ES2562458T3 - Proceso de identificación y preparación de una transaminasa omega específica de (R) - Google Patents

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Abstract

Un proceso para la preparación de una transaminasa ω selectiva de (R), que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar al menos una secuencia de biomolécula incógnita de al menos una transaminasa ω selectiva de (R) y al menos un banco de biomoléculas, b) cribar el banco de biomoléculas con la secuencia de biomolécula incógnita para identificar un grupo de primeras secuencias de biomolécula diana, en donde las primeras secuencias de biomolécula diana tienen un grado de identidad de secuencia de al menos un 20 % con la secuencia de biomolécula incógnita, que se calcula a nivel de aminoácidos, c) seleccionar en el grupo de las primeras secuencias de biomolécula diana un grupo de segundas secuencias de biomolécula diana, que no comprende, a nivel de aminoácidos, al menos uno de los siguientes motivos de secuencia de aminoácidos c1) a c3) siendo c1) en las posiciones 95 a 97 una secuencia de aminoácidos Tyr Xa1 Xa2, siendo Xa1 un aminoácido Ile, Val, Leu, Met, Phe, y siendo Xa2 un aminoácido Arg o Lys o c2) en las posiciones 97 a 99 una secuencia de aminoácidos Tyr Xaa Gln, siendo Xaa un aminoácido y en la región desde la posición 105 a 111 una secuencia de aminoácidos Arg Xaa Xa3, siendo Xa3 un aminoácido, siendo preferentemente His o c3) en la posición 38 Thr, en la posición 97 Lys y en las posiciones 107 a 109 una secuencia de aminoácidos Arg Xa4 Xa5, siendo Xa4 un aminoácido, siendo preferentemente Gly, y siendo Xa5 un aminoácido, siendo preferentemente Tyr y que comprende c4) en la posición 95 otro aminoácido distinto de Tyr, Arg, Lys, o en la posición 95 Tyr, pero en la posición 97 ni Arg ni Lys y c5) en la posición 40 ni Lys ni Arg y c6) en la región desde la posición 161 a 165 al menos una Lys para identificar un grupo de segundas secuencias de biomolécula diana y d) proporcionar una biomolécula que tiene una segunda secuencia de biomolécula diana identificada en la etapa c) y siendo, o codificando al menos parcialmente, una proteína con la actividad de una transaminasa ω selectiva de (R).

Description

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Puede hacerse reaccionar C3OPi con una transaminasa ω selectiva de (R) y un donante de amino para obtener (R) C3APi ópticamente activa.
Puede hacerse reaccionar C3OP con una transaminasa ω selectiva de (R) y un donante de amino para obtener (R) 5 C3AP ópticamente activa.
Puede hacerse reaccionar acetofenona con una transaminasa ω selectiva de (R) y un donante de amino para obtener (R) α-MBA ópticamente activa.
10 Puede hacerse reaccionar un aceptor de amino, en particular grupos cíclicos, aromáticos o hidrocarubro heterocíclicos S-, O-, o N-sustituidos de 5 a 6 miembros que contienen un grupo oxo mono o bicíclico en particular, grupos aromáticos sustituidos con alquilo o alcoxi, con un donante de amino y una transaminasa ω selectiva de (R) para obtener aminas, en particular aminas mono o bicíclicas, en particular aminas cíclicas de 5 a 6 miembros o hidrocarburos heterocíclicos S-, O-, o N-sustituidos o aminas aromáticas, en particular aminas aromáticas sustituidas
15 con alquilo o alcoxi, en particular en forma (R).
Pueden hacerse reaccionar el aceptor de amino y el donante de amino con la transaminasa en medio acuoso, por ejemplo, tampón fisiológico. En una realización particularmente preferida la reacción de transaminación se lleva a cabo a un pH en el intervalo de 5 a 9, en particular de 7 a 8,5. En una realización particular preferida, la reacción se
20 lleva a cabo a un intervalo de temperaturas de 10 a 65 °C, preferentemente de 20 a 50 °C, en particular de 18 a 25 °C, preferentemente a temperatura ambiente o a 34 °C a 39 °C, en particular a 37 °C. En una realización preferida adicional de la presente invención el aceptor de amino y el donante de amino se proporcionan en una relación molar de 1:1 a 1:5, en particular de 1:1 a 1:2. En una realización preferida de la presente invención la actividad enzimática puede ser de 1 a 20.000 µmol/min.
