ES2563097T3 - Procedimientos y compuestos para detectar cáncer - Google Patents

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Mohammed Jaffar
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Abstract

Un procedimiento de determinación de la presencia o ausencia, en una muestra de orina de un paciente, de células de cáncer de vejiga o próstata que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2, comprendiendo el procedimiento: i. poner en contacto la muestra de orina, o un derivado procesado de la misma, con un compuesto de fórmula general (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie) o (If) o una sal de cualquiera de los mismos cuando sea aplicable, donde la muestra de orina contiene o se sospecha que contiene células de cáncer de vejiga o próstata que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2; ii. opcionalmente, en caso de que las células de cáncer de vejiga o próstata sobreexpresen o se sospeche que sobreexpresan NQO2, añadir un cosustrato de NQO2 a la muestra; y iii. determinar la presencia o ausencia de un compuesto de fórmula: z-XH; o un ión de fórmula z-X-; donde z y X son como se definen en la fórmula general (I), donde la presencia del compuesto o ión indica la presencia en la muestra de células cancerosas que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2; donde la fórmula general (I) es: **Fórmula** donde R1, R2, R3, R4 y R5 representan cada uno independientemente hidrogeno, halógeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes reactivos; R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halógeno; o R1 y R2, junto con los átomos de carbono a los que están conectados, forman un sistema de anillo aromático, heteroaromático, carbocíclico o heterocíclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros; X es O, S o NR8; R8 es hidrógeno o alquilo C1-C3; Y es O, S o NR9; R9 es hidrogeno o alquilo C1-C3; z es un resto que está ligado covalentemente con el resto de la molécula y que, tras la reducción del compuesto de fórmula general (I), se escinde del resto de la molécula formando un compuesto z-XH o ión z-X- detectable; la formula general (Ia) es: **Fórmula** donde R1, R2, R3, R4 y R5 representan cada uno independientemente hidrogeno, halógeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes reactivos; R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halógeno; o R1 y R2, junto con los átomos de carbono a los que están conectados, forman un sistema de anillo aromático, heteroaromático, carbocíclico o heterocíclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros; R1', R2', R3', R4' y R5' representan cada uno independientemente hidrógeno, halógeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-alquilo C1-C6 o C(O)O-alquilo C1-C6, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes reactivos; R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halógeno; o R1' y R2', junto con los átomos de carbono con los que están conectados, forman un sistema de anillo aromático, heteroaromático, carbocíclico o heterocíclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros; X es O, S o NR8; R8 es hidrógeno o alquilo C1-C3; Y es O, S o NR9; R9 es hidrógeno o alquilo C1-C3; X' es O, S o NR8; R8 es hidrógeno o alquilo C1-C3; Y' es O, S o NR9; R9 es hidrógeno o alquilo C1-C3; z es un resto que está ligado covalentemente con el resto de la molécula y que, tras la reducción del compuesto de fórmula general (I), se escinde del resto de la molécula formando un compuesto z-XH o ión z-X- detectable; la fórmula general (Ib) es: **Fórmula**

Description

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Procedimientos y compuestos para detectar cancer
La presente solicitud se refiere a procedimientos de diagnostico de canceres, particularmente cancer de vejiga y prostata, usando compuestos que son utiles en la deteccion de celulas que expresan NQO1 o NQO2.
El cancer de vejiga es el noveno cancer mas comun en el mundo. Es mas prevalente en hombres que en mujeres. En todo el mundo, aparecen 356.600 nuevos casos estimados de cancer de vejiga cada ano (2008), con aproximadamente 20.000 muertes al ano. Las tasas mas altas de incidencia de cancer de vejiga se encuentran generalmente en pafses industrialmente desarrollados, particularmente en America del Norte y Europa Occidental.
En los pafses desarrollados, aproximadamente un 90 % de los canceres de vejiga son carcinomas de celulas transicionales (CCT, verrugas en la vejiga), mientras que el 10 % restante son carcinomas escamosos y adenocarcinomas. El carcinoma de celulas transicionales superficial tiende a extenderse solo en la vejiga a menos que se deje sin tratar durante un largo periodo de tiempo. Los CCT pueden extenderse por el revestimiento de la vejiga, pero no penetran profundamente en la vejiga (a menos que se dejen sin tratar) y las celulas se eliminan en la orina.
Los tumores de vejiga superficiales pueden gestionarse muy efectivamente mediante reseccion repetida. El tumor se retira (reseca) mediante un cistoscopio que se pasa por la uretra. Este tipo de tratamiento es altamente invasivo. Los tumores de vejiga superficiales tienden a recidivar intermitentemente y pueden requerir repetidamente la reseccion. El cancer de vejiga invasivo requiere un enfoque mas agresivo. En las etapas tempranas, los tumores pueden resecarse quirurgicamente por retirada parcial o completa de la vejiga. Esto puede requerir cirugfa mayor, que requerira la creacion de un conducto ileal. Se usa la “cistoscopia exploratoria” rutinaria para detectar la recidiva de tumores, particularmente en las etapas tempranas, y se inicia un tratamiento adicional si es necesario. El intervalo de tiempo entre las cistoscopias exploratorias es habitualmente de 3-4 meses inicialmente, pero puede aumentar si la vejiga permanece libre de tumores en la investigacion posterior. La cistoscopia exploratoria esta recomendada durante un periodo de varios anos para asegurar que el tumor no ha vuelto. Aproximadamente un 85 % de los pacientes con cancer de vejiga padecen recidiva al cabo de 5 anos, la mayorfa de pacientes al cabo de 2 anos. La alta tasa de recidiva puede ser atribuida, en gran medida, a los tumores de la vejiga que estan presentes en multiples localizaciones que pueden escapar al examen o que son demasiado pequenos para ser vistos por el cirujano durante la reseccion inicial. Por ello, existe la necesidad clfnica de un medio sensible, especffico y no invasivo de deteccion de cancer de vejiga.
La necesidad de una prueba de diagnostico para detectar el cancer de vejiga de etapa temprana (carcinoma de celulas transicionales superficial) esta justificada debido al alto riesgo de recidiva (85 %) despues de la intervencion quirurgica o quimioterapeutica durante los primeros 5 anos. Ademas de los procedimientos que requieren un examen y muestreo invasivos, se han descritos varias pruebas no invasivas. Una revision reciente (Shariat et al., 2008) de dichos procedimientos concluyo que ninguna de las pruebas revisadas satisfacfa todos los criterios de un marcador tumoral ideal. Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento sencillo, rapido, exacto y no invasivo para la deteccion temprana de cancer de vejiga, y la invencion divulgada en la presente memoria proporciona una solucion a este problema.
Se han detectado niveles elevados de NAD(P)H:quinona reductasa-1 (NQO1, E.C. 1.6.99.2) y otras enzimas redox relacionadas en el cancer de vejiga superficial, en comparacion con el carcinoma de celulas transicionales invasivo (Li et al., 2001, J. Urol., 166, 2500-2505; Choudry et al., 2001, Br. J. Cancer, 85, 1137-1146). Esta diferencia significativa se ha explotado para tratar canceres de vejiga de etapa temprana usando agentes especfficos de NQO1. Se han desarrollado sistemas conjugados de benzoquinona-farmaco para dirigirse especfficamente a celulas tumorales ricas en NQO1.
La NQO1 se sobreexpresa tambien en las celulas de diversos otros tipos de cancer, incluyendo canceres de mama, pulmonar no microcftico, de pancreas, colon y prostata, respecto a celulas normales.
La enzima relacionada NQO2 se sobreexpresa tambien en celulas cancerosas, incluyendo aquellas presentadas anteriormente.
El documento US 2010/047839 y Biosensors and Bioelectronics, 23, 1793-1798 (2003), (Huang et al.) se refiere a indicadores fluorimetricos latentes para monitorizar la actividad de DT diaforasa (NQO1). Los compuestos incluyen derivados de 1,4-benzoquinona en que puede escindirse una sonda fluorimetrica del resto de la molecula usando DT diaforasa y NADH.
Molecular Cancer Therapeutics, 6(12), 3122-3130 (2007), Volpato et al., ensena que la NQO1 es una diana para intervencion terapeutica debido a su capacidad de convertir ciertas quinonas en especies citotoxicas y a que se han encontrado niveles elevados de NQO1 en varios tipos de tumores, por ejemplo canceres de pulmon no microcftico y
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pancreatico. Los autores proponen tratar estos canceres usando compuestos que se activan por NQO1 y que se reducen liberando un metabolite inerte y un agente terapeutico.
J. Med. Chem., 45, 3540-3548 (2002), Hernick et al. se refiere al diseno, sfntesis y evaluacion biologica de profarmacos dirigidos a DT-diaforasa (DTD, NQO1).
J. Med. Chem., 44, 3311-3319 (2001), Swann et al. ensena que la NQO1 cataliza la reduccion de quinonas y es por lo tanto capaz de proteger a celulas ante los efectos toxicos de las quinonas, y se refiere a un estudio de la reaccion de series de indoloquinonas con NQO1.
Biochem. Pharmacol., 47(8), 1325-1332 (1994), Smitskamp-Wilms et al. se refiere al estudio del compuesto EO9, uno de una serie de indoloquinonas biorreductoras que es sustrato de enzimas NQO de humano y roedor (DTD).
El documento WO 2011/113018 se refiere a un procedimiento de medida y modulacion del “tiempo biologico”, que se define como un mecanismo mediante el cual un sistema vivo coordina o sincroniza procesos biologicos. Se dice que el tiempo biologico esta correlacionado con la concentracion de moleculas activas redox tales como NCO1.
El documento EP1445602 se refiere a procedimientos y kits para la deteccion y determinacion de analitos usando una reaccion redox seguida de una determinacion fluorimetrica. Los procedimientos se llevan a cabo usando un compuesto que comprende un grupo apagador ligado a un fluoroforo.
Tetrahedron, 65(25), 4894-4903 (2009), Blanche et al. se refiere a sistemas de profarmaco para uso en terapia del cancer. Los sistemas divulgados incluyen derivados de 1,4-benzoquinona que comprenden un grupo D, en que D es un residuo farmacologico, y la reduccion del compuesto conduce a la liberacion del farmaco Dh. El documento divulga tambien sistemas modelo en que el residuo farmacologico D se reemplaza por un resto de oxocromeno.
El documento US 2009/0012031 se refiere a compuestos que se dirigen a la expresion de EZH2 en cancer de prostata, y el documento WO 2004/009602 se refiere a compuestos de pirazolopiridina que son utiles como inhibidores de cinasa.
La presente invencion aprovecha la sobreexpresion de NQO1 y NQO2 en celulas cancerosas respecto a celulas normales y se refiere a sustratos enzimaticos que son activados por NQO1 o NQO2, dando como resultado una senal detectable en presencia de celulas cancerosas. En contraposicion, se observa una senal minima en ausencia de celulas cancerosas (y por tanto cantidades reducidas en gran medida de NQO1 y/o NQO2).
Afirmaciones de la invencion
En un primer aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia, en la orina de un paciente, de celulas de cancer de vejiga o prostata que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2, comprendiendo el procedimiento: i.
i. poner en contacto la muestra de orina, o un derivado procesado de la misma, con un compuesto de formula general (I), (la), (Ib), (Ic), (Id), (le) o (If) o una sal de cualquiera de los mismos cuando sea aplicable, donde la muestra biologica contiene o se sospecha que contiene celulas de cancer de vejiga o prostata que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2;
ii. opcionalmente, en caso de que las celulas de cancer de vejiga o prostata sobreexpresen o se sospeche que sobreexpresan NQO2, anadir un cosustrato de NQO2 a la muestra; y
iii. Determinar la presencia o ausencia de un compuesto de formula:
z-XH;
o un ion de formula
z-X-;
donde z y X son como se definen en la formula general (I), donde la presencia del compuesto o ion indica la presencia en la muestra de celulas cancerosas que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2; donde la formula general (I) es:
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imagen1
donde R1, R2, R3, R4 y R5 representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno; o
R1 y R2, junto con los atomos de carbono a los que estan conectados, forman un sistema de anillo aromatico, heteroaromatico, carbocfclico o heterocfclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros;
X es O, S o NR8;
R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
Y es O, S o NR9;
R9 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
z es un resto que esta ligado covalentemente con el resto de la molecula y que, tras la reduccion del compuesto de formula general (I), se escinde del resto de la molecula formando un compuesto z-XH o ion z-X" detectable;
donde la muestra biologica contiene o se sospecha que contiene celulas cancerosas que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2;
la formula general (la) es:
imagen2
donde R1, R2, R3 R4, R5, X, Y y z son como se definen para la formula general (I);
R1', R2', R3', R4' y R5' representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno;
o R1' y R2', junto con los atomos de carbono con los que estan conectados, forman un sistema de anillo aromatico, heteroaromatico, carbocfclico o heterocfclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros;
X' es O, S o NR8;
R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
Y' es O, S o NR9;
R9 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
la formula general (Ib) es:
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imagen3
donde R1, R2, R4, X y z son como se definen para la formula general (I) y Rx es H o alquilo C1-C3; la formula general (Ic) es
imagen4
donde R4, R5, X, Y y z son como se definen para la formula general (I); y
R10, R11, R12 y R13 representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno;
la formula general (Id) es:
imagen5
donde X y z son como se definen para la formula general (I); y
R10, R11, R12 y R13 representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno;
la formula general (Ie) es:
imagen6
donde X Y y z son como se definen para la formula general (I); y
R10, R1, R12 y R13 representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7,
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C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo Ci-Ca), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
Ra y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-Ca opcionalmente sustituido con halogeno;
la formula general (If) es:
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donde z es como se define para la formula general (I);
R , R , R y R representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR R , C(O)NRaR7 o alquilo C1-Ca, -O-(alquilo C1-Ca) o C(O)O-(alquilo C1-Ca), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
Ra y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-Ca opcionalmente sustituido con halogeno;
R14 es H o alquilo C1-Ca.
