ES2564227T3

ES2564227T3 - Elemento de ADN que tiene actividad de aumento de expresión de un gen exógeno

Info

Publication number: ES2564227T3
Application number: ES11743651.9T
Authority: ES
Inventors: Daisuke Nishimiya; Tatsuya Inoue
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2016-03-21
Anticipated expiration: 2031-07-06
Also published as: EP2684961A1; TW201207103A; KR101920187B1; RU2013104989A; ES2565428T3; US10407694B2; JP6039048B2; KR20180021247A; WO2012005378A3; AU2016203681A1; EP2591113A2; EP3026117B1; AU2018200686B2; US9371543B2; CA2804381C; EP2684961B1; EP3026117A1; TW201604280A; SG10201505354PA; US11060108B2

Abstract

Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID Nº: 1 en el listado de secuencias.

Description

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unidad de expresión génica.

La expresión “fragmento funcional de un anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno y que incluye Fab, F(ab’)2, y similares. Sin embargo, la expresión no se limita a estas moléculas siempre que el fragmento tenga una afinidad de unión por un antígeno.

1. Elemento de ADN que se usa para potenciar la expresión de un gen exógeno

Tal como se muestra en el ejemplo 1, se puede obtener un elemento de ADN de acuerdo con la invención usando la interacción entre la histona H3 acetilada y el ADN genómico. En general, se dice que la acetilación de histonas (H3 y H4) se asocia con la activación de la transcripción, y se han defendido dos teorías principales. Una teoría es que la acetilación de histonas se asocia con un cambio en la conformación del nucleosoma de tal modo que las colas de histonas se acetilan, neutralizándose eléctricamente de esta manera, lo que da como resultado un debilitamiento de las interacciones ADN-histona (Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22(6): 320-329). La otra teoría es que la acetilación de las histonas se asocia con el reclutamiento de varios factores de transcripción (Nakatani Y. (2001) Histone acetylases -versatile players. Genes Cells. 6(2): 79-86). En cualquiera de las dos teorías, hay una elevada posibilidad de que la acetilación de las histonas se asocie con la activación de la transcripción y llevando a cabo la inmunoprecipitación de cromatina (ChlP) usando un anticuerpo anti-histona H3 acetilada, es posible concentrar un elemento de ADN que interactúe con la histona H3 acetilada.

En la presente invención, A2 es un ejemplo de un elemento de ADN que se va a usar para aumentar la expresión de un gen exógeno. El A2 se localiza en la región desde 80966429 a 80974878 del cromosoma 15 humano y es una secuencia de polinucleótido de 8450 pb, que tiene un contenido de AT del 62,2 %. La secuencia de polinucleótido de A2 está representada por la SEC ID Nº: 1 en el listado de secuencias.

A7, A18, B5 y C14 son ejemplos de elementos de ADN similares. A7 está localizado en la región desde 88992123 a 89000542 del cromosoma humano 11 y es una secuencia de polinucleótido de 8420 pb, que tiene un contenido de AT del 64,52 %. La secuencia de polinucleótido de A7 se representa por la SEC ID Nº: 2 en el listado de secuencias. A18 está localizado en la región desde 111275976 a 111284450 del cromosoma 4 humano y es una secuencia de polinucleótido de 8475 pb, que tiene un contenido de AT del 62,54 %. La secuencia de polinucleótido de A18 está representada por la SEC ID Nº: 3 en el listado de secuencias.

B5 se localiza en la región desde 143034684 a 143043084 del cromosoma 1 humano y es una secuencia de polinucleótido de 8401 pb, que tiene un contenido de AT del 66,37 %. La secuencia de polinucleótido de B5 está representada por la SEC ID Nº: 4 en el listado de secuencias.

Finalmente, C14 se localiza en la región desde 46089056 a 46097482 del cromosoma 11 humano y es una secuencia de polinucleótido de 8427 pb, que tiene un contenido de AT del 63,81 %. La secuencia de polinucleótido de C14 está representada por la SEC ID Nº: 5 en el listado de secuencias.

En la invención, la actividad de aumento de la expresión de un gen exógeno del elemento de ADN se puede ensayar usando la actividad de una proteína codificada por un gen indicador tal como SEAP como índice. En los casos en los que de la actividad de una proteína indicadora en presencia del elemento de ADN aumenta, preferentemente el doble o más, más preferentemente el cuádruple o más, aún más preferentemente el quíntuple o más en comparación con el caso en el que no está presente el elemento de ADN, se puede determinar que el elemento de ADN tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno. Incluso en los casos en los que la actividad aumenta al doble o más, se espera esto reduzca la escala del cultivo celular y el tiempo de cultivo celular, y como resultado, es posible aumentar el rendimiento y reducir el coste del cultivo celular. Si aumenta el rendimiento, entonces es posible suministrar de manera estable una proteína exógena para su uso como agente farmacéutico. Además, si se reduce el coste del cultivo celular, se reduce el coste de la proteína exógena que se usa como agente farmacéutico, y también se reduce la carga financiara sobre los pacientes a quienes se va a administrar la proteína exógena.

