ES2562790T3

ES2562790T3 - Anticuerpos monoclonales contra Glipicano-3

Info

Publication number: ES2562790T3
Application number: ES08796249.4T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Alexander Terrett; Li-Sheng Lu; Haichun Huang; Dapeng Yao; Chin Pan; Heidi Leblanc; Timothy Sproul; Mark Yamanaka
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2007-07-17
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2016-03-08
Anticipated expiration: 2028-07-17
Also published as: RS54624B1; AU2008275985B2; WO2009012394A1; US8680247B2; EP2178921B1; US20100209432A1; US9217033B2; HRP20160270T1; ME02345B; JP5868593B2; KR101570252B1; CN101815726B; US20140186892A1; MX2010000537A; SI2178921T1; AU2008275985A1; KR20150038732A; KR101527342B1; EP2178921A1; CY1117236T1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado o una porcion de union a antigeno del mismo seleccionados entre el grupo que consiste en: (i) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden: a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 1; b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 4; c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 7; d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 10; e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 13; y f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 16; (ii) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden: a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 2; b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 5; c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 8; d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 11; e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 14; y f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 17; y (iii) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden: a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 3; b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 6; c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID No: 9; d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 12; e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 15; y f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID No: 18; en donde el anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo se unen a Glipicano-3.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Anticuerpos monoclonales contra Glipicano-3 Antecedentes de la invencion

El Glipicano-3 es un antigeno oncofetal que pertenece a la familia de glipicano de proteoglicanos de heparin sulfato anclados a glicosil-fosfatidilinositol. Los glipicanos se caracterizan por un enlace covalente con cadenas de polisacaridos complejas llamadas heparinsulfato glicosaminoglicanos. Los glipicanos estan implicados en la senalizacion celular en la interfaz de la matriz celular-extracelular. (Sasisekharan et al., Nature Reviews | Cancer, Volumen 2 (2002)). Hastala fecha, se han identificado seis miembros distintos de la familia de glipicano humano. El Glipicano-3 unido a la membrana celular, esta compuesto de dos subunidades, ligadas por uno o mas enlaces disulfuro.

El Glipicano-3 se expresa en higado fetal y placenta durante el desarrollo, y esta regulado negativamente o silenciado en tejidos adultos normales. Las mutaciones y eliminaciones en el gen de Glipicano-3, son responsables del sindrome Simpson-Golabi-Behmel o de la dismorfia de Simpson en seres humanos. El Glipicano-3 se expresa en varios canceres y, en particular, en carcinoma hepatocelular (“CHC”), melanoma, tumor de Wilm y hepatoblastoma. (Jakubovic y Jothy; Ex. Mol. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura y Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)).

El CHC es la tercera causa de muerte mas importante relacionada con el cancer en todo el mundo. Cada ano, el CHC causa alrededor de 1 millon de muertes (Nakatsura y Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)). El virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, y el consumo excesivo cronico de alcohol, que conduce a cirrosis hepatica, siguen siendo las causas mas comunes de CHC. Su incidencia ha aumentado notablemente en los Estados Unidos, debido a la diseminacion de la infeccion por virus de la hepatitis C y se espera que aumente durante las proximas 2 decadas. El CHC se trata principalmente mediante transplante de higado o reseccion del tumor. El pronostico del paciente es dependiente tanto de la funcion hepatica subyacente como del estadio en el que se diagnostica el tumor (Parikh y Hyman, Am J Med. 120(3):194-202 (2007)). Son necesarias estrategias de tratamiento eficaces para el CHC.

El documento EP1674111 de la tecnica anterior divulga la preparacion de anticuerpos monoclonales que se unen a glipicano 3, mostrando una fuerte actividad CDC (Ej. 16) y la humanizacion de uno de ellos. La afinidad de estos anticuerpos no esta determinada.

Sumario de la invencion

La presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales aislados, en particular, anticuerpos monoclonales humanos, que se unen a Glipicano-3 y que presentan numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen, alta afinidad de union a Glipicano-3 humano.

En un aspecto, la divulgacion concierne a un anticuerpo monoclonal aislado, o a una porcion de union a antigeno del mismo, en la que el anticuerpo:

(a) se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 1x10-7 M o menor;

(b) se une a celulas CHO humanas transfectadas con Glipicano-3.

El anticuerpo es un anticuerpo humano, aunque en aspectos alternativos de la divulgacion, el anticuerpo puede ser un anticuerpo murino, un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado.

En un aspecto, el anticuerpo se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 5 x 10-8 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 2 x 10-8 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 1 x 10-8 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 5x10-9 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 4x10-9 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 3x10-9 M o menor, o se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 2 x 10-9 M o menor.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo compite de forma cruzada por la union a Glipicano-3 con un anticuerpo de referencia que comprende:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 19, 20, y 21; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 22, 23, y 24.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En varias realizaciones, el anticuerpo de referencia comprende:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 19; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 22; o el anticuerpo de referencia comprende:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 20; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 23; o el anticuerpo de referencia comprende:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 21; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 24.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que es el producto de, o procede de de un gen Vh 551 humano, en el que el anticuerpo se une especificamente a Glipicano-3. La divulgacion tambien proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena ligera que es el producto de, o procede de un gen Vk A27 humano, en el que el anticuerpo se une especificamente a Glipicano-3.

En un aspecto preferido, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, que comprende:

(a) una region variable de cadena pesada de un gen Vh 5-51 humano; y

(b) una region variable de cadena ligera de un gen Vk A27 humano; en el que el anticuerpo se une especificamente a Glipicano-3.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, que comprende:

una region variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3; y una region variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en la que:

(a) la secuencia de CDR3 de la region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 7, 8, y 9, y modificaciones conservativas de las mismas;

(b) la secuencia de CDR3 de la region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 16, 17, y 18, y modificaciones conservativas de las mismas;

(c) el anticuerpo se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 1x10-7 M o menor; o

(d) se une a celulas CHO humanas transfectadas con Glipicano-3.

Preferiblemente, la secuencia de CDR2 de la region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 4, 5, y 6, y modificaciones conservativas de las mismas; y la secuencia de CDR2 de la region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 13, 14, y 15, y modificaciones conservativas de las mismas. Preferiblemente, la secuencia de CDR1 de la region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 1, 2, y 3, y modificaciones conservativas de las mismas; y la secuencia de CDR1 de region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacido de SEC ID N°: 10, 11, y 12, y modificaciones conservativas de las mismas.

Una combinacion preferida comprende:

(a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 1;

(b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 4;

(c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 7;

(d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 10;

(e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 13; y

(f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 16.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Otra combinacion preferida comprende:

(a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 2;

(b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 5;

(c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 8;

(d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 11;

(e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 14; y

(f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 17.

Otra combinacion preferida comprende:

(a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 3;

(b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 6;

(c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 9;

(d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 12;

(e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 15; y

(f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 18.

Otros anticuerpos preferidos de la divulgacion, o porciones de union a antigeno de los mismos comprenden:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 19, 20 y 21; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 22, 23, y 24;

en la que el anticuerpo se une especificamente a Glipicano-3.

Una combinacion preferida comprende:

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 22.

Otra combinacion preferida comprende:

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID

(c) N°: 23.

Otra combinacion preferida comprende:

En otro aspecto de la divulgacion, se proporcionan anticuerpos o porciones de union a antigeno de los mismos que compiten por la union a Glipicano-3 con cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Los anticuerpos de la invention pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, por ejemplo de un isotipo IgG1 o IgG4. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, Fab' o Fab'2, o anticuerpos de cadena unica.

La invencion tambien proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invencion, o una portion de union a antigeno del mismo, ligada a un agente terapeutico, tal como una citotoxina o un isotopo radioactivo. La invencion tambien proporciona una molecula biespecifica que comprende un anticuerpo, o porcion de union a antigeno del mismo, de la invencion, ligada a un segundo resto funcional que tiene una especificidad de union diferente a la de dicho anticuerpo, o una porcion de union a antigeno del mismo.

Tambien se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo, o porcion de union a antigeno del mismo, o un inmunoconjugado o molecula biespecifica de la invencion y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

La invencion tambien abarca moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones de union a antigeno de los mismos, de la invencion, asi como vectores de expresion que comprenden dichos acidos nucleicos y celulas hospedadoras que comprenden dichos vectores de expresion.

La divulgacion proporciona metodos para inhibir el crecimiento de celulas tumorales que expresan Glipicano-3. Los metodos comprenden, poner en contacto las celulas con un anticuerpo anti-Glipicano-3, o porcion de union a antigeno del mismo, en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de las celulas tumorales. En una realization preferida, las celulas tumorales proceden de tejido hepatico. Adicionalmente, el anticuerpo, o porcion de union a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

antigeno del mismo, puede ser un inmunoconjugado. Los inmunoconjugados de la invencion pueden ser agentes terapeuticos, por ejemplo, citotoxinas o isotopos radiactivos.

Otras caracteristicas y ventajas de la presente invencion, seran evidentes a partir de la siguiente description detallada y ejemplos, los cuales no deben interpretarse como limitantes.

La invencion es como se define en las reivindicaciones

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1A muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 25) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

19) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4A6. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 1), CDR2 (SEC ID N°: 4) y cDr3 (SEC ID N°: 7), se delinean, y se indican las derivaciones de linea germinal V, D y J.

La Figura 1B muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 28) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

22) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4A6. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 10), CDR2 (SEC ID N°: 13) y CDR3 (SEC ID N°: 16), se delinean y se indican las derivaciones de linea germinal V y J.

La Figura 2A muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 26) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

20) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 11E7. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 2), CDR2 (SEC ID N°: 5) y CdR3 (SEC ID N°: 8) se delinean y se indican las derivaciones de linea germinal V y J.

La Figura 2B muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 29) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

23) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 11E7. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 11), CDR2 (SEC ID N°: 14) y CDR3 (SEC ID N°: 17) se delinean y se indican las derivaciones de linea germinal V y J.

La Figura 3A muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 27) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

21) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 16D10. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 3), CDR2 (SEC ID N°: 6) y CDR3 (SEC ID N°: 9) se delinean y se indican las derivaciones de linea germinal V y J.

La Figura 3B muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 30) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

24) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 16D10. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 12), CDR2 (SEC ID N°: 15) y CDR3 (SEC ID N°: 18) se delinean y se indican las derivaciones de linea germinal V y J.

La Figura 4 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 4A6 (SEC ID N°: 19) con la secuencia de aminoacidos de Vh 5-51 de linea germinal humana (SEC ID N°: 31) y la secuencia de aminoacidos de Jh JH4b de linea germinal humana (SEC ID N°: 32).

La Figura 5 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada de 11E7 (SEC ID N°: 20) con las secuencias de aminoacido de Vh 5-51 de linea germinal humana (SEC ID N°: 31) y la secuencia de aminoacidos de Jh JH4b de linea germinal humana (SEC ID N°: 32).

La Figura 6 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 16D10 (SEC ID N°: 21) con las secuencias de aminoacido de Vh 5-51 de linea germinal humana (SEC ID N°: 31) y la secuencia de aminoacidos de Jh JH4b de linea germinal humana (SEC ID N°: 32).

La Figura 7 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera de 4A6 (SEC ID N°: 22) con la secuencia de aminoacidos de Vk A27 de linea germinal humana (SEC ID N°: 33) y la secuencia de aminoacidos de Jk JK4 de linea germinal humana (SEC ID N°: 34).

La Figura 8 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 11E7 (SEC ID N°: 23) con la secuencia de aminoacidos de Vk A27 de linea germinal humana (SEC ID N°: 33) y la secuencia de aminoacidos de Jk JK4 de linea germinal humana (SEC ID N°: 34).

La Figura 9 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 16D10 (SEC ID N°: 24) con la secuencia de aminoacidos de Vk A27 de linea germinal humana (SEC ID N°: 33) y la secuencia de aminoacidos de Jk JK1 de linea germinal humana (SEC ID N°: 35).

La Figura 10 muestra la afinidad de union de los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7 y 16D10 por la linea celular de CHC Hep-3B. La union se midio usando un ensayo de Clasificacion de Celulas Activadas por Fluorescencia (“FACS").

La Figura 11 muestra que los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10 se unen especificamente a las lineas celulares de CHC Hep-3B y Hep-G2. La union se midio usando un ensayo FACS.

La Figura 12 muestra que los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10 se unen especificamente a celulas CHO transfectadas establemente con un vector de expresion de Glipicano-3, pero no a la linea celular CHO progenitora. La union se midio usando un ensayo FACS.

La Figura 13 muestra que el anticuerpo monoclonal 4A6 se une a celulas de cancer hepatico tomadas de pacientes. La union al anticuerpo se revelo en un ensayo de inmunohistoquimica.

La Figura 14 muestra que los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10, pueden mediar en la elimination de celulas Hep-3B mediada por celulas T citoliticas naturales (“NK”). La eliminacion se midio con un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (“ADCC”).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La Figura 15 muestra que los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10, son internalizados por las celulas Hep-3B despues de la union al Glipicano-3 de la superficie celular. La internalizacion se midio por un ensayo Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA).

La Figura 16 muestra que los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10, son internalizados por las celulas Hep-3B despues de la union al Glipicano-3 de la superficie celular. La internalizacion se revelo en un ensayo de inmunofluorescencia.

Descripcion detallada de la invencion

La presente divulgacion se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, particularmente, anticuerpos monoclonales humanos que se unen especificamente a Glipicano-3 con alta afinidad. En ciertos aspectos, los anticuerpos de la invencion proceden de secuencias particulares de cadena ligera y pesada de linea germinal y/o comprenden caracteristicas estructurales particulares, tales como regiones CDR que comprenden secuencias particulares de aminoacidos. La divulgacion proporciona anticuerpos aislados, metodos para elaborar dichos anticuerpos, inmunoconjugados y moleculas biespecificas que comprenden dichos anticuerpos y composiciones farmaceuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moleculas biespecificas de la invencion. La divulgacion tambien se refiere a metodos para usar los anticuerpos, tales como para detectar Glipicano-3, asi como para tratar enfermedades asociadas con la expresion de Glipicano-3, tal como neoplasias malignas de celulas hepaticas que expresan Glipicano-3. Por consiguiente, la divulgacion tambien proporciona metodos para usar los anticuerpos anti- Glipicano-3 de la invencion, para tratar neoplasias malignas de celulas hepaticas, por ejemplo, CHC.

Para que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, se definen primero ciertos terminos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripcion detallada.

Los terminos “Glipicano-3", “proteoglicano 3 de glipicano”, “GPC3”, “OTTHUMP00000062492”, “GTR2-2”, “SGB”, “DGSX”, “SDYS”, “SGBS”, “OCI-5”, y “SGBS1” se usan de forma indistinta, e incluyen variantes, isoformas y homologos de especie de Glipicano-3 humano. Por consiguiente, los anticuerpos humanos de esta divulgacion pueden, en ciertos casos, reaccionar de forma cruzada con Glipicano-3 de especies distintas al ser humano. En ciertas realizaciones, los anticuerpos pueden ser completamente especificos para una o mas proteinas de Glipicano- 3 humanas y pueden no presentar reactividad cruzada no humana de especie o de otros tipos. La secuencia de aminoacidos completa de un Glipicano-3 humano ilustrativo, tiene el numero de referencia de Genbank/NCBI NM_004484 (SEC ID N°: 36).

El termino “respuesta inmune”, se refiere a la accion de por ejemplo, linfocitos, celulas presentadoras de antigeno, celulas fagociticas, granulocitos y macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o el higado (que incluyen anticuerpos, citocinas y complemento), que resultan en el dano selectivo a, destruccion de, o eliminacion del cuerpo humano de patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con patogenos, celulas cancerosas, o, en casos de autoinmunidad o inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales.

Una “via de transduccion de senal”, se refiere a la relacion bioquimica entre varias de las moleculas de transduccion de senal, que juegan un papel en la transmision de una senal de una porcion de una celula a otra porcion de una celula. Tal como se usa en el presente documento la frase “receptor de superficie celular”, incluye, por ejemplo, moleculas y complejos de moleculas capaces de recibir una senal y de transmitir dicha senal a traves de la membrana plasmatica de una celula. Un ejemplo de un “receptor de superficie celular” de la presente divulgacion es el receptor de Glipicano-3.

El termino “anticuerpo” tal como se cita en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de union a antigeno (es decir, “porcion de union a antigeno”) o cadenas unicas del mismo. Un “anticuerpo”, se refiere a una glicoproteina que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porcion de union a antigeno del mismo. Cada cadena pesada esta constituida por una region variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como Vh) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada esta constituida por tres dominios, Ch1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta constituida por una region variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl), y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera esta constituida por un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl, pueden subdividire ademas en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones detrminantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, llamadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl esta compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, contienen un dominio de union que interactua con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la union de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, que incluyen varias celulas del sistema inmune (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clasico.

El termino “porcion de union a antigeno” de un anticuerpo (o simplemente, “porcion de anticuerpo”), tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse especificamente a un antigeno (por ejemplo, Glipicano-3). Se ha demostrado que la funcion de union a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

antigeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro de la presente divulgacion incluyen, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fab', el cual es esencialmente un Fab con parte de la region bisagra (vease, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3a ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un brazo unico de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), el cual consiste en un dominio Vh; (vii) una region determinante de la complementariedad (CDR) aislada; y (viii) un nanocuerpo, una region variable de cadena pesada que contiene un dominio variable unico y dos dominios constantes. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, pueden unirse, usando metodos recombinantes, por un enlazador sintetico que permite su produccion como una cadena de proteina unica en la cual, las dos regiones Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); vease por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 85:5879-5883).Tambien se pretende abarcar dichos anticuerpos monocatenarios dentro del termino “porcion de union a antigeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y la utilidad de los fragmentos se explora de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Un “anticuerpo aislado” tal como se usa en el presente documento pretende referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a Glipicano-3, esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especificamente antigenos distintos a Glipicano-3). Un anticuerpo aislado que se une especificamente a Glipicano-3 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada frente a otros antigenos, tales como moleculas de Glipicano-3 de otras especies. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias quimicas.

Los terminos “anticuerpo monoclonal” o “composicion de anticuerpo monoclonal”, tal como se usa en el presente documento se refieren a una preparation de moleculas de anticuerpo de composicion molecular unica. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad de union y una afinidad unicas para un epitopo particular.

El termino “anticuerpo humano” tal como se usa en el presente documento pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales, tanto las regiones marco conservadas como las CDR, proceden de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Ademas, si el anticuerpo contiene una region constante, la region constante tambien procede de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invention, pueden incluir restos de aminoacidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o de sitio especifico, in vitro o por mutation somatica in vivo). Sin embargo, el termino “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento no pretende incluir anticuerpos en los cuales, las secuencias CDR procedentes de la linea germinal de otras especies de mamiferos tales como un raton, hayan sido injertadas en secuencias marco conservadas humanas.

El termino “anticuerpo monoclonal humano”, se refiere a anticuerpos que muestran una especificidad de union unica, que tienen regiones variables en las que las regiones tanto marco conservadas como CDR proceden de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. En una realization, los anticuerpos monoclonales humanos, se producen mediante un hibridoma que incluye una celula B obtenida de un animal no humano transgenico, por ejemplo, un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera fusionada a una celula inmortalizada.

El termino “anticuerpo humano recombinante” tal como se usa en el presente documento incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton), que es transgenico o transcromosomico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de este (descrito en mas detalle mas adelante), (b) anticuerpos aislados a partir de una celula hospedadora transformada para que exprese el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria recombinante de anticuerpos humanos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implque el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de aDn. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las cuales, las regiones marco conservadas y CDR proceden de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig humanas, mutagenesis somatica in vivo) y de este modo, las secuencias de aminoacido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes, son secuencias que, aunque proceden de y estan relacionadas con secuencias de Vh y Vl de linea germinal, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de anticuerpo de la linea germinal humana in vivo.

Tal como se usa en el presente documento “isotipo”, se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1), que esta codificada por los genes de las regiones constantes de cadena pesada.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las frases “un anticuerpo que reconoce a un antigeno”, y “un anticuerpo espedfico para un antigeno”, se usan en el presente documento de forma indistinta con el termino “un anticuerpo que se une espedficamente a un antigeno”.

El termino “derivados de anticuerpo humano”, se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

El termino “anticuerpo humanizado”, pretende referirse a anticuerpos en los cuales, las secuencias CDR procedentes de la linea germinal de otras especies de mamifero, tales como un raton, se han injertado en secuencias marco conservadas humano. Pueden efectuarse modificaciones adicionales en la region marco conservada dentro de las secuencias marco conservadas humanas.

El termino “anticuerpo quimerico”, pretende referirse a anticuerpos en los que las secuencias de region variable proceden de una especie y las secuencias de region constante proceden de otra especie, tales como un anticuerpo en el cual, las secuencias de region variable proceden de un anticuerpo de raton y las secuencias de region constante proceden de un anticuerpo humano.

Tal como se usa en el presente documento un anticuerpo que “se une espedficamente a Glipicano-3 humano”, pretende referirse a un anticuerpo que se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 1 x 10-7 M o o menor, mas preferiblemente, 5 x 10-8 M o menor, mas preferiblemente, 3 x 10-8 M o menor, mas preferiblemente, 1 x 10-8 M o menor, aun mas preferiblemente, 5 x 10-9 M o menor.

El termino “no se une sustancialmente” a una proteina o celulas, tal como se usa en el presente documento significa que no se une o no se une con una alta afinidad a la proteina o a las celulas, es decir, se une a la proteina o las celulas con una Kd de 1 x 10-6 M o mayor, mas preferiblemente, 1 x 10-5 M o mayor, o mas preferiblemente, 1 x 10-4 M o mayor, mas preferiblemente, 1 x 10-3 M o mayor, aun mas preferiblemente, 1 x 10-2 M o mayor.

El termino “Kasoc” o “Ka”, tal como se usa en el presente documento pretende referirse al la velocidad de asociacion de una interaccion particular anticuerpo-antigeno, mientras que el termino “Kdis” o “Kd”, tal como se usa en el presente documento pretende referirse a la relacion de disociacion de una interaccion particular anticuerpo-antigeno. El termino “Kd”, tal como se usa en el presente documento pretende referirse a la constante de disociacion, que se obtiene a partir de la relacion de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentracion molar (M). Los valores de Kd para anticuerpos pueden determinarse usando metodos bien establecidos en la tecnica. Un metodo preferido para determinar la Kd de un anticuerpo le uso resonancia de plasmon superficial, preferiblemente, usando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®.

Tal como se usa en el presente documento el termino “alta afinidad” para un anticuerpo IgG, se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1 x 10-7 M o menor, mas preferiblemente, 5 x 10-8 M o menor, aun mas preferiblemente, 1x10-8 M o menor, aun mas preferiblemente, 5 x 1o-9 M o menor y aun mas preferiblemente, 1 x 10-9 M o menor, para un antigeno diana. Sin embargo, la “alta afinidad” de union puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, “alta afinidad” de union para un isotipo de IgM, se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-6 M o menor, mas preferiblemente, 10-7 M o menor, aun mas preferiblemente, 10-8 M o menor.

