ES2566502T3 - Agentes y métodos para provocar una respuesta inmune antitumoral - Google Patents

Agentes y métodos para provocar una respuesta inmune antitumoral Download PDF

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Ihnkyung Jang
Richard Hodes
Jeffrey J. Chiang
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US Department of Health and Human Services
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Columbia University in the City of New York
US Department of Health and Human Services
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Abstract

Una población de células aisladas, sustancialmente purificada, que comprende células T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b para uso como un medicamento, adecuado para uso en rechazo inmune de tumores.

Description

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DESCRIPCION
Agentes y metodos para provocar una respuesta inmune antitumoral
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente de los Estados Unidos serial No. 60/844.240 presentada el 13 de septiembre de 2006.
Esta invencion se realizo con el apoyo del gobierno a traves del programa de investigacion intramural del NIH. Por lo tanto, el Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos.
Esta descripcion de patente contiene material que es sujeto de protection por derechos de autor. El propietario de los derechos de autor no tiene objecion en que cualquier persona pueda hacer una reproduction en facslmil del documento de patente o de la divulgation de la patente ya que aparece en los archivo o registros de la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos, pero por lo demas se reserva todos y cada uno de los derechos de autor.
Antecedentes
Muchos de los tumores cllnicos y experimentales expresan antlgenos tumorales que pueden ser reconocidos por infiltrados de CTL. Numerosas llneas de evidencia indican que los CTL que infiltran el tumor pueden ser activados y expandidos con la vacunacion apropiada. Sin embargo, a pesar del reconocimiento por las celulas T, la mayorla de los tumores antigenicos no son rechazados en el huesped. Los mecanismos que inhabilitan el rechazo del tumor mediado por CTL incluyen baja inmunogenicidad de los tumores tal como la subregulacion de MHC y la interaction debil TCR-MHC-peptido, la supresion activa de la sensibilidad de las celulas T por el mismo tumor, incluyendo el factor de crecimiento beta de transformation derivado del tumor (TGF-beta) y moleculas solubles relacionadas con el MHC clase 1 (MIC), la prevention de la infiltration de celulas T por la barrera del tumor compuesta del estroma infiltrante, as! como los mecanismos inmuno-reguladores del sistema inmune del huesped, tal como la supresion por las celulas t reguladoras CTLA-4, CD4+CD25+, e IL13 producidas por celulas T NK CD4+. Ademas, una amplia evidencia tambien indica que la carencia de un reconocimiento apropiado de las celulas tumorales por los CTL especlficos del tumor tanto en la fase de cebado como en la fase efectora puede contribuir al silencio de una respuesta inmune antitumoral.
Senales para respuestas de celulas T productivas: La teorla de las dos senales
Se requieren dos senales para que las celulas T respondan a los antlgenos presentados por las celulas presentadoras de antlgeno (APC) o celulas objetivo tales como celulas tumorales. El acoplamiento del receptor del antlgeno de celulas T (TCR) con antlgeno (complejos de peptido-MHC) proporcionan la senal inicial. La segunda senal, denominada coestimulacion, se inicia por la interaccion entre correceptores tales como CD28 sobre celulas T y los correspondientes ligandos tales como B7 expresados por las APC. Aunque la estimulacion de las celulas T por las APC profesionales que portan tanto el antlgeno como los ligandos coestimuladoras conduce a la proliferation de celulas T y la production de citoquina, el acoplamiento del TCR con antlgenos en ausencia de coestimulacion trae como resultado la falta de sensibilidad de las celulas T, un estado llamado anergia. Un obstaculo importante en la vigilancia inmune del tumor es que la mayorla de las celulas tumorales no expresan ligandos co-estimuladoras, tales como B7. Por lo tanto, las celulas T que reconocen estas celulas tumorales por lo general no pueden ser completamente activadas y desarrolladas en celulas efectoras, dando como resultado la falla de la vigilancia inmune del huesped contra estos tumores.
La modulation del TCR y las senales coestimuladoras pueden revertir el estado silencioso de las celulas T citotoxicos especlficas del tumor
Las respuestas inmunes contra tumores inmunogenicos son principalmente mediadas por celulas T, que incluyen los CTL cD8+ y las celulas T auxiliares CD4+. La masa del tumor tiene a menudo grandes cantidades de infiltrados de CTL. Sin embargo, estos CTL son principalmente no sensibles a los tumores, ya que son incapaces de ejercer la citotoxicidad a las cargas del tumor. Los experimentos han mostrado que el cebado in vitro de estos infiltrados a traves del TCR en presencia de IL-2 exogeno podrla activar estas celulas para proliferar y desarrollarse en los efectores de los CTL. Sin embargo, cuando estos CTL son transferidos en forma adoptiva en los animales portadores de tumores, a menudo no logran erradicar los tumores establecidos, a menos que se administren simultaneamente una vacuna apropiada, que altera la avidez entre el TCR y el complejo MHC-peptido, as! como una gran cantidad de interleuquina 2 (IL-2), lo que indica que la serialization del mejorada del TCR es esencial para superar la falta de sensibilidad de los CTL especlficos del tumor. Adicionalmente, se ha demostrado que la expresion reforzada de B7 en las celulas tumorales puede inducir respuestas fuertes de CTL, lo que eventualmente trae como resultado la eradication de los tumores inoculados. Se ha logrado tambien un rechazo efectivo del tumor cuando se activan otras rutas de senalizacion coestimuladoras, tales como ICOS (molecula coestimuladora inducible), por las celulas tumorales que expresan al ligando B7HH/B7RP correspondiente. Por lo tanto, la modulacion del TCR y las senales habituales pueden ser un enfoque terapeutico potencialmente poderoso contra el cancer.
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Aunque la expresion forzada de ligandos coestimuladoras en celulas tumorales puede inducir una fuerte respuesta de CTL contra los tumores que expresan antigeno, la aplicacion de este enfoque en terapia clinica se ve obstaculizada por la falta de herramientas eficientes para el suministro de las moleculas coestimuladoras especificamente en las celulas tumorales in vivo. Un enfoque alternativo para inducir respuestas de CTL especificas del tumor es el uso de APC profesionales, tales como celulas dendriticas para presentar antigenos tumorales. Sin embargo, una limitation de este enfoque es que los tumores de inmunogenicidad debil, que son menos susceptibles a la funcion efectora de los CTL, pueden requerir senales coestimuladoras para aumentar la funcion de los CTL. Ademas, ya que las APC profesionales pueden presentar antigenos propios para un amplio espectro de celulas T, la transferencia adoptiva de las APC profesionales cargados con antigeno tumoral puede resultar en el desarrollo de enfermedades autoinmunes sistemicas. La inmunoterapia tumoral es un enfoque prometedor que en una cantidad de modelos animales experimentales, asi como en algunos ensayos clinicos, conduce a la regresion del cancer primario y metastasico establecido. Sin embargo, los enfoques disponibles actualmente siguen siendo menos exitosos de lo deseado. Un obstaculo importante que aun tienen que ser superado se deriva de la observation de que la generation de respuestas efectivas de CTL contra tumores antigenicos requiere de senales coestimuladoras, y que muchos tumores no expresan los ligandos coestimuladores necesarios. Como resultado, las celulas T que reconocen estos tumores son a menudo no sensibles in vivo.
Las respuestas inmunes contra tumores inmunogenicos son mediadas por linfocitos T citotoxicos CD8+ (CTL). A pesar del reconocimiento por las celulas T, la mayoria de los tumores no son rechazados en el huesped. Los mecanismos que pueden evitar el rechazo del tumor mediado por CTL incluyen la inhibition de la sensibilidad de las celulas T por factores derivados del tumor, tal como el factor de crecimiento transformante p (TGF-p) y moleculas solubles relacionadas con MHC clase I secretadas por las celulas del tumor, asi como regulation negativa del sistema inmune del huesped, incluyendo la serialization supresora de CTLA-4, el efecto de las celulas T reguladoras CD25+, y la supresion por IL-13 producida por celulas T NK CD4+. Ademas de estos mecanismos de supresion activa, la falta de reconocimiento efectivo de los tumores por las celulas T puede desactivar una respuesta inmune antitumoral, por ejemplo en ausencia de TCR y/o de senales coestimuladoras. Por lo tanto, subsiste la necesidad de identificar agentes y metodos que permitan y/o mejoren las respuestas inmunes antitumorales en ausencia de senales coestimuladoras.
Resumen de la invencion
De acuerdo con un aspecto de la presente invention, se proporciona una poblacion aislada, sustancialmente purificada, de celulas que comprende celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 en la presente memoria.
De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se proporciona una poblacion aislada, sustancialmente purificada, de celulas que comprende celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b para uso de acuerdo con la reivindicacion 2 en la presente memoria.
En ciertos aspectos, la description proporciona metodos para elaborar una celula T CD8+ que no requiere de estimulacion a traves de un correceptor con el fin de que la celula se active o prolifere en respuesta al contacto a traves de su receptor de celula T. Tales metodos se basan en la funcion de reduccion/eliminacion de Cbl-b, la reduction/ elimination de la expresion genica de Cbl-b, o la desactivacion del gen mismo de Cbl-b.
La descripcion proporciona un metodo para estimular, expandir, proliferar o inducir celulas T CD8+ en una forma que no requiera de coestimulacion del correceptor, comprendiendo el metodo, o en ciertas realizaciones consistiendo los metodo esencialmente en: (a) proporcionar celulas T CD8+, y (b) reducir la actividad de Cbl-b en las celulas T CD8+, estimulando, expandiendo, proliferando, o induciendo celulas T CD8+ en una forma en la que CD28 no fue coestimulada. Los niveles de Cbl-b y de actividad pueden ser reducidos por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, incluyendo pero sin limitarse a, los metodos descritos en la presente memoria, por ejemplo mediante el suministro de un ARN inhibidor de la SEQ ID No: 1 en las celulas T CD8+.
La descripcion proporciona una poblacion aislada, purificada de celulas humanas que comprenden celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b. En ciertos aspectos, la poblacion comprende aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% de celulas T CD8+. La descripcion proporciona una poblacion aislada, purificada de celulas humanas que consiste esencialmente de celulas T CD8+ con actividad reducida Cbl-b. En ciertos aspectos, las celulas T CD8+ son aisladas de infiltradas de tumor de un sujeto que padece un tumor, y son modificadas para reducir el nivel de Cbl-b en las celulas T CD8+.