En la invención, se puede usar el elemento de ADN A2 solo, y pueden usarse dos o más copias del elemento de ADN A2. Como alternativa, puede usarse al menos un elemento de ADN A2 en combinación con al menos uno de los diferentes tipos de elementos de ADN anteriores.

A7, A18, B5 y C14 son ejemplos preferidos de diferentes tipos de elementos de ADN para su uso en la invención.

El elemento de ADN que se va a usar tal como se ha descrito anteriormente puede ser una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que tiene una homología del 95 % o más respecto de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos representadas por las SEC ID Nº: 1 a 5 y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno. La homología del 95 % o más es más preferentemente una homología del 99 % o más. La búsqueda de homología de secuencia de polinucleótido puede llevarse a cabo en, por ejemplo, la Base de datos de ADN de Japón o similares usando un programa tal como FASTA o BLAST.

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3. Vector de expresión de un gen exógeno, vector de elemento

Como vector de expresión de un gen exógeno de la invención, se proporciona un vector que contiene un elemento de ADN del tipo A2 mencionado anteriormente, dos o más copias de un elemento de ADN del tipo A2 mencionado anteriormente en combinación, o al menos uno de elemento de ADN del tipo A2 mencionados anteriormente en combinación con al menos uno de los diferentes tipos de elementos de ADN y que contienen además una unidad de expresión de un gen exógeno. Cuando se expresa un gen exógeno en una célula hospedadora usando el vector de expresión de un gen exógeno mencionado anteriormente, el elemento de ADN se puede situar inmediatamente cadena arriba o cadena abajo de la unidad de expresión génica, o se puede localizar en una posición lejana de la unidad de expresión génica. Además, se puede usar un vector de expresión de un gen exógeno que contenga una diversidad de dichos elementos de ADN. De hecho, el elemento de ADN se puede insertar tanto en orientación directa como inversa con respecto a la unidad de expresión génica.

Además, como un vector que se usa en la invención, también se incluye un vector que contiene un tipo del elemento de ADN mencionado anteriormente, dos o más copias de un tipo del elemento de ADN A2 mencionado anteriormente, dos o más diferentes tipos del elemento de ADN A2 mencionado anteriormente en combinación, o al menos uno de los tipos de elemento de ADN A2 en combinación con al menos uno de los diferentes tipos de elementos de ADN diferentes y que no contenga una unidad de expresión génica (de aquí en adelante denominado también “vector de elemento”). Dicho vector de elemento se puede usar en combinación con el vector de expresión de un gen exógeno mencionado anteriormente que contiene el elemento de ADN o un vector de expresión de un gen exógeno que no contiene un elemento de ADN y solamente contiene la unidad de expresión de un gen exógeno. Permitiendo la coexistencia del vector de elemento con el vector de expresión de un gen exógeno, la expresión de un gen exógeno aumenta en comparación con los casos en los que se usa solo el vector de expresión de un gen exógeno, por lo tanto, la combinación de los vectores mencionados anteriormente también se incluyen en el vector de expresión de un gen exógeno de la invención.

El gen que codifica la proteína exógena no está limitado particularmente, sin embargo, los ejemplos del mismo incluyen los genes indicadores tales como el de la fosfatasa alcalina secretora (SEAP), la proteína verde fluorescente (GFP), y luciferasa; varios genes de enzimas tales como el gen de la α-amilasa, y el gen de la α-galactosidasa; genes de varios interferones que son útiles farmacéuticamente y proteínas fisiológicamente activas tales como el interferón α y el interferón γ; genes de varias interleucinas tales como IL-1 e IL-2; varios genes de citocinas tales como un gen de eritropoyetina (EPO) y un gen de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); genes de factores de crecimiento; y genes de anticuerpos. Estos genes se pueden obtener mediante cualquier procedimiento.

La invención es particularmente eficaz en relación con una proteína que sea altamente hidrófoba y una proteína que sea difícil de producir y secretar debido a su formación compuesta. Por lo tanto, las proteínas exógenas mencionadas anteriormente incluyen una proteína multimérica tal como un heteromultímero que es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. El “fragmento funcional de un anticuerpo” se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene actividad de unión a antígeno y que incluye Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos poliespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo, y similares. El fragmento funcional de un anticuerpo también incluyen al Fab’ que es un fragmento monovalente de una región variable de un anticuerpo que se obtiene tratando el F(ab’)2 en condiciones reductoras. Además, estos fragmentos funcionales incluyen no solamente un fragmento obtenido mediante el tratamiento de una molécula de una proteína de anticuerpo de longitud completa con una enzima adecuada, sino también una proteína producida en una célula hospedadora adecuada usando un gen de anticuerpo modificado genéticamente.