Tal como se usa en el presente documento el termino “sujeto”, incluye cualquier animal humano o no humano. El termino “animal no humano”, incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamiferos y no mamiferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

En las siguientes subsecciones se describen diversos aspectos de la invencion con mas detalle.

Anticuerpos Anti-Glipicano-3

Los anticuerpos de la invencion se caracterizan por aspectos o propiedades funcionales particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen espedficamente a Glipicano-3 humano. Preferiblemente, un anticuerpo de la invencion se une a Glipicano-3 con alta afinidad, por ejemplo, con una Kd de 1 x 10-7 M o menor. Los anticuerpos anti-Glipicano-3 de la invencion, preferiblemente muestran una o mas de las siguientes caracteristicas:

(a) se unen a Glipicano-3 humano con un Kd de 1x10-7 M o menor;

(b) se unen a celulas CHO humanas transfectadas con Glipicano-3.

Preferiblemente, el anticuerpo se une a Glipicano-3 humano con una Kd de 5 x 10-8 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con un Kd de 2 x 10-8 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con un Kd de 5x10-9 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con un Kd de 4x10-9 M o menor, se une a Glipicano-3 humano con un Kd de 3x10-9 M o menor, o se une a Glipicano-3 humano con un Kd de 2,1 x 10 M o menor.

El anticuerpo se une preferiblemente a un epitopo antigenico presente en Glipicano-3, epitopo que no esta presente en otras proteinas. El anticuerpo se une normalmente a Glipicano-3, pero no se une a otras proteinas, o se une a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

otras protemas con una baja afinidad, tal como con una Kd de 1 x 10-6 M o mayor, mas preferiblemente, 1 x 10-5 M o mayor, mas preferiblemente, 1 x 10-4 M o mayor, mas preferiblemente, 1 x 10-3 M o mayor, aun mas preferiblemente, 1 x 10-2 M o mayor. Preferiblemente, el anticuerpo no se une sustancialmente a protemas relacionadas, por ejemplo, el anticuerpo no se une sustancialmente a Glipicano-1, Glipicano-2, Glipicano-4 o Glipicano-6.

En una realizacion, el anticuerpo puede ser internalizado en una celula que expresa Glipicano-3. Se conocen en la tecnica ensayos convencionales para evaluar la internalizacion de anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, un ensayo de internalizacion HumZap.

Se conocen en la tecnica ensayos convencionales para evaluar la capacidad de union de los anticuerpos hacia Glipicano-3, incluyendo, por ejemplo, ELISA, transferencias de Western, RIA, y analisis de citometria de flujo. Los ensayos adecuados se describen en detalle en los ejemplos. Las cineticas de union (por ejemplo, afinidad de union) de los anticuerpos, tambien pueden evaluarse mediante ensayos convencionales conocidos en la tecnica, tales como el sistema de analisis Biacore®. Para evaluar la union a celulas tumorales, por ejemplo, celulas Hep-3b o Hep- G2 (n.° de deposito ATCC HB-8064 y HB-8065, respectivamente), las celulas pueden obtenerse a partir de fuentes publicamente disponibles, tales como la American Type Culture Collection (Coleccion Americana de Cultivos Tipo), y usarse en ensayos convencionales, tales como analisis por citometria de flujo.

Anticuerpos Monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10

Los anticuerpos preferidos de la invencion son los anticuerpos monoclonales humanos 4A6, 11E7, y 16D10, aislados y caracterizados estructuralmente tal como se describe en los ejemplos 1 y 2. Las secuencias de aminoacido de Vh de 4A6, 11E7, y 16D10 se muestran en las SEC ID N°: 19, 20, y 21, respectivamente. Las secuencias de aminoacido de Vl de 4A6, 11E7, y 16D10 se muestran en las SEC ID N°: 22, 23, y 24, respectivamente.

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a Glipicano-3, las secuencias de Vh y Vl pueden “mezclarse y emparejarse”, para crear otras moleculas de union anti-Glipicano-3 de la divulgacion. La union a Glipicano-3 de dichos anticuerpos “mezclados y emparejados”, puede probarse usando los ensayos de union descritos anteriormente y en los ejemplos (por ejemplo, ELISA). Preferiblemente, cuando se mezclan y emparejan las cadenas de Vh y Vl, una secuencia Vh de un emparejamiento Vh/Vl particular, se reemplaza con una secuencia Vh estructuralmente similar. Del mismo modo, preferiblemente, se reemplaza una secuencia Vl de un emparejamiento Vh/Vl particular, se reemplaza con una secuencia Vl estructuralmente similar.

Por consiguiente, en un aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antigeno del mismo que comprende:

en la que el anticuerpo se une especificamente a Glipicano-3, preferiblemente, a Glipicano-3 humano.

Las combinaciones preferidas de cadena ligera y pesada incluyen:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 22; o

(b) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 23.

(c) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 24.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona anticuerpos que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera de 4A6, 11E7, y 16D10, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoacido de las CDR1 de Vh de 4A6, 11E7, y 16D10 se muestran en las SEC ID N°: 1, 2 y 3, respectivamente. Las secuencias de aminoacido de las CDR2 de Vh de 4A6, 11E7, y 16D10 se muestran en las SEC ID N°: 4, 5, y 6, respectivamente. Las secuencias de aminoacido de las CDR3 de Vh de 4A6, 11E7, y 16D10 se muestran en las SEC ID N°: 7, 8, y 9, respectivamente. Las secuencias de aminoacido de las CDR1 de Vk de 4A6, 11E7, y 16D10 se muestran en SEC ID N°: 10, 11, y 12, respectivamente. Las secuencias de aminoacido de las CDR2 de Vk de 4A6, 11E7, y 16D10 se muestran en SEC ID N°: 13, 14, y 15, respectivamente. Las secuencias de aminoacido de las CDR3 de Vk de 4A6, 11E7, y 16D10 se muestran en SEC ID N°: 16, 17, y 18, respectivamente. Las regiones CDR son delineadas usando el sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a Glipicano-3 y que cada especificidad de union al antigeno se proporciona principalmente por las regiones CDR1, CDR2, y CDR3, las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de Vh,

: 19; y (b) : 20; y (b) : 21; y (b)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

y las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de Vk, pueden ser “mezcladas y apareadas” (es decir, CDRs a partir de diferentes anticuerpos pueden ser mezcladas y apareadas, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, CDR2 y CDR3 de Vh, y CDR1, CDR2 y CDR3 de Vk), para crear otras moleculas de enlace a anti-Glipicano-3 de la divulgacion.

El enlace de Glipicano-3 de tales anticuerpos “mezclados y apareados”, puede ser probado usando los ensayos de enlace descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, analisis ELISA, Biacore®). Preferiblemente, cuando las secuencias CDR de Vh son mezcladas y apareadas, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 a partir de una secuencia Vh particular, se reemplaza con una secuencia CDR estructuralmente similar. Del mismo modo, cuando las secuencias CDR de Vk son mezcladas y apareadas, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 a partir de una secuencia Vk particular, preferiblemente se reemplaza con una secuencia CDR estructuralmente similar. Sera facilmente aparente para el experto de habilidad ordinaria, que las nuevas secuencia Vh y Vl pueden ser creadas sustituyendo una o mas secuencias de region CDR de Vh y/o Vl, con secuencias estructuralmente similares a partir de las secuencias de CDR descritas aqui para anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10.

Por consiguiente, en otro aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antigeno del mismo que comprende:

(a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 1,2 y 3;

(b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 4, 5, y 6;

(c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 7, 8, y 9;

(d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 10, 11, y 12;

(e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 13, 14, y 15; y

(f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos

(g) seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 16, 17, y 18;

en donde el anticuerpo se une especificamente a Glipicano-3, preferiblemente, Glipicano-3 humano.

En una realizacion preferida, el anticuerpo comprende:

En otra realizacion preferida, el anticuerpo comprende:

Es bien conocido en la tecnica, que el dominio CDR3, independientemente de los dominios CDR1 y/o CDR2, solo puede determinar la especificidad de union de un anticuerpo para un antigeno afin y que multiples anticuerpos pueden predeciblemente, ser generados teniendo la misma especificidad de union basada en una secuencia CDR3 comun. Vease por ejemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (que describe la produccion de un anticuerpo anti-CD30 humanizado usando solamente el dominio variable de cadena pesada CDR3 de anticuerpo anti-CD30 murino Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (que describe anticuerpos de glicoprotema-2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

epitelial recombinantes (EGP-2), usando solamente la secuencia CDR de cadena pesada del anticuerpo anti-EGP-2 MOC-31 murino progenitor); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (que describe un panel de anticuerpos anti-integrina avP3 humanizados usando un dominio CDR3 variable de cadena ligera y pesada de un anticuerpo LM609 anti-integrina avP3 murino, en donde cada miembro de anticuerpo comprende una secuencia distinta fuera del dominio CDR3 y capaz de enlazar el mismo epitopo como el anticuerpo murino precursor con afinidades tan altas o superiores que el anticuerpo murino precursor); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:21612162 (1994) (que describe que el dominio CDR3 proporciona la contribucion mas significante al enlace de antigeno); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (que describe el injerto de las secuencias CDR3 de cadena pesada de tres Fabs (SI-1, SI-40, y SI-32) contra el aDn placental humano sobre la cadena pesada de un Fab anti-tetanos toxoide, con ello, reemplazando la CDR3 de cadena pesada existente y demostrando que el dominio CDR3 solo confiere especificidad de union); y Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (que describe estudios de injertos en donde la transferencia de solamente la cadena pesada de CDR3 de un LNA3 de Fab poliespecifico precursor a una cadena pesada de un anticuerpo p313 de Fab de enlace a tetanos toxoide IgG monoespecifico, fue suficiente para retener la especificidad de union del Fab precursor).

Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR de cadena ligera y/o pesada, a partir de un anticuerpo procedente de un animal humano o no humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse especificamente a Glipicano-3. Dentro de ciertos aspectos, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena ligera y/o pesada a partir de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de raton o rata, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse especificamente a Glipicano-3. Dentro de algunos aspectos, tales anticuerpos inventivos que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena ligera y/o pesada a partir de un anticuerpo no humano (a) son capaces de competir para enlace con; (b) retener las caracteristicas funcionales; (c) unirse al mismo epitopo; y/o (d) tener una afinidad de enlace similar como el anticuerpo no humano progenitor correspondiente.

Dentro de otros aspectos, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena ligera y/o pesada a partir de un anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido a partir de un animal no humano, en donde el anticuerpo humano es capaz de unirse especificamente a Glipicano-3. Dentro de otros aspectos, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena ligera y/o pesada a partir de un primer anticuerpo humano, tal como por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido a partir de un animal no humano, en donde el primer anticuerpo humano es capaz de unirse especificamente a Glipicano-3 y en donde el dominio CDR3 a partir del primer anticuerpo humano, reemplaza un dominio CDR en un anticuerpo humano que esta carente de especificidad de union para Glipicano-3, para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse especificamente a Glipicano-3. Dentro de algunos aspectos, tales anticuerpos inventivos que comprenden uno o mas dominios CDR3 de cadena ligera y/o pesada a partir del primer anticuerpo humano (a), son capaces de competir por enlace con; (b) retener las caracteristicas funcionales; (c) enlazar al mismo epitopo; y/o (d) tener una afinidad de enlace similar como el primer anticuerpo humano progenitor correspondiente. En aspectos preferidos, el primer anticuerpo humano es 4A6, 11E7, y 16D10.

Anticuerpos que tienen secuencias de linea germinal particulares

En ciertos aspectos, un anticuerpo de la divulgacion comprende una region variable de cadena pesada a partir de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de linea germinal particular y/o una region variable de cadena ligera a partir de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de linea germinal particular.

Por ejemplo, en un aspecto preferido, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que es el producto de, o se deriva a partir de un gen Vh 5-51 humano, en donde el anticuerpo se une especificamente a Glipicano-3. En otro aspecto preferido, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena ligera que es el producto de, o se deriva a partir de un gen Vk A27 humano, en donde el anticuerpo se une especificamente a Glipicano-3. En aun otro aspecto preferido, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, en donde el anticuerpo:

(a) comprende una region variable de cadena pesada que es el producto de, o procede de un gen Vh 5-51

humano (gen que codifica las secuencias de aminoacido expuestas en la SEC ID N°: 31);

(b) comprende una region variable de cadena ligera que es el producto de, procede de un gen Vk A27 humano

(gen que codifica las secuencias de aminoacido expuestas en la SEC ID N°: 33); y

(c) se une especificamente a Glipicano-3, preferiblemente, Glipicano-3 humano.

Ejemplos de anticuerpos que tienen Vh 5-51 y Vk A27 son 4A6, 11E7, y 16D10

Tal como se usa en el presente documento un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena ligera o pesada que son “el producto de" o “se derivan a partir de", una secuencia de linea germinal particular, si las regiones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

variables del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de lmea germinal humana. Tales sistemas incluyen, inmunizar genes de inmunoglobulina humana que portan el gen transgenico con el antigeno de interes, o seleccionar una biblioteca de gen de inmunoglobulina humana desplegado en el fago con el antigeno de interes. Un anticuerpo humano que es “el producto de" o “se deriva a partir de", una secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana, puede ser identificado como tal, comparando la secuencia de aminoacidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoacido de inmunoglobulinas de linea germinal humana, y seleccionar la secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana que es mas cercana en secuencia (es decir, mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es “el producto de" o “se deriva a partir de", una secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana particular, puede contener diferencias de aminoacido comparadas con la secuencia de linea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somaticas que se originan naturalmente o a introduccion intencional de mutacion dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado, normalmente es al menos 90 % identico en secuencia de aminoacidos a una secuencia de aminoacidos codificada por un gen de inmunoglobulina de linea germinal humana y contiene restos de aminoacido que identifican el anticuerpo humano como ser humano, cuando se compara con las secuencias de aminoacido de inmunoglobulina de linea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de linea germinal murina). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 95 %, o aun al menos, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % identico en secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de linea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado a partir de una secuencia de linea germinal humana particular, no exhibira mas de 10 diferencias de aminoacido partir de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de linea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano no puede exhibir mas de 5, o aun no mas de 4, 3, 2, o 1 diferencias de aminoacido a partir de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de linea germinal.

Anticuerpos Homologos

En otra realization mas, un anticuerpo de la divulgation comprende regiones variables de cadena ligera y pesada, que comprenden secuencias de aminoacido que son homologas a las secuencias de aminoacido de los anticuerpos preferidos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-Glipicano-2 de la invention.

Por ejemplo, la divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o portion de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera, en donde:

(a) la region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos, 80 %

homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 19, 20 y 21;

(b) la region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos, 80 %

homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 22, 23, y 24;

y

(c) el anticuerpo se une a Glipicano-3 humano con un Kd de 1x10-7 M o menor.

El anticuerpo puede tambien unirse a celulas CHO transfectadas con Glipicano-3 humano.

En varios aspectos, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.

En otros aspectos, las secuencias de aminoacido de Vh y/o Vl, pueden ser 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homologas a las secuencias expuestas anteriormente. Un anticuerpo que tiene regiones Vh y Vl que tienen alta homologia (es decir, 80 % o mayor) a las regiones Vh y Vl de las secuencias expuestas anteriormente, se pueden obtener por mutagenesis (por ejemplo, mutagenesis mediada por PCR o dirigida al sitio) de moleculas de acido nucleico que codifican SEC ID N°: 25, 26, 27, 28, 29, y 30, seguida por ensayos del anticuerpo alterado codificado para determinar la habilidad para unirse a Glipicano-3 usando los ensayos funcionales descritos en la presente.

Tal como se usa en el presente documento el porcentaje de homologia entre dos secuencias de aminoacido, es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias, es una funcion del numero de posiciones identicas portadas por las secuencias (es decir, % de homologia = # de posiciones identicas/# total de posiciones x 100), tomando en cuenta el numero de aperturas, y la longitud de cada apertura, las cuales necesitan ser introducidas para alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y determinacion del porcentaje de identidad entre las dos secuencias, puede ser realizada usando algoritmo matematico, como se describe en los ejemplos no limitantes posteriores.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacido, puede ser determinado usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), el cual ha sido incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de resido de peso PAM120, un defecto de longitud de apertura de 12 y un defecto de apertura de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoacido, puede ser determinado usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), el cual ha sido incorporado en el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

programa GAP en el paquete de software de GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando ya sea una matriz de Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de apertura de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4, y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.

Adicionalmente o como alternativa, las secuencias de proteina de la presente invention, pueden ademas, ser usadas como una “secuencia pregunta” para realizar una busqueda contra la base de datos publica para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales busquedas pueden ser realizadas usando el programa XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de proteina por BLAST, pueden ser realizadas con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabras = 3, para obtener homologos de secuencia de aminoacidos a las moleculas de anticuerpo de la invencion. Para obtener alineamientos abiertos para propositos de comparacion, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, los parametros de defecto de los programas respectivos pueden ser usados (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Anticuerpos con modificaciones conservativas

En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invencion comprende una region variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde una o mas de estas secuencias de CDR comprende secuencias de aminoacido especificas, basadas en los anticuerpos preferidos descritos aqui (por ejemplo, 4A6, 11E7, y 16D10), o modificaciones conservativas de los mismos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-Glipicano-3 de la invencion. Por consiguiente, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o portion de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde:

(a) la secuencia CDR3 de region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en secuencias de aminoacido de SEC ID N°: 7, 8, y 9, y modificaciones conservativas de las mismas;

(b) la secuencia CDR3 de region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 16, 17, y 18, y modificaciones conservativas de las mismas; y

(c) el anticuerpo se une a Glipicano-3 humano con un Kd de 1x10-7 M o menor. El anticuerpo puede tambien unirse a celulas CHO transfectadas con Glipicano-3 humano.

En un aspecto preferido, la secuencia CDR2 de region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en secuencias de aminoacido de SEC ID N°: 4, 5, y 6, y modificaciones conservativas de las mismas; y la secuencia CDR2 de region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en secuencias de aminoacido de SEC ID N°: 13, 14, y 15, y modificaciones conservativas de las mismas. En otro aspecto preferido, la secuencia CDR1 de region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en secuencias de aminoacido de SEC ID N°: 1, 2, y 3 y modificaciones conservativas de las mismas; y la secuencia CDR1 de region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en secuencias de aminoacido de SEC ID N°: 10, 11, y 12, y modificaciones conservativas de las mismas.

En varios aspectos, los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quimericos.

Tal como se usa en el presente documento el termino “modificaciones de secuencia conservativa”, se pretende para referirse a modificaciones de aminoacido que no afectan o alteran significantemente las caracteristicas de enlace del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacido. Tales modificaciones conservativas incluyen, sustituciones de aminoacido, adiciones y supresiones. Las modificaciones pueden ser introducidas en un anticuerpo de la invencion por tecnicas estandares conocidas en la tecnica, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoacido conservativo son unas en las cuales, el residuo de aminoacido es reemplazado con un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Familias de restos de aminoacido que tienen cadenas laterales similares, han sido definidas en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidicas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). De este modo, uno o mas restos de aminoacido dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invencion, pueden ser reemplazadas con otros restos de aminoacido a partir de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede ser probado para determinar la capacidad para unirse a Glipicano-3 usando los ensayos funcionales descritos en la presente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La secuencia CDR1 de cadena pesada de SEC ID N°: 1, 2, o 3, puede comprender una o mas modificaciones de secuencia conservativa, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacido; la secuencia CDR1 de cadena ligera de SEC ID N°: 10, 11, o 12, puede comprender una o mas modificaciones de secuencia conservativa, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacido; la secuencia CDR2 de cadena pesada mostrada en la SEC ID N°: 4, 5, o 6, puede comprender una o mas modificaciones de secuencia conservativa, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacido; la secuencia CDR2 de cadena ligera mostrada en SEC ID N°: 13, 14, o 15, puede comprender una o mas modificaciones de secuencia conservativa, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacido; la secuencia CDR3 de cadena pesada mostrada en SEC ID N°: 7, 8, o 9, puede comprender una o mas modificaciones de secuencia conservativa, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacido; y/o la secuencia CDR3 de cadena ligera mostrad en SEC ID N°: 16, 17, o 18, puede comprender una o mas modificaciones de secuencia conservativa, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o mas sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacido.

Anticuerpos que se unen al mismo epitopo que los anticuerpos anti-glipicano-3 de la invencion

En otro aspecto, la divulgacion proporciona anticuerpos que se enlazan al mismo epitopo en Glipicano-3 humano, como cualquiera de los anticuerpos monoclonales Glipicano-3 de la invencion (es decir, anticuerpos que tienen la capacidad para competir cruzado por enlace a Glipicano-3, con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invencion). En aspectos preferidos, el anticuerpo de referencia para estudios de competicion cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal 4A6 (que tiene secuencias Vh y Vl como se muestra en SEC ID N°: 19 y 22, respectivamente), el anticuerpo monoclonal 11E7 (que tiene secuencias Vh y VL como se muestra en SEC ID N°: 20 y 23, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 16D10 (que tiene secuencias Vh y Vl como se muestra en SEC ID N°: 21 y 24, respectivamente). Tales estudios de competicion cruzada, pueden ser identificados basados en su capacidad para competir cruzado con 4A6, 11E7, o 16D10 en ensayos de enlace de Glipicano-3 estandares. Por ejemplo, analisis Biacore, ensayos ELISA o citometria de flujo, pueden ser usados para demostrar la competicion cruzada con los anticuerpos de la invencion actual. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir el enlace de, por ejemplo, 4A6, 11E7, o 16D10, a Glipicano-3 humano, demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con 4A6, 11E7, o 16D10 por enlace a Glipicano-3 humano y de este modo, unirse al mismo epitopo en Glipicano-3 humano como 4A6, 11E7, o 16D10. En un aspecto preferido, el anticuerpo que se une al mismo epitopo en Glipicano-3 humano como 4A6, 11E7, o 16D10 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos pueden ser preparados y aislados como se describe en los Ejemplos.

Anticuerpos modificados y disenados por ingenieria genetica

Un anticuerpo de la divulgacion, ademas puede ser preparado usando un anticuerpo que tiene una o mas de las secuencias Vh y/o Vl descritas en la presente, puede ser usado como material de partida para disenar por ingenieria un anticuerpo modificado, en el cual, el anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas comparadas con el anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede ser disenado por ingenieria modificando uno o mas aminoacidos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo, dentro de una o mas regiones CDR y/o dentro de una o mas regiones marco conservadas. Adicionalmente o como alternativa, un anticuerpo puede ser disenado por ingenieria modificando restos dentro de la(s) region(es) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) funcion(es) efectoras del anticuerpo.

