ES2564552T3 - Protección, restablecimiento y potenciación de células, tejidos y órganos sensibles a eritropoyetina - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica que comprende una eritropoyetina no eritropoyética modificada y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en la protección, potenciación o restablecimiento de la función o viabilidad de un tejido de mamífero neuronal sensible a eritropoyetina que comprende células sensibles a eritropoyetina, en la que dicha eritropoyetina modificada tiene al menos una de las siguientes modificaciones: - 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 restos de ácido siálico; o - uno o más residuos de lisina carbamilada y/o una carbamilación del grupo amino N-terminal.

Description

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promover, potenciar, regenerar, o de cualquier otro modo beneficiar, mediante la exposición a una eritropoyetina. Los ejemplos no limitantes de dichas células incluyen células neuronales, retinianas, musculares, de corazón, pulmón, hígado, riñón, intestino delgado, corteza suprarrenal, médula suprarrenal, endotelio capilar, testículos, ovario y endometrio. Además, dichas células sensibles a eritropoyetina y los beneficios proporcionados a las mismas por una eritropoyetina se pueden extender para indirectamente proporcionar protección o potenciación a otras células que directamente no son sensibles a eritropoyetina, o de tejidos u órganos que contienen dichas células no sensibles a eritropoyetina. Estas otras células, o tejidos u órganos que indirectamente se benefician de la potenciación de células sensibles a eritropoyetina están presentes como parte de las células, tejido u órgano como células, tejidos y órganos “asociados”. Por tanto, los beneficios de una eritropoyetina como se describe en el presente documento se pueden proporcionar como resultado de la presencia de un pequeño número o proporción de células sensibles a eritropoyetina en un tejido u órgano, por ejemplo, tejido excitable o neuronal presente en dicho tejido, o las células de Leydig del testículo, que fabrican testosterona. En un aspecto, la célula sensible a eritropoyetina o sus células, tejidos, u órganos asociados no son células, tejidos u órganos excitables o no comprenden predominantemente células o tejidos excitables.

Los procedimientos de la invención proporcionan la protección o potenciación sistémica o local de células, tejidos y órganos dentro de un cuerpo de mamífero, en una amplia variedad de afecciones normales y adversas, o protección de aquellas que están destinadas a la reubicación a otro cuerpo de mamífero. Además, también se proporciona el restablecimiento o regeneración de la disfunción. Como se menciona anteriormente, la capacidad de una eritropoyetina para atravesar una barrera ocluyente de células endoteliales y ejercer sus efectos positivos sobre células sensibles a eritropoyetina (así como otros tipos de células) distales con respecto a la vasculatura ofrece un potencial para prevenir, así como tratar, una amplia variedad de afecciones y enfermedades que de otro modo provocan un daño celular y tisular significativo en un animal, incluyendo humano, y, además, posibilitan el éxito de procedimientos quirúrgicos que no se han podido probar hasta el momento para los que tradicionalmente el riesgo supera a los beneficios. La duración y el grado de afecciones adversas intencionadas inducidas para el beneficio final, tales como quimioterapia en dosis altas, radioterapia, supervivencia al trasplante ex vivo prolongada, y períodos prolongados de isquemia quirúrgicamente inducida, se pueden llevar a cabo aprovechando la invención en el presente documento. Sin embargo, la invención no está limitada a eso, sino que incluye, como un aspecto, los procedimientos o composiciones en las que las células sensibles a eritropoyetina objetivo son distales con respecto a la vasculatura en virtud de una barrera de células endoteliales o uniones ocluyentes endoteliales. En general, la invención está dirigida a cualquier célula sensible a eritropoyetina y células, tejidos y órganos asociados que se pueden beneficiar de la exposición a una eritropoyetina. Además, se puede restablecer o regenerar la disfunción celular, de tejidos u órganos después de un acontecimiento adverso agudo (tal como un traumatismo) por exposición a una eritropoyetina.

Por tanto, la invención está dirigida, en general, al uso de las eritropoyetinas modificadas para la preparación de composiciones farmacéuticas para los propósitos mencionados anteriormente en que se promueve, potencia, regenera, o de cualquier otro modo beneficia, la función celular. La invención también está dirigida a procedimientos para potenciar, promover o regenerar la función celular administrando a un mamífero una cantidad eficaz de una eritropoyetina como se describe en el presente documento. La invención además está dirigida a procedimientos para promocionar, potenciar o regenerar la función celular ex vivo exponiendo células, un tejido o un órgano a una eritropoyetina. La invención también está dirigida a una composición de perfundido que comprende una eritropoyetina modificada para su uso en la conservación de órganos o tejidos.

