ES2562497T3

ES2562497T3 - Trigo y cebada con mayor tolerancia a la salinidad

Info

Publication number: ES2562497T3
Application number: ES07784642.6T
Authority: ES
Inventors: John Damien Platten; Caitlin Byrt; Wolfgang Spielmeyer; Evans Lagudah; Richard Alexander James; Rana Ellen Munns
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Grains Research and Development Corp; Department of Primary Industries and Regional Development
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Grains Research and Development Corp; Department of Primary Industries and Regional Development
Priority date: 2006-07-12
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2016-03-04
Anticipated expiration: 2027-07-12
Also published as: EP2046959B1; WO2008006169A1; AU2007272314B2; EP2046959A4; US20100313289A1; AU2007272314A1; US8536429B2; EP2046959A1

Abstract

Una planta que es homocigotica para un gen Nax2 que confiere mayor tolerancia a los suelos salinos y/o sodicos y/o menor acumulacion de sodio en una parte aerea de la planta, en donde la planta es: (a) cebada; o (b) trigo hexaploide o trigo duro, en donde dicho gen Nax2 esta en el genoma A, en la que dicho gen Nax2 es una secuencia que codifica un polipeptido que es al menos un 90 % identica a SEC ID No 1; y dicha planta no contiene un gen Nax1 que confiere mayor tolerancia a los suelos salinos y/o sodicos y/o menor acumulacion de sodio en una parte aerea de la planta.

Description

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Figura 9. Árbol filogenético desenraizado que muestra las relaciones del fragmento amplificado de T. monococcum y la variedad cultivada de trigo duro Línea 149 con los miembros de la familia de genes transportadores de sodio/potasio (HKT). El fragmento amplificado mostró una homología clara con el extremo 3' de la proteína predicha correspondiente al gen del arroz OSJNBa0022N24.16. La barra de escala muestra 0,2 sustituciones por sitio.

Figura 10. Análisis de transferencia Southern-hibridación de Tamaroi, Línea 149 y seis líneas BC5F2:3 bajas en sodio, en dos volúmenes, cuando se sondaron con la sonda HKT8. Tamaroi y Línea 149 fueron polimórficos para una sola banda para cada digestión con la enzima de restricción, y la progenie baja en sodio resultó tener el mismo patrón de restricción que la Línea 149.

Figura 11. Análisis de transferencia Southern-hibridación tras la digestión con NcoI de ADN de Triticum monococcum, Tamaroi, Línea 149 y 16 líneas de la progenie BC5F2:3, 11 de las cuales tenían altas concentraciones de Na+ en la hoja 3, y 5 de las cuales tenía bajas concentraciones de Na+ en la hoja 3. La banda adicional de la Línea 149 y la progenie baja en sodio, pero no Tamaroi, también estaba presente en T. monococcum.

Figura 12. Análisis de transferencia Southern-hibridación con la sonda HKT8 tras la digestión de restricción con HindIII de ADN de Triticum monococcum (M), Tamaroi (T), Línea 149 (L), Chinese Spring (C), Langdon (1) y las líneas de sustitución de Langdon 4D(4A) (2) y 4D(4B) (3). La ubicación en el genoma de los miembros de genes HKT8 se muestra a la derecha.

Figura 13. Análisis de transferencia Southern-hibridación con la sonda HKT8 tras la digestión de restricción con HindIII de ADN de Chinese Spring (C); líneas de eliminación de cromosomas de Chinese Spring N4AT4B (que carece del cromosoma 4A, cuatro copias de 4B) (1), m4BT4A (una copia de 4B, cuatro copias de 4A) (2), N4DT4B (que carece de 4D, cuatro copias de 4B) (3); y líneas diteloméricas de Chinese Spring Dt4BS (que carece del brazo largo del 4B) (4), Dt4DS (que carece del brazo largo del 4D) (5) y Dt4DL (que carece del brazo corto de 4D) (6). La ubicación en el genoma de los miembros de genes HKT8 se muestra a la derecha.

