescente de la 5-nucleasa (TaqMan) de cada reacción se determinaron utilizando el método de "análisis del máx. de la 2a derivada" del instrumento. Se compararon los Pe de todas las reacciones normales con aquellas con hemina, tal como se muestra en la Tabla 13. En presencia de 2,5 pM de hemina, no se observó amplificación del ARN del VHC por parte de Z05, mientras que la variante Z05 D580G detectó VHC con un retraso del Pe de 3,4 ciclos (vs. el control sin hemina) y Z05 D580G I709K detectó el VHC con un Pe 2,5 ciclos anterior (vs. el control sin hemina).

Tabla 13. Valores de Pe de polimerasas mutantes en presencia y en ausencia de hemina

Enzima

Pe (-) HEMINA Pe (+) HEMINA

Z05

31,9 Sin señal

Z05 D580G

29,2 32,6

Z05 D580G I709K

28,2 25,7

La electroforesis en gel de agarosa confirmó que estos efectos se debían a una amplificación reducida y no por la inhibición por la molécula de porfirina de la hemina. Se obtuvieron resultados similares con los moldes de ADN del VHC, sugiriendo que la hemina actúa como un inhibidor general de la PCR.

Heparina

La heparina es un glucosaminoglicano altamente sulfatado y contiene una de las densidades de carga negativa más altas de entre las moléculas biológicas conocidas. De esta manera, puede mimetizar los sustratos ácidos nucleicos y se utiliza con frecuencia como competidor no específico en ensayos de unión de proteína-ADN/ARN. Mientras que la hemina actúa como un inhibidor general de polimerasas y de la PCR, la heparina inhibe preferentemente la transcripción inversa por, por ejemplo, las ADN polimerasas basadas en Z05.

Utilizando el sistema modelo de amplificación por RT-PCR de ARN del VHC indicado anteriormente, se sometió a ensayo la presencia de 100, 200, 400 o 1.000 ng/pl de heparina para determinar los efectos de inhibición utilizando las polimerasas de Z05, Z05 D580G o Z05 D580G I709K. Se compararon los Pe de todas las reacciones normales con las de la heparina (Tabla 14). Mientras que el enzima Z05 de tipo salvaje fue incapaz de amplificar el ARN del VHC en presencia de 12,5 ng/pl de heparina, los mutantes Z05 D580G y Z05 D580G I709K pudieron tolerar hasta 200 o 1.000 ng/pl de heparina con retrasos mínimos del Pe, sugiriendo que estas variantes son tolerantes de por lo menos 15 a 80 veces más heparina, respectivamente.

Una comparación directa entre los sustratos ARN y ADN reveló que la amplificación del ADN por Z05 D580G y Z05 D580G I709K no se ve afectada en absoluto por la presencia de niveles elevados de heparina. Globalmente estos datos corroboran la idea de que la heparina es un inhibidor que inhibe más específicamente la transcripción inversa. La resistencia de una ADN pol. a la heparina se correlaciona directamente con la actividad de TI intrínseca de cada enzima particular.

Tabla 14. Valores de Pe de polimerasas mutantes en presencia de cantidades crecientes de heparina.

Enzima

Pe (-) HEPARINA Pe (+)100 nq/pIHEPARINA Pe (+) 200 nq/pIHEPARINA Pe (+) 400 ng/pIHEPARINA Pe (+) 1.000 nq/pIHEPARINA

Z05

33,2 Sin señal Sin señal Sin señal Sin señal

Z05 D580G

29,4 32,2 38,7 Sin señal Sin señal

Z05 D580G I709K

28,3 28,4 28,5 29,2 33,4

El presente ejemplo demuestra que la mutación I709K resulta en una eficiencia mejorada de RT-PCR en presencia de los inhibidores hemina y heparina.

Ejemplo 7: las polimerasas mutantes presentan una tolerancia mejorada a la no correspondencia de cebadores al extender un molde de ARN.

El presente ejemplo demuestra que las mutaciones D580G e I709K resultan en polimerasas que presentan una tolerancia mejorada a las no correspondencias de los cebadores respecto a un molde de ARN.

Tolerancia a las no correspondencias

Los transcritos de ARN del VHC se mutaron en regiones bajo los extremos 3' del cebador de manera que las no correspondencias terminal, N-1 y N-2 pudiesen evaluarse sistemáticamente bajo condiciones de RT-PCR (KOAc 120 mM, Mn2+ 3,3 mM, tricina 60 mM; 50 pl de volumen total de reacción) con las polimerasas Z05, Z05 D580G y Z05 D580G I709K. Se llevaron a cabo estas reacciones en un instrumento de PCR en tiempo real Roche LightCycler 480 con una etapa de TI de 12 minutos seguida de 50 ciclos de desnaturalización y extensión. Se detectó la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

fluorescencia en tiempo real en los canales JA270 y CY5.5 durante los últimos 50 ciclos. Los valores de Pe (punto de cruce) de las curvas de crecimiento generadas por la actividad fluorescente de la 5'-nucleasa (TaqMan) de cada reacción se determinaron utilizando el método de "análisis del máx. de la 2a derivada" del instrumento. La tolerancia a no correspondencias del cebador para diversas ADN polimerasas se determinó mediante comparación de los valores de Pe. Tal como se muestra en la Tabla 15, Z05 D580G consistentemente mostró valores de Pe muy anteriores a los de Z05 al utilizar cebadores con no correspondencias (N se refiere a la posición en el extremo 3'- termlnal del cebador con la no correspondencia cebadormolde indicada posteriormente). Resulta importante que Z05 D580G fue capaz de detectar varias no correspondencias que el enzima Z05 parental no pudo detectar.

TABLA 15. Valores de Pe de las polimerasas Z05 y Z05 D580G utilizando cebadores con no correspondencias.

Enzima

No correspondencia N A:A N A:G N-1 T:C N-1 T:T N-2 T:C N-2 T:T

Z05

25,2 Sin señal 49,4 48,9 33,2 47,2 Sin señal

Z05 D580G

24,7 33,1 31,2 32,7 30,1 30,9 34,3

En la Tabla 16, se determinaron los valores de delta Pe mediante la comparación de los valores de Pe de Z05 D580G y Z05 D580G I709K para cada una de las no correspondencias Indicadas. De esta manera, los valores de delta Pe positivos indican cuantos ciclos antes se detectó la señal de TaqMan® con Z05 D580G I709K. Globalmente, el muíante Z05 D580G I709K mostraba la tolerancia más alta a no correspondencias del cebador, proporcionando una mejora de 4 ciclos de media respecto al enzima parental Z05 D580G para las no correspondencias mostradas, reflejando una mejora de 16 veces en el rendimiento de la PCR.

