ES2564358T3

ES2564358T3 - Genes relacionados con la obesidad y sus proteínas y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2564358T3
Application number: ES11833512.4T
Authority: ES
Inventors: Jose Leonardo WALEWSKI; Paul David BERK
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2016-03-22
Anticipated expiration: 2031-10-14
Also published as: WO2012051567A3; US10912816B2; EP2627349A2; WO2012051567A2; CN103391784A; US20130274181A1; WO2012051567A8; CN108404115A; EP2627349B1; BR112013009196A2; EP2627349A4

Abstract

Un polipéptido que consiste en al menos 85 % de identidad con SEC ID Nº: 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en uno o más de: el tratamiento de obesidad o un trastorno asociado con obesidad en un sujeto obeso; para promover la saciedad en un sujeto obeso o un sujeto obeso aquejado de un trastorno asociado con la obesidad; para promover la pérdida de peso en un sujeto obeso o un sujeto obeso aquejado de un trastorno asociado con la obesidad; para reducir los niveles de leptina en suero en un sujeto obeso o un sujeto obeso aquejado de un trastorno asociado con la obesidad; para reducir la captación de ácidos grasos de cadena larga en tejido de adipocitos en un sujeto obeso o un sujeto obeso aquejado de un trastorno asociado con la obesidad; para reducir el consumo de alimentos en un sujeto obeso o un sujeto obeso aquejado de un trastorno asociado con la obesidad; y para reducir el consumo de ácidos grasos en el tejido cardiaco o tejido hepático en un sujeto obeso o un sujeto obeso aquejado de un trastorno asociado con la obesidad.

Description

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aterosclerosis, enfermedad vascular periférica, ictus, hipertensión, retinopatía, neuropatía y nefropatía (Federici M y R Lauro, Aliment Pharmacol Therapy, 2005, 22 (Supl 2): 11-15; Desai AS y PT O’Gara, Indian Heart J, 2005, 57(4):295-303; Natarajan R y JL Nadler, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004, 24: 1542-48). Por lo tanto, el control terapéutico de la obesidad, la homeostasis de la glucosa, hipertensión y metabolismo de lípidos son críticamente importantes en el tratamiento y el control clínico de la diabetes mellitus, para reducir la mortalidad debida a complicaciones diabéticas, tales como enfermedad cardiovascular.

Señalización de insulina y leptina

La unión de insulina con su receptor conduce a la activación de varias rutas mitógenas y metabólicas mediante sustratos de receptor de insulina (IRS 1-4), Gab-1, y Cbl (Sun XJ, et al., Nature, 1995, 377:173-7; Sun XJ, et al., Nature, 1991, 352:73-7; Fantin VR, et al., J Biol Chem, 1998, 273(17):10726-32; Berg CE, et al., Biochem Biophys Res Common, 2002, 293(3):1021-7; Holgado-Madruga M, et al., Nature, 1996, 379:560-4; Ribon V y AR Saltiel, Biochem J, 1997, 324 (Pt 3):839-45). La insulina se une con su receptor dando como resultado autofosforilación de las subunidades β y fosforilación de los restos de tirosina de los sustratos de receptor de insulina (tales como IRS-1). IRS fosforila posteriormente el dominio SH2 de la tirosina fosfatasa, Shp2, así como el dominio SH3 de la molécula adaptadora Grb2. Grb2 activa a su vez se une con Sos1, que activa después la ruta de señalización de Ras y transcripción corriente abajo de genes. La proteína IRS activa también fosfoinositida 3-quinasa (PI3K) mediante unión con su dominio SH2, dando como resultado aumentos de los niveles de PIP2 y PIP intracelulares lo que conduce a la activación de quinasa 1 dependiente de fosfatidilinositol fosfato (PDK-1). Este acontecimiento conduce por lo tanto a la activación de la ruta de Akt/PKB, que da como resultado acontecimientos intracelulares tales como la translocación del transportador de glucosa (GLUT4) de un grupo intracelular a la superficie celular.

Entre las rutas mitogénica y metabólica iniciadas por la cascada de señalización de insulina está la ruta de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) (Berman DM, et al., J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86(1): 97-103; Dennis PB, et al., Mol Cell Biol, 1996, 16 (11): 6242-51). En células lisas vasculares (VSMC), la leptina se une con su receptor y activa las rutas tanto de proteína quinasa activa por mitógeno (MAPK) como PI3K mediante fosforilación de los restos Tyr985 y Tyr1138 del receptor de leptina (Oda A, et al., Kobe J Med Sci, 2001, 47(3):141-50). Se sabe que el receptor de leptina activado regula componentes de la cascada de señalización de insulina, tales como ERK, Akt, IRS-1, MAP quinasa, y PI3-quinasa, una acción celular denominada interferencia (Niswender KD, et al., Trends Endocr Metab, 2004, 15(8):362-9; Myers MG, Recent Prog Horm Res, 2004, 59:287-304; Ahima RS y SY Osei, Physio Behav, 2004, 81:223-41). La activación de la ruta de PI3K puede estimular la fosforilación de mTOR mediante la activación de Akt (proteína quinasa B). Esto liga directamente las hormonas insulina y leptina (una adipocina) con la ruta de mTOR. La activación de mTOR conduce a la hiperfosforilación de p70S6K y la proteína de unión a eIF-4E (4E-BP1) que conduce la traducción del ARNm de tramo de oligopirimidina 5’ terminal y que libera eIF-4E para formar el complejo eIF-4F, respectivamente (Brunner L et al., Obes Relat Metab Disord, 1997, 21(12):1152-60; Cutfield LS, et al., J Pediatr, 2003, 142(2):113-6; Sugiyama H, et al., J Immunol, 1996, 157(2):65660; Volarevic S y G Thomas, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 2001, 65: 101-27; Hara K, et al., J Biol Chem, 1997, 272 (42): 26457-63; Graves LM, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92 (16): 7222-6).