En ciertas realizaciones, el injerto de CDR puede ser usado para disenar por ingenieria regiones variables de anticuerpos. Los anticuerpos interactuan con antigenos objetivo predominantemente a traves de restos de aminoacido que son localizados en las seis regiones que determinan la complementariedad de cadena pesada y ligera (CDRs). Por esta razon, las secuencias de aminoacido dentro de las CDRs, son mas dispersas entre anticuerpos individuales que secuencias fuera de las CDRs. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoria de interacciones anticuerpo-antigeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan propiedades de anticuerpos especificos que se originan naturalmente, construyendo vectores de expresion que incluyen secuencias CDR, a partir del anticuerpo especifico que se origina naturalmente injertado sobre las secuencias marco conservadas a partir de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (vease, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Patente de Estados Unidos n.° 5.225.539 por Winter, y Patentes de Estados Unidos n.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 to Queen et al.).

Por consiguiente, otro aspecto de la invencion pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 1,2, y 3, SEC ID N°: 4, 5, y 6, y SEC ID N°: 7, 8, y 9, respectivamente, y una region variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 10, 11, y 12, SEC ID N°: 13, 14, y 15, y SEC ID N°: 16, 17, y 18, respectivamente. De este modo, tales anticuerpos que contienen las secuencias CDR de Vh y Vl de anticuerpos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

monoclonales 4A6, 11E7, o 16D10, pueden todavia contener diferentes secuencias marco conservadas a partir de estos anticuerpos.

Dichas secuencias marco conservadas se pueden obtener a partir de bases de datos publicas de ADN o referencias publicadas que incluyen secuencias de gen de anticuerpo de linea germinal. Por ejemplo, secuencias de ADN de iinea germinal para genes de region variable de cadena ligera y pesada humana, se pueden encontrar en la base de datos de la secuencia de linea germinal humana “VBase” (disponible en la Internet en
www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), asi como tambien en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germline VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836. Como otro ejemplo, las secuencias de ADN de linea germinal para genes de region variable de cadena ligera y pesada, se pueden encontrar en la base de datos de Genbank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de linea germinal de cadena pesada encontradas en el raton HCo7 HuMAb, estan disponibles en los numeros de referencia de GenBank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT_024637). Como otro ejemplo, las siguientes secuencias de linea germinal de cadena pesada encontradas en el raton HCo12 HuMAb, estan disponibles en los numeros de referencia de GenBank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 5-51 (NG_0010109 y NT_024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) y 3-23 (AJ406678).

Las secuencias de proteina de anticuerpo, son comparadas contra una base de datos de secuencia de proteina compilada, usando uno de los metodos de busqueda de similitud de secuencia llamado, el Gapped BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), el cual es bien conocido por aquellos expertos en la tecnica. El BLAST es un algoritmo heuristico en que, un alineamiento estadisticamente significante entre la secuencia de anticuerpo y la secuencia de base de datos, probablemente esta conteniendo los pares de segmento de alto registro (HSP) de palabras alineadas. Los segmentos de pares cuyos registros no pueden ser mejorados por extension o recortes son llamados un hit. Brevemente, las secuencias de nucleotido de origen vBaSE (
http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php), son traducidas y la region entre y que incluye la region marco conservada FR1 hasta FR3, son retenidas. Las secuencias de base de datos tienen una longitud promedio de 98 restos. Las secuencias duplicadas las cuales son emparejamientos exactos sobre la longitud completa de la proteina, son removidas. Una busqueda BLAST para proteinas usando el programa blastp con parametros estandares, de defecto, excepto el filtro de baja complejidad, el cual es cambiado, y la matriz de sustitucion de BLOSUM62, filtra por 5 hits superiores proporcionando emparejamientos de secuencia. Las secuencias de nucleotido son traducidas en todas las seis estructuras y la estructura sin codones de detencion en el segmento de emparejamiento de la secuencia de base de datos se considera el hit potencial. Esto es en cambio confirmado usando el programa BLAST tblastx, el cual traduce la secuencia de anticuerpo en todas las seis estructuras y compara aquellas traducciones a las secuencias de nucleotido VBASE dinamicamente traducidas en todas las seis estructuras.

Las identidades son emparejamientos de aminoacidos exactos entre la secuencia de anticuerpo y la base de datos de proteina sobre la longitud completa de la secuencia. Los positivos (identidades + emparejamiento de sustitucion), no son identicos, pero las sustituciones de aminoacido son guiadas por la matriz de sustitucion de BLOSUM62. Si las secuencias de anticuerpo aparean dos de las secuencias de base de datos con la misma identidad, el hit con mas positivos podria ser decidido por ser el hit de secuencia de emparejamiento.

Las secuencias marco conservadas preferidas para uso en los anticuerpos de la invencion, son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco conservadas usadas por anticuerpos seleccionados de la invencion, por ejemplo, similares a las secuencias marco conservadas Vh 5-51 (SEC ID N°: 31) y/o las secuencias marco conservadas Vk A27 (SEC ID N°: 33), usadas por los anticuerpos monoclonales preferidos de la invencion. Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de Vh, y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de Vk, pueden ser injertadas sobre las regiones marco conservadas que tienen las secuencias identicas como aquellas encontradas en el gen de inmunoglobulina de linea germinal a partir del cual se deriva la secuencia de armazon, o las secuencias CDR pueden ser injertadas sobre las regiones marco conservadas que contienen una o mas mutaciones comparadas con las secuencias de linea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos, es benefico mutar restos dentro de las regiones marco conservadas para mantener o intensificar la capacidad de enlace al antigeno del anticuerpo (vease por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 por Queen et al.).

Otro tipo de modificacion de region variable es para mutar restos de aminoacido dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de Vh y/o Vk, para con ello, mejorar uno o mas propiedades de enlace (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interes. La mutagenesis mediada por PCR o mutagenesis dirigida al sitio, puede ser realizada para introducir la(s) mutacion(es) y el efecto en el enlace de anticuerpo, u otra propiedad funcional de interes puede ser evaluada en ensayos in vitro o in vivo, como se describe en la presente y se proporciona en los Ejemplos. Preferiblemente, son introducidas modificaciones conservativas (como se discute anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacido, pero son preferiblemente, sustituciones. Es mas, son alteradas normalmente no mas de uno, dos, tres, cuatro o cinco restos dentro de una region CDR.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Por consiguiente, en otro aspecto, la presente descripcion proporciona anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3 aislados, o porciones de enlace al antigeno de los mismos, que comprenden una region variable de cadena pesada que comprende: (a) una region CDR1 de Vh que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 1,2, y 3, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacido, comparada con SEC ID N°: 1, 2 y 3; (b) una region CDR2 de Vh que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 4, 5, y 6, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacido, comparada con SEC ID N°: 4, 5, y 6; (c) una region CDR3 de Vh que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 7, 8, y 9, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacido, comparada con SEC ID N°: 7, 8, y 9; (d) una region CDR1 de Vk que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 10, 11, y 12, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacido, comparada con SEC ID N°: 10, 11, y 12; (e) una region CDR2 de Vk region que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 13, 14, y 15, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacido, comparada con SEC ID N°: 13, 14, y 15; y (f) una region CDR3 de Vk que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 16, 17, y 18, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacido, comparada con SEC ID N°: 16, 17, y 18.

Anticuerpos de la invencion disenados por ingenieria, incluyen aquellos en los cuales, las modificaciones se han hecho a restos de armazon dentro de Vh y/o Vk, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones de armazon se hacen para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un procedimientos es “retromutar” uno o mas restos de armazon a la secuencia de linea germinal correspondiente. Mas especificamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutacion somatica puede contener restos de armazon que difieren de la secuencia de iinea germinal a partir de la cual se deriva el anticuerpo. Tales restos pueden ser identificados comparando las secuencias armazon de anticuerpo a las secuencias de linea germinal a partir de las cuales se deriva el anticuerpo. Por ejemplo, para 4A6, usando el sistema de numeracion Kabat, el resto de aminoacido n.° 73 (dentro de FR3) de Vh es una arginina (SEC ID N°: 19) mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es lisina (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, las mutaciones somaticas pueden ser “retromutadas” a la secuencia de linea germinal mediante, por ejemplo, la mutagenesis dirigida al sitio o mutagenesis mediada por PCR (por ejemplo, resto n.° 73 (resto n.° 8 de fR3) del Vh de 4A6 pueden ser “retromutadas” a partir de arginina a lisina).

Como otro ejemplo, para 4A6, el resto de aminoacido n.° 76 (dentro de FR3) de Vh es arginina (SEC ID N°: 19),

mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una serina (SEC ID N°: 31).

Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 76 (resto n.° 11 de FR3) del Vh de 4A6 puede ser “retromutado” a partir de arginina una serina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 4A6, el resto de aminoacido n.° 89 (dentro de FR3) de Vh es leucina (SEC ID N°: 19), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una metionina (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 89 (resto n.° 27 de FR3) del Vh de 4A6 puede ser “retromutado” a partir de leucina a metionina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 11E7, el resto de aminoacido n.° 76 (dentro de FR3) de Vh es arginina (SEC ID N°: 20),

Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 76 (resto n.° 11 de FR3) del Vh de 11E7 puede ser “retromutado” a partir de arginina una serina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 10 (dentro de FR1) de Vh es aspartato (SEC ID N°: 21), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es un glutamato (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 10 (resto n.° 10 de FR1) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de aspartato a glutamato. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 12 (dentro de FR1) de Vh es treonina (SEC ID N°: 21), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una lisina (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 12 (resto n.° 12 de FR1) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de treonina a lisina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 24 (dentro de FR1) de Vh es valina (SEC ID N°: 21),

mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una glicina (SEC ID N°: 31).

Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuration de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 24 (resto n.° 24 de FR1) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de valina a glicina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invention.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 28 (dentro de FR1) de Vh es arginina (SEC ID N°: 21),

Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 28 (resto n.° 28 de FR1) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de arginina una serina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 37 (dentro de FR2) de Vh es metionina (SEC ID N°: 21), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una valina (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 37 (resto n.° 2 de FR2) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de metionina a valina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 41 (dentro de FR2) de Vh es serina (SEC ID N°: 21),

mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una prolina (SEC ID N°: 31).

Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 41 (resto n.° 6 de FR2) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de serina a prolina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 66 (dentro de FR3) de Vh es histidina (SEC ID N°: 21), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una glutamina (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 66 (resto n.° 1 de FR3) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de histidina a glutamina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 76 (dentro de FR3) de Vh es asparagina (SEC ID N°: 21), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una serina (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 76 (resto n.° 11 de FR3) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de asparagina a serina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 81 (dentro de FR3) de Vh es arginina (SEC ID N°: 21), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal VH 5-51 correspondiente es una glutamina (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 81 (resto n.° 16 de FR3) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de arginina a glutamina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

Como otro ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 89 (dentro de FR3) de Vh es isoleucina (SEC ID N°: 21), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vh 5-51 correspondiente es una metionina (SEC ID N°: 31). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 89 (resto n.° 27 de FR3) del Vh de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de isoleucina a metionina. Tales anticuerpos “retromutados”, tambien estan propuestos para estar abarcados por la invencion.

De manera similar, la invencion se proporciona para la retromutacion de restos de armazon en la cadena ligera. Por ejemplo, para 16D10, el resto de aminoacido n.° 3 (dentro de FR1) de Vk es leucina (SEC ID N°: 24), mientras este residuo en la secuencia de linea germinal Vk A27 es una valina (SEC ID N°: 33). Para devolver a las secuencias de region marco conservada a su configuracion de linea germinal, por ejemplo, el resto n.° 3 (resto n.° 3 de FR1) del Vk de 16D10 puede ser “retromutado” a partir de leucina a valina.

Otro tipo de modification de armazon involucra mutar uno o mas restos dentro de la region marco conservada, o aun dentro de una o mas regiones CDR, para remover los epitopos de celulas T para con ello, reducir el potencial de inmunogenicidad del anticuerpo. Este procedimiento es tambien referido como “desinmunizacion” y se describe en detalle adicional en la Publication de Patente de Estados Unidos N°. 20030153043 por Carr et al.

Ademas, o de forma alternativa a modificaciones hechas dentro del armazon o regiones CDR, anticuerpos de la invencion pueden ser disenados por ingenieria para incluir modificaciones dentro de la region Fc, normalmente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media del suero, fijacion de complemento, enlace al receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente del antigeno. Ademas, un anticuerpo de la invencion puede ser quimicamente modificado (por ejemplo, una o mas porciones quimicas pueden ser unidas al anticuerpo), o ser modificadas para alterar su glicosilacion, nuevamente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe en mas detalle abajo. La numeration de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

restos en la region Fc es aquella del mdice de Estados Unidos de Kabat.

En una realizacion, la region bisagra de CH1 es modificada, de manera tal que el numero de restos de cisteina en la region bisagra se altera, por ejemplo, incrementa o reduce. Este procedimiento se describe ademas, en la Patente de Estados Unidos n.° 5.677.425 por Bodmer et al. El numero de restos de cisteina en la region bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el montaje de las cadenas ligera y pesada o para incrementar o reducir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realizacion, la region bisagra Fc de un anticuerpo es mutada para reducir la vida media biologica del anticuerpo. Mas especificamente, una o mas mutaciones de aminoacido son introducidas en la region de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de articulacion Fc, de manera que el anticuerpo tiene enlace de proteina A estafilococica alterada (SpA), con relacion al enlace SpA del dominio de articulacion Fc nativo. Este procedimiento se describe en detalle adicional en la Patente de Estados Unidos n.° 6.165.745 por Ward et al.

En otra realizacion, el anticuerpo es modificado para incrementar su vida media biologica. Son posibles varios procedimientos. Por ejemplo, se pueden introducir una o mas de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, y T256F, como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 6.277.375 por Ward. Como alternativa, para incrementar la vida media biologica, el anticuerpo puede ser alterado dentro de la region CH1 o Cl para contener un epitopo de enlace al receptor salvaje, tomado a partir de dos bucles de un dominio CH2 de una region Fc de un IgG, como se describe en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.869.046 y 6.121.022 por Presta et al.

En otras realizaciones mas, la region Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoacido con un residuo diferente de aminoacido, para alterar la(s) funcion(es) efectora(s) del anticuerpo. Por ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados a partir de los restos de aminoacidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322, pueden ser reemplazados con un residuo de aminoacido diferente, de manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada para un ligando efector, pero retiene la capacidad de enlace al antigeno del anticuerpo precursor. El ligando efector al cual la afinidad es alterada, puede ser por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este procedimiento es descrito en detalle adicional en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas por Winter et al.

En otro ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados a partir de los restos de aminoacidos 329, 331 y 322, pueden ser reemplazados con un residuo de aminoacido diferente, de manera que el anticuerpo tiene una union a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento abolida o reducida (CDC). Este procedimiento se describe en detalle adicional en las Patentes de Estados Unidos n.° 6.194.551 por Idusogie et al.

En otro ejemplo, uno o mas restos de aminoacido dentro de las posiciones de aminoacido 231 y 239, son alterados para con ello, alterar la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este procedimiento se describe ademas, en la Publicacion de PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

En otro ejemplo mas, la region Fc es modificada para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o, incrementar la afinidad del anticuerpo para un receptor Fcy modificando uno o mas aminoacidos en las posiciones siguientes: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258,

265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305,

307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382,

388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este procedimiento se describe ademas en la Publicacion de PCT WO 00/42072 por Presta. Sin embargo, los sitios de enlace en IgG 1 humano para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn, han sido mapeados y se han descrito variantes con enlace mejorad (vease, Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Mutaciones especificas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339, se mostraron por mejorar el enlace a FcyRIII. Adicionalmente, se mostraron las siguientes combinaciones mutantes para mejorar el enlace de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

En otra realizacion adicional, la glicosilacion de un anticuerpo se modifica. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilacion). La glicosilacion puede ser alterada para, por ejemplo, incrementar la afinidad del anticuerpo por el antigeno. Tales modificaciones de carbohidratos pueden ser realizadas para, por ejemplo, alterar uno o mas sitios de glicosilacion dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, una o mas sustituciones de aminoacido se pueden hacer, que resulten en eliminacion de uno o mas sitios de glicosilacion de armazon de region variable, para con ello, eliminar la glicosilacion en tal sitio. Tal glicosilacion puede incrementar la afinidad del anticuerpo para el antigeno. Tal procedimiento se describe en detalle adicional en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.714.350 y 6.350.861 por Co et al.

Adicionalmente o como alternativa, un anticuerpo puede ser elaborado para que tenga un tipo alterado de glicosilacion, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de restos fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras GlcNac bisectantes incrementadas. Tales patrones de glicosilacion alterados han sido demostrados por incrementar la capacidad de ADCC de anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden realizar, mediante por ejemplo, expresar el anticuerpo en una celula hospedadora con maquinaria de glicosilacion alterada. Las celulas con maquinaria de glicosilacion alterada, han sido descritas en la tecnica y pueden

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ser usadas como celulas hospedadoras en las cuales expresar los anticuerpos recombinantes de la invention para con ello, producir un anticuerpo con glicosilacion alterada. Por ejemplo, las lmeas celulares Ms704, Ms705, y Ms709, carecen del gen fucosiltransferasa, FUT8 (alfa(1,6)fucosiltransferasa), de manera que los anticuerpos expresados en las linea celulares Ms704, Ms705, y Ms709, carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las lmeas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 FUT8-/-, se crearon por el rompimiento objetivo del gen FUT8 en celulas CHO/DG44 usando dos vectores de reemplazo (vease Publication de Patente de Estados Unidos n.° 20040110704 por Yamane et al. y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como otro ejemplo, el documento EP 1.176.195 por Hanai et al., describe una linea celular con un gen FUT funcionalmente interrumpido, el cual codifica una fucosil transferasa, de manera que los anticuerpos expresados en tal linea celular, exhiben hipofucosilacion reduciendo o eliminando la enzima alfa-1,6- unida relacionada. Hanai et al., tambien describe lineas celulares las cuales tienen una baja actividad enzimatica para agregar fucosa a N-acetilglucosamina que se une a la region Fc del anticuerpo o que no tiene la actividad enzimatica, por ejemplo, la linea de celulas de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La Publicacion de PCT WO 03/035835 por Presta, describe que lineas de celulas celular CHO variantes, celulas Lec13, con capacidad reducida para unirse a fucosa a carbohidratos Asn(297)-ligados, tambien resulta en hipofucosilacion de anticuerpos expresados en tal hospedera (vease tambien, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicacion de PCT WO 99/54342 por Umana et al., describe lineas celulares disenadas por ingenieria, para expresar glicosil transferasas que modifican glicoproteinas (por ejemplo, beta(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera tal que los anticuerpos expresados en las lineas celulares disenadas por ingenieria, exhiben estructuras GlcNac bisectantes incrementadas, las cuales resultan en actividad ADCC incrementada de los anticuerpos (vease tambien, Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Como alternativa, los restos del anticuerpo pueden ser desdoblados usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa, remueve restos fucosilo a partir de anticuerpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Otra modification de los anticuerpos del presente documento que se contempla por la invencion es pegilacion. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, incrementar la vida media biologica del anticuerpo (por ejemplo, suero). Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un ester reactivo o derivado aldehido de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o mas grupos PEG llegan a estar unidos al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilacion se lleva a cabo via una reaction de acilacion o una reaction de alquilacion, con una molecula PEG reactiva (o un polimero soluble en agua reactivo analogo). Tal como se usa en el presente documento el termino “polietilenglicol", se pretende para abarcar cualquiera de las formas de PEG que han sido usadas para derivatizar otras proteinas, tales como monoalcoxi (C1-C10) o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a ser pegilado es un anticuerpo aglicosilado. Los metodos para pegilar proteinas se conocen en la tecnica y pueden ser aplicados a los anticuerpos de la invencion. Vease por ejemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al. y EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

Propiedades fisicas del anticuerpo

Los anticuerpos de la presente invencion, pueden ser ademas caracterizados por las varias propiedades fisicas de los anticuerpos anti-Glipicano-3. Pueden ser usados varios ensayos para detectar y/o diferenciar diferentes clases de anticuerpos basadas en estas propiedades fisicas.

En algunas realizaciones, anticuerpos de la presente invencion pueden contener uno o mas sitios de glicosilacion en ya sea la region variable de cadena ligera o pesada. La presencia de uno o mas sitios de glicosilacion en la region variable, puede resultar en inmunogenicidad incrementada del anticuerpo o una alteration del pK del anticuerpo, debido a enlace de antigeno alterado (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA y Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R- 56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). La glicosilacion ha sido mostrada por ocurrir en porciones que contienen la secuencia N-X-S/T. La glicosilacion de region variable puede ser probada usando un ensayo Glycoblot, el cual desdobla el anticuerpo para producir un Fab, y despues examina para glicosilacion usando un ensayo que mide la oxidation de peryodato y formation de base Schiff. Como alternativa, la glicosilacion de region variable puede ser probada usando cromatografia de luz Dionex (Dionex-LC), con sacaridos desdoblados a partir de un Fab en monosacaridos, y analiza el contenido de sacarido individual. En algunos casos, es preferido tener un anticuerpo anti-Glipicano-3 que no contiene glicosilacion de region variable. Esto se puede lograr ya sea, seleccionando anticuerpos que no contienen la portion de glicosilacion en la region variable, o mutando restos dentro de la porcion de glicosilacion usando tecnicas estandares bien conocidas en la tecnica.

En una realization preferida, los anticuerpos de la presente invencion, no contienen sitios de isomerismo de asparagina. Una desamidacion o efecto de acido isoaspartico puede ocurrir en secuencias N-G o D-G, respectivamente. La desamidacion o efecto de acido isospartico, resulta en la creation de acido isospartico el cual reduce la estabilidad de un anticuerpo para crear una estructura quebrada de un termino de cadena lateral en lugar de la cadena principal. La creacion de acido aspartico puede ser medida usando un ensayo iso-quant, el cual usa HPLC de fase inversa para probar para el acido aspartico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Cada anticuerpo tendra un punto isoelectrico unico (pI), pero en general, los anticuerpos caeran en el intervalo de pH de entre 6 y 9,5. El pI para un anticuerpo IgG1, normalmente cae dentro del intervalo de pH de 7-9,5 y el pI para un anticuerpo IgG4, normalmente cae dentro del intervalo de pH de 6-8. Los anticuerpos pueden tener un pI que esta fuera de este intervalo. Aunque los efectos son en general desconocidos, existe especulacion de que los anticuerpos con un pI fuera del intervalo normal, pueden tener alguna inestabilidad y despliegue bajo condiciones in vivo. El punto isoelectrico puede ser probado usando un ensayo de enfoque isoelectrico capilar, el cual crea un gradiente de pH y puede utilizar enfoque laser para exactitud incrementada (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-Glipicano-3 que contenga un valor pI que cae en el intervalo normal. Esto se puede lograr ya sea, seleccionando anticuerpos con un pI en el intervalo normal, o mutando restos de superficie cargados, usando tecnicas estandares bien conocidas en la tecnica.

