ES2564785T3 - Agonistas del receptor beta 2-adrenérgico para su uso en el tratamiento de cicatrices queloides e hipertróficas - Google Patents

Abstract

Un agonista del receptor ß2-adrenergico para su uso en la reduccion de la formacion de una cicatriz queloide o de una cicatriz hipertrofica.

Description

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DESCRIPCION

Agonistas del receptor beta 2-adrenergico para su uso en el tratamiento de cicatrices queloides e hipertroficas

En el presente documento se describen composiciones farmaceuticas, medicamentos y metodos de tratamiento para su uso para modificar de forma simultanea la cantidad de TGFp1 y TGFp3 que produce un fibroblasto, y para modificar la funcion, actividad y diferenciacion fibroblastica. La invencion se refiere a la reduccion o prevention de la formation de cicatrices. En el presente documento tambien se describen composiciones, medicamentos y metodos para su uso en el tratamiento de trastornos fibroticos, para su uso en la modification del deposito de colageno, y para su uso en el tratamiento de arrugas en la piel. El alcance de la invencion es como se indica en las reivindicaciones.

Los fibroblastos estan implicados en muchos procesos en el cuerpo. La cicatrization de heridas es un proceso complejo que necesita la activation combinada de numerosos procesos que incluyen la modulation de la actividad fibroblastica. Durante el proceso de cicatrizacion de la herida, los fibroblastos dermicos migran al lecho de la herida en el cual el Factor de Crecimiento Transformante 1 (TGF-p1) de la herida secretado por celulas, las moleculas de la matriz (por ejemplo una variante de corte y empalme de la fibronectina) y los estimulos mecanicos (es decir tension de la matriz) de la herida, inician su diferenciacion en miofibroblastos. Los miofibroblastos se pueden distinguir de los fibroblastos de la dermis porque expresan a-actina de musculo liso, contienen haces de microfilamentos contractiles, y tienen extensos sitios de union de la celula a la matriz. Los miofibroblastos sintetizan, depositan y remodelan la matriz extracelular para formar tejido fibroso, y de este modo contraen la herida. El tejido conectivo que se forma durante el proceso de curacion a menudo es de naturaleza fibrosa, y normalmente forma una cicatriz de tejido conectivo mediante un proceso conocido como fibrosis.

En el embrion, los procesos de curacion se activan y se detienen para regenerar perfectamente el tejido, y por lo tanto la cicatrizacion podria no producirse. Sin embargo, en el adulto, la evolution ha optimizado los procesos de cicatrizacion de heridas para conseguir el cierre rapido de la herida, lo que minimiza el riesgo de infection pero da como resultado la formacion de la cicatriz. Vistas macroscopicamente, las cicatrices pueden estar hundidas por debajo de la superficie del tejido circundante, o elevadas por encima de la superficie de la piel no danada. Las cicatrices pueden ser de color relativamente mas oscuro que el tejido no lesionado (hiperpigmentacion) o puede tener un color mas palido (hipopigmentacion) que las inmediaciones. Tanto las cicatrices hiperpigmentadas como las hipopigmentadas constituyen un defecto cosmetico facilmente observable, y 100 millones de pacientes desarrollan cicatrices de heridas cada ano a partir de operaciones optativas, traumatismo, lesiones por quemaduras y queloides. Se ha demostrado que el aspecto cosmetico de una herida es uno de los principales factores que contribuyen al impacto psicologico de las heridas sobre el que las sufre, y que estos efectos pueden permanecer durante un largo tiempo despues de que la propia herida se haya curado.

La actividad excesiva de los miofibroblastos tambien produce las deformaciones tisulares que son caracteristicas de las enfermedades fibroticas. Por consiguiente, se piensa los agentes que podrian disminuir la migration, proliferation o diferenciacion fibroblastica que reducen la cicatrizacion y la fibrosis de las heridas. Ademas, tambien se ha demostrado que diversos tratamientos que aceleran la reparation de las heridas disminuyen la fibrosis y la cicatrizacion (Ha et al. (2003) Chin Med J (Engl) 116, 1029-33; Huang et al. (2002) Faseb J 16, 1269-70; Rodgers et al. (2003) J Invest Dermatol 127, 526-37).

La prosecution de la curacion sin cicatrices ha resaltado diversas diferencias entre las heridas embrionarias y del adulto. En particular, las heridas embrionarias tienen niveles disminuidos de TGF-p1 y TGF-p2, y niveles aumentados de TGF-p3, no presentan respuesta inflamatoria, y contienen algunos fibroblastos, lo que por lo tanto da como resultado una reparacion de la herida sin cicatriz. Sin embargo, por el contrario, las heridas en el adulto tienen niveles aumentados de TGF-p1 y TGF-p2, y niveles disminuidos de TGF-p3, presentan respuestas inflamatorias, y contienen muchos fibroblastos, lo que frecuentemente de este modo da como resultado la formacion de cicatrices durante la reparacion de la herida. Se ha demostrado anteriormente que la reduccion de los niveles de TGF-p1 en el sitio de la herida en el adulto reduce la formacion de cicatriz. Ademas, se ha demostrado que anadir TGF-p3 recombinante a heridas en el adulto reduce la inflamacion, el deposito de la matriz y la cicatrizacion.

En el momento actual no hay un producto farmaceutico en el mercado para reducir de forma eficaz la cicatrizacion de heridas, si bien Renovo tiene dos tratamientos potenciales que actualmente estan en los ensayos clinicos, es decir Juvidex™ y Juvista™. Juvidex™ es una formulation de manosa-6-fosfato que inhibe las acciones de TGF-p1 y p2, mientras que Juvista™ es un TGF-p3 de ser humano recombinante. Actualmente Juvidex™ esta solo en ensayos clinicos para el tratamiento de la cicatrizacion de la cornea, debido a que debe utilizarse a muy altas dosis para ser terapeuticamente eficaz, y la unica via por la cual una dosis suficientemente alta se puede administrar es mediante colirios a anadir de forma directa al ojo. Juvista™ ha demostrado ser eficaz en la reduccion de las cicatrices si se anade en el momento de la formacion de la herida a una herida quirurgicamente limpia. Sin embargo, Juvista™ es muy caro.

El documento WO 2006/108176 se refiere a agonistas y antagonistas de p2 AR para la modulacion de la cicatrizacion de heridas, la contraction de heridas y/o la epitelizacion. Se divulgan diversos usos u observaciones

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sobre agonistas de p2 AR en los documentos EP 1 719 507; WO 01/94319; WO 2007/137204; US 5.958.432; WO 03/097073; WO 2006/027579; Eggleston et al. (1991) Chest 99, 1088-1092; Barzon et al. (1991) Eur. Resp. J. 19, 2307-2311; Skipsii et al. (1991) Terapevtiicheski Arkhiv 63, 125-127; Pullar e Isseroff (2005) Wound Rep. & Regen. 13, 405-411; Pullar et al. (2006) FASEB J. 20, 76-86; y Akutsu et al. (2006) Br. J. Pharmacol. 147, 412-421.

Por lo tanto es un objetivo de la presente invencion superar o mitigar uno o mas de los problemas de la tecnica anterior, ya sea que esten identificados en el presente documento o en otro sitio, y proporcionar composiciones y medicamentos que puedan utilizarse en metodos para modificar de forma simultanea la cantidad de TGFp1 y TGFp3 producida por un fibroblasto, para prevenir o reducir la cicatrizacion, y modificar el deposito de colageno. Estos tratamientos implican la modulacion de la diferenciacion, actividad y/o funcion fibroblastica. La invencion es como se indica en las reivindicaciones.

Anteriormente, la inventora de la presente invencion ha demostrado que los agonistas del receptor p2-adrenergico (p2-AR) disminuyen la migracion de queratinocitos in vitro (Pullar et al. (2003) J Biol Chem 278, 22555-62), la reepitelizacion en la piel de ser humano ex vivo (Pullar et al. (2006) Faseb J 20, 76-86) y la contraccion de geles de colageno flotantes mediada por fibroblastos de la dermis (Pullar e Isseroff (2005) Wound Repair Regen 13, 405-11), que es un modelo para la homeostasis de la dermis. Basandose en estos hallazgos, la inventora dedujo que los agonistas de p2-AR no aumentan la tasa de cicatrizacion de heridas. La comprension general en la tecnica es que se espera que un agente que no aumenta la tasa de la cicatrizacion de heridas, tenga poco o ningun efecto en la reduccion o inhibicion de la cicatrizacion. A la inversa, el tecnico experto esperaria que un agente que no aumenta la tasa de cicatrizacion de heridas, tambien reduzca o inhiba la cicatrizacion, y otros trastornos fibroticos. Por consiguiente, basandose en las observaciones anteriores de la inventora en las cuales un agonista de p2-AR fue incapaz de aumentar la tasa de cicatrizacion de heridas, el tecnico experto esperaria que el agonista de p2-AR tenga poco o ningun efecto en la reduccion de la cicatrizacion.

Por lo tanto, la inventora investigo el efecto de los antagonistas de p2-AR en la tasa de cicatrizacion de heridas y la cicatrizacion con la expectativa de que serian capaces de reducir la cicatrizacion. Sin embargo, como se muestra en las figuras adjuntas, contrariamente a sus expectativas, la inventora se sorprendio al observar que los antagonistas de p2-AR eran incapaces de reducir o evitar la cicatrizacion. Sin embargo, encontro que los antagonistas de p2-AR son capaces de modular la actividad de los fibroblastos, y que los antagonistas de p2-AR son capaces de aumentar el deposito de colageno (Figuras 6 y 7). La inventora investigo el efecto de los agonistas de p2-AR sobre la cicatrizacion, y se sorprendio al encontrar que un agonista selectivo de p2-AR (por ejemplo salbutamol) altero la cantidad de citocinas que secretan los fibroblastos de la dermis, en comparacion con un control. En particular, como se muestra en la Figura 9, la inventora observo de forma bastante inesperada que el agonista de p2-AR disminuia la cantidad de TGF-p1 que se secreto a partir de fibroblastos de la dermis, mientras que aumentaba de forma simultanea la cantidad de TGF-p3 que se secreto a partir de fibroblastos. Aunque la inventora no desea estar limitado por ninguna hipotesis, la inventora cree que esta modification en el perfil de citocinas (es decir, disminucion de la concentration de TGF-p1 y aumento de la concentration de TGF-p3) en el fibroblasto disminuye la tasa de diferenciacion de fibroblastos en una herida, disminuyendo de este modo la concentracion de miofibroblastos en la herida. Estudios anteriores han demostrado que la reduccion de los niveles de TGF-p1 y el aumento de los niveles de TGF-p3 en el sitio de la herida en el adulto, dan como resultado una reduccion de la formation de cicatrices. Por lo tanto, la inventora cree que este efecto doble obtenido despues de la aplicacion de un unico compuesto (es decir el agonista selectivo de p2-AR) seria terapeuticamente eficaz para el tratamiento de los trastornos fibroticos, para su uso en modificacion del deposito de colageno y para su uso en la reduccion de la cicatrizacion. Los datos en la Figura 9 tambien muestran que un antagonista selectivo de p2-AR aumenta de forma simultanea la secretion de TGF-p1 y TGF-p2 en los fibroblastos de la dermis.