Spexina

La Spexina es un péptido con actividad GI. Se identificó en primer lugar usando análisis de modelado de Markov basándose en características comunes a hormonas peptídicas para encontrar nuevas secuencias de proteoma humano (Mirabeau et al., (2007) Genome Res., 17: 320-327). Demuestra efectos contráctiles en un ensayo de explante de estómago de rata, lo que indica una actividad biológica.

Ch12, orf39 (Spexina; ~17.333 pb en seres humanos) se mapea en el locus 12p12.1, que también se define por el marcador de microsatélite (MS) D12S1042. Locus 12p12.1, que es el sitio en el que se mapea Spexina, se ha asociado con diversos marcadores fenotípicos de obesidad en diversos estudios de vínculos familiares. Por ejemplo, 12p12.1 se ha asociado con el IMC en blancos, con una puntuación de LOD máxima de 2,1 (estudio HERITAGE; Yvon et al; 2001: Obesity Genome Map; Rankinen et al, 2006). El marcador de MS D12S1042 se ha ligado adicionalmente al perímetro de la cintura, con una puntuación de LOD máxima de 2,374 (Oman Family Study, Bayoumi et al, 2008). Además, la relación con el marcador de microsatélite D12S1042 fue significativa en un subconjunto de familias con mayor perímetro de circunferencia promedio, con una puntuación de LOD máxima de 4,45, p= 0.0045 para aumento de las pruebas de relación (Dominican family study; Wang et al; 2009). En una realización, un método para detectar la presencia de o una predisposición a obesidad o a un trastorno asociado con la obesidad en un sujeto humano comprende obtener una muestra biológica de un sujeto; y detectar si el sujeto expresa o no Spexina en combinación con la presentación de un marcador o marcadores fenotípicos de obesidad (IMC, perímetro de la cintura, o una combinación de los mismos), en comparación con un sujeto no aquejado de obesidad o un trastorno asociado con la obesidad. El gen de Spexina humana se encuentra en un locus que se ha ligado a fenotipos/manifestaciones relacionados con la obesidad en varios estudios de asociación de todo el genoma. En una realización adicional, un gen en el locus 12p12.1 (y la región definida por el marcador de microsatélite D12S1042), desempeña un papel en la obesidad. En otra realización, una alteración genética en SEC ID Nº 1 (por ejemplo, una suspensión, mutación de sentido erróneo, mutación sin sentido o una combinación de los

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natural. Una proteína OS puede ser un fragmento o parte de proteína Spexina humana. Los ácidos nucleicos que codifican proteínas OS de la invención pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante y dichos ácidos nucleicos recombinantes pueden prepararse por técnicas convencionales, incluyendo síntesis química, ingeniería genética, técnicas enzimáticas o una combinación de las mismas. Son ejemplos no limitantes de una proteína OS el polipéptido codificado por el gen de Spexina y/o cualquiera de los genes enumerados en una cualquiera de las Tablas 7-8.

En algunas realizaciones, la descripción abarca el uso de variantes de una proteína OS, tales como Spexina. Dicha variante puede comprender una variante de origen natural debido a variaciones alélicas entre individuos (por ejemplo, polimorfismos), alelos mutados relacionados con la obesidad, o formas de corte y empalme alternativo. En una realización, la descripción abarca métodos para usar una proteína o un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico de un gen de identificación de obesidad (OS), tal como la secuencia mostrada en SEC ID Nº 1, o una proteína o polipéptido OS codificado por cualquiera de los genes enumerados en una cualquiera de las Tablas 7-8. En otra realización, el polipéptido puede estar modificado, tal como por glucosilaciones y/o acetilaciones y/o reacción química o acoplamiento, y puede contener uno o varios aminoácidos no naturales o sintéticos. Un ejemplo de un polipéptido OS tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº 1. En ciertas realizaciones, la descripción abarca variantes de una proteína humana codificada por un gen de identificación de obesidad (OS), tal como Spexina. Dichas variantes pueden incluir las que tienen al menos de aproximadamente 46 % a aproximadamente 50 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 50,1 % a aproximadamente 55 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 55,1 % a aproximadamente 60 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 60,1 % a aproximadamente 65 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 65,1 % a aproximadamente 70 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 70,1 % a aproximadamente 75 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 75,1 % a aproximadamente 80 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 80,1 % a aproximadamente 85 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 85,1 % a aproximadamente 90 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 90,1 % a aproximadamente 95 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 95,1 % a aproximadamente 97 % de identidad con SEC ID Nº 1, o que tienen al menos de aproximadamente 97,1 % a aproximadamente 99,9 % de identidad con SEC ID Nº 1.

ADN y polipéptidos, métodos y purificación de los mismos

La presente invención utiliza biología molecular convencional, microbiología y técnicas de ADN recombinante disponibles para los expertos en la materia. Dichas técnicas se conocen bien por los expertos en la materia y se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "DNA Cloning: A Practical Approach," volúmenes I y II (D. N. Glover, ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames y S. J. Higgins, eds., 1985); "Transcription and Translation" (B. D. Hames y S. J. Higgins, eds., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1986); "Immobilized Cells and Enzyme" (IRL Press, 1986): B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984), y Sambrook, et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (3ª edición, 2001). Un experto en la materia puede obtener una proteína modificada por un gen OS, tal como Spexina, o una variante del mismo, de varias maneras, que incluyen, pero sin limitación, aislar la proteína mediante medios bioquímicos o expresar una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de interés por métodos de ingeniería genética. Por ejemplo, puede obtenerse Spexina, o una variante de la misma, purificándola de células humanas que expresan Spexina, o por síntesis química directa.