La unidad de expresión génica tiene, en la dirección de la fase de lectura de transcripción, al menos una región promotora, un gen exógeno, y una región de terminación de la transcripción (señal de adición de poli(A)). El promotor que se puede usar en el presente documento puede ser un promotor de expresión constitutivo o un promotor de expresión inducible. Los ejemplos de promotor de expresión constitutivo incluyen varios promotores naturales tales como un promotor temprano de SV40, un promotor de adenovirus E1A, un promotor de CMV (citomegalovirus), un promotor EF-1α (factor-1α de elongación humano), un promotor de HSP70, un promotor MT, un promotor de RSV, un promotor de UBC, y un promotor actina, y promotores artificiales (de fusión) tales como un promotor SRα y un promotor CAG. Además, la secuencia de adición de poli(A) puede ser una secuencia que tiene la actividad de provocar la terminación de la transcripción para la transcripción a partir del promotor, y puede ser una secuencia de un gen igual o diferente al del promotor.

Es necesario usar un promotor fuerte con el fin de aumentar la producción de una proteína exógena. Sin embargo, cuando se intenta producir una proteína que sea difícil que se pliegue o una proteína que sea difícil de secretar usando un promotor altamente activo, la proteína puede no llegar a secretarse. Esto es debido a que cuando la proteína se produce en una cantidad que excede la capacidad del ribosoma en el que se lleva a cabo la traducción y la del retículo endoplásmico donde se lleva a cabo el plegamiento y la secreción, la proteína producida en exceso se desnaturaliza, se acumula y se ubiquitina en las células, y luego se degrada en los proteosomas. Por consiguiente, es preferible que se seleccione adecuadamente un promotor que pueda alcanzar un nivel de expresión tal que la proteína no se desnaturalice o agregue o que la cantidad de la proteína resultante no exceda la capacidad de secreción. Como alternativa, el promotor se usa ajustando (por ejemplo, disminuyendo) la actividad del promotor.

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Entre las proteínas multiméricas, una molécula que forma un heteromultímero es susceptible del efecto descrito anteriormente y en particular una molécula, tal como un anticuerpo, que es un heterotetrámero. Un anticuerpo tiene dos moléculas de cadena pesada y dos moléculas de cadena ligera que se asocian entre sí y por lo tanto, con el fin de asociar adecuadamente las moléculas, el nivel de expresión de las mismas es un factor importante.

Además, el vector de expresión de un gen exógeno y el vector de elemento de la invención pueden contener cada uno un marcador de selección para seleccionar un transformante. Se puede seleccionar un transformante, por ejemplo, mediante el uso de un marcador de resistencia a un fármaco que dé lugar a resistencia a un fármaco tal como cerulenina, aureobasidina, zeocina, canavanina, cicloheximida, higromicina, puromicina, blasticidina, tetraciclina, kanamicina, ampicilina o neomicina. Además, también se puede seleccionar un transformante cuando se usa como marcador un gen que da lugar a resistencia a disolventes tales como etanol, resistencia a la presión osmótica de glicerol, de una sal, o similares, la resistencia a un ion metálico tal como el ion cobre, o similares.

El vector de expresión de un gen exógeno y el vector de elemento de la invención pueden ser cada uno un vector que no se incorpora en el ADN cromosómico. En general, el vector de expresión de un gen exógeno se transfecta en una célula hospedadora y entonces se incorpora aleatoriamente en el cromosoma. Sin embargo, usando un componente constituyente procedente de un virus de mamífero tal como un virus de simio 40 (SV40), un papilomavirus (BPV, HPV), o EBV, se puede usar el vector como un vector episómico que es auto-replicable en la célula hospedadora transfectada. Por ejemplo, se puede usar un vector que contiene un origen de replicación (oriP) procedente de SV40 y una secuencia que codifica un gran antígeno T de SV40 que es un factor trans-actuante, un vector que contiene un oriP procedente de EBV y una secuencia que codifica EBNA-1, o similares. El efecto del elemento de ADN se puede expresar por la actividad de aumento de la expresión del gen exógeno independientemente del tipo de vector o de la presencia o ausencia de la incorporación del mismo en el cromosoma.

4. Célula transformada

La célula transformada de la invención es una célula transformada en la que se ha introducido el vector de expresión de un gen exógeno descrito en el artículo “3” anterior que contiene el elemento de ADN descrito en el artículo “1”. Como vector de expresión de un gen exógeno, se puede introducir solamente un vector de expresión de un gen exógeno que contenga un elemento de ADN (a), o se pueden introducir en combinación un vector de expresión de un gen exógeno que contiene un elemento de ADN y también un vector de elemento descrito en el artículo “3” anterior (B). Como alternativa, se pueden introducir en combinación un vector de expresión de un gen exógeno que no contiene un elemento de ADN y un vector elemento (C).