TABLA 16. Delta Pe de las polimerasas Z05 D580G vs. Z05 D580G I709K utilizando cebadores con no _________________________________correspondencias.__________________________________

No correspondencia N C:T N C:A N-1 A:A N-1 A:C N-2 C:C Inserción en N-2

delta Cp

1,3 4,9 2,6 5,2 2,4 4,0 4,8

El ejemplo anterior demuestra que las sustituciones en las posiciones 580 y 709 de la polimerasa Z05 resultan en una eficiencia mejorada de la RT-PCR al utilizar cebadores con no correspondencias.

Ejemplo 8: la mutación 709 mejora la eficiencia de la RT-PCR.

El presente ejemplo demuestra que el muíante único I709K en la ADN polimerasa de Z05 resulta en una polimerasa que presenta una eficiencia mejorada de la RT-PCR sin que se reduzca la eficiencia al amplificar un molde de ADN.

Se subclonó la mutación I709K en el esqueleto de la ADN polimerasa de Z05 como mutante único. Tras la expresión y la purificación, se compararon las eficiencias de la RT-PCR del mutante Z05 I709K con las ADN polimerasas de Z05, Z05 D580G y Z05 D580G I709K en RT-PCR TaqMan® basada en Mn2+. Las condiciones de la mezcla maestra eran las mismas que las indicadas anteriormente, en la Tabla 4, excepto en que la concentración de Mn(OAc)2 era de 1,5 mM, la concentración de UNG era de 0,2 U/pl y la concentración de la sonda era de 100 nM. Se diluyó cada ADN polimerasa en tampón que contenía Tris-HCI 20 mM, pH 8, KCI 100 mM, EDTA 0,1 mM y Tween-20 al 0,1% para preparar las soluciones madre de enzima 5X individuales. A continuación, se añadieron 3 pl de solución madre de enzima 5X al pocilio de reacción adecuado hasta llegar una concentración final de enzima de 20 nM en un volumen total de reacción de 15 pl. Cada reacción presentaba 100.000 copias del transcrito JP2-5, 100.000 copias del ADN del plásmido lineal pJP2-5 o 1.000 coplas del ADN del plásmldo lineal pJP2-5. Se amplificaron todas las dianas con el mismo conjunto de cebadores en réplicas de cuatro reacciones, generando un ampllcón de 240 pares de bases. Todas las reacciones se llevaron a cabo en el ciclador térmico Roche Light Cycler 480. Se calcularon los puntos de cruce (Pe) mediante el método de cuant. abs/max. de 2a derivada y se promediaron. Las condiciones del termoclclado fueron: 2 minutos a 50°C (etapa de "UNG"); 55°C - 30 segundos, 60°C - 1 minuto y 65°C - 1,5 minutos (etapa de "TI" de tres temperaturas); 5 ciclos de 94°C durante 15 segundos seguidos de 62°C durante 30 segundos y 45 ciclos de 91°C durante 15 segundos seguido de 62°C durante 30 segundos. La Tabla 17 muestra los valores de Pe obtenidos del incremento de señal fluorescente debido al corte de la sonda TaqMan®.

Tabla 17. Valores de Pe de las polimerasas mutantes en la RT-PCR

Enzima

Pe 103 copias de ARN Pe 103 coplas de ADN Pe 10J copias de ADN

Z05

34,3 17,8 25,1

Z05 D580G

22,0 17,7 24,8

Z05 I709K

20,8 17,6 24,7

Z05 D580G I709K

18,6 17,5 24,5

El presente ejemplo muestra que la mutación I709K resulta en una eficiencia incrementada de transcripción inversa y amplificación utilizando un molde de ARN en comparación con el enzima parental Z05 sin reducción de la eficiencia de amplificación al utilizar un molde ADN.

5 LISTADO DE SECUENCIAS INFORMAL

SEC ID n° 1 ADN polimerasa de Thermus sp. Z05 (Z05)

MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFWFDAK APSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRIL TADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLK EWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRSDLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEF GSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACKEGRVHRAKDPLAGLKDLKEV RGLLAKDLAVLALREGLDLAPSDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLAERLQQNLLE RLKGEEKLLWLYQEVEKPLSRVLAHMEATGVRLDVAYLKALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRD QLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPGLVHPRTG RLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPIRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENL IRVFQEGKDIHTQTASWMFGVSPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQ SFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKL FPHLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKG

10 SEC ID n° 2 ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq)

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEFVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIWFDAKA PSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILT ADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEE WGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGS LLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARG LLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRL EGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQL ERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRL HTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIR VFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSF PKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFP RLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE

SEC ID n° 3 ADN polimerasa de Thermus filiformis (Tfi)

15

MLPLLEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGEVAIWFDAKAPSF

RHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLVRLEVPGFEADDVLATLARKAEREGYEVRILSADR

DLYQLLSDRIHLLHPEGEVLTPGWLQERYGLSPERWVEYRALVGDPSDNLPGVPGIGEKTALKLLKEWGS

LEAILKNLDQVKPERVWEAIRNNLDKLQMSLELSRLRTDLPLEVDFAKRREPTGKGLKAFLERLEFGSLL

HEFGLLEAPKEAEEAPWPPPGGAFLGFLLSRPEPMWAELLALAGAKEGRVHRAEDPVGALKDLKEIRGLL

AKDLSVLALREGREIPPGDDPMLLAYLLDPGNTNPEGVARRYGGEWKEDAAARALLSERLWQALYPRVAE

EERLLWLYREVERPLAQVLAHMEATGVRLDVPYLEALSQEVAFELERLEAEVHRLAGHPFNLNSRDQLER

VLFDELGLPPIGKTEKTGKRSTSAAVLELLREAHPIVGRILEYRELMKLKSTYIDPLPRLVHPKTGRLHT

RFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRKAFIAEEGHLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVF

REGKDIHTETAAWMFGVPPEGVDGAMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELSIPYEEAAAFIERYFQSFPK

VRAWIAKTLEEGRKKGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRL

RPLGVRILLQVHDELVLEAPKARAEEAAQLAKETMEGVYPLSVPLEVEVGMGEDWLSAKE

SEC ID n° 4 ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl)

MAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDVWWFDAKAP

SFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLVRLEVPGFEADDVLATLAKRAEKEGYEVRILTA

DRDLYQLLSERIAILHPEGYLITPAWLYEKYGLRPEQWVDYRALAGDPSDNIPGVKGIGEKTAQRLIREW

GSLENLFQHLDQVKPSLREKLQAGMEALALSRKLSQVHTDLPLEVDFGRRRTPNLEGLRAFLERLEFGSL

LHEFGLLEGPKAAEEAPWPPPEGAFLGFSFSRPEPMWAELLALAGAWEGRLHRAQDPLRGLRDLKGVRGI

LAKDLAVLALREGLDLFPEDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAGERALLAERLFQTLKERLK

GEERLLWLYEEVEKPLSRVLARMEATGVRLDVAYLQALSLEVEAEVRQLEEEVFRLAGHPFNLNSRDQLE

20 RVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVDRILQYRELTKLKNTYIDPLPALVHPKTGRLH

5

10

15

20

25

TRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFVAEEGWVLWLDYSQIELRVLAHLSGDENLIRV