25 Puede llevarse a cabo un proceso para el análisis de una transaminasa, en particular para la caracterización de las propiedades de una transaminasa, que comprende las siguientes etapas:
i. proporcionar un aceptor de amino cargado, un donante de amino cargado y una transaminasa,
30 preferentemente una transaminasa ω, más preferentemente una transaminasa ω selectiva de (R) que se obtiene de acuerdo con la presente invención
ii. hacer reaccionar el aceptor de amino y el donante de amino con la transaminasa en un medio de reacción, y
de esta manera 35
iii. determinar la conductividad del medio de reacción en un primer grupo de condiciones de reacción y
iv. posteriormente a la etapa iii) determinar la conductividad del medio de reacción en un segundo grupo de
condiciones de reacción, para obtener al menos dos valores de conductividad que reflejen las propiedades de la 40 transaminasa.
En el curso de una reacción catalizada por una transaminasa, preferentemente una ω-TA, de los sustratos de donante de amino cargado, preferentemente una amina, y el aceptor de amino, preferentemente un cetoácido, por ejemplo un piruvato, la conductividad disminuye ya que se forman una cetona no cargada y el componente amino
45 zwitteriónico, preferentemente aminoácido, por ejemplo alanina.
imagen9
imagen10
El proceso de análisis permite una medición simple del progreso de la reacción. Preferentemente, un tampón de baja
50 conductividad, particularmente el tampón CHES (ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico) de baja conductividad es el más adecuado para evitar una conductividad inicial demasiado alta. Preferentemente, se puede hacer una calibración del proceso de conductividad mediante la simulación de diferentes conversiones. Como ejemplo, para la
10
imagen11
imagen12
imagen13
Tabla 1
Nº
Organismos fuente % Identidad con AS-ωTA SEC ID 7 MA-ω-TA SEC ID 5 Nº de ident. genética/ Nº ident. Proteico (base de datos NCBI)
1
Aspergillus terreus NIH2624 44 40 115385557
2
Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 44 42 211591081
3
Aspergillus niger 40 36 145258936
4
Aspergillus oryzae RIB40 41 40 169768191
5
Aspergillus fumigatus Af293 41 38 70986662
6
Neosartorya fischeri NRRL 181 41 38 119483224
7
Gibberella zeae PH-1 40 39 46109768
8
Hyphomonas neptunium ATCC 15444 44 40 114797240
9
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 50 91 120405468
10
Mesorhizobium loti MAFF303099 38 37 13471580
11
Mesorhizobium loti 35 37 20804076
12
Roseobacter sp. MED193 37 37 86137542
13
Marinomonas sp. MED121 36 34 87122653
14
Rhizobium etli CIAT 652 33 32 190895112
15
Rhodoferax ferrireducens T118 38 36 89899273
16
Jannaschia sp. CCS1 37 32 89053613
17
Labrenzia alexandrii DFL-11 42 36 EEE43073
18
Burkholderia sp. 383 32 32 78059900
19
Burkholderia cenocepacia HI2424 36 33 ABK12047
20
Proteobacteria alfa HTCC2255 36 34 ZP_01448442
21
Proteobacteria gamma 27 26
Mycobacterium aurum
49 100 SEC ID 5
Arthrobacter sp.