Los varios procedimientos de la invención utilizan una composición farmacéutica que incluye al menos dicha eritropoyetina en una cantidad eficaz para la vía particular y duración de exposición para ejercer efectos positivos o beneficios sobre células sensibles a eritropoyetina dentro o retiradas de un cuerpo de mamífero. Cuando la célula, tejidos u órganos objetivo del tratamiento destinado requieren que la eritropoyetina atraviese una barrera de células endoteliales, la composición farmacéutica incluye la eritropoyetina en una concentración que, después de atravesar la barrera de células endoteliales, puede ejercer sus efectos deseables sobre las células sensibles a eritropoyetina. Las moléculas que pueden interaccionar con el receptor de eritropoyetina y modular la actividad del receptor, denominadas en el presente documento moduladores de la actividad del receptor de eritropoyetina o eritropoyetina, son útiles en el contexto de la presente invención. Estas moléculas pueden ser, por ejemplo, formas de origen natural, sintéticas o recombinantes de moléculas de eritropoyetina, como se describe anteriormente, u otras moléculas que no necesariamente se asemejan a eritropoyetina de ninguna manera, excepto para modular la actividad de células sensibles a eritropoyetina, como se describe en el presente documento.

La eritropoyetina es una hormona glucoproteica que en los seres humanos tiene un peso molecular de aproximadamente 34 kDa. La proteína madura comprende 165 aminoácidos, y los residuos de glucosilo comprenden aproximadamente un 40 % del peso de la molécula. Las formas de eritropoyetina útiles en la práctica de la presente invención engloban las eritropoyetinas modificadas definidas anteriormente. Además, las formas de eritropoyetina útiles en la práctica de la presente invención incluyen proteínas que representan productos génicos funcionalmente equivalentes. Dicho producto génico de eritropoyetina equivalente incluye eritropoyetinas mutantes, que pueden contener deleciones, incluyendo deleciones internas, adiciones, incluyendo adiciones que dan lugar a proteínas de fusión, o sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos en y/o adyacentes a la secuencia de aminoácidos, pero que dan como resultado un cambio "inactivo", en que el cambio produce una eritropoyetina

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siálico (2) grupos carboxilato o (3) grupos amino.

En otro modo de realización preferente, se puede hacer reaccionar la lisina con un aldehído o azúcar reductor para formar una imina, que se puede estabilizar por reducción como con cianoborohidruro de sodio para formar una lisina N-alquilada tal como glucitolillisina, o que en el caso de azúcares reductores se puede estabilizar por reordenamiento de Amadori o Heyns para formar un alfa-desoxi-alfa-aminoazúcar tal como alfa-desoxi-alfafructosillisina. Como ejemplo, se describe la preparación de una proteína modificada con fructosillisina por incubación con glucosa 0,5 M en tampón fosfato de sodio a pH 7,4 durante 60 días por Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:5133-5138. En otro ejemplo, se puede carbamilar el grupo lisina, tal como en virtud de la reacción con ion cianato, o se puede alquil-o arilcarbamilar o -tiocarbamilar con un alquil-o arilisocianato o -isotiocianato, o se puede acilar por un derivado de ácido alquil-o arilcarboxilico reactivo, tal como por reacción con anhídrido acético o anhídrido succínico o anhídrido ftálico. Son ejemplares la modificación de grupos lisina con 4-sulfofenilisotiocianato o con anhídrido acético, ambos como se describe en Gao et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91(25): 12027-30. Los grupos lisina también se pueden modificar con trinitrofenilo por reacción con ácido trinitrobencenosulfónico o preferentemente sus sales. Dichos procedimientos se describen a continuación en el ejemplo 5.

Se puede modificar al menos un residuo de tirosina de una eritropoyetina en una posición de anillo aromático por un reactivo electrófilo, tal como por nitración o yodación. A modo de ejemplo no limitante, se puede hacer reaccionar la eritropoyetina con tetranitrometano (Nestler et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(12):7316-21; o se puede yodar como se describe en el ejemplo 5.