Ademas, datos adicionales demostraron un aumento mediado por agonista de p2-AR en el cierre de heridas de la piel de ratones (como se muestra en la Figura 3), y la inventora postula adicionalmente que una reduccion de la concentracion de los miofibroblastos de la herida disminuye el deposito de la matriz mediada por miofibroblastos, el remodelado de la herida, y por lo tanto la cicatrizacion. Se apreciara que las cicatrices son areas de tejido fibroso que reemplazan al tejido normal despues de la lesion, mediante un proceso conocido como fibrosis. La inventora tambien ha demostrado que un agonista de p2-AR disminuye la concentracion de la a-actina del musculo liso en la dermis (como se muestra en las Figuras 4 y 5), y tambien disminuye la cantidad de deposito de colageno en la dermis (como se muestra en las Figuras 6 y 7). La inventora tambien ha demostrado que los agonistas de p2-AR disminuyen la incorporation de celulas inflamatorias en las heridas (Figuras 10 a 14) y que los agonistas de p2-AR disminuyen la cantidad de VEGF, mientras que los antagonistas de p2-AR aumentan la cantidad de VEGF que secretan los fibroblastos y neutrofilos de la dermis. Por lo tanto, la inventora cree que un agonista de p2-AR puede tambien aprovecharse para el tratamiento o la prevention de trastornos fibroticos particulares y que los moduladores de p2-AR pueden modular de forma simultanea la expresion de TGFp1 y TGFp3 que produce un fibroblasto, modular la diferenciacion, actividad y funcion fibroblastica, y modular el deposito de colageno.

Los inventores proporcionan composiciones para su uso en la disminucion de la cantidad de TGFp1 y el aumento de la cantidad de TGFp3 que produce un fibroblasto de forma simultanea. El fibroblasto se pone en contacto con un agente que modula de forma positiva el receptor p2-adrenergico.

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Antes de la presente invencion no se habia apreciado que la modulacion de p2-AR podria modificar de forma simultanea la cantidad de TGFpl y TGFp3 que produce un fibroblasto y tampoco se haWa apreciado que los agentes que modulan p2-AR podrian influenciar los procesos implicados en la diferenciacion de los fibroblastos a miofibroblastos, la secrecion de VEGF (estando VEGF implicado en los procesos angiogenicos que pueden estar asociados con la enfermedad fibrotica), y el deposito de colageno.

Los inventores describen composiciones para su uso en la reduccion de la diferenciacion fibroblastica. El fibroblasto se pone en contacto con un agente que modula de forma positiva el receptor p2-adrenergico.

El miofibroblasto es un factor clave en la reconstruccion fisiologica del tejido conectivo en la dermis despues de la lesion y en los acontecimientos patofisiologicos que conducen a la fibrosis tisular. La diferenciacion del fibroblasto a miofibroblasto es un proceso de dos etapas: de forma inicial, a los pocos dias de producida la herida, fibroblastos “quiescentes” sin movilidad en la dermis adquieren un fenotipo migratorio mediante la regulacion positiva de la expresion de fibras de estres, haces contractiles que permiten que los fibroblastos generen pequenas fuerzas de traccion para moverse hacia la dermis de la herida. De forma adicional, el entorno de la dermis de la herida estimula a los fibroblastos “activados” para diferenciarse en miofibroblastos. Los estimulos principales para la diferenciacion fibroblastica son TGFpl, una variante de corte y empalme de la fibronectina de la dermis (ED-A FN) y la tension mecanica en la dermis de la herida. TGFpl es la principal citocina profibrotica conocida hasta la fecha. Estos estimulos promueven la expresion de la alfa actina del musculo liso (a-MLA), la que se incorpora en los haces contractiles en la celula permitiendo que los miofibroblastos remodelen de forma activa el colageno sintetizado recientemente etc. para formar la dermis de la herida cicatrizante. Durante la cicatrizacion normal de la herida, cuando se completa la reparacion, los miofibroblastos en la dermis moriran mediante apoptosis y la remodelacion cesara. En la reparacion patofisiologica de heridas, los miofibroblastos continuan sintetizando y remodelando la matriz, lo que da como resultado la cicatrizacion hipertrofica.

Es particularmente preferente disminuir la diferenciacion fibroblastica mediante el uso de un agente que module de forma positiva p2-AR, debido a que esto reduce el numero de miofibroblastos en la dermis de la herida y por lo tanto reduce el deposito de colageno y el remodelado.

Los inventores describen composiciones para su uso en la disminucion de la cantidad de VEGF que secreta un fibroblasto o un neutrofilo. El fibroblasto o neutrofilo se pone en contacto con un agente que modula de forma positiva el receptor p2-adrenergico.

VEGF es el promotor principal de la angiogenesis en la herida. Las heridas cronicas tienen angiogenesis reducida y VEGF puede acelerar la curacion en heridas cronicas pero tambien aumentar la cicatrizacion.

En los aspectos posteriores, se prefiere que el fibroblasto sea un fibroblasto de la dermis. Se prefiere que el fibroblasto este presente en un animal (es decir el metodo se lleva a cabo en el animal). Se prefiere que el animal sea un ser humano. Normalmente, el fibroblasto esta presente en el sitio de la herida.

Los inventores proporcionan composiciones para su uso en la reduccion del deposito del colageno en un sujeto. Se administra un agente que modula de forma positiva el receptor p2-adrenergico.

Uno de los cambios mas visibles asociados con el proceso de envejecimiento en los seres humanos se relaciona con una disminucion progresiva del grosor de la piel y la aparicion de arrugas gruesas y finas. El mecanismo de la formacion de arrugas parece implicar cambios de componentes de la matriz extracelular de la dermis, incluyendo perdida del deposito de colageno I. La laxitud, las arrugas y el fotoenvejecimiento de la piel en general se tratan mediante procedimientos ablativos que lesionan o destruyen la epidermis y su membrana basal, al menos al principio, y posteriormente conduce a la fibrosis de la dermis papilar. El tratamiento ideal seria conservar la epidermis y promover la formacion normal de colageno y elastina en la dermis. Los inventores han demostrado que un antagonista de p2-AR promueve el deposito de colageno mediado por fibroblastos de la dermis (Figuras 6 y 7). Por lo tanto, la aplicacion del antagonista de p2-AR, en particular su aplicacion topica, promoveria el deposito de colageno, restableciendo la elasticidad de la piel y reduciendo el aspecto de lineas finas y arrugas, proporcionando asi un medio para combatir o reducir las arrugas.

Los inventores proporcionan una composicion para su uso en la prevencion, reduccion o inhibicion (de forma colectiva “combatir”) la cicatrizacion en un sujeto, mediante la administracion de tal tratamiento a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente, que modula de forma positiva la conformacion del receptor p2-adrenergico, o la actividad del receptor, o la activacion del mismo.

Los hallazgos de la inventora que un agente, que modula de forma positiva p2-AR (tal como un agonista de p2-AR), reduce la cicatrizacion y los trastornos fibroticos fueron inesperados debido a dos razones. En primer lugar, la observacion se contrapone con la compresion general en el campo tecnico, que sugiere que un modulador negativo de p2-AR deberia en efecto reducir la cicatrizacion, y que un modulador positivo no deberia tener efecto en la cicatrizacion. Por consiguiente, el tecnico experto no esperaria que un modulador positivo sea eficaz para reducir la cicatrizacion o para tratar los trastornos fibroticos. En segundo lugar, el tecnico experto no esperaria que el

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modulador positivo de p2-AR disminuya la concentracion de TGF-p1 as^ como el aumente de forma simultanea la concentracion de TGF-p3. Como se indica anteriormente, no hay nada en la tecnica anterior que indique que un agonista de p2-AR module de forma fortuita los niveles de TGF-p1 y TGF-p3 de forma simultanea.

Ademas, se sabe que los moduladores de p2-AR para su uso en los metodos de la invencion son seguros y bien tolerados en el hombre. No se observaron efectos adversos en los experimentos in vivo descritos en los Ejemplos utilizando el modulador positivo, que no sea el retraso de la reparacion de la herida. Mas aun, los moduladores de p2-AR son baratos y faciles de fabricar.

El tecnico experto apreciara lo que denota la expresion “receptor p2-adrenergico” o “p2-AR”. Estos receptores se conocen en la tecnica y se han revisado en Johnson M, (J Allergy Clin. Immunol. (2006) 117, 18-24). Sin embargo, para evitar dudas, los receptores adrenergicos son una clase de receptores acoplados a proteina G que se unen a, y se activan mediante, sus ligandos endogenos, las catecolaminas, adrenalina y noradrenalina. Los receptores adrenergicos caen dentro de 5 tipos: al, a2, p1, p2, y p3, y la presente invencion atane al receptor p2-adrenergico (es decir p2-AR). Las secuencias de ADN y de proteina para el receptor p2-adrenergico de ser humano estan disponibles en bases de datos de acceso libre y se discuten en Kobilka et al. (1987 PNAS 84, 46-50). La localizacion cromosomica del gen que codifica el receptor p2-adrenergico es el cromosoma Sq 31-32. De forma adicional, esta disponible la estructura cristalina del p2-AR (Rasmussen S et al. Nature (2007) 450, 383-387).

Por la expresion “modula de forma positiva la conformacion del receptor p2-adrenergico”, los inventores se refieren al agente (o modulador) que es capaz de modificar la forma y configuracion tridimensional del receptor de su conformacion inactiva a la activa.

Preferentemente, el agente, que modula de forma positiva p2-AR de acuerdo con la invencion, es capaz de modular de forma selectiva la conformacion del receptor p2-adrenergico, o la actividad del receptor, o la activacion del mismo. Por lo tanto, el agente es un modulador positivo selectivo de p2-AR.

Por la expresion “modula de forma selectiva”, los inventores se refieren a que el agente modifica la conformacion de p2-AR, o potencia o bloquea la actividad de p2-AR, o la activacion del mismo (dado que el caso puede depender de si el agente es un modulador positivo o negativo) en mayor medida, o a dosis mas bajas, que otros tipos de receptores adrenergicos, es decir receptores a1-, a2-, p1-, o p3-adrenergicos. Por lo tanto, es preferente que el agente sea selectivo para el receptor p2-adrenergico. Se apreciara que un p bloqueado inhibe a los receptores p1-, p2-, y p3-adrenergicos en medida similar, y, asi, no inhibe de forma selectiva al receptor p2-adrenergico. De forma semejante, los bloqueantes a inhiben a los receptores a1- y a los a2-adrenergicos, y, asi, no inhiben de forma selectiva al receptor 2-adrenergico.

El agente, el cual modula de forma positiva p2-AR, es capaz de: -

(i) modificar el estado conformacional del receptor, por ejemplo mediante la estabilizacion de la conformacion activa del receptor y/o manteniendo el receptor en su conformacion activa para de este modo permitir que el receptor se una a su ligando natural, es decir las catecolaminas;

(ii) unirse al receptor p2-adrenergico, y aumentar, promover o incrementar la transmision en el receptor;

(iii) promover o activar las rutas de senalizacion aguas abajo mediante la union del modulador al receptor;

(iv) aumentar, promover o incrementar la transcripcion, traduccion o expresion del receptor p2-adrenergico;

(v) aumentar la sintesis o la liberation del receptor p2-adrenergico, o los agonistas del mismo, a partir de depositos intracelulares; o

(vi) disminuir la tasa de degradation del receptor p2-adrenergico, o de los agonistas del mismo.

Se apreciara que cada uno de los mecanismos (i) a (vi) da como resultado la modification de la transmision en el receptor, y por lo tanto la actividad del mismo, para de este modo modular de forma positiva al receptor p2- adrenergico.

Asi mismo los agentes que modulan de forma negativa p2-AR son conocidos y en general tienen los efectos opuestos a los de los agentes que modulan de forma positiva p2-AR.