Cada anticuerpo tendra una temperatura de fusion que es indicativa de la estabilidad termica (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Una estabilidad termica superior, indica mayor estabilidad de anticuerpo total in vivo. El punto de fusion de un anticuerpo puede ser medido usando tecnicas tales como calorimetria de exploration diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). Tmi, indica la temperatura del despliegue inicial del anticuerpo. Tm2 indica la temperatura del despliegue completo del anticuerpo. En general, se prefiere que la Tmi de un anticuerpo de la presente invention, sea mayor de 60 °C, preferiblemente, mayor de 65 °C, aun mas preferiblemente, mayor de 70 °C. Como alternativa, la estabilidad termica de un anticuerpo puede ser medida usando dicroismo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

En una realization preferida, son seleccionados anticuerpos que no se degraden rapidamente. La fragmentation de un anticuerpo anti-Glipicano-3 puede ser medida usando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS, como es bien entendido en la tecnica (Alexander AJ y Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

En otra realizacion preferida, son seleccionados anticuerpos que tengan efectos de agregacion minimos. La agregacion puede conducir a activation de una respuesta inmune indeseada y/o propiedades farmacocineticas alteradas o desfavorables. En general, los anticuerpos son aceptables con agregacion de 25 % o menos, preferiblemente, 20 % o menos, aun mas preferiblemente, 15 % o menos, aun mas preferiblemente, 10 % o menos y aun mas preferiblemente, 5 % o menos. La agregacion puede ser medida por varias tecnicas bien conocidas en la tecnica, que incluyen cromatografia de exclusion de tamano (SEC), cromatografia liquida de alta resolution (HPLC) y dispersion de luz, para identificar monomeros, dimeros, trimeros o multimeros.

Metodos para disenar anticuerpos por ingenieria genetica

Como se discute anteriormente, los anticuerpos anti-Glipicano-3 que tienen secuencias Vh y Vk descritas en la presente, pueden ser usados para crear nuevos anticuerpos anti-Glipicano-3, modificando las secuencias Vh y/o Vk, o la(s) region(es) constante(s) unidas a estas. De este modo, en otro aspecto de la divulgation, las caracteristicas estructurales de un anticuerpo anti-Glipicano-3 de la invencion, por ejemplo, 4A6, 11E7, y 16D10, son usadas para crear anticuerpos anti-Glipicano-3 estructuralmente relacionados, que retienen al menos, una propiedad funcional de los anticuerpos de la invencion, tales como enlace a Glipicano-3 humano. Por ejemplo, una o mas regiones CDR de 4A6, 11E7, y 16D10, o mutaciones de las mismas, pueden ser combinadas recombinantemente con regiones marco conservadas conocidas y/o otras CDRs para crear anticuerpos anti-Glipicano-3, recombinantemente disenados por ingenieria, adicionales, de la divulgacion, como se discute anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la section previa. El material de partida para el metodo disenado por ingenieria es uno o mas de las secuencias Vh y/o Vk proporcionadas aqui, o una o mas regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo disenado por ingenieria, no es necesario preparar actualmente (es decir, expresar como una proteina), un anticuerpo que tiene una o mas secuencias Vh y/o Vk proporcionadas aqui, o una o mas regiones cDr de las mismas. Preferentemente, la information contenida en la(s) secuencia(s), se usa como el material de partida para crear una secuencia de “segunda generation”, derivada de la(s) secuencia(s) original(es) y despues, la(s) secuencia(s) de “segunda generation”, se prepara y expresa como una proteina.

Por consiguiente, en otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para preparar un anticuerpo anti-Glipicano que comprende:

(a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de region variable de cadena pesada que comprende, una secuencia CDR1 seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 1, 2, y 3, una secuencia CDR2 seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 4, 5, y 6, y/o una secuencia CDR3 seleccionada entre el grupo que consiste en SEC Id N°: 7, 8, y 9; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de region variable de cadena ligera que comprende, una secuencia CDR1 seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N°: 10, 11, y 12, una secuencia CDR2 seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 13, 14, y 15, y/o una secuencia CDR3 seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 16, 17, y 18;

(b) alterar al menos, un residuo de aminoacido dentro de la secuencia de anticuerpo de region variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de region variable de cadena ligera, para crear al menos, una secuencia de anticuerpo alterada; y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una protema.

Pueden usarse tecnicas de biologia molecular estandares, para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.

Preferiblemente, el anticuerpo codificado por la(s) secuencia(s) de anticuerpo alterada(s) es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-Glipicano-3 descritos en la presente, en los cuales las propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a:

(i) unirse a Glipicano-3 humano con un Kd de 1x10-7 M o menor;

(ii) unirse a celulas CHO humanas transfectadas con Glipicano-3.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden ser valoradas usando ensayos estandares disponibles en la tecnica, y/o descritos en la presente, tales como aquellos expuestos en los Ejemplos (por ejemplo, citometria de flujo, ensayos de enlace).

En ciertos aspectos de los metodos de la invencion de anticuerpos disenados por ingenieria, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente o selectivamente, junto con toda o parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti- Glipicano-3, y los anticuerpos anti-Glipicano-3 modificados resultantes, pueden ser seleccionados para determinar actividad de enlace y/o otras propiedades funcionales como se describe en la presente. Los metodos mutacionales han sido descritos en la tecnica. Por ejemplo, la Publicacion de PCT WO 02/092780 por Short, describe metodos para crear y seleccionar mutaciones de anticuerpo usando mutagenesis de saturacion, montaje de ligacion sintetica, o una combinacion de los mismos. Como alternativa, la Publicacion de PCT WO 03/074679 por Lazar et al., describe metodos para usar metodos de seleccion por computadora para optimizar propiedades fisicoquimicas de anticuerpos.

Moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos de la invencion

Otro aspecto de la invencion concierne a moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos de la invencion. Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas completas, en un lisado celular, o en forma sustancialmente pura o parcialmente purificada. Un acido nucleico es “aislado” o “considerado sustancialmente puro”, cuando se purifica lejos de otros componentes u otros contaminantes celulares, por ejemplo, otros acidos nucleicos o proteinas celulares, por tecnicas estandares, que incluyen tratamiento SDS/alcalino, bandas de CsCl, cromatografia de columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la tecnica. Vease, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, New York. Un acido nucleico de la invencion puede ser por ejemplo, ADN o ARN y puede o no puede contener secuencias intronicas. En una realizacion preferida, el acido nucleico es una molecula de ADNc.

Los acidos nucleicos de la invencion se pueden obtener usando tecnicas de biologia molecular estandar. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgenicos que llevan genes de inmunoglobulina humana como se describe ademas abajo), los ADNsc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo hecho por el hibridoma, se pueden obtener por amplificacion de PCR estandar o tecnicas de clonacion de ADNc. Para anticuerpos obtenidos de una biblioteca de gen de inmunoglobulina (por ejemplo, usando tecnicas de despliegue de fago), el acido nucleico que codifica el anticuerpo puede ser recuperado a partir de la biblioteca.

Las moleculas de acido nucleico preferidas de la invencion, son aquellas que codifican las secuencias de Vh y Vl de los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, o 16D10. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias Vh de 4A6, 11E7, o 16D10, se muestran en SEC ID N°: 25, 26, y 27, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de Vl de 4A6, 11E7, o 16D10, se muestran en sEc ID N°: 28, 29, y 30, respectivamente.

Otros acidos nucleicos preferidos de la invencion, son acidos nucleicos que tienen al menos, 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia, con una de las secuencias mostradas en las SEC ID N°: 25, 26, 27, 28, 29, y 30, en las cuales los acidos nucleicos codifican un anticuerpo de la invencion, o una porcion de union a antigeno del mismo.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias de acido nucleico, es el numero de posiciones en la secuencia en la cual el nucleotido es identico, tomando en cuenta el numero de aperturas y la longitud de cada apertura, la cual necesita ser introducida para alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse usando un algoritmo matematico, tal como el algoritmo de Meyers y Miller o el programa XBLAST de Altschul descrito anteriormente.

Ademas, los acidos nucleicos preferidos de la divulgacion comprenden una o mas porciones que codifican CDR de las secuencias de acido nucleico mostradas en las SEC ID N°: 25, 26, 27, 28, 29, y 30. En esta realizacion, el acido nucleico puede codificar la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada de 4A6, 11E7, o 16D10 o la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera de 4A6, 11E7, o 16D10.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los acidos nucleicos los cuales tienen al menos 80 %, tal como al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 9 % de identidad de secuencia, con tal porcion que codifica CDR de SEC ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, o 30, tambien son acidos nucleicos preferidos de la divulgacion. Tales acidos nucleicos pueden diferir de la porcion correspondiente de la SEC ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, o 30, en una region CDR no codificante y/o en una region codificante CDR. En donde la diferencia esta en una region codificante de CDR, la region CDR de acido nucleico codificada por el acido nucleico, normalmente comprende una o mas modificaciones de secuencia conservativa como se define en la presente, comparada con la secuencia CDR correspondiente de 4A6, 11E7, y 16D10.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican segmentos de Vh y Vl, estos fragmentos de ADN pueden ser ademas manipulados por tecnicas de ADN recombinantes estandares, por ejemplo, para convertir los genes de region variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fab o a un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica a Vl- o Vh-, esta operativamente ligado a otro fragmento de ADN que codifica otra proteina, tal como una region constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El termino “operativamente ligado", como se usa en este contexto, esta propuesto para significar que los dos fragmentos de ADN estan unidos, de manera tal que las secuencias de aminoacido codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en la estructura.

El ADN aislado que codifica la region Vh, puede ser convertido a un gen de cadena pesada de longitud completa, operativamente enlazando el ADN que codifica a Vh a otra molecula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de region constante de cadena pesada humana, son conocidas en la tecnica (vease por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones, se pueden obtener por amplificacion de PCR estandar. La region constante de cadena pesada puede ser una region constante IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero mas preferiblemente, es una region constante IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica a Vh puede ser operativamente ligado a otra molecula de ADN que codifica solamente la region constante CH1 de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la region Vl, puede ser convertido a un gen de cadena ligera de longitud completa (asi como tambien un gen de cadena ligera Fab), ligando operativamente el ADN que codifica a Vl a otra molecula de ADN que codifica la region constante de cadena ligera, Cl. Las secuencias de genes de region constante de cadena ligera humana, se conocen en la tecnica (vease por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones, sepueden obtener por amplificacion de PCR estandar. En realizaciones preferidas, la region constante de cadena ligera, puede ser una region constante Kappa o lambda.

Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL, son operativamente ligados a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4 -Ser)3, de manera que las secuencias VH y VL pueden ser expresadas como una proteina de cadena unica contigua, con las regiones Vl y Vh unidas por el enlazador flexible (vease por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Produccion de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) de la presente invencion, pueden ser producidos por varias tecnicas, que incluyen metodologia de anticuerpo convencional, por ejemplo, la tecnica estandar de hibridizacion de celulas somaticas por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque los procedimientos de hibridizacion de celulas somaticas son preferidos, en principio, pueden ser empleadas otras tecnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformacion viral u oncogenica de linfocitos B.

El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La produccion de hibridoma en el raton es un procedimiento bien establecido. Los protocolos de inmunizacion y tecnicas para aislamiento de esplenocitos inmunizados por fusion, son conocidos en la tecnica. Los patrones de fusion (por ejemplo, celulas de mieloma murino) y procedimientos de fusion, tambien son conocidos.

Los anticuerpos quimericos o humanizados de la presente divulgacion, pueden ser preparados basados en la secuencia deun anicuerpo monoclonal no humano preparado como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada, se puede obtener a partir de hibridoma no humano de interes y disenado por ingenieria para contener secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana), usando tecnicas de biologia molecular estandar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimerico, las regiones variables murina pueden ser ligadas a regiones constantes humanas usando metodos conocidos en la tecnica (vease por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 4.816.567 por Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, regiones CDR murinas pueden ser insertads en un armazon humano usando metodos conocidos en la tecnica (vease por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.225.539 por Winter, y Patentes de Estados Unidos n.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los anticuerpos de la invencion son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra Glipicano-3, pueden ser generados usando ratones transgenicos o transcromosomicos que llevan partes del sistema inmune humano en lugarl del sistema de raton. Estos ratones transgenicos y transcromosomicos incluyen, ratones referidos aqui como el HuMAb Mouse® y KM Mouse®, respectivamente, y son colectivamente referidos en la presente como “ratones Ig humanos".

El HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) contiene minilocus del gen de inmunoglobulina humano que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera k y pesada humana no reordenada (|j y y), junto con mutaciones objetivo que inactiva el locus de cadena j y k endogena (vease, por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por lo tanto, el raton exhibe expresion reducida de IgM o k de raton, y en respuesta a inmunizacion, los transgenes de cadena ligera y pesada humana introducidos, experimentan intercambio de clase y mutacion somatica para generar anticuerpos monoclonales IgGK humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-10l; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparacion y uso del HuMAb Mouse®, y las modificaciones genomicas llevados por los ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851.. Vease ademas, Patentes de Estados Unidos N°. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y ay; Patente de Estados Unidos n.° 5.545.807 de Surani et al.; Publicaciones PCT N.° WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y Publicacion PCT No. WO 01/14424 de Korman et al.

En otra realizacion, los anticuerpos humanos de la divulgacion se pueden construir usando un raton que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un raton que porta un transgen de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Este raton se refiere en la presente como un "raton KM®", y se describe en detalle en la Publicacion PCT WO 02/43478 por Ishida et al.

Aun adicionalmente, sistemas animales transgenicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana estan disponibles en la tecnica y se pueden usar para construir anticuerpos anti-Glipicano-3 de la divulgacion. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgenico alternativo se refiere al XenoMouse (Abgenix, Inc.); Kucherlapati y cols describen dichos ratones, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidoss N°. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 por.

Ademas, sistemas animales transcromosomicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana estan disponibles en la tecnica y se pueden usar para construir anticuerpos anti-Glipicano-3 de la divulgacion. Por ejemplo, se pueden usar ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; estos ratones se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Ademas, se han descrito en la tecnica vacas que portan transcromosomas de cadena pesada y ligera humanos (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y solicitud PCT No. WO/2002/092812 y se pueden usar para construir anticuerpos anti-Glipicano-3 de la divulgacion.

Tambien se pueden preparar los anticuerpos monoclonales humanos de la divulgacion usando metodos de presentacion en fagos para seleccion de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Se establecen en la tecnica los metodos de presentacion en fagos para aislar anticuerpos humanos. Vease por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.° 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 por Ladner et al.; Patentes de Estados Unidos N.° 5.427.908 y 5.580.717 por Dower et al.; Patentes de Estados Unidos N.° 5.969.108 y 6.172.197 por McCafferty et al.; y Patentes de Estados Unidos N.° 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 por Griffiths et al.

Tambien se pueden preparar los anticuerpos monoclonales humanos de la divulgacion usando ratones SCID en los cuales las celulas inmunes humanas se han reconstituido de forma que se puede generar una respuesta del anticuerpo humano en inmunizacion. Estos ratones se describen en, por ejemplo, en las patente de Estados Unidoss N°. 5.476.996 y 5.698.767. Wilson et al.

Inmunizacion de Ratones Ig Humanos

Cuando se usan ratones Ig humano para construir anticuerpos humanos de la invencion, estos ratones se pueden inmunizar con una preparacion purificada o enriquecida de antigeno Glipicano-3 y/o Glipicano-3 recombinante, o celulas que expresan Glipicano-3, o una proteina de fusion Glipicano-3, como se describe por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y Publicacion PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferiblemente, los ratones pueden ser de 6-16 semanas de edad en la primera infusion. Por ejemplo, se puede usar una preparacion purificada o recombinante (5-50 jg) de antigeno Glipicano-3 para inmunizar intraperitonealmente los ratones Ig humano.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se describen procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para Glipicano-3 en el Ejemplo 1 posterior. La experiencia acumulativa con varios antigenos ha mostrado que los ratones transgenicos responde cuando son inicialmente inmunizados intraperitonealmente (IP) con antigeno en adyuvante de Freund completo, seguido por inmunizaciones IP cada semana (hasta un total de 6) con el antigeno en adyuvante de Freund completo. Sin embargo, tambien se pueden encontrar por ser efectivos adyuvantes diferentes del Freund. Ademas, se encuentran celulas completas en la ausencia del adyuvante por ser altamente inmunogenicas. La respuesta inmune se puede monitorear durante el curso del protocolo de inmunizacion con muestras de plasma siendo obtenidas por hemorragias retroorbitales. El plasma se puede seleccionar por ELISA (como se describe posteriormente), y se pueden usar por fusiones los ratones con tituladores suficientes de inmunoglobulina humana anti-Glipicano-3. Los ratones se pueden reforzar intravenosamente con antigeno 3 dias antes del sacrificio y remover el bazo. Se espera que se puedan realizar 2-3 fusiones para cada inmunizacion. Entre 6 y 24 ratones son normalmente inmunizados por cada antigeno. En una realizacion, se pueden usar cepas de raton que portan cepas de transgen de cadena pesada humana HCo7, HCo12 o HCo17. Como alternativa o adicionalmente, se puede usar la cepa KM Mouse®. Ademas, dos o mas de estas cepas se pueden reproducir juntas en un raton unico que tiene una pluralidad de diferentes transgenes de cadena pesada humana.

Generacion de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invencion, se pueden aislar esplenocitos y/o celulas del nodo linfatico a partir de ratones inmunizados y fusionar a una linea celular inmortalizada apropiada, tal como una linea celular de mieloma de raton. Los hibridomas resultantes se pueden seleccionar para la produccion de anticuerpos especificos al antigeno. Por ejemplo, las suspensiones celulares unicas de linfocitos esplenicos de ratones inmunizados se pueden fusionar de uno a seis el numero de celulas de mieloma de raton no secretada P3X63-Ag8.653 (ATCC, CrL 1580) con PEG al 50 %. Como alternativa, la suspension celular unica de linfocitos esplenicos de ratones inmunizados se pueden fusionar usando un metodo de electrofusion basado en el campo electrico, usando un electroporador de fusion celular de camara grande CytoPulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland). Las celulas se colocan en aproximadamente 2 x 105 en placa de microtitulador de fondo plano, seguido por una incubacion de dos semanas es medio selectivo que contiene Suero de Clon fetal al 20 %, medio acondicionado "653" al 18 %, origen al 5 % (IGEN), 4 ml de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; se agrega el HAT 24 horas despues de la fusion). Despues de aproximadamente dos semanas, las celulas se pueden cultivar en medio en el cual el HAT se reemplaza con HT. Las cavidades individuales se pueden seleccionar por ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que ocurre el crecimiento del hibridoma extensivo, el medio se puede observar usualmente despues de 10-14 dias. Los hibridomas que secretan anticuerpo se puede volver a colocar en placas, se seleccionan nuevamente, y si aun es positivo para IgG humano, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar al menos dos veces limitando la dilucion. Los subclones estables entonces se pueden cultivar in vitro para generar cantidades pequenas del anticuerpo en medio de cultivo del tejido para caracterizacion.

Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, los hibridomas seleccionados se hacen crecer en matraces para centrifugar de dos litros para purificacion de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografia de afinidad con proteina A sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se puede verificar por electroforesis en gel y cromatografia liquida de alta resolucion para asegurar la pureza. La solucion amortiguadora se puede intercambiar en PBS; y la concentracion se puede determinar por OD280 usando el coeficiente de extincion 1,43. Se pueden hacer alicuotas de los anticuerpos monoclonales y almacenarlos a -80°C.

Generacion de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales

Tambien se pueden producir anticuerpos de la invencion en un transfectoma de celula hospedadora usando, por ejemplo, una combinacion de tecnicas de ADN recombinante y metodos de transfeccion del gen como son bien conocidas en la tecnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmento de anticuerpo de los mismos, se pueden obtener ADNs que codifican cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o parcial, por tecnicas de biologia molecular estandar (por ejemplo, amplificacion PCR o clonacion ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interes) y el ADNc se puede insertar en los vectores de expresion de forma que los genes estan operativamente enlazados a secuencias de control transcripcional o traduccional. En este contexto, el termino "unido operativamente" pretende indicar que un gen de anticuerpo esta ligado en un vector de forma que las secuencias de control transcripcional o traduccional dentro del vector sirven para su funcion planeada de regular la transcripcion o traduccion del gen de anticuerpo. Las secuencias de vector de expresion y control de expresion se eligen por ser compatibles con la celula hospedadora de expresion usada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vector separado o, mas normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresion por metodos estandar (por ejemplo, ligacion de sitios de restriccion complementaria en el fragmento del gen de anticuerpo y vector, o ligacion de extremo romo si no estan presentes los sitios de restriccion). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

anticuerpos descritos en la presente se pueden usar para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertandolos en vectores de expresion que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera del isotipo deseado de forma que el segmento Vh esta unido operativamente a los segmentos Ch dentro del vector y el segmento Vk esta unido operativamente al segmento Cl dentro del vector. Adicionalmente o como alternativa, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido senal que facilita la secrecion de la cadena de anticuerpo de una celula hospedadora. El gen de cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector de forma que el peptido senal esta enlazado en armazon a terminos amino del gen de cadena de anticuerpo. El peptido senal puede ser un peptido senal de inmunoglobulina o un peptido senal heterogeneo (es decir, un peptido senal de una proteina no de inmunoglobulina).

Ademas de los genes de cadenas del anticuerpo, los vectores de expresion recombinante de la invencion lleva secuencias regulatorias que controlan la expresion de los genes de cadena del anticuerpo en una celula hospedadora. El termino "secuencia reguladora" se pretende por incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o traduccion de los genes de cadena de anticuerpo. Las secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Sera apreciado por aquellos expertos en la tecnica que el diseno del vector de expresion, que incluye la seleccion de secuencias reguladoras, puede depender de los factores como la eleccion de la celula hospedadora a ser transformada, el nivel de expresion de proteina deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresion de celula hospedadora de mamifero incluyen elementos virales que dirigen niveles altos de expresion de proteina en celulas de mamifero, tal como promotores y/o intensificadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de Simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Como alternativa, se pueden usar las secuencias regulatorias no virales, tal como el promotor de ubiquitina o promotor p- globina. Aun adicionalmente, los elementos regulatorios compuestos de secuencias a partir de diferentes fuentes, tal como el sistema promotor SRa, el cual contiene secuencias del promotor temprano SV40 y la repeticion terminal larga del virus tipo 1 de leucemia en celula T humana (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472.