Los compuestos de formulas generales (I), (la), (Ib), (Ic), (Id), (le) e (If) son susceptibles de reduccion, produciendo un producto de formula z-XH o un anion de formula z-X- y un residuo reducido. Como se expondra con mas detalle a continuacion, el resto z es un marcador detectable y el resto de la molecula se elige de tal modo que la serial detectable emitida por el grupo z se modifica cuando forma parte del compuesto de formulas generales (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie) o (If) en comparacion con la serial emitida por el compuesto z-XH o el ion z-X-.
Los compuestos de quinona o benzoquinona de formulas (I) y (Ia), los indoles de formula (Ib), los compuestos basados en nitro de formulas generales (Ic), (Id) y (Ie) y los compuestos de formula general (If) son todos conocidos en la materia. Por ejemplo, los compuestos de formula general (Ia) se ensenan en Huang et al., Org. Letters, 8(2), 2aa5-2a8 (200a) y los compuestos de formulas generales (I), (Ib), (Ic), (Id) y (Ie) se exponen en Blanche et al., Tetrahedron, a5(25), 4892-4903 (2009).
La naturaleza del resto detectable, concretamente si es un compuesto de formula z-XH o un anion de formula z-X-, dependera de la naturaleza del marcador detectable z, del procedimiento de deteccion usado y del entorno en que se realice el procedimiento de deteccion. Por lo tanto, de aqui en adelante, deberia considerarse que las referencias a un compuesto de formula z-XH engloban tambien un anion de formula z-X-. Por tanto, los procedimientos para la deteccion y/o cuantificacion de un compuesto z-XH incluyen tambien procedimientos para la deteccion y/o cuantificacion de un anion z-X-.
Adicionalmente, la referencia a un derivado procesado de una muestra biologica incluye la referencia a una muestra biologica despues de que se ha tratado, tipicamente con el fin de prepararla para el procedimiento de la invencion o conservarla antes de emprender dicho procedimiento, e implica el uso de tecnicas convencionales bien conocidas por los especialistas en la tecnica de tomar, preparar o conservar muestras biologicas.
En la presente memoria descriptiva, “alquilo C1-Ca” hace referencia a una cadena de hidrocarburo saturado lineal o ramificada que tiene de 1 a a atomos de carbono. Los ejemplos incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, terc-butilo y n-hexilo.
El termino “alquilo C1-C3" hace referencia a un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 atomos de carbono.
El termino “aromatico” en el contexto de la presente memoria descriptiva hace referencia a un sistema de anillo con caracter aromatico que tiene 5 o a atomos de carbono de anillo. Los grupos aromaticos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados de entre halogeno, metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, nitro y ciano. El fenilo es un grupo arilo particularmente adecuado.
El termino “heteroaromatico” en el contexto de la memoria descriptiva hace referencia a un sistema de anillo con caracter aromatico que tiene 5 o a atomos de anillo, al menos uno de los cuales es un heteroatomo seleccionado de entre N, O y S. Los ejemplos de grupos heteroaromaticos incluyen piridina, pirimidina, furano, tiofeno, oxazol, diazol y triazol. Los grupos heteroaromaticos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados de entre halogeno, metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, nitro y ciano.
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El termino “carbodclico” en el contexto de la presente memoria descriptiva hace referencia a un sistema de anillo no aromatico que tiene 5 o 6 atomos de carbono de anillo. El anillo puede contener uno o mas dobles enlaces carbono- carbono y el termino abarca por lo tanto grupos cicloalquilo y cicloalquenilo. Los ejemplos de grupos carbocfclicos incluyen ciclohexilo, ciclopentilo y ciclohexenilo. Los grupos carbocfclicos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados de entre halogeno, metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, nitro y ciano.
El termino “heterodclico” en el contexto de la presente memoria descriptiva hace referencia a un sistema de anillo no aromatico que tiene 5 o 6 atomos de anillo, al menos uno de los cuales es un heteroatomo seleccionado de entre N, O y S. El anillo puede contener uno o mas dobles enlaces. Los ejemplos de grupos heterocfclicos incluyen grupos piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo y tetrahidrofurilo. Los grupos heterocfclicos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes independientemente seleccionados de entre halogeno, metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, nitro y ciano.
El termino “halogeno” hace referencia a fluoro, cloro, bromo o yodo.
El termino “sustituyentes reactivos” como se usa en la presente memoria hace referencia a un sustituyente que es capaz de reaccionar con un grupo pendiente de un sustrato solido tal como una membrana, nanopartfcula o superficie polimerica o sobre una protefna o polipeptido. Hay muchas reacciones mediante las que los compuestos de formula (I) pueden ligarse con sustratos solidos, y los sustituyentes reactivos dependeran, por supuesto, de la naturaleza del grupo pendiente y de la reaccion elegida. Los sustituyentes reactivos adecuados incluyen halogeno, hidroxilo, tiol, amino, carbonilo, carboxilo, ciano, azido, grupos alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6, siendo los sustituyentes reactivos particularmente adecuados halogeno, hidroxilo, tiol, amino, carbonilo y carboxilo.
La muestra biologica puede ser una muestra de biopsia, o un derivado procesado de la misma, tomada de un paciente que tiene o se sospecha que tiene cancer de mama, pulmonar no microcftico, de pancreas, colon, cervicouterino, testicular, de prostata o vejiga. Como alternativa, la muestra biologica puede ser un derivado procesado de muestra de biopsia, por ejemplo celulas recolectadas de una muestra de biopsia, por ejemplo por centrifugacion y, si es necesario, resuspendidas en un medio alternativo.
El procedimiento es particularmente adecuado para diagnosticar cancer de prostata o vejiga, especialmente tumores de vejiga superficiales, puesto que las celulas se eliminan en la orina, que puede usarse por tanto como muestra biologica. Como alternativa, puede usarse como muestra biologica un derivado procesado de una muestra de orina. Es un ejemplo de dicho derivado procesado las celulas recolectadas de una muestra de orina y, si es necesario, resuspendidas en un medio alternativo.
En un procedimiento preferido de la invencion, se determina tambien el numero de celulas en dicha muestra, o una cantidad de prueba de las mismas, de tal modo que la actividad de NQO1/NQO2 pueda expresarse por celula. Dichas celulas pueden estar presentes en la muestra bruta o pueden enriquecerse, aislarse o purificarse a partir de la muestra bruta. Esto puede conseguirse mediante centrifugacion, filtracion u otros procedimientos divulgados en la bibliograffa cientffica. idealmente, se emprende el enriquecimiento o purificacion usando un procedimiento de union a ligando tal como, pero sin limitacion, el uso de partfculas paramagneticas recubiertas con un anticuerpo, receptor u otro copartfcipe de union para un marcador de superficie celular seleccionado de interes.
En un procedimiento preferido de la invencion, se determina la presencia o ausencia de z-XH o z-X" como la cantidad representada por la relacion de concentracion de z-XH o z-X- de la muestra a la de un control de ensayo negativo que no contiene celulas, no contiene celulas que expresan NQO1 y/o NQO2 o contiene celulas normales que pueden expresar, debido a su naturaleza, niveles muy bajos de las enzimas. Idealmente, las diferentes cantidades de esta relacion se correlacionan con las tecnicas de estadificacion de celulas cancerosas conocidas, de tal modo que puede usarse un ensayo in vitro sencillo para informar fiablemente a un medico no solo sobre la existencia de un cancer, sino tambien su progresion probable. En un procedimiento preferido adicional de la invencion, se ve una mayor actividad de NQO1 en aquellas muestras de pacientes con tumores de etapa posterior.
En un procedimiento preferido adicional de la invencion, el protocolo de ensayo implica centrifugar una muestra que contiene celulas que se cree que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2, retirar el sobrenadante, resuspender las celulas en tampon seleccionado, incubar con un compuesto de formula general (I) y ensayar z-XH o z-X- como anteriormente. Idealmente, la incubacion se emprende durante aproximadamente 3 min. Se deduce que el ensayo de la invencion puede emprenderse de forma relativamente directa y lleva solo un corto periodo de tiempo, favoreciendo una aplicacion de diagnostico inmediato.
Como se describe con mas detalle a continuacion, el marcador z puede ser un cromoforo o un luminoforo (p.ej., un marcador fluorescente, fosforescente, bioluminiscente o quimioluminiscente); o un modulador de emisiones de una molecula o ion fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente o bioluminiscente; o un cofactor de una reaccion quimioluminiscente o bioluminiscente. Como alternativa, el marcador puede ser una micropartfcula o nanopartfcula detectable tal como, pero sin limitacion, una partfcula coloreada o magnetica. El procedimiento mediante el que se
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determina la presencia o ausencia del compuesto z-XH o z-X- variara dependiendo de la naturaleza del marcador detectable z. Por ejemplo, pueden monitorizarse los cambios de la intensidad de fluorescencia o longitud de onda usando un fluorfmetro y monitorizarse los cambios analogos de quimioluminiscencia usando un luminometro. Si es necesario, puede aislarse el producto de la reaccion enzimatica, por ejemplo mediante cromatograffa lfquida, antes de la deteccion y/o cuantificacion.
El compuesto escindido z-XH o z-X" puede ser detectable como alternativa por su capacidad de unirse a un resto de captura, y los pares de union de z-XH o z-X- y resto de captura pueden comprender, por ejemplo, avidina o estreptavidina y biotina o un par de anticuerpo/antfgeno tal como fluorescefna/antifluorescefna.
Como se describe tambien con mas detalle a continuacion, el compuesto escindido z-XH o z-X- puede ser detectable como alternativa por su capacidad de unirse a un resto de captura, y los pares de z-XH o z-X- y resto de captura pueden comprender, por ejemplo, avidina o estreptavidina y biotina o un par de union de anticuerpo/antfgeno tal como fluorescefna/antifluorescefna.
Los compuestos de formulas generales (I), (la), (Ib), (Ic), (Id), (le) y (If) son sustratos de NQO1 y NQO2 y se reducen por estas enzimas. La reduccion da como resultado la escision del resto marcador z, que puede detectarse entonces. La escision ocurre de acuerdo con el Esquema 1 siguiente, que ilustra el mecanismo de reaccion para compuestos de formula general (I). La reduccion de compuestos de formulas generales (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie) y (If) procede de manera similar.
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Los compuestos de la invencion son particularmente utiles en la deteccion del cancer, puesto que el resto de quinona es un sustrato de las enzimas NQO1 y NQO2, que se sobreexpresan en celulas cancerosas. Los compuestos son particularmente utiles para detectar cancer de prostata y vejiga superficial debido a que dichas celulas se eliminan en la orina, y por lo tanto puede llevarse a cabo una prueba diagnostica en una muestra de orina, o un derivado procesado de una muestra de orina tal como celulas recolectadas de la muestra, sin necesidad de un procedimiento invasivo. En caso de que las celulas cancerosas sobreexpresen NQO2, puede ser necesario anadir a la muestra o derivado procesado un cosustrato de NQO2 tal como /V-ribosildihidronicotinamida (NRH) o yoduro de 1- metil-3-carboxamidopiridinio, especialmente cuando se reduce al derivado de 1,4-dihidropiridina o 1-carbamoilmetil- 3-carbamoil-1,4-dihidropiridina, todos los cuales actuan como cosustrato de NQO2. Estan disponibles otros cosustratos de NQO2 y son conocidos por los especialistas en la materia, tales como los descritos por Knox et al. Cancer Res. 60, pag. 4179-4186, 2000. Habitualmente no es necesario anadir un cosustrato en casos en que se va a detectar la sobreexpresion de NQO1, puesto que el NAD(P)H, el cosustrato de NQO1, esta presente en todas las celulas. Sin embargo, puede usarse este ultimo cosustrato, o su equivalente, en situaciones en que se ha aislado anteriormente NQO1 de la muestra biologica antes de la medida de actividad, o se han lisado las celulas para investigar.
La exposicion siguiente se refiere a la deteccion de los compuestos z-XH o iones z-X-. En esta exposicion, las referencias a un compuesto de formula (I) se aplican tambien a compuestos de formulas generales (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie) y (If).
Los compuestos z-XH o iones z-X- detectables adecuados incluyen, en particular, cromoforos y luminoforos, por ejemplo moleculas o iones fluorescentes, fosforescentes, quimioluminiscentes o bioluminiscentes; o moduladores de emisiones de moleculas o iones fluorescentes, fosforescentes, quimioluminiscentes o bioluminiscentes; o un cofactor de una reaccion quimioluminiscente o bioluminiscente. En particular, el resto z puede elegirse de tal modo que sus propiedades opticas cambien cuando se escinde del resto del compuesto de formula general (I), formando el compuesto z-XH o el ion z-X-.
El cambio en las propiedades opticas puede ser, por ejemplo, un cambio detectable en la longitud de onda de luz emitida, la retirada de un efecto apagador ejercido por el resto de quinona de formula general (I) o, en el caso de cofactores, la remodulacion de su actividad.
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Lo mas comunmente, cuando el resto z es un luminoforo o cromoforo, el cambio en sus propiedades opticas tras escision del resto del compuesto de formula (I) esta basado en dos mecanismos subyacentes. El primero es debido a la conexion “atractora de electrones” (a traves del ligamiento C-O-X) del resto de senalizacion activo y el otro es debido al apagamiento conseguido a traves del fenomeno de (seudo) apilamiento n. Estos mecanismos se ilustran en los Esquemas 2A y 2B usando cumarina como ejemplo.
