ES2563073T3

ES2563073T3 - Métodos para mejorar la expresión de proteínas recombinantes

Info

Publication number: ES2563073T3
Application number: ES10807224.0T
Authority: ES
Inventors: Howard Robert Grahame Clarke
Original assignee: CMC ICOS BIOLOGICS Inc
Current assignee: CMC ICOS BIOLOGICS Inc
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2016-03-10
Anticipated expiration: 2030-08-06
Also published as: US20160076043A1; KR20120041245A; US9212367B2; EP2462237A1; EP2462237A4; CA2771410A1; KR101800904B1; WO2011017606A1; NZ598275A; EP2462237B1; HRP20160162T1; HUE028655T2; CN102648285A; AU2010279294A1; US10066231B2; US20120214203A1; SMT201600147B; AU2010279294B2; PL2462237T3; DK2462237T3

Abstract

Un método para aumentar la expresión de proteínas heterólogas en una célula hospedante, que comprende las etapas de cultivar la célula hospedante que comprende una primera secuencia de polinucleótido heteróloga que codifica dicha proteína heteróloga bajo condiciones que permiten la expresión de proteínas, y dicha célula hospedante comprende además una segunda secuencia de polinucleótido que presenta una secuencia codificadora de proteína para una proteína de un marcador seleccionable, y dicho segundo polinucleótido presenta una modificación en la secuencia, comparado con un polinucleótido de tipo salvaje, que codifica dicha proteína del marcador seleccionable, y dicha modificación de la secuencia reduce la eficacia de traducción de un ARNm codificado por dicho segundo polinucleótido, y dicho segundo polinucleótido presenta dicha modificación en la secuencia y dicho polinucleótido de tipo salvaje codifica secuencias de aminoácidos idénticas para dicha proteína del marcador seleccionable; y dicho primer polinucleótido y dicho segundo polinucleótido están codificados sobre un único vector de expresión del factor de alargamiento 1 del hámster chino (CHEF1), en el que el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido están cada uno bajo el control transcripcional de promotores diferenciados.

Description

DESCRIPCION

Metodos para mejorar la expresion de protemas recombinantes Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EEUU n.° de serie 61/231.906, 5 presentada el 6 de agosto, 2009, titulada “Metodos para mejorar la expresion de protemas recombinantes”, n.° de expediente del abogado 31351/44743.

Campo de la invencion

Esta invencion presenta una aplicacion practica en el campo de la expresion de protemas recombinantes en celulas eucariotas por medio del aumento en la presion de seleccion sobre un vector, aumentando con ello la expresion de 10 protemas heterologas asociadas con el vector.

Antecedentes

En el campo de la produccion de protemas recombinantes, el aumento en la expresion de un gen transfectado resulta una prioridad fundamental durante el desarrollo de una lmea celular. El aumento en la transcripcion, la traduccion, el plegamiento de protemas y la secrecion son el objetivo de intensas investigaciones para aumentar las 15 titulaciones de la protema heterologa.

Independientemente de los metodos utilizados en el pasado, en la tecnica resulta necesario proporcionar mejores metodos para la produccion de protemas recombinantes que aumenten el rendimiento de la protema deseada.

Sumario de la invencion

En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para aumentar la expresion de protemas heterologas en una

20 celula hospedante, que comprende las etapas de cultivar la celula hospedante que comprende una primera

secuencia de polinucleotido heterologa que codifica la protema heterologa bajo condiciones que permitan la expresion de protemas, y el primer polinucleotido es codificado sobre un vector, y la celula hospedante comprende ademas una segunda secuencia de polinucleotido que presenta una secuencia codificadora de protema para una protema de un marcador seleccionable, y el segundo polinucleotido presenta una modificacion en la secuencia,

25 comparado con un polinucleotido de tipo salvaje, que codifica la protema del marcador seleccionable, y la

modificacion de la secuencia reduce la eficacia de traduccion de un ARNm codificado por el segundo polinucleotido, y el segundo polinucleotido presenta la modificacion en la secuencia y el polinucleotido de tipo salvaje codifica secuencias de aminoacidos identicas para la protema del marcador seleccionable, y dicho primer polinucleotido y dicho segundo polinucleotido estan codificados sobre un unico vector de expresion del factor de alargamiento 1 del 30 hamster chino (CHEF1), en el que el primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan cada uno bajo el control transcripcional de promotores diferenciados.

En una realizacion del metodo, la modificacion esta una region no traducida del segundo polinucleotido que codifica la protema del marcador seleccionable y, en ciertos aspectos, la modificacion esta en una region no traducida 5' y/o la modificacion esta en una region no traducida 3'.

35 En otra realizacion del metodo, la modificacion esta en una region codificadora de protema del gen que codifica la protema del marcador seleccionable. En un aspecto, la modificacion esta a 25, 20, 15, 10 o 5 codones desde un codon de inicio de la region codificadora de protema para la secuencia codificadora del gen del marcador seleccionable.

En otro aspecto del metodo, la secuencia codificadora de protema en la segunda secuencia de polinucleotido

40 comprende al menos un codon modificado que no es un codon de tipo salvaje en un polinucleotido de tipo salvaje

que codifica la protema del marcador seleccionable, y el codon modificado es un codon que no es un codon preferido para el aminoacido codificado para la celula hospedante. En un aspecto, la secuencia codificadora de protema en la segunda secuencia de polinucleotido comprende al menos un codon modificado que no es un codon de tipo salvaje en un polinucleotido de tipo salvaje que codifica la protema del marcador seleccionable, y el codon 45 modificado es un codon que es un codon menos preferido para el aminoacido codificado para la celula hospedante.

comprende al menos un codon modificado que no es un codon de tipo salvaje en un polinucleotido de tipo salvaje que codifica la protema del marcador seleccionable, y la modificacion introduce un cambio en la estructura secundaria del ARNm que reduce la eficacia de la traduccion del ARNm. En una realizacion del metodo, la 50 secuencia codificadora de protema en la segunda secuencia de polinucleotido comprende al menos un codon modificado que no es un codon de tipo salvaje en un polinucleotido de tipo salvaje que codifica la protema del marcador seleccionable, y la modificacion aumenta el apareamiento de codones en el ARNm. En otra realizacion del metodo, la secuencia codificadora de protema en la segunda secuencia de polinucleotido comprende al menos un codon modificado que no es un codon de tipo salvaje en un polinucleotido de tipo salvaje que codifica la protema del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

marcador seleccionable, y la modificacion modifica el contenido en G+C del ARNm. En diversos aspectos, la modificacion aumenta el contenido en G+C del ARNm, y en diversos aspectos, el contenido en G+C aumenta en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,

66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,

97, 98, 99, o 100%. En otros aspectos, el contenido en G+C aumenta en mas del 100%

En otro aspecto del metodo, la secuencia codificadora de protema en la segunda secuencia de polinucleotido comprende al menos un codon modificado que no es un codon de tipo salvaje en un polinucleotido de tipo salvaje que codifica la protema del marcador seleccionable, y la modificacion modifica el contenido en A+T del ARNm. En una realizacion, la modificacion disminuye el contenido en A+T del ARNm en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,

45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,

76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%.

