ES2562778T3 - Ácidos grasos de cadena corta unidos a motivos quelantes de Zn2+ como una clase novedosa de inhibidores de histona deacetilasa - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de histona deacetilasa que tiene la fórmula:**Fórmula** en la que: X se elige entre H y CH3; Y es (CH2)n, en la que n es 0; Z se elige entre (CH2)m en la que m es 0-3 y (CH)2; A es un grupo alquilo graso aromático α-ramificado de 3 a 14 carbonos, B es hidroxi, y Q es hidrógeno.

Description

DESCRIPCION

Acidos grasos de cadena corta unidos a motivos quelantes de Zn2+ como una clase novedosa de inhibidores de histona deacetilasa.

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Esta invencion se realizo con el apoyo de la subvencion de la Armada DAMD17-02-1-0117 y la subvencion del National Institutes of Health CA94829. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invencion. Esta solicitud reivindica la prioridad del documento provisional de Estados Unidos 60/526.348, presentado el 2 de diciembre de 2002.

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Campo de la Invencion

La invencion se refiere a inhibidores de histona deacetilasa, y en particular, aquellos que incluyen motivos quelantes de Zn2+. Mas particularmente, la invencion se refiere a inhibidores de histona deacetilasa que incluyen motivos 15 quelantes de Zn2+, basados en acidos grasos de cadena corta.

Antecedentes de la Invencion

El estado de acetilacion de las histonas nucleares tiene una funcion clave en la regulacion de la transcripcion genica 20 a traves de la modulacion del empaquetamiento nucleosomal del ADN (Kouzarides, "Histone acetylases and deacetylases in cell proliferation". Curr Opin Genet Dev 9: 40-48 (1999); Gray y Ekstrom, "The human histone deacetylase family". Exp Cell Res 262: 75-83 (2001); Jenuwein y Allis, "Translating the histone code". Science 293: 1074-1080 (2001)). En un estado hipoacetilado, los nucleosomas estan muy compactados, dando como resultado una represion de la transcripcion debido al acceso restringido de los factores de transcripcion a su ADN diana. Por el 25 contrario, la acetilacion de la histona conduce a estructuras nucleosomales relajadas, dando lugar a un estado de la cromatina transcripcionalmente permisivo. Un equilibrio dinamico entre las actividades de las histona acetiltransferasas (HAT) y las histona deacetilasas (HDAC), ambas de las cuales se incluyen en los genes diana en complejos con activadores de la transcripcion espedficos de secuencia, mantiene este nivel de esta modificacion post-traduccional. La regulacion aberrante de este sistema marcador epigenetico ha demostrado causar una 30 expresion genica inapropiada, un evento clave en la patogenesis de muchas formas de cancer (Wade, "Transcriptional control at regulatory checkpoints by histone deacetylases: molecular connections between cancer and chromatin". Hum Mol Genet 10: 693-698 (2001); Cress y Seto, "Histone deacetylases, transcriptional control, and cancer". J Cell Physiol 184: 1-16 (2000); Marks y col., "Histone deacetylases and cancer: causes and therapies". Nat Rev Cancer 1: 194-202 (2001)). Ademas, la evidencia demuestra que la inhibicion de HDAC desencadena 35 detencion del crecimiento, diferenciacion y/o apoptosis en muchos tipos de celulares tumorales mediante la reactivacion de la transcripcion de un pequeno numero de genes (Jung, "Inhibitors of histone deacetylase as new anticancer agents". Curr Med Chem 8: 1505-1511 (2001); Grozinger y Schreiber, "Deacetylase enzymes: biological functions and the use of small-molecule inhibitors". Chem Biol 9: 3-16 (2002); Johnstone, "Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs for the treatment of cancer'. Nat Rev Drug Disco 1: 287-299 (2002); Kramer y col., "Histone 40 deacetylases as a therapeutic target". Trends Endocrinol Metab 12: 294-300 (2001); Marks y col., "Histone deacetylase inhibitors: inducers of differentiation or apoptosis of transformed cells". J Natl Cancer Inst 92: 1210-1216 (2000)). Los modelos de xenoinjerto tambien confirman estos hallazgos in vitro, lo que sugiere que la modulacion de la funcion de las HDAC es una diana para la prevencion y/o intervencion terapeutica del cancer.

45 Hasta la fecha, se han indicado varias clases estructuralmente distintas de inhibidores de HDAC (Jung, Curr Med Chem 8: 1505-1511 (2001); Grozinger y Schreiber, Chem Biol 9: 3-16 (2002); Johnstone, Nat Rev Drug Discov 1: 287-299 (2002); Kramer y col., Trends Endocrinol Metab 12: 294-300 (2001); Marks y col., J Natl Cancer Inst 92: 1210-1216 (2000)), incluyendo acidos grasos de cadena corta (por ejemplo, butirato, valproato, acetato de fenilo y butirato de fenilo) (Lea y Tulsyan, "Discordant effects of butyrate analogues on erythroleukemia cell proliferation, 50 differentiation and histone deacetylase". Anticancer Res 15: 879-883 (1995); Kruh, "Effects of sodium butyrate, a new pharmacological agent, on cells in culture". Mol Cell Biochem 42: 65-82 (1982); Newmark y Young, "Butyrate and phenylacetate as differentiating agents: practical problems and opportunities". J Cell Biochem Suppl 22: 247-253 (1995); Phiel y col., "Histone deacetylase is a direct target of valproic acid, a potent anticonvulsant, mood stabilizer, and teratogen". J Biol Chem 276: 36734-36741 (2001)), derivados de benzamida (por ejemplo, MS-27-275) (Suzuki y 55 col., "Synthesis and histone deacetylase inhibitory activity of new benzamide derivatives". J Med Chem 42: 30013003 (1999); Saito y col., "A synthetic inhibitor of histone deacetylase, MS-27-275, with marked in vivo antitumor activity against human tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 4592-4597 (1999)), tricostatina A (TSA) y analogos (Tsuji y col., "A new antifungal antibiotic, trichostatin". J Antibiot (Tokio) 29: 1-6 (1976); Jung y col. "Amide analogues of trichostatin A as inhibitors of histone deacetylase and inducers of terminal cell differentiation". J Med Chem 42:

4669-4679 (1999); Furumai y col. "Potent histone deacetylase inhibitors built from trichostatin A and cyclic tetrapeptide antibiotics including trapoxin". Proc Natl Acad Sci U S A 98: 87-92 (2001)), compuestos polares hnbridos (por ejemplo, acido hidroxamico suberoilanilida (SAHA)) (Richon y col., "A class of hybrid polar inducers of transformed cell differentiation inhibits histone deacetylases." Proc Natl Acad Sci U S A 95: 3003-3007 5 (1998); Remiszewski y col., "Inhibitors of human histone deacetylase: synthesis and enzyme and cellular activity of straight chain: hydroxamates". J Med Chem 45: 753-757 (2002)), tetrapeptidos dclicos (por ejemplo, apicidina) (Kijima y col., "Trapoxin, an antitumor cyclic tetrapeptide; is an irreversible inhibitor of mammalian histone deacetylase". J Biol Chem 268: 22429-22435 (1993); Shute y col., "Analogues of the cytostatic and antimitogenic agents chlamydocin and HC-toxin: synthesis and biological activity of chloromethyl ketone and diazomethyl ketone 10 functionalized cyclic tetrapeptides". J Med Chem 30: 71-78 (1987); Han y col., "Apicidin, a histone deacetylase inhibitor, inhibits proliferation of tumor cells via induction of p21WAF1/Cip1 and gelsolin". Cancer Res 60: 6068-6074 (2000); Nakajima y col., "FR901228, a potent antitumor antibiotic, is a novel histone deacetylase inhibitor". Exp Cell Res 241: 126-133 (1998)), y el depsipeptido FR901228 (Nakajima y col., Exp Cell Res 241: 126-133 (1998)). Entre estos agentes, los acidos grasos de cadena corta son los inhibidores menos potentes con CI50 en el intervalo mM, en 15 comparacion con la de pM o incluso nM para otros tipos de inhibidores de HDAC. Aunque se ha indicado el uso de acidos grasos de cadena corta en tratamiento del cancer, su eficacia terapeutica se ha limitado por la baja actividad anti-proliferativa, el rapido metabolismo y un modo de accion no espedfico.

Recientemente, el analisis cristalografico de rayos X de HDLP (protema tipo histona deacetilasa), un homologo de 20 HDAC bacteriano, ha sugerido un modo distinto de interacciones protema-ligando por las que TSA y SAHA median la inhibicion enzimatica (Finnin y col., "Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors". Nature 401: 188-193 (1999)). El dominio catalttico de HDAC consiste aparentemente en un bolsillo tipo tubo estrecho que abarca la longitud equivalente a unas cadenas lineales de cuatro a seis carbonos. Un cation de Zn2+ se situa cerca de la parte inferior de este bolsillo enzimatico, que, en cooperacion con dos sistemas de relevo 25 de carga His-Asp, se cree que facilita la catalisis de la desacetilacion.

Tras considerar cuidadosamente otros trabajos en el campo, se comprendio que la potencia deficiente de los acidos grasos de cadena corta en la inhibicion de HDAC podfa atribuirse, en parte, a su incapacidad de acceso al cation Zn2+ en el bolsillo de sitio activo, que se cree que tiene una funcion clave en la catalisis de la desacetilacion. En base 30 a esta realizacion y un estudio adicional, se modificaron estructuralmente los acidos grasos de cadena corta uniendolos con un motivo quelante de Zn2+ a traves de un enlazador aromatico. Los descubrimientos y el estudio han conducido a la invencion de una nueva clase de acidos grasos de cadena corta unidos a motivos quelantes de Zn2+, algunos de los cuales muestran la inhibicion de la actividad de HDAC y la proliferacion de celulas cancerosas en un intervalo de nM, una mejora de tres ordenes de magnitud sobre sus precursores.

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RESUMEN DE LA INVENCION

Se comprendio que la debil potencia de los acidos grasos de cadena corta como inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC) podfa atribuirse, en parte, a su incapacidad de acceder al cation de cinc en el bolsillo de sitio 40 activo de HDAC, que se cree que es importante en la catalisis de la desacetilacion. La presente invencion se basa en la modificacion estructural de los acidos grasos, incluyendo los acidos grasos de cadena corta, por ejemplo, valproato, butirato, acetato de fenilo y butirato de fenilo. La presente invencion incluye generalmente el acoplamiento de acidos grasos con motivos quelantes de Zn2+ (incluyendo, pero sin limitacion, acido hidroxamico y o-fenilen diamina) a traves de enlazadores de o-aminoacidos aromaticos. Esta estrategia ha conducido a la presente 45 invencion, que incluye una nueva clase de acidos grasos de cadena corta unidos a motivos quelantes de Zn2+.

La eficacia de los compuestos de la invencion en la inhibicion de HDAC demuestra que pueden disenarse inhibidores de HDAC potentes basandose en el marco proporcionado por las estructuras cristalinas de complejos de HDLP-ligando. La presente invencion se basa en una estrategia de union que permite la generacion de una gran 50 biblioteca de compuestos a traves de la combinacion divergente de acidos grasos de cadena corta, o-aminoacidos, y un quelante de cinc, tal como hidroxamato.

La presente invencion incluye inhibidores de histona deacetilasa que tienen la formula:

en la que:

imagen1

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X se elige entre H y CH3;

Y es (CH2)n en la que n es 0;

Z se elige entre (CH2)m en la que m es 0-3 y (CH)2;

A es un grupo hidrocarbilo de acuerdo con las reivindicaciones;

B es un grupo hidroxilo; y Q es hidrogeno.

A puede comprender un grupo alifatico, que esta ramificado, y un grupo aromatico, que puede estar sustituido o sin sustituir. En la formula, B puede ser hidroxilo. Y es (CH2)n, en la que n es 0, A comprende un grupo aromatico, B es hidroxi, y Q es hidrogeno.

15 En algunas realizaciones especfficas, m es 0 y X es H. Los compuestos que tienen estas caracteristicas incluyen,

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En algunas realizaciones especfficas, X es H y A se elige entre:

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y

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donde R comprende un grupo ramificado o no ramificado, sustituido o sin sustituir, saturado o insaturado, alifatico o aromatico.

5 La presente invention tambien incluye composiciones que comprenden el inhibidor de acuerdo con la invention, donde la composition se enriquece en el estereoisomero S en comparacion con el estereoisomero R.