Ademas de los genes de cadenas del anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinante de la invencion pueden portar secuencias adicionales, tal como secuencias que regulan la replication del vector en celulas hospedadoras (por ejemplo, origenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selection de celulas hospedadoras en las cuales el vector se ha introducido (vease por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel et al.). Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una celula hospedadora en la cual el vector se ha introducido. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen reductasa de dihidrofolato (DHFR) (para uso en celulas hospedadoras dhfr con seleccion/amplificacion de metotrexato) y el gen neo (para seleccion G418).

Para expresion de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresion que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una celula hospedadora por tecnicas estandar. Las formas variadas del termino "transfection" se planean abarcar una amplia variedad de tecnicas comunmente usadas para la introduction de ADN exogeno en una celula hospedadora procariotica o eucariotica, por ejemplo, electroporation, precipitation de calcio-fosfato, transfeccion de DEAE-dextrano y similares. A pesar que es teoricamente posible expresar los anticuerpos de la invencion en ya sea celulas procarioticas o eucarioticas, la expresion de anticuerpos en celulas eucarioticas, y mas preferiblemente en celulas hospedadoras de mamifero, es la mas preferida debido a que las celulas eucarioticas, y en particular las celulas de mamifero, son mas similares que las celulas procarioticas para montar y secretar un anticuerpo inmunologicamente activo y apropiadamente plegado. La expresion procariotica de los genes del anticuerpo se han reportado por ser inefectivos para la production de altos rendimientos del anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Las celulas hospedadoras de mamifero preferidas para expresion de los anticuerpos recombinantes de la invencion incluyen celulas de Ovario de Hamster Chino (celulas CHO)(que incluyen celulas CHO dhfr, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), celulas de mieloma NSO, celulas COS y celulas SP2. En particular, para uso con celulas de mieloma NSO, otro sistema de expresion preferido es el sistema de expresion del gen GS descrito en WO 87/04462 (por Wilson), WO 89/01036 (por Bebbington) y EP 338.841 (por Bebbington). Cuando los vectores de expresion recombinante que codifican genes de anticuerpo se introducen en celulas hospedadoras de mamifero, los anticuerpos se producen cultivando las celulas hospedadoras por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas hospedadoras, mas preferiblemente, secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se hacen crecer las celulas hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar a partir del medio de cultivo usando metodos de purification de proteina estandar.

Caracterizacion de la union del anticuerpo al antigeno

Se pueden probar anticuerpos de la invencion para unirse a Glipicano-3, por ejemplo, ELISA estandar. Brevemente, las placas microtituladores se recubren con Glipicano-3 purificado a 0,25 |jg/ml en PBS, y despues se bloquean con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

albumina suero de bovino al 5 % en PBS. Se agregan diluciones del anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma a partir de ratones inmunizados con Glipicano-3) a cada cavidad y se incuban por 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y despues se incuban con reactivos secundarios (por ejemplo, para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal especifico a IgG Fc anti-humano de cabra) conjugado a fosfatasa alcalina por 1 hora a 37°C. Despues del lavado, las placas, las placas se desarrollan con sustrato pNPP (1 mg/ml), y se analizan a OD de 405650. Preferiblemente, se pueden usar los ratones los cuales desarrollan los tituladores altos para fusiones.

Tambien se puede usar un ensayo ELISA como se describe anteriormente para seleccionar hibridomas que muestran reactividad positiva con un inmunogeno Glipicano-3. Los hibridomas que se enlazan con alta avidez a Glipicano-3, se subclonan y caracterizan adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, el cual retiene la reactividad de las celulas precursoras (por ELISA), se puede elegir para elaborar un banco celular de 5-10 viales almacenados a - 140°C, y para purificacion de anticuerpo.

Para purificar anticuerpos anti-Glipicano-3, se pueden hacer crecer hibridomas seleccionadas en matraces para centrifugacion de dos litros para purificacion de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografia de afinidad con proteina A sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se puede verificar el IgG eluido por electroforesis en gel y cromatografia liquida de alta resolution para asegurar la pureza. La solution amortiguadora se puede intercambiar en PBS, y la concentration se puede determinar por OD280 usando el coeficiente de extincion 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden forman en alicuotas y almacenar a -80°C.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3 seleccionados enlazados a epitopos unicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL). Se pueden realizar los estudios de competicion usando anticuerpos monoclonales no etiquetados y anticuerpos monoclonales biotinilados usando placas ELISA recubiertas con Glipicano-3 como se describe anteriormente. El enlace mAb biotinilado se puede detectar con una sonda de fosfatasa alcalina-estreptavidina.

Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se puede realizar ELISA en el isotipo usando reactivos especificos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, las cavidades de las placas microtituladoras se puede recubrir con 1 |jg/ml de inmunoglobulina anti-humano durante la noche a 4°C. Despues del bloqueo con BSA al 1 %, las placas se hacen reaccionar con 1 jg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente por una o dos horas. Las cavidades despues se pueden hacer reaccionar con cualquiera de las sondas conjugadas de fosfatasa alcalina especifica para IgM humano o IgG1 humano. Las placas se desarrollan y analizan como se describe anteriormente.

Los IgG humanos anti-Glipicano-3 se puede ademas probar para reactividad con anfigeno Glipicano-3 por transferencia de Western. Brevemente, se puede preparar Glipicano-3 y someter a electroforesis en gel de dodecil sulfato poliacrilamida de sodio. Despues de la electroforesis, los anfigenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero de ternero fetal al 10 % y se sondean con los anticuerpos monoclonales a ser probados. Los enlace IgG humanos se pueden detectar usando fosfatasa alcalina IgG anti-humano y se desarrollan con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem, Co., St. Lous, Mo.).

La especificidad de union de un anticuerpo de la invention tambien se puede determinar monitoreando el enlace del anticuerpo a celulas que expresan Glipicano-3, por ejemplo, por citometria de flujo. Normalmente, una linea celular, tal como una linea de celula CHO, se puede transfectar con un vector de expresion que codifica una forma de transmembrana de Glipicano-3. La proteina transfectada puede comprender una etiqueta, tal como una etiqueta myc, preferiblemente como los terminos N, para deteccion usando un anticuerpo para la etiqueta. Se puede determinar el enlace de un anticuerpo de la invencion para Glipicano-3 incubando las celulas transfectadas con el anticuerpo, y detectando en anticuerpo enlazado. Se puede usar el enlace de un anticuerpo a la etiqueta en la proteina transfectada como un control positivo.

La especificidad de un anticuerpo de la invencion para Glipicano-3 se puede estudiar adicionalmente para determinar si o no el anticuerpo se une a otras proteinas (por ejemplo, Glipicano-1, Glipicano-2, Glipicano-4 o Glipicano-6) o se determina para el mismo Glipicano-3 usando los mismos metodos por el cual se une a Glipicano-3.

Inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente invencion caracteriza un anticuerpo anti-Glipicano-3, o un fragmento del mismo, conjugado a una portion terapeutica, tal como una citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Estos conjugados son referidos en la presente como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o mas citotoxinas son referidos como "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que es perjudicial a celulas (por ejemplo, asesinas). Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, y puromicina, y analogos de u homologos de los mismos. Agentes terapeuticos tambien incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilacion (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapeuticas que se pueden conjugar a un anticuerpo de la invencion, incluyen duocarmicinas, calicamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de los mismos. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo calicamicina que esta farmaceuticamente disponible (Mylotarg®; American Home Products).

Las citotoxinas se pueden conjugar a anticuerpos de la invencion usando tecnologia enlazadora disponible en la tecnica. Ejemplos de tipos de enlazadores que se han usado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioesteres, esteres, disulfuros y enlazadores que contienen peptido. Un enlazador se puede elegir por ser, por ejemplo, susceptible a desdoblamiento por pH bajo dentro del compartimiento lisosomal o susceptible a desdoblamiento por proteasas, tal como proteasas preferencialmente expresadas en tejido de tumor tal como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).

Ejemplos de citotoxinas se describen, por ejemplo en las Patentes de Estados Unidos N.° 6.989.452, 7.087.600, y 7.129.261, y en las solicitudes PCT N.° PCT/US02/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US06/37793,

PCT/US06/060050, PCT/US2006/060711, WO/2006/110476, y en la Solicitud de Estados Unidos N° 60/891.028. Para discusion adicional de tipos de citotoxinas, enlazadores y metodos para conjugar agentes terapeuticos a anticuerpos, vease tambien Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Los anticuerpos de la presente invencion tambien se pueden conjugar a un isotopo radioactivo para generar radiofarmaceuticos citotoxicos, tambien referidos como radioinmunoconjugados. Ejemplos de isotopos radioactivos que se pueden conjugar a anticuerpos para uso diagnosticamente o terapeuticamente incluyen, pero no se limita a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. Se establece en la tecnica el metodo para preparar radioinmunoconjugados. Ejemplos de radioinmunoconjugados estan comercialmente disponibles, incluyendo Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden usar metodos similares para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invencion.

Los conjugados del anticuerpo de la invencion, se pueden usar para modificar una respuesta biologica dada, y la porcion del farmaco no se construye para limitar agentes terapeuticos quimicos clasicos. Por ejemplo, la porcion del farmaco puede ser una proteina o polipeptido que posee una actividad biologica deseada. Estas proteinas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa, o fragmento del mismo activo, tal como abrina, ricina A, exotoxinas de pseudomonas o toxina de difteria; una proteina tal como factor de necrosis tumoral o interferon y, o modificadores de respuesta biologica tal como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor que estimula la colonia macrofaga de granulocito (“GM-CSF”), factor que estimula la colonia de granulocito (“G-CSF”), u otros factores de crecimiento.

Son bien conocidas las tecnicas para conjugar la porcion terapeutica a anticuerpos, vease por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Moleculas biespecificas

En otro aspecto, la presente invencion caracteriza moleculas biespecificas que comprenden un anticuerpo anti- Glipicano-3, o un fragmento del mismo de la invencion. Un anticuerpo de la invencion, o porciones que se enlazan al antigeno del mismo, se puede derivatizar o enlazar a otra molecula funcional, por ejemplo, otro peptido o proteina (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando al receptor) para generar una molecula biespecifica que se une a al menos dos diferentes sitios de enlace o molecula objetivo. El anticuerpo de la invencion puede de hecho ser derivatizada o enlazada a mas de una molecula funcional para generar moleculas multiespecificas que se unen a mas de dos diferentes sitios de enlace y/o moleculas objetivo; estas moleculas multiespecificas tambien se pretenden sean abarcadas por el termino "molecula biespecifica" como se usa en la presente. Para crear una molecula biespecifica de la invencion, un anticuerpo de la invencion puede ser funcionalmente enlazado (por ejemplo, por acoplamiento quimico, fusion genetica, asociacion monovalente o de otra forma) a uno o mas de otras moleculas de enlace, tal

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, peptido o mimetico de enlace, de forma que resulta una molecula biespedfica.

Por lconsiguiente, la presente invencion incluye moleculas biespedficas que comprenden al menos una primera especificidad de union para Glipicano-3 y una segunda especificidad de union o un segundo epftopo objetivo. En una realizacion particular de la invencion, el segundo epitopo objetivo es un receptor Fc, por ejemplo, FCyRI humano (CD64) o un receptor Fca humano (CD89). Por lo tanto, la invencion incluye moleculas biespecificas capaces de enlazar tanto celulas efectoras que expresan FcyR o FCaR (por ejemplo, monocitos, macrofagos o celulas polimorfonucleares (PMNs)), como Glipicano-3 que expresa celulas diana. Estas celulas que expresan Glipicano-3 dirigidas a moleculas biespecificas a celulas efectoras y provoca actividades de celula efectora medidas por el receptor Fc, tal como fagocitosis de celulas que expresan Glipicano-3, citotoxicidad mediada por celula dependiente del anticuerpo (ADCC), liberacion de citocina o generacion de anion de superoxido.

En una realizacion de la invencion en la cual la molecula biespecifica es multiespecifica, la molecula puede ademas incluir una tercera especificidad de union, ademas a una especificidad de union anti-Fc y una especificidad de union anti-Glipicano-3. En una realizacion, la tercera especificidad de union es una porcion del factor anti-intensificacion (EF), por ejemplo, una molecula la cual se une a una proteina de superficie involucrada en actividad citotoxica y con ello libera la respuesta inmune contra la celula objetivo. La "porcion del factor anti-intensificacion" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molecula dada, por ejemplo, un antigeno o un receptor, y con ello resulta en una intensificacion del efecto de los determinantes de enlace para el receptor Fc o antigeno de la celula objetivo. La "porcion del factor anti-intensificacion" puede enlazar un receptor Fc a un antigeno de celula objetivo. Como alternativa, la porcion del factor anti-intensificacion se puede enlazar a una entrada que es diferente de la entrada a la cual la primera y segunda especificidades de enlace se unen. Por ejemplo, la porcion del factor anti-intensificacion puede enlazar una celula T citotoxica (por ejemplo, via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra celula inmune que resulta en una respuesta inmune incrementada contra la celula objetivo).

En una realizacion, las moleculas biespecificas de la divulgacion comprenden una especificidad de union al menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb o una cadena Fv unica. El anticuerpo tambien puede ser un dimero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento minimo del mismo tal como un Fv a un constructo de cadena unica como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 4.946.778 por Ladner et al., los contenidos lo cuales expresamente se incorpora para referencia.

En una realizacion, la especificidad de union para un receptor Fcy se proporciona por un anticuerpo monoclonal, el enlace el cual no se bloquea por inmunoglobulina humana G (IgG). Tal como se usa en el presente documento el termino "receptor IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena y localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce transmembranas o isoformas del receptor soluble los cuales se agrupan en clases del receptor Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), y Fcy RIII (CD16). En una realizacion preferida, el receptor Fcy un FcyRI de alta afinidad humano. El Fcy RI humano es una molecula de 72 kDa, la cual muestra alta afinidad para IgG monomerico (108 - 109M-1).

La produccion y caracterizacion de ciertos anticuerpos monoclonales anti-FcY preferidos se describe en la Publicacion PCT WO 88/00052 y en la Patente de Estados Unidos N°. 4.954.617 por Fanger et al., las ensenanzas las cuales se incorporan completamente para referencia en la presente. Estos anticuerpos enlazados a un epitopo de FcyRI, FcyRII o FcyRIII en un sitio el cual es distinto del sitio de enlace Fcy del receptor y, de esta forma, su enlace no se bloquea sustancialmente por niveles fisiologicos de IgG. Anticuerpos anti-FcYRI especificos utiles en esta invencion son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. Los hibridomas que produce mAb 32 estan disponibles a partir de la American Type Culture Collection, ATCC No. de acceso HB9469. En otras realizaciones, el anticuerpo del receptor anti-FcY es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La produccion y caracterizacion del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y Publicacion PCT WO 94/10332 por Tempest et al. La linea celular que produce el anticuerpo H22 se deposito en la American Type Culture Collection bajo la designacion HA022CL1 y tiene en no. de acceso CRL 11177.

En otras realizaciones mas preferidas, la especificidad de union para un receptor Fc se proporciona por un anticuerpo que se une a un receptor IgA humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89)), el enlace el cual es preferiblemente no bloqueado por inmunoglobulina A humana (IgA). El termino "receptor IgA" se planea para incluir el producto del gen de un gen a (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Este gen se conoce por codificar varias isoformas de transmembrana como alternativa empalmadas de 55 hasta 110 kDa. El FcaRI (CD89) es constitutivamente expresado en monocitos/macrofagos, eosinofilos y granulocitos neutrofilicos, pero no en poblaciones celulares no-efectoras. El FcaRI tiene afinidad media (== 5 x 107 M-1) para tanto IgA1 como IgA2, la cual se incrementa con la exposicion a citocinas tal como G-CSF o GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Se ha descrito cuatro anticuerpos monoclonales especificos a FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, los cuales enlazan FcaRI fuera del dominio de enlace del ligando IgA, (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

FcaRI y FcyRI son receptores activadores preferidos para uso en las moleculas biespedficas de la invencion porque (1) se expresan principalmente en celulas efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMN, macrofagos y celulas dendriticas; (2) expresados a altos niveles (por ejemplo, 5.000-100.000 por celula); (3) mediadores de actividades de citocina (por ejemplo, ADCC, fagocitosis), y (4) mediados por la presentacion de antigeno intensificador de antigenos, que incluyen los mismos antigenos, dirigidos a estos.

Mientras se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos los cuales se puede emplear en las moleculas biespecificas de la divulgacion son anticuerpos monoclonales murinos, quimericos y humanizados.

Las moleculas biespecificas de la presente invencion se pueden preparar conjugando las especificidades de enlace constituyente, por ejemplo, las especificidades de enlace anti-FcR y anti-Glipicano-3, usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, cada especificidad de union de la molecula biespecifica se puede genera separadamente y despues conjugarse a otra. Cuando las especificidades de enlace son proteinas o peptidos, se pueden usar varios agentes de acoplamiento o reticulacion para conjugados covalentes. Ejemplos de agentes de reticulacion incluyen proteina A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o- fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y 4-(N-maleimidometil)ciclohaxan-1- carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (vease por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros metodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugacion preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos comercialmente disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos, se puede conjugar via union de sulfhidrilo de las regiones de articulacion C-terminos de las dos cadenas pesadas. En una realizacion particularmente preferida, la region bisagra contiene un numero impar de restos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugacion.

Como alternativa, ambas especificidades de enlace se puede codificar en el mismo vector y expresado. y montado en la misma celula hospedadora. Este metodo es particularmente util en donde la molecula biespecifica es una proteina de fusion mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molecula biespecifica de la invencion puede ser una molecula de cadena unica que comprende un anticuerpo de cadena unica y un determinante de enlace, o una molecula biespecifica de cadena unica que comprende dos determinantes de enlace. Las moleculas biespecificas pueden comprender al menos dos moleculas de cadena unica. Se describen metodos para preparar moleculas biespecificas por ejemplo en Patentes de Estados Unidoss Numero 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; y 5.482.858.

El enlace de las moleculas biespecificas a sus objetivos especificos se puede confirmar por, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente similar a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), analisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibition de crecimiento), o ensayo de Manchado Western. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos proteina-anticuerpo de interes particular empleando un reactivo etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo) especifico para el complejo de interes. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo se pueden detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo similar a la enzima o fragmento de anticuerpo el cual reconoce y se une especificamente a los complejos anticuerpo-FcR. Como alternativa, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de otros varios inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser radioactivamente etiquetado y usado en un radioinmunoensayo (RIA) (vease, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo, 1986.

Se puede detectar el isotopo radioactivo por los medios como el uso de un contador y o un contador de escintilacion o por autoradiografia.

Composiciones farmaceuticas

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composition, por ejemplo, una composition farmaceutica, que contiene uno o una combination de anticuerpos o porciones de enlace al antigeno del mismo, de la presente invencion, formulados junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Las composiciones pueden incluir uno o una combinacion de (por ejemplo, dos o mas diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o moleculas biespecificas de la invencion. Por ejemplo, una composicion farmaceutica de la invencion puede comprender una combinacion de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecificos) que se enlazan a diferentes epitopos en el antigeno objetivo o que tienen actividades complementarias.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien se pueden administrar en terapia de combinacion, es decir, combinada con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir un anticuerpo anti- Glipicano-3 de la presente invencion combinado con al menos otro agente anti-inflamatorio o inmunosupresor. Ejemplos de agentes terapeuticos que se pueden usar en terapia de combinacion se describen en mayor detalle posteriormente en la section de usos de los anticuerpos de la invencion.

Tal como se usa en el presente documento "vehiculo farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

solventes, medio de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de absorcion, y similares que son fisiologicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para administration intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, por inyeccion o infusion). Dependiendo de la ruta de administracion, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado o molecula biespecifica, se puede recubrir en un material para proteger el compuesto de la action de acidos y otras condiciones naturales que puede inactivar el compuesto.

Los compuestos farmaceuticos de la invention pueden incluir una o mas sales farmaceuticamente aceptables. Una "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biologica deseada del compuesto precursor y no otorga cualquiera de los efectos biologicos indeseados (vease por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de las sales incluyen sales de adicion de acido y sales de adicion de base. Sales de adicion de acido incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos no toxicos, tal como clorhidrico, nitrico, fosforico, sulfurico, bromhidrico, yodhidrico, fosforoso y similares, asi como acidos organicos o toxicos tal como acidos mono-alifatico y dicarboxilico, acidos alcanoicos fenil-sustituidos, acidos hidroxi alcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonico alifatico y aromatico, y similares. Sales de adicion de base incluyen aquellos derivados de metales alcalino terreo, tal como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, asi como de aminas organicas no toxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares.

Una composition farmaceutica de la invencion tambien puede incluir un anti-oxidante farmaceuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tal como acido ascorbico, clorhidrato de cisteina, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes de quelacion de metal, tal como acido citrico, acido etilendiamina tetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y similares.

Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se puede emplear en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilen glicol, polietilen glicol, y similares), y mezcla adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tal como etil oleato. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, para el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de dispersion, y para el uso de tensoactivo

Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes como preservativos, agentes de humectacion, agentes de emulsification y agentes de dispersion. Se puede asegura la prevention de presencia de microorganismos tanto por procedimientos de esterilizacion supra, como por la inclusion de agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, cloroetanol, acido fenol sorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tal como azucares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Demas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede ser provocada por la inclusion de agentes los cuales retrasan la absorcion tal como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparation extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Se conoce en la tecnica el uso del medio y agentes para sustancias farmaceuticamente activas. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Tambien se pueden incorporar en las composiciones compuestos suplementariamente activos.

Las composiciones terapeuticas normalmente pueden ser esteriles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenaje. La composicion se puede formular como una solution, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentration de farmaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol liquido y similares), y mezclas de los mismos adecuadas. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, para el mantenimiento del tamano de particula requerida en el caso de dispersion y por el uso de tensoactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. Se puede provocar la absorcion prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Se pueden preparar soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una combination de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por microfiltracion por esterilizacion. Generalmente, se preparan las dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehiculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado a vacio y secado por congelamiento (liofilizacion) que proporciona un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solucion del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mismo filtrada previamente esterilizada.