La expresión de un gen exógeno en una célula hospedadora usando la combinación anterior de (B) o (C) se puede llevar a cabo, por ejemplo, según el procedimiento de Girod y col. (Biotechnology and Bioengineering, 91, 2-11 (2005)) y el procedimiento de Otte y col. (Biotechnol. Prog., 2007, 23, 801-807 (2007)).

Los ejemplos de la célula hospedadora que se va a transformar incluyen células eucariotas, incluyendo los ejemplos preferidos de las mismas células de mamífero, incluyendo los ejemplos más preferidos células procedentes de seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, monos, o ganado. Los ejemplos de dichas células de mamífero incluyen las células COS-1, células 293, y células CHO (CHO-K1, DG44, CHO dhfr-, CHO-S), sin embargo, la célula hospedadora no se limita a estas.

En la invención, se puede usar cualquier procedimiento para introducir el vector de expresión en la célula hospedadora siempre que el procedimiento permita que gen introducido esté presente de manera estable en la célula hospedadora y se exprese en la misma de manera adecuada. Los ejemplos del método que se usa generalmente incluyen un procedimiento de fosfato cálcico (Ito y col., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341), un procedimiento de electroporación (Becker, D. M. y col., 1990; Methods. Enzymol., 194, 182-187), un procedimiento de esferoplastos (Creggh y col., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), un procedimiento de acetato de litio (Itoh, H. (1983)

J. Bacteriol. 153, 163-168), y un procedimiento de lipofección.

5. Procedimiento para producir proteína exógena

En la invención, se puede producir una proteína exógena mediante el cultivo de la célula transformada descrita en el artículo “4” anterior, en la que se ha introducido un gen que codifica la proteína exógena usando el vector descrito en el artículo “3” anterior mediante un procedimiento conocido, la recogida de la proteína del producto del cultivo resultante, seguido de la purificación de la proteína. La expresión “producto del cultivo” tal como se usa en el presente documento se refiere a células cultivadas o a un homogenado celular además de a un sobrenadante del cultivo. De hecho, puede seleccionarse como proteína exógena que puede producirse usando la célula transformada descrita en el artículo “4” anterior, no solo una proteína monomérica, sino también una proteína multimérica. En los casos en los que se produce una proteína hetero-multimérica formada de una pluralidad de diferentes subunidades, es necesario introducir una pluralidad de genes que codifican estas subunidades en la célula hospedadora que se describe en el artículo “4” anterior, respectivamente.

El procedimiento para el cultivo de la célula transformada se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos convencionales para cultivar células hospedadoras.

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En los casos en que la célula transformada sea una célula de mamífero, la célula se cultiva en condiciones, por ejemplo, de 37 °C, y un 5 % o un 8 % de CO2 durante un tiempo de cultivo de aproximadamente 24 a 1000 horas. El cultivo se puede llevar a cabo por medio de cultivo discontinuo, cultivo de alimentación discontinua, cultivo continuo y similares en condiciones estáticas, de agitación, removido o aireación.

La confirmación del producto de expresión del gen que codifica la proteína exógena a partir del producto de cultivo (solución de cultivo) mencionado anteriormente se puede llevar a cabo por SDS-PAGE, análisis de Western, ELISA

o similares. Con el fin de aislar y purificar la proteína producida, se puede usar un procedimiento de purificación y aislamiento de proteínas convencional. Tras completar el cultivo, en los casos en los que la proteína diana se produce en células, se homogenizan las células usando un homogeneizador ultrasónico, una prensa de French, un homogeneizador de Manton-Gaulin, Dinomil, o similar, obteniendo de esta manera la proteína diana. Además, en los casos en los que se produce la proteína diana fuera de las células, la solución el cultivo se usa como tal, o se eliminan las células por centrifugación o similar. A continuación se recoge la proteína diana por extracción o similar usando un disolvente orgánico y luego se aísla y purifica la proteína diana usando técnicas tales como varias técnicas de cromatografía (cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.), filtración en gel usando un tamiz molecular y electroforesis usando un gel de poliacrilamida o similar solo o en combinación según las necesidades.

Los procedimientos de cultivo mencionados anteriormente y los procedimientos de purificación son solo a modo de ejemplo, y los procedimientos no se limitan a estos. La secuencia de aminoácidos del producto genético purificado se puede confirmar por una técnica de análisis de aminoácidos conocida, tal como la determinación de secuencia de aminoácidos automatizada usando el procedimiento de degradación de Edman.