Los inhibidores espetificos desvelados incluyen N-(2-Amino-fenil)-4-[(2-propil-pentanoilamino)-metil]-benzamida; N- Hidroxi-4-[(2-propil-pentanoilamino)-metil]-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(2-propil-pentanoilamino)-benzamida; N- 10 Hidroxi-4-(2-propil-pentanoilamino)-benzamida; {4-[2-amino-fenilcarbamoil)-metil]-fenil}-amida del acido 2-propil- pentanoico; (4-hidroxicarbamoil-metil-fenil)-amida del acido 2-propil-pentanoico; {4-[2-amino-fenilcarbamoil)-etil]- fenil}-amida del acido 2-propil-pentanoico; [4-(2-hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-amida del acido 2-propil-pentanoico; {4-2- (2-amino-fenilcarbamoil)-vinil]-fenil}-amida del acido 2-propil-pentanoico; [4-(2-hidroxicarbamoil-vinil)-fenil]-amida del acido 2-propil-pentanoico; N-(2-Amino-fenil)-4-(butirilamino-metil)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(fenilacetilamino- 15 metil)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-[(4-fenil-butirilamino-metil]-benzamida; 4-(Butirilamino-metil)-N-hidroxi- benzamida; N-hidroxi-4-(fenilacetilamino-metil)-benzamida; N-hidroxi-4-[(4-fenil-butirilamino)-metil]-benzamida; 4- Butirilamino-N-hidroxi-benzamida; N-hidroxi-4-fenilacetilamino-benzamida; N-hidroxi-4-(4-fenilbutirilamino)- benzamida; N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-butiramida; N-hidroxi-3-(4-fenilacetilamino-fenil)-propionamida; N-[4- (2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-4-fenil-butiramida; N-(2-Amino-fenil)-4-[(2-fenil-butirilamino-metil]-benzamida; N-(2- 20 Amino-fenil)-4-[(3-fenil-butirilamino-metil]-benzamida; N-hidroxi-4-(2-fenilbutirilamino)-benzamida; N-hidroxi-4-(3- fenilbutirilamino)-benzamida; N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-2-fenil-butiramida; N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)- fenil]-3-fenil-butiramida; N-hidroxi-4-[(2-fenil-butirilamino)-metil]-benzamida; N-hidroxi-4-[(3-fenil-butirilamino)-metil]- benzamida; 4-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida; 4-(4-metil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida; 4-(4-cloro)- Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida; 4-(4-bromo)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida; 4-(4-terc-butil)-Benzoilamino-N- 25 hidroxi-benzamida; 4-(4-fenil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida; 4-(4-metoxil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida; 4-(4-trifluorometil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida; 4-(4-nitro)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida; (4- hidroxicarbamoil-fenil)-amida del acido piridin-2-carboxflico; N-hidroxi-4-(2-metil-2-fenil-propionilamino)-benzamida; N-hidroxi-4-(3-metil-2-fenil-butirilamino)-benzamida; N-hidroxi-4-(3-fenil-propionilamino)-benzamida; 4-(2,2-Dimetil-4- fenil-butirilamino)-N-hidroxi-benzamida; N-hidroxi-4-[metil-(4-fenil-butiril)-amino]-benzamida; N-hidroxi-4-(2-fenil- 30 propionilamino)-benzamida; N-hidroxi-4-(2-metoxi-2-fenil-acetilamino)-benzamida; 4-Difenilacetilamino-N-hidroxi- benzamida; N-hidroxi-4-[2-(4-isobutil-fenil)-propionilamino]-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-fenilacetilamino- benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(5-fenil-pentanoilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(2-fenil-butirilamino)- benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(2,2-dimetil-4-fenil-butirilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(3-fenil- propionilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(4-fenil-butirilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(3-fenil- 35 butirilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(3-metil-2-fenil-butirilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(2-metil-2- fenil-propionilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-[2-(4-isobutil-fenil)-propionilamino]-benzamida; y N-hidroxi-4-[2- (S)-fenilbutirilamino]-benzamida; N-hidroxi-4-[2-(R)-fenilbutirilamino]-benzamida; N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-

2-(S)-fenil-butiramida; N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-2-(R)-fenil-butiramida; N-hidroxi-4-(3-(S)-fenilbutirilamino)- benzamida; N-hidroxi-4-(3-(R)-fenilbutirilamino)-benzamida; N-hidroxi-4-[3-(S)-fenilbutirilamino]-benzamida; y N- 40 hidroxi-4-[3-(R)-fenilbutirilamino]-benzamida. Unicamente aquellos que estan dentro de las reivindicaciones son parte de la invencion.

La presente invencion tambien incluye composiciones farmaceuticas que comprenden estos inhibidores, y al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable. Aun adicionalmente, la invencion incluye metodos de inhibicion de la 45 proliferacion de celulas neoplasicas en un animal, tal como un ser humano, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un inhibidor de la invencion.

Caracteristicas y ventajas adicionales de la invencion se expondran, en parte, en la descripcion a continuacion, y en

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parte seran obvias a partir de la descripcion, o pueden aprenderse por la practica de la invencion. Las caractensticas y ventajas de la invencion se realizaran y se conseguiran por medio de los elementos y combinaciones senalados particularmente en las reivindicaciones adjuntas.

Debe apreciarse que tanto la descripcion general anterior como la siguiente descripcion detallada con ejemplares y explicativas. Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran realizaciones de la invencion, y junto con la descripcion, sirven para explicar los principios de la invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra conjugaciones divergentes de acido valproico con cinco o-aminoacidos aromaticos y dos restos quelantes de Zn2+ para generar los compuestos 1 -10.

La figura 2 muestra la potencia inhibidora de HDAC de los compuestos 1 -10. El ensayo de HDAC in vitro se realizo usando un kit de ensayo enzimatico comercial como se describe en el presente documento. Los datos son la media + DE (n = 3).

La figura 3 muestra estructuras y la potencia inhibidora de HDAC de los compuestos 11 - 22. Los valores son la media + DE (n = 3).

La figura 4 muestra el efecto de HTPB, TSA y butirato de fenilo sobre la acetilacion de histona y la expresion de p2iWAF/CIP1 en celulas DU-145. Las celulas DU-145 se expusieron a HTPB, TSA y butirato de fenilo a las concentraciones indicadas en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % durante 24 h. Una cantidad equivalente de protema de lisados individuales se sometio a electroforesis y se sondo por transferencia de Western con los anticuerpos respectivos. Se uso actina como una protema de referencia interna.

La figura 5 muestra el efecto inhibidor del crecimiento de HTPB sobre celulas DU-145. (A) Curso del tiempo del efecto dependiente de la dosis de HTPB sobre la viabilidad celular. Las celulas DU-145 se trataron con HTPB 0-2,5 |iM en medio RPMI 1640 que contema FBS al 10 % durante los tiempos indicados. Las celulas viables se examinaron por el ensayo MTT. Los datos son la media + DE (n = 6). (B) Efecto dependiente de la dosis de HTPB sobre la formacion de ADN nucleosomal despues de 24 h de exposicion. La formacion de nucleosomas se midio cuantitativamente por ELISA de deteccion de muerte celular con lisados equivalentes a 2 x 103 celulas para cada ensayo. Los datos son la media de dos determinaciones independientes.

La figura 6 ilustra ejemplos de esquemas para sintetizar compuestos de acuerdo con la invencion.

La figura 7 (Cuadros 1-11) muestra ejemplos de diferentes compuestos de acuerdo con la invencion.

La figura 8 (Cuadros 1 y 2) muestra ejemplos de motivos quelantes de cinc que pueden usarse de acuerdo con la invencion.

La figura 9 es un estudio de modelado molecular del acoplamiento de ligando del compuesto 19.

La figura 10 ilustra como diagrama la transferencia de protones que se cree que se produce durante la interaccion del compuesto 19 y su sitio de union.

La figura 11 es un estudio de modelado molecular del acoplamiento de ligando del compuesto 42.

La figura 12 muestra el efecto del compuesto 42, SAHA y TSA sobre la hiperacetilacion de la histona H-4 y

w WAF/CIP1 j

la expresion de p21 en celulas de cancer de prostata independientes de androgenos PC-3.

La figura 13 muestra el efecto del compuesto 42, SAHA y TSA sobre el estado de activacion de Akt en celulas PC-3.

La figura 14 muestra el efecto del compuesto 42 sobre varias cinasas.

La figura 15 muestra el efecto del compuesto 42 administrado por via oral sobre el crecimiento de tumores de xenoinjerto PC-3 establecidos.

La figura 16 muestra el efecto del compuesto 42, el compuesto 44 y SAHA sobre el crecimiento de tumores de xenoinjerto PC-3 subcutaneos en ratones atfmicos.

La figura 17 muestra transferencias de Western de histona H3 y H3 acilada en los homogenados de dos tumores PC-3 representativos tratados con el compuesto 42, SAHA o control.

La figura 18 muestra los efectos antiproliferativos dependientes de la dosis del compuesto 42 sobre lmeas celulares representativas de cancer mama, pulmon y tiroides.

La figura 19 muestra el efecto del compuesto 42 sobre celulas LLC primarias.

La figura 20 ilustra en diagrama un esquema de smtesis qmmica para el compuesto 42.

La figura 21 ilustra en diagrama un esquema de smtesis qmmica generica para compuestos de acuerdo con la invencion.

DESCRIPCION DE REALIZACIONES DE LA INVENCION

En general, los acidos grasos de cadena corta muestran la actividad inhibidora de HDAC y antiproliferativa en el

intervalo mM independientemente de la estructura de las cadenas acilo (Grozinger y Schreiber, Chem Biol 9: 3-16 (2002); Johnstone, Nat Rev Drug Discov 1: 287-299 (2002); Kramer y col., Trends Endocrinol Metab 12: 294-300 (2001)). La presente invencion se basa, entre otras cosas, en el descubrimiento de que estos acidos grasos ejercen la inhibicion de HDAC a traves de interacciones hidrofobas no espedficas con residuos superficiales situados en la 5 entrada del bolsillo enzimatico y/o la region hidrofoba en el interior del bolsillo tipo tubo. Se mejoro la potencia inhibidora de HDAC de estos acidos grasos de cadena corta mediante union a un resto quelante de Zn2+ a traves de un separador hidrofobo.

La medicion de la actividad enzimatica de una histona deacetilasa puede conseguirse usando metodologfas 10 conocidas. Por ejemplo, Yoshida y col. (J. Biol. Chem. 265: 17174-17179 (1990)) describen la evaluacion de la actividad enzimatica de la histona deacetilasa mediante la deteccion de histonas acetiladas en celulas tratadas con tricostatina A. Taunton y col. (Science 272: 408-411 (1996)) describen de forma analoga metodos para medir la actividad enzimatica histona deacetilasa usando HDAC-1 endogena y recombinante. Tanto Yoshida y col. (J. Biol. Chem. 265: 17174-17179, 1990) como Taunton y col. (Science 272: 408-411, 1996.

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A lo largo de esta divulgacion, se hara referencia a compuestos de acuerdo con la invencion. La referencia a dichos compuestos, en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluye esteres y sales de dichos compuestos. Por lo tanto, incluso si no se mencionan explfcitamente, dichos esteres y sales se contemplan, por referencia a los propios compuestos.

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Los acidos grasos que pueden usarse de acuerdo con la presente invencion comprenden una porcion hidrocarbilo y una porcion acido carboxflico. Como se usa en el presente documento, el termino "hidrocarbilo" se entiende que incluye "alifatico," "cicloalifatico" y "aromatico". Los grupos hidrocarbilo se entiende que incluyen grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo y alkarilo. Ademas, "hidrocarbilo" se entiende que incluye tanto grupos 25 hidrocarbilo no sustituidos, como grupos hidrocarbilo sustituidos, haciendo referencia los ultimos a la porcion hidrocarburo que lleva sustituyentes adicionales, ademas de carbono e hidrogeno. Ademas, aunque se usa "acido carboxflico" para referirse a los compuestos, las sales de dichos acidos, es decir, carboxilatos, tambien se contemplan expresamente. Ademas, pueden usarse de forma intercambiable en el presente documento acidos carboxflicos y carboxilatos.

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En particular, acidos grasos son aquellos que tienen longitudes de cadena comparables a un acido graso no ramificado de 3 carbonos a 14 carbonos de longitud. Por lo tanto, las cadenas son, por ejemplo, de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12 o 13 carbonos de longitud. Las cadenas pueden ser de hasta, por ejemplo, aproximadamente 14, 13, 12,

11, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 carbonos de longitud. Los acidos de grasos pueden lineales o ramificados y pueden incluir 35 enlaces sencillos, dobles y/o triples enlaces. Los ejemplos de acido grasos incluyen valproato, butirato, acetato de

fenilo y butirato de fenilo.

Los motivos quelantes de cinc2+ contemplados de acuerdo con la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, acidos hidroxamicos y o-fenilen diaminas. Otros ejemplos incluyen trifluorometil cetona, a-ceto amida, a-ceto tiazol, 40 2-ceto 1-metil-1H-imidazol, a-ceto 1 H-tetrazol, a-ceto 1 H-imidazol, 5-ceto 1-metil-1H-imidazol, a-ceto oxazol, a- ceto 4,5-dihidro-oxazol, a-ceto benzooxazol, a-ceto oxazolo[4,5-b]piridina y a-ceto piridina. Las estructuras de estos motivos se muestran en la figura 8.

El separador es un separador de hidrocarbilo de acuerdo con las reivindicaciones, comprende un componente 45 aromatico. Se cree que los enlazadores aromaticos poseen las siguientes ventajas: 1) mejoran la rigidez estructural del conjugado, y 2) aumentan los contactos de van der Waals con la region hidrofoba tipo tubo del bolsillo para mejorar la afinidad de union. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero sin limitacion, o-aminoacidos aromaticos.

Los enlazadores pueden mostrar longitudes equivalentes a la de cadenas lineales de cuatro a ocho carbonos, por 50 ejemplo, equivalentes a cadenas lineales de 4, 5, 6, 7 o 8 carbonos. Por lo tanto, las longitudes pueden ser equivalentes a cadenas lineales de 4-7 o 4-6 carbonos. La longitud puede basarse en la profundidad de la region hidrofoba del bolsillo de union. Los ejemplos de enlazadores desvelados incluyen, pero sin limitacion, acido 4- (aminometil)benzoico, acido 4-aminobenzoico, acido (4-aminofenil)acetico, acido 3-(4-aminofenil)propionico, y acido

3-(4-aminofenil)-acnlico. Entre ellos, se ha usado acido 4-(aminometil)benzoico como el enlazador para MS-27-275 55 (Saito y col., Proc Natl Acad Sci US A 96: 4592-4597 (1999)). Unicamente aquellos que estan dentro de las reivindicaciones son parte de la invencion.