FQEGRDIHTQTASWMFGVSPEGVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSGELSIPYEEAVAFIERYFQSYP

KVRAWIEGTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVRLFPR

LQELGARMLLQVHDELVLEAPKDRAERVAALAKEVMEGVWPLQVPLEVEVGLGEDWLSAKE

SEC ID n° 5 ADN polimerasa de Thermus sp. Sps17 (Sps17)

MLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGEVAIWFDAKAPSF RHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLVRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRILSADR DLYQLLSDRIHLLHPEGEVLTPGWLQERYGLSPERWVEYRALVGDPSDNLPGVPGIGEKTALKLLKEWGS LEAILKNLDQVKPERVREAIRNNLDKLQMSLELSRLRTDLPLEVDFAKRREPDWEGLKAFLERLEFGSLL HEFGLLEAPKEAEEAPWPPPGGAFLGFLLSRPEPMWAELLALAGAKEGRVHRAEDPVGALKDLKEIRGLL AKDLSVLALREGREIPPGDDPMLLAYLLDPGNTNPEGVARRYGGEWKEDAAARALLSERLWQALYPRVAE EERLLWLYREVERPLAQVLAHMEATGVRLDVPYLEALSQEVAFELERLEAEVHRLAGHPFNLNSRDQLER VLFDELGLPPIGKTEKTGKRSTSAAVLELLREAHPIVGRILEYRELMKLKSTYIDPLPRLVHPKTGRLHT RFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRKAFIAEEGHLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVF REGKDIHTETAAWMFGVPPEGVDGAMRRAAKTVNFGVLY GMSAHRL SQ EL SIPYEEAAAFIERYFQSFPK VRAWIAKTLEEGRKKGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRL RPLGVRILLQVHDELVLEAPKARAEEAAQLAKETMEGVYPLSVPLEVEVGMGEDWLSAKA

SEC ID n° 6 ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth)

MEAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFWFDAK APSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGYEADDVLATLAKKAEKEGYEVRIL TADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLRPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLK EWGSLENLLKNLDRVKPENVREKIKAHLEDLRLSLELSRVRTDLPLEVDLAQGREPDREGLRAFLERLEF GSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACRDGRVHRAADPLAGLKDLKEV RGLLAKDLAVLASREGLDLVPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLSERLHRNLLK RLEGEEKLLWLYHEVEKPLSRVLAHMEATGVRRDVAYLQALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRD QLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPSLVHPRTG RLHTRFNQTATATGRL S S SDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENL IRVFQEGKDIHTQTASWMFGVPPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQ SFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKL FPRLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGMGEDWLSAKG

SEC ID n° 7 ADN polimerasa de Thermus caldophilus (Tea)

MEAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFWFDAK

APSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGYEADDVLATLAKNPEKEGYEVRIL

TADRDLDQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWQKYGLKPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLK

EWGSLENLLKNLDRVKPENVREKIKAHLEDLRLSLELSRVRTDLPLEVDLAQGREPDREGLRAFLERLEF

GSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACRDGRVHRAADPLAGLKDLKEV

RGLLAKDLAVLASREGLDLVPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLSERLHRNLLK

RLQGEEKLLWLYHEVEKPLSRVLAHMEATGVRLDVAYLQALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRD

QLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPSLVHPNTG

RLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRXRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENL

IRVFQEGKDIHTQTASWMFGVPPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQ

SFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDXiNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKL

FPRLREMGARMLLQVHDELLLEAPQAGAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGMGEDWLSAKG

SEC ID n° 8

XiX2X3X4X5X6X7X8X9X1oX11X12Xi3GYVXi4TL, en la que Xi es A, D, S, E, R o Q; X2 es W o Y; X3 es cualquier

aminoácido diferente de I, L o M; X4es E, A, Q, K, N o D; Xses K, G, R, Q, H o N; X6 es T, V, M o I; Xzes L, V o K; Xs

es E, S, A, D o Q; Xges E o F; Xioes G o A; Xn es R o K; Xi2es K, R, E, T o Q; X-i3es R, K o H; and Xi4es E, R o T.

SEC ID n° 9

XiX2X3X4X5X6X7X8EXioXhXi2Xi3GYVXi4TL, wherein Xi is A, D, or S; X2 is W or Y; X3 is any amino acid other than I;

X4ÍS E, A, or Q; Xsis K, G, R or Q; X6¡s T or V; X7ÍS L or V; Xgis E, S or A; X-iois G or A; Xnis R or K; Xi2 is K, R or E;

Xi3es R o K; and Xi4es E o R.

SEC ID n° 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

AWX3X4X5TLEEGRX12X13GYVETL, en la que X3 es cualquier aminoácido diferente de I; X4 es E o A; X5 es K o G; X12 es K o R; y X^es R o K.

SEC ID n° 11

AWX3X4X5TLEEGRX12X13GYVETL, en la que X3 es K, R, S, G, o A; X4 es E o A; X5 es K o G; X12 es K o R; and X13 es R o K.

SEC ID n° 12 ZO5

AWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNA SEC ID n° 13 Taq

AWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEA SEC ID n° 14 Tfi

AWIAKTLEEGRKKGYVETLFGRRRYVPDLNA SEC ID n° 15 Tfl

AWIEGTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLNA SEC ID n° 16 Sps17

AWIAKTLEEGRKKGYVETLFGRRRYVPDLNA SEC ID n° 17 Tth

AWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNA SEC ID n° 18 Tca

AWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNA SEC ID n° 19 Tma

DYIQRWSEAKEKGYVRTLFGRKRDIPQLMA SEC ID n° 20 Tne

SYIQQVVAEAKEKGYVRTLFGRKRDIPQLMA SEC ID n° 21 Taf

EYLKRMKDEARKKGYVTTLFGRRRYIPQLRS

SEC ID n° 22 motivo A de sitio activo de ADN polimerasa

DYSQIELR

SEC ID n° 23 Dra

RYINHTLDFGRTHGYVETLYGRRRYVPGLSS SEC ID n° 24 Bst

QYMDNIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITS SEC ID n° 25 Bca

RYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITS

SEC ID n° 26 motivo de consenso nativo

X1X2X3X4X5X6X7X6X9X10X11X12X13GYVX14TL, en la que X1 es A, D, S, E, R o Q; X2 es W o Y; X3 es I, L o M; X4 es E, A, Q, K, N o D; X5 es K, G, R, Q, H o N; Xa es T, V, M o I; X7 es L, V o K; X8 es E, S, A, D o Q; X9 es E o F;

X10 es G o A; X11 es R o K; Xi2es K, R, E, T o Q; X13 es R, K o H; y X14 es E, R o T.