La descripcion proporciona un metodo para inducir una respuesta inmune antitumoral en un sujeto, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una poblacion de celulas (ya sea del sujeto o de otra fuente) que comprende celulas T CD8+, (b) reducir la actividad de Cbl-b en las celulas T CD8+, (c) administrar las celulas de la etapa (b) al sujeto. La descripcion proporciona un metodo para inducir o mejorar una respuesta inmune antitumoral en un sujeto, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una poblacion de celulas que comprende celulas T CD8+, con actividad reducida de Cbl-b en las celulas T CD8+, (b) administrar las celulas de la etapa (a) al sujeto. En ciertos aspectos, la
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poblacion que comprende celulas T CD8+ se alsia de infiltrados tumorales de un sujeto. En ciertos aspectos, la poblacion comprende aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% celulas T CD8+. En ciertos aspectos, la poblacion purificada de celulas consiste esencialmente de celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b. En ciertos aspectos, la respuesta inmune antitumoral inducida o mejorada es una respuesta inmune especlfica del antlgeno tumoral. En ciertos aspectos, la respuesta inmune antitumoral inducido o mejorado es al menos mediada por celulas T CD8+ que tienen un receptor de celulas T (TCR) que es especlfico para un antlgeno o antlgenos de tumor.
En cierto aspecto, la poblacion de celulas se deriva de una llnea de celulas clonales que expresan un receptor de celulas T predeterminado (TCR). En otro aspecto, el TCR reconoce un antlgeno tumoral. En ciertos aspectos, las celulas T CD8+ se proporcionan a partir de un clon de celulas T CD8+. En ciertos aspectos, el clon de celulas T CD8+ comprende un transgen del TCR. En ciertos aspectos, la transgen es especlfico para un antlgeno tumoral. En ciertos aspectos, el antlgeno tumoral es un antlgeno especlfico del tumor.
La descripcion proporciona un metodo para inducir una respuesta inmune antitumoral en un sujeto que padece un tumor, comprendiendo el metodo: (a) aislar del sujeto una poblacion de celulas que comprende celulas T CD8+, (b) reducir la actividad de Cbl-b en las celulas T CD8+ o la ablacion de Cbl-b en las celulas T CD8+, y (c) administrar las celulas de la etapa (b) al sujeto. En ciertos aspectos, la poblacion que comprende las celulas T CD8+ se alsla de infiltrados tumorales de un sujeto. En cierto aspectos, la poblacion comprende aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% celulas T CD8+. En ciertos aspectos, la poblacion purificada de celulas consiste esencialmente de celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b.
En ciertos aspectos, los metodos comprenden una etapa opcional de estimulacion de la poblacion que comprende celulas T CD8+ para que proliferen. En otros aspectos, los metodos comprenden una etapa opcional de estimulacion de la poblacion de celulas T CD8+ para que proliferen en presencia de celulas tumorales aisladas del sujeto, para aumentar el numero de celulas T CD8+ especlficas del tumor, incluyendo las celulas T CD8+ funcionalmente deficientes/sometidas a ablacion en Cbl-b. En otros aspectos, los metodos comprenden una etapa opcional de separacion de las celulas T CD8+ de la poblacion de celulas y la estimulacion de las celulas T CD8+ con celulas tumorales aisladas del sujeto para aumentar el numero de celulas T CD8+ especlficas del tumor. En ciertos aspectos, los metodos comprenden una etapa opcional adicional que comprende poner en contacto las celulas T CD8+ especlficas del tumor con un anticuerpo anti-CD3, o IL-2, o una combinacion de los mismos, para aumentar adicionalmente el numero de celulas T CD8+ especlficas del tumor, incluyendo las celulas T CD8+ funcionalmente deficientes/sometidas a ablacion en Cbl-b. Las etapas opcionales se pueden realizar antes o despues de la etapa de reduccion de la actividad de Cbl-b. En ciertos aspectos, las celulas T CD8+ se alslan de infiltrados tumorales. En ciertos aspectos, las celulas T CD8+ son policlonales. En ciertos aspectos, las celulas T CD8+ se alslan a partir de organos sangulneos o linfaticos perifericos. En ciertos aspectos, la proliferacion de las celulas T CD8+ se estimula con anticuerpo anti-CD3, o la exposicion a IL-2, o una combinacion de los mismos.
En ciertos aspectos, la reduccion o ablacion de la actividad de Cbl-b se logra mediante uno o mas de: (i) poner en contacto las celulas T CD8+ con un agente qulmico que inhibe la expresion o actividad de Cbl-b, (ii) la introduccion de ARNi de la SEQ ID NO: 1 (5'-CAGGAGTATGAGACAGAAG-3'), que dirige Cbl-b en las celulas T CD8+, (iii) desactivar el gen que codifica Cbl-b, o cualquier metodo adecuado, (iv) la introduccion de una forma dominante negativa de Cbl-b. En ciertos aspectos, las moleculas de ARNi, o las formas Cbl-b negativas dominantes pueden ser expresadas por vectores retrovirales que pueden comprender un marcador fluorescente, pero no limitado a una GFP o cualquiera de sus variantes, permitiendo as! distinguir y/o aislar celulas, incluyendo celulas T CD8+, que tienen actividad de Cbl-b reducida/ablacionada. En ciertos aspectos, los metodos comprenden una etapa opcional de separar especlficamente celulas T CD8+, que tienen actividad de Cbl-b reducida/ablacionada. En ciertos aspectos, los metodos comprenden una etapa opcional adicional de estimular la poblacion que comprende las celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b para que proliferen.
La invencion proporciona un metodo para identificar un agente que afecta la expresion o actividad Cbl-b, comprendiendo el metodo: (a) la estimulacion de una celula T CD8+ con un anticuerpo anti-CD3 en ausencia de coestimulacion (con un anticuerpo anti-CD28), (b) poner en contacto la celula T CD8+ con un agente candidato, (c) medir los niveles de estimulacion o proliferacion de celulas T CD8+, en donde un agente que conduce a la estimulacion o proliferacion de celulas T CD8+ es indicativo de un agente que subregula la baja la actividad o expresion de Cbl-b. En ciertos aspectos, la estimulacion de las celulas se mide por el nivel de expresion de citoquinas. En ciertos aspectos, poner en contacto la celula con un agente puede hacerse antes, despues, o durante la estimulacion de la celula con un anticuerpo anti-CD3 en ausencia de coestimulacion con un anticuerpo anti-CD28.
La descripcion proporciona un metodo de cribado para identificar un agente que afecta la actividad de Cbl-b, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto una fuente de Cbl-b con un agente, (b) determinar si el agente (i) disminuye la actividad de Cbl-b, o (ii) afecta la proliferacion de celulas T no modificadas inducidas por TCR, o la submodulacion o la supresion de TGF-beta de la proliferacion de celulas T. En este metodo, si el agente disminuye la submodulacion de TCR inducida por TCR, mejora la proliferacion de celulas T no modificadas inducidas por TCR, o elimina la supresion de TGF-beta, entonces esto es indicativo de que el agente puede disminuir la actividad de
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Cbl-b. En ciertos aspectos, el metodo puede comprender ademas una etapa para determinar si el agente se une a Cbl-b. En ciertos aspectos, la fuente es: una celula que comprende proteina Cbl-b, un extracto celular que comprende proteina Cbl-b, una proteina Cbl-b recombinante, una proteina Cbl-b purificada, una proteina Cbl-b aislada, o un polipeptido Cbl-b sintetico.
La description proporciona un metodo para tratar un tumor en un sujeto, comprendiendo el metodo la administration de un agente, que incluye un agente tal como se identifica en esta memoria por los metodos de cribado, que inhibe la actividad de Cbl-b, en donde el agente induce una respuesta inmune antitumoral. En un aspecto, el agente induce o mejora una respuesta antitumoral de celulas T CD8+. En un aspecto, la respuesta antitumoral de celulas T CD8+ es especifica del antigeno del tumor. En ciertos aspectos, el agente comprende una molecula de ARNi, por ejemplo ARNi de la SEQ ID NO: 1 (5'-CAGGAGTATGAGACAGAAG-3 ').
En ciertos aspectos, el sujeto tratado por cualquiera de los metodos en la presente memoria sufre de cualquiera de los siguientes tipos de tumores: melanoma, linfoma, por ejemplo linfomas espontaneos desarrollados por pacientes con ATM, o cualquier tumor solido que expresa MHC-I con un antigeno que puede ser reconocido por CTL. En ciertos aspectos, el sujeto es un animal que pueden desarrollar tumores, tales como un humano, canino, felino, roedor, y similares.
Un desafio importante a los esfuerzos encaminados a inducir una respuesta inmune antitumoral efectiva es que las celulas T CD8+, que desempenan un papel destacado en estas respuestas, puede ser incapaz de responder a los tumores que carecen de senales coestimuladoras, lo que a menudo resulta en tolerancia o anergia de las celulas T especificas del tumor. La descripcion establece que la activation in vitro o in vivo de las celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b (por ejemplo, pero no limitado a, celulas T CD8+ de Cbl-b'7'), no depende de la coestimulacion de CD28. Por ejemplo, ratones Cbl-b-/- in vivo, pero no controles de tipo silvestre, rechazan de manera eficiente linfomas E.G7 y EL4 que no expresan ligandos B7. La descripcion tambien muestra que la introduction de una mutation de Cbl-/- en ratones con ATM-/- reduce marcadamente la incidencia de linfomas timicos espontaneos que se producen en ratones con ATM-/-. Un estudio inmunohistologico muestra que los tumores E.G7 de ratones Cbl-b-/- pero no de tipo silvestre, contienen una infiltration masiva de celulas T CD8+. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la descripcion establece que la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de Cbl-b-/- purificadas, pero no de celulas T CD8+ de tipo silvestre, conduce a una eradication eficaz de tumores establecidos. La descripcion establece que la ablation de Cbl-b en las celulas T CD8+ se puede utilizar en un metodo para provocar respuestas inmunitarias contra los tumores.
En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para inducir una respuesta antitumoral por la transferencia adoptiva a un sujeto de celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b. En ejemplos no limitantes, celulas T CD8+ de Cbl-b-/- pueden ser ampliamente eficaces contra una amplia clase de tumores somaticos, la mayoria de los cuales no expresan ligandos coestimuladores. La capacidad de las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- para producir respuestas sustanciales de citoquina y para actuar de forma independiente de coestimulacion con cD28 y ayuda de celulas T CD4+ podria evitar la necesidad de administrar grandes cantidades de citoquinas o de inmunizar a los pacientes con vacunas disenadas para mejorar la serialization coestimuladora y las respuestas de celulas T auxiliares. En ciertos aspectos, se podria mejorar el uso clinico de linfocitos que infiltran tumores (TIL) en la inmunoterapia adoptiva, mediante la ablacion de Cbl-b. La ablacion de la funcion de Cbl-b puede lograrse por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo pero no limitado a ARNi o la expresion de una forma negativa dominante del gen cbl-b.