Se desvelan los siguientes compuestos.

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50

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N-(2-Amino-fenil)-4-[(2-propil-pentanoilamino)-metil]-benzamida;

N-Hidroxi-4-[(2-propil-pentanoilamino)-metil]-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(2-propil-pentanoilamino)-benzamida;

N-Hidroxi-4-(2-propil-pentanoilamino)-benzamida;

{4-[2-Amino-fenilcarbamoil)-metil]-fenil}-amida del acido 2-propil-pentanoico; (4-Hidroxicarbamoil-metil-fenil)-amida del acido 2-propil-pentanoico; {4-[2-Amino-fenilcarbamoil)-etil]-fenil}-amida del acido 2-propil-pentanoico; [4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-aiTiida del acido 2-propil-pentanoico; {4-2-(2-Amino-fenilcarbamoil)-vinil]-fenil}-amida del acido 2-propil-pentanoico; [4-(2-Hidroxicarbamoil-vinil)-fenil]-amida del acido 2-propil-pentanoico; N-(2-Amino-fenil)-4-(butirilamino-metil)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(fenilacetilamino-metil)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-[(4-fenil-butirilamino-metil]-benzamida;

4-(Butirilamino-metil)-N-hidroxi-benzamida; N-hidroxi-4-(fenilacetilamino-metil)-benzamida; N-hidroxi-4-[(4-fenil-butirilamino)-metil]-benzamida; 4-Butirilamino-N-hidroxi-benzamida;

N-hidroxi-4-fenilacetilamino-benzomida,

N-hidroxi-4-(4-fenilbutirilamino)-benzamida;

N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-butiramida;

N-hidroxi-3-(4-fenilacetilamino-fenil)-propionamida;

N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-4-fenil-butiramida;

N-(2-Amino-fenil)-4-[(2-fenil-butirilamino-metil]-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-[(3-fenil-butirilamino-metil]-benzamida;

N-hidroxi-4-(2-fenilbutirilamino)-benzamida;

N-hidroxi-4-(3-fenilbutirilamino)-benzamida;

N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-2-fenil-butiramida;

N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-3-fenil-butiramida;

N-hidroxi-4-[(2-fenil-butirilamino)-metil]-benzamida;

N-hidroxi-4-[(3-fenil-butirilamino)-metil]-benzamida;

4-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

4-(4-metil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

4-(4-cloro)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

4-(4-bromo)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

4-(4-terc-butil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

4-(4-fenil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

4-(4-metoxil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

4-(4-trifluorometil)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

4-(4-nitro)-Benzoilamino-N-hidroxi-benzamida;

(4-Hidroxicarbamoil-fenil)-amida del acido piridin-2-carboxflico;

N-hidroxi-4-(2-metil-2-fenil-propionilamino)-benzamida;

N-hidroxi-4-(3-metil-2-fenil-butirilamino)-benzamida;

N-hidroxi-4-(3-fenil-propionilamino)-benzamida;

4-(2,2-Dimetil-4-fenil-butirilamino)-N-hidroxi-benzamida;

N-hidroxi-4-[metil-(4-fenil-butiril)-amino]-benzamida;

N-hidroxi-4-(2-fenil-propionilamino)-benzamida;

N-hidroxi-4-(2-metoxi-2-fenil-acetilamino)-benzamida;

4-Difenilacetilamino-N-hidroxi-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(4-isobutil-fenil)-propionilamino]-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-fenilacetilamino-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(5-fenil-pentanoilamino)-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(2-fenil-butirilamino)-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(2,2-dimetil-4-fenil-butirilamino)-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(3-fenil-propionilamino)-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(4-fenil-butirilamino)-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(3-fenil-butirilamino)-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(3-metil-2-fenil-butirilamino)-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-(2-metil-2-fenil-propionilamino)-benzamida;

N-(2-Amino-fenil)-4-[2-(4-isobutil-fenil)-propionilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(S)-fenilbutirilamino]-benzamida;

N-hidroxi-4-[2-(R)-fenilbutirilamino]-benzamida;

N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-2-(S)-fenil-butiramida;

N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-2-(R)-fenil-butiramida;

5 N-hidroxi-4-(3-(S)-fenilbutirilamino)-benzamida;

N-hidroxi-4-(3-(R)-fenilbutirilamino)-benzamida;

N-hidroxi-4-[3-(S)-fenilbutirilamino]-benzamida; y N-hidroxi-4-[3-(R)-fenilbutirilamino]-benzamida.

10 Los compuestos de la invencion pueden ser racematos, o mezclas racemicas. El termino "racemico", como se usa en el presente documento, se refiere a una mezcla de los enantiomeros (R) y (S), o estereoisomeros, de los compuestos de la invencion, en los que ningun enantiomero, o estereoisomero, se purifica sustancialmente entre st

El termino "enriquecido", como se usa en el presente documento para describir estereoisomeros (R) o (S) de la 15 invencion, se refiere a una composicion que tiene una mayor cantidad del estereoisomero (R) que del estereoisomero (S), o viceversa. Por ejemplo, la composicion puede contener mas del 50 %, 55 %, o al menos aproximadamente el 60 % del estereoisomero (S) del compuesto 42 en peso, basandose en el peso total del compuesto 42. En una realizacion, la cantidad de (S)-compuesto 42 enriquecido puede ser superior, por ejemplo, al menos aproximadamente el 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 20 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o cualquier fraccion de los mismos (es decir, 90,1 %, 90,2 %, etc.), del (S)-compuesto 42 en peso, basandose en el peso total del compuesto 42. En una realizacion particular, la cantidad del (S)-compuesto 42 enriquecido puede ser mayor del 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99:3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9 % o puede ser del 100 %, en peso, basandose en el peso total del compuesto 42. Estos terminos tambien definen la cantidad de cualquier sal farmaceuticamente aceptable del (S)-compuesto 42. 25 Estos son ejemplos no limitantes, y los mismos enriquecimientos pueden conseguirse para otros compuestos racemicos de la invencion.

La administracion de composiciones enriquecidas enantiomericamente de la invencion puede dar como resultado un efecto terapeutico deseable. Es decir, la administracion de composiciones enriquecidas enantiomericamente puede 30 producir un efecto terapeutico a una concentracion total inferior, o puede reducir los efectos secundarios resultantes de la presencia del enantiomero menos deseable. Estas ventajas se contemplan espedficamente.

Cualquiera de los compuestos de la invencion, empleados en los metodos de la invencion, puede administrase por via oral, parenteral (IV, IM, deposito IM, SC y deposito SC), sublingual, intranasal (inhalacion), intratecal, topica o 35 rectal. Las formas de dosificacion conocidas por los expertos en la tecnica son adecuadas para la administracion de los compuestos de la invencion empleados en los metodos de la invencion.

Se proporcionan composiciones que contienen "cantidades terapeuticamente eficaces de los compuestos de la invencion empleados en los metodos de la invencion. Los compuestos pueden formularse en preparaciones 40 farmaceuticas adecuadas, tales como comprimidos, capsulas o elixires para su administracion oral, o en soluciones o suspensiones esteriles para su administracion parenteral. Los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse en composiciones farmaceuticas usando tecnicas y procedimientos bien conocidos en la tecnica.

Aproximadamente de 0,1 a 1000 mg de un compuesto de la invencion o mezcla de compuestos de la invencion 45 empleados en los metodos de la invencion, o una sal o ester fisiologicamente aceptable, se formulan en una composicion con un vetnculo, diluyente, excipiente, aglutinante, conservante, estabilizante, saponfero, etc., fisiologicamente aceptables, en una forma de dosificacion unitaria como lo exige la practica farmaceutica aceptada. La cantidad de sustancia activa en esas composiciones o preparaciones es tal que se obtiene una dosis adecuada en el intervalo indicado. Las composiciones pueden formularse en una forma de dosificacion unitaria, conteniendo 50 cada dosificacion de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg del principio activo. La expresion "forma de dosificacion unitaria" se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mairnferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, junto con un excipiente farmaceutico adecuado.

55

Para preparar composiciones, se mezclan uno o mas compuestos de la invencion empleados en los metodos de la invencion con un vetnculo farmaceuticamente aceptable adecuado. Tras la mezcla o adicion del compuesto o compuestos, la mezcla resultante puede ser una solucion, suspension, emulsion o similar. Tambien pueden usarse suspensiones liposomales como vetnculos farmaceuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con

metodos conocidos por los expertos en la tecnica. La forma de la mezcla resultante depende de varios factores, incluyendo el modo deseado de administracion y la solubilidad del compuesto en el portador o vehmulo seleccionado. La concentracion eficaz es suficiente para reducir o mejorar al menos un smtoma de la enfermedad, trastorno o afeccion tratada, y se puede determinar empmcamente.

5

Los diluyentes o vehmulos farmaceuticos, adecuados para la administracion de los compuestos proporcionados en el presente documento, incluyen cualquiera de dichos vehmulos adecuados para el modo particular de administracion. Ademas, los materiales activos tambien se pueden mezclar con otros materiales activos que no dificulten la accion deseada, o con materiales que complementen la accion deseada, o que tengan otra accion. Los 10 compuestos se pueden formular como el principio farmaceuticamente activo en solitario en la composicion, o se pueden combinar con otros principios activos.

Cuando los compuestos muestran una solubilidad insuficiente, se pueden usar metodos para la solubilizacion. Tales metodos son conocidos e incluyen, pero sin limitacion, el uso de codisolventes tales como dimetilsulfoxido (DMSO), 15 el uso de tensioactivos tales como TWEEN, y la disolucion en bicarbonato sodico acuoso. Tambien se pueden usar derivados de los compuestos, tales como sales o profarmacos, en la formulacion de las composiciones farmaceuticas eficaces.

La concentracion del compuesto es eficaz para la administracion de una cantidad en la administracion que reduce o 20 mejora al menos un smtoma del trastorno para el que se administra el compuesto. Tfpicamente, las composiciones se formulan para una administracion de dosis unitaria.

Los compuestos de invencion empleados en los metodos de la invencion pueden prepararse con vehmulos que los protegen frente a una rapida eliminacion del cuerpo, tal como formulaciones de liberacion en el tiempo o 25 recubrimientos. Dichos vetuculos incluyen formulaciones de liberacion controlada, tales como, pero sin limitacion, sistemas de administracion microencapsulados. El compuesto activo puede incluirse en el vehmulo farmaceuticamente aceptable en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapeuticamente util en ausencia de efectos secundarios no deseados en el paciente tratado. La concentracion terapeuticamente eficaz puede determinarse empmcamente ensayando los compuestos en sistemas modelo in vitro e in vivo conocidos para el 30 trastorno tratado.

Los compuestos y composiciones de la invencion pueden incluirse en recipientes de dosis multiple o dosis unitaria. Los compuestos y composiciones cerrados pueden proporcionarse en kits, por ejemplo, incluyendo componentes que pueden montarse para su uso. Por ejemplo, un compuesto de la invencion en forma liofilizada y un diluyente 35 adecuado pueden proporcionarse como componentes separados para su combinacion antes del uso. Un kit puede incluir un compuesto de la invencion y un segundo agente terapeutico para co-administracion. El compuesto de la invencion y el segundo agente terapeutico pueden proporcionarse como componentes separados. Un kit puede incluir una pluralidad de recipientes, conteniendo cada recipiente una o mas dosis unitarias del compuesto de la invencion empleado en el metodo de la invencion. Los recipientes pueden adaptarse para el modo de administracion 40 deseado, incluyendo, pero sin limitacion, comprimidos, capsulas de gel, capsulas de liberacion sostenida, y similares para administracion oral; productos de deposito, jeringas cargadas previamente, ampollas, viales, y similares para administracion parenteral; y parches, almohadillas medicas, cremas, y similares para administracion topica.

La concentracion del compuesto activo de la invencion en la composicion del farmaco dependera de la absorcion, la 45 inactivacion y las velocidades de excrecion del compuesto activo, la programacion de la dosificacion, y la cantidad administrada, asf como otros factores conocidos por los expertos en la tecnica.

El ingrediente activo puede administrarse de una unica vez, o puede dividirse en varias dosis mas pequenas a administrar a intervalos de tiempo. Se entendera que la dosificacion precisa y la duracion del tratamiento va en 50 funcion de la enfermedad que se trata y puede determinarse empmcamente usando protocolos de ensayo conocidos o por extrapolacion de datos de ensayo in vivo o in vitro. Se ha de observar que las concentraciones y los valores de dosificacion tambien pueden variar con la gravedad de la afeccion que se va a aliviar. Se entendera adicionalmente que, para cualquier sujeto particular, los regimenes de dosificacion espedficos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la 55 administracion de las composiciones, y que los intervalos de concentracion expuestos en el presente documento son unicamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance o la practica de las composiciones reivindicadas.

Si se desea una administracion oral, el compuesto puede proporcionarse en una composicion que lo proteja del entorno acido del estomago. Por ejemplo, la composicion se puede formular en un revestimiento enterico que

mantiene su integridad en el estomago y que libera el compuesto activo en el intestino. La composicion tambien se puede formular en combinacion con un antiacido u otros ingredientes.

Las composiciones orales generalmente incluiran un diluyente inerte o un vehfculo comestible, y pueden 5 comprimirse en comprimidos o encerrarse en capsulas de gelatina. Para los fines de la administracion terapeutica oral, el compuesto o compuestos activos se pueden incorporar con excipientes, y se pueden usar en forma de comprimidos, capsulas o trociscos. Se pueden incluir, como parte de la composicion, agentes aglutinantes y materiales coadyuvantes farmaceuticamente compatibles.