SEC ID n° 27 ADN polimerasa CS5

MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFWFDAK APSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRIL TADRDL Y QLVSDRVAVLH PEGHLITPEWLWEKY GLKPEQWVDFRALVGDPSDNL PGVKGIGEKTALKLLK EWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRSDLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEF GSLLHEFGLLEESEPVGYRIVKDLVEFEKLIEKLRESPSFAIDLETSSLDPFDCDIVGISVSFKPKEAYY IPLHHRNAQNLDEKEVLKKLKEILEDPGAKIVGQNLKFDYKVLMVKGVEPVPPYFDTMIAAYLLEPNEKK FNLDDLALKFLGYKMTSYQELMSFSFPLFGFSFADVPVEKAANYSCEDADITYRLYKTLSLKLHEADLEN VFYKIEMPLVNVLARMELNGVYVDTEFLKKLSEEYGKKLEELAEEIYRIAGEPFNINSPKQVSRILFEKL GIKPRGKTTKTGDYSTRIEVLEELAGEHEIIPLILEYRKIQKLKSTYIDALPKMVNPKTGRIHASFNQTG TATGRLSSSDPNLQNLPTKSEEGKEIRKAIVPQDPNWWIVSADYSQIELRILAHLSGDENLLRAFEEGID VHTLTASRIFNVKPEEVTEEMRRAGKMVNFS11YGVTPYGLSVRLGVPVKEAEKMIVNYFVLYPKVRDYI QRWSEAKEKGYVRTLFGRKRDIPQLMARDRNTQAEGERIAINTPIQGTAADIIKLAMIEIDRELKERKM RSKMIIQVHDELVFEVPNEEKDALVELVKDRMTNWKLSVPLEVDVTIGKTWS

SEC ID n° 28 ADN polimerasa CS6

MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFWFDAK APSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRIL TADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLK EWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRSDLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEF GSLLHEFGLLEESEPVGYRIVKDLVEFEKLIEKLRESPSFAIALATSSLDPFDCDIVGISVSFKPKEAYY IPLHHRNAQNLDEKEVLKKLKEILEDPGAKIVGQNLKFDYKVLMVKGVEPVPPYFDTMIAAYLLEPNEKK FNLDDLALKFLGYKMTSYQELMSFSFPLFGFSFADVPVEKAANYSCEDADITYRLYKTLSLKLHEADLEN VFYKIEMPLVNVLARMELNGVYVDTEFLKKLSEEYGKKLEELAEEIYRIAGEPFNINSPKQVSRILFEKL GIKPRGKTTKTGDYSTRIEVLEELAGEHEIIPLILEYRKIQKLKSTYIDALPKMVNPKTGRIHASFNQTG TATGRLSSSDPNLQNLPTKSEEGKEIRKAIVPQDPNWWIVSADYSQIELRILAHLSGDENLLRAFEEGID VHTLTASRI FNVKPEEVTEEMRRAGKMVNFSIIYGVTPYGLSVRLGVPVKEAEKMI VNYFVLYPKVRDYI QRWS EAKEKGYVRTL FGRKRDIPQLMARDRNTQAEGERIAINTPIQGTAADIIKLAMIEIDRELKERKM 5 RSKMIIQVHDELVFEVPNEEKDALVELVKDRMTNWKLSVPLEVDVTIGKTWS

SEC ID n° 29

PNLQNX1PX2X3X4X5X6G, en la que X1 es I o L; X2 es cualquier aminoácido diferente de I o V; X3 es R o K; X4 es T, S

o L; X5 es P o E; y X6 es L o E.

10

SEC ID n° 30 Cebador directo

5’-CTACCTCCTGGACCCCTCCAA-3’

SEC ID n° 31 Cebador inverso

15 5’-ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA-3’

SEC ID n° 32 ADN polimerasa de Deinococcus radiodurans (Dra)

MADASPDPSKPDALVLIDGHALAFRSYFALPPLNNSKGEMTDAIVGFMKLLLRLARQKSNQVIWFDPPV KTLRHEQYEGYKSGRAQTPEDLRGQINRIRALVDALGFPRLEEPGYEADDVIASLTRMAEGKGYEVRIVT SDRDAYQLLDEHVKVIANDFSLIGPAQVEEKYGVTVRQWVDYRALTGDASDNIPGAKGIGPKTAAKLLQE YGTLEKVYEAAHAGTLKPDGTRKKLLDSEENVKFSHDLSCMVTDLPLDIEFGVRRLPDNPLVTEDLLTEL ELHSLRPMILGLNGPEQDGHAPDDLLEREHAQTPEEDEAAALPAFSAPELAEWQTPAEGAVWGYVLSRED DLTAALLAAATFEDGVARPARVSEPDEWAQAEAPENLFGELLPSDKPLTKKEQKALEKAQKDAEKARAKL REQFPATVDEAEFVGQRTVTAAAAKALAAHLSVRGTWEPGDDPLLYAYLLDPANTNMPWAKRYLDREW PADAPTRAAITGHLVRELPPLLDDARRKMYDEMEKPLSGVLGRMEVRGVQVDSDFLQTLSIQAGVRLADL ESQIHEYAGEEFHIRSPKQLETVLYDKLELASSKKTKLTGQRSTAVSALEPLRDAHPIIPLVLEFRELDK LRGTYLDPIPNLVNPHTGRLHTTFAQTAVATGRLSSLNPNLQNIPIRSELGREIRKGFIAEDGFTLIAAD YSQIELRLLAHIADDPLMQQAFVEGADIHRRTAAQVLGLDEATVDANQRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSN DLGIPYAEAATFIEIYFATYPGIRRYINHTLDFGRTHGYVETLYGRRRYVPGLSSRNRVQREAEERLAYN MPIQGTAADIMKL AMVQLDPQLDAIGARMLLQVHDELLIEA PLDKAEQVAALTKKVMENWQLKVPLAVE

20 VGTGPNWFDTK

SEC ID n° 33 ADN polimerasa de Thermosipho africanas (Taf)