100 49 SEC ID 7
AS: Aspergillus sp., MA: Mycobacterium aurum
Ejemplo 2 -Preparación y análisis de las transaminasas de Aspergillus terreus, Mycobacterium vanbaalenii y Mesorhizobium loti
5
2.1 Las ω-TA de Mycobacterium vanbaalenii, entrada 9 en la Tabla 1 (SEC ID Nº: 49 y 50), de Aspergillus terreus, entrada 1 en la Tabla 1 (SEC ID Nº: 3 y 4), y Mesorhizobium loti, entrada 11 de la Tabla 1 (SEC ID Nº: 1 y 2), se han obtenido y utilizado en forma adaptada al codón de uso (para E. coli) para expresar las enzimas en Escherichia coli. La transaminasa de Mycobacterium vanbaalenii se denomina a continuación Va-TA, la transaminasa de Aspergillus
10 terreus Ate-TA y la de Mesorhizobium loti Malo-TA.
2.2 Ensayo de acetofenona
La Mva-TA y Ate-TA convertían la (R)-α-MBA al menos 100 veces más rápido que al enantiómero (S) en un ensayo 15 de acetofenona con 2,5 mM de amina y 2,5 mM de piruvato a pH 7,5 y 30 °C.
Ensayo: El aumento de absorción de la acetofenona que se forma durante la reacción se controló a 245 nm.
La Mlo-TA no convertía ni la (R)-ni la (S)-α-MBA.
20 A continuación, se han ensayado aminas adicionales en presencia de piruvato o de α-cetoglutarato como receptores de amino (10 mM de amina, 10 mM de piruvato, 0,1 mM de PLP, tampón fosfato pH 7,5, incubación durante 24 h a 30 °C, se analizó por cromatografía en capa fina).
25 Pudo observarse una conversión para 2-aminoheptano, 2-aminopentano, 1,3-dimetilbutilamina y 4-fenil-2aminobutano. También se podía detectar una mínima conversión de isopropilamina.
14
imagen14
imagen15
ml min-1). Las fracciones que contenían la actividad se agruparon y desalaron por medio de cromatografía en gel con un tampón Tricina 20 mM pH 7,5 que contenía 0,01 mM de PLP. Las enzimas purificadas se almacenaron a 4 °C.
La cantidad de cada proteína purificada a partir de aproximadamente 3 g de células (peso húmedo) se dan en la Tabla 4 posterior.
Tabla 4
Entrada
Fuente enzimática Rendimiento en proteína tras la purificación [mg]
1
Aspergillus terreus 8,6
2
Penicillium chrysogenum 26,2
3
Aspergillus niger -
4
Aspergillus oryzae 20,6
5
Aspergillus fumigatus 14,8
6
Neosartorya fischeri 23,3
7
Gibberella zeae 4,8
8
Hyphomonas neptunium 6,5
9
Mycobacterium vanbaalenii 8,9
10
Mesorhizobium loti MAFF303099 6,9
11
Mesorhizobium loti 5,3
12
Roseobacter sp. 27,5
13
Marimonas sp. 23,7
14
Rhizobium etli 6,5
15
Rhodoferax ferrireducens 7,5
16
Jannaschia sp. 24,8
17
Labrenzia alexandrii 12,5
18
Burkholderia sp. 41,6
19
Burkholderia cenocepacia -
20
proteobacteria alfa -
21
proteobacteria gamma 2,6
10 4.2 Caracterización de la especificidad de sustrato de la ω-TA selectiva de (R)
Para determinar la actividad hacia la α-metilbencil amina (α-MBA) en el cribado inicial de las proteínas expresadas, se utilizó un ensayo basado en acetofenona: se hizo reaccionar una solución de (R)-o (S)-α-MBA 2,5 mM y piruvato en presencia de la enzima purificada y se correlacionó el aumento de absorbancia a 245 nm con la formación de
15 acetofenona. Se controlaron las conversiones de las aminas 2-aminohexano, 4-fenil-2-aminobutano y 1-N-Boc-3aminopirrolidina utilizando un ensayo de conductividad: Se hizo reaccionar una solución que contenía amina 10 mM y piruvato en presencia de la amina transaminasa purificada y se relacionó la disminución de la conductividad con la conversión del sustrato.