10 Los comprimidos, pfldoras, capsulas, trociscos, y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como, pero sin limitacion, goma de tragacanto, goma arabiga, almidon de mafz, o gelatina; un excipiente, tal como celulosa microcristalina, almidon o lactosa; un agente disgregante, tal como, pero sin limitacion, acido algmico y almidon de mafz; un lubricante, tal como, pero sin limitacion, estearato de magnesio; un emoliente, tal como, pero sin limitacion, dioxido de silicio 15 coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; y un agente saponfero, tal como hierbabuena, salicilato de metilo o saponfero de fruta.

Cuando la forma de la unidad de dosificacion es una capsula, puede contener, ademas del material del tipo anterior, un vetnculo lfquido tal como un aceite graso. Ademas, las formas unitarias de dosificacion pueden contener otros 20 materiales diversos, que modifican la forma ffsica de la unidad de dosificacion, por ejemplo revestimientos de azucar y otros agentes entericos. Los compuestos tambien se pueden administrar como un componente de un elixir, suspension, jarabe, oblea, goma de mascar, o similar. Un jarabe puede contener, ademas de los compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante, y ciertos conservantes, tintes y colorantes, y aromas.

25 Los materiales activos tambien se pueden mezclar con otros materiales activos que no disminuyan la accion deseada, o con materiales que complementen la accion deseada. Los compuestos de la invencion pueden usarse, por ejemplo, junto con un agente antitumoral, una hormona, un esteroide o un retinoide. El agente antitumoral, puede ser uno de numerosos agentes quimioterapeuticos, tal como un agente de alquilacion, un antimetabolito, un agente hormonal, un antibiotico, colchicina, un alcaloide de vinca, L-asparaginasa, procarbazina, hidroxiurea, 30 mitotano, nitrosoureas o una imidazol carboxamida. Los agentes adecuados incluyen los agentes que promueven la despolarizacion de tubulina. Los ejemplos incluyen colchicina y alcaloides de vinca, incluyendo vinblastina y vincristina.

Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicacion parenteral, intradermica, subcutanea o topica pueden 35 incluir cualquiera de los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, una solucion salina, aceite fijo, un aceite vegetal de origen natural, tal como aceite de sesamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, y similares, o un vetnculo graso sintetico, tal como oleato de etilo, y similar, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol, u otro disolvente sintetico; agentes antimicrobianos tales como alcohol bendlico y metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico y bisulfito sodico; agentes quelantes tales 40 como acido etilendiaminotetraacetico (EDTA); tampones tales como acetatos, citratos y fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio y dextrosa. Las preparaciones parenterales se pueden contener en ampollas, jeringuillas desechables, o viales de multiples dosis fabricados de vidrio, plastico, u otro material adecuado. Los tampones, conservantes, antioxidantes, y similares, pueden incorporarse segun se requieran.

45 Cuando se administran por via intravenosa, los vehnculos adecuados incluyen, pero sin limitacion, una solucion salina fisiologica, solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes tales como glucosa, polietilenglicol, polipropilenoglicol y mezclas de los mismos. Las suspensiones liposomicas, que incluyen liposomas dirigidos a tejidos, tambien pueden ser adecuadas como vehnculos farmaceuticamente aceptables. Estas se pueden preparar de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica.

50

Los compuestos de la invencion se pueden preparar con vehnculos que los protegen de la eliminacion rapida del organismo, tales como formulaciones o revestimientos que se liberan con el tiempo. Tales vehnculos incluyen formulaciones de liberacion controlada, tales como, pero sin limitacion, implantes y sistemas de administracion microencapsulados, y polfmeros biocompatibles biodegradables tales como colageno, acetato de etilenvinilo, 55 polianhndridos, acido poliglicolico, poliortoesteres, acido polilactico, y similares. Se conocen metodos para la preparacion de dichas formulaciones por los expertos en la tecnica.

Los compuestos empleados en los metodos de la invencion se pueden administrar por via enterica o parenteral. Cuando se administran por via oral, los compuestos empleados en los metodos de la invencion se pueden

administrar en formas de dosificacion habituales para la administracion oral, como se conoce bien por los expertos en la tecnica. Estas formas de dosificacion incluyen las formas de dosificacion unitaria solidas habituales de comprimidos y capsulas, as^ como formas de dosificacion lfquidas tales como soluciones, suspensiones y elixires. Cuando se usan formas de dosificacion solidas, pueden ser del tipo de liberacion sostenida, de manera que los 5 compuestos empleados en los metodos de la invencion unicamente han de administrarse una vez o dos veces al dfa.

Las formas de dosificacion orales se administran al paciente 1, 2, 3 o 4 veces al dfa. Los compuestos de la invencion empleados en los metodos de la invencion pueden administrarse tres o menos veces, o incluso una o dos veces al 10 dfa. Por lo tanto, los compuestos de la invencion empleados en los metodos de la invencion se administran en forma de dosificacion oral. Independientemente de la forma de dosificacion oral que se use, pueden disenarse para proteger los compuestos empleados en los metodos de la invencion del entorno acido del estomago. Se conocen bien por los expertos en la tecnica comprimidos revestidos entericos. Ademas, las capsulas cargadas con pequenas esferas, cada una revestida para proteger la del estomago acido, tambien se conocen bien por los expertos en la 15 tecnica.

Los compuestos de la invencion empleados en los metodos de la invencion tambien pueden administrarse ventajosamente en formulaciones de dispersion de nanocristales. La preparacion de dichas formulaciones se describe, por ejemplo, en la Pat. de Estados Unidos N° 5.145.684. Las dispersiones nanocristalinas de inhibidores 20 de proteasa del VIH y su metodo de uso se describen en la Pat. de Estados Unidos N° 6.045.829, cuyo contenido en su totalidad se incorpora por referencia. Las formulaciones nanocristalinas proporcionan tipicamente mayor biodisponibilidad de compuestos farmaceuticos.

Los compuestos de la invencion pueden usarse para inhibir la proliferacion de celulas neoplasicas en un animal. Los 25 usos comprenden administrar a un animal que tiene al menos una celula neoplasica presente en su cuerpo una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos uno de los compuestos de la invencion, en composiciones como se ha descrito anteriormente. El animal puede ser un mairnfero, incluyendo un mairnfero domesticado. El animal puede ser un ser humano.

30 La expresion "celula neoplasica" se usa para representar una celula que muestra un crecimiento celular aberrante. El crecimiento celular aberrante de una celula neoplasica incluye un aumento del crecimiento celular. Una celula neoplasica puede ser, por ejemplo, una celula hiperplasica, una celula que muestra una falta de inhibicion de contacto de crecimiento in vitro, una celula de tumor benigno que es incapaz de metastatizar in vivo, o una celula cancerosa que es capaz de metastatizar in vivo y que puede reaparecer despues de un intento de eliminacion. El 35 termino "tumorigenesis" se usa para representar la induccion de la proliferacion celular que conduce al desarrollo de un crecimiento neoplasico.

Las expresiones "cantidad terapeuticamente eficaz" y "periodo de tiempo terapeuticamente eficaz" se usan para representar tratamientos a dosificaciones y durante periodos de tiempo eficaces para reducir el crecimiento de 40 celulas neoplasicas. Como se ha indicado anteriormente, dicha administracion puede ser parenteral, oral, sublingual, transdermica, topica, intranasal o intrarrectal. Cuando se administra por via sistemica, la composicion terapeutica puede administrarse a una dosificacion suficiente para conseguir un nivel en sangre de los compuestos de la invencion de aproximadamente 0,1 |iM a aproximadamente 100 mM. Para la administracion localizada, pueden ser eficaces concentraciones mucho menores de esta, y pueden tolerarse concentraciones mucho mayores. Un experto 45 en la tecnica apreciara que dicho efecto terapeutico que da como resultado una concentracion eficaz inferior del inhibidor de histona deacetilasa puede variar considerablemente dependiendo del tejido, organo o el animal o paciente particular que se va a tratar de acuerdo con la invencion. Tambien se entiende que, aunque un paciente puede comenzar a una dosis, esa dosis puede variarse con el tiempo segun los cambios de la afeccion del paciente.

50 La presente invencion proporciona composiciones y metodos para tratar una enfermedad o afeccion proliferativa celular en un animal, que comprende administrar a un animal que necesita dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de histona deacetilasa de la invencion. Como se indica, el animal puede ser un mairnfero, incluyendo un mairnfero domesticado. El animal puede ser un ser humano.

55 La expresion "enfermedad o afeccion proliferativa celular" pretende referirse a cualquier afeccion caracterizada por un crecimiento celular aberrante, preferiblemente una proliferacion celular anormalmente aumentada. Los ejemplos de dichas enfermedades o afecciones proliferativas celulares incluyen, pero sin limitacion, cancer, reestenosis y psoriasis. En algunas realizaciones, la invencion proporciona un metodo para inhibir la proliferacion celular neoplasica en un animal que comprende administrar a un animal que tiene al menos una celula neoplasica presente

en su cuerpo una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de histona deacetilasa de la invencion. Los canceres que pueden tratarse de acuerdo con la invencion incluyen, pero sin limitacion, cancer de prostata, cancer de pulmon, leucemia aguda, mieloma multiple, carcinoma de vejiga, carcinoma renal, carcinoma de mama, carcinoma colorrectal, neuroblastoma o melanoma.

5

Se contempla que algunos compuestos de la invencion tienen actividad inhibidora frente a una histona deacetilasa de una fuente protozoaria. Por lo tanto, la invencion tambien proporciona un metodo para tratar o prevenir una enfermedad o infeccion protozoaria, que comprende administrar a un animal que necesita dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de histona deacetilasa de la invencion. De nuevo, el animal puede 10 ser un mairnfero, y puede ser un ser humano. En algunas realizaciones, el inhibidor de histona deacetilasa inhibe una histona deacetilasa protozoaria en mayor medida que inhibe las histona deacetilasas mamfferas, particularmente histona deacetilasas humanas.

La presente invencion tambien proporciona un metodo para tratar una enfermedad o infeccion fungica que 15 comprende administrar a un animal que necesita dicho tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de histona deacetilasa de la invencion. El animal puede ser un mamffero, incluyendo un ser humano. El inhibidor de histona deacetilasa usado de acuerdo con esta realizacion de la invencion puede inhibir la histona deacetilasa fungica en mayor medida que inhibe las histona deacetilasas mamfferas, particularmente las histona deacetilasas humanas.

20

Sera evidente para un experto en la tecnica que la dosis exacta y la frecuencia de administracion dependeran de los compuestos particulares empleados en los metodos de la invencion administrados, de la afeccion particular tratada, de la gravedad de la afeccion que se esta tratando, de la edad, del peso, del estado ffsico general del paciente particular, y de otra medicacion que este tomando la persona, como se sabe bien por los medicos que los 25 administran, expertos en esta tecnica.

Ejemplos

Experimental

30

Los reactivos qmmicos y los disolventes organicos se adquirieron en Aldrich a menos que se indique otra cosa. Los espectros de resonancia magnetica nuclear (1H RMN) se midieron en un Bruker 250 MHz. Los desplazamientos qmmicos (8) se indican en partes por millon (ppm) con respecto al pico TMS. Los analisis por espectrometna de masas de ionizacion por electronebulizacion (ESI) se realizaron con un espectrometro de masas de transformada de 35 Fourier 3-Tesla Finnigan FTMS-2000. Los analisis elementales estuvieron dentro de + 0,4% de los valores calculados.

La cromatograffa en columna ultrarrapida se realizo con gel de sflice (malla 230-400). Los esteres medicos de o- aminoacidos se prepararon a partir de acidos disponibles en el mercado usando metanol/TMSCI, y se sintetizo ester 40 bendlico del acido (2-amino-fenil)carbamico a partir de o-fenilendiamina y formiato de cloruro de bencilo de acuerdo con procedimientos convencionales. Los anticuerpos policlonales de anti-acetil-Histona H3 y H4 de conejo se adquirieron en Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY), los anticuerpos anti-p21 de conejo eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). La anti-actina monoclonal de raton era de ICN Biomedicals (Irvine, CA). La IgG anti- conejo de cabra conjugada con HRP y la IgG anti-raton de cabra conjugada con HRP eran de Jackson 45 ImmunoResearch (West Grove, PA).

Los compuestos 1 - 8 y 11 -22 se sintetizaron de acuerdo con los metodos a - e descritos como se indica a continuacion (Esquema 1A, figura 6), y los compuestos 9 y 10 se prepararon a partir de acido 3-[4-(2-propil- pentanoilamino)-fenil]-acnlico mediante los metodos f y g, respectivamente (Esquema 1B, figura 6), que se describen 50 por separado en los compuestos del tttulo.

Metodo a [Acoplamiento de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida (EDC)]. A una solucion de acidos grasos de cadena corta individual en THF seco (5-l0 mmol/ml) en una atmosfera de N2 se le anadieron diversos esteres medicos de o-aminoacidos (1 equiv.) seguido de EDC (1,3 equiv.). Despues de agitar durante una 55 noche, el THF se retiro a presion reducida, y el residuo se disolvio en acetato de etilo (100 ml). La mezcla se lavo consecutivamente dos veces con agua (50 ml) y salmuera saturada (50 ml). La capa organica se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vado. El residuo resultante se purifico por cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice.

Metodo b (Escision de ester). El ester resultante del Metodo a se disolvio en una solucion 2 M de KOH/MeOH. La

mezcla se agito a 80 °C durante 1 h, se enfrio a 0 °C, se acidifico con HCl 2 N a pH 3, se concentro al vado y se anadieron acetato de etilo (100 ml) y H2O (50 ml). La fase organica se separo, se lavo consecutivamente con agua y salmuera saturada, 50 ml cada vez, se seco Na2SO4 y se concentro al vado. El residuo resultante se purifico por cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice.