Se puede modificar al menos un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico de una eritropoyetina, tal como por reacción con una carbodiimida seguido de reacción con una amina tal como pero sin limitarse a glicinamida. Se pueden encontrar ejemplos de dichas modificaciones en el ejemplo 5.

En otro ejemplo, se puede modificar un residuo de triptófano de una eritropoyetina, tal como por reacción con nbromosuccinimida o n-clorosuccinimida, siguiendo procedimientos tales como se describe en Josse et al., Chem Biol Interact 1999, 14 mayo;119-120.

Aún en otro ejemplo, se puede preparar una molécula de eritropoyetina retirando al menos un grupo amino, esto se puede lograr por reacción con ninhidrina seguido de reducción del grupo carbonilo posterior por reacción con borohidruro.

Aún en otro ejemplo, se proporciona una eritropoyetina que tiene al menos una abertura de al menos uno de los enlaces cistina en la molécula de eritropoyetina por reacción con un agente reductor tal como ditiotreitol, seguido de reacción de los sulfhidrilos posteriores con yodoacetamida, ácido yodoacético u otro electrófilo para evitar la reformación de los enlaces disulfuro.

Se proporciona una eritropoyetina que tiene al menos una sustitución de uno cualquiera de varios aminoácidos, tales como una leucina, con al menos uno de los residuos de lisina, arginina, triptófano, tirosina o cisteína de eritropoyetina, usando técnicas de biología molecular.

Se puede preparar una eritropoyetina modificada sometiendo una eritropoyetina a una proteolisis química limitada que se dirige a residuos específicos, por ejemplo, para escindir después de los residuos de triptófano. Dichos fragmentos de eritropoyetina resultantes se abarcan en el presente documento.

Como se destaca anteriormente, una eritropoyetina útil para los propósitos en el presente documento puede tener al menos una de las modificaciones mencionadas anteriormente, pero puede tener más de una de las modificaciones anteriores. A modo de ejemplo de una eritropoyetina modificada con una modificación para la parte de hidratos de carbono de la molécula y una modificación para la parte de aminoácidos, una eritropoyetina modificada puede ser asialoeritropoyetina y tener sus residuos de lisina biotinilados o carbamilados.

Por tanto, se abarcan diversas moléculas de eritropoyetina y composiciones farmacéuticas que las contienen para los usos descritos en el presente documento. Dichas moléculas de eritropoyetina incluyen, pero no se limitan a, asialoeritropoyetina, eritropoyetina N-desglucosilailada, eritropoyetina O-desglucosilada, eritropoyetina con una reducción en el contenido en hidratos de carbono, eritropoyetina con patrones de glucosilación alterados, eritropoyetina con hidratos de carbono oxidados y después reducidos, eritropoyetina modificada con arilglioxal, eritropoyetina modificada con alquilglioxal, eritropoyetina modificada con 2,3-butanodiona, eritropoyetina modificada con ciclohexanodiona, eritropoyetina biotinilada, lisileritropoyetina N-alquilada, glucitolillisinaeritropoyetina, alfadesoxi-alfa-fructosillisina-eritropoyetina, eritropoyetina carbamilada, eritropoyetina acetilada, eritropoyetina succinilada, alfa-carboxialquileritropoyetina, eritropoyetina nitrada, eritropoyetina yodada, por nombrar algunos ejemplos representativos aunque no limitantes en base a las enseñanzas en el presente documento. Son preferentes las formas modificadas mencionadas anteriormente a base de eritropoyetina humana.

Además, varias de las eritropoyetinas mencionadas anteriormente son nuevas, y la invención se refiere a dichos compuestos así como a composiciones farmacéuticas que los comprenden. Dichas nuevas eritropoyetinas incluyen

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alcoholismo, autismo, isquemia retiniana, glaucoma, trastornos de función autónoma tales como hipertensión y trastornos del sueño, y trastornos neuropsiquiátricos que incluyen, pero no se limitan a esquizofrenia, trastorno esquizoafectivo, trastorno por déficit de atención, trastorno distímico, trastorno depresivo grave, manía, trastorno obsesivo-compulsivo, trastornos por consumo de sustancias psicoactivas, ansiedad, trastorno de angustia, así como

5 trastornos afectivos unipolares y bipolares. Trastornos neuropsiquiátricos y neurodegenerativos adicionales incluyen, por ejemplo, los enumerados en el Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales (Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders, DSM) de la Asociación estadounidense de psiquiatría, de la que su versión más actual se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

10 En otro modo de realización, se pueden usar moléculas de toxinas quiméricas recombinantes que comprenden eritropoyetina para la administración terapéutica de toxinas para tratar un trastorno proliferativo, tal como cáncer, o trastorno vírico, tal como panencefalitis esclerosante subaguda.