En otros aspectos del metodo, al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 11%, al menos 12%, al menos 13%, al menos 14%, al menos 15%, al menos 16%, al menos 17%, al menos 18%, al menos 19%, al menos 20%, al menos 21%, al menos 22%, al menos 23%, al menos 24%, al menos 25%, al menos 26%, al menos 27%, al menos 28%, al menos 29%, al menos 30%, al menos 31%, al menos 32%, al menos 33%, al menos 34%, al menos 35%, al menos 36%, al menos 37%, al menos 38%, al menos 39%, al menos 40%, al menos 41%, al menos 42%, al menos 43%, al menos 44%, al menos 45%, al menos 46%, al menos 47%, al menos 48%, al menos 49%, al menos 50%, al menos 51%, al menos 52%, al menos 53%, al menos 54%, al menos 55%, al menos 56%, al menos 57%, al menos 58%, al menos 59%, al menos 60%, al menos 61%, al menos 62%, al menos 63%, al menos 64%, al menos 65%, al menos 66%, al menos 67%, al menos 68%, al menos 69%, al menos 70%, al menos 71%, al menos 72%, al menos 73%, al menos 74%, al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de los codones en la secuencia codificadora de protema del segundo polinucleotido que codifica la protema del marcador seleccionable son codones modificados.

En otros aspectos del metodo, la protema del marcador seleccionable se selecciona del grupo que consiste en neomicina fosfotransferasa (npt II), higromicina fosfotransferasa (hpt), dihidrofolato reductasa (dhfr), zeocina, fleomicina, gen de resistencia a la bleomicina ble, gentamicina acetiltransferasa, estreptomicina fosfotransferasa, una forma mutante de la acetolactato sintasa (als), bromoxinil nitrilasa, fosfinotricina acetil transferasa (bar), enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa (aro A), molecula del receptor de tirosina quinasa espedfica del musculo (MuSK-R), cobre-cinc superoxido dismutasa (sod 1), metalotionemas (cup1, MT1), beta-lactamasa (BLA), puromicina N-acetil-transferasa (pac), blasticidina acetil transferasa (bls), blasticidina desaminasa (bsr), histidinol deshidrogenasa (HDH), N-succinil-5-aminoimidazol-4-carboxamida ribotido (SAICAR) sintetasa (ade1), argininosuccinato liasa (arg4), beta-isopropilmalato deshidrogenasa (leu2), invertasa (suc2), orotidina-5-fosfato (OMP) descarboxilasa (ura3) y ortologos de muchas de estas protemas de marcadores.

En diversas realizaciones del metodo, la celula hospedante es una celula eucariota, la celula hospedante es una celula de mairnfero, la celula hospedante es una celula humana, la celula hospedante es una celula de hamster chino, la celula hospedante es una celula de ovario de hamster chino, la celula hospedante es una celula de levadura, la celula hospedante es una celula de Saccharomyces cerevisiae, la celula hospedante es una celula de Pichia pastoris, la celula hospedante es una celula procariota, la celula hospedante es una celula de Escherichia coli, la celula hospedante es una celula de insecto, la celula hospedante es una celula de Spodoptera frugiperda, la celula hospedante es una celula vegetal, o la celula hospedante es una celula fungica.

En el metodo, el vector de expresion es un vector de expresion del factor de alargamiento 1 del hamster chino (CHEF1). En otro aspecto, el metodo utiliza un segundo polinucleotido que comprende el polinucleotido indicado en la figura 2.

Descripcion de los dibujos

La figura 1A es un polinucleotido que codifica DHFR, y la figura 1B es una secuencia del polipeptido de DHFR utilizada para la desoptimizacion de codones identica al ADNc BC005796m de Mus musculus.

La figura 2 muestra secuencias de ADN de las secuencias de DHFR con codones desoptimizados denominadas lisiada (“crippled”, cr) y peor (“worst”, wst).

La figura 3 muestra la DHFR desoptimizada (peor (wst) y lisiada (cr)) alineada con la secuencia de tipo salvaje (wt). Se indican los cambios en nucleotidos (*) que incluyen los codones menos preferidos de hamster (vease la tabla 4) y nuevas parejas de codones en tandem (en negrita; vease la tabla 5). Los sfmbolos degenerados son: B (C o G o T), D (A o G o T), H (A o C o T), V (A o C o G).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La figura 4 muestra el vector de expresion de CHEF1, pDEF38, con DHFR de tipo salvaje (WT). La DHFR con codones desoptimizados reemplaza a la DHFR WT para formar pDEF81 (DHFR lisiada) y pDEF82 (DHFR peor). El gen indicador de FIGI se clona en los sitios de clonacion Xhol-Xbal para formar pDEF38:FIGI, pDEF81:FIGI y pDEF82:FIGI.

La figura 5 demuestra que la expresion de protemas aumenta utilizando la DHFR con codones desoptimizados. Celulas CHO se transfectaron con DHFR de tipo salvaje (wt) y con codones desoptimizados (lisiada, pDEF81:FIGI, y peor, pDEF82:FIGI) que coexpresan una protema de interes (FIGI). Los valores de las titulaciones determinadas mediante HPLC de protema A e indicados en |ig/ml son la media de dos transfecciones independientes, cada una mediada por triplicado (seis ensayos de produccion total). Los resultados indican una clara mejora en la titulacion de la expresion para las agrupaciones de transfeccion seleccionadas para la DHFR con codones desoptimizados frente a las agrupaciones de DHFR de tipo salvaje.

La figura 6 demuestra que un modelo de produccion de alimentacion discontinua de agrupaciones de transfeccion proporciona una mayor productividad en lmeas celulares con codones desoptimizados. Este experimento se realizo durante 12 dfas en tubos de centnfuga de 50 ml con los transfectantes agrupados: DHFR de tipo salvaje (pDEF38:FIGI, azul) y con codones desoptimizados (pDEF81:FIGI, morado, y pDEF82:FIGI, rosa) que coexpresan la protema de interes FIGI. Dos agrupaciones de transfeccion (Ay B) se realizaron por duplicado. Las agrupaciones con codones desoptimizados muestran mayor productividad que las muestras de tipo salvaje.

La figura 7 demuestra que las celulas seleccionadas para DHFR con codones desoptimizados tienen una menor expresion de DHFR y una mayor expresion de la protema de interes. Celulas CHO se transfectaron con DHFR de tipo salvaje (T462) y con codones desoptimizados (pDEF81:FIGI, T463 y pDEF82:FIGI, T464) que coexpresan la protema de interes FIGI. Las agrupaciones de transfeccion se tineron con metotrexato fluorescente (F-MTX) para detectar DHFR, y un anticuerpo marcado fluorescente que reconoce a FIGI (RPE). Las celulas tenidas se analizaron mediante citometna de flujo en un FACSCalibur. La figura 7A muestra los perfiles FACS de tincion dual de 10.000 celulas individuales procedentes de cada transfeccion que representa la expresion combinada de DHFR (F-MTX) y FIGI (RPE:FIGI). La figura 7B muestra el promedio de intensidad de fluorescencia de F-MTX (DHfR) y rPE procedente de dos poblaciones de 10.000 celulas promediada para cada transfeccion. Estos resultados indican que ambas agrupaciones de DHFR con codones desoptimizados presentan una menor produccion de DHFR y una mayor produccion de FIGI cuando se comparan con las celulas de tipo salvaje.