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En el Esquema 2A, el anion de cumarina experimenta tautomerfa de resonancia que da como resultado la generacion de fluorescencia. Si el grupo X esta conectado a un resto de quinona atractor de electrones como en la formula general (I), la fluorescencia se anula.
El Esquema 2B muestra el apagamiento fluorescente por seudoapilamiento n entre los restos de quinona y de cumarina aromatica.
En una realizacion alternativa, el resto z puede comprender un marcaje detectable, por ejemplo una partfcula detectable, especialmente una micropartfcula o nanopartfcula detectable tal como, pero sin limitacion, una micropartfcula de latex coloreada, nanopartfcula de oro o partfcula magnetica, asf como numerosas moleculas detectables, todas las cuales son bien conocidas por los especialistas en la materia. El procedimiento mediante el que se determina la presencia o ausencia del compuesto z-XH o ion z-X" variara dependiendo de la naturaleza del resto z detectable. Por ejemplo, pueden monitorizarse los cambios de la intensidad de fluorescencia o longitud de onda usando un fluorfmetro y monitorizarse los cambios analogos de quimioluminiscencia usando un luminometro. Si es necesario, puede aislarse el producto de la reaccion enzimatica, por ejemplo mediante cromatograffa lfquida, antes de la deteccion y/o cuantificacion.
Como alternativa, el compuesto z-XH o ion z-X- escindido puede ser detectable por su capacidad de unirse a un resto de captura. En este caso, el resto z puede comprender simplemente una porcion de union que se une selectivamente al resto de captura y el resto de captura puede comprender un copartfcipe de union del resto z y un marcaje detectable, por ejemplo una partfcula detectable como se describe anteriormente.
Cuando z comprende un marcaje detectable como se describe anteriormente, puede comprender adicionalmente una porcion de union que se une selectivamente a un resto de captura.
Los ejemplos de pares de union adecuados que pueden usarse en este tipo de realizacion son conocidos, por ejemplo, biotina y avidina o estreptavidina y pares de union de antfgeno/anticuerpo.
Por tanto, en algunos casos, uno de z y el resto de captura puede comprender biotina, o un derivado de biotina, y el otro puede comprender avidina o estreptavidina o un derivado de las mismas. Como alternativa, uno de z y el resto de captura puede comprender un antfgeno y el otro un anticuerpo especffico del antfgeno, por ejemplo fluorescefna/anti-fluorescefna. Son conocidos en la materia otros ejemplos de pares de union adecuados.
Es un modo de detectar dicho marcador inmovilizar el complejo formado por el marcador z y el resto de captura sobre un sustrato solido y detectar el marcaje sobre dicho sustrato solido. Por tanto, en una realizacion, se inmovilizara el resto de captura sobre un sustrato solido tal como perlas, fibras o una membrana, y el resto z comprendera un marcaje detectable.
Si esta presente NQO1 en la muestra, se escindira el resto z del compuesto de formula general (I) y se unira el z-XH
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o z-X- libre al resto de captura inmovilizado, permitiendo la deteccion del marcaje.
Como alternativa, puede usarse un formato de ensayo de union y este sera particularmente adecuado cuando el resto z comprenda simplemente un copartfcipe de union del resto de captura. En este caso, se usa un reactivo de union secundario marcado apropiado para monitorizar la ocupacion del resto de captura.
En algunos casos, puede inmovilizarse el compuesto de formula (I) sobre un sustrato solido en una primera localizacion, por ejemplo mediante conexion covalente que implica cualquiera de los grupos R1 a R5 o derivados adecuados de los mismos, e inmovilizarse una molecula de captura en una segunda localizacion. Los derivados y procedimientos adecuados para inmovilizar en general moleculas en soportes solidos son bien conocidos por los especialistas en la materia. Si esta presente NQO1 o NQO2 en la muestra, se reducira el compuesto de formula (I), se escindira el resto z del residuo del compuesto de formula general (I) y sera libre de moverse a la segunda localizacion, donde puede capturarse y detectarse
Los procedimientos de deteccion descritos anteriormente pueden ser cualitativos o cuantitativos. La deteccion cuantitativa del compuesto z-XH o z-X- hace posible determinar la gravedad del cancer y monitorizar la efectividad de cualquier tratamiento.
En un aspecto adicional de la invencion, se proporciona un kit para diagnosticar un cancer que sobreexpresa NQO1 y/o NQO2, comprendiendo el kit una composicion que comprende un compuesto de formulas generales (I), (la), (Ib), (ic), (Id), (Ie) o (If) en un envase adecuado, instrucciones para usar el kit y opcionalmente una composicion que comprende un cosustrato de NQO2 en un envase adecuado.
Los ejemplos especfficos de restos marcadores z incluyen fluorescefna, 2-oxo-2H-1-benzopiranilo y 4-metil-2-oxo- 2H-cromen-7-ilo.
En una realizacion particularmente adecuada, se pone en contacto la muestra biologica con un compuesto de formula general (I).
En compuestos adecuados de formula general (I), independientemente o en cualquier combinacion, R1, R2, R3, R4 y R5 son cada uno independientemente hidrogeno, metilo o etilo;
X es O o NH; e Y es O.
En compuestos mas adecuados, R1, R2, R3, R4 y R5 son cada uno independientemente hidrogeno o metilo y aun mas adecuadamente:
R1 y R2 son ambos metilo;
R es hidrogeno o metilo; y
R4 y R5 son iguales y pueden ser hidrogeno o metilo.
Los compuestos particularmente adecuados de formula general (I) incluyen:
3-metil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)butanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1= R2= R3= R4= R5= Me);
3-(4,5-dimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)-3-metilbutanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1= R2= R4= R5= Me; R3= H);
3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)propanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1= R2= R3= Me; R4= R5= H); y
3-metil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)butanoato de 4-metil-2-oxo-2H-cromen-7-ilo (R1= R2= R3= R4= R5= Me).
En realizaciones alternativas separadas, se pone en contacto la muestra con un compuesto de formula general (Ia), un compuesto de formula general (Ib), un compuesto de formula general (Ic), un compuesto de formula general (Id), un compuesto de formula general (Ie) o un compuesto de formula general (If).
En los compuestos de formula general (Ia), son valores particularmente adecuados de R1, R2, R3, R4 como se definen para la formula general (I), mientras que son valores particularmente adecuados de R y R5', X' e Y' como se definen para R1, R2, R3, R4, R5, X e Y de formula general (I).
R5, X, Y y z , R2', R3', R4'
En los compuestos de formula general (Ib), son valores particularmente adecuados de R1, R2, R3, R4, R5, X, Y y z como se definen para la formula general (I).
En los compuestos de formula general (Ic), son valores particularmente adecuados de R4, R5, X, Y y z como se definen para la formula general (I).
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En los compuestos de formula general (le), son valores particularmente adecuados de X, Y y z como se definen para la formula general (I).
En los compuestos de formula general (If), son valores particularmente adecuados de X y z como se definen para la formula general (I) y R10 es adecuadamente H o metilo.
En compuestos mas adecuados de las formulas generales (Ic), (Id), (Ie) e (If), cada uno de R , R , R y R representa independientemente H o alquilo C1-C6, particularmente H o metilo, y lo mas adecuadamente H.
Los compuestos de formula general (I) pueden prepararse a partir de compuestos de formula general (II):
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donde R1, R2, R3, R4, R5 y Y como se definen para la formula general (I); mediante reaccion con un compuesto de formula (III):
z-XH o z-X- (III)
donde X y z son como se definen anteriormente para la formula general (I).
Tfpicamente, se lleva a cabo esta reaccion en presencia de un reactivo de acoplamiento tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) y una base tal como 4-dimetilaminopiridina (DMAP). La reaccion puede realizarse a una temperatura de aproximadamente 15-30 °C, tfpicamente a temperatura ambiente. Cuando X es NR8, puede llevarse a cabo la reaccion en presencia de DCC y W-hidroxisuccinimida y procede de manera similar a una reaccion de acoplamiento peptfdico convencional.
Los compuestos de formula general (II) pueden prepararse a partir de compuestos de formula general (IV):
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donde R1, R2, R3, R4, R5 e Y son como se definen para la formula general (I);
mediante reaccion con W-bromosuccinimida en acetonitrilo, seguido de la adicion de agua. La reaccion puede realizarse a una temperatura de aproximadamente 15-30 °C, tfpicamente a temperatura ambiente.
Los compuestos de formula general (IV) pueden prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula general (VI):
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donde R1, R2 y R3 son como se definen para la formula general (I), con un compuesto de formula general (VII):
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donde Y, R4 y R5 son como se definen para la formula general (I).
La reaccion puede realizarse en condiciones acidas, por ejemplo en presencia de acido metanosulfonico a una temperature de aproximadamente 60-100 °C, mas habitualmente de 70-90 °C.
Los compuestos de formulas generales (VI) y (VII) estan facilmente disponibles o pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos por los especialistas en la materia.
Como ya se ha mencionado anteriormente, los compuestos de formula general (Ia) se ensenan por Huang et al., Org. Letters, 8(2), 2665-268 (2006) y los compuestos de formulas generales (Ib), (Ic), (Id) e (Ie) se exponen en Blanche et al., Tetrahedron, 65(25), 4892-4903 (2009). Se ensenan procedimientos para la preparacion de estos compuestos en estas referencias directamente o se describen en referencias citadas en esos documentos.
Los compuestos de formula general (I) y de formulas generales (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie) e (If) son de uso en procedimientos de diagnostico de cancer.
Los ejemplos de canceres con los que pueden usarse los compuestos de formula general (I) y de formulas generales (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie) e (If) para diagnosticar incluyen canceres de prostata y malignidades urologicas, donde las celulas tumorales pueden estar presentes en la orina. Por lo tanto, el cancer es adecuadamente cancer de prostata o, mas adecuadamente, cancer de vejiga, especialmente tumores de vejiga superficiales.
La invencion se describira ahora con mas detalle con referencia a los Ejemplos siguientes y a los dibujos, en que:
La FIGURA 1 muestra un ejemplo de un formato de ensayo en que puede detectarse o cuantificarse la actividad de NQO1 por su capacidad de escindir una partfcula inmovilizada detectable de una conexion de fase solida mediante la medida de las partfculas en la localizacion inicial, localizacion final o ambas.
La FIGURA 2 es una grafica que muestra la absorbancia UV (a 265 nm) (•) y la serial fluorimetrica (Xex 410nm; Xem 550mm) (o) de MTL8-252 (0,1 M) en presencia de tampon fosfato (10 mM) a 37 °C monitorizado durante un periodo de 75 minutos como se detecta con el espectrofotometro de UPLC. La grafica demuestra que MTL8-252 es significativamente estable en tampon fosfato durante al menos 1 hora.
La FIGURA 3 es una grafica de UV que muestra la desaparicion de MTL8-252 (100 pM) monitorizada a una absorbancia de 265 nm a 265 nm a pH 7 y a 37 °C com el tiempo. El control (•) desigma el sustrato en tampon fosfato solo; (o) designa el sustrato en tampon y NADH (500 pM); (A) designa el sustrato en presencia de hNQO1 (0,10 pg/ml) y NADH (500 pM) y (▼) designa el sustrato en presencia de hNQOI (0,20 pg/ml) y NADH (500 pM). La grafica indica que MTL8-252 es un excelente sustrato de hNQO1.
La FIGURA 4 es una grafica que muestra la desaparicion de MTL8-252 y la aparicion de 4-MU en presencia y ausencia de hNQO1 con el tiempo usando un ensayo de UPLC. (o) representa la desaparicion de MTL8-252 (conc. inicial 100 pM) en presencia de hNQO1 (0,2 pg/ml) y NADH (500 pM); (▲) representa la aparicion de 4-MU detectado por su fluorescencia; (•) es el experimento de control en que se incubo MTL8-252 con NADH. Se calculo la velocidad de desaparicion del compuesto como 13,51 pM/min y se calculo la velocidad de aparicion de 4-MU como 8,41 pM/min.
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La FIGURA 5 es una nueva grafica de los datos mostrados en la Figura 6, pero en que se midieron las concentraciones usando UV (a 210 nm) en lugar de fluorescencia con el tiempo. (□) representa MTL8-252 solo; (•) representa MTL8-252 en presencia de NADH; (o) representa la desaparicion de MTL8-252 en presencia de hNQOI y NADH; (A) representa la aparicion de 4-MU (liberacion de 4-MU del proceso de activacion: MTL8- 252+NADH+hNQO1); (▲) representa la aparicion del subproducto de lactona (formacion de la lactona a partir del proceso de activacion). Se calculo la velocidad de desaparicion de MTL8-252 como 8,41 pg/min. Se calculo la velocidad de aparicion de 4-MU como 11,48 pg/min y se midio la velocidad de aparicion de lactona como 9,84 pg/min.
La FIGURA 6 es una grafica de estabilidad con el tiempo cuando se incubaban 4-MU (100 pM) y la lactona (100 pM) con hNQO1 (0,2 mg/pl) y NADH (500 mM). (•) representa 4-MU medido por UV a 210 nm; (o) representa 4-MU medido por fluorescencia (datos de FL Plus); (V) representa la lactona medida por UV a 210 nm. Los datos indican que tanto 4-MU como la lactona son estables en presencia de hNQO1 (concretamente no se afectan/activan por hNQO1).
La FIGURA 7 es una grafica espectrofotometrica de luminiscencia que muestra las velocidades de formacion de 4- MU con el tiempo cuando se incuba MTL8-252 (100 mM) con lfneas celulares que expresan hNQO1 (hDT7; 2,5x105 celulas/ml) y que no expresan hNQO1 (F170; 2,5x105 celulas/ml). (•) representa el compuesto en orina solo; (▼) representa el compuesto con la lfnea celular hDT7 que expresa NQO1: (o) representa MTL8-252 con F179, lfneas celulares sin expresion de NQO1. La velocidad de formacion de 4-MU en la orina sola y en las celulas F179 es de 0,32 nmol/min y 0,18 nmol/ml, respectivamente. La velocidad de formacion de 4-MU en las celulas hDT7 es de 0,83 nmol/ml.
