ES2565380T3 - Método para aislar osteopontina usando alimentaciones concentradas - Google Patents

Abstract

Un método para aislar osteopontina a partir de una alimentación procedente de leche, método que comprende las operaciones de: a) obtener una alimentación procedente de leche que comprende osteopontina, alimentación procedente de leche que tiene un pH en el intervalo de 3,6-6,5 a 25 °C y una conductancia específica en el intervalo de 0,4-1,0 S/m (4-10 mS/cm) a 25 °C, y en donde la alimentación procedente de leche comprende una cantidad total de proteína en el intervalo de 50-250 g/l de alimentación procedente de leche, b) someter dicha alimentación procedente de leche a cromatografía de intercambio aniónico, que incluye poner la alimentación procedente de leche en contacto con un medio de intercambio aniónico, c) opcionalmente, lavar el medio de intercambio aniónico, y d) recuperar la proteína unida al medio de intercambio aniónico, obteniéndose de este modo una composición que comprende osteopontina aislada.

Description

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alimentación procedente de leche en contacto con un medio de intercambio aniónico;

c) opcionalmente, lavar el medio de intercambio aniónico; y

d) recuperar la proteína unida al medio de intercambio aniónico, obteniéndose de este modo una composición que comprende osteopontina aislada.

Más adelante, en los ejemplos, se describe una composición que contiene osteopontina, obtenible mediante el método de la presente invención.

La presente invención ha sido anteriormente descrita con referencia a realizaciones específicas. Sin embargo, dentro del alcance de la invención son igualmente posibles otras realizaciones distintas a las anteriormente descritas. Las diferentes características y operaciones de diversas realizaciones y aspectos de la invención se pueden combinar de modos distintos a los descritos en esta memoria, a menos que se afirme otra cosa.

Ejemplos

Ejemplo 1. Enriquecimiento en osteopontina de un concentrado de lactosuero dulce de conductancia controlada

Protocolo

Los siguientes experimentos de purificación se llevaron a cabo mediante un equipo de cromatografía rápida para proteínas en fase líquida (FPLC; del inglés, fast protein liquid chromatography) provisto de la resina Q-Sepharose Bigbeads para intercambio aniónico fuerte, empaquetada en una columna de 13,3 ml (170 mm x 10 mm). En todos los experimentos se mantuvo el caudal a 3,33 ml/min durante toda la carga, el lavado y la elución. La materia prima era un producto de aislamiento de proteína de lactosuero dulce, y se cargaron 70 g de proteína total en la columna durante cada experimento. Se analizó el contenido de CMP en la materia prima. Se diluyeron muestras de la materia prima hasta una concentración final de proteína de 10% (peso/volumen) y a continuación se ajustaron el pH (pH de 3,0 – 5,7 a 4,7 mS/cm) y la conductancia específica (2,3 – 10,3 mS/cm en un pH de 4,3) mediante la adición de HCl y NaCl, respectivamente. Las proteínas no unidas fueron separadas de la columna mediante lavado con 3 volúmenes de lecho de una disolución 100 mM de NaCl, pH de 5,0. Posteriormente, las proteínas unidas fueron eluidas mediante el paso de una disolución 1 M de NaCl, pH de 5,0, a través de la columna hasta que no se detectó más proteína en el eluato.

Para cada muestra de eluato se analizaron los contenidos de osteopontina (OPN), CMP y proteína total utilizando las técnicas siguientes.

Determinación de proteína total

El contenido de proteína total del eluato se midió mediante una digestión estándar por el método Kjeldahl del modo descrito en Cohen.

Cuantificación de OPN mediante un método de HPLC

Principio analítico: La muestra se filtró a través de un filtro de 0,22 µm y se sometió a HPLC con una columna MonoQ HR 5/5 (1 ml) de Pharmacia y detección a 280 nm. Se calculó la concentración de la muestra mediante el método del patrón externo (comparación con el área del pico de un patrón con un contenido de OPN conocido). Un requisito previo para este procedimiento analítico es que las muestras comprendan OPN relativamente pura según se determina, por ejemplo, mediante SDS-PAGE (Laemmli, 1970), a causa de la baja especificidad del método.

Reactivos: patrón de OPN, agua Milli Q de calidad HPLC, NaCl (Merck), Tris HCl (Sigma).

Tampón A: NaCl 10 mM, Tris HCl 20 mM, pH de 8,0.

Tampón B: NaCl 0,8 M, Tris HCl 20 mM, pH de 8,0.

Se construyó una curva de calibración patrón a partir de 5 patrones en el intervalo de concentraciones de 1-10 mg/ml de patrón de OPN en tampón A. Todos los patrones se filtraron a través de filtros de 0,22 µm antes de ser cargados en la columna.

Muestreo y pretratamiento: Las muestras para el análisis se diluyeron con agua Milli Q de calidad HPLC si estaban fuera del intervalo de la curva de calibración patrón. En algunos casos también fue necesaria una dilución para permitir la unión de la OPN a la resina de intercambio aniónico si estaba presente gran cantidad de NaCl del eluyente. Para el análisis se inyectó una cantidad equivalente a 25 µl de OPN en concentración de 1-10 mg/ml. Las muestras se filtraron a través de filtros de 0,22 µm antes de ser inyectadas en el sistema de HPLC.