La descripcion proporciona metodos para inducir una respuesta inmune contra un tumor en un sujeto, incluyendo, pero no limitado a, los metodos de transferencia adoptiva, que no requieren de la coadministracion al sujeto de citoquinas y/o componentes de vacuna exogenos.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra la proliferation independiente de CD28 y la production de citoquinas por celulas T CD8+ de Cbl- b-/-. La figura 1a muestra la produccion de IL-2 e IFN-y. Las celulas T CD8+ purificadas a partir de ratones tipo silvestre (TS) y Cbl-b-/-, fueron estimuladas ya sea con anticuerpo anti-CD3 unido a la placa o anticuerpos anti-CD3 unido a la placa + anticuerpos anti-CD28 solubles. Se visualizaron las celulas productoras de IL-2 e IFN-y por tincion intracelular y se analizaron por citometria de flujo. Se muestran las graficas de contorno de la tincion intracelular para la expresion de IL-2 e IFN-y en celulas T CD8+. Los porcentajes de celulas productoras de IL-2 e IFN-y se indican en las graficas. La figura 1b muestra la respuesta proliferativa inducida por TCR. Las celulas T CD8+ purificadas a partir de nodos linfaticos y de bazos de raton Cbl-b-/- y de tipo silvestre fueron estimuladas con diversas concentraciones de anticuerpos anti-CD3 en presencia o en ausencia de anticuerpos anti-CD28. La proliferacion celular se determino por incorporation de 3[H]-timidina y se expreso como la media +/- DE de muestras por triplicado. Se muestran los representantes de mas de tres experimentos independientes. Las Figuras 1c, d muestra la resistencia de celulas T cD8+ de Cbl-b-/- a la supresion de TGF-p. Los histogramas (Fig. 1c) muestran intensidades de CSFE de celulas T CD8+ de TS y marcadas con Cbl-b-/- despues de 3 dias de estimulacion anti-CD3 y anti-CD28. Las celulas se cultivaron en ausencia o en presencia de diferentes concentraciones de TGF-p, como se indica en la figura. Las
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graficas de contorno (Fig. 1d) muestran la produccion de IFN-y en ausencia o en presencia de TGF-p. Los porcentajes de celulas IFN-y+ se indican en las graficas.
La Figura 2 muestra la erradicacion de los tumores inoculados en ratones Cbl-b-/-. La Figura 2a muestra las tasas de crecimiento de tumores inoculados con E.G7. Se inocularon 106 celulas E.G7 en los costados de ratones Cbl-b-/" o de tipo silvestre (TS) mediante inyeccion subcutanea. Se documento el crecimiento del tumor como el volumen total del tamano del tumor. En la parte superior se muestran las tasas de crecimiento de los tumores E.G7 en un experimento representativo. Cada curva representa un raton individual. Las barras inferiores representan los porcentajes de ratones con crecimiento tumoral al final de la septima semana despues de la inoculacion del tumor. La Figura 2b y la Figura 2c muestran las tasas de crecimiento de tumores EL4. Se inyectaron dosis bajas (5 x 104 celulas/raton) y dosis altas (2,5 x 105 celulas/raton) de celulas EL4 por via subcutanea en los costados de cinco ratones TS y 5 ratones Cbl-b-/", respectivamente. Los diagramas muestran resultados respectivamente representativos de 4 o 2 experimentos independientes inoculados ya sea con tumores de baja dosis (Figura 2b) o de dosis alta (Fig.2c). Cada curva representa un raton individual. La Figura 2d muestra los porcentajes de ratones supervivientes (TS, n = 13; Cbl-b-/", n = 29) durante el transcurso del crecimiento del tumor. Cuando el volumen del tumor alcanza aproximadamente 5.000 mm3, se sacrificaron los ratones y se registraron como muertos. La Figura 2e muestra de rechazo de tumores EL4 por ratones Cbl-b'/'CD28'/'. Se inyectaron celulas EL4 (5 X 104 celulas/raton), y se hizo seguimiento al crecimiento del tumor como se describe en B. El numero de ratones con crecimientos tumorales se indica en la parte superior de cada columna.
La Figura 3 muestra que el rechazo del tumor en ratones Cbl-b'/_ es mediado por celulas T CD8+ de Cbl-b'/_. La Figura 3a muestra la inmunohistologla de las celulas CD8+ que infiltran el tumor. Se muestran las secciones de tumores tenidos con H&E (izquierda) o anticuerpo anti-CD8 (derecha). Las celulas CD8+ son las celulas positivas para FITC (verde). Los tumores eran de ratones Cbl-b'/_ y de tipo silvestre (TS) y a los 7 o 19 dlas despues de la inoculacion. La Figura 3b muestra el analisis por citometrla de flujo de infiltrados tumorales. Se prepararon infiltrados tumorales de tumores de ratones de tipo silvestre (TS) o Cbl-b'/_. Estas celulas se tineron con anticuerpo anti-TCRp, anti-CD8 y anti-CD44 y se analizaron en LSR II. En la parte superior izquierda se muestran las graficas de contorno de la expresion de CD8 y TCRp en celulas que infiltran el tumor. Los porcentajes de celulas CD8+ TCRp+ se indican en las graficas. Los porcentajes de celulas T CD8+ TCRp+ en los infiltrados tumorales totales se resumen y se muestran como barras (arriba a la derecha). Los histogramas (abajo) muestran los niveles de expresion de TCRp y CD44 en las celulas T CD8+ infiltrantes. La Fig.3c, erradicacion de tumores E.G7 establecidos por celulas T CD8+ de Cbl-b'A transferidos en forma adoptiva. Se inocularon 106 celulas E.G7 en ratones C57BL/6 mediante inyeccion subcutanea. Siete dlas despues de la inoculacion, se transfirieron 3 x 106 celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ o de tipo silvestre (TS) en los ratones portadores de tumores mediante inyeccion intravenosa. Se muestran los volumenes de los tumores en diferentes puntos de tiempo despues de la transferencia de celulas T CD8+. Las curvas representan el tamano de los tumores en ratones individuales. Las barras rellenas (abajo) representan porcentajes de ratones con tumor. El numero total de ratones incluidos en estos experimentos se indican en la grafica. La Figura 3d muestra el analisis por citometrla de flujo de infiltrados tumorales. Los infiltrados tumorales se prepararon a partir de tumores de ratones Cbl-b'/_ o de TS. Estas celulas se tineron con anticuerpos anti-TCRp, anti-CD8, anti-CD4 y anti-CD44 y se analizaron en LSR II. Se identificaron las celulas Foxp3+ (Treg) por tincion intracelular con un anticuerpo anti-Foxp3 de acuerdo al protocolo del fabricante. En la parte superior izquierda se muestran las graficas de contorno de la expresion de CD8 y TCRp en celulas infiltrantes de tumor de 1 a 3 experimentos independientes. Los porcentajes de celulas CD8+ TCRp+ se indican en las graficas. Los porcentajes de infiltrados de CD8+ TCRp+, CD4+, y Treg en los infiltrados tumorales totales se resumen y se muestra como barras.* P <0,001, ** P <0,005. Los histogramas muestran los niveles de expresion de TCRp y CD44 en las celulas T CD8+ infiltrantes. La Figura 3e muestra la erradicacion de tumores E.G7 establecidos por celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ o Cbl-b'/_ OT1 adoptivamente transferidas. Se inocularon 106 celulas E.G7 en ratones C57BL/6 mediante inyeccion subcutanea. Siete dlas despues de la inoculacion, se transfirieron 3 x 106 celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ OT1 o TS OT1 (abajo) o celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ o TS purificadas (arriba) en ratones portadores de tumores mediante inyeccion intravenosa. A la izquierda se muestran los volumenes de los tumores en diferentes puntos de tiempo despues de la transferencia de celulas T CD8+. Los genotipos de las celulas del donante se indican en la parte superior de cada grafica. Los resultados son de 1 de 5 o mas experimentos independientes. La Figura 3f muestra los porcentajes de ratones receptores sobrevivientes (TS, n = 11; Cbl-b_/_, n = 13) que recibieron celulas T CD8+ de Cbl-b'A o TS. Cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 5.000 mm3, se sacrificaron los ratones fueron y se registraron como muertos.
La Figura 4 muestra el analisis de Kaplan-Meier de la incidencia de tumores en ratones mutantes dobles Cbl-b'A ATM'r La supervivencia libre de linfoma tlmico se representa graficamente en funcion del tiempo en dlas para ratones Cbl-b'A, ATM'/_ (n = 25) y Cbl-b'/_ ATM'/_ (n = 21). Los ratones doblemente mutantes Cbl-b'A ATM'/_ exhibieron una incidencia reducida de linfoma espontaneo.
La Figura 5 muestra la produccion de IL-2 e IFN-y de las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ en presencia de celulas T CD4+. Las celulas T totales de ratones de tipo silvestre (TS) o Cbl-b'/_ se estimularon con anticuerpo anti-CD3 solo unido a la placa o anticuerpos anti-CD3+ anti-CD28 solubles. Se determino la produccion de IL-2 e INF-y mediante tincion intracelular y se analizo por citometrla de flujo. Los porcentajes de celulas productoras de IL-2 e iNF-y se indican en las graficas. Los resultados muestran que la produccion de IL-2 e INF-y por celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ fue
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significativamente mas alta que la de las celulas T CD8+ de TS despues de la estimulacion con anticuerpo anti-CD3 incluso en presencia de celulas T CD4+.
La Figura 6 muestra que la activacion de celulas T de Cbl-b-/- suprime la dependencia de la coestimulacion con CD28. La figura 6a muestra proliferation de celulas T in vitro y la production de IL-2. Se purificaron celulas T CD4+ de bazo de ratones Cbl-b-/- y de tipo silvestre usando un kit de purification de celulas T CD4+ (Accurate). Se estimularon las celulas T CD4+ purificadas (105 celulas/pozo, placa de 96 pozos) ya sea con anticuerpo anti-CD3 solo unido a la placa (2C11, 5 pg/ml), o con anticuerpos anti-CD3 (unido a la placa) y anti-CD28 (soluble) (37,51, 2 pg/ml). Se determino la proliferacion celular y la secretion de IL-2 de acuerdo con un protocolo publicado (56, 60). La figura 6b muestra que la mutation de Cbl-b'/_ rescata la respuesta de anticuerpos dependiente de T en ratones CD28'/_. Para el ensayo de proliferacion de celulas T (izquierda), se purificaron celulas T CD4+ de bazo y se determino la proliferacion celular, despues de la estimulacion con anticuerpos anti-CD3, anti-CD3 y anti-CD28 o con PMA e ionomicina, como se describio anteriormente. Para las respuestas de anticuerpo dependientes de T (derecha), se inmunizaron ratones Cbl-b'/_ CD28'/_, Cbl-b'A, CD28'/_ y de tipo silvestre con 100 pg de NP-KLH en adyuvante de alumbre por inyeccion intraperitoneal. Diez dlas despues, se tomaron muestras de sangre de los ratones, y se determinaron los tltulos de anticuerpos anti-NP en suero de diversos isotipos de Ig por ELISA. Se presentaron arbitrariamente los tltulos de anticuerpos anti-NP de diverso isotipos de Ig en ratones de tipo silvestre como 100%. Los datos representan valores medios de los tltulos de anticuerpos de 5-8 ratones (de 2-3 meses de edad) de cada genotipo.