Figura 14. PCR con el marcador gpw2181. La banda inferior (flecha roja) resultó ser polimórfica entre las líneas con Nax2 y las líneas sin Nax2. La banda inferior resultó ser menor en Tamaroi (T) y las líneas con alta concentración de Na+ en la hoja en comparación con T. monococcum (M), Línea 149 (L) y las líneas con baja concentración de Na+ en la hoja. N = sin control de molde. 1kb+ = escalera de ADN.

Figura 15. Se encontró que 5AL físico corresponde a 4AL genético debido a una antigua translocación recíproca entre el extremo distal del cromosoma 4AL y 5AL. 5AL genético del trigo duro representa el fragmento que contiene Nax2 que se había sometido a introgresión de la Línea 149 al origen de Tamaroi en la población de mapeo de Nax2. Próximo a la introgresión estaba gwm595. Nax2 estaba ligado a gwm291, gwm410 y gpw2181.

Figura 16. PCR con el marcador específico del gen (HKT8-A) para Nax2. Este marcador fue dominante para Nax2. Las líneas con Nax2 contenían una banda de 986 pb (carriles para T. monococcum (M), Línea 149 (L) y las líneas con baja concentración de Na+ en la hoja). Esta banda estaba ausente para Tamaroi (T) y las líneas comparadas con alta concentración de Na+ en la hoja. N = sin control de molde, 1kb = escalera de ADN de patrones de peso molecular.

Figura 17. Alineación de secuencias de aminoácidos predichas de longitud completa para los genes HKT8 de T. monococcum (SEC ID Nº 1), T. turgidum sp. durum variedad cultivada Tamaroi (SEC ID Nº de 2 y 3) y variedad cultivada T. aestivum. Halberd (SEC ID Nº 6). Solo se muestra el homólogo del genoma D para T. aestivum, pues los genes del genoma B fueron idénticos a los de T. turgidum sp. durum variedad cultivada Tamaroi. Las alineaciones se construyeron usando CLUSTALX (Thompson et al. 1997) y los parámetros por defecto. Las alineaciones se visualizaron usando GeneDoc (Nicholas et al. 1997).

Figura 18. Alineación de las secuencias de ADN genómico de HKT8T de las variedades cultivadas T. monococcum y T. aestivum. Halberd. Los homólogos del genoma B de T. turgidum sp. durum variedad cultivada Tamaroi eran esencialmente idénticos en secuencia a sus homólogos del genoma B de T. aestivum. El fragmento mostrado abarca una región de 10 pb secuencia arriba del primer intrón a 10 pb secuencia abajo del segundo intrón, e incluye el segundo exón intermedio (posiciones de nucleótidos de 381 a 611 en la alineación). La secuencia de codificación de la proteína corresponde a los nucleótidos 1-10, 381 a 611 y 800 a 809 de la alineación. La alineación se creó usando MEGA3 (REF) y los parámetros por defecto. La alineación se visualizó usando GeneDoc (REF).

Figura 19. Filogenia de mínima evolución desenraizada de las secuencias de aminoácidos de HKT8 de longitud completa mostradas en la Figura 18 y las secuencias de nucleótidos de ADNc. La secuencia de OsHKT7 (acceso CAD37197) se incluyó como un grupo de fuera. A. filogenia de proteínas desenraizada. El árbol se construyó usando MEGA3 (Kumar et al. 2004), con el algoritmo de intercambio con el vecino próximo (nivel 2) para calcular el árbol, un árbol de unión al vecino como el árbol de partida y 10.000 repeticiones de arranque con una semilla

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los suelos salinos y/o sódicos, y/o menor acumulación de sodio en una parte aérea de una planta, en el genoma de una especie de trigo o de cebada que carece de dicho alelo. El objetivo de este aspecto es producir una planta con una mayoría del genotipo de una primera planta madre, pero que comprende dicho alelo Nax2 introducido de una segunda planta madre. Como se usa en este contexto, el término "mayoría" significa que el producto de la