La cantidad del ingrediente activo el cual se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificacion unica variara dependiendo del sujeto a ser tratado, y la forma particular de administration. La cantidad del ingrediente activo el cual se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificacion unica, generalmente sera la cantidad de la composition la cual produce un efecto terapeutico. Generalmente, del cien por ciento, esta cantidad variara de aproximadamente 0,01 por ciento hasta aproximadamente noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 0,1 por ciento hasta aproximadamente 70 por ciento, mas preferiblemente de aproximadamente 1 por ciento hasta aproximadamente 30 por ciento del ingrediente activo en combination con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Se ajustan los regimenes de dosificacion para proporcionar una respuesta optima deseada (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo unico, se pueden administrar dosis varias veces dividida durante un tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada como se indica por las exigencias de la situation terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificacion unitaria para facil administracion y uniformidad de dosificacion. La forma unitaria de dosificacion tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades fisicamente discretas adecudas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion para formas de dosificacion unitarios de la invention se dicta por y directamente depende de (a) las caracteristicas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de composicion de un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para administracion del anticuerpo, la dosificacion varia de aproximadamente 0,0001 hasta 100 mg/kg, y mas usualmente 0,01 hata 5 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un regimen de tratamiento ejemplar implica administracion una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Regimenes de dosificacion preferidas para un anticuerpo anti-Glipicano-3 de la invencion incluye 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal via administracion intravenosa, con el anticuerpo siendo proporcionado usando uno de los siguientes esquemas de dosificacion: (i) cada cuatro semanas por seis dosificaciones, entonces cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos metodos, se administran simultaneamente uno o dos anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de enlace, en este caso la dosificacion de cada anticuerpo administrado caen dentro de intervalo indicado. El anticuerpo es usualmente administrado en multiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones unicas pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos tambien pueden ser irregulares como se indica por los niveles de sangre medidos de anticuerpo para en antigeno objetivo en el paciente. En algunos metodos, la dosificacion se ajusta para lograr una concentration de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 |jg/ml en algunos metodos aproximadamente 25-300 |jg/ml.

Como alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulation de liberation sostenida, en este caso se requiere administracion menos frecuente. La dosificacion y frecuencia varia dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran una vida media prolongada, seguido por anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos no humanos. La dosificacion y frecuencia de administracion puede variar dependiendo si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, se administra una dosificacion relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuente durante un periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes continuan recibiendo el tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapeuticas, una dosificacion relativamente alta a intervalos relativamente cortos es algunas veces requerida hasta que el progreso de la enfermedad se reduce o termina, y preferiblemente hasta que el paciente muestra mejora parcial o completa de los sintomas de la enfermedad. A partir de entonces, al paciente se le puede administrar un regimen profilactico.

Los niveles de dosificacion reales de los ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden ser variados como para obtener una cantidad del ingrediente activo el cual es efectivo para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente particular, composicion y forma de administracion, sin ser toxico al paciente. El nivel de dosificacion seleccionada depende de varios factores de farmacocinetica, que incluye la actividad de las composiciones particulares de la presente invencion empleadas, o el ester, sal, amida de las mismas, la ruta de administracion, el tiempo de administracion, la velocidad de excretion del compuesto particular a ser empleado, la duration del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combinacion con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condition, salud general e historia medica anterior del paciente a ser tratado, y factores similares bien conocidos en las tecnicas medicas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Una "dosificacion terapeuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-Glipicano-3 de la invencion, preferiblemente resulta en una disminucion en severidad de sintomas de la enfermedad, un incremento en frecuencia y duracion de periodo libres de sintomas de la enfermedad, o una prevention del deterioro o discapacidad debido a la afliccion de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores Glipicano-3+, una "dosificacion terapeuticamente efectiva" preferiblemente inhibe el crecimiento celular o crecimiento de tumor por al menos aproximadamente 20 %, mas preferiblemente por al menos aproximadamente 40 %, aun mas preferiblemente por al menos aproximadamente 60 %, y todavia mas preferible por al menos aproximadamente 80 % en relation a sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento del tumor se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en tumores humanos. Como alternativa, esta propiedad de una composition se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibicion se puede medir in vitro por ensayos conocidos por un experto medico. Una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto terapeutico pude disminuir el tamano del tumor, o de otra forma mejorar los sintomas en un sujeto. Un experto ordinario en la tecnica puede ser capaz para determinar estas cantidades basandose en los factores como el tamano del sujeto, la severidad de los sintomas del sujeto y la composicion particular o ruta de administration seleccionada.

Una composicion de la presente invencion se puede administrar via una o mas rutas de administracion usando una o mas de varios metodos conocidos en la tecnica. Como se apreciara por el experto el la tecnica, la ruta y/o forma de administracion puede variar dependiendo de los resultados deseados. Las rutas preferidas de administracion para anticuerpos de la invencion incluyen intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutanea, espinal u otras rutas parenterales de administracion, por ejemplo por inyeccion o infusion. La frase "administracion pareneral" como se usa en la presente significa modelos de administracion diferentes de la administracion enteral y topica, usualmente por inyeccion, e incluye, sin limitation inyeccion e infusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal.

Como alternativa, un anticuerpo de la invencion se puede administrar via una ruta no parenteral, tal como una ruta de administracion topica, epidermica o mucosa, por ejemplo, intranasalemente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente o topicamente.

Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que pueden proteger al compuesto contra liberation rapida, tal como una formulation de liberacion controlada, que incluye implantes, parches transdermales y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polimeros biocompatibles, biodegradables, tal como atinel vinil acetato, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Muchos metodos para la preparation de las formulaciones estan patentadas o generalmente conocidas por aquellos expertos en la tecnica. Vease por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Se pueden administrar composiciones terapeuticas con dispositivos medicos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un una realization preferida, se puede administrar una composicion terapeutica de la invencion con un dispositivo de inyeccion de agujas hipodermicas, tal como el dispositivo descrito en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.399.163; 5.383.851; 5.3l2.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes y modulos bien conocidos en la tecnica utiles en la presente invencion incluyen: Patente de Estados Unidos n.° 4.487.603 la cual describe una bomba de micro-infusion implantable para dispersar medication a una velocidad controlada; Patente de Estados Unidos n.° 4.486.194, la cual describe un dispositivo terapeutico para administrar medicamentos a traves de la piel; Patente de Estados Unidos n.° 4.447.233, la cual describe una bomba de infusion de medicacion para suministrar una medicacion a una velocidad de infusion precisa; Patente de Estados Unidos n.° 4.447.224, la cual describe un aparato de infusion implantable de flujo variable para suministro de farmaco continuo; Patente de Estados Unidos n.° 4.439.196, la cual describe un sistema de suministro de farmaco osmotico que tiene compartimientos de camaras multiples; y Patente de Estados Unidos n.° 4.475.196, la cual describe un sistema de suministro del farmaco osmotico. Estas patentes se incorporan en la presente para referencia. Se conocen por aquellos expertos en la tecnica muchos otros implantes, sistemas de suministro y modulos.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invencion se pueden formular para asegurar la distribution apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera emato-encefalica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofilicos. Para asegura que los compuestos terapeuticos de la invencion crucen la BBB (si desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para metodos para manufacturar liposomas, vease, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.° 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o mas porciones las cuales selectivamente se transportan en celulas y organos especificos, de esta forma de intensifica el suministro de farmaco objetivo (vease, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porciones objetivo ejemplares incluye folato o biotina (vease por ejemplo, Patente de Estados Unidos 5.416.016 por Low et al.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteina A del tensoactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vease tambien K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEbS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos y metodos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los anticuerpos, particularmente los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpo y metodos de la presente divulgacion tienen numerosos diagnosticos y utilidades terapeuticas in vitro o in vivo que involucra el diagnostico y tratamiento de trastornos mediados por Glipicano-3. Por ejemplo, estas moleculas se pueden administrar celulas en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y para diagnosticar varios trastornos. Tal como se usa en el presente documento el termino "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humano. Animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamiferos y no mamiferos, tal como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles. Sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por actividad de Glipicano-3. Los metodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con expresion de Glipicano-3 aberrante. Cuando se administran anticuerpos para Glipicano-3 junto con otro agente, los dos se pueden administrar en cualquier orden o simultaneamente.

Dando el enlace especifico de los anticuerpos de la invention para Glipicano-3, los anticuerpos de la invention se pueden usar para especificamente detectar expresion de Glipicano-3 en la superficie de las celulas, y sin embargo, se pueden usar para purificar Glipicano-3 via purification de inmunoafinidad.

Ademas, dando la expresion de Glipicano-3 en varias celulas de tumor de higado, los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpo y metodos de la presente divulgacion, se pueden usar para tratar un sujeto con un trastorno tumorigenico del higado, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de celulas tumorales que expresan Glipicano-3 que incluyen, por ejemplo, celulas CHC.

En una realization, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas, y composiciones) de la invencion se pueden usar para detectar niveles de Glipicano-3, o niveles de celulas las cuales contienen Glipicano-3 en su superficie de membrana, los niveles despues se pueden unir a ciertos sintomas. Como alternativa, los anticuerpos se pueden usar para inhibir o bloquear la funcion de Glipicano-3 la cual, a su vez, se puede unir a la prevention o mejora de ciertos sintomas de cierta enfermedad, de este modo se implica a Glipicano-3 como un mediador de la enfermedad. Esto se puede lograr poniendo en contacto una muestra y una muestra control con el anticuerpo anti-Glipicano-3 bajo condiciones que permiten la formation de un complejo entre el anticuerpo y Glipicano-3. Cualquiera de los complejos formados entre el anticuerpo y Glipicano-3 se detecta y compara en la muestra y el control.

En otra realizacion, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas y composiciones) de la invencion pueden inicialmente ser probadas para actividad de enlace asociada con uso terapeutico o diagnostico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invencion se pueden probar usando los ensayos de citometria de flujo descritos en los Ejemplos posteriores.

Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas, inmunoconjugados y composiciones) de la invencion tienen utilidad adicional en terapia y diagnostico de enfermedades relacionadas a Glipicano-3. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moleculas multiespecificas o biespecificas y los inmunoconjugados se pueden usar para obtener in vivo o in vitro una o mas de las siguientes actividades biologicas: parea inhibir el crecimiento de y/o eliminar una celula que expresa Glipicano-3; para mediar fagocitosis o ADCC de una celula que expresa Glipicano-3 en la presencia de celulas efectoras humanas, o para bloquear un ligando de Glipicano-3 del enlace a Glipicano-3.

En una realizacion particular, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas, y composiciones) se usan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar varias enfermedades relacionadas a Glipicano-3. Ejemplos de enfermedades relacionadas a Glipicano-3 incluyen, entre otros, CHC y otros canceres de higado.

Rutas adecuadas para administrar las composiciones del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas e inmunoconjugados) de la invencion in vivo e in vitro se conocen bien en la tecnica y se pueden seleccionar por aquellos expertos ordinarios. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpo se pueden administrar por inyeccion (por ejemplo, intravenosa o subcutanea). Dosificaciones adecuadas de las moleculas usadas dependeran de la edad y peso del sujeto y la concentration y/o formulacion de la composicion del anticuerpo.

Como previamente se describe, anticuerpos anti-Glipicano-3 humanos de la invencion se puden co-administrar con uno o mas de los agentes terapeuticos, por ejemplo, un agente citotoxico, un gente radiotoxico o un agente inmunosupresivo. El anticuerpo se puede enlazar al agente (como un inmunocomplejo) o se puede administrar separado del agente. En el ultimo caso (administration separada), el anticuerpo se puede administrar antes, despues o junto con el agente o se puede co-administrar con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anti- cancerigena, por ejemplo, radiation. Tales agentes terapeuticos incluyen, entre otros, agentes anti-neoplasticos, tal como doxorubicina (adriamicina), cisplatin bleomicin sulfato, carmustina, cloroambicil y ciclofosfamida hidroxiurea los cuales pos si mismos, son unicamente efectivos a niveles los cuales son toxicos o subtoxicos a un paciente. La cisplatina se administra intravenosamente a una dosis de 100 mg/kg una vez cada cuatro semanas y adramicina se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

administra intravenosamente a una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 d^as. La co-administracion de los anticuerpos anti-Glipicano-3, o fragmentos de enlace al antigeno de los mismos, de la presente invencion con agentes quimioterapeuticos proporciona dos agentes anti-cancerigenos los cuales operan v^a diferentes mecanismos los cuales proporcionan un efecto citotoxico a celulas de tumor humanas. La co-administracion puede resolver los problemas debido al desarrollo de resistencia a farmacos o cambio en la antigenicidad de las celulas de tumor las cuales les haria reactivas con el anticuerpo.

Las celulas efectoras especificas de diana, por ejemplo, celulas efectoras ligadas a composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas) de la invencion se pueden usar como agentes terapeuticos. Celulas efectoras para direccion pueden ser leucocitos humanos tal como macrofagos, neutrofilos o monocitos. Otras celulas incluyen eosinofilos, celulas asesinas naturales y otras celulas que portan el receptor IgG o IgA. Si se desea, las celulas efectoras se pueden obtener a partir del sujeto a ser tratado. Las celulas efectoras especificas de diana se pueden administrar como una suspension de celulas en una solucion fisiologicamente aceptable. El numero de celulas administradas puede estar en el orden de 108-109 pero variara dependiendo del proposito terapeutico. En general, la cantidad puede ser suficiente para obtener la ubicacion en la celula objetivo, por ejemplo, una celula tumoral que expresa Glipicano-3, y no afecta la eliminacion celular por, por ejemplo, fagocitosis. Las rutas de administracion tambien pueden variar.

La terapia con celulas especificas de diana se puede realizar junto con otras tecnicas para remover las celulas diana. Por ejemplo, terapia anti-tumor usando las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas) de la invencion y/o celulas efectoras armadas con estas composiciones se pueden usar junto con quimioterapia. Adicionalmente, la inmunoterapia de combinacion se puede usar para dirigir dos distintas poblaciones efectoras citotoxicas hacia rechazo de celula de tumor. Por ejemplo, anticuerpos anti-Glipicano- 3 enlazados a gamma RI anti-Fc o anti-CD3 se pueden usar junto con agentes de enlace especificos al receptor IgG o IgA.

Moleculas biespecificas y multiespecificas de la invencion tambien se pueden usar para modular FcyR o niveles de FcyR en celulas efectoras, tal como tapando y eliminacion de los receptores en la superficie celular. Las mezclas de receptores anti-Fc tambien se pueden usar para este proposito.

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, humanizados o quimericos, moleculas multiespecificas y biespecificas e inmunoconjugados) de la invencion las cuales tienen sitios de enlace al complemento, tal como porciones de IgG1, -2 o -3, o IgM los cuales se unen al complemento, tambien se pueden usar en la presencia del complemento. En una realizacion, tratamiento ex vivo de una poblacion de celulas que comprenden celulas diana con un agente de enlace de la invencion y celulas efectoras apropiadas se puede suplementar por la adicion del complemento o suero que contiene el complemento. La fagocitosis de las celulas diana recubiertas con un agente de enlace de la invencion se puede mejorar enlazando las proteinas del complemento. En otra realizacion, las celulas diana recubiertas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas) de la invencion tambien se pueden lisar por el complemento. En otra realizacion mas, las composiciones de la invencion no activan el complemento.

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, humanizados o quimericos, moleculas multiespecificas y biespecpificas e inmunoconjugados) de la invencion tambien se pueden administrar junto con el complemento. En determinadas realizaciones, las moleculas multiespecificas o biespecificas y suero o complemento. Estas composiciones pueden ser ventajosas cuando el complemento se localiza en proximidad cercana a los anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas o biespecificas. Como alternativa, los anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas o biespecificas de la invencion y el complemento o suero se pueden a administrar separadamente.

Tambien dentro del alcance de la presente invencion estan kits que comprenden las composiciones del anticuerpo de la invencion (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas o biespecificas, o inmunoconjugados) e instrucciones para uso. El kit puede ademas contener uno o mas reactivos adicionales, tal como un reactivo inmunosupresor, un agente citotoxico o un agente radiotoxico, o uno o mas anticuerpos humanos adicionales de la invencion (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria la cual se une a un epitopo en el antigeno Glipicano-3 distinto del primer anticuerpo humano).

Por consiguiente, los pacientes tratados con las composiciones del anticuerpo de la invencion pueden ser adicionalmente administrar (antes a, simultaneamente con, o despues de la administracion de un anticuerpo humano de la invencion) con otro agente terapeutico, tal como un agente citotoxico o radiotoxico, el cual intensifica o aumenta el efecto terapeutico de los anticuerpos humanos.

En otras realizaciones, el sujeto puede ser adicionalmente tratado con un agente que modula, por ejemplo, intensifica o inhibe, la expresion o actividad de Fcy o receptores Fcy por, por ejemplo, tratar al sujeto con una citocina. Citocinas preferidas para administracion durante el tratamiento con la molecula multiespecifica incluye el factor que estimula la colonia de granulocito (G-CSF), factor que estimula la colonia macrofaga de granulocito (GM- CSF), interferon y (IFN-y) y factor de necrosis tumoral (TNF).

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas) de la invencion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tambien se pueden usar a celulas diana que expresan FcyR o Glipicano-3, por ejemplo para etiquetar las celulas. Para este uso, el agente de enlace se puede unir a una molecula que se puede detectar. De esta forma, la invencion proporciona metodos para localizar ex vivo o in vivo, celulas que expresan los receptores Fc, tal como FcyR o Glipicano-3. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima.

En una realizacion particular, la invencion proporciona metodos para detectar la presencia de antigeno Glipicano-3 en una muestra, o medir la cantidad de antigeno Glipicano-3, que comprende poner en contacto la muestra, y una muestra control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porcion del mismo enlazado al antigeno, el cual se une especificamente a Glipicano-3, bajo condiciones que permiten la formacion de un complejo entre el anticuerpo o porcion del mismo y Glipicano-3. La formacion de un complejo despues se detecta, en donde una diferencia de formacion del complejo entre la muestra comparada a la muestra control es indicativo de la presencia de antigeno Glipicano-3 en la muestra.

En otros aspectos, la divulgacion proporciona metodos para tratar un trastorno mediado por Glipicano-3 en un sujeto, por ejemplo, CHC u otros canceres hepaticos.

En aun otra realizacion, los inmunoconjugados de la invencion se pueden usar para compuestos objetivo (por ejemplo, agentes terapeuticos, etiquetas, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) a celulas las cuales tienen receptores de superficie de celula Glipicano-3 enlazando los compuestos al anticuerpo. Por ejemplo, se puede conjugar un anticuerpo anti-Glipicano-3 a cualquiera de los compuestos de toxina descritos en las Patentes de Estados Unidos n.° 6.281.354 y 6.548.530, publicaciones de patente de Estados Unidos N.° 20030050331, 20030064984, 20030073852, y 20040087497, o publicado en WO 03/022806. De esta forma, la divulgacion tambien proporciona metodos para localizar ex vivo o in vivo celulas que expresan Glipicano-3 (por ejemplo, con una etiqueta detectable, tal como un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima). Como alternativa, los inmunoconjugados se pueden usar para matar celulas las cuales tienen receptores de superficie celular de Glipicano-3 dirigiendo citotoxinas o radiotoxinas al Glipicano-3.

La presente invencion ademas se ilustra mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben interpretarse para limitarla.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generacion de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra Antigeno Glipicano-3 Antigeno

Se crea una proteina de fusion recombinante, Glipicano-3 que comprende el dominio extracelular de la proteina Glipicano-3 enlazada a polipeptido no-Glipicano-3, una marca de histidina. El Glipicano-3-his se genera por metodos recombinantes estandar y se usa como un antigeno para inmunizacion. Ademas, las celulas CHO transfectadas con un constructo de expresion Glipicano-3-Myc y una linea celular, se usan Hep-G2 como antigenos para inmunizacion.

HuMAb Mouse® y KM Mouse® transgenicos

Se prepararan anticuerpos monoclonales completamente humanos para Glipicano-3 usando una cepa HCo17 del HuMAb Mouse® y la cepa KM de ratones transcromosomicos transgenicos, cada uno de los cuales expresa genes de anticuerpo humano. La cepa HCo17 se construye como se describe en el documento WO/2005/058815. La cepa KM se construye como se describe en el documento WO 02/43478.

Inmunizaciones de HuMab Mouse y KM Mouse

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para Glipicano-3, se inmunizan ratones del HuMAb Mouse® y KM Mouse® con proteinas Glipicano-3-his expresada en celulas CHO, celulas CHO que expresan la proteina Glipicano-3-Myc y celulas Hep-G2. Se describen esquema de inmunizacion general para el HuMAb Mouse® en Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y Publicacion PCT WO 98/24884. Los ratones tenian de 6-16 semanas de edad en la primera infusion del antigeno. Una preparation recombinante purificada (5-25 |jg) de proteina de fusion Glipicano-3 o Celulas de expresion de Glipicano-3 (1x107 celulas) se usaron para inmunizar cada HuMab mouse® y KM mouse®.

Ratones transgenicos se inmunizaron con antigeno en adyuvante completo Freund o adyuvante Ribi, ya sea intraperitonealmente (IP), subcutaneamente (Sc) o via la planta del pie (FP), seguido por 3-21 dias de inmunizacion IP, Sc o FP (hasta un total de 12 inmunizaciones), con el adyuvante Ribi o Freund incompleto. La respuesta inmune se monitoreo por sangrados retroorbitales. El plasma se selecciono por ELISA (como se describe abajo), y FACS, y los ratones con suficientes tituladores de inmunoglobulina humana anti-Glipicano-3, se usaron para infusiones. Los ratones se reforzaron intravenosamente con antigeno, 3 y 2 dias antes del sacrificio y remocion del vaso. Como es tipico, se realizaron entre diez y 35 fusiones para cada una de las fusiones. Se inmunizaron varias docenas de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ratones para cada antigeno.

Seleccion de HuMab Mouse® o KM Mouse® productor de Anticuerpos Anti-Glipicano-3

Para seleccionar un HuMab Mouse® o un KM Mouse® que produce anticuerpos que se unen a Glipicano-3, suero de ratones inmunizados se probaron por ELISA como se describe por Fishwild, D. et al. (1996)(supra). Brevemente, las placas microtituladoras se revistieron con Glipicano-3 recombinante purificado a 1-2 |jg /ml en PBS, 50 jl/cavidad incubada a 4°C durante la noche, despues se bloqueo con 200 jl/cavidad de suero de pollo al 5 % en PBS/Tween (0,05 %). Las diluciones de plasma a partir de ratones Glipicano-3 inmunizados, se agregaron a cada cavidad y se incubaron por 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y despues se incubaron con un anticuerpo policlonal Fc IgG anti-humano de cabra, conjutado con peroxidasa de rabano picante (HRP) por 1 hora a temperatura ambiente. Despues del lavado, las placas se desarrollaron con sustrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) y se analizaron por espectrofotometro a OD 415-495.

Los sueros de ratones inmunizados entonces se seleccionaron adicionalmente por citometria de flujo por enlace a una linea celular que expresa Glipicano-3 humano recombinante, pero no en una linea de celulas de control que no expresa Glipicano-3. Brevemente, el enlace de anticuerpos anti-Glipicano-3 se valoro incubando celulas CHO que expresan Glipicano-3 con el anticuerpo anti-Glipicano-3 a una dilucion de 1:20. Las celulas se lavaron y el enlace se detecto con un Ab IgG anti-humano etiquetado con FITC. Los analisis citometricos de flujo se realizaron usando un citometro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Los ratones que desarrollaron los tituladores mas altos de anticuerpos anti-Glipicano-3, se usaron por fusiones. Las fusiones se realizaron como se describe abajo, y se probaron los sobrenadantes de hibridoma para determinar la actividad anti-Glipicano-3 por ELISA y FACS.