La Figura 7 muestra la activacion independiente CD28 de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_. Se purificaron las celulas T de ganglios linfaticos de ratones C57BL/6 (B6) o Cbl-b'/_, mediante MACS, estimuladas ya sea con anticuerpo anti-CD3 solo unido a la placa (5 pg/ml) o en combination con anticuerpos anti-CD28 solubles (2 pg/ml). Veinte horas despues, se anadieron 10 pg/ml de Brefeldina A en el cultivo para bloquear la secrecion de citoquinas. Se cultivaron las celulas durante 3 horas adicionales. Despues de la permeabilizacion, se tineron las celulas con anticuerpos anti- CD8 (PE) y anti-IL-2 (FITC) (Figura 7a) o anti-Y (FITC) (Figura 7b) y luego se analizaron en un LSR II. Se indican los porcentajes de celulas positivas para IL-2 e IL-y CD8+ o CD8-. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
La figura 8 muestra la resistencia de ratones Cbl-b'A a tumores E.G7, EL4 o B16 implantados. La Figura 8a y la Figura 8b muestran el rechazo de los tumores E.G7 por ratones Cbl-b'/_. Se inocularon aproximadamente 106 celulas por raton en forma subcutanea en ratones hembra companeros de camada de tipo silvestre (TS) y Cbl-b'/_ (8 semanas de edad) en el dla 0. Se determinaron las tasas de crecimiento de los tumores inoculados mediante los tamanos de los tumores y se graficaron en diametro de acuerdo a (36) (Figura 8a). Las tasas de mortalidad representan el porcentaje de ratones que murieron ya sea dentro de las 5 semanas despues de la inoculation del tumor o que se sacrificaron cuando el tamano de los tumores se hizo mas grande de 20 mm de diametro (Figura 8b). Los resultados representan el 10 ratones C57BL/6 y 18 Cbl-b'/_. La Figura 8c y la Figura 8d muestran el rechazo de los tumores EL4 y B16 por los ratones Cbl-b'/_. <se inocularon 2,5 x 104 celulas EL4 o 1,0 x 104 celulas B16 en los costados de los ratones C57BL/6 o Cbl-b'/_ (8-10 semanas de edad) por inyeccion subcutanea.
La Figura 9 muestra que los ratones Cbl-b'/_ con reducida cantidad de celulas T son susceptibles a tumores E.G7. La Figura 9a muestra el agotamiento de las celulas T. Se inyectaron anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 y (100 pg/raton) en ratones Cbl-b'A en forma diaria por inyeccion intravenosa durante 3 dlas consecutivos. Dos dlas despues de la ultima inyeccion, se sacrificaron los ratones, y se analizaron las celulas del bazo y de los ganglios linfaticos mediante FACS. Se tineron las celulas con anticuerpos anti-CD3 (un marcador de celulas T) y anti-B220 (un marcador de celulas B) o con anti-CD4 y anti-CD8, respectivamente. La Figura 9b muestra el crecimiento de tumores E.G7 en ratones Cbl-b_/" con cantidad reducida de celulas T. Se inyectaron aproximadamente 106 celulas E.G7 en forma subcutanea en los costados de los ratones Cbl-b'/_ tratados con anticuerpo anti-CD4 y anti-CD8 (anti-CD4,8) (negro) (n = 3) y no tratados (NT) (rojo) (n = 5), respectivamente. La tasa de crecimiento de los tumores se documento semanalmente.
La Figura 10 muestra la infiltration de celulas CD8+ en tejido tumoral de E.G7. Se inocularon 1x106 celulas E.G7 en forma subcutanea en los costados de ratones Cbl-b'/_ y tipo silvestre. La Figura 10a muestra el analisis inmunohistologico de infiltrados de leucocitos infiltrantes en tejidos tumorales. Se sacrificaron los ratones 20 dlas despues de la inoculacion del tumor. Se recolectaron los tejidos tumorales de ratones de tipo silvestre (B6) y Cbl-b'/_ (Cbl-b'/_) y se embebieron en Tissue-Tek (Sakura). Se tineron las celulas T CD8+ (verde) en las secciones criogenicas con anticuerpo anti-CD8 biotinilado seguido por estreptavidina-Alexa 488 (Molecular Probes). H&E: coloration de hematoxilina y eosina. La Figura 10b muestra el analisis de citometrla de flujo de celulas T CD8+ que infiltran el tumor. Se recolectaron los tejidos tumorales de ratones C57BL/6 y Cbl-b'/_ el dla 20 despues de la inoculacion de celulas tumorales. Se cortaron los tejidos en pequenos pedazos (menos de 2 mm de diametro) y se digirieron con colagenasa (1 pg/ml) a 37°C durante 30 minutos. Despues la digestion, se removieron las celulas muertas por centrifugation Ficoll. Se recolectaron las celulas viables de la interfase, se lavaron tres veces con medio DMEM que contenla FCS al 5%, se tineron con anticuerpos anti-CD8a (PE-Cy7), anti-TCRp (PE), anti-CD62L (FITC), y anti-CD44 (APC), y luego se analizaron en un lSr II para FACS. En la parte superior se muestran las coloraciones con CD8 y TCRp de las celulas de tumores de ratones C57BL/6 (B6) o Cbl-b'A. Los porcentajes de
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celulas T CD8+ (cerrado) se muestran en las graficas. Los histogramas inferiores muestran respectivamente la expresion de TCRp, CD62l o CD44 o en las celulas T CD8+ cerradas.
La Figura 11 muestra el rechazo de los tumores E.G7 establecidos por las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ transferidas de forma adaptiva. Para generar ratones que tengan tumores E.G7, se inocularon ratones C57BL/6 (8-10 semanas de edad) en forma subcutanea 106 celulas E.G7, que produjeron tumores subcutaneos con un volumen aproximado de 5 x 5 x 5 mm3 en dos semanas. Dos semanas despues de la inoculacion, se transfirieron 3 x 106 celulas T CD8+ purificadas ya sea de ratones C57BL/6 de tipo silvestre o Cbl-b-/- por inyeccion intravenosa. Se purificaron las celulas T CD8+ mediante MACS hasta un 95% de pureza. En las siguientes semanas, se hizo seguimiento a los tamanos de los tumores con un microcalibrador y se documentado como volumen (mm3). Se muestran las estadlsticas de los tamanos de los tumores de ratones con tumores que recibieron celulas T CD8+ de tipo silvestre (izquierda) o Cbl-b-/- (derecha).
La Figura 12 muestra que las celulas T CD8+ de Cbl-b-/" son resistentes a la supresion de TGF-beta. Se purificaron las celulas T CD8+ de los ganglios linfaticos de ratones de tipo silvestre y Cbl-b-/" mediante MACS, utilizando un protocolo de enriquecimiento de celulas CD8 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Para examinar la proliferacion celular, se marcaron primero las celulas con CFSE de acuerdo con las e instrucciones del fabricante (Molecular Probe). Se estimularon las celulas marcadas con anti-CD3 unido a la placa (5 pg/ml) y anti- CD28 soluble (2 pg/ml) en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de TGF-beta. Despues de 3 dlas de cultivo, se recolectaron las celulas, se tineron con anticuerpo anti-CD8 (PE), y luego se analizaron en un LSR II. La tincion intracelular de IFN-y se realizo como se describe en la presente memoria. La Figura 12a muestra histogramas de intensidad de CFSE de las celulas T CD8+ cerradas. Figura 12b, estadlsticas de la proliferacion celular medida con base en tres experimentos independientes de marcacion con CFSE. Figura 12c tincion intracelular de IFN-y en celulas T CD8+ cultivadas en ausencia o en presencia de TGF-beta.
La Figura 13 muestra la desactivacion de la expresion de Cbl-b por ARNpi e infeccion retroviral de celulas T primarias cultivadas. La Figura 13a muestra un mapa esquematico del vector retroviral basado en hCD2 para la expresion de ARNpi. Se indican los elementos de un 5'-LTR viral, un promotor H1 (Pro (H1)), ARNpi, un promotor de ubiquitina (Pro (Ubi)), y un 3'LTR. La Figura 13b muestra un analisis de transferencia tipo Western de la expresion de Cbl-b en celulas 293 T transfectadas en forma transitoria. Se lisaron las celulas 293t transfectadas con ARNpi de Cbl-b, se sometieron a transferla tipo Western las Cbl-b en los lisados y se detectaron mediante un anticuerpo anti-Cbl-b. Se cuantifico la carga de protelna mediante un anticuerpo anti-actina. La Figura 13c muestra la infeccion retroviral de celulas T cultivadas. Se activaron las celulas T de ganglio linfatico de ratones C57BL/6 de tipo silvestre in vitro y se infectaron con un vector retroviral vaclo de expresion de ARNpi con base en hCD2 como se describe en el texto. Las celulas infectadas por retrovirus se visualizaron por FACS despues de tincion de las celulas con anticuerpo anti-CD2 humano. El porcentaje de celulas hCD2+ se indica en los histogramas.
La Figura 14 muestra la restauracion de la relacion de celulas T CD8+ con respecto a las CD4+ en timocitos doblemente desactivados c-Cbl y Cbl-b (c-Cbl Cbl-b dKO) que expresan un transgen c-Cbl de tipo silvestre. Los timocitos c-Cbl Cbl-b dKO exhibieron un aumento en celulas de linaje CD8+ (celulas GFP-). Para introducir un c-Cbl de tipo silvestre en celulas madre hematopoyeticas, se cultivaron celulas c-Cbl Cbl-b dKO BM tratadas con 5-FU durante dos dlas en presencia de factor celulas madre de raton (50 ng/ml), IL-3 (20 ng/ml) e IL-6 (50 ng/ml). Mientras tanto, se prepararon los sobrenadantes virales, y se infectaron las celulas madre hematopoyeticas cultivadas de acuerdo con un protocolo publicado (70). Las celulas madre infectadas con virus (Ly9.1+) se transfirieron luego a los ratones Rag2'/_ (Ly9.1-) para generar quimeras c-Cbl Cbl-b dKO Rag2'/_ BM. Un mes despues, se evaluo el desarrollo de los timocitos derivados del donante (Ly9.1+) en las quimeras BM mediante FACS. Se muestran las celulas Ly9.1 + cerradas (derivadas del donante). Se cerraron luego las celulas GFP- (dKO) y GFP+ (que expresan c-Cbl transgenico) y se presentaron, respectivamente, como graficas de puntos de la tincion CD4 y CD8. Se indican los porcentajes de cada poblacion. Aproximadamente 20-40% de los timocitos que expresan al transgen infectado retroviral (GFP+) pueden ser obtenidos por este enfoque (Tabla 1). Los timocitos que expresan al transgen (TS c- Cbl) (GFP+) exhibieron una relacion normal de celulas de linaje CD4+ con respecto a CD8+ con una reproducibilidad consistente (vease la Tabla 1), lo que indica que la expresion de un c-Cbl de tipo silvestre transgenico restablecio completamente la relacion de timocitos CD4+ con respecto a CD8+.