Pueden identificarse células hospedadoras que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido OS (por ejemplo, Spexina), y que expresa posteriormente una proteína codificada por un gen OS (por ejemplo, Spexina), mediante diversos procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteínas que incluyen tecnologías basadas en membrana, solución o microplaca para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, la presencia de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de Spexina puede detectarse por hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación usando sondas o fragmentos de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de Spexina.

Los métodos de amplificación incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR (PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, ed. Innis, Academic Press, N.Y., 1990 y PCR Strategies, 1995, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Wu, Genomics 4:560, 1989; Landegren, Science 241:1077, 1988; Barringer, Gene 89:117, 1990); amplificación de transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989); y replicación de secuencia auto mantenida (véase, por ejemplo, Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990); amplificación de Q Beta replicasa (véase, por ejemplo, Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491, 1997), ensayo de amplificación de Q-beta replicasa automático (véase, por ejemplo, Burg, Mol. Cell. Probes 10:257-271,1996) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véase también Berger, Methods Enzymol. 152:307-316, 1987; Sambrook; Ausubel; patentes de Estados Unidos n.º 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan, Biotechnology 13:563-564, 1995.

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Se encuentra una guía para hibridación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley y Sons, Inc., Nueva York, 1997; Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, parte 1. Theory and Nucleic Acid Reparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., 1993.

En una realización, un fragmento de un ácido nucleico del gen de Spexina puede abarcar cualquier parte de al menos aproximadamente 8 nucleótidos consecutivos de SEC ID Nº 2. En otra realización, el fragmento puede comprender al menos aproximadamente 10 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos, o al menos aproximadamente 30 nucleótidos consecutivos de SEC ID Nº 2. Los fragmentos pueden incluir todas las longitudes de nucleótidos posibles entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos, por ejemplo, longitudes entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100 nucleótidos, o entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 nucleótidos. Los ensayos basados en amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de oligonucleótidos seleccionados de secuencias que codifican un polipéptido codificado por un gen OS (por ejemplo, Spexina), o son complementarios de él, para detectar transformantes que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína o un polipéptido OS, por ejemplo, Spexina.

Se conocen en la técnica métodos para detectar y cuantificar polipéptidos OS (por ejemplo, un polipéptido de Spexina) y polinucleótidos (por ejemplo, un polinucleótido de Spexina) en muestras biológicas. Por ejemplo, están bien establecidos protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido codificado con un gen OS, tal como Spexina, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el polipéptido. Los ejemplos no limitantes incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Puede usarse un inmunoensayo de base monoclonal, de dos sitios, usando anticuerpos monoclonales sensibles a dos epítopos no interferentes en un polipéptido codificado por un gen OS (por ejemplo, Spexina), o puede emplearse un ensayo de unión competitiva. En una realización, puede determinarse la expresión de infra o sobreexpresión de un producto génico de OS (por ejemplo, un polipéptido de Spexina o ARNm de Spexina). En una realización, una muestra biológica comprende una muestra de sangre, suero, células (incluyendo células completas, fracciones celulares, extractos celulares y células o líneas celulares cultivadas), tejidos (incluyendo tejidos obtenidos por biopsia), fluidos corporales (por ejemplo, orina, esputo, líquido amniótico, líquido sinovial) o de medios (de células o líneas celulares cultivadas). En realizaciones adicionales, la muestra tisular es tejido adiposo. En realizaciones específicas, el tejido adiposo es adiposo omental, adiposo subcutáneo o adiposo mesentérico. Los métodos para detectar o cuantificar polinucleótidos de Spexina incluyen, pero sin limitación, ensayos basados en amplificación con amplificación de señal, ensayos basados en hibridación y ensayos de combinación de amplificación-hibridación. Para detectar y cuantificar polipéptidos de Spexina, un método ejemplar es un inmunoensayo que utiliza un anticuerpo u otros agentes de unión que se unen específicamente con un polipéptido o epítopo de Spexina, por ejemplo, ensayos de ELISA o RIA.

Se conocen por los expertos en la materia técnicas de conjugación y marcaje y pueden usarse en diversos ensayos de ácido nucleico y aminoácidos. Los métodos para producir hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas con secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína OS, tales como Spexina, incluyen, pero sin limitación, oligomarcaje, traslación de muesca, marcaje de extremos o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Como alternativa, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido codificado por un gen OS puede clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores se conocen en la técnica, están disponibles en el mercado, y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6. Estos procedimientos pueden realizarse usando una diversidad de kits disponibles en el mercado (Amersham Pharmacia Biotech, Promega y US Biochemical). Las moléculas indicadoras o marcadores adecuados que pueden usarse para facilitar la detección incluyen radionúclidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores y/o partículas magnéticas.

Las células hospedadoras transformadas con una secuencia de ácido nucleico que codifican un polipéptido OS, tal como Spexina, pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. El polipéptido producido por una célula transformada puede secretarse o estar contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Los vectores de expresión que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido OS pueden diseñarse para contener secuencias señal que dirigen la secreción de moléculas polipeptídicas solubles codificadas por un gen OS tal como Spexina, o una variante del mismo, a través de una membrana celular procariota o eucariota, o que dirigen la inserción en membrana de una molécula polipeptídica unidad a membrana codificada por un gen OS o una variante del mismo.

También pueden usarse otras construcciones para unir una secuencia génica que codifica un polipéptido OS (por ejemplo, Spexina) con una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico que facilitaría la purificación de proteínas solubles. Dichos dominios facilitadores de purificación incluyen, pero sin limitación, péptidos quelantes metálicos tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Pueden

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ejemplo, exceso de grasa corporal, niveles de leptina en suero elevados, niveles de Spexina en suero reducidos o una combinación de los mismos. Dichos modelos animales pueden usarse como sustratos de ensayo para la identificación de fármacos, productos farmacéuticos, terapias e intervenciones que pueden ser eficaces en el tratamiento de la obesidad y trastornos asociados con la obesidad. Por ejemplo, pueden exponerse modelos animales a un compuesto, que se sospecha que muestra una capacidad para aliviar síntomas de obesidad y trastornos asociados con la obesidad, por ejemplo, exceso de grasa corporal, niveles de leptina en suero elevados, niveles de Spexina en suero reducidos, o una combinación de los mismos, a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para inducir dicho alivio de síntomas en los animales expuestos. La respuesta de los animales a la exposición puede supervisarse evaluando la inversión de exceso de grasa corporal, los niveles de leptina en suero elevados, o los niveles de Spexina en suero reducidos asociados con la obesidad y trastornos asociados con la obesidad.