5

Metodo c [Acoplamiento de cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfordiaiTHdico (BOP-CI)]. A una solucion del acido resultante del Metodo b en THF seco (5-10 mmol/ml) se le anadio trietilamina (TEA, 1 equiv.) en una atmosfera de N2. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min, y se anadieron BOP-CI (1,1 equiv.), clorhidrato de O- bencilhidroxilamina (1 equiv.) y TEA (3 equiv.). Despues de agitar a temperatura ambiente durante una noche, la 10 solucion se concentro al vado y se anadio acetato de etilo (100 ml) seguido de NaHCO3 al 3 % (50 ml). La fase organica se separo, se lavo consecutivamente con agua y salmuera saturada, 50 ml cada vez, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vado. El residuo resultante se purifico por cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice.

Metodo d (Acoplamiento de EDC). A una solucion de acidos individuales resultantes del Metodo b en THF seco (5 - 15 10 mmol/ml) en una atmosfera de N2 se le anadio ester bendlico del acido (2-aminofenil)carbamico (1 equiv.) seguido de EDC (1,3 equiv.). Despues de agitar durante una noche, la mezcla se concentro al vado, y se anadio acetato de etilo (100 ml). La fase organica se lavo dos veces consecutivamente con agua (50 ml) seguido de salmuera saturada (50 ml), se seco sobre Na2SO4 y se concentro. El residuo resultante se purifico por cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice.

20

Metodo e (Hidrogenolisis). El derivado N-benciloxi o N-Cbz, resultante del Metodo c o d, se disolvio en 1:1 de metanol/THF (5-10 mmol/ml), y se anadio paladio al 10 % sobre carbon (10 % p/p). La mezcla se trato con hidrogeno a presion atmosferica durante 2 h y se filtro. El disolvente se evaporo y el residuo se recristalizo con acetato de etilo.

25 N-(2-Amino-fenil)-4-[(2-propil-pentanoilamino)-metil]-benzamida (1). 1H RMN (DMSO-cfe) 8 9,63 (s, 1 H), 8,45 (t, J = 6,1 Hz, 1 H), 7,94 (d, J = 7,8 Hz, 2 H), 7,36 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 7,16 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 6,98 (t, J = 7,5 Hz, 1 H), 6,78 (d, J = 7,7 Hz, 1 H), 6,60 (t, J = 7,6 Hz, 1 H), 4,90 (s, 2 H), 4,35 (d, J = 5,9 Hz, 2 H), 2,24 (m, 1 H), 1,6-1,1 (m, 8 H), 0,87 (t, 6 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 390,215195 amu; masa observada de (M+Na)+, 390,21793 amu; anal. (C22H29N3O2) C, H, N.

30

W-Hidroxi-4-[(2-propil-pentanoilammo)-metil]-benzamida (2). 1H RMN (DMSO-cfe) 8 11,17 (s, 1 H), 9,00 (s, 1 H), 8,40 (t, J = 5,9 Hz, 1 H), 7,70 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 7,30 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 4,31 (d, J = 5,7 Hz, 2 H), 2,24 (m, 1 H), 1,6-1,1 (m, 8 H), 0,85 (t, 6 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 315,167911 amu; masa observada de (M+Na)+ 315,16755 amu; anal. (C16H24N2O3) C, H, N.

35

W-(2-Ammo-feml)-4-(2-propil-pentanoilamino)-benzamida (3). 1H RMN (DMSO-cfe) 8 10,13 (s, 1 H), 9,57 (s, 1 H), 7,95 (d, J = 8,7 Hz, 2 H), 7,74 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 7,16 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 6,98 (t, J = 7,6 Hz, 1 H), 6,78 (d, J =

8,0 Hz, 1 H), 6,60 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 4,89 (s, 2 H), 2,44 (m, 1 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,89 (t, 6 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 376,199545 amu; masa observada de (M+Na)+, 376,19762 amu; anal. (C21H27N3O2) C, H, N.

40

W-Hidroxi-4-(2-propil-pentanoilamino)-benzamida (4). 1H RMN (DMSO-cfe) 8 11,07 (s, 1 H), 10,13 (s, 1 H), 8,94 (s, 1 H), 7,65 (m, 4 H), 2,42 (m, 1 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,8 (t, 6 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 301,152261 amu; masa observada de (M+Na)+, 301,15194 amu; anal. (C15H22N2O3) C, H, N.

45 {4-[(2-Amino-fenilcarbamoil)-metil]-fenil}-amida del acido 2-propil-pentanoico (5). 1H RMN (DMSO-cfe) 8 9,84 (s, 1 H), 9,33 (s, 1 H), 7,56 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,26 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,14 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 6,90 (t, J = 7,8 Hz, 1 H), 6,72 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 6,53 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 4,83 (s, 2 H), 2,41 (m, 1 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,89 (t, 6 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+ 390,215195 amu; masa observada de (M+Na)+, 390,21523 amu; anal.

(C22H29N3O2) C, H, N.

50

(4-Hidroxifenilcarbamoilmetil-fenil)-amida del acido 2-propil-pentanoico (6). 1H RMN (DMSO-cfe) 8 10,61 (s, 1 H), 9,82 (s, 1 H), 8,81 (s, 1 H), 7,52 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,16 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 3,22 (s, 2 H), 2,38 (m, 1 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,89 (t, 6 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 315,167911 amu; masa observada de (M+Na)+, 315,16751 amu; anal. (C16H24N2O3) C, H, N.

55

{4-[2-{2-Amino-fenilcarbamoil)-etil]-fenil}-amida del acido 2-propil-pentanoico (7). 1H RMN (DMSO-d6) 8 9,80 (s, 1 H), 9,15 (s, 1 H), 7,53 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,17 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,11 (d, J = 7,8 Hz, 1H),6,89 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,70 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 6,53 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 4,80 (s, 2 H), 2,86 (t, J = 7,9 Hz, 2H), 2,59 (t, J = 8,1 Hz, 2 H), 2,38 (m, 1 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,87 (t, 6 H); HRmS: masa exacta de (M+Na)+, 404,230845 amu; masa observada de

(M+Na)+ 404,23043 amu; anal. (C23H31N3O2) C, H, N.

[4-(2-Hidroxifenilcarbamoil)-etil)-fenil]-amida del acido 2-propil-pentanoico (8). 1H RMN (DMSO-d6) 8 10,38 (s, 1 H), 9,78 (s, 1 H), 8,70 (s, 1H), 7,50 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,10 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 2,75 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 2,40 (m, 5 H), 2,22 (t, J = 7,4 Hz, 2 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,87 (t, 6 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 329,183561 amu; masa observada de (M+Na)+ 329,18295 amu; anal. (C17H26N2O3) C, H, N.

Acido 3-[4-(2-propil-pentanoil)-feml]-acrilico. Este compuesto, un precursor a los compuestos 9 y 10, se sintetizo a partir de acido 2-propil-pentanoico (0,78 ml, 4,9 mmol) y ester mefflico del acido 3-(4-amino-fenil)-acfflico (0,86 g, 10 4,9 mmol) de acuerdo con los Metodos a y b que se han mencionado anteriormente. Rendimiento total, 1,05 g (70 % en 2 etapas); 1H RMN (CDCla, DMSO-d6 al 10 %) 8 9,49 (s, 1 H), 7,71 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,55 (d, J = 15,9 Hz, 1 H), 7,45 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 6,31 (d, J = 15,9 Hz, 1 H), 2,40 (m, 1 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,87 (t, 6 H).

W-(2-Ammo-feml)-3-[4-(2-propil-pentanoilammo)-feml]-acrilamida (9). A una solucion de acido 3-[4-(2-propil- 15 pentanoil)-fenil]-acfflico (200 mg, 0,7 mmol) en THF seco se le anadio benceno-1,2-diamina (450 mg, 4,2 mmol) en una atmosfera de N2 seguido de EDC (180 mg, 0,9 mmol). Despues de agitar durante una noche, la mezcla se concentro al vado, se anadio acetato de etilo (50 ml) y se lavo dos veces consecutivamente con agua (30 ml) y salmuera saturada (30 ml). La capa organica se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vado. El producto en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida (acetato de etilo-hexano, 1:1), dando el compuesto 9 (200 mg, rendimiento del 20 76 %) en forma de un solido de color blanco. 1H RMN (DMSO-cfe) 8 10,07 (s, 1 H), 9,35 (s, 1 H), 7,71 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 7,56 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,51 (d, J = 15,7 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 6,6 Hz, 1 H), 6,92 (t, J = 7,1 Hz, 1 H), 6,80 (d, J = 15,5 Hz, 1 H), 6,75 (d, J = 6,6 Hz, 1 H), 6,58 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 4,96 (s, 2 H), 2,44 (m, 1 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,87 (t, 6 H); HRmS: masa exacta de (M+Na)+, 402,215195 amu; masa observada de (M+Na)+, 402,21448 amu; anal. (C23H29N3O2) C, H, N.

25

W-Hidroxi-3-[4-(2-propil-pentanoilammo)-feml]-acrilamida (10). A una solucion de acido 3-[4-(2-propil- pentanoilamino)-fenil]-acfflico (100 mg, 0,35 mmol) en DMF seca (3 ml) se le anadieron EDC (79 mg, 0,53 mmol) y hidroxibenzotriazol hidrato (HOBT) (62 mg, 0,46 mmol) en una atmosfera de nitrogeno. La mezcla se agito durante 1 h, se anadieron clorhidrato de hidroxilamina (27,4 mg, 0,39 mmol) y TEA (54 |il), se agito durante 12 h mas, se 30 concentro al vado y se anadieron acetato de etilo (40 ml) y una solucion saturada de NaHCO3 (15 ml). La fase organica se separo y se lavo consecutivamente con agua y salmuera saturada. 20 ml cada vez. La capa organica se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vado. El producto en bruto se purifico por cromatograffa ultrarrapida [acetato de etilo-MeOH (9:1)], produciendo el compuesto 10 (45 mg, rendimiento del 40 %) en forma de un solido de color blanco. 1H RMN (DMSO-d6) 8 10,69 (s, 1 H), 10,07 (s, 1 H), 9,00 (s, 1 H), 7,67 (d, J = 7,9 Hz, 2 H), 7,53 (d, J = 35 8,4 Hz, 2 H), 7,39 (d, J = 15,6 Hz, 1 H), 6,39 (d, J = 15,3 Hz, 1 H), 2,40 (m, 1 H), 1,7-1,1 (m, 8 H), 0,87 (t, 6 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 327,167911 amu; masa observada de (M+Na)+, 327,16809 amu; anal.

(C17H24N2O3)C, H, N.

W-(2-Amino-fenil)-4-(butirilamino-metil)-benzamida (11). 1H RMN (DMSO-d6) 8 9,63 (s, 1 H), 8,41 (t, J = 5,7 Hz, 1

40 H), 7,94 (d, J = 8,1, Hz, 2 H), 7,36 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,17 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 6,98 (t, J = 7,6 Hz, 1 H), 6,78 (d, J =

8.1 Hz, 1 H), 6,60 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 4,90 (s, 2 H), 4,35 (d, J = 5,8 Hz, 2 H), 2,15 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 1,60 (m, 2 H), 0,88 (t, J = 7,3 Hz, 3 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 334,152595 amu; masa observada de (M+Na)+, 334,15221 amu; anal. (C18H21N3O2) C, H, N.

45 W-(2-Amino-fenil)-4-(fenilacetilamino-metil)-benzamida (12). 1H RMN (DMSO-d6) 8 9,60 (s, 1 H), 8,66 (t, J =

6.1 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,2 Hz, 2 H), 7,31 (m, 7 H), 7,16 (d, J = 7,0 Hz, 1 H), 6,98 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 6,78 (d, J =

6.6 Hz, 1 H), 6,60 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 4,90 (s, 2 H), 4,35 (d, J = 5,7 Hz, 2 H), 3,51 (s, 2 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 382,152595 amu; masa observada de (M+Na)+, 382,15228 amu; anal. (C22H21N3O2) C, H, N.

50 W-(2-Amino-fenil)-4-[(4-fenilbutirilamino)-metil]-benzamida (13). 1H RMN (DMSO-cfe) 8 9,63 (s, 1 H), 8,43 (t, J =

6.1 Hz, 1 H), 7,94 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 7,34 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 7,21 (m, 6 H), 6,98 (t, J = 7,2 Hz, 1 H), 6,78 (d, J = 8,11 Hz, 2 H), 6,61 (t, J = 6,5 Hz, 1 H), 4,90 (s, 2 H), 4,34 (d, J = 6,1 Hz, 2 H), 2,59 (t, J = 7,6 Hz, 2 H), 2,20 (t, J =

7.7 Hz, 2 H), 1,84 (m, 2 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 410:183895 amu; masa observada de (M+Na)+, 410,18232 amu; anal. (C24H25N3O2) C, H, N.

55

4-(Butirilammo-metil)-W-hidroxi-benzamida (14). 1H RMN (DMSO-de) 8 11,15 (s, 1 H), 9,01 (s, 1 H), 8,36 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 7,7 (d, J = 8,1 Hz, 2 H), 7,32 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 4,30 (d, J = 5,7 Hz, 2 H), 2,15 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 1,60 (m, 2 H), 0,88 (t, J = 7,3 Hz, 3 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 259,10569 amu; masa observada de (M+Na)+,

259,10569 amu; anal. (C12H16N2O3) C, H, N.