Condiciones de la HPLC: Caudal de 1 ml/min; volumen de inyección de 25 µl; gradiente: B al 0% 0-3 min, B al 0-60% 3-17 min, B al 60-100% 17-30 min, B al 100% 30-33 min, B al 100-0% 33-34 min, B al 0% 34-40 min.

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Cálculo y expresión de los resultados: La concentración de OPN en cada muestra se calculó por referencia a la curva patrón y observando las diluciones empleadas.

Se calculó la pureza mediante la proporción entre OPN y proteína total utilizando el factor de Jones específico para OPN de 7,17 ya que la mayor parte o toda la proteína determinada mediante la digestión por el método Kjeldahl era OPN en el contexto real.

Cuantificación de las proteínas principales del lactosuero por HPLC

Separación y cuantificación de proteínas principales del lactosuero, alfa-lactalbúmina, β-lactoglobulina y CMP (caseino-glicomacropéptido), mediante cromatografía de permeación en gel.

La cromatografía de permeación en gel se llevó a cabo utilizando 2 columnas de TSKgel 3000PWxl (7,8 mm x 30 cm) conectadas en serie con una precolumna PWxl fijada (6 mm x 4 cm) (Tosohass, Japón).

La disolución de patrones para la calibración del sistema consistía en 225 mg de CMP, 225 mg de alfa-lactalbúmina y 50 mg de β-lactoglobulina, disueltos en 500,0 ml de tampón de fosfato 0,02 M, pH de 7,5.

Pretratamiento de las muestras: Se disolvieron muestras pulverulentas en tampón de fosfato en concentración de 1 mg/ml y se dejaron las disoluciones durante la noche para la solubilización. Alternativamente, se diluyeron muestras líquidas con tampón de fosfato para obtener un contenido de proteína de aproximadamente 0,1%. Si el contenido de proteína era inferior a 0,1%, la muestra era sometida a medición sin diluir. Todas las muestras se filtraron a través de filtros de 0,22 µm antes de ser inyectadas en la columna.

Cálculo y expresión de los resultados: El porcentaje de proteína individual en la muestra se calculó de acuerdo con

A x 0,1 x F, en donde

B

A = área medida en la muestra

0,1 = factor de conversión para una disolución al 0,1%

F = factor de dilución (100.000/peso de muestra en miligramos)

B = área calculada de proteína individual en la disolución de patrón al 0,1%

Resultados

Contenido de CMP

El contenido de CMP en la materia prima de lactosuero dulce fue 20,1%, pero el CMP resultó sorprendentemente indetectable en las composiciones enriquecidas en OPN del Ejemplo 1.

Efecto del pH de la alimentación sobre la pureza y la producción de osteopontina: La primera serie de experimentos con variación del valor del pH de la alimentación aplicada, mostrada en la Figura 1, muestra que la producción de OPN (miligramos de OPN en 70 g de proteína total en la alimentación) aumenta conforme aumenta el pH de 3 a aproximadamente 4,3. La elevada producción se mantiene cuando se aumenta el pH más allá de 4,3. La pureza de la OPN en las preparaciones de OPN obtenidas es muy alta en valores bajos de pH pero, cuando se aumenta el pH por encima de aproximadamente 4,5, la pureza decae lentamente pero aún es aceptable hasta un pH de aproximadamente 6,5. Sin embargo, la mejor producción de OPN de elevada pureza se obtiene en la ventana de pHs de 3,8-5,5, y particularmente en el intervalo de pHs de 4,3-4,5.

Efecto de la conductancia específica de la alimentación sobre la pureza y la producción de osteopontina: En la Figura 2 se muestran los resultados de la serie de experimentos con conductancia específica variable. A baja conductancia específica la producción es elevada mientras que la pureza es baja. Al aumentar la conductancia específica aumenta la pureza, que alcanza el 100% con una conductancia de aproximadamente 5,5 mS/cm. Cuando se aumenta más la conductancia específica la pureza permanece elevada, mientras que la producción de OPN comienza a decaer cuando la conductancia específica excede de aproximadamente 10 mS/cm. Sin embargo, parece que la mejor producción de OPN de elevada pureza se obtiene en el intervalo de conductancias específicas de 4,59,0 mS/cm, y particularmente en el intervalo de 5-8 mS/cm.

Discusión/conclusión

Efecto del pH: En la Figura 1 se ve que, en un valor de pH por debajo de aproximadamente 3,6, disminuye la carga de la OPN y, por lo tanto, disminuye su unión a los grupos catiónicos de la resina. En valores de pH por encima de aproximadamente 4,5 la pureza de la OPN comienza a disminuir ya que otras proteínas de la alimentación llegan a cargarse negativamente y comienzan a unirse a la resina. De este modo, hemos identificado una ventana de valores

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