Como se indica en el presente documento, el tecnico experto no esperaria que el agente, que modula de forma positiva p2-AR, disminuya la concentracion de TGF-p1, asi como el aumento de forma simultanea de la concentracion de TGF-p3 secretada a partir de fibroblastos. Convenientemente, el agente, que modula de forma positiva p2-AR, es capaz de disminuir la concentracion de TGF-p1 que se secreta a partir de fibroblastos en al menos el 5 %, mas convenientemente al menos el 10 %, incluso mas convenientemente al menos el 15 %, y todavia mas convenientemente al menos el 20 %, en comparacion con la concentracion de TGF-p1 que se secretaria a partir de fibroblastos en ausencia del modulador positivo. Preferentemente, el agente, que modula de forma positiva p2- AR, es capaz de disminuir la concentracion de TGF-p1 que se secreta a partir de fibroblastos al menos el 25 %, mas preferentemente al menos el 30 %, incluso mas preferentemente al menos el 35 %, y aun mas preferentemente al menos el 40 %, en comparacion con la concentracion de TGF-p1 que se secretaria a partir de fibroblastos en ausencia del modulador positivo. Es especialmente preferente que el agente, el cual modula de forma positiva p2-

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AR, sea capaz de disminuir la concentration de TGF-p1 que se secreta a partir de fibroblastos en al menos el 45 %, mas preferentemente al menos el 50 %, y aun mas preferentemente al menos el 55 % en comparacion con la concentracion de TGF-p1 que se secretaria a partir de fibroblastos en ausencia del modulador positivo.

Convenientemente, el agente, que modula de forma positiva p2-AR, es capaz de aumentar la concentracion de TGF- p3 que se secreta a partir de fibroblastos en al menos el 25 %, mas convenientemente al menos el 50 %, incluso mas convenientemente al menos el 100 %, y aun mas convenientemente al menos el 125 % en comparacion con la concentracion de TGF-p3 que se secretaria a partir de fibroblastos en ausencia del modulador positivo. Preferentemente, el agente, el cual modula de forma positiva p2-AR, es capaz de aumentar la concentracion de TGF-p3 secretado a partir de fibroblastos en al menos el 150 %, mas preferentemente al menos el 175 %, incluso mas preferentemente al menos el 200 %, y aun mas preferentemente al menos el 225 %, en comparacion con la concentracion de TGF-p3 que se secretaria a partir de fibroblastos en ausencia del modulador positivo. Es especialmente preferente que el agente, el cual modula de forma positiva p2-AR, sea capaz de aumentar la concentracion de TGF-p3 secretado a partir de fibroblastos en al menos el 250 %, mas preferentemente al menos el 275 %, y aun mas preferentemente al menos el 300 % en comparacion con la concentracion de TGF-p3 que se secretaria a partir de fibroblastos en ausencia del modulador positivo. Como se muestra en la Figura 9, la inventora observo de forma bastante inesperada que el agonista de p2-AR disminuyo la cantidad de TGF-p1 que se secretaba a partir de fibroblastos de la dermis en cuatro veces, mientras que aumentaba de forma simultanea la cantidad de TGF-p3 que se secretaba a partir de fibroblastos en cinco veces. Se apreciara que el modulador positivo del receptor p2-adrenergico se puede adaptar para modular las concentraciones de TGF-p1 y de TGF-p3 hasta cualquier grado como se indica en el presente documento, por ejemplo reduciendo la concentracion de TGF-p1 en alguno del 5 %, 10 %, 15 %, 20 % y asi, y aumentando la concentracion de TGF-p3 en cualquiera del 25 %, 50 %, 75 % y etcetera, preferentemente in vivo.

Como se muestra en la Figura 9, la inventora observo de forma bastante inesperada que el antagonista de p2-AR aumento la cantidad de TGF-p1 que se secretaba a partir de fibroblastos de la dermis en tres veces, mientras que aumentaba de forma simultanea la cantidad de TGF-p2 que se secretaba a partir de fibroblastos de la dermis en 1,6 veces.

Convenientemente, el valor de la afinidad de union (valor Ki) del modulador positivo del receptor p2-adrenergico es menor que aproximadamente 100 nM, mas convenientemente menor que 80 nM, y mas convenientemente menor que 50 nM. Preferentemente, el valor Ki del modulador positivo para el receptor p2-adrenergico es menor que 30 nM, mas preferentemente menor que 15 nM, y mas preferentemente menor que 10 nM.

Un agente preferente, que modula de forma positiva p2-AR, es un agonista del receptor p2-adrenergico. Por el termino “agonista", los inventores se refieren a una molecula que se une de forma selectiva al receptor p2- adrenergico para iniciar la reaction de transduction de senales.

Un agonista adecuado se puede seleccionar de una lista de agonistas que consiste en un compuesto quimico organico o inorganico simple; un peptido; una proteina; un acido nucleico; un azucar; un anticuerpo (o un fragmento activo del mismo); o cualquier otro agente biologico o quimico; cada uno de los cuales es capaz de modificar la conformacion/estabilidad del receptor, o de inducir la actividad del receptor. Los agonistas adecuados del receptor p2-adrenergico pueden incluir fenoterol, butoxamina, salbutamol, clembuterol, formoterol, o salmeterol. Sin embargo, un agonista selectivo de receptor p2-adrenergico preferente es salbutamol, segun se describe en los Ejemplos. Salbutamol es un agonista de p2-AR altamente selectivo, y sera conocido para el tecnico experto.

El log Kd (constante de disociacion) del salbutamol para p1 es -4,66, para p3 es -4,33, y para p2 es -6,12. Por lo tanto, el log Kd es mucho menor para el receptor p2-adrenergico que para el p1- o para el p3-AR. Por lo tanto el salbutamol es al menos el 29 veces mas selectivo para p2-AR que para el p1-AR, y 62 veces mas selectivo para p2- AR que para el p3-AR, y por lo tanto puede describirse como que es un agonista selectivo de p2-AR.

Los inventores proporcionan un agente que modula de forma positiva el receptor p2-adrenergico para su uso en, de forma simultanea, la disminucion de la cantidad de TGFp1 y el aumento de la cantidad de TGFp2 que produce un fibroblasto o un neutrofilo; para la reduction de la diferenciacion fibroblastica; para la disminucion de la cantidad de VEGF que secreta un fibroblasto; para de forma simultanea disminuir la cantidad de TGFp1 y aumentar la cantidad de TGFp3 en el sitio de la herida; para reducir el deposito de colageno en un sujeto.

Los inventores describen un agente que modula de forma positiva al receptor p2-adrenergico en la fabrication de un medicamento para su uso en, de forma simultanea, la disminucion de la cantidad de TGFp1 y el aumento de la cantidad de TGFp2 que produce un fibroblasto; para la reduccion de la diferenciacion de fibroblastos o neutrofilos; para la disminucion de la cantidad de VEGF que secreta un fibroblasto; para de forma simultanea disminuir la cantidad de TGFp1 y aumentar la cantidad de TGFp3 en el sitio de la herida; para reducir la deposito de colageno en un sujeto.

Se apreciara que la capacidad de los agentes para tener los efectos descritos en relation con la modulation de la cantidad de TGFp1 y TGFp3 que produce un fibroblasto, en la modulacion de la diferenciacion de fibroblastos, en la

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modulacion de la secrecion de VEGF de un fibroblasto, y en la modulation del deposito de colageno, da lugar a muchos usos clmicos en la piel sin lesiones, por ejemplo para tratar el eccema o la soriasis.

Se apreciara que la capacidad de los usos de la invention, que implica un agente que modula de forma positiva p2- AR para tratar los trastornos fibroticos o para reducir la cicatrization, significa que estos usos son valiosos en un amplio rango de situaciones clinicas. Los medicamentos de acuerdo con la invencion pueden utilizarse para reducir la cicatrizacion como resultado de muchos tipos de lesion distintos. Por ejemplo, los medicamentos de la invencion se pueden utilizar para reducir la cicatrizacion provocada por heridas penetrantes o heridas no penetrantes formadas como resultado de agresiones o lesiones fisicas que incluyen (pero sin limitation): rozaduras, abrasiones, incisiones quirurgicas, y otros procedimientos quirurgicos (en particular injertos de grosor parcial de tejidos tales como la piel), “quemaduras” (las que, excepto donde el contexto requiere lo contrario, se puede considerar que incluyen dano tisular como resultado de la exposition a altas o bajas temperaturas, a agentes quimicos o a radiation) u otras formas de traumatismo.

Se sabe que TGF-p1 promueve la cicatrizacion durante la cicatrizacion de heridas, y que TGF-p3 reduce la cicatrizacion. Por consiguiente, debido a que los medicamentos proporcionados en el presente documento han mostrado reducir de forma sorprendente los niveles de TGF-p1 y de forma simultanea aumentar los niveles de TGF- p3 en un fibroblasto, la cicatrizacion durante la cicatrizacion de heridas se puede evitar. Esto es particularmente importante cuando el tratamiento de afecciones oftalmologicas como una cicatriz en el ojo con frecuencia de como resultado una perdida de la calidad de vision. Por lo tanto, los medicamentos proporcionados en el presente documento pueden utilizarse en el tratamiento de las afecciones oftalmologicas, tales como defectos epiteliales persistentes, queratitis neurotrofica, queratopatia bullusa, extirpation de lesiones, tales como tumor de la conjuntiva, y en asociacion con la cirugia de trasplante de celulas madre.

Los inventores han encontrado que el agonismo de la actividad del receptor p2-adrenergico es particularmente eficaz en la prevention o el tratamiento de cicatrices, por ejemplo una cicatriz patologica. Por lo tanto, los usos de acuerdo con la invencion son utilizados para la reduction de la formation de una cicatriz seleccionada un grupo de cicatrices que consiste en cicatrices queloides y cicatrices hipertroficas.

Los agentes para los usos de acuerdo con la invencion que modulan de forma positiva p2-AR se utilizan en la reduccion de la formacion de cicatrices de acuerdo con las reivindicaciones, lo que puede estar asociado con los procedimientos de injerto. El tratamiento que utiliza los agentes de la invencion sera beneficioso en un sitio donante de injerto (en el cual puede ayudar al restablecimiento de una capa epitelial funcional mientras que se reduce la formacion de cicatriz), y tambien en los sitios receptores de injerto (en los cuales los efectos anticicatrizacion del tratamiento reducen la formacion de cicatrices). La inventora cree que los agentes de la invencion confieren ventajas en los contextos de injertos que utilizan piel, piel artificial, y sustitutos de piel.

Los agentes de acuerdo con la invencion que modulan de forma positiva p2-AR se pueden aplicar al sitio de la herida o a un sitio que puede dar como resultado cicatrizacion de acuerdo con las reivindicaciones, como un injerto o parche a un lado, por debajo, o sobre el area afectada y adyacente al tejido sano, como se describe de forma amplia en la bibliografia publicada. Por lo tanto, deberia apreciarse que el agente, que modula de forma positiva p2-AR (por ejemplo un agonista), se puede aplicar de forma directa al sitio a ser tratado. Como alternativa, el modulador positivo se puede procesar en una composition terapeuticamente aceptable adecuada para la aplicacion posterior, tal como un aceite, crema, aerosol, hidrogel o liquido, dependiendo del sitio de tratamiento, como se describe en el presente documento.

Los agentes de acuerdo con la invencion que modulan de forma positiva p2-AR, de acuerdo con las reivindicaciones se pueden utilizar durante el trasplante de piel, o como un vendaje biologico para la piel quemada, para heridas de la piel, y para ulceras cronicas, por ejemplo en la pierna, como un tejido suplementario en la reconstruction quirurgica de partes corporales artificiales, o para prevenir la adhesion tisular en procedimientos quirurgicos del abdomen, la cabeza y la pelvis.