5 reproducción comprende más del 50 % del genoma de la primera planta madre. Sin embargo, el producto comprende preferentemente al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 96 %, más preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 98 % e incluso más preferentemente al menos un 99 % del genoma de la primera planta madre. En una realización, el producto que comprende el gen Nax2 no comprende uno o más de los cromosomas 1A, 2A, 3A, 4A, 6A y 7A de la segunda planta madre, preferentemente la mayor parte o todos ellos. En una realización particular, el producto no contiene los cromosomas 1A, 2A, 3A, 4A, 6A y 7A del trigo duro de la Línea 149, Línea 5049 o la variedad Tamaroi.

Como se usa en el presente documento, el término "trigo" se refiere a cualquier especie del género Triticum,

15 incluyendo sus progenitores, así su progenie producida por cruces con otras especies. El trigo incluye "trigo hexaploide", que tiene la organización del genoma de AABBDD, compuesta por 42 cromosomas, y el "trigo tetraploide", que tiene la organización del genoma de AABB, compuesta por 28 cromosomas. El trigo hexaploide incluye T. aestivum, T. spelta, T. macha, T. compactum, T sphaerococcum, T. vavilovii, y el cruce entre dichas especies. El trigo tetraploide incluye T. durum (también denominado en el presente documento trigo duro o Triticum turgidum sp. durum), T. dicoccoides, T. dicoccum, T. polonicum, y el cruce entre dichas especies. Además, el término "trigo" incluye los posibles progenitores de la especie Triticum hexaploide o tetraploide tal como T. uartu, T. monococcum o T. boeoticum para el genoma A, Aegilops speltoides para el genoma B, y T. tauschii (también conocido como Aegilops squarrosa o Aegilops tauschii) para el genoma D. Los progenitores particularmente preferidos son los del genoma A, incluso más preferentemente el progenitor del genoma A es T. monococcum. Una

25 variedad cultivada de trigo para su uso en la presente invención puede pertenecer, pero sin limitación, a cualquiera de las especies enumeradas anteriormente. También se incluyen plantas que se producen mediante técnicas convencionales usando Triticum sp. como planta madre en un cruce sexual con una especie distinta de Triticum (tales como centeno [Secale cereale]), incluyendo, pero sin limitación, Triticale.

Como se usa en el presente documento, el término "cebada" se refiere a cualquier especie del género Hordeum, incluyendo sus progenitores, así como su progenie producida mediante cruces con otras especies. Se prefiere que la planta sea de una especie Hordeum que se cultiva comercialmente, tal como, por ejemplo, una cepa o una variedad cultivada o una variedad de Hordeum vulgare o adecuada para la producción comercial de grano.

35 El término "planta" incluye plantas enteras, estructuras vegetativas (por ejemplo, las hojas, los tallos), raíces, órganos/estructuras florales, semillas (incluyendo embriones, endospermo y cubierta de la semilla), tejido de la planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido del suelo, y similares), células y la progenie de la misma.

Una "planta transgénica", "planta modificada genéticamente" o variaciones de la misma se refiere a una planta que contiene una construcción génica ("transgén") que no se encuentra en una planta de tipo silvestre de la misma especie, variedad o variedad cultivada. Un "transgén", como se denomina el presente documento, tiene el significado normal en la técnica de la biotecnología, e incluye una secuencia genética que se ha producido o modificado mediante tecnología de ADN o ARN recombinante, y que se ha introducido en la célula vegetal. El transgén puede incluir secuencias genéticas derivadas de una célula vegetal. Por lo general, el transgén se ha introducido en la

45 planta por manipulación humana tal como, por ejemplo, por transformación, pero, como cualquier experto en la materia reconoce, se puede usar cualquier método.