También puede usarse un ensayo de explante de intestino para identificar agentes de ensayo que alivian síntomas de obesidad y trastornos asociados con la obesidad, por ejemplo, exceso de grasa corporal, niveles de leptina en suero elevados, niveles de Spexina en suero reducidos o una combinación de los mismos. De acuerdo con Mirabeau et al., ((2007) Genome Res., 17: 320-327), pueden recogerse tiras de músculos del fundus del estómago de ratas y montarse en un baño de órganos oxigenado, en el que pueden estirarse y exponerse a agentes bioactivos, actuando de este modo como un sistema de bioensayo útil. Al comienzo de cada experimento, se aplica cloruro de acetilcolina para conseguir una máxima contracción de control, y se registran las contracciones. En una realización, puede aplicarse un péptido de Spexina amidado sintético (NWTPQAMLYLKGAQ-amida [SEC ID Nº 32]; Primm; véase Mirabeau et al., (2007) Genome Res., 17: 320-327). Para identificar un agonista con propiedades similares a Spexina, por ejemplo, pueden aplicarse después dosis individuales de un agente de ensayo hasta que se obtienen respuestas reproducibles, si las hubiera. Para identificar un antagonista de Spexina, por ejemplo, pueden aplicarse después dosis individuales de un agente de ensayo hasta que se reduzcan las respuestas de Spexina inducidas en el ensayo de explante del intestino.

Los compuestos de ensayo o agentes de la invención comprenden péptidos (tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos o péptidos solubles), moléculas pequeñas (por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas e inorgánicas pequeñas), ácidos nucleicos (tales como ARNip o ARN antisentido), u otros agentes que pueden unirse con una molécula polipeptídica codificada por un gen OS (por ejemplo, Spexina) y/o tienen un efecto estimulante o inhibidor en la actividad biológica de una proteína codificada por un gen OS o su expresión (por ejemplo, Spexina). Se determinará después si los agentes de ensayo pueden promover la saciedad o pérdida de peso en un sujeto obeso

o un sujeto aquejado de un trastorno asociado con la obesidad, o si el agente de ensayo puede usarse en el tratamiento de obesidad o un trastorno asociado con la obesidad (por ejemplo, examinando si hay un cambio en un fenotipo de peso corporal, tal como una reducción en la masa de grasa corporal).

Como se usa en el presente documento, un “compuesto modulador de Spexina” se refiere a un compuesto que interacciona con el gen Spexina, o la proteína o el polipéptido Spexina, y modula su actividad y/o su expresión. El compuesto puede aumentar la actividad o expresión de una proteína Spexina. Por el contrario, el compuesto puede reducir la actividad o sobreexpresión de una proteína Spexina. El compuesto puede ser un agonista de Spexina o un antagonista de Spexina. Algunos ejemplos no limitantes de compuestos moduladores de Spexina incluyen péptidos (tales como fragmentos peptídicos que comprenden SEC ID Nº 1, o anticuerpos o fragmentos de los mismos), moléculas pequeñas (orgánicas o inorgánicas), y ácidos nucleicos (tales como ARNip o ARN antisentido específicos para un ácido nucleico que comprende SEC ID Nº 2). Los agonistas de Spexina pueden ser moléculas que, cuando se unen con Spexina o su receptor, aumentan o prolongan la actividad de la proteína Spexina. Los agonistas de Spexina pueden ser compuestos (por ejemplo, compuestos sintéticos u otros péptidos de origen natural) que inducen la misma actividad o una similar en comparación con Spexina. Los agonistas de Spexina incluyen, pero sin limitación, proteínas, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas o cualquier otra molécula que active la proteína Spexina. Los antagonistas de Spexina pueden ser moléculas que, cuando se unen con la proteína Spexina, reducen la cantidad o la duración de la actividad de Spexina. Los antagonistas incluyen proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, moléculas pequeñas o cualquier otra molécula que reduzca la actividad de la proteína Spexina.

“Modular” se refiere a un cambio en la actividad o expresión de un gen o proteína OS, tal como Spexina. Por ejemplo, la modulación puede provocar un aumento o una reducción de la actividad proteica, las características de unión o cualquier otra propiedad biológica, funcional o inmunológica de una proteína OS. En una realización, la proteína OS es Spexina.

En una realización, un compuesto modulador de Spexina puede ser un fragmento peptídico de la proteína Spexina que se une con la Spexina en sí misma. Por ejemplo, puede abarcar cualquier parte de al menos aproximadamente 8 aminoácidos consecutivos de SEC ID Nº 1. El fragmento puede comprender al menos aproximadamente 10 aminoácidos consecutivos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos consecutivos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos consecutivos, al menos aproximadamente 40 aminoácidos consecutivos, al menos aproximadamente 50 aminoácidos consecutivos, al menos aproximadamente 60 aminoácidos consecutivos, o al menos aproximadamente 75 aminoácidos consecutivos de SEC ID Nº 1. Los fragmentos incluyen todas las posibles longitudes de aminoácidos entre e incluyendo aproximadamente 8 y aproximadamente 100 aminoácidos, por ejemplo, longitudes entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 15 y

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aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 35 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 70 y aproximadamente 100 aminoácidos, entre aproximadamente 75 y aproximadamente 100 aminoácidos, o entre aproximadamente 80 y aproximadamente 100 aminoácidos. Estos fragmentos peptídicos pueden obtenerse comercialmente o sintetizarse mediante métodos de síntesis de fase líquida o fase sólida (Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, Inglaterra). Los fragmentos peptídicos de Spexina pueden aislarse de una fuente natural, obtenerse por ingeniería genética o prepararse de forma química. Estos métodos se conocen bien en la técnica.