La Figura 15 muestra los mecanismos hipoteticos de la dependencia de CD28 de la activacion de celulas T. La activacion de celulas T, tal como la proliferacion de celulas y la secrecion de IL-2, requiere la senalizacion especlfica de TCR as! como la senalizacion coestimuladora mediada por CD28, esto ultimo principalmente a traves de la ruta de senalizacion de Vav. Cbl-b puede suprimir especlficamente la activacion de Vav inducida por TCR pero no la inducida por CD28. En presencia de Cbl-b, es necesaria coestimulacion de CD28 para activar una cantidad suficiente de Vav para la respuesta de celulas T, estableciendo de este modo la dependencia de CD28 de la activacion de celulas T. Sin embargo, en ausencia de Cbl-b, no es necesaria la coestimulacion de CD28 ya que la sola estimulacion de TCR puede inducir suficiente cantidad de actividad de Vav.
La Figura 16 muestra la resistencia de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ a la supresion de TGF-beta. Se purificaron las celulas T CD8+ usando una columna de enriquecimiento de CD28. Luego se marcaron las celulas con CFSE,
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estimuladas con anti-CD3 unido a la placa en presencia o en ausencia de 5 pg/ml de TGF-beta. La figura 16a muestra un analisis de citometrla de flujo de la intensidad de CFSE de las celulas T CD8+ despues de tres dlas de estimulacion. Las celulas en division mostraron menor intensidad de CFSE en comparacion con las celulas no estimuladas. La figura16b muestra la supresion dependiente de la dosis de TGF-beta de la proliferacion de celulas T. Se muestran los resultados de la incorporacion de 3H-timidina de la proliferacion de las celulas T CD8+ de Cbl-b-/-. Figura 16c produccion de INF-gama. Se muestra la tincion intracelular de la produccion de INF-gama en celulas T CD8+ TS y Cbl-b'/_ en presencia o en ausencia de la supresion de TGF-beta. Los porcentajes de celulas positivas para INF-gama se indican en las graficas.
La Figura 17 muestra una realization para generar celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ para inmunoterapia tumoral. Los tejidos tumorales contienen una gran cantidad de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Estas celulas se enriquecen en linfocitos T citotoxicos (CTL) CD8+ especlficos del tumor. Para aislar los CTL especlficos del tumor, se pueden activar los TIL in vitro por estimulacion de anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de IL-2. Para generar los CTL de Cbl-b' /-, la funcion de Cbl-b endogena de la celula puede ser suprimida mediante la expresion de ARNi de Cbl-b o una forma negativa dominante de Cbl-b usando un vector retroviral. Las celulas con ablation de Cbl-b pueden ser identificadas con base en la expresion de GFP, que es codificada por el mismo vector retroviral. Los CTL sometidos a ablacion de Cbl-b especlfica del tumor pueden ser luego expandidos adicionalmente in vitro utilizando antlgeno tumoral o celulas tumorales como estlmulos. Las celulas expandidas pueden ser utilizadas para la transferencia adoptiva terapeutica.
Descripcion detallada
Definiciones
Las "celulas T super asesinas" son celulas T CD8+ que pueden montar una respuesta inmune en ausencia de una senal coestimuladora.
El termino " deficiencia de Cbl-b " se usa indistintamente con el termino " ablacion de Cbl-b " para indicar deficiencia de Cbl-b debida a la desactivacion del gen cbl-b, y la reduction en la actividad de la protelna Cbl-b debida a la desactivacion de la funcion de Cbl-b por el ARNi, o por la expresion de la forma negativa dominante, que incluye, pero no se limita al mutante negativo dominante, o por un agente que dirige a Cbl-b, o por cualquier otro metodo adecuado.
La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ es un metodo para inmunoterapia celular, que comprende la administration de efectores especlficos de inmunidad a un organismo huesped del sujeto, evitando as! obstaculos en el organismo huesped que puedan impedir la generation de una respuesta inmune efectiva in vivo. La transferencia adoptiva puede comprender la eliminacion de una poblacion que comprende celulas T CD8+ de un sujeto, enriqueciendo la poblacion de celulas T CD8+, ya sea por aislamiento de celulas T CD8+ o elimination de otros tipos de celulas de esta poblacion, expandiendo opcionalmente la poblacion de celulas T CD8+, y administrando la poblacion enriquecida de celulas T CD8+ a un sujeto. La transferencia adoptiva puede comprender la administracion de una poblacion de celulas T CD8+ de una llnea celular, incluyendo una llnea celular clonal de las celulas T CD8+. La transferencia adoptiva permite el uso de un gran numero de celulas T efectoras, aisladas de un sujeto, o derivadas de clones y/o llneas con especificidad y funcion definidas.
Los terminos celulas T CD8+ y CTL se utilizan indistintamente en toda la memoria descriptiva. Es bien conocido en la tecnica, que la activation inmunitaria de las celulas T CD8+ genera una poblacion de celulas efectoras con capacidad lltica denominada linfocitos T citotoxicos, o CTL. Estas celulas efectoras tienen un papel importante en el reconocimiento y la eliminacion de las celulas malignas y patogenas. En general, los CTL son CD8+ y estan, por lo tanto, restringidas al MHC clase I, aunque en raras ocasiones las celulas T restringidas a CD4+ clase II han demostrado que funcionan como CTL. Dado que virtualmente todas las celulas nucleadas en el cuerpo expresan moleculas del MHC clase I, los CTL pueden reconocer y eliminar casi cualquier celula corporal alterada. Las celulas T CD8+ reconocen el antlgeno presentado en moleculas HLA clase I de celulas tumorales a traves de receptores de celulas T. La respuesta inmune mediada por CTL puede dividirse en dos fases, lo que refleja los diferentes aspectos de la respuesta de celulas T citotoxicas. La primera fase consiste en la activacion y diferenciacion de celulas T CD8+ en CTL efectores funcionales. En la segunda fase, los CTL, reconocen los complejos antlgeno-MHC clase I en celulas objetivo especlficas, iniciando una secuencia de eventos que culmina con la destruction de la celula objetivo. Una discusion mas detallada del proceso se encuentra en el capltulo 15 de la segunda edition de "Immunology" por Janis Kuby, W. H. Freeman and Company (1991).
Aunque la estimulacion de las celulas T a traves de los receptores TCR y receptores coestimuladores, tales como CD28, conduce a la activacion de celulas T, la activacion de celulas T a traves solamente de TCR trae como resultado un estado no sensible (anergia) de estas celulas (Schwartz, R. H. 1992). La importancia de la coestimulacion para una respuesta inmune antitumoral ha sido demostrada por experimentos en los cuales la expresion reforzada en celulas tumorales de B7 o ICOS/B7h, ligandos para CD28, resulta en una eradication eficiente de los tumores inoculados (Townsend, S.E. y J.P. Allison 1993; Chen y colaboradores, 1994;. Wallin y
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colaboradores, 2001; Liu, X. y colaboradores, 2001; Yu X., R y colaboradores, 1998). Sin embargo, este enfoque para inmunoterapia es diflcil en la practica debido a la falta de una forma eficiente para expresar una molecula coestimuladora en todas las celulas tumorales. Una alternativa a este enfoque es la generacion de celulas T que pueden evitar el requerimiento de la coestimulacion de CD28 durante la activacion. Tal enfoque puede permitir la activacion directa de los CTL especlficos de tumores por las celulas tumorales en ausencia de ligandos coestimuladores, lo que representa una poderosa herramienta terapeutica contra el cancer.
En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos que implican el uso de los CTL que son deficientes en la funcion de Cbl-b y tienen un TCR especlfico para un antlgeno tumoral. Tales CTL pueden tener por ejemplo un transgen que codifica un TCR especlfico para un antlgeno tumoral. En ciertos aspectos, tales CTL pueden derivarse de una poblacion policlonal de tejido tumoral (Ramarithanam y colaboradores, 2003). En una realization, los CTL de Cbl-b-/- especlficos del tumor pueden ser generados por desactivacion de la funcion de Cbl-b usando un ARNpi de Cbl-b o una forma dominante negativa de Cbl-b en los CTL derivados de tumores.
Protelnas Cbl-b
Las protelnas Cbl son ubiquitina ligasas E3 que contienen un dominio de dedo RING involucradas en diversos eventos de serialization de los receptores de membrana (Lupher y colaboradores, 1999; Joazeiro y colaboradores, 1999; Liu, Y.C. 2004). Experimentos anteriores han demostrado que Cbl-b, un miembro de la familia de protelnas Cbl, juega un papel crltico en la activacion de las celulas T perifericas (Chiang y colaboradores, 2000; Bachmaier y colaboradores, 2000). En forma notable las celulas T CD4+ de Cbl-b-/- han evitado la dependencia de senales coestimuladoras, para su activacion, ya que proliferan vigorosamente y secretan grandes cantidades de IL-2 despues de la estimulacion de TCR en ausencia de coestimulacion de CD28. Estos resultados ponen de relieve por lo tanto el papel de Cbl-b como regulador clave de la senalizacion coestimuladora de CD28 y sugieren que los CTL deficientes en Cbl-b pueden responder a y montar una respuesta eficiente contra tumores que carecen de senales coestimuladoras.
Las protelnas Cbl pertenecen a una familia de moleculas de multiples adaptadores involucradas en diversas senalizaciones de receptores de membrana (46-48). En celulas de mamlferos, hay tres miembros de la familia de protelnas Cbl, c-Cbl, Cbl-b, y Cbl-3. Entre estos miembros, c-Cbl y Cbl-b se coexpresan en linfocitos (49-51). Estructuralmente, c-Cbl y Cbl-b comparten una alta homologla de secuencia en la region terminal C que contiene un dominio PTB conservado (enlazado a fosfotirosina) y un motivo dedo RING, este ultimo puede estar asociado con enzimas que se conjugan con ubiquitina E2 (52, 53). En la portion terminal N, tanto c-Cbl como Cbl-b contienen multiples motivos ricos en prolina, as! como varios residuos de tirosina que se fosforilan tras la activacion por diversos receptores (52). Las secuencias de protelna de la region terminal N entre c-Cbl y Cbl-b son significativamente diferentes, lo que sugiere que estas dos moleculas pueden ejercer distintas funciones a traves de esta region.
La importancia de c-Cbl y Cbl-b en la senalizacion de TCR, el desarrollo y activacion de celulas T ha sido demostrado recientemente por varios grupos utilizando ratones con genes manipulados (54-58). Al menos dos estudios han mostrado que la deficiencia de c-Cbl (c-Cbl-/-) mejora significativamente la senalizacion de TCR en timocitos, pero no en celulas T perifericas (54, 57). Por el contrario, el analisis de ratones deficientes en Cbl-b (Cbl-b- /-) revela que Cbl-b juega un papel crltico en la activacion de celulas T perifericas, pero no en el desarrollo de timocitos, ya que pueden responder eficientemente a una baja estimulacion de antlgeno (55, 56). Notablemente, las celulas T CD4+ de Cbl-b-/- han perdido la dependencia de las senales coestimuladoras para la activacion, ya que ellas proliferan vigorosamente y secretan grandes cantidades de IL-2 despues de la estimulacion de TCR en ausencia de coestimulacion de CD28 (55, 56). Es importante destacar que, celulas T de Cbl-b-/- no estan anergizadas bajo las condiciones que normalmente inducen anergia en celulas T (no sensibles). Como resultado, los ratones Cbl-b-/- se vuelven susceptibles a enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, estos resultados subrayan a Cbl- b como un regulador clave para senalizacion coestimuladora de TCR y CD28 y la activacion de celulas T, y sugiere que la modulation de la ruta de Cbl-b puede ser un enfoque poderoso para generar las celulas T "super asesinas" que son sensibles a la estimulacion por antlgenos de baja afinidad e independientes de la coestimulacion de CD28 (Rangachari y Penninger, Current Opinion in Pharmacology 2004, 4, 415-422).