La prevencion o la reduccion de la cicatrizacion en el contexto de la presente invencion deberia entenderse como que abarca cualquier reduccion de la cicatrizacion de acuerdo con las reivindicaciones, en comparacion con el nivel de cicatrizacion que se presenta en una herida tratada de control o no tratada, es decir una a la que no se ha administrado un agente que modula de forma positiva p2-AR. Aunque los agentes que modulan de forma positiva p2-AR se pueden utilizar para reducir la cicatrizacion de heridas y/o tratar trastornos fibroticos en un amplio intervalo de tejidos descritos en el presente documento, se utilizan para reducir la cicatrizacion de la piel. La reduccion de la cicatrizacion de la dermis lograda utilizando los usos de la invencion se puede evaluar con referencia al aspecto microscopico y/o, preferentemente macroscopico de una cicatriz tratada en comparacion con el aspecto de una cicatriza no tratada. Mas preferentemente, la reduccion en la cicatrizacion se puede evaluar con referencia al aspecto macroscopico y microscopico de la cicatriz tratada. Por la expresion “cicatriz tratada”, los inventores se refieren a una cicatriz formada en la curacion de una herida tratada, mientras que una “cicatriz no tratada” se refiere a la cicatriz formada en la curacion de una herida no tratada, o de una herida tratada con un placebo o un cuidado convencional. Las cicatrices de comparacion adecuadas se pueden emparejar preferentemente con la cicatriz tratada con referencia a la edad, sitio, tamano y paciente.

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En la consideracion del aspecto macroscopico de una cicatriz resultante de una herida tratada, la extension de la cicatrizacion, y por lo tanto la magnitud de cualquier reduccion lograda en la cicatrizacion, se puede evaluar con referencia a cualquiera de diversos parametros. Los parametros adecuados para la evaluacion macroscopica de cicatrices puede incluir: (i) color de la cicatriz; (ii) altura de la cicatriz; (iii) textura de la superficie de la cicatriz; y (iv) la rigidez de la cicatriz. Una cicatriz tratada preferentemente demostrara una reduccion en la cicatrizacion segun se evalue con referencia a al menos uno de los parametros para la evaluacion macroscopica indicados anteriormente. Mas preferentemente, una cicatriz tratada puede demostrar cicatrizacion reducida en referencia a al menos dos de los parametros, incluso mas preferentemente a al menos tres de los parametros, y muy preferentemente los cuatro parametros.

Los parametros adecuados para la evaluacion microscopica de cicatrices puede incluir: - (i) grosor de las fibras de la matriz extracelular (MEC); (ii) orientacion de las fibras de la MEC; (iii) la composition de MEC de la cicatriz; y (iv) la celularidad de la cicatriz. Una cicatriz tratada preferentemente demostrara una reduccion en la cicatrizacion segun se evalua con referencia a al menos uno de los parametros para la evaluacion microscopica indicados anteriormente. Mas preferentemente, una cicatriz tratada puede demostrar cicatrizacion reducida con referencia a al menos dos de los parametros, incluso mas preferentemente a al menos tres de los parametros, y muy preferentemente los cuatro parametros. Una reduccion o una mejora en la cicatrizacion de una herida tratada puede evaluarse adicionalmente con referencia a parametros adecuados utilizados en:-

i) la evaluacion clinica macroscopica de las cicatrices, en particular la evaluacion de cicatrices en un sujeto;

ii) evaluacion de imagenes fotograficas de cicatrices; y

iii) evaluacion microscopica de cicatrices, por ejemplo mediante analisis histologicos de la estructura

microscopica de cicatrices.

Se apreciara que una mejora en la cicatrizacion de una herida tratada se puede indicar mediante la mejora de uno o mas de tales parametros adecuados, y que en el caso de una mejora segun se evalua con referencia a diversos parametros, que estos parametros se pueden combinar a partir de distintos esquemas de valoracion (por ejemplo mejora en al menos un parametro utilizado en la valoracion macroscopica y al menos un parametro utilizado en la valoracion microscopica). Una reduccion o mejora en la cicatrizacion se puede demostrar mediante una mejora en uno o mas parametros que indican que una cicatriz tratada se aproxima de forma mas estrecha a la piel sin cicatrices con referencia al/los parametro(s) seleccionados que a una cicatriz no tratada o de control.

Los parametros adecuados para la medicion y evaluacion clinica de cicatrices se pueden seleccionar basandose en diversas medidas o evaluaciones incluyendo las descritas por Beausang et al. (1998, Plast. Reconstr. Surg. 102(6): 1954-1961) y van Zuijlen et al. (20O2, Plast. Reconstr. Surg. 109(3): 1108-22). Una valoracion global de la cicatrizacion se puede hacer utilizando, por ejemplo, una Escala Analoga Visual o una escala de evaluacion digital. Por lo tanto, normalmente, los parametros adecuados pueden incluir: valoracion con respecto a la puntuacion de cicatrices de la Escala Analoga Visual (EAV), altura de la cicatriz, ancho de la cicatriz, perimetro de la cicatriz, area de la cicatriz o volumen de la cicatriz, aspecto y/o color de la cicatriz en comparacion con la piel sin cicatrices circundante, distorsion de la cicatriz y funcionamiento mecanico, contorno de la cicatriz y textura de la cicatriz, organization del colageno, grosor de las fibras y densidad de las fibras. Cada uno de estos parametros sera conocido para el tecnico experto. Una reduccion o mejora de la cicatrizacion se puede demostrar mediante un cambio de cualquiera de estos parametros de tal manera que un sitio de herida potencial o una cicatriz tratados con el modulador positivo de p2-AR se asemeje de forma mas estrecha a la piel sin cicatrices que una cicatriz de control o no tratada.

Es preferente que la herida a ser tratada sea una en la que no se desea una disminucion en la contraction de la herida. Esto es para evitar o tratar resultados no deseados. La contraccion excesiva de la herida puede provocar efectos cosmeticos desagradables, afectacion de la movilidad e incomodidad debido a la tensione aumentada a traves del sitio de la herida y que se produce debido a la contraccion excesiva de tejidos existentes. Estas heridas se distinguiran de las heridas a ser evaluadas mediante esta invention, en las cuales los resultados adversos (por ejemplo cicatrizacion) se deben al deposito y/o remodelado de colageno anormal.

Es preferente que el sujeto o persona sea uno que no padezca lupus eritematoso o esclerodermia o esclerosis sistemica.

Es preferente que el agonista de p2-AR no sea una molecula que tambien tenga actividad fosfodiesterasa-4 (PDE- 4).

Se apreciara que las cicatrices son areas de tejido fibroso que reemplazan el tejido normal despues de la lesion mediante el proceso conocido como fibrosis. Por lo tanto, en referencia a la cicatrizacion, el tecnico experto conocera que los trastornos fibroticos son manifestaciones medicas en las que la fibrosis excesiva conduce al desarreglo patologico y al mal funcionamiento del tejido. Los trastornos fibroticos se caracterizan por la acumulacion de un modo anormal de tejido fibroso (de forma predominante colagenos) en el tejido. La acumulacion de tales tejidos fibrosos puede originarse a partir diversos procesos patologicos. Como se muestra en las Figuras 6 y 7, la inventora ha demostrado que las heridas tratadas con agonista de p2-AR contienen menos deposito de colageno III

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que las heridas de control no tratadas. Por lo tanto, a la vista de estos datos, la inventora cree que la administracion de un agente, que modula de forma positiva p2-AR, puede utilizarse en el tratamiento, mejora o prevencion de trastornos fibroticos.

La inventora cree que los agentes que modulan de forma positiva p2-AR son capaces de reducir la cicatrizacion de acuerdo con las reivindicaciones o que se pueden utilizar para tratar trastornos fibroticos cuando se administran antes de la formacion de la herida, o una vez que la herida ya se ha formado. Los agentes de la invention se pueden utilizar de forma profilactica, es decir en los sitios en los cuales no existe herida, pero en los cuales se puede formar una herida que de otra forma daria lugar a una cicatriz o una herida cronica. A modo de ejemplo, los agentes de acuerdo con la invencion se pueden administrar en sitios que experimentaran la formacion de una herida como resultado de procedimientos optativos (tales como cirugia, por ejemplo cirugia plastica), o en sitios que se cree que estan en alto riesgo de formacion de heridas. Puede ser preferente que los medicamentos de la invencion se administren en el sitio de forma inmediatamente anterior a la formacion de una herida (por ejemplo en el periodo de hasta seis horas antes de la formacion de la herida) o que los medicamentos se puedan administrar en un tiempo temprano antes de la formacion de la herida (por ejemplo hasta 48 horas antes de que una herida se forme).

El tecnico experto apreciara que los tiempos mas preferentes de administracion antes de la formacion de una herida se determinaran con referencia a diversos factores, incluyendo la formulation y la via de administracion del medicamento seleccionado, la dosificacion del medicamento a administrar, el tamano y la naturaleza de la herida a formarse, y el estado biologico del paciente (que se puede determinar con referencia a factores tales como edad, salud, y predisposition a las complicaciones en la curacion o cicatrizacion adversa del paciente). Los usos profilacticos de acuerdo con la invencion es una realization preferente de la invencion, y es particularmente preferente en la reduction de la cicatrizacion en el contexto de las heridas quirurgicas.

Los agentes de la invencion tambien son utiles para reducir la cicatrizacion si se administran despues de que una herida se ha formado. Es preferente que tal administracion debe producirse tan pronto como sea posible despues de la formacion de la herida, pero los usos de la invencion son capaces de reducir la cicatrizacion en cualquier momento hasta que el proceso de curacion se haya completado (es decir incluso en el acontecimiento de que una herida ya se haya curado de forma parcial, los usos de la invencion se pueden utilizar para reducir la cicatrizacion con respecto a cualquier portion restante no curada). Se apreciara que el intervalo de tiempo en el que los medicamentos de la invencion se pueden utilizar para reducir la cicatrizacion es dependiente de la naturaleza de la herida en cuestion (incluyendo el grado de dano que ha tenido lugar, y el tamano del area herida). Por lo tanto, en el caso de una herida grande, los agentes de la invencion pueden administrarse relativamente tarde en la respuesta de curacion y aun asi ser capaces de reducir la cicatrizacion. Los agentes de la invencion pueden, por ejemplo, administrarse preferentemente dentro de las primeras 24 horas despues de que se forma una herida, pero pueden todavia reducir la cicatrizacion si se administran hasta dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez, o mas, dias despues de la formacion de la herida.

Los agentes de la invencion se pueden administrar una o mas ocasiones segun sea necesario para reducir la cicatrizacion. Por ejemplo, para reducir el proceso de cicatrizacion las cantidades terapeuticamente eficaces de los medicamentos se pueden administrar a una herida tan frecuentemente como se necesite hasta que el proceso de curacion se haya completado. A modo de ejemplo, los agentes de la invencion se pueden administrar diariamente o dos veces al dia a una herida durante al menos los primeros tres dias despues de la formacion de la herida.

Muy preferentemente, los agentes de la invencion pueden administrarse antes y despues de la formacion de una herida. Se apreciara que la cantidad de un agente para uso de la invencion, que deberia aplicarse a una herida depende de varios factores tales como la actividad biologica y la biodisponibilidad del agente presente en el medicamento, que a su vez depende, entre otros factores, de la naturaleza del agonista del receptor p2-adrenergico, y el modo de administracion del medicamento.

En general, cuando los agentes para su uso de acuerdo con la invencion se utilizan para tratar heridas existentes, el agente deberia administrarse tan pronto como la herida se haya producido (o en el caso de heridas que no son evidentes de forma inmediata, tales como las de sitios corporales internos, tan pronto como la herida se haya diagnosticado). La terapia con agentes de acuerdo con la invencion deberia continuar hasta que se haya acelerado el proceso de curacion, y la cicatrizacion se haya reducido, hasta la satisfaction del medico clinico.

Se apreciara que el agente, el cual modula de forma positiva p2-AR, y los usos de acuerdo con la invencion, se pueden utilizar en una monoterapia (es decir el uso de un agente, que modula de forma positiva la conformation de p2-AR, o la actividad del receptor o solo la activation del receptor), para reducir la cicatrizacion o para tratar trastornos fibroticos. Como alternativa, el agente que modula de forma positiva p2-AR, y lo usos de acuerdo con la invencion, se pueden utilizar como un complemento de, o en combination con, terapias conocidas para reducir la cicatrizacion o para tratar trastornos fibroticos. Por ejemplo, se puede utilizar en combinacion con terapeuticos anticicatrizacion conocidos, tales como inyecciones de corticoesteroide, crioterapia, laminas de silicona topicas, radiation, indumentaria compresiva e Imiquimod (Meier K y Nanney L, B, Expert Opinion in Emerging Drugs (2006) 11(1), 39).