La FIGURA 8 es una grafica espectrofotometrica de una repeticion de la Figura 9 usando unos ajustes del detector FL-Plus (Xex= 360 nm; Xem= 450 nm) que detectan la fluorescencia del 4-MU liberado. El experimento de control se representa por (o), que es MTL8-252 (10 pM) en PBS solo; (▲) representa MTL8-252 (10 pM) en PBS incubado con la lfnea celular hDT7 que expresa NQO1 (5x105 celulas/ml); (•) representa MTL8-252 (10 pM) en PBS incubado con la lfnea celular F179 sin expresion (5x105 celulas/ml). Se calculo la velocidad inicial de liberacion de 4-MU en las celulas hDT7 y F179 como 6,1 pM/min y 0,068 pM/min respectivamente. La velocidad de liberacion de 4-MU del experimento de control era de 0,002 pM/min.
La FIGURA 9 es una grafica espectrofotometrica que muestra la estabilidad de MTL8-252 en PBS (o); en medio con 10 % de suero fetal bovino (FBS) (•) y en medio sin FBS (□). MTL8-252 es muy estable en PBS y en medio sin FBS.
Las FIGURAS 10 y 11 son graficas que muestran la precision de un ensayo ejemplar. Se efectuo el ensayo en muestras duplicadas de celulas HDT7 productoras de NQO1 adicionadas a medio de cultivo (DMEM) (Figura 10) u orina (Figura 11). La Figura 10 muestra la precision de las determinaciones por triplicado de 1 x 105 o 5 x 105 celulas indicadas adicionadas a medio de cultivo. La Figura 11 muestra la precision de las medidas por duplicado de 106 celulas HDT7 adicionadas a orina. Las barras de error son de +1 EEM y los experimentos demuestran que las celulas pueden medirse en cualquiera de medio de cultivo u orina sin ningun efecto adverso sobre la precision.
Las FIGURAS 12 y 13 son graficas que muestran que podrfa usarse el ensayo ejemplar para ensayar en una serie de diferentes tipos de celulas la actividad de NQO1, a saber HDT7 y F179 (lfneas celulares productoras de NQO1 y genomanipuladas para produccion nula, respectivamente), las lfneas celulares de cancer de vejiga humanas EJ138 y RT112 y la lfnea celular de cancer de prostata humana PC3. Se usaron numeros similares de celulas en cada experimento para permitir la comparacion. NC representa un control negativo no celular.
La FIGURA 14 muestra que el ensayo ejemplar puede discriminar entre la actividad de NQO1 y NQO2. Las celulas de carcinoma de prostata (ejemplificadas por celulas PC3) expresan tanto la actividad de NQO1 como de NQO2. Sin embargo, esta ultima se activa solo por la presencia de un cosustrato no presente naturalmente en las celulas (EP- 0152R, 1-carbamoilmetil-3-carbamoil-1,4-dihidronicotinamida). Es conocido que, en ausencia de EP-152R, hNQO2 es inactiva. La Figura 14 muestra que hay un aumento de 1,2 veces en la formacion de 4-MU mediante la adicion de un cosustrato selectivo de hNQO2. Esta liberacion de 4-MU adicional indica que el ensayo, cuando se suplementa con cosustrato de hNQO2, puede usarse para detectar celulas tumorales que, adicionalmente o como alternativa, expresan la enzima hNQO2. En el primer caso, puede usarse el ensayo suplementado para proporcionar una senal de ensayo mas fuerte, y en el ultimo caso para detectar canceres que expresan hNQO2 solo.
Las FIGURAS 15 y 16 muestran la naturaleza cuantitativa del ensayo ejemplar. Se ensayaron 2,5 x 105, 1,25 x 105, 0,625 x 105 y 0,3125 x 105 celulas RT112 (Figura 15). Simultaneamente, se expusieron tambien las celulas a 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI), usando protocolos establecidos, para permitir la cuantificacion del numero total de celulas mediante la medida de la intensidad de fluorescencia celular de DAPI en el mismo fluorfmetro (Figura 16). Por tanto, la valoracion de los datos de las Figuras 15 y 16 posibilita determinar la cantidad de senal por celula y el numero de celulas en una muestra productora de dicha senal. Esto es particularmente ventajoso cuando se desea determinar la actividad de NQO1 o NQO2 “por celula”.
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Las FIGURAS 17 y 18 muestran los resultados de una version modificada del ensayo donde se mejoran la sensibilidad y/o especificidad mediante el enriquecimiento/aislamiento/purificacion de celulas antes del ensayo. La Figura 17 muestra la compatibilidad de la presente invencion con dichos procedimientos. Aquf, se aislaron muestras que contienen celulas cancerosas portadoras del antfgeno epitelial Ber-EP4 usando partfculas magnetizables (paramagneticas) recubiertas con anticuerpos de este antfgeno (Invitrogen, Dynal AS, Oslo, Noruega). Se obtuvo una suspension de complejos de partfcula/celula, que se proceso en el protocolo del ensayo ejemplar resenado en las Figuras 10-16. La Figura 17 muestra que la recuperacion de la actividad de NQO1 en celulas de cancer de vejiga RT112 es de aproximadamente un 60-70 % respecto a la actividad del numero total de celulas presentes (100 %, representado por la barra de 0 perlas de la figura) en un intervalo de densidades de partfcula (ilustrado por el volumen de la solucion madre de perlas del fabricante (4 x 106 partfculas/ml) anadido). La Figura 18 muestra resultados comparables para celulas HDT7 que expresan NQO1 pero no expresan el antfgeno Ber-EP4 humano. Los datos ilustran la capacidad de enriquecer especfficamente la poblacion de celulas epiteliales.
La FIGURA 19 muestra los resultados obtenidos cuando se uso el ensayo en muestras obtenidas de un entorno clfnico. Los resultados se expresan como la relacion de concentracion de 4-MU de las muestras a la del control de ensayo negativo y se correlaciona con el eventual diagnostico clfnico (carcinoma de celulas transicionales o no). El triangulo blanco representa una muestra que contiene cantidades significativas de desechos, sugiriendo que el uso de inmunoextraccion como se describe en la presente memoria con referencia a la Figura 17 serfa beneficioso para aumentar la especificidad. El cfrculo blanco representa una muestra de un paciente diagnosticado posteriormente con cancer de vejiga Ta de etapa muy temprana, y es probable que haya insuficientes celulas para un analisis fiable de esta muestra.
La TABLA 2 muestra los resultados de ensayo para pacientes ya diagnosticados con cancer de vejiga pero aun no tratados. Los resultados se expresan como la relacion de concentracion de 4-MU de las muestras a la del control de ensayo negativo. La muestra 89 de esta serie no pudo ensayarse debido a la presencia de hematuria macroscopica.
La TABLA 3 muestra los resultados del ensayo de NQOI para pacientes diagnosticados con carcinoma de prostata. Estas muestras se recogieron despues de examen rectal digital.
Se ilustra un tipo de formato de ensayo en la Figura 1. En la mitad superior de la figura, (12) representa una primera localizacion definida sobre una membrana (10) adecuada con la que se ha conectado una micropartfcula biotinilada (16; un resto “z”) detectable a traves de un resto de sustrato de NQO1 activo (14, "ensayo sensible a redox "). Por tanto, (14) y (16) comprenden conjuntamente un compuesto de Formula (I). En ausencia de NQO1 humana (hNQO1), la partfcula detectable (16) permanece inmovilizada en la primera localizacion definida (12) cuando se induce un flujo de fluido a traves de la membrana en la direccion de una segunda localizacion definida (18). Por tanto, no hay captura de micropartfculas biotiniladas por la avidina (20) inmovilizada en la segunda localizacion (18). En contraposicion, la mitad inferior de la figura ilustra el efecto de la escision anterior del resto sensible a redox (14) mediante la accion de hNQO1 en una muestra aplicada a la primera localizacion (12). En este caso, la posterior induccion del flujo de fluido a traves de la membrana da como resultado la migracion de las micropartfculas biotiniladas detectables (16) con posterior captura por los restos de avidina (20) inmovilizados en la segunda localizacion (18). La deteccion y/o cuantificacion de micropartfculas en las localizaciones primera (12) o segunda (18) definidas respecto a la otra localizacion respectiva es por tanto un indicador de la presencia o ausencia, o de la cantidad, de hNQO1 en la muestra aplicada a la primera localizacion (12) antes de la induccion del flujo de fluido.
La invencion se describira ahora con mas detalle con referencia a los ejemplos.
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Reactivos y condiciones: (i) acrilato apropiado, MeSO3H, 70-90 °C, 2-5 h; (ii) NBS, MeCN: H2O, 1,5-3 h, TA; (iii) DCC, DMAP, Z-XH, DCM, 16-24 h, TA
Parte experimental
Se obtuvieron los productos qufmicos y reactivos en Aldrich Chemical Co., Dorset RU, Lancaster Synthesis Ltd, Lancashire, RU y VWR International, Leicestershire, RU. Se obtuvieron los disolventes deuterados y el tetrametilsilano (TMS) en Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover EE.UU. Se expreso y purifico NQO1 por Morvus Technology Ltd. Se monitorizaron las reacciones usando cromatograffa en capa fina (TLC) sobre placas de gel de sflice 60-F254 revestidas de aluminio prerrecubiertas visualizadas por radiacion ultravioleta (UV) a 254 nm y 325 nm usando una lampara de luz mineral UV GL-58 o por tincion con solucion de permanganate de potasio (KMnO4). Se llevo a cabo la cromatograffa en columna usando gel de sflice de malla 100-125 de VWR International. Se registraron los espectros de resonancia magnetica nuclear (RMN) de 1H y 13C en los espectrometros de RMN Bruker Avance a 300 MHz o Varian a 400 MHz. Se resenan los desplazamientos qufmicos como 6 partes por millon (ppm) campo abajo de TMS para muestras procesadas en cloroformo deuterado (CDCh) o dimetilsulfoxido deuterado (DMSO-d6). Se asignaron los espectros de 13C con la ayuda de experimentos de aumento sin distorsion por transferencia de polarizacion (experimentos de DEPT). Se usaron las siguientes abreviaturas: s (singlete), d (doblete), dd (doblete doble), t (triplete) y m (multiplete). Valores de J medidos en Hz. Se registraron la ionizacion electronica (IE) e ionizacion qufmica positiva y negativa (IQ) en un espectrometro Micromass Trio 2000. Se registraron la ionizacion por electropulverizacion positiva y negativa (IEP) usando un espectrometro de ionizacion Micromass Tof Spec 2e. Se registraron los espectros de alta resolucion (EMAR) en un espectrometro Thermo Finnigan MAT95XP. Se registro la espectroscopia infrarroja usando el Jasco FT/IR-4100 running spectra manager. Se resenaron todos los picos en longitud de onda a cm-1. Se determinaron los puntos de fusion (PF) en tubos capilares de vidrio abiertos en un aparato GallenKamp MPD.350.BM2.5 y se dejaron sin corregir. Se registraron los espectros ultravioleta (UV) en un espectrometro Cary 100 UV procesado con software Cary Win UV usando cubetas de cuarzo de longitud de recorrido (2 lados opuestos esmerilados) de 1 cm de longitud de recorrido. Se registraron los espectros de fluorescencia para las reacciones enzimaticas en un fluorfmetro Cary Eclipse usando cubetas termostatizadas de cuarzo de 4 lados de 1 cm de longitud de recorrido. Se usaron valores de ranura de 2,5, 5 y 10 dependiendo de la intensidad generada, usandose una funcion de obturacion automatica para minimizar el fotoblanqueamiento. Se registraron los espectros de emision y excitacion de fluorescencia para reducciones qufmicas en cubetas de cuarzo termostatizadas de 4 lados usando un espectrofluorfmetro Shimadzu RF-5301PC. Se suministro la fuente de luz a traves de una bombilla de xenon de 150 W. Se procesaron los datos usando el software Shimadzu Rf-5301PC y el sistema ThermoFisher Accela U-HPLC (cromatograffa lfquida a presion ultraalta), y se consiguio la separacion usando una columna en fase inversa C18 (dimensiones: 50x2,1 mm; tamano de partfcula 1,9 micrometres). Se analizaron los datos usando un sistema de PDA (matriz de fotodiodos) y se procesaron usando el software ChromQuest (version 4.2). Se usaron todos los disolventes sin purificacion adicional. En las reacciones, se
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secaron las soluciones con MgSO4. Se evaporaron los disolventes a presion reducida. Se obtuvieron las partfculas magnetizables recubiertas con anticuerpos anti-Ber-EP4 en (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Noruega).
Abreviaturas: DCC es diciclohexilcarbodiimida; DMAP es 4-dimetilaminopiridina; DCM es diclorometano; DCE es dicloroetano; DMSO es dimetilsulfoxido y PBS es solucion salina tamponada con fosfato.