No existe evidencia clara que demuestre que la funcion biologica de las protelnas Cbl este ligada a su actividad de ubiquitina ligasa, a pesar de que Cbl promueve la ubiquitinacion de diversas protelnas. En ciertas realizaciones, la invention proporciona metodos para determinar si la contribution de Cbl-b con el fenotipo de doble desactivacion (DKO) es, en realidad, debida a la actividad de la ubiquitina ligasa. En otros aspectos, la invencion proporciona un vector retroviral que porta una Cbl-b deshabilitada en ubiquitina. En otra aspectos, la invencion proporciona clones de celulas ES con la mutation KI de Cbl-b deshabilitada en ubiquitina.
En ciertas realizaciones, la descripcion proporciona metodos para determinar el papel de la funcion de la ubiquitina ligasa de Cbl-b en las respuestas de celulas T antitumorales. En otras realizaciones, la descripcion proporciona metodos para determinar si la supresion de la funcion de la ubiquitinacion de la ligasa de Cbl-b, proporciona celulas T CD8+ con la capacidad para rechazar los diversos tumores. La identification del dominio de Cbl-b crltico para su
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funcion biologica, es importante para el desarrollo de farmacos que pueden suprimir la funcion de Cbl-b. Cbl-b es una ubiquitina ligasa e3 y promueve la ubiquitinacion de diversas proteinas de senalizacion tales como p85 PI-3 quinasa y Vav en celulas T, lo que sugiere que Cbl-b regula la respuesta antitumoral de celulas T a traves de la funcion de ubiquitinacion. En ciertos aspectos, la descripcion establece que la interrupcion de la funcion de la ubiquitinacion de Cbl-b es suficiente para volver sensibles a las celulas T al antigeno tumoral. La funcion de la ubiquitinacion de Cbl-b es un farmaco objetivo potencial para inactivar la funcion de Cbl-b. En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para determinar si se requiere la funcion de ubiquitina ligasa de Cbl-b para senales de coestimulacion durante la activacion de celulas T. En otros aspectos, la invencion proporciona metodos para determinar si la inactivacion de la actividad de ubiquitina ligasa de Cbl-b vuelve sensibles a las celulas T contra los tumores.
Las celulas T CD8+ de Cbl-b'7' no requieren coestimulacion
Anteriormente, se demostro que la activacion de celulas T CD4+ de Cbl-b7- es independiente de la coestimulacion de CD28 (Chiang y colaboradores, 2000; Bachmaier y colaboradores, 2000). En ciertos aspectos, la descripcion establece que celulas T CD8+ de Cbl-b7- responden eficientemente a la estimulacion antigenica, incluso sin coestimulacion de CD28. En ciertas realizaciones, la descripcion establece que las celulas T CD8+ de Cbl-b7- producen grandes cantidades de interleuquina 1 (IL-2) e interferon gamma (IFN-y) despues de estimulacion solamente por el anticuerpo anti-CD3, lo que indica que los CTL de Cbl-b7- pueden ser completamente activados mediante la activacion de TCR sin coestimulacion de CD28 y ayuda de celulas T CD4+. En ciertos aspectos, la descripcion establece que celulas T CD8+ de Cbl-b7- evitan la dependencia de la senalizacion de CD28. En ciertos aspectos, la descripcion establece que las celulas T CD8+ de Cbl-b7- eliminan de manera eficiente tumores singenicos. En ciertos aspectos, la descripcion establece que celulas las T CD8+ de Cbl-b7- son responsables de la erradicacion de los tumores.
En ciertos aspectos, la invencion proporciona celulas T CD8+ aisladas de Cbl-b7-. La descripcion establece que la respuesta in vitro de celulas T de Cbl-b7- es hiperactivo, independiente de la coestimulacion, y no es inhibida por TGF-beta. La descripcion establece, ademas, que los ratones Cbl-b7- montan una respuesta inmune normal in vivo, incluso en ausencia de CD28. La descripcion tambien establece que Cbl-b regula la sensibilidad de las celulas T a traves de un mecanismo que depende de la ubiquitinacion.
En ciertos aspectos, la descripcion proporciona una poblacion clonal de las celulas T CD8+ Cbl-b7-, en donde todas las celulas T en la poblacion tienen la misma especificidad de TCR. En un aspecto, la poblacion clonal comprende los CTL que son Cbl-b7- y expresan un TCR especifico para un antigeno tumoral. En ciertos aspectos, la descripcion establece ademas que las celulas T de Cbl-b7- montan una respuesta antitumoral eficiente in vivo. En un ejemplo no
limitante, esto se demuestra mediante la inhibicion del crecimiento de tumores E.G7, EL4 y B16 en ratones Cbl-b7-.
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La mayoria de los ratones Cbl-b ", o bien no permiten en absoluto el crecimiento del tumor o exhiben regresion tumoral dentro del mismo lapso de tiempo. Ademas, existe una infiltracion masiva de celulas T CD8+ en los tejidos tumorales de ratones Cbl-b7-. En ciertas realizaciones, la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ purificadas de Cbl-b7- erradica los tumores establecidos de E.G7. La descripcion establece que las celulas T CD8+ deficientes de Cbl-b especificas del tumor, por ejemplo, pero no limitado a, celulas CD8+ T de Cbl-b7-, pueden ser usadas como celulas T "super asesinas" para terapia tumoral.
En ciertos aspectos, la descripcion establece que las celulas T CD8+ de Cbl-b7- son responsables del rechazo del tumor. Ademas las celulas T de Cbl-b7- son resistentes a la supresion de TGF-beta, lo que sugiere que las celulas T CD8+ de Cbl-b7- pueden rechazar tumores a traves del rompimiento de multiples obstaculos que los tumores utilizan generalmente para evitar una respuesta inmune antitumoral. En ciertas formas de realizacion la descripcion proporciona metodos para determinar cuantitativamente si los CTL de Cbl-b7- pueden montar respuestas inmunes contra diversos tumores, y para examinar cuantitativamente la eficiencia de las celulas T CD8+ especificas del tumor requerida para el rechazo del tumor, y el efecto a largo plazo de las celulas T CD8+ de Cbl-b7- en la erradicacion de tumor establecido. La descripcion proporciona metodos para examinar si los CTL de Cbl-b7- pueden erradicar tumores que impiden la respuesta de las celulas T a traves de TGF-beta, y la barrera del tumor. La descripcion tambien establece que los ratones Cbl-b7- rechazan de manera eficiente tanto los tumores antigenicos fuertes como los debiles, y la transferencia adoptiva de las celulas T CD8+ de Cbl-b7- erradica los tumores establecidos. La descripcion tambien proporciona metodos que determinan los mecanismos por los cuales los CTL de Cbl-b7- montan respuestas inmunes contra tumores inmunogenicos. La descripcion tambien establece que la ablacion de Cbl-b en los CTL especificos de tumores los hace sensibles contra diversos tumores.
La descripcion tambien establece que las celulas T CD8+ de Cbl-b7- son resistentes a la supresion de TGF-beta, una caracteristica que puede ser util para superar el efecto negativo de cierto entorno del tumor. En otros aspectos, la descripcion establece que las celulas T CD8+ de Cbl-b7- son resistentes a la supresion de TGF-beta, lo que sugiere que estas celulas pueden responder a tumores que estan protegidos por TGF-beta producido ya sea por el tumor mismo o celulas inmunes tales como celulas T reguladoras CD4+CD25+. Diversas realizaciones demuestran que celulas T CD8+ de Cbl-b7- se puede utilizar como "super asesinas" contra diversos tipos de cancer. En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para determinar el efecto a largo plazo de celulas T CD8+ de Cbl-b7-
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en terapia tumoral mediante el uso de sistemas transgenicos bien estudiados, as! como diversos modelos de tumores que impiden la respuesta inmune a traves de diferentes mecanismos. Otros metodos pueden determinar la memoria inmune contra las celulas tumorales, en donde se puede analizar el efecto a largo plazo de la respuesta antitumoral en ratones con regresion tumoral.
En ciertos aspectos, la descripcion establece que la ablacion de Cbl-b impide espontanea de tumores en celulas deficientes de ATM-/-, incluyendo ratones ATM-/-. La descripcion establece ademas, que la ablacion de llnea germinal de Cbl-b en ratones ATM-/- da como resultado una marcada reduction de tumores espontaneos, y consecuentemente un perlodo de vida mas largo. En ciertos aspectos, la descripcion establece que la inhibition sistemica de la funcion de Cbl-b es un enfoque efectivo para reducir la incidencia de tumores. La descripcion establece ademas que los ratones Cbl-b-/- son resistentes a tumores E.G7 y EL4 inoculados y los ratones doblemente mutantes Cbl-b-/" ATM-/" muestran una incidencia significativamente menor de linfomas espontaneos que los ratones que expresan Cbl-b. En otros aspectos, la descripcion establece que la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de Cbl-b-/" es suficiente para erradicar los tumores E.G7 establecido en ratones receptores de tipo silvestre.
Metodos para inducir una respuesta inmune en ausencia de coestimulacion para tratar tumores
En ciertos aspectos, la presente descripcion proporciona metodos para utilizar CTL deficientes en Cbl-b, incluyendo, pero sin limitarse a CTL de Cbl-b'/_, como celulas T "super asesinas" para terapia de cancer. En ciertas realizaciones, los ratones Cbl-b'/_ rechazan tumores inmunogenicos de alta y baja inoculation, y las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ son suficientes para mediar la respuesta inmune antitumoral en ratones portadores de tumores. La descripcion establece que las celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b son herramientas efectivas en el tratamiento de canceres, incluyendo cancer humano.
En ciertos aspectos, la descripcion esta dirigida a metodos para utilizar las celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b en inmunoterapia tumoral, incluyendo pero sin limitarse a metodos de transferencia adoptiva, para inducir una respuesta inmune antitumoral en un sujeto. En ciertas realizaciones, el metodo comprende proporcionar una poblacion de celulas, que comprende celulas T CD8+ con especificidad de tumor, reducir la actividad de Cbl-b, y administrar las celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b a un sujeto. La poblacion de celulas utilizadas en los metodos de la descripcion comprende al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de celulas T CD8+. En ciertas realizaciones, El metodo comprende proporcionar una poblacion de celulas, que consiste esencialmente de celulas T CD8+, reducir la actividad de Cbl-b, y administrar r las celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b a un sujeto.