La figura 8 demuestra que los clones de DHFR con codones desoptimizados tienen una menor expresion de DHFR y una mayor expresion de la protema de interes. La agrupaciones de transfeccion de celulas CHO (tipo salvaje T462, lisiada T463 y peor T464) se clonaron mediante una dilucion limitante, y 23 lmeas celulares monoclonales confirmadas se expandieron de cada transfeccion. Las celulas clonales se tineron con metotrexato fluorescente (DHFR RFU) para detectar DHFR y con un anticuerpo fluorescente anti-FIGI marcado con RPE (FIGI RFU). Se analizo un total de 10.000 celulas tenidas de cada poblacion clonal mediante citometna de flujo en un FACSCalibur. La figura 8A muestra el promedio de fluorescencia de celulas tenidas con F-MTX. Cada punto de datos es un clon individual. Los clones se clasifican desde un promedio bajo de fluorescencia a un promedio alto. La figura 8B muestra el promedio de fluorescencia de las celulas tenidas con RPE. Cada punto de datos es un clon individual. Los clones se clasifican desde un promedio bajo de fluorescencia a un promedio alto.

La figura 9 demuestra que los clones con codones desoptimizados tienen una mayor productividad, comparado con los clones de tipo salvaje. Las titulaciones de los clones se determinaron mediante HPLC de protema A en los sobrenadantes recolectados el dfa 8 procedentes de modelos de produccion de 6 pocillos. Los clones se clasificaron segun la titulacion de alta a baja. Los clones con codones desoptimizados, pDEF81:FIGI y pDEF82:FIGI, muestran una mayor productividad de FIGi que los clones de DHFR de tipo salvaje (pDEF38:FIGI).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona una nueva generacion de vectores de expresion y sus usos, que mejoran los rendimientos de protemas recombinantes. Los vectores de la invencion permiten una mayor expresion de un gen de interes (GOI) en una celula hospedante y reducen la eficacia de traduccion de un marcador seleccionable cotransformado, aumentando con ello la rigurosidad de la seleccion. Los marcados seleccionables se emplean en experimentos de transfeccion para complementar las deficiencias de protemas de la celula hospedante o para conferir resistencia a un agente que sena toxico en otro caso, y asf se puede seleccionar la presencia (expresion) de genes de interes cotransformados. Los vectores que proporcionan la menor eficacia de traduccion de la protema del marcador seleccionable se disenan de modo que el polinucleotido que codifica la protema del marcador de seleccion esta “desoptimizado” con respecto a uno o mas parametros. El uso de los vectores proporcionados es contrario a la logica de los materiales y metodos utilizados para potenciar la expresion de protemas recombinantes. En efecto, una mayor expresion de protemas generalmente se lleva a cabo “optimizando” un polinucleotido que codifica una protema de interes, aumentando con ello la eficacia de la traduccion y la expresion de protemas. Por extension, se optimiza la region codificadora de protema para el gen del marcador seleccionable de la misma manera. En la presente, sin embargo, se demuestra de modo inesperado que la modificacion de un polinucleotido que codifica una secuencia de un gen de un marcador seleccionable para que sea menos que optimo para la traduccion, independientemente de realizar cambios similares en el gen de interes, permite el aislamiento de celulas

5

10

15

20

25

30

35

40

hospedantes transformadas o transfectadas con un polinucleotido que codifica un GOI y un polinucleotido que codifica un marcador seleccionable, en las que la protema codificada por el GOI se expresa a unos niveles inesperadamente altos.

Por consiguiente, el termino “desoptimizado”, tal como se emplea en la presente referido a un polinucleotido, significa que el polinucleotido se ha modificado de tal forma que la traduccion de una protema codificada por el polinucleotido es menos que optima para la celula hospedante en la que se ha introducido el polinucleotido. Un polinucleotido se desoptimiza en una multitud de formas, y la presente invencion no se limita a los metodos ejemplificados en la presente.

Los metodos para la optimizacion de codones han sido descritos por otros (Itakura 1987, Kotula 1991, Holler 1993, Seed 1998). Sin embargo, existen ejemplos limitados de utilidades para la desoptimizacion de codones. Uno de estos ejemplos es la desoptimizacion de genes vmcos para reducir la aptitud replicativa mediante la incorporacion de codones menos preferidos o pares de codones no aleatorizados (Burns 2006, Mueller 2006, Coleman 2008, Kew 2008). En la presente se describen las consideraciones metodologicas para reducir la eficacia transcripcional de un gen dhfr para su uso en celulas hospedantes mediante la incorporacion de codones menos preferidos espedficos de especie y parejas de codones en tandem. Los metodos presentados en general son aplicables para desoptimizar codones en un polinucleotido que codifica cualquier marcador seleccionable para su hospedante de una especie espedfica.

Sin pretender quedar limitado por ningun mecanismo de accion concreto, la menor traduccion del marcador seleccionable puede conducir a un aumento compensatorio en la produccion de la misma protema a traves de una via alternativa distinta de la traduccion, tal como, por ejemplo y sin limitacion, una mayor transcripcion o secrecion, para permitir la supervivencia de las celulas que portan el gen ineficaz. Asf, las celulas hospedantes que son capaces de superar el debilitamiento del gen del marcador y, por tanto, sobrevivir, tambien pueden expresar el GOI a mayor tasa. Independientemente del mecanismo exacto, en la presente se demuestra, de modo inesperado, que, en contra del conocimiento convencional, la modificacion de la secuencia del polinucleotido del gen del marcador seleccionable de una manera que se reduzca la eficacia traduccional de alguna manera aumenta la expresion del gen cotransformado que codifica el GOI.

Los vectores y los metodos de la invencion pueden utilizarse con cualquier gen de un marcador seleccionable que proporcione una seleccion positiva. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, sin limitacion, genes de resistencia a antibioticos que codifican la neomicina fosfotransferasa (npt II), higromicina fosfotransferasa (hpt), dihidrofolato reductasa (dhfr), zeocina, fleomicina, gen de resistencia a la bleomicina ble (la enzima no se conoce), gentamicina acetiltransferasa, estreptomicina fosfotransferasa, una forma mutante de la acetolactato sintasa (als), bromoxinil nitrilasa, fosfinotricina acetil transferasa (bar), enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa (aro A), molecula del receptor de tirosina quinasa espedfica del musculo (MuSK-R), cobre-cinc superoxido dismutasa (sod 1), metalotionemas (cup1, MT1), beta-lactamasa (BLA), puromicina N-acetil-transferasa (pac), blasticidina acetil transferasa (bls), blasticidina desaminasa (bsr), histidinol deshidrogenasa (HDH), N-succinil-5-aminoimidazol-4- carboxamida ribotido (SAICAR) sintetasa (ade1), argininosuccinato liasa (arg4), beta-isopropilmalato deshidrogenasa (leu2), invertasa (suc2), y orotidina-5-fosfato (OMP) descarboxilasa (ura3).

Tal como se entiende en la tecnica, el codigo genetico presenta codones que dirigen la adicion de aminoacidos espedficos en un polipeptido traducido. Como tambien se conoce en la tecnica, los veinte aminoacidos naturales son codificados por un numero diferente de codones, que vana de uno a seis codones diferentes para cada aminoacido. Tal como se emplea en la presente, los diferentes codones que codifican el mismo aminoacido se denominan “codones sinonimos”. Estos codones sinonimos se indican en la siguiente tabla 1.