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El agente de la invencion puede ser mediante cualquiera via adecuada capaz de conseguir el efecto deseado, de reducir la cicatrizacion de acuerdo con las reivindicaciones. Con respecto a la cicatrizacion es preferente que los agentes se administren por via local en el sitio de la herida o en el sitio de la herida previsto. Por lo tanto, el agente, el cual modula p2-AR, se puede combinar en composiciones farmaceuticas que tengan varias formas distintas dependiendo de, en particular, la manera en que la posicion se va a utilizar. Por lo tanto, por ejemplo, la composicion puede estar en la forma de un polvo, comprimido, capsula, liquido, pomada, crema, gel, hidrogel, aerosol, pulverizacion, solucion miscelar, parche transdermico, suspension liposomal o cualquier otra forma adecuada que puede administrarse a un sujeto que necesite tratamiento. Se apreciara que el vehiculo de los medicamentos deberia ser uno que sea bien tolerado por el sujeto al cual se proporcionara.

Los medicamentos que comprenden al agente, los cuales modulan p2-AR, pueden utilizarse de varias maneras. Por ejemplo, puede necesitarse administration oral, en cuyo caso el modulador de p2-AR puede estar contenido dentro de una composicion que puede, por ejemplo, ingerirse por via oral en la forma de un comprimido, capsula o liquido. Las composiciones que comprenden al modulador de p2-AR se pueden administrar mediante inhalation (por ejemplo por via intranasal).

Como alternativa, o de forma adicional, los medicamentos pueden administrarse en una forma topica, por ejemplo los moduladores positivos de p2-AR para su uso para reducir la cicatrizacion. Tal administracion se puede efectuar como parte de la atencion inicial y/o de seguimiento del area herida. Los inventores creen que la reduction de la cicatrizacion o el tratamiento de trastornos fibroticos se mejora de forma particular mediante la aplicacion topica de un modulador positivo de p2-AR a una herida (o, en el caso de aplicacion profilactica, a un tejido o sitio en el cual se podria formar una herida). Por lo tanto, por ejemplo, los medicamentos adecuados pueden estar en la forma de un iiquido, pomada, crema, gel, hidrogel, polvo o aerosol. Todos de tales componentes son adecuados para la aplicacion topica a una herida, la cual es un medio preferente de administracion del modulador positivo de p2-AR a un sujeto (por ejemplo una persona o un animal) que necesite tratamiento. Es preferente que tales formulaciones se apliquen de forma directa a un sitio de la herida, o por lo menos a un sitio de la herida adyacente. Estos medios para la aplicacion topica tambien son utiles para la administracion de un modulador negativo de p2-AR, tal como un antagonista de p2, al sitio de arrugas en la piel.

Como alternativa, el modulador positivo de p2-AR o medicamento se puede proporcionar en un vehiculo (tal como un vendaje o parche esteril), el cual se puede utilizar para cubrir un sitio de la herida o sitio de fibrosis anomala. Se apreciara que el vehiculo deberia ser uno que sea bien tolerado por el paciente y que permita la liberation del agente activo a la herida. Tal vehiculo preferentemente es biodegradable, biorreabsorbible y/o no inflamatorio.

El positivo o modulador de p2-AR utilizado de acuerdo con la invencion tambien puede incorporarse en un dispositivo de liberacion lenta o retardada. Tales dispositivos pueden, por ejemplo, insertarse en o debajo de la piel, y el medicamento se puede liberar a lo largo de dias, semanas o incluso meses. El dispositivo se puede localizar al menos adyacente al sitio de tratamiento, por ejemplo de forma directa en un sitio de la herida. El medicamento se aplica en y/o alrededor de una herida para reducir la cicatrizacion. Tales dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se necesita tratamiento prolongado con el modulador positivo de p2-AR y el cual normalmente necesitaria la administracion frecuente (por ejemplo, al menos inyeccion diaria).

En una realization, farmaceuticamente un vehiculo para la administracion del modulador positivo de p2-AR puede ser un liquido, y una composicion farmaceutica adecuada estaria en la forma de una solucion. En otra realizacion, el vehiculo farmaceuticamente aceptable es un solido, y una composicion adecuada del medicamento esta en la forma de un polvo o comprimido. En una realizacion adicional, el positivo o modulador de p2-AR se puede formular como parte de un parche transdermico farmaceuticamente aceptable.

Los inventores creen que la reduccion optima de la cicatrizacion se puede efectuar mediante la administracion de un agente, el cual modula de forma positiva p2-AR mediante la inyeccion en o alrededor del sitio de la herida. Por ejemplo, en el caso de heridas dermicas, el modulador positivo de p2-AR puede administrarse por medio de inyeccion intradermica. Por lo tanto, un medicamento preferente de acuerdo con la invencion comprende una solucion de un agente, el cual modula de forma positiva p2-AR, el cual es inyectable de forma directa en un sitio que necesita tratamiento (por ejemplo para inyeccion alrededor de los margenes de un sitio de dano epitelial o un sitio que probablemente se danara). Por lo tanto, en una realizacion preferente el medicamento puede inyectarse en una herida, o en el sitio de una incision quirurgica inminente. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusion) o subcutaneas (bolo o infusion), o intradermicas (bolo o infusion). Tambien esta previsto que los medicamentos se puedan administrar por via sistemica a un sujeto mediante la inyeccion en el torrente sanguineo.

Se apreciara que la cantidad del modulador positivo de p2-AR que se necesita se determina mediante su actividad biologica y biodisponibilidad, lo que a su vez depende del modo de administracion, las propiedades fisico quimicas del agente y si el agente esta utilizandose como una monoterapia o en una terapia combinada. La frecuencia de administracion tambien estara influenciada por los factores mencionados anteriormente y de forma particular la semivida del agente en el sujeto a ser tratado. Los expertos en la materia pueden determinar las dosificaciones optimas a ser administradas, y variara con el agente particular en uso, la fuerza de la composicion farmaceutica, el modo de administracion, y el avance de la cicatrizacion o enfermedad fibrotica. Los factores adicionales que

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dependen del sujeto en particular que se trata daran como resultado una necesidad de ajuste de las dosificaciones, incluyendo edad, peso, genero, dieta del sujeto, y tiempo de administracion.

Normalmente, para efectuar el tratamiento la cantidad de un modulador de p2-AR necesaria para su uso en la persona estara dentro del rango de 0,001 ng a 100 mg del agente por 24 horas, aunque este diagrama se puede modificar hacia arriba o hacia abajo en respuesta a los factores descritos anteriormente. Para el tratamiento de un sitio de la herida, la cantidad del modulador positivo de p2-AR a administrar puede preferentemente ser de 50 a 500 ng por centimetro lineal de dano epitelial en el sitio de la herida. En general, una dosis diaria de entre 0,001 Mg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal del modulador positivo de p2-AR se puede utilizar para reducir la cicatrizacion dependiendo de cual modulador se utiliza. Mas preferentemente, la dosis diaria del modulador positivo de p2-AR esta entre 0,01 Mg/kg de peso corporal y 1 mg/kg de peso corporal, mas preferentemente entre 0,1 Mg/kg y 100 Mg/kg de peso corporal, y muy preferentemente entre aproximadamente 0,1 Mg/kg y 10 Mg/kg de peso corporal.

La frecuencia de administracion dependera de la semivida biologica del medicamento utilizado. Normalmente deberia administrarse una crema o pomada que contiene el modulador positivo de p2-AR a un tejido diana de forma tal que la concentracion del modulador en el sitio de tratamiento, tal como una herida (se mantiene a un nivel adecuado para tener un efecto terapeutico. Esto puede necesitar la administracion diaria, o incluso varias veces al dia. Las dosis diarias pueden proporcionarse como una administracion unica (por ejemplo una inyeccion diaria unica). Como alternativa, el modulador positivo de p2-AR puede necesitar la administracion dos o mas veces en el transcurso de un dia. Como ejemplo, el modulador positivo de p2-AR puede administrarse como dos (o mas, dependiendo de la gravedad de la afeccion a ser tratada) dosis diarias de entre 0,07 Mg y 700 mg (es decir asumiendo un peso corporal de 70 kg). Un paciente que recibe el tratamiento puede tomar una primera dosis al levantarse y despues una segunda dosis por la tarde (si es en un regimen de dos dosis), o dosis a intervalos de 3 o 4 horas.

Como alternativa, para proporcionar dosis optimas del modulador positivo de p2-AR a un paciente sin necesidad de administrar dosis repetidas, se puede utilizar un dispositivo de liberacion lenta o retardada. Tales dispositivos pueden, por ejemplo, ponerse sobre o insertarse bajo la piel y el modulador positivo de p2-AR se puede liberar a lo largo de dias, semanas o incluso meses. Tal dispositivo puede ser particularmente util para pacientes (tales como los que padecen heridas cronicas) que necesitan reduccion de la cicatrizacion prolongada. Los dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se utilizan para la administracion de un modulador positivo de p2-AR, el cual normalmente necesitara administracion frecuente (por ejemplo al menos la administracion diaria mediante otras vias).

Los procedimientos conocidos, tales como los empleados de forma convencional por la industria farmaceutica (por ejemplo experimentacion in vivo, ensayos clinicos, etc.), se pueden utilizar para formar formulaciones especificas de los agentes de acuerdo con la invencion y regimenes terapeuticos precisos (tales como dosis diarias de los agentes y la frecuencia de administracion). La inventora cree que el es el primero en sugerir que los moduladores de p2-AR son capaces de modular de forma simultanea las concentraciones de TGFp1 y TGFp3 que producen los fibroblastos, y las aplicaciones de los moduladores de p2-AR como se divulga en el presente documento.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, se proporciona una composicion anticicatrizacion que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente, el cual modula de forma positiva la conformacion de p2-AR, o la actividad del receptor, o la activacion del mismo, y de forma opcional un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Por la expresion “composicion anticicatrizacion", los inventores se refieren a un compuesto farmaceutico utilizado en la prevencion, reduccion o inhibicion terapeutica de la cicatrizacion en un paciente.

En un aspecto adicional los inventores proporcionan un proceso para preparar la composicion de acuerdo con los aspectos anteriores, comprendiendo el proceso la combinacion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente, el cual modula de forma positiva la conformacion de p2-AR, o la actividad del receptor, o la activacion del mismo (segun sea el caso), con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

El agente, el cual modula de forma positiva p2-AR, en la composicion de acuerdo con los aspectos anteriores preferentemente es selectivo para p2-AR, y puede ser un agonista de p2-AR. El agonista se puede seleccionar de una lista de agonistas que consiste en un compuesto quimico organico o inorganico simple; un peptido; una proteina; un acido nucleico; un azucar; un anticuerpo (o un fragmento activo del mismo); cada uno de los cuales es capaz de modificar la conformacion/estabilidad del receptor, o de inducir la actividad del receptor. El agonista selectivo de p2-AR puede ser fenoterol, butoxamina, salbutamol, clembuterol, formoterol, o salmeterol. Sin embargo, en la composicion un agonista selectivo de p2-AR preferente es salbutamol.

Un “sujeto" puede ser un vertebrado, mamifero, o animal domestico. Por lo tanto, los usos de acuerdo con la invencion pueden ser utilizados para tratar cualquier mamifero, por ejemplo animales de produccion (por ejemplo un caballo), animales de compania o puede utilizarse en otras aplicaciones veterinarias. Muy preferentemente, el sujeto es un ser humano.