Como se usa en el presente documento, la expresión "planta no modificada correspondiente" se refiere a una planta de tipo silvestre. "Tipo silvestre", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula, un tejido o una planta que no ha sido modificado de acuerdo con la invención. Las células, los tejidos o las plantas de tipo silvestre se pueden usar como controles para comparar los niveles de expresión de un ácido nucleico exógeno o la extensión y la naturaleza de la modificación de un rasgo con células, tejidos o plantas modificados como se describe en el presente documento. Las variedades de tipo silvestre que son adecuadas como patrón de referencia incluyen la variedad cultivada de trigo duro Tamaroi, y las variedades cultivadas de trigo blando Westonia y Chinese Spring.

55 Los términos "semilla" y "grano" se usan indistintamente en el presente documento. "Grano" se refiere, en general, al grano cosechado, maduro, pero también puede referirse al grano después de la imbibición o la germinación, de acuerdo con el contexto. El grano maduro comúnmente tiene un contenido de humedad inferior al aproximadamente 18-20 %.

"Molécula de ácido nucleico" se refiere a un oligonucleótido, polinucleótido o cualquier fragmento de los mismos. Puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético, bicatenario o monocatenario, y combinarse con hidratos de carbono, lípidos, proteínas u otros materiales para realizar una actividad en particular definida en el presente documento.

65 Como se usa en el presente documento, la expresión "amplificación de ácido nucleico" se refiere a cualquier método

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que se establezca lo contrario, la secuencia de consulta es de al menos 45 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP aliena las dos secuencias en una región de al menos 45 nucleótidos. Preferentemente, la secuencia de consulta es de al menos 150 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP aliena las dos secuencias en una región de al menos 150 nucleótidos. Más preferentemente, la secuencia de consulta es de al menos 300 nucleótidos de longitud, y el análisis

5 GAP aliena las dos secuencias en una región de al menos 300 nucleótidos. Incluso más preferentemente, el análisis GAP alinea dos secuencias en su longitud completa.

Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que las cifras de % de identidad superiores a las proporcionadas anteriormente englobarán realizaciones preferidas. Por lo tanto, cuando sea aplicable, a la luz de las cifras de % de identidad mínimas, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia que sea al menos un 40 %, más preferentemente al menos un 45 %, más preferentemente al menos un 50 %, más preferentemente al menos un 55 %, más preferentemente al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 65 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al

15 menos un 91 %, más preferentemente al menos un 92 %, más preferentemente al menos un 93 %, más preferentemente al menos un 94 %, más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 96 %, más preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 98 %, más preferentemente al menos un 99 %, más preferentemente al menos un 99,1 %, más preferentemente al menos un 99,2 %, más preferentemente al menos un 99,3 %, más preferentemente al menos un 99,4 %, más preferentemente al menos un 99,5 %, más preferentemente al menos un 99,6 %, más preferentemente al menos un 99,7 %, más preferentemente al menos un 99,8 % e incluso más preferentemente al menos un 99,9 % idéntico a la SEC ID Nº designada relevante.

Como se usa en el presente documento, el término "hibrida" se refiere a la capacidad de dos moléculas de ácido

25 nucleico monocatenario para formar al menos un ácido nucleico parcialmente bicatenario a través de enlaces de hidrógeno.

Como se usa en el presente documento, la expresión "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones en las que un polinucleótido, una sonda, un cebador y/o un oligonucleótido se hibridarán con su secuencia diana, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas que las secuencias más cortas. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 ºC menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la que el 50 % de las

35 sondas complementarias a la secuencia diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Dado que las secuencias diana, en general, están presentes en exceso, a la Tm, el 50 % de las sondas están ocupadas en equilibrio. Por lo general, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1,0 M de ion de sodio, normalmente ion de sodio de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es al menos aproximadamente 30 ºC para las sondas, los cebadores o los oligonucleótidos cortos (por ejemplo, de 10 nt a 50 nt) y de al menos aproximadamente 60 ºC para sondas, cebadores y oligonucleótidos más largos. También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida.

Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la materia y se pueden encontrar en Ausubel et al.