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 1 - El codigo genetico

| T: C I A G

T: TTT Phe (F) TTC Phe (F) TTA Leu (L) TTG Leu (L) TCT Ser (S) TCC Ser (S) TCA Ser (S) TCG Ser (S) TAT Tyr (Y) TAC Tyr (Y) TAA FIN TAG FIN TGT Cys (C) TGC Cys (C) TGA FIN TGG Trp (W)

C: CTT Leu (L) CTC Leu (L) CTA Leu (L) CTG Leu (L) CCT Pro (P) CCC Pro (P) CCA Pro (P) CCG Pro (P) CAT His (H) CAC His (H) CAA Gin (Q) CAG Gin (Q) CGT Arg (R) CGC Arg (R) CGA Arg (R) CGG Arg (R)

A: ATT lie (I) ATC lie (I) ATA lie (I) ATG Met (M) ACT Thr (T) ACC Thr (T) ACA Thr (T) ACG Thr (T) AAT Asn (N) AAC Asn (N) AAA Lys (K) AAG Lys (K) AGT Ser (S) AGC Ser (S) AGA Arg (R) AGG Arg (R)

G: GTT Val (V) GTC Val (V) GTA Val (V) GTG Val (V) GCT Ala (A) GCC Ala (A) GCA Ala (A) GCG Ala (A) GAT Asp (D) GAC Asp (D) GAA Glu (E) GAG Glu (E) GGT Gly (G) GGC Gly (G) GGA Gly (G) GGG Gly (G)

Debido a que los codones sinonimos codifican el mismo aminoacido, la alteration de la secuencia codificadora de una protema reemplazando un codon de tipo salvaje por un codon sinonimo no cambia la secuencia de aminoacidos de la secuencia polipeptfdica codificada. Sin embargo, se altera la secuencia del ARNm subyacente que codifica la protema, y el cambio en la secuencia de nucleotidos del ARNm puede alterar la expresion genica influyendo en la eficacia traduccional (Ikemura 1981a, Ikemura 1981b, Ikemura 1985).

Los factores espedficos que gobiernan la eficacia de la traduction incluyen la incorporation de codones “preferidos”, codones en tandem o consecutivos (Rosenberg 1993), sesgos de parejas de codones (Gutman1989, Boycheva 2003), estructura secundaria del ARN (Kozak 2005, Kudla 2009), contenido en GC y estructuras de repetition de nucleotidos (Hall 1982, Zhang 1991, Carlini 2003, Griswold 2003, Gustafsson 2004). Muchos de estos factores producen, por ejemplo y sin pretender quedar limitado por ningun mecanismo espedfico, sitios de pausa de la traduccion que no solo detienen la traduccion, sino que pueden afectar a la cinetica de plegamiento de la protema, y ambas situaciones, en ultimo termino, alteran la expresion de la protema. Un ejemplo bien caracterizado de pausa en la traduccion se produce durante la smtesis de genes biosinteticos de aminoacidos en bacterias, y se conoce ampliamente como atenuacion (Watson 1988).

Preferencia de codones

En un aspecto, la invention proporciona vectores y metodos para aumentar la expresion de una protema recombinante codificada por un GOI, utilizando un vector de expresion que comprende el GOI y que tambien codifica una protema de un marcador seleccionable en un polinucleotido sintetico disenado con codones que no son preferidos en la celula hospedante. Se sabe en la tecnica que, en diferentes especies, ciertos codones sinonimos se utilizan con mas frecuencia que otros. Los codones que se utilizan con mas frecuencia se denominan “codones preferidos” para esa especie. Otros han propuesto que la preferencia por ciertos codones es una funcion del numero relativo de ARN de transferencia (ARNt) espedficos codificados en el genoma de una especie, y se han desarrollado programas para determinar el numero preciso de cada ARNt codificado en un genoma espedfico (Lowe y Eddy, 1997). Asi, en un aspecto, la selection de los codones menos preferidos se basa en la frecuencia de utilization, previamente determinada, de codones sinonimos en una especie de celula hospedante concreta de origen.

En un aspecto, la invencion proporciona un polinucleotido que codifica un marcador seleccionable, en el que la region codificadora de protema del polinucleotido incluye al menos una modification de un codon, y dicha modification es la sustitucion de un codon de tipo salvaje por un codon que es un codon no preferido para la celula hospedante. En otro aspecto, la modificacion es la sustitucion de un codon de tipo salvaje por un codon que es un codon menos preferido para la celula hospedante. Se contempla cualquier numero de dichas sustituciones de codones, con la condition de que al menos una de dichas modificaciones se incorpore en la region codificadora de protema. Por consiguiente, la invencion contempla cualquier numero de modificaciones desde una modificacion de un codon de este tipo a la modificacion de todos los codones en la region codificadora de protema del gen del marcador seleccionable.

5

10

15

20

25

De forma mas espedfica, en diversos aspectos, al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 11%, al menos 12%, al menos 13%, al menos 14%, al menos 15%, al menos 16%, al menos 17%, al menos 18%, al menos 19%, al menos 20%, al menos 21%, al menos 22%, al menos 23%, al menos 24%, al menos 25%, al menos 26%, al menos 27%, al menos 28%, al menos 29%, al menos 30%, al menos 31%, al menos 32%, al menos 33%, al menos 34%, al menos 35%, al menos 36%, al menos 37%, al menos 38%, al menos 39%, al menos 40%, al menos 41%, al menos 42%, al menos 43%, al menos 44%, al menos 45%, al menos 46%, al menos 47%, al menos 48%, al menos 49%, al menos 50%, al menos 51%, al menos 52%, al menos 53%, al menos 54%, al menos 55%, al menos 56%, al menos 57%, al menos 58%, al menos 59%, al menos 60%, al menos 61%, al menos 62%, al menos 63%, al menos 64%, al menos 65%, al menos 66%, al menos 67%, al menos 68%, al menos 69%, al menos 70%, al menos 71%, al menos 72%, al menos 73%, al menos 74%, al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de los codones en la secuencia codificadora de protema del polinucleotido que codifica el gen del marcador seleccionable son codones modificados.

Utilizando secuencias de nucleotidos de acceso publico y tablas de utilizacion de codones conocidas en la tecnica y ejemplificadas en las tablas 2 y 3 (Nakamura et al., 2000) se puede crear una version con codones desoptimizados de cualquier marcador seleccionable incorporando una seleccion aleatoria de los codones menos preferidos para la especie de origen de la celula hospedante seleccionada para la expresion de una protema recombinante codificada por el GOI. Un ejemplo de los codones menos preferidos del hamster (Cricetulus griseus) se muestra en la tabla 4. Estos codones se emplean para reemplazar preferentemente codones sinonimos en la secuencia de un gen nativo que codifica un gen de un marcador, de modo que al menos uno a todos los codones sinonimos son reemplazados por cualquier codon que no sea el codon preferido para un resto aminoacido concreto.

Tabla 2 - Tabla de utilizacion de codones del hamster

Un ejemplo de tabla de utilizacion de codones del hamster (Cricetulus griseus) a partir de 331 regiones codificadoras de protemas y 153527 codones. Para cada codon, el primer numero es la frecuencia por mil y el segundo numero es

el numero real de veces que se observo ese codon.