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Una “cantidad terapeuticamente eficaz” del agente es cualquier cantidad que, cuando se administra a un sujeto, da como resultado una reduction de la cicatrization en el sujeto.

Por ejemplo, la cantidad terapeuticamente eficaz del agente utilizada puede ser desde aproximadamente 0,07 |jg a aproximadamente 700 mg, y preferentemente desde aproximadamente 0,7 jg a aproximadamente 70 mg. Es preferente que la cantidad del agente sea una cantidad desde aproximadamente 7 jg a aproximadamente 7 mg, y muy preferentemente desde aproximadamente 7 |jg a aproximadamente 700 jg.

Un “vehiculo farmaceuticamente aceptable” al que se hace referencia en el presente documento es cualquier compuesto conocido o combination de compuestos conocidos que es util en la formulation de composiciones farmaceuticas que es conocido para los expertos en la materia.

En una realization, el vehiculo farmaceuticamente aceptable puede ser un solido, y la composition puede estar en la forma de un polvo o comprimido. Un vehiculo farmaceuticamente aceptable solido puede incluir una o mas sustancias las cuales pueden tambien actuar como agentes aromatizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspension, colorantes, rellenos, emolientes, ayudas de compresion, aglutinantes inertes, edulcorantes, conservantes, colorantes, agentes de revestimiento, o agentes de desintegracion de comprimidos. El vehiculo tambien puede ser un material encapsulante. En polvos, el vehiculo es un solido dividido de forma fina que esta en combinacion con los agentes activos divididos de forma fina de acuerdo con la invention. En comprimidos, el agente activo puede estar mezclado con un vehiculo que tenga las propiedades de compresion necesarias en proporciones adecuadas y puede estar compactado en la forma y tamano deseados. Los polvos y comprimidos preferentemente contienen hasta el 99 % de los agentes activos. Los vehiculos solidos adecuados incluyen, por ejemplo fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azucares, lactosa, dextrina, almidon, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidona, ceras de baja fusion y resinas de intercambio ionico. En otra realizacion, el vehiculo farmaceutico puede ser un gel y la composicion puede estar en la forma de una crema o similar.

Sin embargo, en una realizacion preferente, el vehiculo farmaceutico es un liquido, y la composicion farmaceutica esta en la forma de una solution. Los vehiculos liquidos se utilizan en la preparation de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. El agente activo de acuerdo con la invencion puede disolverse o suspenderse en un vehiculo liquido farmaceuticamente aceptable tal como agua, un disolvente organico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmaceuticamente aceptables. El vehiculo liquido puede contener otros aditivos farmaceuticos adecuados tales como solubilizadores, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes saporiferos, agentes de suspension, agentes espesantes, colores, reguladores de la viscosidad, estabilizantes u osmoreguladores. Los ejemplos adecuados de vehiculos liquidos para la administration oral o parenteral incluyen agua (que contiene de forma parcial aditivos como anteriomente, por ejemplo derivados de celulosa, preferentemente solucion de carboximetilcelulosa de sodio), alcoholes (incluyendo alcoholes monohidricos y alcoholes polihidricos, por ejemplo glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo aceite de coco y aceite de cacahuete fraccionados). Para la administracion parenteral, el vehiculo puede tambien ser un ester oleoso tal como oleato de etilo o miristato de isopropilo. Para la administracion parenteral, los vehiculos liquidos esteriles son utiles en las composiciones en forma liquida esteril. El vehiculo liquido para las composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones farmaceuticas liquidas que son soluciones o suspensiones esteriles se pueden utilizar mediante, por ejemplo, inyeccion intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa y particularmente subcutanea. El modulador positivo de p2-AR puede prepararse como una composicion solida esteril que puede disolverse o suspenderse en el momento de la administracion utilizando agua esteril, solucion salina u otro medio inyectable esteril apropiado.

Los agentes y composiciones se pueden administrar por via oral en la forma de una solucion o suspension esteril que contenga otros solutos o agentes de suspension (por ejemplo, solucion salina o glucosa suficiente para hacer isotonica la solucion), sales biliares, goma arabiga, gelatina, monooleato de sorbitan, polisorbato 80 (esteres oleato de sorbitol y sus anhidridos copolimerizados con oxido de etileno) y similares. Los agentes utilizados de acuerdo con la invencion tambien pueden administrarse por via oral en forma de composicion liquida o solida. Las composiciones adecuadas para la administracion oral incluyen formas solidas, tales como pildoras, capsulas, granulados, comprimidos, y polvos, y formas liquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires, y suspensiones. Las formas utiles para la administracion parenteral incluyen soluciones, emulsiones, y suspensiones esteriles.

Para una mejor comprension de la invencion, y para mostrar como las realizaciones de la misma pueden llevarse a efecto, se hara referencia ahora, por medio de ejemplo, a los siguientes Ejemplos y Figuras adjuntas, en las que:-

La Figura 1 es un diagrama de barras que demuestra que un antagonista de p2-AR aumenta la tasa de migration de fibroblastos de la dermis individuales. “Velocidad” es la velocidad promedio en jm/minuto a la que las celulas se desplazan en un periodo de tiempo de una hora. Los analisis estadisticos se realizaron utilizando la prueba T de Student (*P < 0,01);

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La Figura 2 es un grafico que muestra que los antagonistas de p2-AR potencian la contraccion de gel de colageno flotante mediada por 30 fibroblastos de la dermis. Una solucion de colageno bovino de tipo I (97 %) y tipo III se mezclo con DMEM de triple fuerza, DMEM que contenia tampon Hepes 20 mM, suero de ternera, celulas (desprendidas mediante tripsina de cultivos confluentes en monocapa), y en la presencia (la linea es una combinacion de lmea discontinua y puntos, es decir “_..._”) o ausencia (lmea negra continua) de 10 nM antagonista del p2-adrenoreceptor (ICI 118.551);

La Figura 3 es un grafico que muestra que un antagonista de p2-AR potencia el cierre de heridas en raton in vivo, mientras que el agonista de p2-AR retrasa el cierre de la herida. Las heridas se trataron por via topica con 100 [jl de gel hidroactivo solo (lmea negra continua y simbolos circulares) o que contenia agonista selectivo de p2-AR al 0,1 % (salbutamol, linea punteada y simbolos cuadrados) o antagonista selectivo de p2-AR al 0,1 % (ICI 118.551, linea discontinua y simbolos con forma de diamante) de forma inmediatamente anterior a la formacion de la herida y posteriormente de forma diaria hasta la recoleccion. Las imagenes se capturan diariamente y el area de la herida se calculo utilizando Image J.

La Figura 4 son fotografias que muestran que los antagonistas de p2-AR aumentan el nivel de la tincion de la a- actina de musculo liso (AML) en la dermis herida, 5 dias despues de la formacion de la herida, mientras que los agonistas de p2-AR disminuyen el nivel de la tincion de la a-actina de musculo liso en la dermis herida, 5 dias despues de la formacion de la herida. Las imagenes de las secciones de herida con AML tenida se capturaron con un aumento de 2x en un microscopio vertical Nikon SMZ-U con el programa informatico Nikon ACT-1, y se muestran imagenes representativas. La barra de escala es 500 jM;

La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra que los antagonistas de p2-AR aumentan el nivel de tincion de la a-actina de musculo liso en la dermis herida, 5 dias despues de la formacion de la herida, mientras que los agonistas de p2-AR disminuyen el nivel de tincion de la a-actina de musculo liso en la dermis herida, 5 dias despues de la formacion de la herida;

La Figura 6 son fotografias que muestran que los antagonistas de p2-AR aumentan la cantidad de tincion del colageno III en la dermis herida, 5 dias despues de la formacion de la herida, mientras que los agonistas de p2- AR disminuyen la cantidad de tincion del colageno III en la dermis herida, 5 dias despues de la formacion de la herida. Las imagenes de las secciones de la herida con tincion del colageno III se capturaron a un aumento de 20x en un microscopio invertido Nikon Eclipse 2000 U con el programa informatico NIS-Elements. Se muestran imagenes representativas. La barra de escala es 100 jM;

La Figura 7 es un diagrama de barras que muestra que los antagonistas de p2-AR aumentan la cantidad de tincion del colageno III en la dermis herida, 5 dias despues de la formacion de la herida, mientras que los agonistas de p2-AR disminuyen la cantidad de tincion del colageno III en la dermis herida, 5 dias despues de la formacion de la herida;

La Figura 8 muestra que los agonistas de p2-AR disminuyen la diferenciacion y funcion fibroblastica y la funcion en un modelo de gel de colageno anclado, un modelo 3D de dermis herida mientras que, por el contrario, los antagonistas de p2-AR aumentan la diferenciacion y funcion fibroblastica en geles de colageno anclado.

El Panel A muestra que el tratamiento con antagonista de p2-AR aumenta la rigidez de los geles de colageno sembrados con fibroblastos de la dermis de ser humano despues de 4 dias de incubacion. Los fibroblastos de la dermis de ser humano se incorporaron en geles de colageno al 40 % anclados durante 4 dias, se sumergieron en medio solo o medio que contenia agonista de beta2-adrenorreceptor 10 jM (salbutamol) o antagonista (ICI 118.551). Los geles se incubaron a 37 °C hasta 216 horas y se fotografiaron despues de 72, 96, 168 y 216 horas para observar el mantenimiento de la tension en los geles.

El Panel B muestra que el tratamiento con agonista de p2-AR disminuye la tincion de colageno I mientras que el tratamiento con antagonista aumenta la tincion de colageno I en fibroblastos de la dermis de ser humano liberados de geles de colageno despues de 4 dias de incubacion. Los fibroblastos de la dermis de ser humano se incorporaron en geles de colageno anclados durante 4 dias, se sumergieron en medio solo o medio que contenia agonista de beta2-adrenorreceptor 1 jM (salbutamol) o antagonista (ICI 118.551). Las celulas se liberaron de los geles mediante tratamiento con colagenasa, se sembraron en placas recubiertas con colageno I, se fijaron con paraformaldehido al 4 % y se tineron con un anticuerpo anticolageno I (coloracion negra).

El Panel C muestra que el tratamiento con agonista de p2-AR disminuye la proliferacion de fibroblastos de la dermis de ser humano mientras que el tratamiento con antagonista aumenta la proliferacion celular en geles de colageno despues de 4 dias de incubacion. Los fibroblastos de la dermis de ser humano se incorporaron en geles de colageno al 40 % anclados durante 4 dias, se sumergieron en medio solo o en medio que contenia agonista de beta2-adrenorreceptor 10 jM (salbutamol) o antagonista (ICI 118.551). Los geles se incubaron a 37 °C durante 96 horas, se fotografiaron en un microscopio invertido Nikon cada 24 horas.

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El Panel D muestra que el tratamiento con agonista de p2-AR disminuye la tincion de alfa actina de musculo liso mientras que el tratamiento con antagonista aumenta la tincion de alfa actina de musculo liso en fibroblastos de la dermis de ser humano liberados de geles de colageno despues de 4 dias de incubacion. Los fibroblastos de la dermis de ser humano se incorporaron en geles de colageno anclados durante 4 dias, se sumergieron en medio solo o en medio que contenia agonista de beta2-adrenorreceptor 10 |jM (salbutamol) o antagonista (ICI 118.551). Las celulas se liberaron de los geles mediante tratamiento con colagenasa, se sembraron en placas recubiertas con colageno I, se fijaron con paraformaldehido al 4 % y se tineron con un anticuerpo especifico anti alfa actina de musculo liso.