6. Procedimiento para producir una proteína de anticuerpo

Como proteína hetero-multimérica que se va a producir usando el procedimiento de producción descrito en el artículo “5” anterior, puede ejemplificarse una proteína de anticuerpo. La proteína de anticuerpo es una proteína tetramérica que comprende dos moléculas de polipéptido de cadena pesada y dos moléculas de polipéptido de cadena ligera. Por consiguiente, para obtener dicha proteína de anticuerpo en un estado que mantenga la afinidad de unión a antígeno, es necesario introducir ambos genes de cadena pesada y ligera en la célula transformada descrita en el artículo “4” anterior. En este caso, las unidades de expresión génica de la cadena pesada y ligera pueden estar presentes en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión.

Como anticuerpo que se va a producir en la invención, puede ejemplificarse un anticuerpo preparado mediante la inmunización de un animal experimental, tal como un conejo, un ratón o una rata con un antígeno deseado. Además, también puede ejemplificarse como el anticuerpo que se va a producir en la invención un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado obtenido mediante el uso del anticuerpo anteriormente mencionado como material de partida. Además, también se incluye como anticuerpo que se va a producir en la invención un anticuerpo humano obtenido usando un animal modificado genéticamente o un procedimiento de presentación en fagos.

El gen de anticuerpo que se va a usar para la producción del anticuerpo no está limitado a un gen de anticuerpo que tenga una secuencia de polinucleótido específica, siempre que la combinación de polipéptido de cadena pesada y polipéptido de cadena ligera que se van a transcribir y traducir a partir del gen de anticuerpo tenga la actividad de unión a una proteína antigénica dada.

Además, no es necesario que el gen de anticuerpo codifique la molécula de longitud completa del anticuerpo, puede usarse un gen que codifica un fragmento funcional del anticuerpo. Dicho gen que codifica un fragmento funcional del mismo puede obtenerse modificando genéticamente un gen que codifica la molécula de longitud completa de la proteína de anticuerpo.

7. Procedimiento de producción de otras proteínas exógenas

Los ejemplos de proteínas exógenas que se van a producir usando el procedimiento de producción de la invención incluyen, además de los anticuerpos mencionados anteriormente, varias proteínas procedentes de seres humanos y no humanos, fragmentos funcionales de las mismas, y productos modificados de las mismas. Los ejemplos de dichas proteínas y similares incluyen hormonas peptídicas tales como el péptido natriurético auricular (ANP), péptido natriurético cerebral (BNP), péptido natriurético tipo C (CNP), vasopresina, somatostatina, hormona de crecimiento (GH), insulina, oxitocina, grelina, leptina, adiponectina, renina, calcitonina, osteoprotegerina, y factor de crecimiento insulínico (IGF); citocinas tales como interleucinas, quimiocinas, interferón, factores de necrosis tumoral (tales como TNF-α ,TNF-β, y la superfamilia de TNF), factores de crecimiento nerviosos (tales como NGF), factores de crecimiento celular (tal como EGF, FGF, PDGF, HGF, y TGF), factores de crecimiento hematopoyético (tales como CSF, G-CSF, y eritropoyetina), y adipocina; receptores tales como los receptores de TNF; enzimas tales como lisozima, proteasas, proteinasas, y peptidasas; fragmentos funcionales de las mismas (fragmentos que tienen la totalidad o parte de la actividad biológica de la proteína original), y proteínas de fusión que comprenden cualquiera de estas proteínas. Sin embargo, las proteínas no se limitan a estas.

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Luego, se añadió a esto 1 ml de medio SOC, y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 90 minutos. La cantidad total de la solución de cultivo se emplacó en una placa LB (que contenía 100 μg/ml de ampicilina), y la placa se incubó. A continuación se obtuvo el plásmido diana por lisis alcalina. Finalmente, se confirmaron la secuencia del plásmido que se obtuvo y los sitios de la enzima de restricción del mismo, por lo que se construyó el plásmido diana. El vector construido se muestra en la Fig. 2.

(2-3) Evaluación usando la expresión de SEAP como índice

Se evaluó cada plásmido construido en (2-2) usando la célula hospedadora CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen)

Se llevó a cabo la selección con antibióticos con higromicina a 800 μg/ml durante aproximadamente 2 semanas comenzando 2 días tras la transfección, por lo que se estableció una línea celular policlonal que expresaba establemente. La línea celular establecida de esta manera se sometió a un remplazo de medio el día antes de la medición, y se sembraron un número determinado de células en una placa de 24 pocillos (IWAKI). A las 24 horas tras poner las células en las placas, se recolectó el sobrenadante, y se midió la actividad de SEAP. La actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo se midió usando el Ensayo de Fosfatasa Alcalina Segregada indicadora SensoLyte™ pNPP (ANASPEC).