Un compuesto modulador de Spexina puede ser una proteína tal como un anticuerpo (monoclonal, policlonal, humanizado, quimérico o completamente humano), o un fragmento de unión del mismo, dirigido contra un polipéptido codificado por el gen de Spexina. Un fragmento de anticuerpo puede estar en forma de un anticuerpo distinto de la forma de longitud completa e incluye partes o componentes que existen dentro de anticuerpos de longitud completa. Un fragmento de anticuerpo también puede ser un fragmento de anticuerpo que se ha modificado técnicamente. Los fragmentos de anticuerpo pueden incluir, pero sin limitación, Fv monocatenarios (scFv), diacuerpos, Fv, (Fab’)2, triacuerpos, Fc, Fab, CDR1, CDR2, CDR3, combinaciones de CDR, regiones variables, tetracuerpos, anticuerpos híbridos bifuncionales, regiones marco conservadas, regiones constantes y similares (véase, Maynard et al., (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). Los anticuerpos pueden obtenerse comercialmente, pueden generarse a medida, o pueden sintetizarse contra un antígeno de interés de acuerdo con métodos establecidos en la técnica (por ejemplo, véase Beck et al., Nat Rev Immunol. May 2010; 10 (5): 345-52; Chan et al., Nat Rev Immunol. May 2010; 10 (5): 301-16; y Kontermann, Curr Opin Mol Ther. Abr 2010; 12 (2): 176-83.

La inhibición de ARN que codifica un polipéptido codificado por un gen OS, por ejemplo, Spexina, puede modular eficazmente la expresión de un gen OS del que se transcribe ARN. Se seleccionan inhibidores del grupo que comprende: ARNip; ARN de interferencia o ARNi; ARNbc; ADN transcrito por ARN polimerasa III; ribozimas; y ácidos nucleicos antisentido, que pueden ser ARN, ADN o un ácido nucleico artificial.

Los oligonucleótidos antisentido, incluyendo ADN antisentido, ARN y moléculas de ADN/ARN, actúan para bloquear directamente la traducción de ARNm uniéndose con ARNm diana y evitando la traducción de proteínas. Por ejemplo, pueden sintetizarse oligonucleótidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarios de regiones únicas de la secuencia de ADN que codifica un polipéptido de Spexina, por ejemplo, por técnicas de fosfodiéster convencionales (Dallas et al., (2006) Med. Sci. Monit.12(4): RA67-74; Kalota et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:173-96; Lutzelburger et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:243-59). Las secuencias de nucleótidos antisentido incluyen, pero sin limitación: morfolinos, 2’-O-metil polinucleótidos, ADN, ARN y similares.

El ARNip comprende una estructura bicatenaria que contiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 pares de bases, por ejemplo de aproximadamente 21 a aproximadamente 25 pares de bases, y que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica o casi idéntica a un gen diana expresado o ARN dentro de la célula. El ARNip comprende una cadena de ARN con sentido y una cadena de ARN antisentido complementaria hibridadas entre sí por interacciones de formación de pares de bases de Watson-Crick convencionales. La cadena con sentido comprende una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una secuencia de ácido nucleico contenida dentro de la molécula de ARNmi diana. “Sustancialmente idéntica” a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana se refiere a una secuencia de ácido nucleico que difiere de la secuencia diana en aproximadamente 3 % o menos. Las cadenas con sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenarias complementarias, o pueden comprender una única molécula en la que dos partes complementarias forman pares de bases y se unen covalentemente por un área “en horquilla” monocatenaria. Véase también, McMnaus y Sharp (2002) Nat Rev Genetics, 3:737-47, y Sen y Blau (2006) FASEB J., 20:1293-99.

El ARNip puede ser ARN alterado que difiere de ARN de origen natural por la adición, supresión, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al extremo o los extremos del ARNip o a uno o más nucleótidos internos del ARNip, o modificaciones que hacen al ARNip resistente a la digestión por nucleasa, o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNip con desoxirribonucleótidos. Una o ambas cadenas del ARNip también pueden comprender un saliente 3’. Como se usa en el presente documento, un saliente 3’ se refiere a al menos un nucleótido desapareado que se extiende desde el extremo 3’ de una cadena de ARN bicatenaria. Por ejemplo, el ARNip puede comprender al menos un saliente 3’ de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) de longitud, o de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, o de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud,

o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena del ARNip puede comprender salientes 3’ de ácido ditimidílico ("TT") o ácido diuridílico ("uu").

Puede producirse ARNip de forma química o biológica, o puede expresarse a partir de un plásmido recombinante o vector viral (por ejemplo, véase patente de Estados Unidos n.º 7.294.504, patente de Estados Unidos n.º 7.148.342, y patente de Estados Unidos n.º 7.422.896. se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de

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se producen en paralelo en recipientes de reacción separados, identificándose y localizándose cada compuesto por su dirección espacial. Se proporcionan ejemplos de mezclas de síntesis en paralelo y métodos de síntesis en paralelo en Estados Unidos n.º de serie 08/177.497, presentado el 5 de enero de 1994 y su solicitud de patente publicada de PCT correspondiente WO95/18972, publicada el 13 de julio de 1995 y patentes de Estados Unidos n.º

5.712.171 concedida el 27 de enero de 1998 y su solicitud de patente publicada de PCT correspondiente WO96/22529.