W-Hidroxi-4-(fenilacetilamino-metil)-benzamida (15). 1H RMN (DMSO-da) 8 11,2 (s, 1 H), 8,9 (s, 1 H), 8,6 (t, J =

5,8 Hz, 1 H), 7,9 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 7,28 (m, 7 H), 4,04 (d, J = 5,7 Hz, 2 H), 3,5 (s, 2 H); HRMS: masa exacta de 5 (M+Na)+, 307,105311 amu; masa observada de (M+Na)+, 307,10512 amu; anal. (C16H16N2O3) C, H, N.

W-Hidroxi-4-[(4-fenilbutirilamino)-metil]-benzamida (16). 1H RMN (DMSO-de) 8 11,2 (s, 1 H), 9,0 (s, 1 H), 8,4 (t, J

= 5,8 Hz, 1 H), 7,7 (d, J = 8,0 Hz, 2 H), 7,21 (m, 7 H), 4,3 (d, J = 5,8 Hz, 2 H), 2,58 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 2,18 (t, J =

7.3 Hz, 2 H), 1,83 (m, 2 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 335,136611 amu; masa observada de (M+Na)+, 10 335,13716 amu; anal. (C18H20N2O3) C, H, N.

4-Butirilamino-W-hidroxi-benzamida (17). 1H RMN (DMSO-d6) 8 11,08 (s, 1 H), 10,09 (s, 1 H), 8,94 (s, 1 H), 7,67 (m, 4 H), 2,31 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 1,61 (m, 2 H), 0,92 (t, J = 7,4 Hz, 3 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+ 245,089661 amu, Masa observada de (M+Na)+ 245,08971 amu, Diferencia <1,0 ppm. Anal. (C11H14N2O3) C, H, N.

15

W-Hidroxi-4-fenilacetilamino-benzamida (18). 1H RMN (DMSO-d6) 8 11,1 (s, 1 H), 10,40 (s, 1 H), 8,94 (s, 1 H), 7,67 (m, 4 H), 7,33 (m, 5 H), 3,67 (s, 2 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 293,089661 amu; masa observada de (M+Na)+, 293,08957 amu; anal. (C15H14N2O3) C, H, N.

20 W-Hidroxi-4-(4-fenilbutirilamino)-benzamida (19). 1H RMN (DMSO-d6) 8 11,02 (s, 1 H), 10,1 (s, 1 H), 8,94 (s, 1 H), 7,67 (m, 4 H), 7,27 (m, 5 H), 2,63 (t, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,35 (t, J = 7,4 Hz, 2 H), 1,87 (m, 2 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 321,120961 amu; masa observada de (M+Na)+, 321,11940 amu; anal. (C17H18N2O3) C, H, N.

W-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-butiramida (20). 1H RMN (DMSO-d6) 8 10,4 (s, 1 H), 9,8 (s, 1 H), 8,70 (s, 1 H), 25 7,50 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 7,10 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 2,75 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 2,24 (m, 4 H), 1,61 (m, 2 H), 0,92 (t, J =

7.4 Hz, 3H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 273,120961 amu; masa observada de (M+Na)+, 273,12080 amu; anal. (C13H18N2O3) C, H, N.

W-Hidroxi-3-(4-fenilacetilamino-fenil)-propionamida (21). 1H RMN (DMSO-d6) 8 10,36 (s, 1 H), 10,14 (s, 1 H), 8,70 30 (s, 1 H), 7,50 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 7,2-7,4 (m, 5 H), 7,10 (d, J = 8,3 Hz, 2 H), 3,62 (s, 2 H), 2,75 (t, J = 7,5 Hz, 2 H),

2,22 (t, J = 7,6 Hz, 2 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+ 321,120961 amu; masa observada de (M+Na)+,

321,12040 amu; anal. (C17H18N2O3) C, H, N.

W-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-feml]-4-feml-butiramida (22). 1H RMN (DMSO-d6) 8 10,36 (s, 1 H), 9,80 (s, 1 H), 35 8,70 (s, 1 H), 7,52 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,2-7,4 (m, 5 H), 7,10 (d, J = 8,4 Hz, 2 H), 2,75 (t, J = 7,4 Hz, 2 H), 2,62 (t, J =

7,5 Hz, 2 H), 2,15-2,4 (m, 4 H), 1,8-2,0 (m, 2 H); HRMS: masa exacta de (M+Na)+, 349,152261 amu; masa

observada de (M+Na)+, 349,15223 amu; anal. (C19H22N2O3) C, H, N.

Se muestra una lista de todos los compuestos, incluyendo los compuestos adicionales 23 - 67, en la figura 6.

40

Ensayo HDAC in vitro. La actividad de HDAC se analizo usando un kit de ensayo de histona deacetilasa (Upstate Biotechnology Lake Placid, NY) siguiendo las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones. Este ensayo se

bas0 en la capacidad del extracto nuclear DU-145, que es rico en la actividad de histona deacetilasa, para mediar la desacetilacion del peptido [ H]-acetil histona H4 biotinilado que se unio a perlas de estreptavidina agarosa. La 45 liberacion de [3H]-acetato en el sobrenadante se midio para calcular la actividad de HDAC. Se uso butirato sodico (0,25-1 mM) como control positivo.

Ensayo de viabilidad celular. El efecto de HTPB sobre la viabilidad celular se evaluo por el ensayo MTT {[bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio]} en placas de fondo plano de 96 pocillos, en las que se 50 sembraron 4.000 celulas DU-145/pocillo. Las celulas se expusieron a HTpB a las concentraciones indicadas en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10 % a 37 °C en CO2 al 5 % durante el tiempo indicado. El medio se retiro y se reemplazo por 150 |il de 0,5 mg/ml de MTT en medio RPMI-1640, y las celulas se incubaron en la incubadora de CO2 a 37 °C durante 2 horas. Los sobrenadantes se retiraron de los pocillos, y el tinte MTT reducido se solubilizo con 200 ^l/pocillo de DMSO. La absorbancia se determino en un lector de placas a 570 nm. Cada 55 tratamiento se repitio en seis pocillos.

Deteccion de la Apoptosis mediante Ensayo Inmunoabsorbente Unido a Enzimas (ELISA). La induccion de la apoptosis se evaluo usando un ELISA de muerte celular (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) siguiendo las

instrucciones del fabricante. Esta prueba se basa en la determinacion cuantitativa de los fragmentos de ADN asociados a histona citoplasmicos en forma de mononucleosomas y oligonucleosomas despues de la muerte apoptotica inducida. En resumen, se cultivaron 1 x 106 celulas DU-145 en un matraz T-75 24 h antes del experimento. Las celulas se trataron con HTPB a las concentraciones indicadas en medio RPMI 1640 5 complementado con FBS al 10 %. Tanto las celulas flotantes como adherentes se recogieron, y se usaron lisados celulares equivalentes a 2 x 103 celulas en el ELISA.

Analisis por transferencia de Western. Se recogieron las celulas DU-145 (1 x 106) tratadas con HTPB a las concentraciones indicadas en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % durante 24 h y se sonicaron. Las 10 concentraciones de protemas de los lisados se determinaron usando un kit de ensayo de protemas de Bradford (BioRad, Hercules, CA); se resolvieron cantidades equivalentes de protemas de cada lisado en SDS al 10%-gel de poliacrilamida, y despues se transfirieron sobre membranas de Immobilon-nitrocelulosa (Millipore, Bellerica, MA) en una celula de transferencia semi-seca. La membrana transferida se lavo dos veces con solucion salina tamponada con Tris (TBS) que contema Tween 20 al 0,1 % (TBST). Despues del bloqueo con TBST que contema leche 15 desnatada al 5% durante 40 min, la membrana se incubo con el anticuerpo primario (dilucion 1:1000) en TBST- leche desnatada al 1 % a 4 °C durante una noche. Despues del tratamiento con el anticuerpo primario, la membrana se lavo tres veces con TBST durante un total de 15 min seguido de conjugados de IgG anti-conejo o anti-raton de cabra-peroxidasa de rabano rusticano (diluidos 1:3000) durante 1 h a temperatura ambiente y se lavo tres veces con TBST durante un total de 1 h. Las inmunotransferencias se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada.

20

Resultados

Para la primera serie de compuestos, se empleo acido valproico como principal para sintetizar conjugados unidos a Zn2+ (figura 1) de acuerdo con los procedimientos representados en el Esquema 1 (A, compuestos 1 - 8; B, 25 compuestos 9 y 10). Para los compuestos 1 - 8, se acoplo acido valproico con cuatro separadores diferentes de ester metilico de o-aminoacido a traves de activacion por EDC. Los esteres resultantes se escindieron en acidos a traves de hidrolisis alcalina. En condiciones de acoplamiento peptfdico tfpicas (BOPCI o EDC), los acidos resultantes se trataron con hidroxilamina Bn-protegida y o-fenilendiamina Cbz-protegida para formar, despues de la hidrogenolisis, las anilidas y acidos hidroxamicos respectivos (Esquema 1A). Los compuestos 9 y 10 se sintetizaron 30 mediante acoplamiento directo de acido 3-[4-(2-propil-pentanoil)-fenil]-acnlico con o-fenilendiamina e hidroxilamina, respectivamente, en condicion de acoplamiento EdC tfpica (Esquema 1B).

Derivados de valproato unidos a motivos quelantes de Zn2+. La conjugacion diveraente de acido valproico con cinco enlazadores aromaticos diferentes y posteriormente dos motivos de union de Zn2+ produjo los compuestos 1 - 35 10. Estos conjugados unidos mostraron un grado variable de potencia inhibidora de HDAC (figura 2), con valores de CI 50 que variaban de 5 |iM (compuesto 8) a 80 |iM (compuesto 5). Esta potencia era una mejora de ocho a cinco veces sobre la de la molecula precursora (CI50, 0,4 mM). La eliminacion del resto valproflo o el motivo quelante de Zn2+ de cualquiera de estos conjugados suprimio completamente la actividad inhibidora de HDAC (datos no mostrados), indicando la importancia de la funcion acilo y el motivo quelante de Zn2+ en las interacciones protema- 40 ligando.

Entre los diez conjugados unidos examinados, los compuestos 1, 2, 4 y 8 representaron los derivados optimos (CI50, 5-8 |iM) seguidos de los 3, 9 y 10 (CI50, 10 - 20 |iM). Relativamente, los hidroxamatos (compuestos 2, 4, 6, 8 y 10) eran generalmente mas potentes que sus equivalentes de fenilendiamina (compuestos 1, 3, 5, 7 y 9). Ademas, el 45 enlazador aromatico mostro un efecto sutil sobre la actividad inhibidora de HDAC. Entre los cinco o-aminoacidos aromaticos examinados, (4-aminofenil)acetato dio lugar a conjugados con la menor potencia inhibidora de HDAC (5 y 6), mientras que 4-(aminometil)benzoato parecfa ser optimo. Para las modificaciones estructurales adicionales, se usaron los compuestos 1, 2, 4 y 8 como principales, dado que todos ellos mostraron una CI50 <10 |iM.

50 Modificacion estructural. El hallazgo de que la eliminacion del grupo valproflo anulo completamente la actividad inhibidora del conjugado subrayo la importancia del resto acilo en la interaccion con el bolsillo de sitio activo. Por lo tanto, se sustituyo el grupo valproflo en los compuestos 1, 2, 4 y 8 por un butirilo, fenilacetilo o fenilbutirilo para mejorar el efecto estereoelectronico sobre la inhibicion de HDAC (figura 3). Todos estos derivados mostraron una potencia mejorada en la inhibicion de HDAC en comparacion con los equivalentes de valproflo. Entre las diversas 55 funciones acilo examinadas, la potencia relativa estuvo en el orden de fenilbutirilo > fenilacetilo > butirilo > valproflo al conjugarse con el mismo separador y el motivo quelante de Zn2+.

De estos doce derivados, el compuesto 19 fue especialmente notable. Este butirato de fenilo unido a hidroxamato (HTPB), es decir, el compuesto 19, mostro una CI50 de 44 nM, una mejora de cuarto orden de magnitud sobre

butirato de fenilo. Este compuesto se uso para examinar su efecto sobre la actividad de HDAC en celulas de cancer de prostata DU-145.

Efecto de HTPB sobre la acetilacion de histona y expresion de p2iWAF/CIP1 en celulas de cancer de prostata 5 DU-145. La hiperacetilacion de histona y el aumento de expresion del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina p21WAF/CIP1 representan dos caractensticas distintivas en relacion con la inhibicion de HDAC intracelular (Marks y col., Nat Rev Cancer 1: 194-202 (2001)). En consecuencia, se examino el efecto de HTPB frente a TSA y butirato de fenilo sobre la actividad de HDAC en celulas de cancer de prostata DU-145 mediante la caracterizacion del estado de la acetilacion de histona y la expresion de p21WAF/CIP1.

10

Las celulas DU-145 se expusieron a HTPB a 0,5, 1, 2,5 |uM, TSA a 0,25 y 0,5 |uM, o butirato de fenilo a 1, 2,5 y 5 mM en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % durante 24 h. El analisis por transferencia de Western de los lisados celulares indica que el tratamiento de estos agentes dio lugar a elevados niveles de las histonas acetiladas H3 y H4, y p21WAF/CIP1 (figura 4). El efecto de HTPB 1 |uM sobre estos biomarcadores se aproximo al de TSA 15 0,25 uM, o butirato de fenilo 2,5 mM. Las celulas DU-145 mostraron pequenas pero significativas cantidades de p21WAF/CIP1 intrmseco, y el nivel aumento sustancialmente despues de una exposicion a HTPB tan baja como de 0,5 |uM. En conjunto, estos datos confirmaron que HTPB se dirigio a la actividad de HDAC en las celulas DU-145.