Ejemplo 1- Lactonas de formula general (IV), Y es O
A. 6-Hidroxi-4,4,5,7,8-pentametil-1-benzopiran-2-ona (Ri= R2= R3= R4= R5= Me)
Se anadieron 2,3,5-trimetil-1,4-hidroquinona (5,0 g, 32,9 mmol) y 3,3-dimetilacrilato de metilo (4,31 g, 4,94 ml, 37,8 mmol) a acido metanosulfonico (50 ml). Se agito la mezcla a 70 °C durante 3 horas, se inactivo entonces con H2O (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3x100 ml). Se lavo entonces la fase organica con H2O (100 ml), NaHCO3 acuoso saturado (100 ml) y salmuera saturada (100 ml). Se seco entonces la fase organica sobre MgSO4 y se condenso a vacfo, dando un solido. Se recristalizo el residuo con hexano-cloroformo (3:1), dando la lactona (5,4 g,
70,2 %) en forma de cristales incoloros. PF: 182-184 °C, bib. 186-187 °C (Borchardt y Cohen, 1972b). RMN-1H (CDCla): 6 4,73 (1H, s, OH), 2,55 (2H, s, CH2), 2,36 (3H, s, ArCH3), 2,22 (3H, s, ArCH3), 2,19 (3H, s, ArCH3), 1,45 (6H, s, 2xgem-CH3). RMN-13C (CDCl3): 6 169,3 (C=O), 148,7, 142,3, 127,6, 123,4, 120,9, 119,5 (6xArC), 45,7 (CH2), 34,6 (C(CH3)2), 27,5 (2x gem-CH3), 14,6, 12,4, 12,1 (3x ArCH3). EM: IQ 235, (M+1)+ 33 %; IE 234, (M)+ 100 %.
B. 6-Hidroxi-4,4,7,8-tetrametil-1-benzopiran-2-ona (R1= R2= R= R5= Me; R3= H)
Se anadieron 2,3-dimetil-1,4-hidroquinona (5,03 g, 36,2 mmol) y 3,3-dimetilacrilato de metilo (5,68 ml, 4,96 g, 43,5 mmol) a acido metanosulfonico (50 ml). Se agito la mezcla a 90 °C durante 5 horas, se inactivo entonces con H2O (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3x200 ml). Se lavo entonces la fase organica con agua (100 ml), NaHCO3 saturado (100 ml) y salmuera saturada (100 ml). Se seco entonces la fase organica sobre MgSO4 y se condenso a vacfo. Se recristalizo el residuo con hexano-cloroformo (3:1), dando la lactona en forma de cristales incoloros (3,40 g, 42,7 %). PF: 145-147 °C, bib.: 146-148 °C (Yenes y Messeguer, 1999). RMN-1H (CDCl3): 6 6,63 (1H, s, ArH), 5,21 (1H, s, OH), 2,58 (2H, s, CH2), 2,23 (3H, s, CH3), 2,16 (3H, s, CH3), 1,30 (6H, s, 2x gem-CH3); RMN-13C (CDCl3): 6 169,4 (C=O), 150,3, 142,6, 126,5, 126,3, 122,7, 107,8 (6xArC), 43,6 (CH2), 33,1 (C(CH3)2), 27,6 (2x gem-CH3), 12,3,
12,0 (2x ArCH3); EM: IQ 221, (M+1)+ 44,7 %; IE 220, (M)+ 100 %.
C. 6-Hidroxi-5,7,8-trimetil-1-benzopiran-2-ona (R1= R2= R3= Me; R4= R5= H)
Se anadieron 2,3,6,-trimetilhidroquinona (5 g, 32,9 mmol) y 3-3-dimetilacrilato de metilo (3,39 g, 3,55 ml, 39,5 mmol) a acido metanosulfonico (50 ml). Se agito la mezcla a 90 °C durante 2 horas, se inactivo entonces con H2O (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3x200 ml). Se lavo entonces la fase organica con H2O (100 ml), NaHCO3 acuoso saturado (100 ml) y salmuera acuosa saturada (100 ml). Se seco la fase organica sobre MgSO4 y se condenso a vacfo. Se recristalizo el residuo con hexano-cloroformo (3:1), dando la lactona (4,21 g, 62,1 %) en forma de cristales incoloros. PF: 169-171 °C. RMN-1H (CDCl3): 6 4,65 (1H, s, OH), 2,91 (2H, t, CH2, J= 7,2), 2,71 (2H, t, CH2, J= 7,4), 2,21 (3H, s, CH3), 2,19 (3H, s, CH3), 2,18 (3H, s, CH3); RMN-13C (CDCl3): 6 169,5 (C=O), 148,2, 144,2, 122,9, 121,8,
119.3, 118,0, (6xCAr), 29,1 (3CH2), 21,3 (4CH2), 12,2, 12,1, 11,8 (3xArCH3); IQ 207, (M+1)+ 25 %; IE 206, (M)+ 100 %.
Ejemplo 2- Acidos quinonicos de formula general (II), Y es O
A. Acido 3-(3’,6’-dioxo-2’,4’,5’-trimetilciclohexa-1’,4’-dieno)-3,3-dimetilpropanoico (R= R2= R3= R4= R5= Me)
Se suspendio 6-hidroxi-4,4,5,7,8-pentametil-1-benzopiran-2-ona (3,7 g, 15,8 mmol) en acetonitrilo (ac., 15 % v/v, 200 ml). Se anadio gota a gota una solucion de NBS (3,8 g, 21,3 mmol) en acetonitrilo (ac., 40 % v/v, 60 ml) durante un periodo de 1 hora a la suspension. Se agito la mezcla durante 30 minutos adicionales, se diluyo entonces con H2O (330 ml) y se extrajo con dietileter (3x75 ml). Se lavo la fase organica combinada con H2O (2x100 ml) y salmuera (100 ml), se seco sobre MgSO4 y se condenso entonces por bombeo, dando un solido. Se recristalizo el solido con acetato de etilo, procurando los acidos quinonicos en forma de cristales amarillos (1,9 g, 48,1 %). PF: 97-99 °C, bib.: 101-103 °C (Borchardt y Cohen, 1973c). RMN-1H (CDCl3): 6 11,04 (1H, s a, OH), 3,06 (2H, s, CH2), 2,10 (3H, s, ArCH3), 1,95 (6H, s, 2x CH3), 1,43 (6H, s, 2x gem-CH3); RMN-13C (CDCl3): 6 190,9, 187,4 (2x C=O de quinona),178,9 (COOH), 152,0, 143,0, 139,0, 138,4 (4x C de anillo), 47,3 (CH2), 37,9 (C(CH3)2), 28,8 (2x gem-CH3),
14.3, 12,5, 12,1 (3x ArCH3); EM: IQ 251, (M+1)+ 100 %; IE 250, (M)+ 5 %.
B. Acido 3-(3’,6’-dioxo-,4’,5’-dimetilciclohexa-1’,4’-dieno)-3,3-dimetilpropanoico (R1= R2= R4= R5= Me, R3= H)
Se suspendio 6-hidroxi-4,4,7,8-tetrametil-1-benzopiran-2-ona (2,0 g, 9,1 mmol) en acetonitrilo (ac., 15 %, 110 ml). Se anadio gota a gota una solucion de NBS (2,18 g, 12,3 mmol) en acetonitrilo (ac., 40 %, 35 ml) durante 1 hora a la
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suspension de lactona agitada. Se agito la mezcla durante 2 horas adicionales, se diluyo entonces con H2O (180 ml) y se extrajo con dietileter (3x45 ml). Se lavaron los extractos organicos combinados con H2O (120 ml) y salmuera saturada (100 ml) y se secaron sobre MgSO4. Se evaporo la solucion organica amarilla hasta sequedad y se recristalizo con acetato de etilo, produciendo el acido quinonico en forma de cristales amarillos (1,3 g, 60,5 %) PF: 92-94 °C. RMN-1H (CDCh): 6 10,37 (1H, s a, OH), 6,53 (1H, s, 2-H), 2,94 (2H, s, CH2), 2,00 (6H, s, 2XCH3), 1,32 (6H, s, 2x gem-CHa); RMN-13C (CDCla): 6 187,9, 187,5 (C=O de quinona), 177,3 (COOH), 152,9, 142,4, 139,7, 132,2 (4x C de anillo), 44,8 (CH2), 36,8 (C(CH3)2), 28,1 (2x gem-CHs), 12,6, 11,9 (2xAr-CH3). EM: IQ 237, (M+1)+ 22,4 %, 254 (M+NH4) 100 %; IE 237, (M+1)+ 55,3 %.
C. Acido 3-(3’,6’-dioxo-2’,4’,5’-trimetilciclohexa-1’,4’-dieno)propanoico (Ri= R2= R3= Me; R4= R5= H)
Se suspendio la lactona apropiada (1,5 g, 7,3 mmol) en acetonitrilo (ac., 15 %, 90 ml). Se anadio gota a gota una solucion de NBS (1,72g, 9,83 mmol) en acetonitrilo (ac., 40 %, 30 ml) durante 1 hora a la suspension de lactona agitada. Se agito la mezcla durante 1 hora adicional, se diluyo entonces con H2O (220 ml) y se extrajo con dietileter (3x75 ml). Se lavaron los extractos organicos combinados con H2O (150 ml), se secaron sobre MgSO4, se condensaron a vacfo y se recristalizaron con acetato de etilo, produciendo el acido quinonico en forma de un compuesto amarillo (1,19 g, 73,5 %). PF: 113-115 °C. RMN-1H (CDCh): 6 11,00 (1H, a, OH), 2,82 (2H, t, CH2, J= 7,7), 2,52 (2H, t, CH2, J= 7,7), 2,11 (3H, s, CH3), 2,02 (6H, s, 2xCH3); RMN-13C (CDCh): 6 187,5, 186,9 (C=O de quinona), 178,5 (COOH), 141,8, 141,6, 140,8, 140,6 (4x C de anillo), 32,6 (2CH2), 22,1 (3CH2), 12,4, 12,3, 12,3 (3xAr-CH3). EM: IQ 223, (M+1)+ 100 %; IE 222, (M)+ 19,7 %.
Ejemplo 3- Sustratos fluorigenicos de formula general (I), Y es O
A. 3-Metil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)butanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1= R2= R3= R4= R5= Me)(Compuesto A)
Se suspendio en DCM seco (10 ml) una mezcla de acido 3-(3',6'-dioxo-2',4',5'-trimetilciclohexa-1',4'-dieno)-3,3- dimetilpropanoico (400 mg, 1,7 mmol), DCC (415 mg, 2,0 mmol) y DMAP (21 mg, 0,2 mmol). Se agito la suspension durante 30 minutos. Se anadio 7-hidroxicumarina (317 mg, 2,0 mmol) y se agito la mezcla durante 24 horas adicionales. Se filtro la suspension resultante y se evaporo el filtrado. Se filtro la suspension formada, se evaporo, se redisolvio en acetato de etilo y se filtro. Se purifico el extracto organico por cromatograffa en columna (1:3, acetato de etilo-hexano), procurando el producto: 330 mg (50,0 %) en forma de un solido amarillo. PF: 128-130 °C. RMN-1H (CDCl3): 6 7,68 (1H, d, ArH, J= 9,6), 7,46 (1H, d, ArH, J= 8,4), 7,02 (1H, d, ArH, J= 2,1), 6,94 (1H, d, d, ArH, J= 2,1), 6,39 (1H, d, ArH, J= 9,6), 3,29 (2H, s, CH2), 2,19 (3H, s, CH3), 1,94 (6H, s, 2xCHb), 1,53 (6H, s, 2x gem-CH3). RMN- 13C (CDCfj): 6 190,8, 187,3 (2x C=O de quinona), 170,8 (C=OO), 160,3 (C=O de cumarina), 154,7, 152,9, 151,4, 142,8, 142,7, 139,5, 138,9, 128,6, 118,3, 116,7, 116,2, 110,4 (12x C de anillo), 47,7 (CH2), 39,0 (C(CH3)2), 29,9 (2x gem-CH3), 14,5, 12,7, 12,2 (3xCH3). EM: ES+ve 417,1 (M+Na) 100 %.
B. 3-(4,5-Dimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)-3-metilbutanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1= R2= R4= R5= Me; R3= H)(Compuesto B)
Se anadieron DCC (4,18 mg, 2,0 mmol) y DMAP (21 mg, 0,2 mmol) a una suspension de acido 3-(3',6'-dioxo-4',5'- dimetilciclohexa-1',4'-dieno)-3,3-dimetilpropanoico (400 mg, 1,7 mmol) en DCM seco (10 ml). Se agito la mezcla durante 30 minutos y se anadio entonces 7-hidroxicumarina (329 mg, 2,0 mmol). Se agito entonces la mezcla durante 16 horas. Se filtro la mezcla resultante y se condenso a vacfo. Se disolvio el solido resultante en acetato de etilo y se filtro. Se condenso el filtrado, se redisolvio en acetato de etilo y se filtro, se redujo de nuevo el filtrado resultante a vacfo y se purifico por cromatograffa en columna (acetato de etilo-hexano 1:3), produciendo el producto en forma de un solido amarillo, 285 mg (44,4 %). PF: 108-110 °C. RMN-1H (CDCfj): 6 7,66 (1H, d, ArH, J= 9,6), 7,44 (1H, d, ArH, J= 8,4), 7,00 (1H, d, ArH, J= 1,8), 6,93 (1H, d, d, ArH, J= 2,1, 2,1), 6,59 (1H, s, ArH), 6,38 (1H, d, ArH, J= 9,6), 3,22 (2H, s, CH2), 2,02 (3H, s, CH3), 1,94 (3H, s, CH3), 1,42 (6H, s, 2xgem-CH3). RMN-C (CDCh): 6 188,0
187.0 (2xC=O), 170,1 (C=OO), 160,7 (C=O de cumarina), 154,9, 153,2, 153,1, 143,3, 142,7, 140,3, 132,6, 129,0, 118,7, 117,1, 116,4, 110,7 (12x C de anillo), 45,4 (CH2), 37,7 (C(CH3)2), (2x gem-CH3), 13,0, 12,3 (2xCH3). EM: ES+
403.1 (M+Na).