MGKMFLFDGTGLVYRAFYAIDQSLQTSSGLHTNAVYGLTKMLIKFLKEHISIGKDACVFVLDSKGGSKKR KDILETYKANRPSTPDLLLEQIPYVEELVDALGIKVLKIEGFEADDIIATLSKKFESDFEKVNIITGDKD LLQLVSDKVFVWRVERGITDLVLYDRNKVIEKYGIYPEQFKDYLSLVGDQIDNIPGVKGIGKKTAVSLLK KYNSLENVLKNINLLTEKLRRLLEDSKEDLQKSIELVELIYDVPMDVEKDEIIYRGYNPDKLLKVLKKYE FSSIIKELNLQEKLEKEYILVDNEDKLKKLAEEIEKYKTFSIDTETTSLDPFEAKLVGISISTMEGKAYY IPVSHFGAKNISKSLIDKFLKQILQEKDYNIVGQNLKFDYEIFKSMGFSPNVPHFDTMIAAYLLNPDEKR FNLEELSLKYLGYKMISFDELVNENVPLFGNDFSYVPLERAVEYSCEDADVTYRIFRKLGRKIYENEMEK LFYEIEMPLIDVLSEMELNGVYFDEEYLKELSKKYQEKMDGIKEKVFEIAGETFNLNSSTQVAYILFEKL NIAPYKKTATGKFSTNAEVLEELSKEHEIAKLLLEYRKYQKLKSTYIDSIPLSINRKTNRVHTTFHQTGT STGRL S S SNPNLQNLPTRS EEGKEIRKAVRPQRQDWWILGADYSQIELRVLAHVSKDENLLKAFKEDLDI HTITAAKIFGVSEMFVSEQMRRVGKMVNFAIIYGVSPYGLSKRIGLSVSETKKIIDNYFRYYKGVFEYLK RMKDEARKKGYVTTLFGRRRYIPQLRSKNGNRVQEGERIAVNTPIQGTAADIIKIAMINIHNRLKKENLR SKMILQVHDELVFEVPDNELEIVKDLVRDEMENAVKLDVPLKVDVYYGKEWE

SEC ID n° 34 ADN polimerasa de Thermotoga marítima (Tma)

MARLFLFDGTALAYRAYYALDRSLSTSTGIPTNATYGVARMLVRFIKDHIIVGKDYVAVAFDKKAATFRH KLLETYKAQRPKTPDLLIQQLPYIKKLVEALGMKVLEVEGYEADDIIATLAVKGLPLFDEIFIVTGDKDM LQLVNEKIKVWRIVKGISDLELYDAQKVKEKYGVEPQQIPDLLALTGDEIDNIPGVTGIGEKTAVQLLEK YKDLEDILNHVRELPQKVRKALLRDRENAILSKKLAILETNVPIEINWEELRYQGYDREKLLPLLKELEF ASIMKELQLYEESEPVGYRIVKDLVEFEKLIEKLRESPSFAIDLETSSLDPFDCDIVGISVSFKPKEAYY IPLHHRNAQNLDEKEVLKKLKEILEDPGAKIVGQNLKFDYKVLMVKGVEPVPPYFDTMIAAYLLEPNEKK FNLDDLALKFLGYKMTSYQELMSFSFPLFGFSFADVPVEKAANYSCEDADITYRLYKTLSLKLHEADLEN VFYKIEMPLVNVLARMELNGVYVDTEFLKKLSEEYGKKLEELAEEIYRIAGEPFNINSPKQVSRILFEKL GIKPRGKTTKTGDYSTRIEVLEELAGEHEIIPLILEYRKIQKLKSTYIDALPKMVNPKTGRIHASFNQTG TATGRLSSSDPNLQNLPTKSEEGKEIRKAIVPQDPNWWIVSADYSQIELRILAHLSGDENLLRAFEEGID VHTLTASRIFNVKPEEVTEEMRRAGKMVNFS11YGVT PYGLSVRLGVPVKEAEKMIVNYFVLYPKVRDYI QRWSEAKEKGYVRTLFGRKRDIPQLMARDRNTQAEGERIAINTPIQGTAADIIKLAMIEIDRELKERKM 5 RSKMIIQVHDELVFEVPNEEKDALVELVKDRMTNWKLSVPLEVDVTIGKTW S

SEC ID n° 35 ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne)

MARLFLFDGTALAYRAYYALDRSLSTSTGIPTNAVYGVARMLVKFIKEHIIPEKDYAAVAFDKKAATFRH KLLVSDKAQRPKTPALLVQQLPYIKRLIEALGFKVLELEGYEADDIIATLAVRAARFLMRFSLITGDKDM LQLVNEKIKVWRIVKGISDLELYDSKKVKERYGVEPHQIPDLLALTGDDIDNIPGVTGIGEKTAVQLLGK YRNLEYILEHARELPQRVRKALLRDREVAILSKKLATLVTNAPVEVDWEEMKYRGYDKRKLLPILKELEF ASIMKELQLYEEAEPTGYEIVKDHKTFEDLIEKLKEVPSFALDLETSSLDPFNCEIVGISVSFKPKTAYY IPLHHRNAHNLDETLVLSKLKEILEDPSSKIVGQNLKYDYKVLMVKGISPVYPHFDTMIAAYLLEPNEKK FNLEDLSLKFLGYKMTSYQELMSFSSPLFGFSFADVPVDKAAEYSCEDADITYRLYKILSMKLHEAELEN VFYRIEMPLVNVLARMEFNWVYVDTEFLKKLSEEYGKKLEELAEKIYQIAGEPFNINSPKQVSNILFEKL GIKPRGKTTKTGDYSTRIEVLEEIANEHEIVPLILEFRKILKLKSTYIDTLPKLVNPKTGRFHASFHQTG TATGRLSSSDPNLQNLPTKSEEGKEIRKAIVPQDPDWWIVSADYSQIELRILAHLSGDENLVKAFEEGID VHTLTASRIYNVKPEEVNEEMRRVGKMVNFSIIYGVTPYGLSVRLGIPVKEAEKMIISYFTLYPKVRSYI QQWAEAKEKGYVRTLFGRKRDIPQLMARDKNTQSEGERIAINTPIQGTAADIIKLAMIDIDEELRKRNM KSRMIIQVHDELVFEVPDEEKEELVDLVKNKMTNWKLSVPLEVDISIGKSWS

10

SEC ID n° 36 ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Bst)

MKNKLVLIDGNSVAYRAFFAL PLLHNDKGIHTNAVYGFTMMLNKILAEEQ PTHILVAFDAGKTTFRHETF QDYKGGRQQTPPELSEQFPLLRELLKAYRIPAYELDHYEADDIIGTMAARAEREGFAVKVISGDRDLTQL ASPQVTVEITKKGITDIESYTPETWEKYGLTPEQIVDLKGLMGDKSDNIPGVPGIGEKTAVKLLKQFGT VENVLASIDEIKGEKLKENLRQYRDLALLSKQLAAICRDAPVELTLDDIVYKGEDREKWALFQELGFQS FLDKMAVQTDEGEKPLAGMDFAIADSVTDEMLADKAALWEWGDNYHHAPIVGIALANERGRFFLRPET ALADPKFLAWLGDETKKKTMFDSKRAAVALKWKGIELRGWFDLLLAAYLLDPAQAAGDVAAVAKMHQYE AVRSDEAVYGKGAKRTVPDEPTLAEHLARKAAAIWALEEPLMDELRRNEQDRLLTELEQPLAGILANMEF TGVKVDTKRLEQMGAELTEQLQAVERRIYELAGQEFNINSPKQLGTVLFDKLQLPVLKKTKTGYSTSADV LEKLAPHHEIVEHILHYRQLGKLQSTYIEGLLKWHPVTGKVHTMFNQALTQTGRLSSVEPNLQNIPIRL EEGRKIRQAFVPSEPDWLIFAADYSQIELRVLAHIAEDDNLIEAFRRGLDIHTKTAMDIFHVSEEDVTAN MRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNITRKEAAEFIERYFASFPGVKQYMDNIVQEAKQKGYVTTLLHRR RYLPDITSRNFNVRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLSVRLREERLQARLLLQVHDELILEAPKEE IERLCRLVPEVMEQAVALRVPLKVDYHYGPTWYDAK