Una limitation potencial en los metodos adoptivos es la necesidad de generar y transferir mediante infusion a un sujeto, un numero suficiente de celulas T CD8+. El numero de celulas T CD8+ que pueden producir una respuesta inmune efectiva o suficiente depende de multiples factores, tales como la carga de antlgeno tumoral, la capacidad de replication de las celulas transferidas, y la capacidad de la celulas transferidas a persistir en el huesped. En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para determinar el numero de celulas T CD8+ necesarias para inducir una respuesta inmune en un sujeto. En ciertas realizaciones, los metodos pueden transferir en un sujeto aproximadamente 5x105 celulas T Cd8+, 1x106 celulas T CD8+, 5x106 celulas T cD8+, 1x107 celulas T CD8+, 5x106 celulas T CD8+. Otras realizaciones pueden incluir multiples transferencias de celulas T CD8+ en un sujeto.
En ciertas realizaciones, la poblacion de celulas que comprende celulas T CD8+ se puede obtener a partir de celulas T de infiltrados tumorales. Los metodos para obtener, aislar y purificar las celulas T de infiltrados tumorales son conocidos en la tecnica
La obtencion de celulas T CD8+ de infiltrados tumorales que comprenden celulas T es ventajoso porque las celulas T en la masa del tumor pueden reconocer el antlgeno tumoral presentado por las celulas tumorales. Sin embargo, la mayorla de los tumores antigenicos no son rechazados de manera eficiente por estas celulas T. Los mecanismos crlticos que impiden el rechazo tumoral mediado por celulas T incluyen la falta de senales adecuadas del TCR o de receptores coestimuladores de celulas tumorales y/o anergia o supresion de celulas T especlficas del tumor por el ambiente del tumor o el tumor mismo. Por lo tanto, una tarea retadora en la inmunoterapia tumoral es desarrollar estrategias que puedan activar los CTL especlficos del tumor dentro de los tumores con un dano mlnimo o sin un dano severo a los tejidos normales. Las celulas T CD8+ derivadas de infiltrados tumorales pueden ser modificadas mediante la reduccion de la actividad de Cbl-b proporcionando as! celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b. La capacidad de las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ para rechazar tumores antigenicos proporciona una nueva ruta en inmunoterapia tumoral, en donde la administration de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_, derivadas de infiltrados tumorales, pueden inducir respuestas inmunes antitumorales especlficas.
En ciertas realizaciones, los metodos para utilizar celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b en inmunoterapia tumoral para inducir una respuesta inmune antitumoral en un sujeto, comprenden el aislamiento y/o purification de celulas T CD8+ de infiltrados tumorales de los sujetos. El metodo puede comprender opcionalmente una etapa de estimular la expansion y proliferation de las celulas T CD8+ aisladas. En ciertas realizaciones, la etapa de expansion y la proliferation pueden realizarse antes de la reduccion de la actividad de Cbl-b. En otras formas de realization, la
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etapa de expansion y proliferacion puede hacerse despues de reducir la actividad de Cbl-b. Los metodos para inducir expansion y proliferacion de celulas T CD8+ en un cultivo celular son bien conocidos en la tecnica. En ciertas realizaciones, la expansion y proliferacion pueden ser estimuladas por tratamiento de las celulas con anticuerpo anti- CD3, y/o en presencia de IL-2.
En otros aspectos, la descripcion esta dirigida a metodos para utilizar transferencia adoptiva de celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b, tales como celulas T CD8+ de Cbl-b-/-, como una herramienta terapeutica para el tratamiento del cancer. Por ejemplo, la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ purificadas de Cbl-b-/" en ratones de tipo silvestre que portan tumores E.G7 erradica al tumor establecido. En otro ejemplo, los ratones Cbl-b-/" tambien rechazan tumores fisiologicos tales como EL4 y B16.
En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para inducir una respuesta antitumoral en un sujeto mediante transferencia adoptiva de las celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b. El enfoque de transferencia adoptiva tiene varias ventajas. En ejemplos no limitantes, las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ pueden ser ampliamente efectivas contra una gran clase de tumores somaticos, la mayorla de los cuales no expresan ligandos coestimuladores. La capacidad de las celulas T CD8+ de Cbl-b'A para producir respuestas sustanciales de citoquinas y para funcionar independiente de la coestimulacion de CD28 y de la ayuda de celulas T CD4+ puede evitar la necesidad de administrar grandes cantidades de citoquinas o inmunizar pacientes con vacunas disenadas para mejorar la serialization coestimuladora y las respuestas de celulas T auxiliares. En ciertas realizaciones, el uso cllnico de los linfocitos que infiltran el tumor (TIL) en la inmunoterapia adoptiva, se podrla mejorar mediante la ablation de Cbl-b. La ablation de la funcion de Cbl-b se puede lograr por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo pero sin limitarse a ARNi o la expresion de la forma negativa dominante del gen cbl-b.
En un ejemplo no limitante de un metodo de transferencia adoptiva de la presente descripcion, las celulas T CD8+ se alslan y purifican a partir de infiltrados tumorales de un sujeto que padece un tumor. Los niveles de Cbl-b se reducen en estas celulas T CD8+ aisladas y purificadas, por ejemplo, por transfection estable con un vector retroviral que expresa ARNpi que manipula Cbl-b, para producir celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b. En ciertas realizaciones, el vector retroviral que expresa al ARN inhibidor puede comprender un marcador fluorescente, tal como, pero sin limitarse a GFP o cualquiera de sus variantes. Tal marcador fluorescente puede permitir la detection de celulas T CD8+, que se han vuelto deficientes en Cbl-b. Las celulas T CD8+ aisladas y purificadas deficientes en Cbl-b pueden ser expandida ex vivo a un numero de celulas adecuadas para infusion al sujeto que sufre de un tumor. En ciertas realizaciones, La celulas T CD8+ aisladas y purificadas deficientes en Cbl-b pueden se expandidas y/o enriquecidas por celulas T CD8+ especlficas del tumor mediante exposition y estimulacion con celulas tumorales derivadas del tumor del sujeto.
La presente descripcion contempla diversas vlas de administration de los CTL en cualquiera de los metodos de la presente invention para el tratamiento de un sujeto que padece de un tumor. En ciertos aspectos, los CTL pueden ser administrados mediante suministro intravenoso. En otros aspectos, los CTL pueden ser administrados directamente a un sitio tumoral. En ciertas realizaciones, se contemplan multiples infusiones de tales celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b.
In vivo, la falta de capacidad de respuesta de los CTL a los tumores puede implicar supresion activa de los CTL o la falta de un reconocimiento apropiado de las celulas tumorales por los CTL. En ciertas realizaciones, la activation independiente de la coestimulacion de celulas T de Cbl-b'/_ es responsable por la respuesta antitumoral observada. En otras formas de realization, los mecanismos diferentes a la activacion de celulas T CD8+ independientes de CD28 pueden contribuir al rechazo del tumor. En ciertas realizaciones, la infiltration masiva de celulas T CD8+ de Cbl-b'A en masas tumorales puede resultar de la adhesion y migration de celulas alteradas. Ademas, se ha demostrado que las celulas T de Cbl-b'/_ pueden escapar del destino anergico bajo condiciones que normalmente inducen tolerancia inmune in vivo (Jeon M.S. y colaboradores, 2004). Las celulas T de Cbl-b'/_ pueden ser resistentes a la induction de tolerancia por las celulas tumorales, proporcionando por lo tanto una mejor supervision inmune contra las celulas tumorales recientemente transformadas o inoculadas. Finalmente, se ha demostrado que la respuesta de CTL contra los tumores pueden ser inhibida por las celulas T reguladoras CD25+ (Treg) (Somasundaram y colaboradores, 2002). Las Treg CD25+ pueden ejercer una supresion inmune a traves de la secretion de TGF-p (Kronenberg M. y A. Rudensky, 2005). En ciertas realizaciones, la descripcion establece que celulas T de Cbl-b'A son menos sensibles a la supresion de TGF-p. En ciertas realizaciones, la falta de supresion inmune de las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ por Treg CD4+ podrla ser tambien un factor que conduce a las respuestas inmunes antitumorales mejoradas.
La inmunoterapia tumoral es un enfoque prometedor que puede resultar en la regresion de un cancer inmunogenico invasivo voluminoso en algunos pacientes. Los enfoques disponibles actualmente siguen siendo menos exitos de lo deseado. Un obstaculo importante que sin embargo tiene que ser superado, es el desarrollo de un enfoque efectivo que pueda iniciar, amplificar y mantener respuestas de CTL contra tumores que carecen de senales coestimuladoras. En ciertos aspectos, la presente descripcion establece que los ratones Cbl-b'A rechazan en forma efectiva tumores inoculados en ausencia de inmunizacion previa. La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de Cbl-b'A erradica los tumores E.G7 establecidos, demostrando que los CTL por si solos de Cbl-b'/_ son suficientes
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para mediar una respuesta antitumoral efectiva. Las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ tambien son resistentes a la supresion de TGF-beta, lo que indica un papel mucho mas amplio de las celulas T de Cbl-b-/- en el rechazo de los tumores, que puede prevenir la respuesta de celulas T a traves de otros mecanismos tales como la produccion de TGF-beta. En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para la modulacion de la ruta de Cbl-b en los CTL especlficos del tumor, en donde tal modulacion puede ser utilizada para generar CTL especlficos del tumor que puede ser utilizado en inmunoterapia del cancer.
En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para determinar los mecanismos mediante los cuales los ratones Cbl-b-/" montan respuestas antitumorales. En otros aspectos, la descripcion proporciona metodos para el uso de los CTL deficientes en Cbl-b, por ejemplo pero no limitado a los CTL de Cbl-b-/", como una herramienta terapeutica para el tratamiento de tumores establecidos. En ciertas realizaciones, la eficiencia de las celulas T CD8+ de Cbl-b-/" especlficas del tumor en el rechazo del tumor puede ser cuantificada por diversos metodos conocidos en la tecnica. En ciertos aspectos, la descripcion establece que celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ erradican un tumor metastasico y tumores con ambiente supresor tales como TGF-beta, la barrera del tumor, y las celulas NKT. En otros aspectos, la descripcion establece que la desactivacion (Kd) de la funcion de Cbl-b en CTL que infiltran al tumor por ARNpi, una forma negativa dominante de Cbl-b, o cualesquiera otros agentes adecuados, conducen a una reduccion en tamano, y/o erradicacion de tumores establecidos. En otros aspectos, la descripcion establece que la transferencia adoptiva de los CTL kd de Cbl-b conduce a la reduccion de tamano, y/o erradicacion de los tumores establecidos. En otros aspectos, la descripcion establece que los CTL kd de Cbl-b erradican tumores metastasicos y tumores con ambiente supresor, tales como TGF-beta, la barrera del tumor, y las celulas NKT.