C. 3-(2,4,5-Trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)propanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1= R2= R3= Me; R4= R5= H)(Compuesto C)
Se anadio acido 3-(3',6'-dioxo-2',4',5'-trimetilciclohexa-1',4'-dieno)propanoico (500 mg, 2,3 mmol) a una solucion de DCC (557 mg, 2,7 mmol) y DMAP (27 mg, 0,2 mmol) en DCM seco (10 ml) y se agito la suspension durante 30 minutos. Se anadio a la mezcla 7-hidroxicumarina (437 mg, 27 mmol) y se continuo la agitacion durante 16 horas a temperatura ambiente. Se filtro la mezcla resultante y se condenso a vacfo. Se disolvio el solido resultante en acetato de etilo y se filtro. Se condenso el filtrado, se redisolvio en acetato de etilo y se filtro. Se redujo de nuevo el filtrado resultante a vacfo y se purifico por cromatograffa en columna (eluyendo con acetato de etilo:hexano 1:3), produciendo el producto en forma de un solido amarillo, 285 mg (34,6 % de rendimiento). RMN-1H (CDCh): 6 7,69 (1H, d, ArH J= 9,6), 7,49 (1H, d, ArH J= 8,4), 7,13 (1H, d, ArH J= 2,1), 7,06, 7,04 (1H, d, d, ArH J= 2,1), 6,40 (1H, d,
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ArH J= 9,6), 2,94 (2H, t, CH2 J= 7,5), 2,76 (2H, t, CH2 J= 7,5), 2,11 (3H, s, CH3), 2,03 (3H, s, CH3).
D. 3-Metil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)butanoato de 4-metil-2-oxo-2H-cromen-7-ilo (Ri=
R2= R3= R4= R5= Me) [MTL8-252]; (Compuesto D)
Se suspendio en DCE seco (20 ml) una mezcla de acido 3-(3',6'-dioxo-2',4',5'-trimetilciclohexa-1',4'-dieno)-3,3- dimetilpropanoico (800 mg, 3,4 mmol), DCC (830 mg, 4,0 mmol) y DMAP (42 mg, 0,4 mmol). Se agito la suspension durante 30 minutos. Se anadio 4-metilumbeliferona (634 mg, 3,6 mmol) y se agito la mezcla durante 24 horas adicionales. Se filtro la suspension resultante y se evaporo el filtrado. Se filtro la suspension formada, se evaporo, se redisolvio en acetato de etilo y se filtro. Se evaporo el extracto organico y se recristalizo con acetato de etilo, procurando el producto en forma de cristales amarillos (0,96 g, 69 %). RMN-1H (CDCh): 5 7,58 (1H, d, ArH, J= 5 Hz),
7,02 (1H, d, ArH, J= 3 Hz), 6,98 (1H, d, ArH, J= 3 Hz), 6,96 (1H, d, ArH, J= 3 Hz), 3,29 (2H, s, CH2), 2,41 (3H, s, CH3), 2,18 (3H, s, CH3), 1,94 (3H, s, CH3), 1,53 (6H, s, 2XCH3). RMN-13C (CDCl3): 5 190,8, 187,3 (2x C=O de quinona), 170,8 (C=OO), 160,4 (C=O de cumarina), 154,1, 152,8, 151,8, 151,5, 142,7, 139,7, 138,8, 125,4, 117,9, 117,8, 114,6, 110,4 (12x C de anillo), 47,7 (CH2), 38,4 (C(CH3)2), 29,0 (2x gem-CH3), 18,7 (CH3), 14,4, 126, 12,1 (3xCH3).
Se sintetizaron los siguientes sustratos de amido como modelos de los compuestos de formula general (I), en que X es NR8.
Ejemplo 4. Sustratos de amido
A. N-Metil-N-fenil-[3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)-3-metil]butanamida
Se anadieron DCC (371 mg, 1,8 mmol) y DMAP (22 mg, 0,2 mmol) en DCM seco (10 ml) al acido quinonico apropiado (400 mg, 1,6 mmol). Se agito la mezcla durante 30 min y despues de dicho tiempo se anadio N- metilanilina (192,6 mg, 1,8 mmol). Se agito entonces la mezcla durante 16 horas. Se filtro la suspension resultante y se lavo con HCl (ac., 0,1 M, 5 ml), se redujo a vacfo y se purifico por cromatograffa en columna (eluyendo con acetato de etilo:hexano 3:1), produciendo un solido amarillo del producto: 390 mg (71,9 %). PF: 92-94 °C. RMN-1H (CDCl3): 5 7,45 (2H, t, meta H, J= 6,9), 7,36 (1H, t, para H J= 6,8), 7,20 (2H, d, orto H J= 7,2), 3,17 (3H, s, NCH3), 2,75 (2H, s, CH2), 2,10 (3H, s, CH3), 2,01 (3H, s, CH3), 1,97 (3H, s, CH3), 1,30 (6H, s, 2xgem-CH3). RMN-13C (CDCl3): 5 191,2 (C=O de quinona), 187,7 (C=O de quinona), 172,1 (C=O), 154,8, 144,0, 143,6, 137,7, 136,2 (5x C de anillo), 129,8 (meta C), 127,8 (para C), 127,5 (orto C), 47,6 (CH2), 38,0 (C(CH3)2), 37,1 (NCH3), 28,4 (2x gem- CH3), 14,1, 12,7, 12,1 (3x CH3). EM: ES+ 362,2 (M+Na).
B. N-Metil-N-fenil-[3-(4,5-dimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)-3-metil]butanamida
Se anadio acido 3-(3',6'-dioxo-4',5'-dimetilciclohexa-1',4'-dieno)-3,3-dimetilpropanoico (400 mg, 1,69 mmol) a una solucion de DCC (371 mg, 1,80 mmol) y DMAP (22 mg, 0,180 mmol) en 10 ml de dCm seco. Se agito la mezcla durante 30 minutos y despues de dicho tiempo se anadio N-metilanilina (181,8 mg, 1,80 mmol). Se agito entonces la mezcla durante 16 horas. Se filtro la mezcla, se lavo con HCl (ac., 0,1 M, 5 ml), se redujo a vacfo y se purifico por cromatograffa en columna (eluyendo con acetato de etilo:hexano 3:1), dando un solido amarillo del producto, 330 mg (60,4 %). PF: 110-112 °C. RMN-1H (CDCfj): 5 7,44 (2H, t, meta H J= 7,4), 7,36 (1H, t, para H J= 7,2), 7,16 (2H, d, meta H J= 7,5), 6,49 (1H, s, ArH de quinona), 3,16 (3H, s, NCH3), 2,02 (3H, s, CH3), 1,99 (3H, s, CH3), 1,16 (6H, s, 2x gem-CH3). RMN-C (CDCh): 5 188,2 (C=O de quinona), 188,0 (C=O de quinona), 171,3 (C=O), 155,5, 144,1,
142,3, 139,6, 130,4 (5x C de anillo), 129,8 (2x meta C), 127,8 (para C), 127,5 (2x orto C), 44,4 (CH2), 37,4 (C(CH3)2),
37,2 (NCH3), 28,5 (2x gem-CH3), 12,7, 11,9 (2x CH3 de quinona). ES: ES+ 348,1 (M+Na).
C. N-Metil-N-fenil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)propanamida (R1= R2= R3= Me; R4= R5= H)
Se anadieron DCC (371 mg, 1,8 mmol) y DMAP (22 mg, 0,2 mmol) en DCM seco (10 ml) al acido quinonico (64) apropiado (400 mg, 1,8 mmol) y se agito durante 30 minutos. Se anadio a la mezcla agitada N-metilanilina (192,6 mg, 1,8 mmol). Se agito entonces la mezcla durante 16 horas. Se filtro la mezcla resultante, se lavo con HCl (ac., 0,1 M, 5 ml), se redujo a vacfo y se purifico por cromatograffa en columna (eluyendo con acetato de etilo:hexano 3:1), produciendo un solido amarillo del producto: 285 mg (50,9 %). PF: 69-71 °C. RMN-1H (CDCh): 5 7,40 (2H, t, meta H J= 7,4), 7,32 (1H, t, para H J= 7,2), 7,17 (2H, d, orto H J= 7,5), 3,26 (3H, s, NCH3), 2,75 (2H, t, CH2 J= 7,8), 2,19 (2H, t, CH2 J= 7,8) 2,00 (3H, s, 2xCH3), 1,94 (3H, s, CH3). RMN-13C (CDCh): 5 187,6 (C=O de quinona), 186,8 (C=O de quinona), 171,7 (C=O), 143,8, 142,9, 141,0, 140,4 (5x C de anillo), 129,8 (2x meta C), 127,9 (para C), 127,3 (2x orto C), 37,4 (NCH3), 32,8, 23,0 (2xCH2), 12,4, 12,3, 12,1 (3xCH3). EM: ES+ 334,2 (M+Na).
D. N-Fenil-[3-metil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)]butanamida (R1= R2= R3= R4= R5= Me)
Se anadieron DCC (371 mg, 1,8 mmol) y DMAP (22 mg, 0,2 mmol) en 10 ml de DCM seco al acido quinonico apropiado (400 mg, 1,6 mmol) y se agito durante 30 minutos. Se anadio a la mezcla agitada anilina (148,8 mg, 1,6
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E. N-Fenil-[3-(4,5-dimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)-3-metil]butanamida (Ri= R2= R4= R5= Me; R3= H)
Se anadieron DCC (371 mg, 1,80 mmol) y DMAP (22 mg, 0,180 mmol) en DCM seco (10 ml) al acido quinonico apropiado (400 mg, 1,69 mmol) y se agito durante 30 minutos. Se anadio a la mezcla agitada anilina (157,2 mg, 1,69 mmol). Se agito entonces la mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente. Se filtro la mezcla resultante, se lavo con HCl (ac., 0,1 M, 2 ml) se redujo a vado y se purifico por cromatograffa en columna (eluyendo con acetato de etilo:hexano 3:1), produciendo un solido amarillo (86), 390 mg (73,9 %). PF: 131-133 °C. rMn-1H (CDCh): 5 7,37 (2H, d, orto H J= 7,5), 7,27 (2H, t, meta H, J= 7,8), 7,07 (2H, t, para H, J= 7,4), 7,05 (NH, intercambio de D2O), 6,60 (1H, s, H de quinona), 2,94 (2H, s, CH2), 2,02 (3H, s, CH3), 2,00 (3H, s, CH3), 1,38 (6H, s, 2xgemCH3). RMN-C (CDCl3): 5 188,4 (C=O de carbonilo de quinona), 187,9 (C=O de carbonilo de quinona), 169,1 (C=O de carbonilo de amida), 153,5 (C de quinona), 142,3 (C de quinona), 140,0 (C de quinona), 137,4 (ipso C de anilina), 132,0 (C de quinona), 129,0 (meta C), 124,4 (para C), 119,8 (orto C), 48,3 (CH2), 37,6 (C(CH3)2), 28,5 (2xgemCH3), 12,6 (CH3 de quinona), 11,9 (CH3 de quinona). EM: eS+ 334,1 (M+Na).
F. N-Fenil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)propanamida (R1= R2= R3= Me; R4= R5= H)
Se anadieron DCC (371 mg, 1,80 mmol) y DMAP (22 mg, 0,180 mmol) en DCM seco (10 ml) al acido quinonico apropiado (400 mg, 1,80 mmol) y se agito durante 30 minutos. Se anadio a la mezcla agitada anilina (167,4 mg, 1,80 mmol). Se agito entonces la mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente. Se filtro la mezcla resultante, se lavo con HCl (ac., 0,1 M, 2 ml), se redujo a vado y se purifico por cromatograffa en columna (eluyendo con acetato de etilo:hexano 3:1), produciendo un solido amarillo del producto, 360 mg (67,2 %). PF: 135-137 °C. RMN-1H (CDCh): 5 8,09 (1H, s, NH), 7,51 (2H, d, orto H J= 7,8), 7,30 (2H, t, meta H J= 8,0), 7,08 (1H, t, para H J= 7,4), 2,89 (2H, t, CH2 J= 7,7), 2,50 (2H, t, CH2, J= 7,8), 2,08 (3H, s, CH3), 2,00 (6H, s, 2xCH3). RMN-13C (CDCl3): 5 187,4, 187,4 (2x C=O de quinona), 170,0 (C=O), 142,2, 141,7, 141,0, 140,4, 137,8 (5x C de anillo), 129,0 (meta C), 124,3 (para C), 119,8 (orto C), 36,2 (CH2), 23,0 (CH2), 12,5, 12,3 (3xCH3). EM: ES+ 320,2 (M+Na) 100 %.
Ejemplo 5- Solubilidad y pureza
Solubilidad en NMP: Se preparo una solucion del producto del Ejemplo 3D (MTL8-252) en NMP y se diluyo adicionalmente a 0,1 M en NMP. Se valoro la pureza del compuesto mediante UPLC usando un gradiente de acetonitrilo de 1-99 %. Se usaron volumenes de inyeccion de 0,5 pl, 1 pl, 2 pl, 3 pl y 5 pl. Se determino que la pureza era de casi 100 % basandose en los datos de UV a 265 nm. Los ajustes de FL Plus eran (alto voltaje de PMT, Xex 410 nm y Xem 550 nm, fuera del pico). Se detecto un solo pico con un tiempo de retencion de aprox. 4,3 min. El MTL8-252 era igualmente muy soluble en DMSO.
Las soluciones madre acuosas de NMP y DMSO en tampon fosfato de sodio 10 mM, pH 10, dieron como resultado una solucion ligeramente turbia que no sedimentaba cuando se centrifugaba a 13.000 rpm en una microcentfffuga de mesa. Sin embargo, el area de pico de la senal de UV HPLC no pareda haber sido alterada (en comparacion con la de la muestra diluida en NMP). La filtracion usando una membrana de 0,2 micrometros dio como resultado una solucion transparente, pero no se detecto pico por HPLC, sugiriendo que el material se retema en el filtro de nailon. Se obtuvo un resultado similar para la solucion madre de DMSO diluida. Experimentos posteriores utilizaron la solucion madre diluida a 0,1 M en tampon fosfato 10 mM, pH 7,0, e inyectada directamente en la columna de UPLC.