5

10

15

20

25

SEC ID n° 37 ADN polimerasa de Bacillus caldotenax (Bca)

MKKKLVLIDGS SVAYRAFFALPLLHNDKGIHTNAVYGFTMMLNKILAEEEPTHMLVAFDAGKTTFRHEAF QEYKGGRQQTPPELSEQFPLLRELLRAYRIPAYELENYEADDIIGTLAARAEQEGFEVKVISGDRDLTQL ASPHVTVDITKKGITDIEPYTPEAVREKYGLTPEQIVDLKGLMGDKSDNIPGVPGIGEKTAVKLLRQFGT VENVLASIDEIKGEKLKETLRQHREMALLSKKLAAIRRDAPVELSLDDIAYQGEDREKWALFKELGFQS FLEKMESPSSEEEKPLAKMAFTLADRVTEEMLADKAALWEWEENYHDAPIVGIAWNEHGRFFLRPET ALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYE AVRPDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWALERPFLDELRRNEQDRLLVELEQPLSSILAEMEF AGVKVDTKRLEQMGEELAEQLRTVEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKSKTGYSTSADV LEKLAPYHEIVENILQHYRQLGKLQSTYIEGLLKWRPDTKKVHTIFNQALTQTGRLSSTEPNLQNIPIR LEEGRKIRQAFVPSESDWLIFAADYSQIELRVLAHIAEDDNLMEAFRRDLDIHTKTAMDIFQVSEDEVTP NMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNISRKEAAEFIERYFESFPGVKRYMENIVQEAKQKGYVTTLLHR RRYLPDITSRNFNVRSFAERMAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLNARLKEERLQARLLLQVHDELILEAPKE EMERLCRLVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGSTWYDAK

SEC ID n° 38 motivo modificado de Z05 D580

T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N, en la que X7 es S o T; y X8 es cualquier aminoácido diferente de D o E.

SEC ID n° 39 amplicón sintético codificante de la ADN polimerasa Z05 D580G

ctacctcctggacccctccaacaccacccccgagggggtggcccggcgctacgggggggagtggacggag

gacgccgcccaccgggccctcctcgctgagcggctccagcaaaacctcttggaacgcctcaagggagagg

aaaagctcctttggctctaccaagaggtggaaaagcccctctcccgggtcctggcccacatggaggccac

cggggtaaggctggacgtggcctatctaaaggccctttccctggagcttgcggaggagattcgccgcctc

gaggaggaggtcttccgcctggcgggccaccccttcaacctgaactcccgtgaccagctagagcgggtgc

tctttgacgagcttaggcttcccgccctgggcaagacgcaaaagacggggaagcgctccaccagcgccgc

ggtgctggaggccctcagggaggcccaccccatcgtggagaagatcctccagcaccgggagctcaccaag

ctcaagaacacctacgtagaccccctcccgggcctcgtccacccgaggacgggccgcctccacacccgct

tcaaccagacagccacggccacgggaaggctctctagctccgggcccaacctgcagaacatccccatccg

cacccccttgggccagaggatccgccgggccttcgtggccgaggcgggatgggcgttggtggccctggac

tatagccagatagagctccgggtcctcgcccacctctccggggacgagaacctgatcagggtcttccagg

aggggaaggacatccacacccagaccgcaagctggatgttcggcgtctccccggaggccgtggaccccct

gatgcgccgggcggccaagacggtgaacttcggcgtcctctacggcatgtccgcccataggctctcccag

gagcttgccatcccctacgaggaggcggtggcctttatagagcgctacttccaaagcttccccaaggtgc

gggcctggatagaaaagaccctggaggaggggaggaagcggggctacgtggaaaccctcttcggaagaag

gcgctacgtgcccgacctcaacgcccgggtgaagagcgtcagggaggccgcggagcgcatggccttcaac

atgcccgtccagggcaccgccgccgacctcatgaagctcgccatggtgaagctcttcccccacctccggg

agatgggggcccgcatgctcctccaggtccacgacgagctcctcctggaggccccccaagcgcgggccga

ggaggtggcggctttggccaaggaggccatggagaaggcctatcccctcgccgtgcccctggaggtggag

gtggggatcggggaggactggctttccgccaagggctgatatcagatctccctgattatgcgtcagtcta

tgaagaaaaatcgtatacagatggacgaagagagaatccttgtgaatttaacagagggtatagggattac

acgccactaccagttggttat

SEC ID n° 40

gggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgc SEC ID n° 41

gggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgt SEC ID n° 42

gggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgca SEC ID n° 43

gggaagggcgatcggtgcgggcctcttca SEC ID n° 44

gggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctt SEC ID n° 45

gggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctc

5

10

15

20

25

30

35

SEC ID n° 46

gggaagggcgatcggtgcgggcctcttcc SEC ID n° 47

gggaagggcgatcggtgcgggcctcttct

SEC ID n° 48 ADN polimerasa de Carboxydothermus hydrogenoformans (Chy)

MGKWLVDGNSLLHRAFFALPPLKTTKGEPTGAVYEFLTMLFRVIKDEKPEYLAVAFDISRKTFRTEQFTAYKGHRK EAPDELVPQFALVREVLKVLNVPYIELDGYEADDIIGHLSRAFAGQGHEWIYTADRDMLQLVDEKTWYLTKKGIT ELVKMDLAAILENYGLKPKQLVDVKGLMGDPSDNIPGVPGIGEKTALDLIKTYGSVEEVLARKDELKPKLREKLAEH ENLAKISKQLATILREIPLEISLEDLKVKEPNYEEVAKLFLHLEFKSFLKEIEPKIKKEYQEGKDLVQVETVETEGQ IAWFSDGFYVDDGEKTKFYSLDRLNEIEEIFRNKKIITDDAKGIYHVCLEKGLTFPEVCFDARIAAYVLNPADQNP GLKGLYLKYDLPVYEDVSLNIRGLFYLKKEMMRKIFEQEQERLFYEIELPLTPVLAQMEHTGIQVDREALKEMSLEL GEQIEELIREIYVLAGEEFNLNSPRQLGVILFEKLGLPVIKKTKTGYSTDAEVLEELLPFHEIIGKILNYRQLMKLK STYTDGLMPLINERTGKLHTTFNQTGTLTGRLASSEPNLQNIPIRLELGRKLRKMFIPSPGYDYIVSADYSQIELRL LAHFSEEPKLIEAYQKGEDIHRKTASEVFGVSLEEVTPEMRAHAKSVNFGIVYGISDFGLGRDLKIPREVAGKYIKN YFANYPKVREYLDELVRTAREKGYVTTLFGRRRYIPELSSKNRTVQGFGERTAMNTPLQGSAADIIKLAMINVEKEL KARKLKSRLLLSVHDELVLEVPAEELEEVKALVKGVMESWELKVPLIAEVGAGKNWYEAK