La siguiente tabla recoge indicaciones no limitantes ejemplares adicionales, para las diversas afecciones y 15 enfermedades que se pueden tratar por las eritropoyetinas mencionadas anteriormente.

Célula, tejido uórgano

Disfunción o patología Afección o enfermedad Tipo

Corazón

Isquemia Arteriopatía coronaria Aguda, crónica Estable, inestable

Infarto de infarto

Síndrome de Dressler

Angina

Cardiopatía congénita

Valvular Miocardiopatía

Angina de Prinzmetal

Rotura cardíaca

Aneurismática Perforación septal

Vasculitis

Arritmia

Taquicardia, Bradiarritmia Supraventricular, ventricular Anomalías en la conducción Estable, inestable Nodo sinusal carotídeo hipersensible

Insuficiencia cardíaca congestiva

Izquierda, derecha, biventricular Miocardiopatías, tales como idiopática familiar, infecciosa, metabólica, tesaurismosis, deficiencias, trastorno del tejido conjuntivo, infiltración y granulomas, neurovascular

Miocarditis

Autoinmunitario, infeccioso, idiopático

Cardiopatía pulmonar

Traumatismo cerrado y penetrante

Toxinas

Cocaína

Vascular

Hipertensión Primaria, secundaria

Enfermedad por descompresión

Hiperplasia fibromuscular

Aneurisma

Disecante, roto, en crecimiento

Pulmones

Obstructiva Asma Bronquitis crónica, Enfisema y obstrucción de las vías aéreas

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Célula, tejido uórgano

Disfunción o patología Afección o enfermedad Tipo

Neumopatía isquémica

Embolia pulmonar, Trombosis pulmonar, Embolia grasa

Neumopatía ambiental

Neumopatía isquémica

Embolia pulmonar, Trombosis pulmonar

Neumopatía intersticial

Fibrosis pulmonar idiopática

Congénita

Fibrosis quística

Cardiopatía pulmonar

Traumatismo

Neumonía y neumonitis

Infecciosa, parasitaria, tóxica, traumática, quemadura, aspirativa

Sarcoidosis

Páncreas

Endocrina Diabetes mellitus, tipo I y II Insuficiencia de células beta, disfunción, Neuropatía diabética

Otra insuficiencia celular endocrina del páncreas

Exocrina

Insuficiencia pancreática exocrina pancreatitis

Hueso

Osteopenia Primaria secundaria Hipogonadismo inmovilización

Posmenopáusica Senil Hiperparatiroidismo Hipertiroidismo Carencia de calcio, magnesio, fósforo y/o vitamina D

Osteomielitis

Necrosis avascular

Traumatismo

Enfermedad de Paget

Piel

Alopecia Areata Totalis Primaria Secundaria Calvicie masculina

Vitiligo

Localizada Generalizada Primaria Secundaria

Ulceración diabética

Vasculopatía periférica

Lesiones por quemadura

Trastornos autoinmunitarios

Lupus eritematoso, Sjiogren, Artritis reumatoide, Glomerulonefritis, Vasculitis

Histiocitosis de Langerhan

Ojo

Neuritis óptica

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Célula, tejido uórgano

Disfunción o patología Afección o enfermedad Tipo

Lesiones cerradas y penetrantes, infecciones, sarcoidosis, enfermedad drepanocítica, desprendimiento de retina, arteritis temporal

Trastornos embrionarios y fetales

Asfixia

Isquemia

SNC

Síndrome de fatiga crónica, síndrome hiposmolar y hiperosmolar agudo y crónico, demencia sídica, electrocución

Encefalitis

Rabia, herpes

Meningitis

Hematoma subdural

Tabaquismo

Drogadicción y abstinencia

Cocaína, heroína, crack, marihuana, LSD, PCP, politoxicomanía, éxtasis, opioides, sedantes hipnóticos, anfetaminas, cafeína