La Figura 9 muestra que los agonistas de p2-AR disminuyen la secrecion de factores de crecimiento profibroticos y aumentan la secrecion de factores de crecimiento antifibroticos. Mientras que, por el contrario, los antagonistas de p2-AR aumentan la secrecion de factores de crecimiento profibroticos, los agonistas de p2-AR disminuyen la cantidad de TGFp1 profibrotico secretado en el 74 % y aumenta la cantidad de TGFp3 antifibrotico secretado en

5 veces, despues de 24 horas. Por el contrario, los antagonistas de p2-AR aumentan los niveles de TGFp2 profibrotico en 1,6 veces despues de 6 horas y aumentan los niveles de TGFp1 en 3 veces despues de 24 horas. Se sembraron en placa fibroblastos de la dermis de ser humano en presencia o ausencia (control) de agonista de beta2-adrenorreceptor 10 jM (salbutamol) o antagonista (ICI 118.551). El sobrenadante se recolecto despues de

6 horas o 24 horas y se analizo utilizando ELISA individuales especificos para TGFbeta 1,2 o 3.

La Figura 10 son fotografias que muestran que los agonistas de p2-AR disminuyen el numero de neutrofilos en el lecho de la herida despues de 3 dias. Las imagenes de las heridas tenidas con Ly6G-6C se capturaron a un aumento de 60x en un microscopio invertido Nikon Eclipse 2000U con el programa informatico NIS-Elements. Se muestran imagenes representativas. La barra de escala es 100 jM;

La Figura 11 es un diagrama de barras que muestra que los agonistas de p2-AR disminuyen el numero de neutrofilos (celulas polimorfonucleares, PMN) en el lecho de la herida despues de 3 dias;

La Figura 12 son fotografias que muestran que los agonistas de p2-AR disminuyen el numero de macrofagos en el lecho de la herida despues de 3 dias. Las imagenes de heridas tenidas con F 4/80 se capturaron con un aumento de 60x en un microscopio invertido Nikon Eclipse 2000U con el programa informatico NIS-Elements. Se muestran imagenes representativas. La barra de escala es 100 jM; y

La Figura 13 es un diagrama de barras que muestra que los agonistas de p2-AR disminuyen el numero de macrofagos en el lecho de la herida despues de 3 dias.

La Figura 14 muestra que los agonistas de p y p2-AR disminuyen la incorporacion de celulas inflamatorias en heridas de la cola de pez cebra, 6 horas despues de la formacion de la herida. Se bisecciono la aleta caudal de embriones de pez cebra de tres dias con un bisturi para crear una herida en la aleta caudal. 6 horas mas tarde los embriones se fijaron en paraformaldehido al 4 % y se tineron con fluoresceina-tiramina para visualizar la incorporacion de neutrofilos en las heridas de la cola en un microscopio invertido a un aumento de 20x. Aqui se demuestra que los agonistas de p-AR y p2-AR reducen la incorporacion de neutrofilos en las heridas de la aleta caudal del pez cebra en el 60 y 62 %, dentro de las 6 horas de la formacion de la herida, respectivamente. Por el contrario, un antagonista de p-AR no tuvo efecto (Figura 14). Estos datos muestran una nueva inhibicion de la orientacion de neutrofilos hacia una herida mediada por p2-AR. Ademas, este es el primer informe de algun efecto fisiologico de un agonista de p2-AR en embriones de pez cebra.

La Figura 15 muestra que los agonistas de p2-AR disminuyen la cantidad de VEGF profibrotico secretado mientras que los antagonistas de p2-AR aumentan los niveles de VEGF profibrotico secretado de fibroblastos de la dermis de ser humano y neutrofilos de ser humano despues de 48 horas. Se sembraron en placa los fibroblastos o neutrofilos de la dermis de ser humano en presencia o ausencia (control) de agonista o antagonista de p-adrenorreceptor. Se recolecto el sobrenadante despues de 48 horas y se analizo utilizando un ELISA especifico para VEGF. Iso es isoproterenol. Salb es salbutamol. Salm es salmeterol. Form es formotorol. Tim es timolol. Timolol es un antagonista, los otros compuestos son agonistas.

Ejemplos

Materiales

Los siguientes experimentos utilizaron un agonista selectivo del receptor p2-adrenergico, salbutamol (Sigma-Aldrich, St Louise, MO). Este compuesto es un agonista del receptor p2-adrenergico altamente selectivo, que tiene valores de Ki de -6,12, -4,66 y -4,33 nM para los receptores p2-, p1- y p3-adrenergicos, respectivamente. Los experimentos tambien utilizaron un antagonista selectivo del receptor p2-adrenergico, ICI 118.551 (Tocris Cookson, Inc., Ellisville, MO). Este compuesto es un antagonista del receptor p2-adrenergico altamente selectivo que tiene valores de Ki de 1,2, 120, y 257 nM para los receptores p2-, p1-, y p3-adrenergicos, respectivamente (Bilski et al. (1983) J. Cardiovasc. Pharmacol 5, 430).

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Metodos

Ensayo de migracion de celulas individuates

Se recubrieron placas de 35 mm con fondo de vidrio (MatTek Corporation) con colageno I (60 jg/ml) (Cohesion Technologies) en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a 37 °C. Se sembraron en placa fibroblastos de la dermis de ser humano (Cascade Biologics, RU) a una densidad de 25 celulas/mm2 en medio de crecimiento de fibroblastos (FM) (FM: Medio de Eagle Modificado por Dulbecco, DMEM, o que contenia suero de ternero al 10 %) durante 2 horas a 37 °C. Las celulas se incubaron con FM solo (control) o con FM que contenia antagonista selectivo de p2-AR 10 nM (ICI 118.551, Tocris) en el tiempo 0. Las placas de 35 mm con fondo de vidrio se pusieron en una camara de calefaccion, disenada para mantener el medio entre 35-37 °C, y asegurada a la plataforma de un microscopio invertido Nikon Diaphot segun se describe en (Pullar (2006) Chin Med J (Engl) 116, 1029-33). “Velocidad” es la velocidad promedio en jm/min que las celulas recorren en un periodo de tiempo de una hora, segun se muestra en la Figura 1.

Ensayos de geles flotantes y anclados de colageno

Una solucion de colageno bovino de tipo I (97 por ciento) y III (3 mg de colageno/ml, Vitrogen 100, Collagen Corporation, Palo Alto, CA) se mezclo con DMEM de tiple fuerza, DMEM que contenia tampon Hepes 20 mM (Gibco, Grand Island, NY) para mantener el pH neutro, suero de ternero, celulas (desprendidas mediante tripsina de cultivos confluentes en monocapa), y diluciones apropiadas de un agonista del receptor p2-adrenergico (es decir salbutamol) y antagonista (es decir ICI 118.551). Las soluciones individuales se prepararon y enfriaron a 4 °C antes de la mezcla para evitar la gelacion prematura. La solucion final contenia Vitrogen al 40 % (v/v), DMEM al 20 %, DMEM al 30 % con tampon Hepes, y suero de ternero al 10 %. Las celulas se incubaron con la concentracion de farmaco apropiada durante 30 minutos a 37 °C y se anadieron a la mezcla de gel de colageno justo antes de la fundicion de gel a la concentracion de 30.000 por ml. Las estructuras reticulares se fundieron, con 1,7 ml de la solucion final por placa, en placas bacteriologicas de 35 mm (Falcon Labware, BD Biosciences), a las que los fibroblastos se adhieren mal. La mezcla gelifico dentro de los 30 minutos despues de la incubacion a 37 °C en una atmosfera humidificada de aire al 95 por ciento y CO2 al 5 por ciento.

Para determinar el efecto de los antagonistas de p2-AR en la contraccion del gel flotante (como se muestra en la Figura 2), las estructuras reticulares se desprendieron de los lados de las placas despues de 2 h, bordeando los bordes de las placas utilizando una punta esteril de 100 ml y agitando suavemente las placas hasta que los geles se deslizaron libremente. La retraccion de las estructuras reticulares se midio cada dia poniendo las placas sobre una regla plana en un fondo negro. Para determinar el efecto de los agonistas y antagonistas de p2-AR sobre la proliferacion de celulas en un modelo de la dermis herida, los geles permanecieron anclados a un lado de la placa (como se muestra en la Figura 8).

Modelo de herida

Se adquirieron ratones FVB/NJ (p2-AR+/+) del laboratorio The Jackson (Bar Harbor, Maine). Todos los animales utilizados en el estudio eran hembras de entre 8-12 semanas. Los ratones p2-AR+/+ se anestesiaron mediante inyeccion intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg)/xilacina (10 mg/kg) (Pfizer). Se afeito la piel del lomo y se crearon en el centro del lomo dos heridas por escision, de grosor total de 6 mm circulares separada en 2 cm, utilizando un punzon de biopsia de 6 mm esteril (SMS Inc.). Las heridas se trataron por via topica con 100 jl de gel hidroactivo solo (Duoderm, ConvaTec) o que contenia agonista selectivo de p2-AR al 0,1 % (salbutamol) o antagonista selectivo de p2-AR al 0,1 % (ICI 118.551) inmediatamente despues de la formacion de la herida y posteriormente a diario hasta la recoleccion (n = 5-7 ratones por grupo, 2 heridas por raton). Despues de la formacion de la herida cada raton se alojo de forma separada hasta la recoleccion de la herida. Las heridas se dejaron descubiertas y se fotografiaron diariamente de forma digital, para determinar la contraccion de la herida a lo largo del tiempo. Las heridas se recolectaron en los dias 3 y 5 despues de la formacion de la herida mediante la aplicacion cuidadosa de un punzon de 8 mm (SMS Inc.) alrededor del sitio de la herida original y presionando ligeramente para formar un contorno en la piel. Despues se utilizaron tijeras para retirar el sitio de la herida sin danar el delicado lecho de la herida.

Recoleccion, inmunohistoquimica y analisis del tejido

Para el analisis histologico las heridas se fijaron en un fijador de cinc HIC (BD Biosciences). Las biopsias fijadas en cinc se biseccionaron para asegurar que las secciones se tomaban del centro de la herida, se deshidrataban a traves de una serie de etanol xileno, y se incluyeron en parafina. Se tineron secciones transversales de 7 jm de grosor, utilizando la tecnica de hematoxilina eosina (H y E) o se tineron con un anticuerpo contra a-actina de musculo liso (AML, Dako) (Figuras 4, 5 y 8B), colageno III (Rockland) (Figuras 6 y 7), Ly6G-6C (un marcador de neutrofilos, BD Pharmingen) (Figuras 10 y 11), o F4-80 (un marcador de macrofagos, Serotec) (Figuras 12 y 13) seguido de deteccion por diaminobencidina (DAB) (BD Pharmingen) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.

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Se excluyeron del estudio los espedmenes que se danaron en el proceso histologico o que de otro modo no eran interpretables. Se cuantifico el cierre de la herida mediante la medicion del area de la herida de cada herida a partir de las fotos digitales tomadas cada dia con Image J, sitio web del National Institutes of Health. Cada foto se calibro de forma individual (como se muestra en la Figura 3). Se capturaron imagenes de las heridas con alfa actina de musculo liso (AML) tenida a un aumento de 2x en un microscopio vertical Nikon SMZ-U con el programa informatico Nikon ACT-1 (como se muestra en la Figura 4). Se utilizo Image J para determinar el area de tincion de la AML en cada grupo (como se muestra en la Figura 5). Se capturaron las imagenes de las heridas con colageno III tenidos a un aumento de 20x en un microscopio invertido Nikon Eclipse 2000U con el programa informatico NIS-Elements (como se muestra en la Figura 6). La intensidad de la tincion de colageno III se graduo en una escala de 0-6, recibiendo la no tincion una valoracion de 0 y la tincion mas oscura recibiendo una valoracion de 6 (como se muestra en la Figura 7). La tincion de cada herida se valoro en una manera de ocultacion doble y se calculo para cada grupo la intensidad de tincion media.