Tratamiento de la obesidad y trastornos asociados con la obesidad

Se conocen en la técnica varios tratamientos de obesidad bien establecidos que varían de intervención no farmacéutica a farmacéutica. Las intervenciones no farmacéuticas incluyen, pero sin limitación, restricción dietética, ejercicio, tratamiento psiquiátrico y tratamientos quirúrgicos para reducir el consumo de alimentos (por ejemplo, cirugía bariátrica) o eliminar grasa (por ejemplo, liposucción). Las presentes intervenciones farmacológicas pueden inducir una pérdida de peso de entre 5 y 15 kg. Los supresores del apetito y agentes modificadores de nutrientes o gasto de energía son el principal centro de atención de la intervención farmacológica. Dexfenfluramina (Redux), sibutramina (Meridia), agonistas beta3-adrenérgicos, agentes adrenérgicos simpatomiméticos (tales como anfetaminas (dextroanfetamina)), fentermina, benzfetamina, fendimetrazina, mazindol, dietilpropión, fenilpropanolamina, inhibidores de la recaptación de serotonina (5-HT) (tales como sibutramina), y lipasas gastrointestinales (tales como orlistat) son ejemplos de dichas intervenciones farmacológicas. Véase también, Bays, (2004) Obesity Research 12 (8): 1197-1211, y Klonoff et al., J Diabetes Sci Technol. Sep 2008; 2 (5): 913-8. Sin embargo, si se detiene la medicación, pueden aparecer aumentos de peso renovados. Los tratamientos quirúrgicos son comparativamente exitosos, pero son complicados, caros y tienen riesgos significativos. Los tratamientos quirúrgicos se reservan para pacientes con obesidad extrema y/o con graves complicaciones médicas.

En una realización, se administra Spexina a un sujeto obeso para tratar la obesidad o un trastorno asociado con la obesidad. En otra realización, un polipéptido que comprende SEC ID Nº 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a un sujeto obeso para tratar la obesidad o un trastorno asociado con la obesidad. En una realización, se administra Spexina a un sujeto obeso o un sujeto aquejado de un trastorno asociado con la obesidad para promover la pérdida de peso en el sujeto. En otra realización, un polipéptido que comprende SEC ID Nº 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a un sujeto obeso o un sujeto aquejado de un trastorno asociado con la obesidad para promover la pérdida de peso en el sujeto. En una realización, se administra Spexina a un sujeto obeso o un sujeto aquejado de un trastorno asociado con la obesidad para promover la saciedad en el sujeto. En otra realización, se administra un polipéptido que comprende SEC ID Nº 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo a un sujeto obeso o un sujeto aquejado de un trastorno asociado con la obesidad para promover la saciedad en el sujeto

La Spexina, un polipéptido que comprende SEC ID Nº 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un agente de ensayo de la invención (por ejemplo, una molécula orgánica pequeña, una molécula inorgánica pequeña, un péptido soluble o un anticuerpo) pueden administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, una cantidad que es suficiente para tratar la obesidad o el trastorno asociado con la obesidad, tal como aliviando síntomas asociados con la obesidad o el trastorno asociado con la obesidad (por ejemplo, niveles de leptina elevados, niveles de Spexina reducidos y masa corporal aumentada) evitando o retardando la aparición de obesidad o el trastorno asociado con la obesidad y/o reduciendo también la gravedad o frecuencia de síntomas de obesidad o el trastorno asociado con la obesidad (por ejemplo, niveles de leptina elevados, niveles de Spexina reducidos y masa corporal aumentada).

La cantidad que será terapéuticamente eficaz en el tratamiento de un trastorno o una afección de un individuo particular dependerá de los síntomas y la gravedad de la enfermedad, y puede determinarse por técnicas clínicas convencionales. Pueden usarse también ensayos in vitro o in vivo para identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa para usar en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la obesidad o el trastorno asociado con la obesidad, y debería decidirse según el criterio de un practicante y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a dosis de sistemas de ensayo de modelos animales o in vitro, tal como un ratón db/db, un ratón ob/ob, o un modelo de ratón alimentado con dieta alta en grasas (por ejemplo el modelo de ratón con obesidad inducida por dieta (DIO)).

La Spexina es una hormona peptídica que tiene actividad biológica en el intestino pero está notablemente infraexpresada por grasa tanto omental como subcutánea en pacientes obesos (véase Ejemplos). En una realización, la Spexina es un factor de saciedad. La Spexina, o una molécula pequeña que actúa a través del mismo sistema de receptor/señalización, puede usarse para inhibir ansias alimentarias y regular el consumo calórico.

Un factor de saciedad es una señal de retroalimentación relacionada con el gasto de energía y el consumo de alimentos. Un factor de saciedad está implicado en la regulación del apetito, el consumo de alimentos, el consumo o gasto de energía, o actúa como una señal de saciedad. El factor de saciedad más estudiado hasta la fecha es la hormona leptina, que se sintetiza y se secreta predominantemente por células grasas. En una realización, la Spexina es un factor de saciedad. En una realización adicional, la Spexina como un factor de saciedad puede usarse para el tratamiento de obesidad. En otra realización, la Spexina puede ser una alternativa y/o un complemento a

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tratamientos quirúrgicos para reducir el consumo de alimentos (por ejemplo, cirugía bariátrica) o eliminar grasas (por ejemplo, liposucción).

Tratamiento de otros trastornos del peso corporal

La obesidad es el más prevalente de los trastornos de peso corporal. Otros trastornos de peso corporal, tales como anorexia nerviosa y bulimia nerviosa, también son graves riesgos para la salud. Además, dichos trastornos del peso corporal como anorexia, lipodistrofia y caquexia (debilitamiento) también son características prominentes de otras enfermedades tales como cáncer, fibrosis quística, tuberculosis, insuficiencia cardiaca congestiva y SIDA. Un aspecto de la invención proporciona un método para diagnosticar un trastorno de peso corporal en un sujeto. En una realización, el exceso de la producción de Spexina o Spexina en circulación es responsable de la anorexia nerviosa, u otros trastornos alimentarios. En una realización, el método para diagnosticar un trastorno de peso corporal en un sujeto humano comprende: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto y (b) detectar si hay o no una alteración en la expresión del gen de Spexina en el sujeto en comparación con un sujeto no aquejado de un trastorno del peso corporal.