UUU 19,6 (3005): UCU 16,0 (2450) UAU 13,1 (2017) UGU 9,1 (1397)

UUC 22,0 (3381): UCC 16,5 (2529) UAC 16,4 (2519) UGC 10,3 (1589)

UUA 6,4 (978): UCA 10,3 (1577) UAA 0,6 (93) UGA 1,2 (177)

UUG 14,1 (2169): UCG 3,4 (529) UAG 0,5 (84) UGG 13,1 (2012)

CUU 13,2 (2023): CCU 16,7 (2563) CAU 10,2 (1563) CGU 5,6 (863)

CUC 18,4 (2818): CCC 17,0 (2608) CAC 12,9 (1980) CGC 9,3 (1429)

CUA 7,6 (1174): CCA 15,6 (2388) CAA 10,3 (1587) CGA 7,2 (1102)

CUG 38,8 (5955): CCG 4,3 (657) CAG 33,4 (5122) CGG 10,1 (1558)

AUU 17,4 (2673): ACU 14,1 (2172) AUU 17,4 (2671) AGU 11,4 (1756)

AUC 24,8 (3808): ACC 20,3 (3118) AAC 21,2 (3248) AGC 16,4 (2521)

AUA 6,9 (1053): ACA 15,7 (2418) AAA 24,6 (3782) AGA 10,1 (1557)

AUG 23,0 (3538): ACG 4,5 (685) AAG 38,4 (5895) AGG 10,2 (1570)

GUU 11,6 (1780): GCU 22,4 (3434) GAU 24,6 (3781) GGU 12,8 (1968)

GUC 15,7 (2408): GCC 25,9 (3973) GAC 28,1 (4310) GGC 21,3 (3568)

GUA 7,8 (1202): GCA 16,3 (2497) GAA 28,4 (4355) GGA 15,8 (2425)

GUG 30,1 (4628): GCG 5,0 (765) GAG 41,1 (6311) GGG 13,4 (2063)

Tabla 3 - Tabla de utilizacion de codones del ser humano

Se proporciona un ejemplo de una tabla de utilizacion de codones del ser humano (Homo sapiens) determinada a partir de 93487 regiones codificadoras de protemas y el analisis de 40662582 codones. Para cada codon, el primer 5 numero es la frecuencia por mil y el segundo numero es el numero real de veces que se observo ese codon.

UUU 17,6 (714298): UCU 15,2 (618711) UAU 12,2 (495699) UGU 10,6 (430311)

UUC 20,3 (824692): UCC 17,7 (718892) UAC 15,3 (622407) UGC 12,6 (513028)

UUA 7,7 (311881): UCA 12,2 (496448) UAA 1,0 (40285) UGA 1,6 (63237)

UUG 12,9 (525688): UCG 4,4 (179419) UAG 0,8 (32109) UGG 13,2 (535595)

CUU 13,2 (536515): CCU 17,5 (713233) CAU 10,9 (441711) CGU 4,5 (184609)

CUC 19,6 (796638): CCC 19,8 (804620) CAC 15,1 (613713) CGC 10,4 (423516)

CUA 7,2 (290751): CCA 16,9 (688038) CAA 12,3 (501911) CGA 6,2 (250760)

CUG 39,6 (1611801): CCG 6,9 (281570) CAG 34,2 (1391973) CGG 11,4 (464485)

AUU 16,0 (650473): ACU 13,1 (533609) AUU 17,0 (689701) AGU 12,1 (493429)

AUC 20,8 (846466): ACC 19,9 (768147) AAC 19,1 (776603) AGC 19,5 (791383)

AUA 7,5 (304565): ACA 15,1 (614523) AAA 24,4 (993621) AGA 12,2 (494682)

AUG 22,0 (896005): ACG 6,1 (246105) AAG 31,9 (1295568) AGG 12,0 (486463)

GUU 11,0 (448607): GCU 18,4 (750096) GAU 21,8 (885429) GGU 10,8 (437126)

GUC 14,5 (588138): GCC 27,7 (1127679) GAC 25,1 (1020595) GGC 22,2 (903565)

GUA 7,1 (287712): GCA 15,8 (643471) GAA 29,0 (1177632) GGA 16,5 (669873)

GUG 28,1 (1143534): GCG 7,4 (299495) GAG 39,6 (1609975) GGG 16,5 (669768)

Tabla 4 - Codones menos preferidos del hamster Un ejemplo de los codones menos preferidos del hamster (Cricetulus griseus)

Aminoacido: Codon menos preferido

Alanina: GCG, GCA

Arginina: CGT, CGA, CGC

Acido aspartico: GAT

Asparagina: AAT

Cistema: TGT

Acido glutamico: GAA

Glutamina: CAA

Glicina: GGT, GGG

5

10

15

20

25

30

35

40

Aminoacido: Codon menos preferido

Isoleucina: ATA, ATT

Histidina: CAT

Leucina: TTA, CTA, CTT

Lisina: AAA

Fenilalanina: TTT

Prolina: CCG, CCA

Serina: AGT, TCG, TCA

Treonina: ACG, ACT

Tirosina: TAT

Valina: GTA, GTT

La desoptimizacion de codones puede realizarse mediante una diversidad de metodos, por ejemplo, seleccionando codones que son menos preferidos para su uso en genes altamente expresados en una celula hospedante concreta. Pueden emplearse algoritmos informaticos que incorporen tablas de frecuencia de codones, tales como “Ecohigh.cod” para la preferencia de codones de genes bacterianos altamente expresados, y que pueden obtenerse en the University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI. Otras tablas de frecuencia de codones utiles incluyen “Celegans_high.cod”, “Celegans_low.cod'”, “Drosophila_high.cod”, “Human_high.cod”, “Maize_high.cod”, y “Yeast_high.cod”.

Sesgo de parejas de codones

En otro aspecto, la invencion proporciona vectores y metodos para aumentar la expresion de una protema recombinante codificada por un GOI transfectado, utilizando un vector de expresion que codifica una protema de un marcador seleccionable en un polinucleotido sintetico disenado con parejas de codones que son menos preferidas en la especie de la celula hospedante de origen. Recientes resultados experimentales apoyan la idea de que las tasas de traduccion estan influidas por las compatibilidades de ARNt adyacentes en los sitios A y P sobre la superficie de los ribosomas de traduccion (Smith y Yarus, 1989; Yarus y Curran, 1992). En la actualidad se entiende que algunas parejas de codones se emplean en secuencias codificadores de protemas con mucha mas frecuencia que la esperada partiendo de la utilizacion de los codones individuales de estas parejas (parejas de codones sobrerrepresentadas), y que algunas parejas de codones se observan con mucha menos frecuencia que la esperada (parejas de codones infrarrepresentadas). Coleman et al. (2008) han demostrado que una pareja de codones infrarrepresentada se traduce con mas lentitud que una pareja de codones sobrerrepresentada, y que cuanto mas infrarrepresentada este una pareja de codones, con mas lentitud se traduce.