20 Para investigar la actividad DATA y BCAT se midió el descenso de NADH espectrofotométricamente a 340 nm utilizando ensayos de acoplamiento a deshidrogenasa: se hizo reaccionar una solución de ácido α-cetoglutárico 5 mM y D-alanina en presencia de la transaminasa purificada, 1 U/ml de lactato deshidrogenasa y 0,5 de NADH para medir la actividad de DATA. Se utilizó una solución que contenía ácido 3-metil-2-oxobutírico 5 mM y L-glutamato, 10 mM de cloruro amónico, 1 U/ml de glutamato deshidrogenasa y 0,5 mM de NADH para medir la actividad de BCAT.
25 Todas las reacciones tuvieron lugar en tampón de Tricina 20 mM pH 7,5 que contenía 0,01 mM de PLP. El pH del tampón se ajustaba con 1,8-Diazabiciclo [5.4.0] undecil-7-eno.
17
Los resultados se dan en la Tabla 5 a continuación. Tabla 5: Actividades específicas para varios sustratos.
Sustratos
piruvato 1 piruvato 2 piruvato 3 piruvato 4 2KG D-Ala MOB L-Glu
Entrada
R S R S R S R S
1
15,2 <0,001 2,91 <0,001 9,7 <0,001 0,031 <0,001 <0,001 0,003
2
1,3 <0,001 1,1 0,044 5,6 <0,001 0,264 <0,001 <0,001 <0,001
3
-a) - - - - - - - - -
4
3,7 0,001 1,4 0,023 5,2 0,002 0,051 0,002 <0,001 <0,001
5
4,1 <0,001 2,4 <0,001 4,5 <0,001 0,009 <0,001 <0,001 0,005
6
4,5 <0,001 7,4 <0,001 6,0 <0,001 0,013 <0,001 <0,001 0,005
7
18,6 <0,001 19,6 <0,001 8,2 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,016
8
3,6 <0,001 3,2 0,225 20,7 <0,001 0,163 <0,001 <0,001 0,012
9
4,7 <0,001 5,6 <0,001 2,6 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,003
10
0,011 <0,001 0,003 <0,001 0,010 <0,001 0,001 <0,001 0,004 0,004
11
0,013 <0,001 0,124 <0,001 0,002 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,005
12
0,003 <0,001 0,001 <0,001 0,001 <0,001 0,001 <0,001 0,003 0,002
13
0,002 <0,001 0,020 <0,001 0,003 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,003
14
0,867 <0,001 0,012 <0,001 0,260 <0,001 <0,001 <0,001 0,020 0,016
15
0,056 <0,001 0,001 <0,001 0,307 <0,001 <0,001 <0,001 0,010 0,098
16
0,059 0,007 0,071 0,002 0,370 0,068 0,022 <0,001 0,062 0,020
17
0,060 0,003 0,073 0,001 0,120 0,027 0,205 0,002 0,063 0,023
18
0,017 <0,001 0,002 <0,001 1,1 0,007 <0,001 <0,001 <0,001 0,001
19
-a) -
20
- - - - - - - - -
21
0,028 <0,001 0,610 0,004 0,034 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,031
1 -aminohexano, 2 -α-MBA, 3 -4-fenil-2-aminobutano, 4 -1-N-Boc-3-aminopirrolidina, 2KG -2-cetoglutarato, D-Ala -D-alanina, L-Glu -L-glutamato, MOB -ácido 3-metil-2-oxobutírico. El número de entrada corresponde con la Tabla 1. Todas las mediciones se hicieron al menos por duplicado. La desviación de mediciones únicas del valor medio era < 10 %. a) No fue posible la medición ya que el rendimiento de proteína durante la expresión era muy baja/ la proteína era inestable durante la purificación.
5 4.3 Síntesis asimétrica de aminas (R) 1-4 (véase la leyenda en la Tabla 5 anterior) con ω-TA de Aspergillus terreus, Mesorhizobium loti y Mycobacterium vanbaalenii
Se llevaron a cabo las síntesis asimétricas a 30 °C durante 24 horas en tampón de fosfato sódico (100 mM, pH 7) que contenía fosfato-5’ de piridoxal PLP monohidrato (1 mM) y NAD+ (1 mM) en tubos Eppendorf de 1,5 ml.
10
18

Claims (1)

  1. imagen1
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