El debilitamiento es un síndrome caracterizado por la pérdida de peso, atrofia muscular, fatiga, debilidad y pérdida significativa de apetito en un sujeto que no intenta activamente perder peso.

La lipodistrofia es una afección médica caracterizada por condiciones anómalas o degenerativas del tejido adiposo del cuerpo. Se caracteriza por una falta de leptina en circulación que puede conducir a osteosclerosis.

La Spexina puede desempeñar un papel en la patogénesis de, o el tratamiento de, lipodistrofia en pacientes infectados por VIH. Por lo tanto, los niveles en suero de Spexina pueden regularse en pacientes VIH+. En una realización, un antagonista de Spexina se administra a un sujeto para tratar la lipodistrofia. En otra realización, un polipéptido dirigido al aminoácido que comprende SEC ID Nº 1 (por ejemplo, un anticuerpo de Spexina) se administra a un sujeto para tratar la lipodistrofia. En una realización, un antagonista de Spexina se administra a un sujeto o para promover el aumento de peso en el sujeto. En otra realización, un polipéptido dirigido al aminoácido que comprende SEC ID Nº 1 (por ejemplo, un anticuerpo de Spexina) se administra a un sujeto para promover el aumento de peso en el sujeto.

Los síntomas de estos trastornos del peso corporal caracterizados por un fenotipo de peso corporal menor de lo normal (por ejemplo, caquexia o lipodistrofia) pueden aliviarse reduciendo el nivel de expresión del gen de Spexina y/o actividad del producto génico de Spexina. Por ejemplo, pueden utilizarse secuencias génicas de Spexina (por ejemplo, SEC ID Nº 2) junto con un método antisentido, de “supresión” génica, de ribozimas y/o de ARNip para reducir el nivel de la expresión génica de Spexina. En una realización, un anticuerpo dirigido a la proteína Spexina puede neutralizar la actividad de Spexina por medio de la unión con la proteína Spexina.

Administración y dosificación

Puede administrarse Spexina o un compuesto modulador de Spexina al sujeto una vez (por ejemplo, como una única inyección o deposición). Como alternativa, puede administrarse Spexina o un compuesto modulador de Spexina de la invención una vez o dos veces al día a un sujeto que lo necesite durante un periodo de aproximadamente 2 a aproximadamente 28 días, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 10 días, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 días. También puede administrarse una vez o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 veces al año, o una combinación de los mismos. Además, puede coadministrarse Spexina o un compuesto modulador de Spexina con otro producto terapéutico, tal como dexfenfluramina (Redux), sibutramina (Meridia), un agonista beta3-adrenérgico, un agente adrenérgico simpatomimético (tal como anfetaminas (dextroanfetamina)), fentermina, benzfetamina, fendimetrazina, mazindol, dietilpropión, fenilpropanolamina, un inhibidor de la recaptación de serotonina (5-HT) (tal como sibutramina), una lipasa gastrointestinal (tal como orlistat), un factor de saciedad o una combinación de los mismos.

La Spexina o un compuesto modulador de Spexina de la invención pueden administrase a un sujeto por cualquier medio adecuado para suministrar Spexina o un compuesto modulador de Spexina a células del sujeto, tales como células adiposas omentales o células adiposas subcutáneas. Por ejemplo, puede administrarse Spexina o un compuesto modulador de Spexina por métodos adecuados para transfectar células. Se conocen en la técnica métodos de transfección para células eucariotas, e incluyen inyección directa del ácido nucleico al núcleo o pronúcleo de una célula; electroporación; trasferencia de liposomas o transferencia mediada por materiales lipófilos; suministro de ácidos nucleicos mediado por receptor, biobalística o aceleración de partículas; precipitación con fosfato cálcico o transfección mediada por vectores virales. Las composiciones de la presente invención pueden formularse y administrarse para reducir los síntomas asociados con obesidad o un trastorno asociado con la obesidad por cualquier medio que produzca contacto del principio activo con el sitio de acción del agente en el cuerpo de un sujeto humano o no humano. Pueden administrarse por cualquier medio convencional disponible para su uso junto con productos farmacéuticos, bien como principios activos terapéuticos individuales o en una combinación de principios activos terapéuticos. Pueden administrarse

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Resultados

Identificación de Ch12; orf39 (Spexina) como significativamente infraexpresados en grasa de sujetos obesos. El punto de datos de tenomodulina se identifica para validar el conjunto de datos, ya que se presentó recientemente

5 que este gen estaba sobreexpresado en muestras de grasa de sujetos obesos (Figura 1; Tolppanen, 2007; Saki, 2009). Otro biomarcador es quitinasa, que indica activación de macrófagos, lo que refleja un estado inflamatorio que se conoce bien en la obesidad (Figura 1). Tanto Spexina como anhidrasa carbónica III están significativamente sobreexpresadas en grasa normal en comparación con grasa de sujetos obesos (Figura 1).

10 Ch12;orS9 es un péptido recién identificado con actividad GI (Mirabeau, 2007; Rucinski, 2010), y un factor de saciedad potencial que está infraexpresado en grasa de sujetos obesos (Figura 1).

La Tabla 1 a continuación representa datos de expresión de ARNm para Spexina.