Ejemplo 6- Estabilidad de MTL8-252 en NMP y tampon de fosfato de sodio
Se valoro la estabilidad de MTL8-252 0,1 M en NMP durante un periodo de 2 horas a 37 °C. El compuesto pareda estable, como se demuestra por el hecho de que el area del pico de absorbancia UV permaneciera sustancialmente inalterado. No se observo liberacion detectable de 4-metilumbeliferona (4-MU). Se llevo a cabo un experimento similar con solucion madre de DMSO diluida en tampon fosfato de sodio 10 mM. El resultado (vease la Figura 2) muestra que MTL8-252 es significativamente estable durante al menos 1 h.
Ejemplo 7- Evaluacion de la actividad de MTL8-252 con NQOI humana
Se llevo a cabo la HPLC inicial en muestras que contienen MTL8-252 (0,1 mM), NADH (0,5 mM) y hNQO1 0,5 pg/ml en tampon fosfato (10 mM, pH 7) usando un gradiente de acetonitrilo de 1-99 % y un volumen de inyeccion de pl. Se
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mantuvo la temperatura a 37 °C. Se muestran los resultados en la Tabla 1 siguiente. Taba 1- Datos de resumen (velocidades iniciales)
Velocidad de disminucion de la concentracion de MTL8-252 (pM/min) (n= 4)
Velocidad de formacion de 4-MU (pM/min) por FL (n= 2) Velocidad de formacion de 4-MU (pM/min) a 210 nm (n= 2) Velocidad de formacion de lactona (pM/min) (n= 2)
5,9, 6,12, 8,41, 9,05
13,51,6,90 11,48, 6,0 9,84, 7,61
La reduccion del compuesto original fue rapida, ya que la mayorfa habfa desaparecido para la segunda inyeccion. Se encontro que una concentracion enzimatica de 0,2 pg/ml de hNQOI era adecuada para determinar la velocidad inicial de reduccion de MTL8-252. No se observo una reduccion significativa del area del pico en presencia de MTL8- 252 solo o de NADH solo (vease la Figura 3). Se calculo la velocidad de reduccion de la concentracion de MTL8-252 como 5,9 pM/min, y cuando se dividio entre dos la concentracion de la enzima, se redujo la velocidad a 1,5 pM/min.
Este hallazgo demuestra que MTL8-252 es un sustrato de hNQO1. Hubo un aumento del area de pico de 4-MU cuando se monitorizaba a 325 nm que coincidfa con la perdida de sustrato. Se confirmo esto por un aumento del pico de fluorescencia de 4-MU. La presencia de NADH no interferfa con los espectros de FL.
Se fijo el punto de corte de los datos de UV inicialmente a entre 220-800 nm, y cuando se redujo la longitud de onda menor a 180 nm, la lactona, 4-MU y MTL8-252 eran bastante evidentes a pesar de la minima interferencia de ruido de fondo.
Al alterar los ajustes del detector FL Plus (bajo voltaje de PMT, Xex 410 nm, Xem 550 nm) y calibrar para las medidas de 4-Mu estableciendo una grafica de calibracion, puede verse que habfa una respuesta lineal a 4-MU hasta al menos 200 pM. La concentracion maxima usada en los experimentos de incubacion es de 100 pM final.
Despues de la calibracion del instrumento, se llevo a cabo un experimento repetido de activacion de MTL8-252 por hNQO1, dando como resultado las velocidades de perdida de MTL8-252 y formacion de 4-MU calculadas (vease la Figura 4). La velocidad de perdida de MTL8-252 era de 8,41 pM/min y la correspondiente a la formacion de 4-MU determinada por fluorescencia era de 13,51 pM/min.
Las nuevas graficas de los datos de UV a 210 nm mostraron velocidades iniciales de formacion de 4-MU y lactona que eran de 11,48 pM/min y 9,84 pM/min, respectivamente (vease la Figura 5).
Ejemplo 8- Actividad de 4-MU y lactona con hNQO1
Se efectuo este experimento para asegurar que los productos de activacion no se metabolizaban adicionalmente por hNQO1. Se llevo a cabo la HPLC en muestras que contenfan 4-MU y lactona (0,1 mM), NADH (0,5 mM) y hNQO1 (0,2 pg) en tampon fosfato (10 mM, pH 7) usando un gradiente de acetonitrilo de 1-99 % y un volumen de inyeccion de 2 pl. Se mantuvo la temperatura a 37 °C. Los resultados muestran que ambos subproductos liberados despues de la activacion de MTL8-252 no eran sustratos de hNQO1 (vease la Figura 6).
Ejemplo 9- Incubacion de MTL8-252 con celulas cultivadas in vitro
A. Determinacidn espectrofotometrica de la luminiscencia
Se cultivaron celulas que expresan NQO1 humanas (HDT7) y celulas que sin expresion (F179) en medio MEM de Eagle enriquecido con aminoacidos no esenciales y 10 % de FBS. Se recolectaron las celulas en fase de crecimiento exponencial y se suspendieron en PBS frio a 5x106 celulas/ml. Se anadieron 100 pl de suspension celular (5x105 celulas) a 3 ml de PBS que contiene MTL8-252 10 pM a 37 °C en una cubeta de fluorfmetro y se midio durante 3 minutos la velocidad de aumento de la intensidad de fluorescencia (atribuida a la liberacion de 4-MU). El experimento de control contenfa sustrato solo en PBS. Los ajustes del espectrofotometro de luminiscencia fueron los siguientes: Xex= 360 nm; Xem= 452 a 37 °C.
La Figura 7 muestra un aumento significativo de la velocidad de formacion de 4-MU (al menos 5 veces) despues de la incubacion con celulas que expresan hNQO1 (HDT7) en comparacion con las celulas sin expresion (F179). Habfa una indicacion de un brote inicial de actividad pero, debido a la baja sensibilidad del instrumento, esto no pudo verificarse.
Sin embargo, se repitio el experimento con un detector FL-Plus mas sensible ligado a una UPLC.
B. Separacion por UPLC seguida de deteccion por FL-Plus
Se recolectaron las celulas en fase de crecimiento exponencial y se resuspendieron en PBS frio a 5x106 celulas/ml.
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Se anadieron 100 pi de suspension celular (5x105 celulas) a 1 ml de PBS que contiene MTL8-252 10 pM a 37 °C y se incubo durante los siguientes periodos de tiempo: 0, 5, 30 y 60 min. Se detuvo la reaccion centrifugando las celulas a 13.000 rpm durante 30 segundos y se inyecto el extracto libre de celulas (2 pl) directamente en la UPLC. Se consiguio la separacion de metabolitos usando una columna Whatman Partisil C18 (S/N n° 4SF03177) con un gradiente de MeCN 1-99 % durante 10 min a un caudal de 1 ml/min. Los ajustes del detector FL-Plus fueron los siguientes: PMT (bajo), Xex= 360 nm; Xem = 450 nm. La Figura 8 siguiente muestra la velocidad de formacion de 4- MU por celulas que expresan hNQO1. Las medidas iniciales de velocidad sugieren un aumento de aproximadamente 100 veces de la actividad frente a las celulas sin expresion. Hay tambien confirmacion de un brote inicial de actividad como se sugiere en el experimento espectrofotometrico de luminiscencia.
El reemplazo de PBS por medio de cultivo celular sugiere que otros componentes del medio pueden reducir MTL8- 252, Figura 9 siguiente. La posible fuente es el FBS anadido al medio.
Ejemplo 10- Protocolo tfpico para incubacion de MTL8-252 con celulas cultivadas in vitro
Se adopto el siguiente procedimiento general para los resultados mostrados en las Figuras 10-19. Se preparo una solucion 1 mM de sustrato fluorigenico en DMSO. Se centrifugaron a 1200 rpm muestras de orina o muestras de tampon (tfpicamente 5-20 ml como se especifica en un experimento dado) que contienen celulas para sedimentar las celulas. Se retiro el sobrenadante y se lavo el sedimento con 10 ml de PBS o medio de cultivo como se prescriba para un experimento dado. Se resuspendio el sedimento celular en el tampon/medio deseado (1 ml) y se anadieron 10 pl de solucion de sustrato con mezclado. Despues de incubar a 37 °C durante el periodo de tiempo deseado (tfpicamente 3 minutos), se paso la mezcla a traves de un filtro de jeringuilla de 0,45 pm y se mantuvo el filtrado en hielo hasta que se analizo por fluorimetrfa (100 pl, 380 nm ex/480 nm em) o HPLC (UPLC) (2 pl). Se expresa la actividad de NQO1 como concentracion del producto (4-MU) producido. Ciertos medios exhibieron una fluorescencia de fondo mayor que otros.
Ejemplo 11- Precision del ensayo
Se efectuo el procedimiento estandar anterior en muestras por duplicado de celulas HDT7 productoras de NQO1 anadidas a medio de cultivo u orina. La Figura 10 muestra la precision de determinaciones por triplicado del numero especificado de celulas anadidas al medio de cultivo. La Figura 11 muestra la precision de las medidas por duplicado de celulas HDT7 (106 celulas) anadidas a orina. Las barras de error y EEM del experimento demuestran que las celulas pueden medirse en medio de cultivo u orina sin ningun efecto adverso sobre la precision.
Se uso tambien el procedimiento para ensayar en diversos tipos celulares la actividad de NQO1, a saber HDT7 y F179 (lfneas celulares productora de NQO1 y genomanipulada sin produccion, respectivamente), las lfneas celulares de cancer de vejiga humanas EJ138 y RT112 y la lfnea celular de cancer de prostata humana PC3. Se muestran los resultados en las Figuras 12 y 13. Se usaron numeros similares de celulas en cada experimento para permitir la comparacion. NC representa un control negativo no celular.
Ejemplo 13- Discriminacion entre la actividad de NQO1 y NQO2
Las celulas de carcinoma de prostata (ejemplificadas por celulas PC3) expresan tanto la actividad de NQO1 como de NQO2. Sin embargo, esta ultima se activa solo por la presencia de un cosustrato no presente naturalmente en las celulas (EP-0152R, 1-carbamoilmetilcarbamoil-1,4-dihidronicotinamida). Esto se demostro como sigue:
Se anadio el sustrato fluorigenico MTL8-252 10 pM en DMSO (final, 10 pl) a 440 pl de PBS que contiene 5x105 celulas PC-3 preincubadas a 37 °C durante 5 min y se ajusto el volumen a 500 pl con PBS. Despues de incubar durante 5 min adicionales, se filtro la mezcla por jeringuilla como anteriormente y se analizaron 2 pl de sobrenadante por UPLC como se describe anteriormente. Se repitio la reaccion con el mismo numero de celulas con la inclusion de EP-0152R 100 pM (50 pl) como cosustrato durante la incubacion. Se filtro la mezcla de reaccion y se analizo como anteriormente. Es conocido que, en ausencia de EP-152R, hNQO2 es inactiva. La Figura 14 muestra que hay un aumento de 1,2 veces en la formacion de 4-MU por la adicion de un cosustrato selectivo de hNQO2. Esta liberacion de 4-MU adicional indica que el ensayo, cuando se suplementa con cosustrato de hNQO2, puede usarse para detectar celulas tumorales que, adicionalmente o como alternativa, expresan la enzima hNQO2. En el primer caso, cuando se expresan NQO1 y NQO2, puede usarse el ensayo suplementado para proporcionar una senal de ensayo mas fuerte y, en el ultimo caso, cuando solo se expresa NQO2, puede usarse el ensayo suplementado para detectar canceres que expresan hNQO2 solo.
Ejemplo 14- Relacion entre el numero de celulas cancerosas y la respuesta del ensayo
Se sometieron diversos numeros de celulas RT112 al ensayo anterior para demostrar las capacidades de cuantificacion del procedimiento. Se muestran los datos para estas pruebas en la Figura 15. Como se esperarfa de un ensayo funcional, a medida que aumenta el numero de celulas con NQO1, lo hace la magnitud de la senal del ensayo. Simultaneamente, se expusieron tambien las celulas a 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) usando protocolos
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45
establecidos, para permitir la cuantificacion del numero total de celulas mediante la medida de la intensidad de fluorescencia de DAPI celular en el fluorfmetro (Figura 16). Por tanto, la valoracion de los datos de las Figuras 15 y 16 posibilita determinar la cantidad de senal por celula y el numero de celulas en una muestra productora de dicha senal. Esto es particularmente ventajoso cuando se desea determinar la actividad de NQO1 o NQO2 “por celula”.
Ejemplo 15- Enriquecimiento/aislamiento/purificacion de celulas
En ciertas situaciones, es ventajoso mejorar la sensibilidad y/o especificidad del procedimiento mediante el enriquecimiento/aislamiento/purificacion de celulas antes del ensayo. Este ejemplo demuestra la capacidad y compatibilidad de la presente invencion con dichos procedimientos. Aquf, se aislaron muestras que contienen celulas cancerosas portadoras del antfgeno epitelial Ber-EP4 usando partfculas magnetizable recubiertas con anticuerpos de este antfgeno (Invitrogen). Se usaron las partfculas de acuerdo con las instrucciones del fabricante de tal modo que se obtuvo una suspension de complejos de partfculas/celulas que se proceso por el protocolo de ensayo estandar descrito anteriormente. La Figura 17 muestra que la recuperacion de la actividad de NQO1 en celulas de cancer de vejiga RT112 es de aproximadamente un 60-70 % respecto a la del numero total de celulas presentes (100 %, representado por la barra de 0 perlas en la figura) en un intervalo de densidades de partfcula (ilustrado por el volumen de la solucion madre de perlas del fabricante (4 x 106 partfculas/ml) anadido). La Figura 18 muestra resultados comparables para celulas HDT7 que expresan NQO1 pero no expresan el antfgeno Ber-EP4 humano. Esto ilustra la capacidad de enriquecer especfficamente la poblacion de celulas epiteliales, un procedimiento que puede ser deseable en casos en que una muestra contenga un gran numero de celulas, no sobreexpresando probablemente todas NQO1 o NQO2, pero pudiendo aumentar la senal de fondo no especffica en el ensayo.