Se capturaron diez imagenes de las heridas tenidas con Ly-6G-6C y F4-80 (aumento de 6x) en un microscopio invertido Nikon Eclipse 2000U con el programa informatico NIS-Elements (las Figuras 10 y 12 muestran campos representativos). Los diez campos se seleccionaron de la dermis por debajo de los margenes de la herida y a traves del lecho de la herida utilizando un molde para asegurar que las imagenes se capturaban de areas similares en cada herida. El numero de celulas tenidas en cada imagen se conto en una manera de ocultacion doble y se calculo para cada grupo el numero de celulas promedio (como se muestra en las Figuras 11 y 13).

Medicion de la secrecion de TGF-B1. TGF-B2. TGF-B3 y VEGF de fibroblastos de la dermis, y de VEGF de neutrofilos

Se sembraron fibroblastos de la dermis de ser humano (Figuras 9 y 15) o neutrofilos de ser humano (solamente VEGF) (Figura 15) en placas de 6 pocillos y se cultivaron en FM hasta el 60 % de confluencia. El medio se reemplazo en el tiempo 0 con medio solo o que contenia agonista de p2-AR 10 |jM (salbutamol) o antagonista (ICI 118.551). Los sobrenadantes se prepararon y ensayaron utilizando kits de ELISA para TGF-p1, TGF-p2, 15 TGF-p3 y VEGF (R & D systems) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Metodo para el experimento de produccion de heridas en pez cebra

Las aletas caudales de embriones de pez cebra se transfectaron con una hoja de bisturi esteril de 1 mm a partir de la punta. Se incubaron los embriones a 28 °C durante 6 horas en agua estancada +/- isoproterenol (agonista no especifico de p), salbutamol (agonista especifico de p2) o timolol (antagonista no especifico de p2) (todos 10 jM), despues se incubaron con fluorescema-tiramina (Perkin Elmer) seguido de fijacion. Se tomaron imagenes de los embriones en un sistema de microscopio invertido Nikon TE2000E a un aumento de 20x (n = 15-30).

Analisis estadistico

Las variables categoricas se compararon con una prueba Exacta de Fisher de dos colas mientras que todas las variables continuas se compararon con la prueba t de Student para muestras no relacionadas con varianza desigual. Los inventores consideraron P<0,05 como significativo.

Resultados

Haciendo referencia a la Figura 1, la inventora ha demostrado que los antagonistas de p2-AR potencian la migracion de los fibroblastos de la dermis. Ademas, como se muestra en la Figura 2, los antagonistas de p2-AR potencian la contraccion mediada por fibroblastos de la dermis de geles de colageno flotantes. Por consiguiente, a la vista de estas observaciones, la inventora postula que la aceleracion de la reparacion de la heridas mediada por antagonista de p2-AR puede tambien disminuir la accion de los fibroblastos, y de este modo reducir la cicatrizacion.

Para analizar esta hipotesis, se crearon heridas producidas con punzon de 6 mm en el lomo de ratones FVB hembra. Se trataron las heridas de grosor completo diariamente, por via topica, con 100 jl de hidrogel solo o un hidrogel que contenia agonista de p2-AR al 0,1 % (salbutamol) o antagonista de p2-AR al 0,1 % (ICI 118.551). Haciendo referencia a la Figura 3, se muestran los resultados de una cuantificacion macroscopica del cierre de la herida a partir de fotografias digitales diarias las cuales confirmaron la aceleracion esperada del cierre de la herida despues de la aplicacion del antagonista de p2-AR, mientras que el cierre de la herida se retraso en los ratones tratados con agonista de p2-AR. La tincion inmunohistoquimica de secciones de 5 jm de 5 heridas fijadas en cinc, incluidas en parafina, 5 dias despues de la formacion de la herida, demostraron que habia un aumento de las celulas que expresaban a-actina de musculo liso en las heridas tratadas con antagonista de p2-AR, en comparacion con los controles (como se muestra en las Figuras 4 y 5). Ademas, las Figuras 6 y 7 demuestran que habia un aumento en el deposito de colageno III en las heridas tratadas con antagonista de p2-AR, en comparacion con los controles.

Sin embargo, al contrario de las heridas tratadas con antagonista de p2-AR, como se muestra en las Figuras 4 y 5, las heridas tratadas con agonista de p2-AR contenian menos celulas que expresaban a-actina de musculo liso que las heridas no tratadas. Ademas, como se muestra en las Figuras 6 y 7, las heridas tratadas con agonista de p2-AR

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conteman menos deposito de colageno III que las heridas no tratadas de control. Por lo tanto, a la vista de estos datos, parece que el tratamiento con antagonista de p2-AR potencia el cierre de la herida, posiblemente reduciendo la cicatrizacion.

Para modelar la dermis de la herida in vitro, se sembraron fibroblastos de la dermis en geles de colageno adherentes, los cuales mimetizan el estres mecanico presente en el lecho de la herida (Grinnell, 2003, Trends Cell Biol 13, 264-9). Los fibroblastos en las matrices ancladas proliferaran y adoptaran la morfologia elongada, bipolar caracteristica de los miofibroblastos (Arora et al. (1999) Am J Pathol 154, 871-82), mientras que los fibroblastos sembrados en las matrices flotantes se haran quiescentes a los pocos dias. Se sembraron geles de colageno I al 50 % con 30.000 celulas por ml en la ausencia o presencia de un agonista de p2-AR o de un antagonista de p2-AR. Como se muestra en la Figura 8, mientras que los geles tratados con antagonista de p2-AR conteman fibroblastos que proliferaban rapidamente y permanecian anclados, los geles no tratados comenzaron a retraerse dentro de las 96 horas. Sin embargo, el tratamiento con agonista de p2-AR disminuyo la proliferacion de fibroblastos en los geles, lo que dio como resultado la perdida de tension y la liberacion del gel a partir de la placa dentro de las 72 horas.

Se sabe que TGF-p1 estimula la proliferacion de fibroblastos de la dermis (Ghahary et al. (2002) Wound Repair Regen 10, 328-35). Por lo tanto, la inventora formula la hipotesis de que los antagonistas de p2-AR pueden aumentar la produccion de TGF-p1 y/o TGF-p2 y quizas reducir TGF-p3 en los geles anclados que generan la proliferacion prolongada de fibroblastos, y se dispuso a probar esta hipotesis. Por lo tanto, se cultivaron fibroblastos de la dermis en ausencia o presencia de un antagonista de p2-AR (ICI 118.551) o de un agonista de p2-AR (salbutamol) durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes, y se realizaron ELISA para determinar las cantidades de TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3 que secretaban los fibroblastos de la dermis. Como se muestra en la Figura 9, el tratamiento con antagonista de p2-AR aumento los niveles de TGF-p1 en 3 veces y los niveles de TGF- p2 en 1,6 veces, mientras que no tuvo efecto sobre los niveles de TGF-p3. Sin embargo, de forma sorprendente, los agonistas de p2-AR disminuyeron de forma significativa la cantidad de TGF-p1 que se secreto a partir de fibroblastos en 4 veces y aumento la cantidad de TGF-p3 secretada en 5 veces. Por lo tanto, la inventora se sorprendio mas al observar que las alteraciones mediadas por agonista de p2-AR en los niveles de TGF-p1 y TGF-p3 reflejaban los niveles relativos de citocinas halladas en heridas de embriones, las cuales no cicatrizan (Redd et al. (2004) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 359, 777-84). En efecto, se sabe que la reduccion de los niveles de TGF-p1 en el sito

de la herida en el adulto reduce la formacion de cicatriz, mientras que se sabe que la adicion de TGF-p3

recombinante a las heridas en el adulto reduce la inflamacion, la deposito de matriz y por lo tanto la cicatrizacion (Shah et al. (1995) J Cell Sci 108 (Pt 3), 985-1002).

En las heridas en adultos, las plaquetas agranulares de vasos sanguineos danados liberan un coctel de citocinas y factores de crecimiento. El coctel de factores de crecimiento promueve una respuesta inflamatoria rapida, iniciando la quimiotaxis de celulas inflamatorias hacia la herida. Los neutrofilos migran al sitio de la herida dentro de horas desde la formacion de la herida, mientras que los macrofagos se incorporan a las heridas despues de 2-3 dias en los cuales se convierten en una fuente principal de factores de crecimiento, que incluye el factor de crecimiento profibrotico, TGF-p1. Por el contrario, los embriones carecen de plaquetas y los linajes celulares inflamatorios se desarrollan bastante tarde en el desarrollo embrionario. Por consiguiente, el perfil de citocinas/factores de crecimiento de una herida embrionaria es marcadamente distinto del de una herida en el adulto. Las heridas

embrionarias tienen niveles disminuidos de TGF-p1 y p2 y niveles aumentados de TGF-p3 y no tienen respuesta

inflamatoria. Los niveles de TGF-p1 y p2 neutralizantes o de TGF-p3 potenciadores, pueden producir la curacion sin cicatriz en ratones, ratas y cerdos adultos.

Aunque la inventora no desea limitarse a ninguna hipotesis, cree que la reduccion de la incorporacion de celulas inflamatorias a la herida podria disminuir los niveles de TGF-p1 en la herida, y de este modo reducir la fibrosis y la cicatrizacion. Por lo tanto la inventora se dispuso a comprobar esta hipotesis despues de la adicion de un agonista selectivo de p2-AR a las heridas.

Haciendo referencia a las Figuras 10 y 11, la adicion de agonista de p2-AR a las heridas in vivo disminuyo los numeros de neutrofilos presentes en la herida 3 dias despues de la formacion de la herida. Ademas, haciendo referencia a las Figuras 12 y 13, la adicion de agonista de p2-AR a las heridas in vivo disminuyo los numeros de macrofagos presentes en la herida, 3 dias despues de la formacion de la herida. La inventora postula que una disminucion de la inflamacion mediada por agonista de p2-AR podria tambien contribuir a sus efectos anticicatrizacion y antifibrotico.

Conclusiones

La inventora ha demostrado que la aplicacion de un agonista selectivo de p2-AR, tal como salbutamol, al sitio de la herida, da como resultado una disminucion en la cantidad de TGF-p1 y un aumento concomitante de la cantidad de TGF-p3 y que esto media una modification de la funcion, actividad y diferenciacion fibroblastica. Estos cambios en la funcion, actividad y diferenciacion fibroblastica dan como resultado una reduccion del deposito de colageno y una disminucion de la acumulacion de colageno remodelado de forma anomala. Por lo tanto, la inventora cree que un agonista selectivo de p2-AR podria utilizarse como un tratamiento eficaz para varias afecciones medicas

caracterizadas por la fibrosis anomala, en las cuales se indujo mediante traumatismo o como consecuencia de iatrogenia o de susceptibilidad metabolica o genetica.

De forma similar, un antagonista de p2-AR se considera eficaz en condiciones en las cuales se necesita un aumento 5 de la diferenciacion fibroblastica y el aumento concomitante del deposito de colageno, tal como en las cuales se necesita una reduccion de las arrugas de la piel.

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un agonista del receptor p2-adrenergico para su uso en la reduccion de la formacion de una cicatriz queloide o de una cicatriz hipertrofica.

   5
2. 2. El agonista del receptor p2-adrenergico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, para la reduccion de la formacion de una cicatriz queloide o de una cicatriz hipertrofica en una herida que es uno o mas de: una rozadura, una abrasion, incision quirurgica, injerto de grosor parcial de piel, una quemadura, o que se produce como resultado de acne.

   10
3. 3. El agonista del receptor p2-adrenergico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde la quemadura comprende dano tisular que se produce por la exposicion a temperaturas altas o bajas, agentes quimicos o radiacion.

   15 4. Un agonista del receptor p2 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el

   sujeto o individuo es un ser humano.
4. 5. Un agonista del receptor p2 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agonista del receptor p2-adrenergico es uno cualquiera de salbutamol, fenoterol, butoxamina, clembuterol, 20 formoterol o salmeterol.