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH

<120> ADN polimerasas con actividad mejorada

<130> 27044WO-HS

<140> No asignado todavía <141 > No asignado todavía

<150> US61/474160 <151 > 11 de abril de 2011

<160> 48

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1 <211 >834 <212> PRT <213> Thermus sp.

<220>

<223> ADN polimerasa de Thermus sp. Z05 (Z05)

<400> 1

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. ADN polimerasa que presenta una eficiencia de transcriptasa inversa, tolerancia a no correspondencias, tasa de extensión y/o tolerancia de la TI y de inhibidores de polimerasa reducidas en comparación con una ADN polimerasa de control, en la que la ADN polimerasa presenta una identidad de secuencias de aminoácidos de por lo menos 80% respecto a una polimerasa seleccionada de entre el grupo que consiste de:

   (a) SEC ID n° 1,

   (b) SEC ID n° 2,

   (c) SEC ID n° 3,

   (d) SEC ID n° 4,

   (e) SEC ID n° 5,

   (f) SEC ID n° 6,

   (g) SEC ID n° 7,

   (h) SEC ID n° 32,

   (i) SEC ID n° 33,

   G)SEC ID n° 34,

   (k) SEC ID n° 35,

   (l) SEC ID n° 36, y

   (m) SEC ID n° 37,

   y en la que el aminoácido de la ADN polimerasa correspondiente a la posición 709 de SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de I, L o M, y en la que la ADN polimerasa de control presenta la misma secuencia de aminoácidos que la ADN polimerasa excepto en que el aminoácido de la ADN polimerasa de control correspondiente a la posición 709 de la SEC ID n° 1 es I, L o M.
2. 2. ADN polimerasa según la reivindicación 1, que comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-Xi2-X13-G-Y-V-X14-T-L) (SEC ID n° 8), en la que:

   Xi es A, D, S, E, R o Q,

   X2 es W o Y,

   X3 es cualquier aminoácido diferente de I, L o M, X4 es E, A, Q, K, N o D,

   X5 es K, G, R, Q, H o N,

   X6 es T, V, M o I,

   X7 es L, V o K,

   Xa es E, S, A, D o Q,

   X9 es E o F,

   X10 es G o A,

   Xn es R o K,

   X12 es K, R, E, T o Q,

   Xi3es R, Ko H, y X14 es E, R o T.
3. 3. ADN polimerasa según la reivindicación 1, que comprende un motivo en el dominio de polimerasa que comprende A-W-X3-X4-X5-T-L-E-E-G-R-X12-X13-G-Y-V-E-T-L (SEC ID n° 11), en la que:

   X3 es K, R, S, G o A, X4 es E o A,

   X5 es K o G,

   X12 es K o R, y X13 es R o K.
4. 4. ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el aminoácido correspondiente a la posición 580 de la SEC ID n° 1 es cualquier aminoácido diferente de D o E.
5. 5. ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el aminoácido correspondiente a la posición 580 de la SEC ID n° 1 se selecciona de entre el grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K.
6. 6. ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la ADN polimerasa presenta una identidad de secuencias de aminoácidos de por lo menos 90% respecto a una polimerasa seleccionada de entre el grupo que consiste de:

   (a) SEC ID n° 1,

   (b) SEC ID n° 2,

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   (c) SEC ID n° 3,

   (d) SEC ID n° 4,

   (e) SEC ID n° 5,

   (f) SEC ID n° 6,

   (g) SEC ID n° 7,

   (h) SEC ID n° 32,

   (i) SEC ID n° 33,

   (j) SEC ID n° 34,

   (k) SEC ID n° 35,

   (l) SEC ID n° 36, y

   (m) SEC ID n° 37.
7. 7. ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la polimerasa presenta una identidad de secuencias de aminoácidos de por lo menos 80% respecto a la SEC ID n° 1.
8. 8. ADN polimerasa según cualquiera de la reivindicación 7, en la que el aminoácido en la posición 580 se selecciona de entre el grupo que consiste de L, G, T, Q, A, S, N, R y K.
9. 9. Ácido nucleico recombinante codificante de la ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. Método para llevar a cabo la extensión de cebadores, que comprende:

    poner en contacto una ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con un cebador, un molde polinucleótido y nucleósidos trifosfato bajo condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido.
11. 11. Método según la reivindicación 1, en el que el método se lleva a cabo en presencia de por lo menos un inhibidor de la actividad de la ADN polimerasa y/o de la actividad de transcripción inversa.
12. 12. Kit para producir un cebador extendido, que comprende por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
13. 13. Kit según la reivindicación 12, que comprende además uno o más recipientes adicionales seleccionados de entre el grupo que consiste de:

    (a) un recipiente que proporciona un cebador hibridable, bajo condiciones de extensión de cebadores, con un molde polinucleótido predeterminado,

    (b) un recipiente que proporciona nucleósidos trifosfato, y

    (c) un recipiente que proporciona un tampón adecuado para la extensión de cebadores.
14. 14. Mezcla de reacción que comprende una ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, por lo menos un cebador, un molde polinucleótido y nucleósidos trifosfato.
15. 15. Mezcla de reacción según la reivindicación 14, en la que mezcla comprende por lo menos un Inhibidor de la actividad de la ADN polimerasa y/o de la actividad de transcripción inversa.