Los resultados medidos se muestran en la Fig. 3. Cuando la actividad de SEAP del control sin elemento se normalizó a 1, la actividad SEAP en el sobrenadante del cultivo de la línea celular CHO que expresaba establemente que tenía el elemento de ADN A2, A7, A18, B5 o C14 mostraba un valor numérico cinco veces mayor o más que el del control. Basándose en los resultados, se confirmó que los 5 tipos de elementos de ADN aumentan drásticamente la expresión de SEAP. De hecho, las secuencias de polinucleótidos de los 5 tipos de elementos de ADN anteriores se representan en las SEC ID Nº: 1 a 5 del listado de secuencias, respectivamente.

Ejemplo 3

Generalidad de promotores que se va a usar en combinación

El promotor para el vector que se usa en la evaluación de los elementos de ADN del ejemplo 2 era un promotor de CMV, y de esta manera se estudió en el ejemplo 3 el uso de elementos de ADN en combinación con otros promotores generales.

(3-1) Construcción del vector de expresión de SEAP usando promotores EF-1α y SV40

Utilizando el pSEAP2-control (Clontech) como molde, se amplificó el gen SEAP por el procedimiento PCR (94 °C durante 30 s y 68 °C durante 2 min x 40 ciclos) usando los cebadores descritos en (2-1) y KOD-plus-. El SEAP amplificado se preparó como una inserción de la misma manera que en (2-1). La inserción se digirió con las enzimas de restricción NheI y BgIII, y se digirió un vector pIRES puro3 (Clontech) con las enzimas de restricción NheI y BamHI, y se construyó el pCMV/SEAP ires Puro de la misma manera que en (2-1).

Posteriormente, usando el PEF1/V5-His A (Invitrogen) como molde, se amplificó un promotor EF-1α por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 seg, 60 °C durante 30 seg, y 68 1C durante 2 min x 30 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus-. 5’-AAAACTAGTCAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACC-3’ 5’-AAAGATATCCCTAGCCAGCTTGGGTGGTACCAAGC-3’

Utilizando el pCMV/SEAP ires Puro construido anteriormente como vector, se llevó a cabo la digestión con las enzimas de restricción SpeI y EcoRV para el vector y el promotor, y se construyó el pEF/SEAP ires Puro de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-1).

De manera similar, usando el pcDNA3.1+ (Invitrogen) como molde, se amplificó un promotor de SV40 por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, y 68 1C durante 1 min x 30 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus. 5’-AAAACTAGTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTG-3’ 5’-AAAGATATCAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC-3’

Utilizando el pCMV/SEAP ires Puro construido anteriormente como vector, se llevó a cabo la digestión con las enzimas de restricción SpeI y EcoRV para el vector y el promotor, y se construyó el pSV40/SEAP ires Puro de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-1).

(3-2) Clonación del elemento de ADN A2 o A7

Posteriormente, se llevó a cabo la clonación del elemento de ADN A2 o A7 usando el pEF/SEAP ires Puro y pSV40/SEAP ires Puro construidos en (3-1) como estructuras básicas.

Primero se digirieron el pEF/SEAP ires Puro y el pSV40/SEAP ires Puro con la enzima de restricción SpeI durante varias horas, seguido de precipitación en etanol, y el precipitado se disolvió en agua estéril. Utilizando los

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5’-AAACCCGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3’

El fragmento A obtenido y un fragmento de ADN que contenía una secuencia de ADN que codifica una señal secretora de cadena κ humana, una región constante de cadena κ humana, y una señal de adición de poli(A) humana (de aquí en adelante denominado “fragmento B”) se unieron por PCR de solapamiento. El fragmento de ADN que se obtuvo de esta manera en la que se ligaron el fragmento A y el fragmento B, se digirió con enzimas de restricción KpnI y SmaI, y el fragmento resultante se unió al plásmido pEF6/V5-HisB (Invitrogen) que se digirió con las enzimas de restricción KpnI y SmaI, por lo que se construyó un vector de expresión de cadena ligera humana pEF6KCL que tiene una secuencia de señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena κ humana, y una secuencia de señal de adición de poli(A) humana cadena abajo del promotor EF-1α .

El fragmento de ADN que se obtiene por escisión del pEF6KCL obtenido por el procedimiento mencionado anteriormente con las enzimas de restricción KpnI y SmaI se unió al pEF1/myc-HisB (Invitrogen) que se digirió con KpnI y SmaI, seguido de la transformación por lisis alcalina, y su confirmación de secuencia, por lo que se construyó el plásmido pEF1KCL.

(1-2) Construcción del vector de expresión de cadena pesada humana pEF1FCCU

Un fragmento de ADN (la secuencia de polinucleótido de este fragmento de ADN está representada por la SEC ID Nº: 7 en el listado de secuencias) que contenía una secuencia de ADN que codificaba una secuencia de señal de IgG1 humana y una secuencia de aminoácidos de una región constante se digirieron con las enzimas de restricción NheI y PmeI, y el fragmento resultante se unió a un plásmido pEF1KCL que se digirió con NheI y PmeI, por lo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada humana pEF1FCCU que tenía una secuencia de señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena pesada humana, y una secuencia de señal de adición de poli(A) humana cadena abajo del promotor EF-1α .