Efecto de HTPB sobre la viabilidad de celulas DU-145. El efecto de HTPB sobre la viabilidad de las celulas 20 cancerosas se evaluo en celulas DU-145 en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10%. Estas celulas mostraron un alto grado de sensibilidad a HTPB, con una CI50 en la inhibicion del crecimiento de aproximadamente entre 0,5 y 1 |uM (figura 5A). Como se puso de manifiesto por la fragmentacion del ADN, HTPB sensibilizo las celulas DU-145 para la apoptosis de una manera dependiente de la dosis (figura 5B). Como se muestra, se produjo una extensa apoptosis en 24 h cuando la concentracion del farmaco excedio de 1 |uM, indicando que este efecto 25 citotoxico podfa atribuirse, al menos en parte, a la induccion de la apoptosis por la inhibicion de HDAC. Otras lmeas celulares examinadas inclman celulas de cancer endometrial AN3CA, y celulas de cancer colorrectal SW-48 y HCT- 15. Estas celulas cancerosas tambien fueron susceptibles al efecto citotoxico de HTPB con una potencia similar (datos no mostrados).

30 Analisis

En el presente documento, se presenta el desarrollo de una nueva clase de inhibidores de HDAC, en la que los acidos grasos de cadena corta se unieron a un resto quelante de Zn2+ a traves de un enlace hidrofobo. La estrategia en el desarrollo de estos compuestos se construyo sobre un modelo de trabajo proporcionado por el unico modo de 35 inhibicion de HDAC por TSA y SAHA (Finnin y col., Nature 401: 188-193 (1999)). Esta estrategia de union novedosa condujo al descubrimiento de HTPB (o el compuesto 19), que muestra actividades de inhibicion de HDAC y antiproliferativa en concentraciones sub-|uM acordes con las indicadas para SAHA (Richon y col., Proc Natl Acad Sci U S A 95: 3003-3007 (1998)).

40 Se obtuvieron dos lmeas de evidencia de que HTPB se dirigio a la actividad de HDAC en varias lmeas celulares de cancer. Espedficamente, el tratamiento de celulas de cancer de prostata DU-145 con HTPB tan bajo como de 0,5 |uM causo la hiperacetilacion de las histonas H-3 y H-4 de manera dependiente de la dosis. De forma analoga, la expresion de p21WAF/CIP1 se regulo en aumento sustancialmente en respuesta a HTPB. Por el contrario, la molecula precursora butirato de fenilo requirio al menos 2 5 mM para conseguir los mismos efectos intracelulares sobre la 45 acetilacion de histona y la expresion de p21WAF/CIP .

HTPB difiere estructuralmente de los inhibidores de HDAC existentes, en muchos de los cuales los grupos protectores consisten en estructuras planas y polares. Por ejemplo, los grupos protectores de TSA, SAHA y MS-275 contienen grupos dimetilaminofenilo, fenilamino y piridin-3-il-metoxicarbonilo, respectivamente. Por lo tanto, se ha 50 concluido adicionalmente que el bolsillo de sitio activo muestra un alto grado de flexibilidad en el alojamiento de los grupos protectores con diferentes propiedades estereoelectronicas. Los datos indican que fenilbutirilo y fenilacetilo eran mas eficaces que los restos acilo alifaticos al facilitar la union de los conjugados al bolsillo de sitio activo. Esta discrepancia podna deberse, en parte, a diferencias en la densidad de electrones y/o el impedimento esterico impuesto por la cadena lateral ramificada. Con respecto al enlazador aromatico, 4-aminobenzoato pareda ser 55 optimo para unir fenilbutirilo con hidroxamato, cuya longitud fue suficiente para hacer contactos en ambos extremos del bolsillo.

Diseno y sintesis de los inhibidores de HDAC de 2a generacion - Optimizacion basada en estructura del

Compuesto 19. El compuesto 19 (HTPB) es estructuralmente distinto de los inhibidores HDAC existentes, muchos de los cuales tienen grupos protectores que consisten en estructuras planas polares, por ejemplo, TSA, dimetilaminofenilo; SAHA, fenilamino; y MS-27-275, piridin-3-il-metoxicarbonilo. Este hallazgo sugiere que el bolsillo de sitio activo de HDAC muestra un alto grado de flexibilidad en el alojamiento de grupos protectores con diferentes 5 propiedades estereo-electronicas.

Para prever la union a ligando, se realizo un acoplamiento molecular del compuesto 19 (figura 9, en color rojo) y TSA (figura 9, en color amarillo) en el bolsillo de sitio activo de HDLP tras la minimizacion de energfa para comparar el modo de reconocimiento de los ligandos individuales. Como se muestra en la figura 9, ambos ligandos adoptan 10 configuraciones similares en la union al bolsillo. El enlazador aromatico del compuesto 19, 4-aminobenzoato, proporciona una longitud optima para unir fenilbutirilo con hidroxamato, permitiendo que ambas funciones hagan contactos en ambos extremos del bolsillo. Parece que la funcion del acido hidroxamico [C(O)NH-OH] se atribuye al aumento de cuatro ordenes de magnitud en la potencia inhibidora de HDAC del compuesto 19 sobre butirato de fenilo.

15

Los datos de modelado en la figura 9 sugieren que la funcion del hidroxamato en la union a ligando es doble. En primer lugar, quela el cation Zn2+. En segundo lugar, facilita la transferencia protonica de NH-OH a Nt de His-131 con la ayuda del sistema de relevo de carga de His131 = Asp173 (figura 10). (Vease Vanommeslaeghe, K., Van Alsenoy, C., De Proft, F., Martins, J. C., Tourwe, D., y Geerlings, P. Ab initio study of the binding of Trichostatin A 20 (TSA) in the active site of histone deacetylase like protein (HDLP). Org Biomol Chem, 1: 2951-2957, 2003, para estudios de union a ligando de TSA.)

Como consecuencia, la union de los inhibidores de HDAC de hidroxamato, TSA o el compuesto 19, da lugar a una transferencia de carga negativa de Asp a hidroxamato, dando como resultado una formacion de puente de sal entre 25 el hidroxamato cargado negativamente y las cargas positivas en Zn2+ y el anillo imidazol (panel central, figura 10). Mecanicamente, este puente de sal representa una fuerza principal que contribuye a la union de ligandos basados en hidroxamato al bolsillo de sitio activo, y subraya el cambio de energfa libre diferencial (AAG* = -5,4 kcal/mol) requerido para el aumento de 104 veces en HDAC: Potencia inhibidora en relacion con la conversion de butirato de fenilo en el compuesto 19 (CI50, 0,4 mM frente a 44 nM).

30

La funcion de este puente de sal en la afinidad de union se subraya adicionalmente por una cafda de 10 veces de la potencia inhibidora de HDAC cuando el resto hidroxamato del compuesto 19 se reemplazo por un funcion fenilendiamina (compuesto 55), es decir, CI50, 0,044 frente a 0,4 |iM. A diferencia del hidroxamato, la union del grupo fenilendiamina al sitio activo no implica una transferencia de protones de a Nt de His131. En su lugar, la diamina rica 35 en electrones unicamente quela con el cation Zn2+ sin formar interacciones carga-carga con His131. En consecuencia, la afinidad de union con un ligando basado en fenilendiamina, por ejemplo, el compuesto 55, disminuye significativamente en comparacion con el equivalente hidroxamato.

Este acoplamiento molecular tambien proporciono una orientacion util para la posterior modificacion del compuesto 40 19. Como se muestra en la figura 9, los grupos protectores de TSA y el compuesto 19 se situan cerca de un surco

91 92 140 141 ^ 1 1 J '

rodeado por Tyr , Glu , Gly y Phe . En principio, este surco podna proporcionar flexibilidad en el alojamiento de los grupos protectores con grados variables de voluminosidad y, por lo tanto, podna aprovecharse para mejorar la potencia inhibidora de HDAC.

45 Por consiguiente, se reemplazo el resto fenilbutirilo del compuesto 19 con diversos grupos de acidos grasos aromaticos a-ramificados, de los cuales la razon fue doble. En primer lugar, el enlace amida entre el grupo fenilbutirilo y el enlazador en el compuesto 19 puede ser susceptible a la digestion proteolftica. El aumento de la voluminosidad de la funcion acilo puede mejorar la estabilidad metabolica haciendo el enlace amida mas impedido estericamente. En segundo lugar, el aumento del tamano de la funcion acilo puede aumentar el enlace hidrofobo con 50 el surco que se ha mencionado anteriormente, mejorando de este modo la afinidad de union.

Esta estrategia condujo a varios inhibidores de HDAC con una potencia mayor que el compuesto 19 (es decir, HTPB). Las estructuras y los valores de CI50 de algunos de los derivados representativos se resumen en la Tabla 1. Unicamente aquellos que estan dentro de las reivindicaciones son parte de la invencion.

55

Tabla 1. Inhibidores de HDAC basados en butirato de fenilo representativos

H R Y ^ H OH 0 .

Designation R CI50 (nM)

19

err 44

42

efr 25

44

32

61

cyV 38

Entre mas de 80 derivados que se sintetizaron, el compuesto 42 representa el agente optimo con una CI50 comparable a la de TSA. El analisis de modelado molecular indica que el compuesto 42 asumio una configuracion 5 que se contrapone con la de TSA dentro del bolsillo de sitio activo. (Vease la figura 11). Ademas, el resto isopropilo residia en el interior del surco, y puede interactuar con los residuos hidrofobos cercanos. Por lo tanto, el compuesto 42 se selecciono para caracterizaciones in vitro e in vivo adicionales.

El compuesto 42 y TSA median efectos antiproliferativos tanto a nivel epigenetico como celular - 10 Identificacion de dianas celulares novedosas. El compuesto 42, SAHA y TSA se sometieron a examenes de sus efectos sobre la expresion de p21WAF/CIP1 y la hiperacetilacion de histona H-4 en celulas de cancer de prostata independientes de androgenos PC-3. La figura 12 demuestra que la potencia del compuesto 42 en la induction de estos biomarcadores es comparable a la de TSA, y es aproximadamente cinco veces mayor que la de SAHA.

15 Tambien se examino el efecto de estos agentes sobre el estado de activation de Akt en celulas PC-3 (PTEN-/-). Akt se activa constitutivamente en las celulas PC-3 debido a la falta de PTEN funcional, lo que contribuye a la independencia androgenica y la resistencia quimioterapeutica de estas celulas. Cabe senalar que tanto el compuesto 42 como TSA causaron una desfosforilacion de Akt significativa tan baja como de 1 |aM en celulas PC-3 (figura 13). Por el contrario, no se observo ningun efecto apreciable de SAHA sobre fosfo-Akt a concentraciones 20 comparables, lo que sugiere diferencias sutiles en el modo de action entre SAHA y el compuesto 42/TSA.

El efecto del compuesto 42 sobre fosfo-Akt en celulas PC-3 es destacado a la luz de la aplicacion clmica de este inhibidor de HDAC en celulas de cancer de prostata refractarias a hormonas, la mayor parte de las cuales muestran mutaciones PTEN. Este efecto desfosforilante, sin embargo, es espedfico de las cinasas. Entre una serie de cinasas 25 de senalizacion diferentes examinadas, el nivel de fosforilacion de FAK (cinasa de adhesion focal) y ERK disminuyo de manera dependiente de la dosis, mientras que el de p38 o JNK no se vio afectado (figura 14).

Se supone que esta desfosforilacion se media a traves de la protema fosfatasa 1 (PP1) que se ha indicado para formar complejos con isoenzimas HDAC para facilitar su localization nuclear. Se propone que el tratamiento de las 30 celulas PC-3 con el compuesto 42 o TSA da como resultado la interruption de los complejos HDAC-PP1 en el nucleo, lo que conduce a la reubicacion de PP1 en el citoplasma para medir la desfosforilacion de las cinasas diana. Como alternativa, este efecto podria deberse a la acetilacion de la protema de choque termico (HSP)-90, que da como resultado una disminucion de la union a Akt y su posterior degradation (Fuino, L., Bali, P., Wittmann, S., Donapaty, S., Guo, F., Yamaguchi, H., Wang, H. G., Atadja, P., y Bhalla, K. Histone deacetylase inhibitor LAQ824 35 down-regulates Her-2 and sensitizes human breast cancer cells to trastuzumab, taxotere, gemcitabine, and epothilone B. Mol Cancer Ther, 2: 971-984, 2003).

Caracterizacion in vivo de los efectos antitumor del compuesto 42 sobre el cancer de prostata. Se examino el efecto del compuesto 42 administrado por via oral (50 y 100 mg/kg/dia) frente a sAhA inyectado por via 40 intraperitoneal (50 mg/kg/dia) sobre el crecimiento de tumores de xenoinjerto PC-3 establecidos. Ademas, tambien se incluyo el compuesto 44 (50 y 100 mg/kg/dia) en vista de su potencia inhibidora de HDAC comparable a la del compuesto 42 (CI50, 32 frente a 25 nM). Ambos compuestos 42 y 44 fueron eficaces en la supresion de la proliferation de celulas PC-3 in vitro en medio que contema FBS al 10 % de manera dependiente de la dosis, con valores CI50 de 0,6 y 0,8 ^M, respectivamente (figura 15, 72 h de tratamiento).