45 (supra), “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6, así como en los ejemplos descritos en el presente documento. Preferentemente, las condiciones son tales que las secuencias al menos aproximadamente un 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 99 % homólogas entre sí normalmente se mantienen hibridadas entre sí. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en un tampón de alta concentración de sal que comprende 6 x SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02 %, Ficoll al 0,02 %, BSA al 0,02 % y 500 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 65 ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, BSA al 0,01 % a 50 ºC. En otra realización, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que es hibridable con la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 10 a 18 o 90 a 98, en condiciones de rigurosidad moderada. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación de rigurosidad moderadas son la hibridación en 6 x SSC, 5 x solución de Denhardt, SDS

55 al 0,5 % y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 55 ºC, seguida de uno o más lavados en 1 x SSC, SDS al 0,1 % a 37 ºC. Otras condiciones de rigurosidad moderada que se pueden usar son bien conocidas en la técnica; véase, por ejemplo, Ausubel et al.(supra), y Kriegler, 1990; “Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual”, Stockton Press, NY. En otra realización más, se proporciona un ácido nucleico que es hibridable con la molécula de ácido nucleico que comprende una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº 10 a 18 o 90 a 98, en condiciones de baja rigurosidad. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación de baja rigurosidad es la hibridación en formamida al 35 %, 5 x SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,02 %, Ficoll al 0,02 %, BSA al 0,2 %, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, sulfato de dextrano al 10 % (peso/vol) a 40 ºC, seguido de uno o más lavados en 2 x SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM y SDS al 0,1 % a 50 ºC. Hay otras condiciones de baja rigurosidad que se pueden usar que son bien conocidas en la técnica;

65 véase, por ejemplo, Ausubel et al. (supra) y Kriegler, 1990, “Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual”, Stockton Press, NY, así como los ejemplos proporcionados en el presente documento.

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diversas especies de plantas, incluyendo Arabidopsis y arroz. De esta manera, se recopiló una lista no redundante

de 397 genes candidatos que comprendían aproximadamente 20 familias de genes diferentes. Las secuencias de

proteínas correspondientes a los genes de esta lista se obtuvieron de bases de datos públicas, por ejemplo,

GenBank, y se usó todo el conjunto para consultar todas las secuencias EST del trigo que estaban disponibles en la

5 base de datos GenBank a partir del 18 de agosto de 2004, mediante el programa BLAST con los parámetros por

defecto. Así, se identificaron 1.540 EST de trigo únicas que codificaban secuencias de aminoácidos que eran

significativamente similares a una o más de las secuencias de proteínas de la consulta, teniendo cada una un valor

E de BLAST inferior a aproximadamente 0.001. A continuación, se analizaron los resultados de BLAST por lotes

para obtener el gen de consulta más similar para cada una de las 1.540 secuencias EST de trigo, de modo que cada 10 una de ellas se pudiera clasificar como relacionada con el homólogo de ese gen transportador de cationes o de

tolerancia a la sal en particular.

Además, se confirmaron las relaciones entre las secuencias realizando múltiples alineaciones de las secuencias de

aminoácidos conocidas y predichas usando el programa CLUSTALX (Thompson et al., 1997). En estos análisis, se 15 usaron las secuencias de aminoácidos en lugar de las secuencias de nucleótidos, pues los porcentajes de identidad

fueron, en general, mayores para las primeras. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos normalmente fueron

menos de un 50 % idénticas, incluso para los miembros de las familias de los homólogos claros, mientras que las

secuencias de aminoácidos correspondientes fueron al menos un 50 % idénticas y, por lo general, al menos un 60 %

idénticas. Por lo tanto, se generaron árboles filogenéticos (de unión al vecino) para las secuencias de aminoácidos 20 relacionadas con CLUSTALX usando los parámetros por defecto (semilla de número aleatorio 111, repeticiones de

arranque = 1.000, huecos no excluidos) para determinar las amplias relaciones entre los diversos miembros de cada

familia. A partir de esta información, se recopiló una lista de EST de trigo que tenían similitud con cada familia de

genes transportadores de cationes o de genes con tolerancia a la sal. Esto dio lugar a la identificación de

aproximadamente 20 familias de genes diferentes que se podían subdividir en subfamilias. La Tabla 5 muestra el 25 número de EST de trigo identificadas para cada familia de genes candidatos. La Figura 6 muestra un ejemplo de uno

de los árboles filogenéticos para la denominada familia de antiportadores de Na+/H+ (familia NHX en la Tabla 5).