Trastornos obsesivo-compulsivos

Estenosis del conducto vertebral, Mielitis transversa, Guillian Barré, traumatismo, compresión del nervio raquídeo, compresión tumoral, termoplejía

ORL

Acúfenos, Síndrome de Meuniere, Pérdida auditiva

Lesión traumática, barotraumatismo

Riñón

Insuficiencia renal Aguda, crónica Enfermedad intersticial vascular/isquémica, nefropatía diabética, síndromes nefróticos, infecciones

Púrpura de Schoenlein Henoch

Músculo estriado

Trastornos autoinmunitarios Miastenia grave, Dermatomiositis, Polimiositis

Miopatías

Heredada metabólica, endocrina y tóxica

Termoplejía

Lesión por aplastamiento

Rabdomiólisis

Enfermedad mitocondrial

Infección

Fascitis necrosante

Disfunción sexual

Central y periférica Impotencia derivada de la medicación

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Célula, tejido uórgano

Disfunción o patología Afección o enfermedad Tipo

Hígado

hepatitis Vírica, bacteriana, parasitaria

Enfermedad isquémica

Cirrosis, esteatosis hepática

Enfermedades infiltrantes/metabólicas

Gastrointestinal

Enteropatía isquémica

Enteropatía inflamatoria

Enterocolitis necrosante

Trasplante de órganos

Tratamiento de donante y receptor

Aparato reproductor

Esterilidad Vascular Autoinmunitaria Anomalías uterinas Trastornos de implantación

Endocrino

Hiper-e hipofunción glandular

En consecuencia, la presente invención proporciona en general un tratamiento terapéutico o profiláctico de las consecuencias de traumatismo mecánico o de enfermedades humanas. Es preferente el tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o afecciones del SNC y/o sistema nervioso periférico. Se proporciona el tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o afecciones que tienen un componente psiquiátrico. Se proporciona el tratamiento terapéutico o profiláctico para enfermedades, trastornos o afecciones incluyendo, pero sin limitarse a las que tienen un componente oftálmico, cardiovascular, cardiopulmonar, respiratorio, renal, urinario, reproductivo, gastrointestinal, endocrino o metabólico.

En un modo de realización, una composición farmacéutica de este tipo de una eritropoyetina se puede administrar por vía sistémica para proteger o potenciar las células, tejido u órgano objetivo. Dicha administración puede ser por vía parenteral, por vía de inhalación, o por vía transmucosa, por ejemplo, por vía oral, por vía nasal, por vía rectal, por vía vaginal, por vía sublingual, por vía submucosa o por vía transdérmica. Preferentemente, la administración es parenteral, por ejemplo, por medio de inyección intravenosa o intraperitoneal, y también incluyendo, pero no se limita a, administración intraarterial, intramuscular, intradérmica y subcutánea.

Para otras vías de administración, tales como por el uso de un perfundido, inyección en un órgano, u otra administración local, una se puede proporcionar una composición farmacéutica que da como resultado niveles similares de una eritropoyetina como se describe anteriormente. Es preferente un nivel de aproximadamente 15 pM

– 30 nM.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un modo de realización específico, el término "farmacéuticamente aceptable" quiere decir aprobado por una agencia reguladora de la Administración federal o de un Estado o enumerado en la Farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea extranjera generalmente reconocida para su uso en animales, y más en particular, en seres humanos. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua y aceites, incluyendo los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Una solución salina es un vehículo preferente cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones de glicerol y dextrosa acuosas como vehículos líquidos, en particular para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. Se puede formular la composición en forma de supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. Los compuestos de la invención se pueden formular como formas neutras o de sal. Las sales

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En la práctica de un modo de realización de la invención, un paciente mamífero está sometido a quimioterapia sistémica para tratamiento del cáncer, incluyendo radioterapia, que normalmente tiene efectos adversos tales como daño nervioso, pulmonar, cardíaco, ovárico o testicular. La administración de una composición farmacéutica que comprende una eritropoyetina como se describe anteriormente se realiza antes de y durante la quimioterapia y/o radioterapia, para proteger los tejidos y órganos neuronales del daño por el agente quimioterápico, tal como para proteger los testículos. El tratamiento se puede continuar hasta que los niveles circulantes del agente quimioterápico hayan quedado por debajo de un nivel de daño potencial al cuerpo del mamífero.