Generacion de Hibridomas productores de Anticuerpos Monoclonales a Glipicano-3:

Los esplenocitos de raton, aislados de un HuMab mouse® o un KM mouse®, se fusionaron usando electrofusion a base de campo electrico, usando un electroporador de fusion de desecho de camara grande de Pulso Cyto, (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Los hibridomas resultantes entonces se seleccionaron para la produccion de anticuerpos especificos del antigeno. Las suspensiones celulares unicas de linfocitos esplenicos a partir de ratones inmunizados, se fusionaron con celulas de mieloma de raton no secretante SP2/0 (AtCC, CrL 1581), usando electrofusion a base de campo electrico usando un electroporacion de desecho de camara grande de Pulso Cyto (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Las celulas se plaquearon a aproximadamente 1x104 celulas/cavidad en placas microtituladoras de fondo plano, seguidas por aproximadamente dos semanas de incubacion en medio selectivo que contiene suero bovino fetal al 10 %, 10 % de medio acondicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5 % de origen (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con alta glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio), mas 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina y 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Despues de 1-2 semanas, las celulas se cultivaron en medio, en el cual el HAT se reemplazo con HT. Las cavidades individuales entonces se seleccionaron por ELISA y FACS (descrito anteriormente), para anticuerpos IgG monoclonales anti-Glipicano-3 humanos. Una vez que ha ocurrido el crecimiento extensivo de hibridoma, el medio se monitorea usualmente despues de 10-14 dias. Los hibridomas que secretan anticuerpo se replaquearon, seleccionaron nuevamente y, si todavia son positivos para anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3, IgG humanos, se subclonaron al menos, dos veces por dilucion limitante. Los subclones estables entonces se cultivaron in vitro para generar pequenas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterizacion adicional.

Los clones de hibridoma 4A6, 11E7, y 16D10, generados a partir de un HuMAb Mouse®, se seleccionaron para analisis adicional.

Ejemplo 2: Caracterizacion Estructural de los Anticuerpos Monoclonales Humanos 4A6, 11E7, y 16D10

Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10, se obtuvieron a partir de los hibridomas 4A6, 11E7, y 16D10, respectivamente, usando tecnicas de PCR estandares y se secuenciaron usando tecnicas de secuenciamiento de ADN estandar.

Las secuencias de aminoacido y nucleotido de la region variable de cadena pesada de 4A6, se muestran en la Figura 1A y en la SEQ ID N°:25 y 19, respectivamente.

Las secuencias de aminoacido y nucleotido de la refion variable de cadena ligera de 4A6, se muestran en la Figura 1B y en la SEC ID N°: 28 y 22, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 4A6 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de linea germinal humana conocida, demuestra que la cadena pesada 4A6 utiliza un segmento Vh de la linea germinal humana Vh 5-51 y un segmento Jh a partir de la linea germinal humana JH4b. El alineamiento de la secuencia de Vh 4A6 a la secuencia Vh 5-51 de linea germinal, se muestra en la Figura 4. Analisis adicional de la secuencia Vh de 4A6 usando el sistema Kabat de la determinacion de region CDR, conduce a el delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 1A y 4, y en las SEC ID N°: 1,4 y 7, respectivamente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 4A6 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de lmea germinal humana conocida, demostraron que la cadena ligera 4A6 utiliza un segmento Vl de una lmea germinal humana Vk A27 y un segmento Jk de la lmea germinal humana JK4. El alineamiento de la secuencia Vl 4A6 con la secuencia Vk A27 de linea germinal, se muestra en la Figura 7. El analisis adicional de la secuencia Vl 4A6 usando el sistema Kabat de la determinacion de region CDR, condujo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, como se muestra en las Figuras 1B y 7, y en las SEC ID N°: 10, 13, y 16, respectivamente.

Las secuencias de aminoacido y nucleotido de la region variable de cadena pesada de 11E7, se muestran en la Figura 2A y en las SEC ID N°: 26 y 20, respectivamente.

Las secuencias de aminoacido y nucleotido de la region variable de cadena ligera de 11E7, se muestran en la Figura 2B y en SEC ID N°: 29 y 23, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 11E7 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de linea germinal humana conocidas, demuestran que la cadena pesada 11E7 utiliza un segmento Vh a partir del Vh 5-51 de linea germinal humana y un segmento Jh a partir de una linea germinal humana JH4b. El alineamiento de la secuencia Vh de 11E7 a la secuencia Vh 5-51 de linea germinal humana, se muestra en la Figura 5. Analisis adicional de la secuencia 11E7 usando un sistema Kabat de la determinacion de region CDR, conduce al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, como se muestra en las Figuras 2A y 5, y en las SEC ID N°: 2, 5, y 8, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 11E7 a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de linea germinal humana conocidas, demuestra que la cadena ligera 11E7 utiliza un segmento Vl a partir del segmento Vk A27 y Jk de linea germinal humana a partir de JK4 de linea germinal humana. El alineamiento de la secuencia Vl de 11E7 a la secuencia Vk A27 de linea germinal, se muestra en la Figura 8. Analisis adicional de la secuencia Vl 11E7 usando el sistema Kabat de la determinacion de region CDR, conduce al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 2B y 8, y en las SEC ID N°: 11, 14, y 17, respectivamente.

Las secuencias de aminoacido y nucleotido de la region variable de cadena pesada de 16D10, se muestran en la Figura 3A y en las SEC ID N°: 27 y 21, respectivamente.

Las secuencias de aminoacido y nucleotido de la region variable de cadena ligera de 16D10, se muestran en la Figura 3B y en las SEC ID N°: 30 y 24, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 16D10 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de linea germinal humana conocidas, demuestra que la cadena pesada 16D10 utiliza un segmento Vh a partir de un segmento Jh y Vh 5-51 de linea germinal humana a partir de la linea germinal humana JH4b. El alineamiento de la secuencia Vh 16D10 a la secuencia de linea germinal Vh 5-51, se muestra en la Figura 6. Analisis adicional de la secuencia Vh 16D10 usando el sistema Kabat de determinacion de region CDR, conduce al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, como se muestra en las Figuras 3A y 6, y en las SEC ID N°: 3, 6, y 9, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 16D10 a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de linea germinal humana conocidas, demuestra que la cadena ligera 16D10, utiliza un segmento Vl del segmento Jk y Vk A27 de linea germinal humana a partir de la linea germinal humana JK1. El alineamiento de la secuencia Vl 16D10 a la secuencia Vk A27 de linea germinal, se muestra en la Figura 9. Analisis adicional de la secuencia Vl de 16D10 usando el sistema Kabat de determinacion de region CDR, conduce al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3, como se muestra en las Figuras 3B y 9, y en las SEC ID N°: 12, 15, y 18, respectivamente.

Ejemplo 3: Caracterizacion de Especificidad de union y Cinetica de Enlace de Anticuerpos Monoclonales Humanos Anti-Glipicano-3

En este ejemplo, la afinidad de enlace, cinetica y especificidad de anticuerpos anti-Glipicano-3, se examinaron por analisis Biacore y citometria de flujo.

Afinidad y Cinetica de union

Los anticuerpos anti-Glipicano-3 se caracterizaron para determinar cineticas y afinidades de enlace por analisis Biacor (Biacore AB, Uppsala, Sweden). El Glipicano-3 se enlazo covalentemente a un chip CM5 (chip revestido de carboximetil dextrano), via aminas primarias, usando quimica de acoplamiento de amina estandar y kit proporcionado por Biacore. El enlace se midio fluyendo una serie de concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3 en amortiguador HBS-Ep (proporcionado por Biacore AB) a 20, 10, 5, 2,5 y 1,25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

|jg/ml a una velocidad de flujo de 40 jL/min. El enlace antecedente se conto fluyendo a series de concentracion de IgG1 a traves del mismo chip. Las cineticas de asociacion de antigeno-anticuerpo, se siguieron por 3 minutos y las cineticas de disociacion se siguieron por 10 minutos. Las curvas de asociacion y disociacion se ajustaron a un modelo de enlace Langmuir 1: usando software BIAevaluation (Biacore AB). Los valores Kd, kasoc y kdisoc, que se determinaron, se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Datos de union de Biacore para anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3

Anticuerpo anti-Glipicano- 3: Kd de afinidad x 10-9 (M) Constante de asoc. Kasoc x 106 (1/ms) Constante de disoc. Kdisoc x 10-4 1/s

4A6: 0,20 1,6 3,2

16D10: 0,31 1,8 5,4

11E7: 0,40 1,8 7,3

Afinidad de union medida por FACS

Los anticuerpos anti-Glipicano-3, se mostraron por unirse a las proteinas de Glipicano-3 de la superficie celular, con una alta afinidad usando un ensayo clasificador celular activado por fluorescencia (“FACS"). Se agrego la linea celular CHC Hep-3B a una densidad de 2 x 105 celulas en cada cavidad de placa de 96 pocillos. Los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10, se agregaron a una concentracion de partida de 20jg/ml y se diluyo serialmente el anticuerpo a una dilucion 1:3. Las celulas se lavaron y se detecto el enlace con un Ab IgG anti-humano etiquetado con FITC. Los analisis citometricos de flujo se realizaron usando citometro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Las afinidades de enlace resultantes, trazadas como la intensidad de fluorescencia media (“MFI”), se muestran en la Figura 10. Las afinidades de enlace de los anticuerpos se unen a las celulas CHC en una manera dependiente de la concentracion. La concentracion efectiva (“EC50”) para cada anticuerpo, se determino como la concentracion que resulta en una intensidad de fluorescencia media al 50 % (“MFI”). En este ejemplo, se observo la afinidad de enlace mas fuerte con el anticuerpo 4A6, el cual mostro un MFI de 0,83. La siguiente mejor afinidad observada fue para 16D10, el cual tiene un EC50 de 1,39. La afinidad observada mas baja de los tres anticuerpos, fue para 11E7, la cual tiene un EC50 de 1,98.

Especificidad de union medida por FACS

Los anticuerpos anti-Glipicano-3, se mostraron por unirse a proteinas Glipicano-3 de la superficie celular, con una alta especificidad usando un ensayo FACS. Las lineas de celulas CHC Hep-3B y Hep-G2, se hicieron crecer en DMEM + 10 % de FBS, a una densidad de 1 x 105 celulas. Los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7 y 16D10, se agregaron a una concentracion de 10 jg/ml. Adicionalmente, se analizaron tres controles negativos por comparacion. Estos controles negativos fueron (1) no todos tenidos, (2) el anticuerpo secundario agregado solo, y (3) un anticuerpo de control de isotipo hIgGi. Las celulas se lavaron y se detecto enlace con un Ab IgG anti-humano etiquetado con FITC. Se realizaron analisis citometricos de flujo usando un citometro de flujo FACSCalibur. La Figura 11 muestra que los anticuerpos anti-Glipicano-3 unidos a las celulas CHC con una alta afinidad. Por el contrario, las muestras de control negativo no mostraron algun enlace a las celulas CHC.

Lineas de celulas de ovario de Hamster chino (CHO), que expresan establemente Glipicano-3 en la superficie celular, se desarrollaron y usaron para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales Glipicano-3 por citometria de flujo. Las celulas CHO se transfectaron con plasmidos de expresion que contienen ADNc de longitud completa que codifican a Glipicano-3. El enlace de los tres anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3, se valoro incubando las celulas transfectadas con cada uno de los anticuerpos Glipicano-3 a una concentracion de 10 jg/ml. Las celulas se lavaron y se detecto el enlace con un Ab IgG anti-humano etiquetado con picoeritrina (BD Biosciences). El anticuerpo secundario solo, se uso como un control negativo. Los resultados se representan en la Figura 12. Los anticuerpos monoclonales de Glipicano-3, 4A6, 11E7, y 16D10, unidos a la linea de celulas CHO transfectados con Glipicano-3 pero no con las lineas de celulas CHO progenitores. Estos daos demuestran que la especificidad de los anticuerpos monoclonales para Glipicano-3.

Agrupamiento de epitopos de anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3 por Biacore

Se realizo agrupamiento de epitopo por analisis Biacore, para determinar si los anticuerpos anti-Glipicano-3 se enlazan a epitopos traslapantes. Los anticuerpos que tienen epitopos traslapantes, competiran para enlace a Glipicano-3, mientras aquellos con distintos epitopos no competiran y simultaneamente se enlazaran al antigeno. Los 4A6 y 16D10 purificados, se inmovilizaron a 4000 RU en un chip CM5 usando un protocolo de acoplamiento estandar. El Glipicano-3-his (50 nM), se pre-incubo por al menos 1 hora con los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, o 16D10, previo a la inyeccion. Las concentraciones de anticuerpo fueron en una serie de dilucion en dos partes partiendo a 400 nM. Las mezclas de anticuerpo-antigeno se inyectaron a una velocidad de flujo de 5 |jl/min por 5 minutos. Cada uno de los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7 y 16D10, fuera capaz de competir para enlace a los anticuerpos 4A6 y 16D10 inmovilizados en una manera dependiente de la concentracion. Esto muestra que 4A6, 16D10, y 11E7, tienen epitopos trasplantes.

Ejemplo 4: Los anticuerpos Glipicano-3 se unen a tejido canceroso hepatico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El anticuerpo monoclonal anti-Glipicano-3 4A6, se mostro por unirse a tejidos cancerosos hepaticos humanos. Se obtuvieron biopsias de pacientes con cancer hepatico y los anticuerpos se usaron para tenido por inmunohistoqmmica (Cytomyx, MA). Se usaron nucleos de tejidos de 5 |jm. Despues del secado por 30 minutos en los portaobjetos, las secciones de tejido se fijaron con acetona a temperatura ambiente por 5 minutos. Los portaobjetos se enjuagaron en PBS y despues se bloquearon con proteina libre de suero y bloqueador de peroxidasa (Dako S2001, CO) y subsecuentemente se incubaron con complejo de anticuerpo primario a 5 |jg/ml por 45 minutos a temperatura ambiente. Despues, los portaobjetos se lavaron e incubaron por 30 minutos con anticuerpo secundario conjugado con FITC (Jackson Immunoresearch Lab, 109-097-003) y se lavaron nuevamente con PBS e incubaron con conjugados HRP de polimero (Dako, CO, K4063) por 20 minutos. Se uso cromogeno (Dako K3464) como un sustrato, resultando en tenido marron. Los portaobjetos se montaron en un Medio de Montaje Acuoso Faramount (Dako, S3025). El 4A6 se mostro por unirse especificamente a celulas de tumor hepatico. Como se ejemplifica en la Figura 13, el anticuerpo monoclonal especificamente tine tejido hepatico canceroso pero no el tejido normal circundante. Cuando se tine con los anticuerpos monoclonales, otros organos exhiben tenido no especifico o negativo, los cuales incluyen utero, pulmon, higado, rinon, colon, cuello de utero, mama, medula osea, glandulas suprarrenales, cerebelo, cerebro, esofago, corazon, prostata, placenta, pituitaria, ovario, pancreas, mesotelio, glandulas salivales, amigdalas, piel, intestino delgado, musculo esqueletico, estomago, vaso, testiculos, timo y tiroides. Los datos demuestran que 4A6 HuMab anti-Gpc3, reconocen Gpc3 expresadas en tumores hepaticos.

Ejemplo 5: Actividad de los anticuerpos anti-Glipicano-3

Se demostro que los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7 y 16D10 eliminan a las celulas Hep-G2 positivas para Gcp3 en presencia celulas T citoliticas naturales usando un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (“ADCC”).

Se prepararon celulas efectoras humanas a partir de sangre completa como sigue. Celulas mononucleares de sangre periferica humana, se purificaron a partir de sangre completa heparinizada por separacion de paca Ficoll estandar. Las celulas se resuspendieron en medio RPMI 1640 que contiene 10 % de FBS 200U/ml de IL-2 humano (PeproTech, NJ), y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al siguiente dia, las celulas se recolectaron y se lavaron dos veces en RPMl + 1 % de BSA (medio de ensayo) y se resuspendieron a 1x10e6/ml.

100 jl de celulas diana a 1x10e4/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano, se incubaron en medio de ensayo durante la noche a 37 °C. Despues que las celulas diana se lavaron dos veces en medio de ensayo, 100 jl del medio de ensayo se agregaron en cada cavidad y se incubo por 50 jl de las celulas efectoras y 50 jl de ya sea anticuerpos anti-Gpc3 o IgG1 humano como control de isotipo a una concentration final de 10 jg/ml. La linea de celulas Hep-G2 de Gpc3, se probo por especificidad de anticuerpo ADCC a anticuerpos anti-Gpc3 usando el kit de detection de citotoxicidad Takara lDh (Roche, 04744 926001, Suiza), un analisis de emision de fluorescencia como sigue. La linea de celulas objetiva, Hep-G2, se incubo con celulas efectoras a una relation de objetivo a efector de 1:50. Despues de una incubation de 18 horas a 37 °C, se recolectaron 100 jl de los sobrenadantes y se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano. Se agregaron 100 jl de Solution C a cada cavidad y se incubo a temperatura ambiente por 30 minutos. La absorbancia de las muestras a 490 nM, se midio por SPECTRAMAX 340 PC (MTX Lab System, VA). El % de lisis se determino calculando la absorbancia promedio de los triplicados, y sustrayendo el antecedente.

Como se puede ver en la Figura 14, los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7 y 16D10, cada uno causa lisis especifica de las celulas Hep-3b por celulas T asesinas naturales, comparadas con el anticuerpo de control de isotipo hIgG1.

Ejemplo 6: Internalization de Anticuerpo Anti-Glipicano-3

Los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10, se mostraron por ser internalizados por celulas Hep-3b despues del enlace a las celulas usando un ensayo Hum-Zap. El ensayo Hum-ZAP, mostro la internalizacion de los anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3 a traves del enlace de un anticuerpo secundario IgG anti-humano, conjugado a la saporina toxina. (Advanced Targeting System, San Diego, CA, lT-22-100). Primero, 4A6, 11E7, y 16D10 se unieron a la superficie de las celulas Hep-3B. Despues, los anticuerpos Hum-ZAP se unieron a los anticuerpos primarios. Despues, el complejo primario anticuerpo/Hum-ZAP se internalizo por las celulas. La entrada de Saporina en las celulas resulto en la inhibition de sintesis de proteina y eventual muerte celular.

El ensayo Hum-ZAP se condujo como sigue. Cada una de las celulas se sembro a una densidad de 3x103 celulas por cavidad. Los anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3 o un IgG humano de control de isotipo, se diluyeron serialmente, despues se agregaron a las celulas. El Hum-ZAP entonces se agrego a una concentracion de 2 jg/ml y las placas se dejaron incubar por 96 horas. La viabilidad celular en las placas se detecto por kit de Ensayo de Viabilidad de Celula Luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, G7571) y las placas se leyeron a 490nM por un Luminomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA). Los datos se analizaron por Prism (Graphpad). Como se puede ver en la Figura 15, la muerte celular fue proporcional a la concentracion de anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

16D10. De este modo, los anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3 se internalizaron eficientemente por celulas Hep-3b, comparado con el anticuerpo de control de isotipo hIgGl.

Los anticuerpos monoclonales 4A6, 11E7, y 16D10, tambien se mostraron por ser internalizados por celulas Hep-3b, usando un ensayo de tenido por inmunohistoqmmica. Las celulas, recolectadas con la solucion de disociacion celular, se sembraron a 104 celulas por 100ul de medio en cada cavidad de una placa de 96 pocillos y se incubo con cada anticuerpo monoclonal a una concentracion de 5|jg/ml en amortiguador FACs (PBS + 5 % FBS) por 30 minutos en hielo. Se uso un control de isotipo IgG1 humano, como un control negativo. Las celulas se lavaron dos veces, se resuspendieron en medio (100ul por cavidad), y despues se incubaron en anticuerpo secundario anti-humano de cabra conjugado con ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch Lab, PA) a una dilucion 1:100 por 30 minutos. Las celulas entonces se lavaron con el medio y ya sea inmediatamente se formaron en imagen bajo un microscopio de fluorescencia o se incubaron a 37° C para formation de imagen a puntos de tiempo posteriores. Las imagenes de morfologia celular e intensidad de inmunofluorescencia de las celulas tenidas, se tomaron con una camara Nikon TE200 camera a 0, 30 o 60 minutos como se indica en la Figura 16. La fluorescencia fue solamente observad en las celulas tenidas con los anticuerpos 4A6, 11E7, y 16D10. No se detecto fluorescencia con el anticuerpo de control

igG1.

Como se puede ver en la Figura 16, a 0 minutos despues de la adicion de los anticuerpos, las celulas se tineron en la superficie celular. Despues de 30 minutos, las celulas han comenzado a internalizar los anticuerpos. Despues de 60 minutos, los anticuerpos han sido casi completamente internalizados por las celulas. Esto muestra que los anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3 humanos, son especificamente internalizados despues del enlace a celulas CHC que expresan Glipicano-3.

Ejemplo 7: Estabilidad del anticuerpo anti-Glipicano-3

Estabilidad Termica

Se determino la estabilidad termica de los anticuerpos monoclonales anti-Glipicano-3, por analisis calorimetrico de las temperaturas de fusion para los anticuerpos 4A6, 11E7, y 16D10. Las mediciones calorimetricas de temperaturas de fusion (Tm), se realizaron en una plataforma microcalorimetrica de exploration diferencial DSC VP-Capilar, que se combino con un automuestreador (MicroCal LLC, Northampton, MA, USA). El volumen de celula de muestra fue 0,144 mL. Los datos de desnaturalizacion sobre los anticuerpos, se obtuvieron calentando las muestras, a una concentracion de 2,3 ^M, desde 30 hasta 95 °C a una velocidad de 1 °C/min en salina amortiguada con fosfato (PBS) a pH 7,4. Se uso el mismo amortiguador en la celula de referencia para obtener la capacidad de calor molar por comparacion. Los termogramas observados fueron corregidos de la linea base y los datos normalizados se analizaron basados en un modelo sin 2- estados, usando el software Origin v7.0. Como se muestra en la Tabla 2, el 16D10 se observo por tener el grado mas alto de estabilidad termica de los tres anticuerpos monoclonales anti- Glipicano-3.