Ejemplo 16- Deteccion de NQO1 en muestras clfnicas
Se obtuvieron muestras de orina (20 ml) de pacientes que asisten a una clfnica urologica y se sometieron al ensayo resumido anteriormente. Se expresan los resultados como la relacion de concentracion de 4-MU (producida por el sustrato fluorigenico como resultado de la actividad de NQO1) de las muestras a la del control de ensayo negativo, y se correlacionaba con el diagnostico clfnico eventual (carcinoma de celulas transicionales o no). El triangulo blanco representa una muestra que contiene cantidades significativas de desechos, sugiriendo que el uso de inmunoextraccion como se describe en la presente memoria serfa beneficioso para aumentar la especificidad. El cfrculo blanco representa una muestra de un paciente diagnosticado posteriormente con cancer de vejiga Ta de etapa muy temprana, y es probable que haya insuficientes celulas para un analisis fiable de esta muestra. Los sustratos quimioluminogenicos descritos en la presente memoria es probable que sean ventajosos cuando se requiere una mayor sensibilidad de deteccion.
La Tabla 2 muestra los correspondientes resultados para pacientes ya diagnosticados con cancer de vejiga pero todavfa no tratados. La muestra 89 de esta serie no pudo ensayarse debido a la presencia de hematuria macroscopica.
Se recogieron muestras de orina adicionales (20 ml) de pacientes diagnosticados con carcinoma de prostata. Estas muestras se recogieron despues de examen rectal digital. La Tabla 3 muestra los resultados del ensayo de NQO1 para estas muestras. En ambos de estos experimentos, se vio una mayor actividad de NQO1 en aquellas muestras de pacientes con tumores de etapa mas tardfa. En el procedimiento de la invencion, el aumento cuantitativo de la actividad de NQO1/NQO2 con la enfermedad avanzada significa que el procedimiento puede usarse no solo para identificar el cancer, sino tambien para valorar la progresion de la enfermedad al relacionar la naturaleza cuantitativa del ensayo con las diversas etapas de la enfermedad. Los especialistas en la materia apreciaran que esto es posible debido a la sensibilidad del ensayo y la patologfa de la enfermedad.
Tabla 2
Muestras de cancer de vejiga
Muestra
Etapa Relacion de concentraciones de 4-MU de muestra/4-MU de control de ensayo negativo (NC)
88
T2 4,0
90
DESC 2,9
91
Ta 1,4
92
Ta 1,5
93
Ta 1,0
NC
N/A 1,0
NC es el control de ensayo negativo, DESC es desconocido
Tabla 3 5
Muestras de cancer de prostata
Muestra
PSA Etapa Observaciones Relacion de concentraciones de 4-MU de muestra/4-MU de control de ensayo negativo (NC)
105
6,6 T1c Orina tras ERD 1,2
106
9,2 DESC Orina tras ERD 1,4
107
6 T1c Orina tras ERD 1,4
108
3,7 T2a Orina tras ERD, RTUP anterior 4,0
109
6 T1c Sin ERD 1,0
NC
n/a n/a 1,0
NC es control de ensayo negativo, DESC es desconocido. Nota: Se crefa originalmente que toda esta cohorte era de recogida de orina despues ERD. Sin embargo, al comprobar los registros, la muestra 109 se obtuvo sin ERD. La precision de la medida es tfpicamente <10 % CV.

Claims (21)

  1. 5
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    1. Un procedimiento de determinacion de la presencia o ausencia, en una muestra de orina de un
    paciente, de celulas de cancer de vejiga o prostata que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2, comprendiendo el procedimiento:
    i. poner en contacto la muestra de orina, o un derivado procesado de la misma, con un compuesto de formula general (I), (la), (Ib), (Ic), (Id), (le) o (If) o una sal de cualquiera de los mismos cuando sea aplicable, donde la muestra de orina contiene o se sospecha que contiene celulas de cancer de vejiga o prostata que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2;
    ii. opcionalmente, en caso de que las celulas de cancer de vejiga o prostata sobreexpresen o se sospeche que sobreexpresan NQO2, anadir un cosustrato de NQO2 a la muestra; y
    iii. determinar la presencia o ausencia de un compuesto de formula:
    z-XH;
    o un ion de formula
    z-X-;
    donde z y X son como se definen en la formula general (I), donde la presencia del compuesto o ion indica la presencia en la muestra de celulas cancerosas que sobreexpresan NQO1 y/o NQO2; donde la formula general (I) es:
    imagen1
    donde R1, R2, R3, R4 y R5 representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
    R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno; o
    R1 y R2, junto con los atomos de carbono a los que estan conectados, forman un sistema de anillo aromatico, heteroaromatico, carbocfclico o heterocfclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros;
    X es O, S o NR8;
    R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    Y es O, S o NR9;
    R9 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    z es un resto que esta ligado covalentemente con el resto de la molecula y que, tras la reduccion del compuesto de formula general (I), se escinde del resto de la molecula formando un compuesto z-XH o ion z-X- detectable;
    la formula general (Ia) es:
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    10
    15
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    imagen2
    donde R1, R2
    NR6R7,
    R , R y R representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
    R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno; o
    R1 y R2, junto con los atomos de carbono a los que estan conectados, forman un sistema de anillo aromatico, heteroaromatico, carbocfclico o heterocfclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros;
    R1', R2', R3'
    R4' y R5' representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7,
    C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-alquilo C1-C6 o C(O)O-alquilo C1-C6, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
    R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno;
    o R1' y R2', junto con los atomos de carbono con los que estan conectados, forman un sistema de anillo aromatico, heteroaromatico, carbocfclico o heterocfclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros;
    X es O, S o NR8;
    R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    Y es O, S o NR9;
    R9 es hidrogeno^ o alquilo C1-C3;
    X' es O, S o NR R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    Y' es O, S o NR9;
    R9 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    z es un resto que esta ligado covalentemente con el resto de la molecula y que, tras la reduccion del compuesto de formula general (I), se escinde del resto de la molecula formando un compuesto z-XH o ion z-X- detectable;
    la formula general (Ib) es:
    imagen3
    donde R1 R2 y R4 representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
    R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno; o
    R1 y R2, junto con los atomos de carbono a los que estan conectados, forman un sistema de anillo aromatico, heteroaromatico, carbocfclico o heterocfclico opcionalmente sustituido de 5 o 6 miembros; Rx es H o alquilo C1-C3;
    X es O, S o NR8;
    R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    Y es O, S o NR9;
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    z es un resto que esta ligado covalentemente con el resto de la molecula y que, tras la reduccion del compuesto de formula general (I), se escinde del resto de la molecula formando un compuesto z-XH o ion z-X" detectable;
    la formula general (Ic) es
    imagen4
    4 5 10 11 12 13
    donde R, R, R,R, R y R representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
    R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno;
    X es O, S o NR8;
    R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    Y es O, S o NR9;
    R9 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    z es un resto que esta ligado covalentemente con el resto de la molecula y que, tras la reduccion del compuesto de formula general (I), se escinde del resto de la molecula formando un compuesto z-XH o ion z-X- detectable;
    la formula general (Id) es:
    imagen5
    X es O, S o NR8;
    R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    R , R , R y R representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR R , C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
    R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno;
    z es un resto que esta ligado covalentemente con el resto de la molecula y que, tras la reduccion del compuesto de formula general (I), se escinde del resto de la molecula formando un compuesto z-XH o ion z-X- detectable;
    la formula general (Ie) es:
    imagen6
    10 11 12 13 6 7
    donde R , R , R y R representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR R , C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O(-alquilo C1-C6) o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
    R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido
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    55
    con halogeno;
    X es O, S o NR8;
    R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    Y es O, S o NR9;
    R9 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    z es un resto que esta ligado covalentemente con el resto de la molecula y que, tras la reduccion del compuesto de formula general (I), se escinde del resto de la molecula formando un compuesto z-XH o ion z-X" detectable;
    la formula general (If) es:
    imagen7
    10111213 67
    donde R , R , R y R representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR R , C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-(alquilo C1-C)6 o C(O)O-(alquilo C1-C6), cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes reactivos;
    R6 y R7 representan cada uno independientemente hidrogeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halogeno;
    R14 es H o alquilo C1-C6 y X es O, S o NR8;
    R8 es hidrogeno o alquilo C1-C3;
    z es un resto que esta ligado covalentemente al resto de la molecula y que, tras la reduccion del compuesto de formula general (I), se escinde del resto de la molecula formando un compuesto z-XH o ion z-X- detectables.
  2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 donde, en el caso en que las celulas de cancer de vejiga o prostata sobreexpresen o se sospecha que sobreexpresen NQO1, se anade un cosustrato de NQO1 a la muestra.
  3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde z comprende un cromoforo o luminoforo.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, donde z comprende un marcador fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente o bioluminiscente de tal modo que z-XH o z-X- sea una molecula o ion fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente o bioluminiscente; o un modulador de emisiones de una molecula o ion fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente o bioluminiscente; o un cofactor para una reaccion quimioluminiscente o bioluminiscente.
  5. 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, donde las propiedades opticas del resto z cambian cuando se escinde del resto del compuesto de formula general (I), formando el compuesto z-XH o el ion z-X-.
  6. 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, donde el cambio en las propiedades opticas del resto z comprende un cambio detectable en la longitud de onda de la luz emitida, la retirada del efecto apagador ejercido por el resto de quinona de formula general (I) o, en el caso de cofactores, la modulacion de su actividad.
  7. 7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el resto z comprende una partfcula detectable, por ejemplo una micropartfcula de latex coloreada, nanopartfcula de oro o partfcula magnetica.
  8. 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 7, donde el resto z comprende una porcion de union que se une selectivamente a un resto de captura, donde el resto de captura comprende un copartfcipe de union del resto z.
  9. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, donde uno del resto z y el resto de captura es un antfgeno y el otro es un anticuerpo; o donde uno de z y el resto de captura es biotina o un derivad de biotina y el otro es avidina o estreptavidina o un derivado de la misma.
  10. 10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde z comprende
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    fluorescefna, 2-oxo-2H-1-benzopiranilo o 4-metil-2-oxo-2H-cromen-7-ilo.
  11. 11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde, en el compuesto de formula general (I), R1, R2, R3, R4 y R5 representan cada uno independientemente hidrogeno, halogeno, NR6R7, C(O)NR6R7 o alquilo C1-C6, -O-alquilo C1-C6 o C(O)O-alquilo C1-C6, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes seleccionados de entre halogeno, hidroxilo, tiol, amino, carbonilo, carboxilo, ciano, azido, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6.
  12. 12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde en el compuesto de formula general (I), independientemente o en cualquier combinacion:
    R1, R2, R3, R4 y R5 son cada uno independientemente hidrogeno, metilo o etilo;
    X es O o NH e Y es O.
  13. 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el compuesto de formula (I) se selecciona de entre
    3-metil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)butanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1 = R2= R3= R4= R5= Me);
    3-(4,5-dimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)-3-metilbutanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1 = R2= R4= R5= Me; R3= H);
    3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)propanoato de 2-oxo-2H-1-benzopiran-7-ilo (R1= R2= R3= Me; R4= R5= H); y
    3-metil-3-(2,4,5-trimetil-3,6-dioxociclohexa-1,4-dienil)butanoato de 4-metil-2-oxo-2H-cromen-7-ilo (R1= R2= R3= R4= R5= Me).
  14. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el paciente tiene o se sospecha que tiene tumores de vejiga superficiales.
  15. 15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende poner en contacto la muestra biologica con un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 y donde, en la etapa (iii), determinar la presencia o ausencia de un compuesto o ion de formula:
    z-XH o z-X-
    comprende detectar la presencia de un cromoforo o luminoforo.
  16. 16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende poner en contacto la muestra biologica con un compuesto como se define en la reivindicacion 7 y donde, en la etapa (iii), determinar la presencia o ausencia de un compuesto de formula:
    z-XH o z-X-
    comprende detectar la presencia de una partfcula coloreada o magnetica.
  17. 17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende poner en contacto la muestra biologica con un compuesto como se define en la reivindicacion 8 o reivindicacion 9, y donde, en la etapa (iii), determinar la presencia o ausencia de un compuesto de formula:
    z-XH o z-X-
    comprende detectar la presencia del compuesto z-XH o z-X- unido al resto de captura.
  18. 18. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde la etapa (iii) comprende determinar cuantitativamente la presencia, o determinar la ausencia, del compuesto de formula z-XH o z-X-.
  19. 19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 18, que comprende adicionalmente la etapa de determinar el numero de celulas en la muestra de orina, o derivado procesado de la misma, con lo que puede expresarse la actividad de NQO1/NQO2 por celula.
  20. 20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 18, donde la etapa (iii) comprende determinar cuantitativamente la presencia o ausencia del compuesto de formula z-XH o z-X- como una relacion de la concentracion de z-XH o z-X- de la muestra de orina a la de la muestra de control de ensayo negativo.
  21. 21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 19, donde dicha relacion se correlaciona con
    tecnicas de estadificacion de celulas cancerosas conocidas.
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