En la práctica de otro modo de realización de la invención, se planea extraer varios órganos de un víctima de un accidente de automóvil para su trasplante a varios receptores, y de los que algunos requieren un transporte a una distancia y periodo de tiempo prolongados. Antes de la extracción de los órganos, se perfunde a la víctima con una composición farmacéutica que comprende una eritropoyetina como se describe en el presente documento. Se perfundieron los órganos extraídos para su envío con un perfundido que contenía eritropoyetina como se describe en el presente documento, y se almacenaron en un baño que comprendía eritropoyetina. Se perfundieron de forma continua determinados órganos con un dispositivo de perfusión pulsátil, utilizando un perfundido que contenía una eritropoyetina de acuerdo con la presente invención. Se produjo un deterioro mínimo de la función de los órganos durante el transporte y tras el implante y la revascularización de los órganos in situ.

En otro modo de realización de la invención, un procedimiento quirúrgico para reparar una válvula cardíaca requirió cardioplejía temporal y oclusión arterial. Antes de la intervención quirúrgica, se perfundió al paciente con 500 U de eritropoyetina por kg de peso corporal. Dicho tratamiento evitó el daño celular isquémico hipóxico, en particular después de la revascularización.

En otro modo de realización de la invención, en cualquier procedimiento quirúrgico, tal como en intervención con circulación extracorporal, se puede usar una eritropoyetina natural o cualquier eritropoyetina de la invención. En un modo de realización, la administración de una composición farmacéutica que comprende una eritropoyetina como se describe anteriormente se realiza antes de, durante, y/o después del procedimiento de derivación, para proteger la función del tejido neuronal cerebro, corazón, y otros órganos.

En los ejemplos anteriores en los que se usa una eritropoyetina de la invención, a saber dicha eritropoyetina modificada, para aplicaciones ex vivo, o para tratar células sensibles a eritropoyetina tales como tejido neuronal, la invención proporciona una composición farmacéutica en forma de unidad de dosificación adaptada para la protección o potenciación de células, tejidos u órganos sensibles a eritropoyetina alejados de la vasculatura que comprenden, por unidad de dosificación, una cantidad no tóxica eficaz dentro del intervalo de aproximadamente

50.000 a 500.000 Unidades, de 60.000 a 500.000 Unidades, de 70.000 a 500.000 Unidades, de 80.000 a 500.000 Unidades, de 90.000 a 500.000 Unidades, de 100.000 a 500.000 Unidades, de 150.000 a 500.000 Unidades, de

200.000 a 500.000 Unidades, de 250.000 a 500.000 Unidades, de 300.000 a 500.000 Unidades, de 350.000 a

500.000 Unidades, de 400.000 a 500.000 Unidades, o de 450.000 a 500.000 Unidades de dicha eritropoyetina, vehículo farmacéuticamente aceptable. En un modo de realización preferente, la cantidad no tóxica eficaz de eritropoyetina está dentro del intervalo de aproximadamente 50.000 a 500.000 Unidades. La eritropoyetina en la composición mencionada anteriormente no es eritropoyética.

En otro aspecto de la invención, se descubrió que la administración de eritropoyetina restablece la función cognitiva en animales que han sufrido traumatismo craneoencefálico. Después de un retraso de 5 días o 30 días, la administración de eritropoyetina todavía podía restablecer la función en comparación con animales del grupo quirúrgico de referencia, lo que indica la capacidad de una eritropoyetina para regenerar o restablecer la actividad cerebral. Por tanto, la invención también se refiere al uso de una eritropoyetina para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de traumatismo craneoencefálico y otras disfunciones cognitivas, incluyendo el tratamiento bien después de la lesión (por ejemplo, tres días, cinco días, una semana, un mes, o más). La invención también se refiere a un procedimiento para el tratamiento de la disfunción cognitiva después de lesión administrando una cantidad eficaz de una eritropoyetina. Se puede usar cualquier eritropoyetina como se describe en el presente documento para este aspecto de la invención.

Además, este aspecto restablecedor de la invención se refiere al uso de cualquiera de las eritropoyetinas en el presente documento para la preparación de una composición farmacéutica para el restablecimiento de disfunción neuronal celular, de tejido u órgano, en el que el tratamiento se inicia después de, y bien después de, la lesión inicial responsable de la disfunción. Además, el tratamiento usando eritropoyetinas de la invención puede abarcar la evolución de la enfermedad o afección durante la fase aguda, así como una fase crónica.