(1-3) Construcción de un vector de expresión del gen X de anticuerpo humanizado sencillo (gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN#)

Uniendo el vector de expresión de cadena L o cadena H construido en (1-1) o (1-2), se construyó un vector de expresión de anticuerpo humanizado sencillo (pEF_LHN (que carece de región variable).

Se añadió un sitio de enzima de restricción SaII por el procedimiento de PCR a ambos extremos de la unidad de expresión génica desde cadena arriba del promotor a cadena abajo del poli(A) del pEF1KCL. Se llevaron a cabo entonces la electroforesis en gel, el recorte de un fragmento de ADN deseado del gel, y la purificación del fragmento de ADN, preparando de este modo la inserción. Digiriendo el pEF1FCCU construido en (1-2) con la enzima de restricción SaII, se linealizó el vector y el sitio de SaII localizado cadena arriba de la unidad de expresión génica. Entonces, el vector linealizado se unió con la inserción anterior, seguido de transformación, lisis alcalina, y confirmación de secuencias, construyendo de esta manera un vector de expresión de anticuerpo humanizado sencillo (pEF_LHN (que carece de región variable)).

Posteriormente, se introdujeron los siguientes oligonucleótidos en un sitio AatII del vector PEF_LHN (que carece de región variable). 5’-CGCGGCCGCACTAGTGACGT-3’ 5’-CACTAGTGCGGCCGCGACGT-3’

Los respectivos oligonucleótidos se diluyeron hasta 5 pmol, y usando la T4 polinucleótido cinasa (TAKARA), se permitió que se produjera una reacción a 37 °C durante 1 hora. Luego, se añadió a esto 10 x de tampón (TAKARA), y se llevó a cabo la hibridación a 96 °C durante 1 min a temperatura ambiente. Estos oligonucleótidos y el vector pER_LHN que se había digerido con la enzima de restricción AatII se unieron, seguido de transformación, lisis alcalina, y confirmación de secuencia, construyéndose así el pEF_LHN# (que carece de región variable).

Mediante la integración de la región variable del gen X de anticuerpo humanizado en el vector universal construido anteriormente (pEF_LHN# (que carece de región variable)), se completó la construcción de un vector único de expresión del gen X de anticuerpo humanizado (gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN#).

En primer lugar, usando los siguientes cebadores y KOD-plus-, se amplificó una región variable de cadena L del gen X de anticuerpo humanizado por el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s, y 68 °C durante 1 min x 30 ciclos). Región variable de cadena L: 5’-AAACATATGGCGACATCCAGATGAC-3’ 5’-AAACGTACGCTTGATCTCCACCTTGG-3’

El fragmento de región variable de cadena L amplificado y el vector universal (pEF_LHN# (que carece de región variable)) se digirieron con las enzimas de restricción NdeI y BsiWI, seguido de electroforesis en gel de agarosa, recorte de un fragmento deseado del gel, purificación, reacción de ligadura, transformación, lisis alcalina, y confirmación de secuencia, por lo que se integró la región variable de cadena L en el vector. De la misma manera, usando los siguientes cebadores y KOD-plus-, se amplificó la región variable de cadena H del gen X de anticuerpo humanizado por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s, y 68 °C durante 1 min x 30 ciclos).

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Gen X de anticuerpo humanizado/pCMV_LHN# R:

Se usó el gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN# R.

Utilizando el ADN preparado anteriormente para la transformación y el BAC transfectado con pRed/ET, se clonó el elemento de ADN A7 en los vectores de expresión del gen X de anticuerpo humanizado sencillo que se describen en (1-3) y (1-4). La construcción del vector se muestra en la Fig. 5. De hecho, se llevó a cabo el procedimiento de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-2).

(1-6) Evaluación usando la expresión de anticuerpo como índice

Cada plásmido que se construyó en (1-5) se evaluó usando la célula hospedadora CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen).