Como parte de este proceso y como ejemplo de ello, se exploró la base de datos en busca de EST que codificaran

secuencias de aminoácidos similares a una familia de genes transportadores de sodio/potasio conocidos y 30 supuestos (HKT en la Tabla 5). Esta familia incluía el transportador de la captación de potasio de alta afinidad del

trigo U16709 (acceso de proteína AAA52749), el transportador de sodio de Arabidopsis AF237672 (acceso de

proteína AAF68393) y secuencias similares. Se han descrito nueve genes de esta familia en el arroz (Garciadeblas

et al., 2003). Estos se incluyeron en el BLAST por lotes junto con homólogos de otras varias especies. La Figura 7

muestra el árbol filogenético creado con CLUSTALX para los miembros de esta familia. Se encontró que los genes 35 del arroz pertenecían a 3 subfamilias, cada una con 2 subdivisiones. Las subfamilias fueron esencialmente

equidistantes en el árbol filogenético. Los análisis de los resultados del BLAST por lotes revelaron 6 EST de trigo

con similitud con el gen del trigo U16709, y 1 de cada uno de los genes del arroz AF500082, AJ491853 y

OSJNBb0022N24.16 (accesos de proteínas AAM46870, CAD37197 y BAB93392, respectivamente). Estas EST se

enumeran en la Tabla 6. Se identificó una sola EST del trigo (CK193616) que mostró mayor homología con el gen 40 OSJNBb0022N24.16 del arroz que cualquier otra EST del trigo.

Tabla 5. Número de EST del trigo identificadas correspondientes a cada familia de genes candidatos.

Superfamili a: Función Familia N.º de EST

CHX: Antiportadores de catión-hidrógeno, todos o la mayoría para cationes monovalentes o divalentes CHX 6

KEA: 44

MHX: 4

NHA: 6

NHD: 4

NHX: 53

SOS1: 10

CNGC: Las proteínas de la familia CNGC se cree que son canales catiónicos no selectivos, mientras que los miembros de la familia KAT se cree que son canales de K+. Ambas tienen dominios para la regulación por nucleótidos cíclicos. CNGC 117

KAT: 247

KC: Se cree que son canales de K+ de afinidad variable, pero la investigación sugiere papeles para las HKT en el transporte del sodio. HAK 212

HKT: 9

KCO: 72

Supuestos canales catiónicos no selectivos; similares a las proteínas receptoras de glutamato de animal.: GLR 41

Supuestos canales catiónicos no selectivos; desconocidas.: LCT 26

Pirofosfatasas de H+ vacuolares.: AVP 191

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heterocigótico del homocigótico para Nax2.

Por lo tanto, los miembros de la familia de genes HKT8 identificados por el marcador TmHKT8-Am se localizaron en el brazo largo del cromosoma 4B y 4D en Chinese Spring, y el brazo largo del cromosoma 5A en la Línea 149 de

5 trigo duro. Cabía suponer que había otros tres miembros de la Línea 149 en el cromosoma 4B, correspondientes a los de Chinese Spring. El fragmento del gen duro del cromosoma A resultó ser idéntico al de T. monococcum, que tiene un genoma A, y cabía suponer que procedía de T. monococcum por introgresión.