Como ejemplo, en los seres humanos, los estudios han descubierto que el codon GCC de Ala se emplea cuatro veces mas frecuentemente que el codon sinonimo GCG y que otras parejas de codones sinonimos se emplean con mas o menos frecuencia que la esperada (Coleman et al., 2008). Esta frecuencia de parejas de codones espedficos se denomina “sesgo de parejas de codones”. Por ejemplo y de nuevo en seres humanos, basandose en la utilizacion de codones preferidos, se espera que la pareja de aminoacidos Ala-Glu sea codificada por GCCGAA y GCAGAG con una frecuencia aproximadamente igual. De hecho, la pareja de codones GCCGAA esta muy infrarrepresentada, aunque contiene el codon Ala mas frecuente, de modo que solo se utiliza una septima parte de las veces que se utiliza GCAGAG.

Apareamiento de codones en tandem

En otro aspecto, la invencion proporciona vectores y metodos para aumentar la expresion de una protema recombinante codificada por un GOI, utilizando un vector de expresion que comprende el GOI y que tambien codifica una protema de un marcador seleccionable en un polinucleotido sintetico disenado con parejas de codones en tandem. La frecuencia y la composicion de las parejas de codones en una secuencia genica puede influir en la tasa de traduccion, segun se evidencia por la atenuacion (Watson, 1988) y el desplazamiento de marco traduccional (Gurvich et al., 2005). El mecanismo de atenuacion implica la detencion de los ribosomas en las parejas en tandem o repeticiones multimericas del mismo codon, y se ve influido por la concentracion de ARNt activados espedficos de codones. Cuando se aparean codones raros, la detencion de las moleculas de ARNt cognadas puede conducir no solo a la detencion, sino al desplazamiento de marco, produciendo una reduccion de la protema traducida con precision. Ambos mecanismos de accion de apareamiento de codones en tandem pueden utilizarse para

5

10

15

20

25

30

35

desoptimizar la expresion de un gen de un marcador seleccionable.

En la tabla 5 se muestran ejemplos de parejas de codones en tandem menos preferidos del hamster incorporados en los genes dhfr desoptimizados.

Tabla 5 - Parejas de codones en tandem Los codones son los menos preferidos, excepto los que aparecen en negrita

Aminoacido: Parejas de codones en tandem

Acido aspartico: GAC GAC

Acido glutamico: GAA GAA

Glicina: GGG GGG

Leucina: CTA CTA

Lisina: AAA AAA

Fenilalanina: TTC TTC

Prolina: CCG CCG

Serina: TCG TCG

Serina: TCA TCA

Treonina: ACG ACG

Treonina: ACT ACT

Asf, en una realizacion del metodo, los restos aminoacidos repetidos en tandem en la protema del marcador seleccionable, en la que el mismo aminoacido esta presente en mas de una copia en la estructura primaria en tandem, son codificados por codones que no son un codon preferido para ese aminoacido. En otra realizacion, los restos aminoacidos repetidos en tandem en la protema del marcador seleccionable, en la que el mismo aminoacido esta presente en mas de una copia en la estructura primaria en tandem, son codificados por codones que son los codones menos preferidos para ese aminoacido. En otra realizacion, los mismos aminoacidos presentes en mas de una copia y en tandem en la estructura primaria son codificados por el mismo codon.

Estructura secundaria

En otro aspecto, la invencion proporciona metodos para aumentar la expresion de una protema recombinante codificada por un GOI, utilizando un vector de expresion que codifica una protema de un marcador seleccionable en un polinucleotido disenado con modificaciones en la secuencia que alteran la estructura secundaria del ARN.

En esta realizacion, se toma en cuenta la estructura del ARNm cuando se disena un gen para la desoptimizacion de codones. El contexto de la secuencia, por ejemplo, de los codones redisenados puede modular la estructura secundaria del ARN, que ha demostrado regular la estabilidad y la traduccionabilidad del mensaje del ARNm (Griswold 2003, Kozak 2005, Kudla 2009). Los factores a considerar cuando se disena un marcador seleccionable con codones desoptimizados incluyen, pero no se limitan a la estabilidad de la estructura secundaria y la energfa libre minima (MFE) del ARN completo o del extremo 5' del ARN, segun se puede determinar mediante un software de prediccion de la estructura del ARN de libre acceso, tal como RNAfold (Gruber et al., 2008). El contexto de la secuencia del gen desoptimizado en las regiones que lo rodean o en parte de un codon menos preferido tambien puede ser importante. Los factores que pueden reducir la eficacia traduccional incluyen el contenido en GC, G+C en la tercera posicion del codon (Sueoka y Kawanishi, 2000), y las puntuaciones del mdice de adaptacion del codon (Sharp y Li, 1987). En efecto, las pruebas han demostrado que un contenido mayor en GC en el ARNm aumenta la probabilidad de formacion de una estructura secundaria que obstaculice la eficacia de la traduccion, y la reduccion en el contenido de GC desestabiliza estas estructuras secundarias (Bulmer, 1989). Y a la inversa, para reducir la eficacia de traduccion segun se propone en los presentes metodos, el aumento del contenido en GC, mediante la sustitucion de codones de tipo salvaje en la region codificadora de protema por codones sinonimos con mayor contenido en GC o simplemente modificando las regiones no traducidas para incluir un mayor contenido en Gc, proporciona un aumento en la estructura secundaria, reduciendo con ello la eficacia de la traduccion.

En la tecnica se sabe que la estructura primara y secundaria de la region no codificadora 5' del ARNm modula la eficacia traduccional; se ha demostrado que la eficacia traduccional es inversamente proporcional al grado de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

estructura secundaria en la region no codificadora 5' del ARNm (Pelletier y Sonenberg, 1987). En otro aspecto, se proporciona un metodo en el que el polinucleotido que codifica la protema del marcador seleccionable se modifica fuera del contexto de la region codificadora de protema, y las modificaciones en el gen se realizan de modo que las regiones no traducidas del ARNm codificado tienen mayor estructura secundaria, comparado con el ARNm de tipo salvaje. En un aspecto, se introducen una o mas modificaciones en una region no traducida 5' y/o 3' que no es necesaria para la traduccion. En otro aspecto, la modificacion o las modificaciones se introducen en una region 5' y/o 3' que necesaria para la traduccion.

Vectores y celulas hospedantes

El termino “vector” se emplea segun se reconoce en la tecnica para indicar cualquier molecula (por ejemplo, acido nucleico, plasmido o virus) empleada para transferir informacion codificadora a una celula hospedante. La expresion “celula hospedante” se emplea para indicar una celula que ha sido transformada o que es capaz de ser transformada por un vector que porta un gen de interes seleccionado, que despues es expresado por la celula. La expresion incluye celulas de mairnfero, levadura, fungicas, de insecto, vegetales y protozoarias, y la progenie de la celula parental, independientemente de que la progenie sea identica en morfologfa o en constitucion genetica al progenitor original, con la condicion de que el gen seleccionado este presente. En general, la seleccion de un vector apropiado, en un aspecto, se basa en la celula hospedante seleccionada para la expresion del GOI.

Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a celulas de mamffero, tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO) (ATCC n.° CcL61); celulas CHO DHFR, celulas 293 o 293T de rinon embrionario humano (HEK) (ATCC n.° CRL1573); o celulas 3T3 (ATCC n.° CCL92). Otras lmeas celulares de mamffero adecuadas son las lmeas celulares COS-1 (ATCC n.° CRL1650) y COS-7 (ATCC n.° CRL1651) de mono, y la lmea celular CV-1 (ATCC n.° CCL70). Otras lmeas celulares de mamffero adecuadas incluyen, pero no se limitan a Sp2/0, celulas de hibridoma de raton NS1 y NS0, celulas N2A de neuroblastoma de raton, HeLa, celulas L-929 de raton, lmeas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, lmeas de celulas de hamster BHK o HaK, que tambien estan disponibles en el ATCC.