La eritropoyetina útil para los propósitos en el presente documento es no eritropoyética, es decir, puede ejercer las actividades descritas en el presente documento, pero sin provocar un incremento en la concentración de hemoglobina o hematocrito. Dicha forma no eritropoyética de eritropoyetina es preferente en casos en los que los procedimientos de la presente invención están destinados a proporcionarse de forma crónica. En otro modo de realización, se administra una eritropoyetina a una dosis mayor que la necesaria para como estimular de forma máximo la eritropoyesis. Como se destaca anteriormente, una eritropoyetina de la invención no tiene necesariamente actividad eritropoyética, y por lo tanto, las dosificaciones anteriores expresadas en unidades

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Obviamente, las diversas moléculas de eritropoyetina de la invención puede que no tengan grupos reactivos adecuados disponibles para su uso con determinados agentes de reticulación; sin embargo, un experto en la técnica será muy consciente de la elección de los agentes de reticulación en base a los grupos disponibles para reticulación en una eritropoyetina de la invención.

Cuando un grupo reactivo de una molécula heterobifuncional forma un enlace covalente con un grupo amino, el enlace covalente será normalmente un enlace amido o imido. El grupo reactivo que forma un enlace covalente con un grupo amino puede ser, por ejemplo, un grupo carboxilato activado, un grupo halocarbonilo, o un grupo éster. El grupo halocarbonilo preferente es un grupo clorocarbonilo. Los grupos éster son preferentemente grupos éster reactivos tales como, por ejemplo, un grupo éster N-hidroxisuccinimídico.

El otro grupo funcional típicamente es un grupo tiol, un grupo que se puede convertir en un grupo tiol, o un grupo que forma un enlace covalente con un grupo tiol. El enlace covalente será normalmente un enlace tioéter o un disulfuro. El grupo reactivo que forma un enlace covalente con un grupo tiol puede ser, por ejemplo, un doble enlace que reacciona con grupos tiol o un disulfuro activado. Un grupo reactivo que contiene un doble enlace que puede reaccionar con un grupo tiol es el grupo maleimido, aunque también son posibles otros, tales como acrilonitrilo. Un grupo disulfuro reactivo puede ser, por ejemplo, un grupo 2-piridilditio o un grupo ácido 5,5'-ditio-bis-(2nitrobenzoico). Algunos ejemplos de reactivos heterobifuncionales que contienen enlaces disulfuro reactivos incluyen 3-(2-piridil-ditio)propionato de N-succinimidilo (Carlsson, et al., 1978, Biochem J., 173:723-737), S-4succinimidiloxicarbonil-alfa-metilbenciltiosulfato de sodio, y 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-(2-piridilditio)tolueno. Es preferente 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo. Algunos ejemplos de reactivos heterobifuncionales que comprenden grupos reactivos que tienen un doble enlace que reacciona con un grupo tiol incluyen 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo y m-maleimidobenzoato de succinimidilo.

Otras moléculas heterobifuncionales incluyen 3-(maleimido)propionato de succinimidilo, 4-(p-maleimido-fenil)butirato de sulfosuccinimidilo, 4-(N-maleimidometil-ciclohexano)-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, éster maleimidobenzoilN-hidroxi-succinimidínico. Es preferente la sal de sulfonato de sodio de m-maleimidobenzoato de succinimidilo. Muchos de los reactivos heterobifuncionales mencionados anteriormente y sus sales de sulfonato están disponibles de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois USA.

La necesidad de que el conjugado descrito anteriormente sea reversible o lábil se puede determinar fácilmente por el experto en la técnica. Se puede someter a prueba un conjugado in vitro para determinar tanto la eritropoyetina como la actividad farmacológica deseable. Si el conjugado mantiene ambas propiedades, a continuación se puede someter a prueba su idoneidad in vivo. Si la molécula de conjugado requiere la separación de la eritropoyetina para determinar la actividad, será preferente un enlace lábil o asociación reversible con eritropoyetina. Las características de labilidad también se pueden someter a prueba usando procedimientos in vitro estándar antes de la prueba in vivo.

Se puede obtener información adicional sobre cómo fabricar y usar estos así como otros reactivos polifuncionales de las siguientes publicaciones u otras disponibles en la técnica:

Carlsson, J. et al., 1978, Biochem. J. 173:723-737.

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