La diferencia en las posiciones cromosómicas, el cromosoma 4 para los genomas B y D, y el cromosoma 5 para el

10 genoma A, podría haberse debido a una translocación antigua entre 4AL y 5AL, posiblemente formada durante la hibridación que dio lugar a la formación del trigo tetraploide a partir de los progenitores de genoma A y B. El segmento terminal de 5AL ha demostrado ser homólogo a 4BL y 4DL (Liu et al., 1992). Por lo tanto, se explica que la ubicación en 5AL del gen HKT8 y el gen Nax2 vinculado en T. monococcum y la Línea 149 se produce por una translocación de 4AL/5AL a nivel diploide antes o durante la poliploidización del trigo (Figura 15). Se concluyó que

15 HKT8 y Nax2 se cartografían hasta este segmento translocado.

Tabla 8. Marcadores microsatélite polimórficos entre la Línea 149 o P04973 y Tamaroi.

Número WMS: Dominancia Cromosoma Posición [cM] Tamaños de los Línea 149 192, 214 222 190 fragmentos Tamaroi 216,240 208 192

WMS4090: codominante 1A, 5B 89,7; 247,6

WMS0784: codominante 1B 98,6

WMS4106: codominante 1B 105,5

WMS1521: codominante 1B 141,9 125, 173, 187 230, 238 187, 199, 213, 227 140, 160, 182, 186 199, 205 204, 212, 224 137, 143 146 152, 170 91, 131 186, 220 165 P04973 0 0 125, 177, 187 238 199, 227 140, 160, 182 205 204 137 144 170 93, 131 188, 220 167 156,185 171

WMS4096: codominante 1B 156,8

WMS0153: codominante 1B 168,3

WMS0274: codominante 1B 170,9

WMS0124: dominante 1B 176,5

WMS0268: codominante 1B 176,5

WMS0077: codominante 3B 168,1

WMS0637: codominante 4A 145,9

WMS0260: codominante 7A 197,8

WMS0731: codominante 4A 48,1

WMS4445: codominante 4A 54

WMS0610: codominante 4A 65,6

WMS1342: dominante 5A 173,9

WMS0291: dominante 5A 247,2

WMS0132: dominante 6B 43,6 135, 149, 156 0 99, 111, 123 116, 120 167, 176 0 -0, 170, 177 135, 0, 0 200 99, 111, 0 0, 120 0, 176 148 -157, 170, 177

WMS3085: dominante 1A 63,9

WMS0095: dominante 2A 165

WMS0685: dominante 3B 163,1

WMS3144: dominante 3B 205,7

WMS4063: dominante 4A 55,1

WMS0410: dominante 5A -

WMS1694: dominante 4A 238

Se usó el polimorfismo de secuencias (véase el Ejemplo 6) entre los miembros de genes HKT8 A y B para

20 desarrollar un marcador de PCR (marcador HKT8-A) específico del miembro de genes A, muy probable que sea Nax2, es decir, aquel que podía distinguir los miembros del genoma A y B en una población reproductora. Las secuencias de cebadores fueron: para AI, 5'-GAGTGGGGCTCCGACGGGCTGAA-3’ (SEC ID Nº 68) y, para RevAl, 5'-GCCGGCCGTCCACTGCGGACTGC-3’ (SEC ID Nº 69). Se realizó la PCR en condiciones convencionales con el siguiente protocolo de ciclado: 95 ºC, 15 min; a continuación, 5 ciclos a 94 ºC, 1 min; 60 ºC, 1 min; 72 ºC, 1 min;

25 seguido por 30 ciclos a 94 ºC, 30 s; 60 ºC, 30 s; y 72 ºC, 50 s. Se observó una banda del tamaño esperado (986 pb) para todas las líneas con Nax2 y ninguna para las que carecían de Nax2 (Figura 16). No se determinó la distancia genética entre el marcador gpw2181 codominante y Nax2, si bien estarían estrechamente vinculados. Por lo tanto, si se usó gpw2181 como un marcador genético para el locus en la reproducción vegetal, quedaba una posibilidad baja de recombinación entre gpw2181 y Nax2. Así pues, se prefería el marcador HKT8-A. Sin embargo, se prefiere

30 todavía más el uso de la combinación de gpw2181 con el marcador HKT8-A en un programa de reproducción para rastrear Nax2.

Conclusión

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Claims

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