15 Tabla 1. Datos de expresión de ARNm de Spexina, muestra a muestra Grupo Condición N Media ETM ETM/Media

1 obeso 12 1,6869 +/-0,4284 25,4 %

2 normal 8 24,9532 +/-5,2260 20,9 %

• Por diana

Expresión normalizada con Grupo Muestra respecto a la mediana Obeso Subcu 2,1212

Obeso Subcu 5,5443 Obeso Subcu 1,8812 Obeso Subcu 1,2796 Obeso Omental 0,4901 Obeso Subcu 1,5738 Obeso Omental 0,2394 Obeso Omental 2,6547 Obeso Omental 2,6115 Obeso Omental 0,6285 Obeso Omental 0,3092 Obeso Omental 0,9090 normal Subcu -1-22,1529 normal Subcu -2-45,3350 normal Subcu -3-16,7751 normal Subcu -4-29,0327 normal Omental -1-19,6793 normal Omental -2-8,5981 normal Omental -3-10,3961 normal Omental -4-47,6567

De todos los genes que están infraexpresados en grasa de sujetos obesos, la Spexina demuestra el mayor factor de 20 cambio entre muestras de sujetos obesos (1,687) y normales (24,95) (p<0,00292) (Figura 2, Tabla 2).

Tabla 2. Datos de expresión de ARNm de Spexina, muestra a muestra (valores normalizados con respecto a la mediana para cada muestra clasificada por grupo [obesos frente a normales]). Análisis estadístico por ensayo de T de dos colas, suponiendo una varianza desigual en los dos conjuntos de muestras (p= 0,00292).

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Obeso: Normal

2,1212: 22,1529

5,5443: 42,335

1,8812: 16,7751

1,2796: 29,0327

0,4901: 19,6793

1,5738: 8,5981

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Obeso: Normal

0,2394: 10,3961

2,6547: 47,6567

2,6115

0,6285

0,3092

0,909

1,686875: 24,95324

La Spexina es un péptido recién identificado con actividad GI. Mirabeau et al. (2007) fue el primer informe que describía Spexina, y usaron análisis de modelización de Markov basándose en características comunes con las hormonas peptídicas, para encontrar nuevas en secuencias del proteoma humano. Una de las hormonas que

5 identificaron fue la Spexina, que demostró actividad contráctil en un ensayo de explante de estómago de rata, lo que indica una actividad biológica. La Spexina se secreta. Wan et al. (2010) describieron secreción sensible a brefeldina A (BFA) de Spexina de células transfectadas, lo que indica un mecanismo dependiente del Golgi, y que presenta un papel en la función biológica de la placenta. La Spexina está conservada entre diversas especies como se indica en el alineamiento de múltiples secuencias de homólogos de Spexina mostrado en la Figura 3.

10 Referencias

1: Mirabeau O, Perlas E, Severini C, Audero E, Gascuel O, Possenti R, Birney E, Rosenthal N, Gross C. Identification of novel peptide hormones in the human proteome by hidden Markov model screening. Genome Res.

15 Mar 2007; 17 (3):320-7. Epub 6 Feb 2007 .

2: Rucinski M, Porzionato A, Ziolkowska A, Szyszka M, Macchi V, De Caro R, Malendowicz LK. Expression of the spexin gene in the rat adrenal gland and evidences indicating that spexin inhibits adrenocortical cell proliferation. Peptides. 4 Ene 2010.

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3: Saiki A, Olsson M, Jernas M, Gummesson A, McTernan PG, Andersson J, Jacobson P, Sjöholm K, Olsson B, Yamamura S, Walley A, Froguel P, Carlsson B, Sjöström L, Svensson PA, Carlsson LM. Tenomodulin is highly expressed in adipose tissue, increased in obesity, and down-regulated during diet-induced weight loss. J Clin Endocrinol Metab. Oct 2009; 94 (10): 3987-94.

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4: Tolppanen AM, Pulkkinen L, Kolehmainen M, Schwab U, Lindström J, Tuomilehto J, Uusitupa M; Finnish Diabetes Prevention Study Group. Tenomodulin is associated with obesity and diabetes risk: the Finnish diabetes prevention study. Obesity (Silver Spring). May 2007; 15 (5): 1082-8.

30 Ejemplo 2 – EXPRESIÓN DE SPEXINA EN MUESTRAS DE SUERO DE SUJETOS OBESOS Y NORMALES

El ejemplo 1 analiza la infraexpresión significativa de Spexina en muestras de grasa omental y subcutánea de pacientes obesos. Por lo tanto, se decidió ensayar Spexina en muestras de suero de pacientes con peso normal y obesos, para ver si las diferencias en la expresión génica en grasa de sujetos obesos daba como resultado

35 diferencias significativas en los niveles de Spexina en circulación. También se midieron los niveles de leptina ya que se sabe que la leptina es una adipocina en circulación que está elevada en el estado obeso. Sin quedar ligado a la teoría, la Spexina y Leptina en circulación pueden ser hormonas/adipocinas “antagonistas” que están implicadas en la regulación de la saciedad, el consumo de alimentos y el peso corporal.

40 Muestras de suero: se ensayaron muestras de suero de 7 pacientes humanos mujeres de peso normal y 7 obesas en estos estudios iniciales.

Ensayo de Spexina: se ensayaron los niveles de Spexina en circulación en suero usando el kit de EIA de Spexina / NPQ (humano, de ratón, bovino) de Phoenix Pharmaceuticals, Inc, n.º de catálogo EK-023-81, Lote n.º 601716. Este

45 kit mide lo que se cree que es el péptido bioactivo, procesado:

Asn-Trp-Thr-Pro-Gln-Ala-Met-Leu-Tyr-Leu-Lys-Gly-Ala-Gln-NH2 (SEC ID Nº 3)

No se ha confirmado la naturaleza (secuencia primaria y estructura) de Spexina en circulación en suero humano, ni

50 se ha presentado en ninguna bibliografía hasta la fecha. El ensayo usado se ha diseñado para detectar el péptido SEC ID Nº 3.

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