    *

    205 AWIEKTLEEGRitR GYVE TLFGRRRYVPDLNA

    Tñq AWIEKTLEESRRR GYVE TLFGRRRYVPDLEA

    Tf i AWIAKTLEEGRKK GYVE TLFGRRRYVFDLNA

    Tf 1 AWIEGTLEEGRER GYVE TLFGRKRYVPDLNA

    Spsl7 AWIAKTLEEGRKK GTVE TLFGRRRYVFDLNA

    Tth AWXEKTLEEGRKR GYVE TLFGRRRYVFDLNA

    Tea AWIEKTLEEGRKR GYVE TLFGRRRYVPDLNA

    ma DnQRVVSEAEEE GYVR TLFGHKRDl PQLMA

    Trie SYIQQVVAEAKEK GYVR TLFGRKRDI PQLMA

    Taf K YLKRHKD EARRE GYVT TLFGRRRYI PQLRS

    Dra RYINHTLDFGRTH GYVE TLYGRRRYVPGLSS

    Bst QYMDtTIVQEAKQK GYVT TLLKRHRYLPDITS

    Bea RIHENI VQBRKQR GYVT TLLHRRRYL PDITS

    XjXiXsXiXtXgXvXtXtXj oXuXi2Xi 3GYVX24 Th-------------------

    (SEC

    ID n° 12)

    (SEC

    ID n° 13)

    í SEC

    ID n° 14)

    (SEC

    ID n° 15}

    (SEC

    ID n° 16}

    (SEC

    ID n° 17)

    (SEC

    ID n° 18)

    í SEC

    ID n° 19)

    ( SEC

    ID n° 20)

    (SEC

    ID n° 21)

    ( SEC

    ID n° 23)

    ( SEC

    ID n° 24)

    ( SEC

    ID n° 25)

    (SEC

    ID n° 26)

    A» Identidades de secuencia a Id tamn riel enzima pofrnerasa 1 Entero Icones pond Ente a los nrinoándosl-IQIiIe ZDB

    file, naracc

    205 Tu Tfl TU Spsl7 Tth Tu Dr» Tena Toe T»f Bst Bca

    xos

    0464 0.833 0.859 0.839 0.962 0.958 0,459 0.374 0.368 0-359 0.407 0.408

    Tte

    0064 0.S31 0.854 0.836 0.872 0.864 0.468 0.382 0.368 0.151 0.397 0.397

    Tfi

    O.S33 0.831 0.82 0.991 0.829 0.824 045 0.371 0.375 0.353 0.405 0,397

    Tfl

    0.059 0.854 0.82 0.824 0.853 0.848 0462 0.381 0.374 0.356 0.397 0.395

    Sp*17

    0.039 0.836 0.991 0.824 0.835 0.83 0.452 0,375 0.377 0.355 0407 0.3»

    Tth

    0.962 0.872 0829 0.853 0.835 0.989 0463 0-373 0.167 0358 0.406 0.406

    T«b

    0.950 0.864 0.824 0-848 0,83 0.989 0.46 0-371 0.365 0,356 0,404 0.404

    Dril

    0.459 0.468 0.45 0.462 0.452 0.463 0.46 0.334 0.325 0-314 0.338 0.339

    Tma

    0.374 0382 0371 0.3S1 0.375 0,373 0371 0.334 0.8 S4 0.567 0,37 0.377

    The

    0.368 0.368 0.375 0.374 0.377 0.367 0365 0.325 0.S54 0.558 0.377 0376

    Taf

    0J59 0.351 0.353 0.356 0.355 0.358 0356 0,314 0.567 0.558 0.356 0.364

    Bst

    0.407 0397 0.405 0.397 0.407 0406 0404 0.338 0.37 0.377 0.356 0.881

    (tea

    0.408 0.39? 0,397 0.398 0.199 0406 0,404 0.339 0.377 0-376 0.364 0.881

    B, UBAtalBdesBumi

    jabhigatfcinijaiiHifeEl5iiiihimdep{É[HiiM ^QWBptiiBlMihalgsarÉiDéiilifljJMMdejD^

    Montee

    205 Tan Tfi Tfl Spsl? Tth Tea Dnt Tina Tac Taf Bst Bca

    ZOS

    0.901 0.S45 0.891 0845 0.975 0.973 0.563 0.483 0.478 0.44 0.498 0.49

    Tm

    0.90) 0.879 0.901 0.877 0.906 0.901 0.561 0.488 0473 0.44 0.503 0.495

    tu

    0.845 0.879 0.857 0.997 0.853 0.853 0.566 0.495 049 0.449 0.512 0.49

    Tfl

    0.89) 0001 0.857 0.855 0Ü89 0.889 0,571 0492 048 0.444 0494 0.485

    SpsÍ7

    0,845 0,877 0,907 0,855 0.853 0.853 0.566 0495 0,49 0.449 0.512 0-49

    Tth

    0975 0906 0-853 0.889 0,853 0.9p 0,563 0-478 0473 0,437 0496 0-488

    Tcb

    0.973 0.901 0.853 0.889 0-853 0.99 0563 0-478 0.473 0437 0496 0.4SE

    Dr*

    0.563 0.561 0.566 0.571 0.566 0563 0.563 0-45 0.448 0426 0474 0.454

    This

    0.463 0.488 0.495 0492 0495 0,478 0.478 045 04&3 0-622 0.474 0.475

    Tiw

    0470 0.473 0.49 048 0,49 0,473 0.473 0.448 0.883 0.615 0.476 0.473

    Taf

    044 0,44 0.449 0-444 0449 0,437 0.417 0.426 1 0.622 0.61 i 0.46 0.473

    Bsi

    0/198 0.503 0,512 0,494 0.512 0.494 0,496 0.474 0.474 0,476 0.46 0.898

    Be*

    0.49 0495 049 0,485 049 0-488 0.488 0,454 0.475 01473 0473 0,898

    FIGURA 3

    A. Identidades de secuencia a lo largo del enzima polimerasa I entero (correspondiente a los aminoácidos 1-834 de Z05)

    Nombre

    Z05 Tth Tfl Tfl Tea Taq Spsl7

    Z05

    0.962 0.833 0.859 0.958 0.864 0.839

    Tth

    0.962 0.829 0.853 0.989 0.872 0.835

    Tfi

    0.833 0,829 0.82 0.824 0.831 0.991

    Tfl

    0.859 0.853 0.82 0.848 0.854 0.824

    Tea

    0.958 0.989 0.824 0.848 0.864 0.83

    Taq

    0.864 0.872 0.831 0.854 0.864 0.836

    Spsl7

    0.839 0.835 0.991 0.824 0.83 0.836

    B. Identidades de secuencia a lo largo del subdominio de polimerasa solo (correspondiente a los aminoácidos 420-834 de Z05)

    Nombre

    Z05 Tth Tfi Tfl Tea Taq Spsl7

    ZG5

    0,975 0.845 0.891 0.973 0.901 0.845

    Ttb

    0.975 0.853 0.889 0.99 0.906 0.853

    Tfi

    0.845 0.853 0.857 0.853 0.879 0.997

    Tfl

    0.891 0.889 0.857 0.889 0.901 0.855

    Tea

    0.973 0.99 0.853 0.889 0.901 0.853

    Taq

    0.901 0.906 0.879 0.901 0.901 0.877

    Spsl7

    0.845 0.853 0.997 0.855 0.853 0.877