Otros ejemplos de celulas hospedantes de mamffero incluyen lmeas celulares de primates y lmeas celulares de roedores, que incluyen las lmeas celulares transformadas. Tambien son adecuadas las celulas diploides normales, cepas de celulas derivadas de un cultivo in vitro de tejido primario, asf como explantes primarios.

Otras lmeas celulares que tambien son utiles incluyen, por ejemplo, diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, (ATCC n.° 33694) DH5y, DH10, y MC1061 (ATcC n.° 53338)), diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., Streptomyces spp., Salmonella typhimurium y similares.

Muchas cepas de celulas de levadura conocidas por los expertos en la tecnica tambien estan disponibles como celulas hospedantes para la expresion de un GOI e incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, Pichia ciferrii y Pichia pastoris.

Ademas, cuando se desee, pueden utilizarse sistemas de celulas de insecto en los metodos de la presente invencion. Estos sistemas incluyen, por ejemplo y sin limitacion, Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Los ejemplos de celulas fungicas incluyen, sin limitacion, Thermoascus aurantiacus, Aspergillus (hongo filamentoso), que incluye, sin limitacion, Aspergillus oryzaem, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, y Aspergillus niger, Fusarium (hongo filamentoso), que incluye, sin limitacion, Fusarium venenatum, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Mortierella alpina, y Chrysosporium lucknowense.

Los ejemplos de celulas protozoarias incluyen, sin limitacion, cepas de Tetrahymena y cepas de Trypanosoma. Ejemplos

En una realizacion, la presente invencion se ejemplifica empleando codones de hamster menos preferidos para generar un gen que codifica DHFR con codones desoptimizados (CDD) adecuado para la seleccion en celulas de ovario de hamster chino (CHO).

El gen de inicio es identico a un ADNc que codifica DHFR de Mus musculus, n.° de registro BC005796, y codifica el polipeptido de DHFR de tipo salvaje (vease la figura 1). Se sintetizaron dos versiones de un polinucleotido que codifica DHFR con codones desoptimizados, denominados en la presente lisiado y peor, que representan las secuencias codificadoras desoptimizadas en un grado intermedio y maximo, respectivamente. Estos polinucleotidos se disenaron utilizando un algoritmo de utilizacion de codones GENEART AG CHO. Las secuencias de polinucleotidos que codifican DHFR con codones desoptimizados se muestran en la figura 2. Los genes de DHFR con codones desoptimizados se alinean con la secuencia del gen de DHFR de tipo salvaje en la figura 3, y se resaltan las diferencias en los nucleotidos que resultan de la introduccion de los codones menos preferidos de hamster y parejas de codones en tandem. Los productos de la traduccion de los tres genes, el tipo salvaje, el lisiado y el peor, son identicos.

Las secuencias de polinucleotidos que codifican DHFR con codones desoptimizados se introdujeron en el vector de

11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

expresion pDEF38, un vector de expresion de CHEF1 (patente de EEUU n.° 5.888.809), para sustituir la secuencia codificadora de DHFR de tipo salvaje (figura 4). Los plasmidos resultantes se denominaron (DHFR lisiada) y pDEF82 (DHFR peor). El gen indicador de interes, FIGI, que codifica una protema de fusion IgG1 Fc, se clono en el sitio de clonacion multiple (Xhol a Xbal) de pDEF38, pDEF81 y pDEF82 para crear los vectores de expresion pDEF38:FIGI, pDEF81:FIGI y pDEF82:FIGI, respectivamente.

Estos vectores de expresion de FIGI se transfectaron en celulas CHO DG44, se cultivaron durante dos dfas en medio sin seleccion que contema hipoxantina y timidina (HT), y despues se seleccionaron en medio que carecfa de HT (-HT). Las poblaciones celulares seleccionadas, o agrupaciones, se expandieron y se dividieron en cultivos de modelo de produccion para evaluar la productividad.

Las agrupaciones de transfeccion se diluyeron hasta celulas individuales de siembra en pocillos individuales de placas de 96 pocillos. Se formaron imagenes de las placas con el Clone Select Imager (Genetix), y los pocillos que conteman celulas que expresan FIGI derivadas de una unica celula se expandieron. Se seleccionaron aleatoriamente 23 clones a partir de placas de dilucion limitante para cada transfeccion (DHFR de tipo salvaje, lisiada o peor) a partir de los conjuntos monoclonales confirmados.

Los modelos de produccion de 6 pocillos se inocularon con un total de un millon de celulas en 3 ml de medio de cultivo celular con FBS al 10% y se cultivaron durante 4 dfas a 37 °C, despues durante 4 dfas a 34 °C. Los sobrenadantes de la recoleccion se filtraron a traves de filtros de 0,2 micrometros y se ensayaron para la produccion de FIGI con una HPLC de protema A. Los modelos de produccion de alimentacion discontinua se sembraron a 0,5 millones de celulas/ml en medio de cultivo suplementado con FBS al 10% en tubos de centrifugacion. Los tubos de centrifugacion de 50 ml se ensayaron con un volumen de trabajo de 15 ml. Despues de sembrar, las muestras se cultivaron a 37 °C y con CO2 al 6% durante 3 dfas, con alimentacion y desplazamiento de la temperatura hasta 34 °C que comienza en el dfa 4. Las muestras para la titulacion y la densidad celular se recogieron en los dfas 3, 5, 7, 10 y 12. El estudio concluyo en el dfa 12.

Se realizaron analisis FACS con celulas del cultivo normales del dfa 2 que fueron recolectadas y tenidas con metotrexato marcado con isotiocianato-fluorescema (F-MTX) para detectar la protema de DHFR y un Fc anti-IgG1 marcado con R-ficoeritrina (RPE) para detectar el FIGI.

Se prepararon lmeas celulares estables que expresan la protema indicadora FIGI utilizando genes de tipo salvaje y con codones desoptimizados que codifican el marcador seleccionable DHFR. Se realizaron transfecciones por duplicado (T462-T464, A y B) con los plasmidos de DHFR de tipo salvaje, lisiada y peor que expresan la protema indicadora FIGI. Las colonias individuales contadas para cada transfeccion se indican como “n.° de transfectantes”. Tal como puede observarse en la tabla 6, los resultados de la transfeccion indican que la presion de seleccion aumenta cuando se emplea DHFR con codones desoptimizados (CDD), comparado con la DHRF de tipo salvaje. Este resultado se considera como una reduccion en el numero de transfectantes CDD seleccionados en un medio que carece de HT.