Tabla 2: Calorimetria de exploracion diferencial:

Anti-Glipicano-3: Tm1 (°C) Tm2 (°C) Tm3 (°C)

16D10: 72,1 74,3 83,5

4A6: 70,7 80,9 83,1

11E7: 70,6 82,6 84,9

Estabilidad Quimica medida por espectroscopio de fluorescencia

Se comparo la estabilidad de 4A6, 11E7, y 16D10, midiendo el punto medio de desnaturalizacion quimica por espectroscopio de fluorescencia. Las mediciones de fluorescencia de desnaturacion quimica se realizaron en un SPEX Fluorolog 3,22, equipado con un lector de placa Micromax (SPEX, Edison, NJ). Las mediciones se realizaron en las muestras de anticuerpo que han sido equilibradas por 20 horas en 16 diferentes concentraciones de clorhidrato de guanidinio en amortiguador de PBS. Las mediciones se hicieron en placas de 384 cavidades de superficie no enlazante, de bajo volumen, negras (Corning, Acton, MA) y requieren 1 |jM de anticuerpo en un volumen de cavidad de 12 jL. La fluorescencia se excito a 280 nm y los espectros de emision se midieron entre 320 y 400nm. La velocidad de exploracion fue 1 segundo por nm y los deslizamientos se ajustaron a un paso de banda de 5nm. Se realizo un blanco amortiguador usando PBS y se sustrajo automaticamente a partir de los datos. Los datos se ajustaron a un modelo de desnaturalizacion de dos estados usando software GraphPad Prism software. Como se muestra en la Tabla 3, se observo que 16D10 y 4A6, tienen estabilidades similares, pero el 11E7 mostro despliegue bifasico.

Tabla 3: Desnaturalizacion quimica determinada por espectroscopio de fluorescencia

Clon: Punto medio dedespliegue (M)

4A6: 2,84

16D10: 2,74

11E7: bifasico

La discusion de las referencias aqui, se pretende para resumir meramente las afirmaciones hechas por sus autores, no se hace admision de que cualquier referencia constituye la tecnica anterior y los Solicitantes reservan el derecho 5 a cambiar la exactitud y pertinencia de las referencias citadas.

Aunque la invencion mencionada anteriormente ha sido descrita en algun detalle por medio de ilustracion y ejemplos, para propositos de claridad de entendimiento, sera facilmente aparente para aquellos de habilidad ordinaria en la tecnica en vista de las ensenanzas de esta invencion, que ciertos cambios y modificaciones pueden 10 hacerse a esta, sin apartarse del espiritu o alcance de las reivindicaciones dependientes.

Tabla 4: Sumario de listado de secuencias

SEC ID NO:: SECUENCIA SEC ID NO: SECUENCIA

1: CDR1 de VH a.a. 4A6 25 VH n.t. 4A6

2: CDR1 de VH a.a. 11E7 26 VH n.t. 11E7

3: CDR1 de VH a.a. 16D10 27 VH n.t. 16D10

4: CDR2 de VH a.a. 4A6 28 VK n.t. 4A6

5: CDR2 de VH a.a. 11E7 29 VK n.t. 11E7

6: CDR2 de VH a.a. 16D10 30 VK n.t. 16D10

7: CDR3 de VH a.a. 4A6 31 linea germinal VH 5-51 a.a.

8: CDR3 de VH a.a. 11E7 32 linea germinal JH JH4b a.a.

9: CDR3 de VH a.a. 16D10 33 linea germinal VK A27 a.a.

10: CDR1 de VK a.a. 4A6 34 linea germinal JK JK4 a.a.

11: CDR1 de VK a.a. 11E7 35 linea germinal JK JK1 a.a

12: CDR1 de VK a.a. 16D10 36 Glipicano-3 a.a.

13: CDR2 de VK a.a. 4A6

14: CDR2 de VK a.a. 11E7

15: CDR2 de VK a.a. 16D10

16: CDR3 de VK a.a. 4A6

17: CDR3 de VK a.a. 11E7

18: CDR3 de VK a.a. 16D10

19: VH a.a. 4A6

20: VH a.a. 11E7

21: VH a.a. 16D10

22: VK a.a. 4A6

23: VK a.a. 11E7

24: VK a.a. 16D10

15 Listado de secuencias

<110> Medarex Inc.

<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA GLIPICANO-3

20

<130> P34550EP-PCT

<140> EP08796249.4 <141 > 25

<150> US 60/959845 <151>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211>5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Tyr Trp lie Ala 1 5

<210>2 <211>5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

Asn Tyr Trp lie Ala

1 5

<210>3 <211>5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>3

Asn Tyr Trp lie Gly 1 5

<210>4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>4

lie lie Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15

Gly

<210>5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5

lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15

Gly

<210>6 <211> 17 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<213> Homo sapiens <400>6

lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15

Gly

<210>7 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 7

Thr Arg Gin Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5

<210>8 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>8

Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5

<210>9 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>9

Thr Arg Glu Gly Phe Phe Asp Tyr

1 5

<210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 10

Arg Ala Val Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10

<210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 11

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10

<210> 12 <211> 12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 12

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10

<210> 13 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 13

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5

<210> 14 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 14

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5

<210> 15 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 15

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5

<210> 16 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 16

Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Thr 1 . 5

<210> 17 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 17

Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Thr 1 5

<210> 18 <211>8 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 18

Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Thr 1 5

5 <210> 19

<211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens

10 <400>19

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp lie Ala Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 '40 45

Gly lie lie Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50- 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Arg Ser lie Arg Thr Ala Tyr

65 70 75' 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

. 85 90 '95

imagen1

<210> 20

15 <211> 117

<212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 20

20

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 - 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 ■

Trp lie Ala Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

■ 35 40 45

Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys.

85 90 95

Ala Arg Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 21 <211> 117 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

imagen2

<210> 22 <211> 107 <212> PRT

5

10

<213> Homo sapiens <400> 22

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Tbr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Val Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105

<210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 23

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

He Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Pbe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105

<210> 24 <211> 107 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Glu lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

10

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105

<210> 25 <211> 351 <212> ADN

15 <213> Homo sapiens

gaggtgcagc: tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg: gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag: gcctggagtg gatggggatc atctttcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct: tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca ggtccatcag aaccgcctac 240

ctgcagtgga: gcagcctgaa ggcctcggac accgccttgt attactgtgc gagaacccgg 300

gaggggtact: ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

5

10

15

20

25

<210> 26 <211> 351 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 26

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc aactactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag aaccgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaacccgg 300

gaggggtact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

<210> 27 <211> 351 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 27

gaggtgcaac tggtgcagtc tggagcagat gtgacaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg tttctggata caggtttacc aactactgga tcggctggat gcgccagatg 120

tccgggaaag gcctggaatg gatgggcatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agtccgtcct tccaaggcca cgtcaccatc tcagccgaca aatccatcaa caccgcctac 240

ctacggtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccattt attactgtgc gcgaacccgg 300

gaggggttct ttgactactg gggccaggga accccggtca ccgtctcctc a 351

<210> 28 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens

5

10

15

20

gaaattgtgt: tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca: gggccgttca gagtgttagc agcagctatt tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg: ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca: gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt: ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac tttcggcgga 300

gggaccaagg: tggagatcaa a 321

<210> 29 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 29

gaaattgtgt: tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca: gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg: ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca: gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt: ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac tttcggcgga 300

gggaccaagg: tggagatcaa a 321

<210> 30 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 30

gaaattctgt: tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca: gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg: ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca: gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt: ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgac gttcggccaa 300

gggaccaagg: tggaaatcaa a 321

<210> 31 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 31

imagen3

5

10

15

<210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 32

Tyr Phe Asp Tyr Tup Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 15

<210> 33 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 33

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

5

10

15

20

25

lie: Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
lie

: 50 55

Gly: Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65: 70 75

Pro: Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin

85

90

Pro Asp Arg Phe Ser 60

lie Ser Arg Leu Glu

80

Tyr Gly Ser Ser Pro 95

<210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 34

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 1 5 10

<210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 35

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 15 10

<210> 36 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 36

Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 15 10 15

Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gin Ala Gin Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30

Ala Thr Cys His Gin Val Arg Ser Phe Phe Gin Arg Leu Gin Pro Gly 35 40 45

Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gin Val 50 55 60

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o una porcion de union a antigeno del mismo seleccionados entre el grupo que consiste en:

(i) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden:

a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 1;

b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 4;

c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 7;

d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 10;

e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 13; y

f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 16;

(ii) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden:

a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 2;

b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 5;

c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 8;

d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 11;

e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 14; y

f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 17; y

(iii) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden:

a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 3;

b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 6;

c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 9;

d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 12;

e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 15; y

f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 18;

en donde el anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo se unen a Glipicano-3.
2. El anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo de la reivindicacion 1 que comprenden:

a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 1;

b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 4;

c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 7;

d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 10;

e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 13; y

f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 16.
3. El anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo de la reivindicacion 1 que comprenden:

a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 2;

b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 5;

c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 8;

d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 11;

e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 14; y

f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 17.
4. El anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo de la reivindicacion 1 que comprenden:

a) una CDR1 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 3;

b) una CDR2 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 6;

c) una CDR3 de region variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N°: 9;

d) una CDR1 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 12;

e) una CDR2 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 15; y

f) una CDR3 de region variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N°: 18.
5. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porcion de union a antigeno del mismo seleccionados entre el grupo que consiste en:

i) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 19; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 22;

ii) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 20; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 23; y

iii) un anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo que comprenden:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 21; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 24; en el que el anticuerpo o una porcion de union a antigeno del mismo se unen a Glipicano-3.
6. El anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo de la reivindicacion 5, que comprenden:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 19; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 22.
7. El anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo de la reivindicacion 5, que comprenden:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 20; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 23.
8. El anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo de la reivindicacion 5, que comprenden:

(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 21; y

(b) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 24.
9. El anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo hipofucosilado.
10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, el cual es un anticuerpo de longitud completa de un isotipo IgG1 o una porcion de union a antigeno del mismo.
11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, el cual es un anticuerpo de longitud completa de un isotipo IgG4 o una porcion de union a antigeno del mismo.
12. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, o porcion de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, ligado a un agente terapeutico.
13. El inmunoconjugado de la reivindicacion 12, en el que el agente terapeutico es una citotoxina.
14. El inmunoconjugado de la reivindicacion 12, en el que el agente terapeutico es un isotopo radiactivo.
15. Una composicion que comprende el anticuerpo, o porcion de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
16. Una molecula aislada de acido nucleico que codifica el anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
17. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 16.
18. Una celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 17.
19. El anticuerpo, o una porcion de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en un metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales que expresan Glipicano-3, en donde el metodo comprende poner en contacto las celulas con el anticuerpo o porcion de union a antigeno del mismo.
20. El anticuerpo, o una porcion de union a antigeno del mismo, para su uso en un metodo como se define en la reivindicacion 19, en donde las celulas tumorales proceden de tejido hepatico.
21. El anticuerpo, o una porcion de union a antigeno del mismo, para su uso en un metodo como se define en la reivindicacion 19, en donde el anticuerpo, o porcion de union a antigeno del mismo, es un inmunoconjugado.

segmento V: 5-51

segmento J: JH4b

evqlvqsgaevkkpgesl

1 GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG

CDR1

kisckgsgysftsywiaw

55 AAG ATC TCC TGT AAG GGT TCT GGA TAC AGC TTT ACC AGC TAC TGG ATC GCC TGG

CDR2

VRQMPGKGLEWMGIIFPG 109 GTG CGC CAG ATG CCC GGG AAA GGC CTG GAG TGG ATG GGG ATC ATC TTT CCT GGT

CDR2

dsdtryspsfqgqvtisa

163 GAC TCT GAT ACC AGA TAC AGC CCG TCC TTC CAA GGC CAG GTC ACC ATC TCA GCC

DRS IRTAYLQW S SLKASD 217 GAC AGG TCC ATC AGA ACC GCC TAC CTG CAG TGG AGC AGC CTG AAG GCC TCG GAC

CDR3

TALYYCARTREGYFDYWG 271 ACC GCC TTG TAT TAC TGT GCG AGA ACC CGG GAG GGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC

QGTLVTVSS 325 CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA

>Glypican-3 4A6, VH-NT con lider

ATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTG

T GCC G AGGT GC AGC T GGT GC AGTCTGG AGC AGAGGT G A AA AAGC C C GGGG A

GTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGA

TCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCAT

CTTTCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCA

CCATCTCAGCCGACAGGTCCATCAGAACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCT

GAAGGCCTCGGACACCGCCTTGTATTACTGTGCGAGAACCCGGGAGGGGTAC

TTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

> Glypican-3 4A6, VH-AA con lider

MGSTAILALLLAVLQGVCAEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIA WVRQMPGKGLEWMG1IFPGDSDTRYSPSFQGQVTISADRSIRTAYLQWSSLKAS DTAL Y Y C ARTREG YFD YW GQGTL VTV S S

segmento V: A27

segmento J: JK4

eivltqspgtlslspger

1 GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA

CDR1

atlscravqsvsssylaw

55 GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC GTT CAG AGT GTT AGC AGC AGC TAT TTA GCC TGG

CDR2

YQQKPGQAPRLLIYGASS 109 TAC CAG CAG AAA CCT GGC CAG GOT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC AGC

CDR2

RATGIPDRFSGSGSGTDF 163 AGG GCC ACT GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC

CDR3

tltisrle PEDFAVYYCQ 217 ACT CTC ACC ATC AGC AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAG

CDR3

QYGSSPTFGGGTKVEIK 271 CAG TAT GGT AGC TCA CCC ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA

>Glypican~3 4A6, YK-NT con lider

ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATAC

CACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAG

GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCGTTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTA

TTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATG

GTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTC

TGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCA

GTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCACTTTCGGCGGAGGGACCA

AGGT GGAG AT C A A A

>Glypican-3 4A6, VK-AA con lider

METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAVQSVSSSYLA WY QQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRF S GS GS GTDFTLTISRLEPEDF A V YYCQQ YGS SPTF GGGTKVEIK

segmento V: 5-51

segmento J: JH4b

EVQLVQSGAEVKKPGESL 1 GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG

CDR 1

KISCKGSGYSFTNYWIAW 55 AAG ATC TCC TGT AAG GGT TCT GGA TAC AGC TTT ACC AAC TAC TGG ATC GCC TGG

CDR 2

VRQMPGKGLEWMGI IYPG 109 GTG CGC CAG ATG CCC GGG AAA GGC CTG GAG TGG ATG GGG ATC ATC TAT CCT GGT

CDR 2

DSDTRYSPSFQGQVTISA 163 GAC TCT GAT ACC AGA TAC AGC CCG TCC TTC CAA GGC CAG GTC ACC ATC TCA GCC

DKSIRTAYLQWSSLKASD 217 GAC AAG TCC ATC AGA ACC GCC TAC CTG CAG TGG AGC AGC CTG AAG GCC TCG GAC

CDR 3

TAMYYCARTREGYFDYWG 271 ACC GCC ATG TAT TAC TGT GCG AGA ACC CGG GAG GGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC

QGTLVTVS S 325 CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA

> Glypican-3 11E7, VH-NT conlider

ATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGT

CTGTGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCG

GGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAAC

TACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGAT

GGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCC

AAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGAACCGCCTACCTG

CAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAG

AACCCGGGAGGGGTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCG

TCTCCTCA

>Glypican-3 11E7, VH-AA con lider

MGSTAILALLLAVLQGVCAEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYWIA WVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIRTAYLQWSSLKAS DTAMYYC ARTREGYFDYWGQGTLVTYS S

segmento V: A27

segmento J: JK4

EIVLTQSPGTLSLSPGER 1 GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA

CDR 1

ATLSCRASQSVSSSYLAW 55 GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC AGC TAC TTA GCC TGG

CDR 2

YQQKPGQAPRLLIYGASS 109 TAC CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC AGC

CDR 2

RATGIPDRFSGSGSGTDF 163 AGG GCC ACT GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC

CDR

TLTISRLEPEDFAVYYCQ 217 ACT CTC ACC ATC AGC AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAG

CDR 3

QYGSSPTFGGGTKVEIK 271 CAG TAT GGT AGC TCA CCC ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA

>Glypican-3 11E7, VK-NT con lider

ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGA

TACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGT

CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGC

AGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCT

CCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCA

GTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG

CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCAC

TTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

> Glypican-3 11E7, VK-AA con lider

METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAW

YQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY

GSSPTFGGGTKVEIK

segmento V: 5-51

segmento J: JH4b

EVQLVQSGADVTKPGESL 1 GAG GTG CAA CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAT GTG ACA AAG CCC GGG GAG TCT CTG

CDR1

KISCKVSGYRFTNYWIGW 55 AAG ATC TCC TGT AAG GTT TCT GGA TAC AGG TTT ACC AAC TAC TGG ATC GGC TGG

CDR2

MRQMSGKGLEWMGIIYPG 109 ATG CGC CAG ATG TCC GGG AAA GGC CTG GAA TGG ATG GGC ATC ATC TAT CCT GGT

CDR2

DSDTRYSPSFQGHVTISA 163 GAC TCT GAT ACC AGA TAC AGT CCG TCC TTC CAA GGC CAC GTC ACC ATC TCA GCC

DKSINTAYLRWSSLKASD 217 GAC AAA TCC ATC AAC ACC GCC TAC CTA CGG TGG AGC AGC CTG AAG GCC TCG GAC

CDR3

TAIYYCARTREGFFDYWG 271 ACC GCC ATT TAT TAC TGT GCG CGA ACC CGG GAG GGG TTC TTT GAC TAC TGG GGC

QGTPVTVSS 325 CAG GGA ACC CCG GTC ACC GTC TCC TCA

>Glypican-3 16D10, VF1-NT con lider

ATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTATTCTCCGAGGAGTCTG

TGCCGAGGTGCAACTGGTGCAGTCTGGAGCAGATGTGACAAAGCCCGGGGA

GTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGTTTCTGGATACAGGTTTACCAACTACTGGA

T C GGCTGG AT GC GCC AGAT GT C CGGGA AA GGC C T GGA AT GGAT GGGC ATC AT

CTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGTCCGTCCTTCCAAGGCCACGTCA

CCATCTCAGCCGACAAATCCATCAACACCGCCTACCTACGGTGGAGCAGCCT

GAAGGCCTCGGACACCGCCATTTATTACTGTGCGCGAACCCGGGAGGGGTTC

TTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCCGGTCACCGTCTCCTCA

> Glypican-3 16D10, VH-AA con lider

MGSTAILALLLAILRGVCAEVQLVQSGADVTKPGESLKISCKVSGYRFTNYWIG WMRQMSGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGHVTISADKSINTAYLRWSSLKAS DTAIYYCARTREGFFDYWG QGTPVTVSS

segmento V : A2 7

segmento J : JK1

eilltqspgtlslspger

1 GAA ATT CTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA

CDR1

ATLSCRASQSVSSSYLAW 55 GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC AGC TAC TTA GCC TGG

CDR2

YQQKPGQAPRLLIYGASS 109 TAC CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC AGC

CDR2

RATGIPDRFSGSGSGTDF 163 AGG GCC ACT GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC

CDR3

tltisrlepedfavyycq

217 ACT CTC ACC ATC AGC AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAG CDR3

QYGSSPTFGQGTKVEIK 271 CAG TAT GGT AGC TCA CCG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA

>Glypican-3 16D10, VK-NT con lider

ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATAC

CACCGGAGAAATTCTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAG

GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTA

CTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT

GGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGT

CTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGC

AGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGACGTTCGGCCAAGGGACC

AAGGTGGAAATCAAA

>Glypican-3 16D10. VK-AA con lider

METPAQLLFLLLLWLPDTTGEILLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAW YQQKPGQ APRLLIYG AS SRATGIPDRFS GS GS GTDFTLTISRLEPEDF A Y Y YC QQ Y GS SPTF GQGTKVEIK

5-51 linea geminal 4A6 VH

Figura 4: Anti-Glipicano -3 4A6 Vh CDRl EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIC-W

5-51 linea geminal 4A6 VH

CDR2 VRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISA

5-51 linea geminal JH4b linea geminal 4A6 VH

CDR3 DKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR Y F D Y W G

JH4b linea geminal 4A6 VH

QGTLVTVSS --------- (JH4b)

JCDR1_____

5-51 linea germinal EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGW 11E7 VH

CDR2

5~51 linea germinal VRQMPGKGLEWMGI IYPGDSDTRYS PSFQGQVTI S A 11E7 VH ____ ----- ____________________ --------- ----- _____

CDR3

5-51 linea germinal DKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR

JH4b linea germinal Y F D Y W G

11E7 VH »___R_____________________TREG______

JH4b Ifnea germinal QGTLVTVSS

11E7 VH _________

Figura 6

: Anti-Glipicano-3 16D10Vh

5-51 linea geminal 16D1Q VH

EVQLVQS GAEVKKPGESLK

5-51 linea geminal 16D10 VH

CDR1 ISCKGSGYSFTSYWIGWVR ----V---R--N-----M-

5-51 linea geminal 16D10 VH

CDR2 QMPGKGLEWMGI IYPGDSD --S----------------

5-51 linea geminal 16D10 VH

TRYSPSFQGQVTISADKSI

5-51 linea geminal 16D10 VH

STAYLQW S SLKAS DTAMYY N----R----------I--

5-51 linea geminal JH4b linea geminal 16D10 VH

CDR3 CAR FDYWGQGTLVT ---TREGF--------P--

JH4b linea geminal 16D10 VH

V S S

A27 linea germinal 4A6 VK

EIVLTQSPGTLSLSPGER

A27 linea germinal 4A6 VK

CDR1 ATLSCRASQSVSSSYLAW - -- -- -----

A27 linea germinal 4A6 VK

CDR2 YQQKPGQAPRLLIYGASS

A27 linea germinal 4A6 VK

CDR2_ RATGI PDRFSGSGSGTDF

A27 linea germinal 4A6 VK

TLTISRLEPEDFAVYYCQ

A27 linea germinal JK4 linea germinal 4A6 VK

CDR3 Q Y G S S P TFGGGTKVEIK (JK4)

Figura 8

: Anti-Glipicano -3 11E7VK

A27 linea germinal 11E7 VK

EIVLTQSPGTLSLSPGER

A27 linea germinal 11E7 VK

CDR1 ATLSCRASQSVSSSYLAW

A27 linea germinal 11E7 VK

CDR 2 YQQKPGQAPRLLIYGASS

A27 linea germinal 11E7 VK

CDR_ 2 RATGIPDRFSGSGSGTDF

A27 linea germinal 11E7 VK

TLTISRLEPEDFAVYYCQ

A27 linea germinal JK4 linea germinal 11E7 VK

CDR3 Q Y G S S P TFGGGTKVEIK

A27 linea germinal 16D10 VK

EIVLTQS PGTLSLSPGER

A27 linea germinal 16D10 VK

CDR1 ATLSCRASQSVS S SYLAW

A27 linea germinal 16D10 VK

CDR2 YQQKPGQAPRLLIYGASS

A27 linea germinal 16D10 VK

RATGI PDRFSGSGSGTDF

A27 linea germinal 16D10 VK

TLTI SRLEPEDFAVYYCQ

A27 linea germinal JKl linea germinal 16D10 VK

CDR3 Q Y G S S P TFGQGTKVEIK

MFI

Figura 10: Titulacion FACS (EC50)

imagen1

imagen2

% de Max

imagen3

% de Max

....... CHO parental CHO Glipicano-3

imagen4

imagen5

Lisis especifica (%)

imagen6

imagen7

imagen8