La figura 16 representa el crecimiento de tumores de xenoinjerto PC-3 subcutaneos en ratones atimicos tratados con inhibidores de HDAC como se ha descrito anteriormente (Panel A, datos presentados como volumen tumoral medio ± DE; Panel B, fotografias de ratones representativos de grupos tratados con vehmulo, el compuesto 44 y el

compuesto 42). Como se muestra, ambos compuestos 42 y 44 en cualquier dosis fueron eficaces en la supresion del crecimiento de tumores PC-3 establecidos a traves de la ruta oral. La eficacia in vivo del compuesto 42 oral a 50 mg/kgMa fue comparable a la del SAHA i.p. a la misma dosis, lo que causo reducciones del 70,4 % y del 69,9 %, respectivamente, en el crecimiento de los tumores en comparacion con los grupos de control tratados con vehmulo. 5 A 100 mg/kgMa, el compuesto 42 causo una inhibicion casi completa del crecimiento tumoral PC-3 (reduccion del 91,7%) en ausencia de una toxicidad evidente como se evaluo por el control del peso corporal y el examen patologico.

Al finalizar el estudio, se realizo una evaluacion patologica completa de un raton de cada grupo de tratamiento por 10 patologos veterinarios acreditados en The Ohio State University College of Veterinary Medicine, que inclrna patologfa clmica (hematologfa, qmmicas en suero) y necropsia completa (examen general y microscopico de al menos 27 tejidos y organos diferentes). Las anomalfas patologicas generales observadas en la necropsia se limitaron a pequenas adhesiones en el peritoneo de los ratones de control tratados con SAHA y tratados con DMSO, que fueron probablemente secundarias a las inyecciones i.p. diarias. Los parametros hematologicos estaban dentro 15 de los lfmites normales, excepto para una neutrofilia, que se observo unicamente en ratones de tanto grupos de control tratados con vehmulo como los grupos tratados con SAHA y el compuesto 44 (50 mg/kg). Los valores qrnmicos en suero fueron coherentes con una leve deshidratacion en los ratones tratados con vehmulo, pero estaban dentro de los lfmites normales para todos los demas ratones.

20 Para correlacionar la respuesta biologica con el mecanismo propuesto de accion identificado in vitro, la capacidad del compuesto 42 administrado por via oral y SAHA i.p. para modular la acetilacion de histona H-3 en tumores de xenoinjerto PC-3 se evaluo por inmunotransferencia. La figura 17 representa transferencias de Western de histona H3 y H3 acetilada en los homogenados de dos tumores PC-3 representativos con diferentes volumenes de ratones portadores de tumor tratados con vehmulo, el compuesto 42 oral a 50 o 100 mg/kg/dfa, o SAHA i.p. a 50 mg/kg/dfa 25 durante 28 dfas. Se aprecio un aumento significativo en el nivel de acetilacion de la histona H3 en los grupos tratados con farmaco, caractenstico de la inhibicion de HDAC in vivo.

En el experimento in vivo, las celulas PC-3, suspendidas en volumenes iguales de medio libre de suero y matriz de membrana basal Matrigel, se inyectaron por via subcutanea en el costado de ratones desnudos atfmicos NCr 30 machos de 5 - 7 semanas de edad (nu/nu) (0,5 x 106 celulas/0,1 ml/raton). El tratamiento diario con el compuesto 42 o 44 (50 y 100 mg/kg/dfa) por sonda oral o SAHA (50 mg/kg/dfa) por inyeccion intraperitoneal (N = 6 para cada grupo) comenzo cuando los volumenes tumorales alcanzaron 170-200 mm3. El grupo de control recibio vehmulo p.o. o i.p. unicamente (metilcelulosa al 0,1 %/Tween 80 al 0,05% en agua y DMSO, respectivamente). Los tratamientos continuaron hasta que el volumen tumoral medio del grupo de control alcanzo aproximadamente 1.500 mm3. Los 35 tumores se midieron cada semana usando calibres de Vernier y sus volumenes se calcularon usando una formula estandar: anchura x longitud x 0,52. Los pesos corporales se midieron semanalmente y fueron estables a lo largo de todo el estudio.

Efectos antiproliferativos in vitro del compuesto 42 en lmeas celulares de cancer de mama, lmeas celulares de 40 cancer de pulmon y lmeas celulares de cancer de tiroides. De acuerdo con la seleccion de sesenta lmeas celulares por el NCI Developmental Therapeutics Program (DPT), el compuesto 42 mostro potentes actividades antiproliferativas in vitro con un valor de GI50 medio (inhibicion del 50 % del crecimiento celular) de 0,2 |iM frente a todas las 60 lmeas celulares. Ademas, se ha ensayado el compuesto 42 en lmeas celulares de cancer de tiroides. Los efectos antiproliferativos dependientes de la dosis del compuesto 42 en lmeas celulares de cancer de mama, 45 pulmon y tiroides representativas se muestran en la figura 18.

Efecto antiproliferativo in vitro e in vivo del compuesto 42 en leucemia linfocitica cronica (LLC). El compuesto 42 se ensayo en celulas LLC primaras para comprobar su capacidad de inhibir HDAC y promover la citotoxicidad. Como se muestra en la figura 19, a la concentracion 1 |iM y superior donde se inhiben las HDAC, se observo una 50 citotoxicidad significativa (N = 6). Ademas, un estudio piloto in vivo usando el modelo de raton transgenico TLC-1 indica una tendencia hacia una mejor supervivencia y ninguna toxicidad notable con 100 mg/kg del compuesto 42 por sonda oral durante 5 dfas/dos dfas libres durante 4 semanas.

Estereoselectividad

55

Se descubrio sorprendentemente que la actividad inhibidora de HDAC del compuesto 42 es estereoselectiva, de la cual el isomero (S) es mas potente que el equivalente (R) (CI50, 15 nM frente a 80 nM).

En resumen, combinando el modelado molecular y tecnicas de qmmica de combinacion, se usaron acidos grasos de

cadena corta como estructuras para desarrollar una nueva clase de potentes inhibidores de HDAC. El agente optimo, el compuesto 42 (NSC-D-731438) inhibe la actividad de HDAC con una CI50 de 25 nM, un aumento de mas de 10.000 veces sobre el de su precursor butirato de fenilo. El compuesto 42 muestra varias caractensticas unicas que lo hacen un candidato prometedor para utilizarse en la practica clmica. En primer lugar, el compuesto 42 media 5 efectos antiproliferativos in vitro a traves de tanto mecanismos epigeneticos como celulares, una caractenstica que es similar a la de TSA, pero ausente en SAHA. En segundo lugar, esta biodisponible por via oral con una potencia in vitro y/o in vivo superior a la de MS-275 y SAHA. En tercer lugar, no tiene un efecto de toxicidad demostrable en ratones portadores de tumor despues de un transcurso de 28 dfas a la dosis de 50 o 100 mg/kg/dfa, lo que ofrece la oportunidad de su administracion cronica y combinacion con otras terapias dirigidas. Finalmente, el compuesto 42 10 tiene una estructura sencilla, y es susceptible a smtesis a gran escala.

Produccion del Compuesto 42

Los inventores han sintetizado el compuesto 42 numerosas veces en escalas multigramo. Basicamente, se ha 15 preparado a traves de una smtesis de cuatro etapas con un rendimiento total del 52% (figura 20). Todos los materiales de partida estan facilmente disponibles, y la smtesis es susceptible de aumentar a niveles de multiples cientos de gramos en un entorno de laboratorio, cuyos procedimientos se describen como se indica a continuacion. Los intermedios y el producto final pueden aislarse por cristalizacion en la mezcla de reaccion con una pureza mayor del 99 % sin usar separacion cromatografica. En general, los procedimientos de smtesis y purificacion son obvios, y 20 no hay ningun interes especial con respecto a la produccion a gran escapa de este compuesto.

N-(4-Acetil-fenil-3-metil-2-fenil-butiramida (1). Se disolvio acido (a-isopropil)-fenilacetico (4 g, 22,3 mmol) en cloruro de tionilo (30 ml) y se calento a 50 °C durante 1 h. Despues de eliminar el disolvente, el residuo se disolvio en THF (50 ml), y se anadieron ester metilico del acido p-aminobenzoico (3,4 g, 22,5 mmol) y Et3N (3,5 ml, 25 mmol) en THF 25 (50 ml) con agitacion a temperatura ambiente. Despues de 4 h, se retiro al vado el THF, se disolvio en acetato de etilo (200 ml) y se lavo, en tandem, con agua (100 ml) y salmuera (100 ml). La capa organica se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vado, produciendo el compuesto 1 (5,6 g; rendimiento del 85 %). El producto en bruto se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

30 Acido 4-(3-metil-2-fenil-butirilamino)benzoico (2). El compuesto 1 (5,6 g; 20 mmol) se disolvio en metanol (150 ml) que contema KOH (21 g). La mezcla se calento a reflujo durante 2 h, se enfrio a 0 °C y se anadieron gota a gota 30 ml de HCl 12 N (12 N) para precipitar el producto. El disolvente se retiro al vado y se anadio agua fna (120 ml). El precipitado se recogio por filtracion, se lavo con agua y se seco, produciendo el compuesto 2 (5 g; rendimiento del 84 %).

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N-Bendloxi-4-(3-metil-2-fenil-butirilamino)-benzamida (3). A una solucion de 2 (5 g; 16,8 mmol) en THF seco (120 ml) se le anadio trietilamina (TEA, 2,5 ml; 16,8 mmol) en una atmosfera de N2. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min, y se anadieron cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfordiaiTHdico (BOP-CI) (4,7 g; 18,7 mmol), clorhidrato de O-bencilhidroxilamina (2,7 g; 17 mmol) y TEA (7,5 ml). Despues de agitar a 40 temperatura ambiente durante una noche, la solucion se concentro al vado, y se anadio acetato de etilo (200 ml) seguido de NaHCO3 al 3 % (80 ml). La fase organica se separo y se lavo consecutivamente con agua y salmuera saturada, 100 ml cada vez, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vado. El residuo (6,1 g, rendimiento del 90 %) se uso directamente para la hidrogenolisis sin purificacion adicional.

45 N-Hidroxi-4-(3-metil-2 fenil-butirilamino)-benzamida (4). El compuesto 3 (6,1 g; 15,2 mmol) se disolvio en 1:1 de metanol/THF (120 ml), y se anadio paladio al 10 % sobre carbon (0,6 g, 10 % p/p). La mezcla se trato con hidrogeno a presion atmosferica durante 2 h y se filtro. El disolvente se evaporo y el residuo se recristalizo con acetato de etilo, produciendo 4,2 g (rendimiento del 90 %).

50 Se ilustra un esquema alternativo par la smtesis de inhibidores de HDAC de acuerdo con la presente invencion en la figura 21.

Otras realizaciones de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la consideracion de la memoria descriptiva y la practica de la invencion desvelada en el presente documento.

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Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren como ejemplares.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un inhibidor de histona deacetilasa que tiene la formula:

   imagen1

   5 en la que:

   X se elige entre H y CH3;

   Y es (CH2)n, en la que n es 0;

   Z se elige entre (cH2)m en la que m es 0-3 y (CH)2;

   10 A es un grupo alquilo graso aromatico a-ramificado de 3 a 14 carbonos, B es hidroxi, y Q es hidrogeno.
2. 2. Un inhibidor de histona deacetilasa elegido entre N-(2-Amino-fenil)-4-(5-fenilpentanoilamino)-benzamida; N-(2- Amino-fenil)-4-(2-fenil-butirilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(2,2-dimetil-4-fenil-butirilamino)-benzamida; N-(2- Aminofenil)-4-(3-fenil-propionilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(4-fenilbutirilamino)-benzamida; N-(2-Amino-

   15 fenil)-4-(3-fenil-butirilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-(3-metil-2-fenil-butirilamino)-benzamida; N-(2-Amino- fenil)-4-(2-metil-2-fenil-propionilamino)-benzamida; N-(2-Amino-fenil)-4-[2-(4-isobutil-fenil)-propionilamino]-

   benzamida; y N-hidroxi-4-[2-(S)-fenilbutirilamino]-benzamida.
3. 3. Un inhibidor de histona deacetilasa elegido entre N-hidroxi-4-[2-(R)-fenilbutirilamino]-benzamida; N-[4-(2- 20 Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-2-(S)-fenilbutiramida; N-[4-(2-Hidroxicarbamoil-etil)-fenil]-2-(R)-fenil-butiramida; N-hidroxi-

   4-(3-(S)-fenilbutirilamino)-benzamida; N-hidroxi-4-(3-(R)-fenilbutirilamino)-benzamida; N-hidroxi-4-[3-(S)- fenilbutirilamino]-benzamida; y N-hidroxi-4-[3-(R)-fenilbutirilamino]-benzamida.
4. 4. El inhibidor de acuerdo con la revindication 1, en el que el inhibidor es un ester o sal.

   25
5. 5. Una composition farmaceutica que comprende el inhibidor de acuerdo con la reivindicacion 1, y al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.
6. 6. Un inhibidor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una composicion farmaceutica de 30 acuerdo con la reivindicacion 5, para su uso en la inhibition de la proliferation celular neoplasica en un animal, en el

   que el inhibidor o la composicion farmaceutica sirve para su administration en una cantidad terapeuticamente eficaz.
7. 7. El inhibidor o composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el animal es un ser humano.

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8. 8. El inhibidor de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que m = 0 y X = H.
9. 9. El inhibidor de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el compuesto es:

   imagen2
10. 10. El inhibidor de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el compuesto es:

    imagen3

    5
11. 11. El inhibidor de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el compuesto es:

    imagen4
12. 12. Una composicion que comprende el inhibidor de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que la composicion se enriquece en el estereoisomero S en comparacion con el estereoisomero R.