Tabla 6 - Numero de transfectantes por transfeccion

Transfeccion: Plasmido Marcador de DHRF n.° de transfectantes

T462A: pDEF38:FIGI tipo salvaje 33834

T462B: pDEF38:FIGI tipo salvaje 22663

T463A: pDEF81:FIGI lisiado 1915

T463B: pDEF81:FIGI lisiado 4309

T464A: pDEF82:FIGI peor 7342

T464B: pDEF82:FIGI peor 6863

La cantidad de protema de FIGI producida a partir de los transfectantes agrupados en los modelos de produccion de la placa de 6 pocillos, dfa 8 (figura 5) y del tubo de centrifugacion, alimentacion discontinua durante 12 dfas (figura 6) mostraron un aumento inesperado en la productividad del GOI con el gen del marcador seleccionable de DHFR con codones desoptimizados, frente al gen de DHFR de tipo salvaje. El gen de DHFR lisiado produjo la titulacion mayor. Esto resultado resulta coherente con la observacion de que la seleccion de DHFR lisiada fue la mas rigurosa (vease la tabla 6) y sugiere que la diversidad en la poblacion puede reducirse, pero la celula promedio expresa mas POI. Esta conclusion es evidente en la distribucion FACS de la DHFR lisiada (T463) en la figura 7A, que muestra un apretado grupo de celulas que se tinen muy intensamente con RPE:FIGI, con una tincion reducida con F-MTX concomitante. Las celulas de DHFR peor muestran un patron de tincion de RPE:FIGI similar pero mas amplio, comparado con la DHFR lisiada, que resulta coherente con una titulacion ligeramente menor en el modelo de

produccion. Comparado con el patron de tincion de tipo salvaje, ambas agrupaciones con codones desoptimizados presentan un desplazamiento notable en la tincion, con una reduccion en la DHFR y mas FIGI. Esta diferencia se observa mas claramente en el mayor promedio de fluorescencia de las agrupaciones de CDD frente a la agrupaciones de tipo salvaje (figura 7B), y corrobora la conclusion de que la seleccion con DHFR con codones 5 desoptimizados produce una mayor produccion de POI.

El aumento observado en la productividad con las agrupaciones de CDD tambien se confirma en los clones individuales. Clones seleccionados aleatoriamente se expandieron, despues se analizaron mediante citometna de flujo y se introdujeron en el modelo de produccion de 6 pocillos. Los perfiles FACS de los clones individuales demostraron que las celulas seleccionadas con codones desoptimizados se tinen con mas intensidad para el POI 10 (figura 8B), pero tienen unos niveles inferiores de DHFR (figura 8A), comparado con los clones seleccionados de DHFR de tipo salvaje. Estos datos son coherentes con los datos de las agrupaciones de transfeccion. La productividad de los clones en el ensayo de la protema A se muestra en la figura 9 y demuestra un aumento en la titulacion para clones aleatorios procedentes de las agrupaciones seleccionadas de CDD. Las diferencias en la titulacion para los clones de CDD son entre 2 y 3 veces mayores que el tipo salvaje.

15

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

REIVINDICACIONES

1. - Un metodo para aumentar la expresion de protemas heterologas en una celula hospedante, que comprende las etapas de cultivar la celula hospedante que comprende una primera secuencia de polinucleotido heterologa que codifica dicha protema heterologa bajo condiciones que permiten la expresion de protemas, y dicha celula hospedante comprende ademas una segunda secuencia de polinucleotido que presenta una secuencia codificadora de protema para una protema de un marcador seleccionable, y dicho segundo polinucleotido presenta una modificacion en la secuencia, comparado con un polinucleotido de tipo salvaje, que codifica dicha protema del marcador seleccionable, y dicha modificacion de la secuencia reduce la eficacia de traduccion de un ARNm codificado por dicho segundo polinucleotido, y dicho segundo polinucleotido presenta dicha modificacion en la secuencia y dicho polinucleotido de tipo salvaje codifica secuencias de aminoacidos identicas para dicha protema del marcador seleccionable; y dicho primer polinucleotido y dicho segundo polinucleotido estan codificados sobre un unico vector de expresion del factor de alargamiento 1 del hamster chino (CHEF1), en el que el primer polinucleotido y el segundo polinucleotido estan cada uno bajo el control transcripcional de promotores diferenciados.
2. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la modificacion se produce en una region no traducida de dicho segundo polinucleotido que codifica dicha protema de un marcador seleccionable.
3. - El metodo de la reivindicacion 2, en el que la modificacion se produce en una region no traducida 5' y/o en una region no traducida 3'.
4. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la modificacion se produce en una region codificadora de protema del gen que codifica la protema del marcador seleccionable.
5. - El metodo de la reivindicacion 4, en el que la modificacion esta a 25, 20, 15, 10 o 5 codones desde un codon de inicio de la region codificadora de protema para el gen del marcador seleccionable.
6. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha secuencia codificadora de protema en dicha segunda secuencia de polinucleotido comprende al menos un codon modificado que no es un codon de tipo salvaje en un polinucleotido de tipo salvaje que codifica dicha protema del marcador seleccionable, y dicho codon modificado es un codon que no es un codon preferido o es un codon menos preferido para el aminoacido codificado para la celula hospedante.
7. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha secuencia codificadora de protema en dicha segunda secuencia de polinucleotido comprende al menos un codon modificado que no es un codon de tipo salvaje en un polinucleotido de tipo salvaje que codifica dicha protema del marcador seleccionable, y dicha modificacion introduce un cambio en la estructura secundaria de dicho ARNm que reduce la eficacia de traduccion de dicho ARNm, aumenta el apareamiento de codones en dicho ARNm, aumenta el contenido en G+C de dicho ARNm, o modifica el contenido en A+T de dicho ARNm.
8. - El metodo de la reivindicacion 8, en el que al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 11%, al menos 12%, al menos 13%, al menos 14%, al menos 15%, al menos 16%, al menos 17%, al menos 18%, al menos 19%, al menos 20%, al menos 21%, al menos 22%, al menos 23%, al menos 24%, al menos 25%, al menos 26%, al menos 27%, al menos 28%, al menos 29%, al menos 30%, al menos 31%, al menos 32%, al menos 33%, al menos 34%, al menos 35%, al menos 36%, al menos 37%, al menos 38%, al menos 39%, al menos 40%, al menos 41%, al menos 42%, al menos 43%, al menos 44%, al menos 45%, al menos 46%, al menos 47%, al menos 48%, al menos 49%, al menos 50%, al menos 51%, al menos 52%, al menos 53%, al menos 54%, al menos 55%, al menos 56%, al menos 57%, al menos 58%, al menos 59%, al menos 60%, al menos 61%, al menos 62%, al menos 63%, al menos 64%, al menos 65%, al menos 66%, al menos 67%, al menos 68%, al menos 69%, al menos 70%, al menos 71%, al menos 72%, al menos 73%, al menos 74%, al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de los codones en dicha secuencia codificadora de protema del segundo polinucleotido son codones modificados.
9. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la celula hospedante se selecciona de una celula eucariota, una celula procariota, una celula de Escherichia coli, una celula de levadura, una celula de Saccharomyces cerevisiae, una celula de Pichia pastoris, una celula de insecto, una celula de Spodoptera frugiperda, una celula vegetal, una celula protozoaria, una celula de mairnfero, una celula humana, una celula de hamster chino, y una celula de ovario de hamster chino.
10. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que el segundo polinucleotido comprende el polinucleotido indicado en la figura 2.
11. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la protema del marcador seleccionable es la dihidrofolato reductasa.
12. - El metodo de la reivindicacion 11, en el que el segundo polinucleotido comprende la secuencia de la dihidrofolato reductasa lisiada (cr) indicada en la figura 2.
13.- El metodo de la reivindicacion 11, en el que el segundo polinucleotido comprende la secuencia de la dihidrofolato reductasa peor (wst) indicada en la figura 2.