Se llevó a cabo la selección por antibiótico con Geneticina (Roche) a 800 μg/ml durante aproximadamente 2 semanas comenzando 2 días después de la transfección, estableciendo de esta manera una línea celular policlonal que expresaba establemente. La línea celular establecida de esta manera se sometió a sustitución del medio el día antes de la medición, y se sembró un número determinado de células en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas tras la colocación en placas de las células, se recolectó el sobrenadante del cultivo, y se midió el nivel de expresión del anticuerpo en el sobrenadante del cultivo por el procedimiento ELISA. De hecho, el ELISA se llevó a cabo de la siguiente manera. Se añadieron 100 μl del sobrenadante del cultivo libre de células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos revestidos con un anti-cadena ligera kappa a 50 ng/pocillo, y se incubó la placa a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, se retiró la muestra (sobrenadante del cultivo), y cada pocillo se lavó con 200 μl de PBS-Tween (0,05 %). Luego, se añadieron 100 μl de IgG (Fc) anti-humano marcada con HRP a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora adicional. A continuación, se retiró la IgG (Fc) anti-humana marcada con HRP, y se lavó cada pocillo con PBS-Tween (0,05 %). Luego se reveló el color usando un kit ABTS (Nacalai) de sustrato POD, y se midió la absorbancia a una longitud de onda determinada de 405 nm. Para la dilución de la anti-cadena ligera kappa, la IgG (Fc) anti-humano y la muestra, se usó PBS-Tween (0,05 %). Utilizando la IgG humana diluida en serie a 12 ng, 6 ng, 3 ng, 0,75 ng, 0,375 ng, y 0,1875 ng como referencia, se calculó la concentración de la muestra.

Los resultados se muestran en la Fig. 6. Se confirmó que la muestra que tenía el elemento de ADN A7 tenía un efecto mayor de aumento de producción de anticuerpo en comparación con un control sin elemento cuando se usaba el promotor EF-1α o el promotor CMV en el vector de expresión de anticuerpo.

Ejemplo 4

Longitud de la secuencia que muestra actividad de aumento de expresión de un gen exógeno

(4-1) Clonación de elementos de ADN que tienen diferentes longitudes de secuencia

Basándose en la longitud de secuencia que se usa en el ejemplo 2, se construyeron vectores que contenían cada uno de los elementos de ADN pero tenían diferentes longitudes de secuencia.

Los detalles de los elementos de ADN que tenían diferentes longitudes de secuencia que fueron diseñados basándose en la longitud completa de cada elemento de ADN A2, A7, A18, B5 y C14 se muestran en las Figs. 7, 9, 11, 13, 15, 18 y 19 respectivamente. El pCMV/SEAP ires Hygro descrito en (2-1) se digirió con la enzima de restricción SpeI durante varias horas, seguido de precipitación en etanol, y se disolvió el precipitado en agua estéril. Utilizando el vector digerido con SpeI como molde, se preparó el ADN para la transformación por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s, y 68 °C durante 10 min x 30 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus-. Utilizando el ADN preparado de esta manera para la transformación y el correspondiente BAC transfectado con pRed/ET, cada elemento de ADN que tenía una diferente longitud de secuencia se clonó en el pCMV/SEAP ires Hygro descrito en (2-1). La construcción del vector se muestra en la Fig. 2. De hecho, el procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-2).

A2-1D:

5'-CATGCACAGATTAGCCATTTAGTACTTACTAAATCAAACTCAATTTCTGAAGTCT AGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-1R:

5'-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-2D:

5'-ACACTGGTCAAAGGGACAGGTCATTGTTATGCTGGCAATGCAGGCTGCTGAAAAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

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A2-2R: 5'-ACTGTAGCTTCTTATTTTTTACCTGCAGTGCATTCCTGTAAAAGTAGTGTGGAGT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3' A2-3D: 5 5'-CTGGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3' A2-3R: 5'-CCAAGCTTGTCCAACCGCGGCCTGCAGGCTGCATGCAGCCTGTGAAGGCTTTGAT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3' 10 A2-4D: 5'-TCAATCATTTATCAATTTTATCTTCAAAGTCCCTCACTTCAGGGAGATGATATAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3' A2-4R: 5'-ATATATAAAAGTTCATGTATATATAAAATCATGCAATACACGGCCTTTTGTGACT 15 CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3' A2-5D: 5' -CGCATAAAAGGAAAAGCATCCTTAAAATAAACACCATCAATGGCTCCTCGGTGGC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3' A2-5R: 20 Se usó A2-4R. A2-6D: 5' -GGGAGGCTACAGCTTGCCTCTCTAACCACTAAAAGGCATGACCCTCCTCAAAGCT AGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-6R: 25 Se usó A2-4R. A2-7D:

5'-TCTGGCTTCCCTGGGCCACGCTGGAAGAAGAATTGTCTTGCGCCACACATAAAAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3' A2-7R: 30 5'-AGCTGATTTTTACGTTAAATGTAACATGTAAAGAAATATATGTGTGTTTTTAGAT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3' A2-8D: 5'-GTGAAGAGGAGGAGATGTCAAAATTCAAAGTCTTAAATGATGTAGTTTTAAGTAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3' 35 A2-8R: 5'-ATGACACTTGATATTGTTGTTTATATTGCTGGTTAGTATGTGCCTTCATTTACCT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3' A2-9D: Se usó A2-6D. 40 A2-9R: Se usó A2R.

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Claims

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