Metodos para elaboracion de celulas T CD8+ de Cbl-b'A
Las celulas T CD8+ utilizadas en el metodo de transferencia adoptiva de la presente invencion pueden ser aisladas de diversas fuentes. En ciertas realizaciones, las celulas T CD8+ pueden ser aisladas de infiltrados tumorales que comprenden CTL. En otras realizaciones, celulas T CD8+ pueden ser aisladas de sangre periferica, y/o organos linfaticos. En otras realizaciones, la fuente de celulas T CD8+ puede ser una llnea celular clonal que expresa TCR especlficos para el antlgeno tumoral. En ciertas realizaciones, la llnea celular clonal preferiblemente hace coincidir moleculas MHC clase I con una molecula MHC clase I de un sujeto en un metodo de transferencia adoptiva.
Los metodos y condiciones para aislar, purificar, estimular y expandir CTL sin modificar de memoria o efectores, son bien conocidos en la tecnica, y son contemplados por los metodos para elaborar poblaciones de celulas T CD8+ para uso en los metodos de la descripcion. En ciertas realizaciones, las celulas T cD8+ clonales que expresan un TCR especlfico pueden ser generadas por rondas repetidas de estimulacion de celulas T CD8+ purificadas con celulas dendrlticas pulsadas con un antlgeno tumoral mutado.
El tipo de antlgeno tumoral mencionado en la descripcion puede ser un antlgeno especlfico del tumor (TSA) o un antlgeno asociado al tumor (TAA). Un TSA es unico para las celulas tumorales y no se produce en otras celulas en el cuerpo. Un antlgeno asociado TAA no es unico para una celula tumoral y en vez de eso tambien se expresa en una celula normal en condiciones que no inducen un estado de tolerancia inmunologica al antlgeno. La expresion del antlgeno en el tumor se puede producir en condiciones que le permitan al sistema inmune responder al antlgeno. Los T AA pueden ser antlgenos que se expresan en las celulas normales durante el desarrollo fetal cuando el sistema inmune es inmaduro e incapaz de responder o pueden ser antlgenos que estan normalmente presentes en niveles extremadamente bajos en las celulas normales, pero que son expresados en niveles mucho mas altos en celulas tumorales.
Ejemplos no limitantes de antlgenos grandes, con base en protelnas incluyen los siguientes: antlgenos de diferenciacion tales como MART-1/MelanA (MART-1), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antlgenos de linaje multiple especlficos del tumor tales como as MaGe-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; antlgenos embrionarios sobreexpresados tales como CEA; oncogenes sobreexpresados y genes supresores del tumor mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antlgenos unicos del tumor que resultan de translocaciones cromosomicas; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; y antlgenos virales, tales como antlgenos EBVA del virus de Epstein Barr y los antlgenos del virus de papiloma humano (HPV) E6 y E7. Otros antlgenos grandes con base en protelna incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAgE-6, RaGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoprotelna, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NYCO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 que se enlazan a la protelna\protelna ciclofilina asociada a C, TAAL6, TAG72, TLP, y TPS. Estos antlgenos con base en protelnas y sus secuencias son conocidos y se encuentran disponibles para aquellos expertos en la tecnica en la literatura o comercialmente. Antlgenos adicionales, que en ciertas realizaciones pueden ser reconocidos por los TCR transgenicos autologas expresados por llneas de celulas CD8+ T clonales, pueden encontrarse en la publicacion de la solicitud de patente de los Estados Unidos 2006/0153858.
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La atenuacion de la actividad Cbl-b, por ejemplo la atenuacion de la actividad Cbl-b en infiltrados de CTL especlficos del tumor, promueve una respuesta antitumoral. La invencion contempla una variedad de metodos para atenuar y/o suprimir la actividad de Cbl-b en celulas T CD8+. En ciertas realizaciones, la actividad de Cbl-b se atenua en una forma transitoria. En otras realizaciones, la actividad Cbl-b se atenua en forma continua y/o en forma permanente. En ciertas realizaciones, la actividad de Cbl-b puede ser reducida, o eliminada mediante la introduccion de cualquier agente que sea un antagonista para la actividad Cbl-b, tal como, pero sin limitarse a molecula(s) de ARN de interferencia (ARNi). En ciertas realizaciones, la actividad de Cbl-b puede ser atenuada y/o suprimida mediante el uso de compuestos polinucleotidos, tales como, pero sin limitarse a, polinucleotidos antisentido, ribozimas, moleculas de ARN de interferencia, polinucleotidos de triple helice y similares, donde la secuencia de nucleotidos de tales compuestos esta relacionadas con las secuencias de nucleotidos de ADN y/o ARN del gen de Cbl-b. En ciertos aspectos, los niveles o actividad de Cbl-b, se reducen hasta aproximadamente un 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% de los niveles o actividad de Cbl-B en celulas que no son tratadas con un antagonista de Cbl-b, por ejemplo ARNpi que dirige a Cbl-b.
La tecnologla de nucleotidos antisentido ha sido el enfoque mas comunmente descrito en los protocolos para lograr una interferencia especlfica de genes. Para estrategias antisentido, pueden introducirse cantidades estequiometricas de acido nucleico monocatenario complementario al ARN mensajero para el gen de interes, en la celula. Las estructuras de acidos nucleicos de triple helice tambien son utiles para interferencia manipulada geneticamente. Este enfoque se basa en la rara capacidad de ciertas poblaciones de acido nucleico para adoptar una estructura de triple cadena. Bajo condiciones fisiologicas, los acidos nucleicos son virtualmente todos monocatenarios o bicatenarios, y raramente, si acaso, forman estructuras de cadena triple.
En ciertas realizaciones, se usa una molecula de ARN de interferencia (ARNi) para disminuir o inhibir la expresion del acido nucleico contra el cual se dirige el ARNi. ARNi se refiere al uso de moleculas de ARN de interferencia (ARNi), por ejemplo, pero sin limitarse a, ARN bicatenario (ARNbc) o ARN pequeno de interferencia (ARNpi) para suprimir la expresion de un gen que comprende una secuencia relacionada de nucleotidos. ARNi tambien se denomina como silenciamiento genico post-transcripcional (o PTGS).
ARNi regula la expresion genica a traves de un mecanismo ubicuo por degradation de ARNm objetivo en una forma especlfica de la secuencia. McManus y colaboradores, 2002, Nat Rev Genet 3: 737-747. En celulas de mamlferos, el ARN de interferencia (ARNi) puede ser activado por duplex de 21 a 23 nucleotidos de ARNpi. Lee y colaboradores, 2002, Nat Biotechnol 20: 500-505; Paul y colaboradores, 2002, Nat Biotechnol. 20: 505-508; Miyagishi y colaboradores, 2002, Nat Biotechnol. 20: 497-500; Paddison y colaboradores, 2002, Genes Dev. 16: 948-958. La expresion de ARNpi o ARN de horquilla corta (ARNhc) dirigido por el promotor U6, media efectivamente la degradacion del ARNm objetivo en celulas de mamlfero. Los duplex sinteticos de ARNpi y los ARNpi derivados del plasmido pueden inhibir la infection y replication del VIH-1 degradando especlficamente el ARN genomico del VIH. McManus y colaboradores, J. Immunol. 169: 5754 a 5760; Jacque y colaboradores, 2002 Nature 418: 435-438; Novina y colaboradores, 2002, Nat Med 8: 681-686. Tambien, el ARNpi que dirige al ARN genomico de VHC inhibe la replicacion del VHC. Randall y colaboradores, 2003, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 100:. 235-240; Wilson y colaboradores, 2003, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 100: 2783-2788. Fas dirigida por ARNpi protege al hlgado de hepatitis y fibrosis fulminante. Song y colaboradores, 2003, Nat Med 9: 347-351.
Se puede usar ARNbc para interferir con la expresion de genes en muchos organismos, incluyendo, pero sin limitarse a mamlferos. ARNbc se utiliza como ARN inhibidor o ARNi de la funcion de una molecula de acido nucleico de la invencion para producir un fenotipo que es igual a aquel de un mutante nulo de una molecula de acido nucleico de la description (Wianny y Zernicka-Goetz, 2000, Nature Cell Biologla 2: 70-75).
Se han desarrollado muchos metodos para elaborar ARNpi, por ejemplo, slntesis qulmica o transcription in vitro. Una vez elaborado, el ARNpi puede introducirse directamente en una celula para mediar la interferencia de ARN (Elbashir y colaboradores, 2001, Nature 411: 494-498; Song, E. y colaboradores, RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat. Med. 2003; 9: 347-351; y Lewis, D L, y colaboradores., Efficient delivery of ARNpi for inhibition of gene expression in postnatal mice. Nat. Gineta. 2002; 32: 107-108). Alternativamente, el ARNpi p puede ser encapsulado en liposomas para facilitar el suministro a una celula (Sorensen, DR y colaboradores, Gene silencing by systemic delivery of synthetic ARNpis in adult mice. J Mol Biol. 2003; 327: 761766). Los ARNpi pueden ser introducidos tambien en las celulas a traves de transfection transitoria.
Se han desarrollado tambien una serie de vectores de expresion para expresar continuamente Los ARNpi en celulas de mamlfero transfectadas en forma estable y transitoria (Brummelkamp y colaboradores, 2002, Science 296: 550553; Sui y colaboradores, 2002, PNAS 99 (6): 5515-5520; Paul y colaboradores, 2002, Nature Biotechnol. 20: 505508). Algunos de estos vectores han sido manipulados geneticamente para expresar los ARN de horquilla pequena (ARNhp), que se procesan in vivo en moleculas como ARNpi capaces de llevar a cabo silenciamiento especlfico de genes. En ciertas realizaciones, un ARNhp contiene plasmido bajo el control de un promotor, preferiblemente un promotor U6 (Paul, C P y colaboradores, Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat Biotechnol 2002; 20: 505-508). Otro tipo de vector de expresion de ARNpi codifica las cadenas sentido y antisentido de ARNA bajo el control de promotores pol III separados (Miyagishi y Taira, 2002, Nature Biotechnol. 20: 497-500). Las
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cadenas de ARNpi de este vector, como los ARNhp de los otros vectores, tienen las senales de terminacion timidina 3'. El gen de ARNhp puede ser suministrado a traves de un sistema de vector adecuado, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), o retrovirus (Xia, H y colaboradores, ARNpi-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 2002; 20: 1006-1010; y Barton, G M, y colaboradores Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2002; 99: 14943-14945). En ciertas realizaciones, la descripcion contempla el uso de vectores de ARNi que permiten la transfeccion estable y la atenuacion continua de la actividad de Cbl-b en celulas T CD8+.
En ciertas realizaciones, el ARN puede comprender una o mas cadenas de ribonucleotido polimerizadas. Puede incluir modificaciones ya sea de la cadena principal de fosfato-azucar o del nucleosido. Por ejemplo, los enlaces fosfodiester o el ARN natural pueden ser modificados para incluir al menos uno entre un heteroatomo de nitrogeno o azufre. Las modificaciones en la estructura del ARN pueden ser hechas para permitir una inhibicion genetica especlfica mientras se evita una respuesta general de panico en algunos organismos, que se generan por ARNbc. Igualmente, las bases pueden ser modificar para bloquear la actividad de la adenosina desaminasa. El ARN puede ser producido enzimaticamente o mediante slntesis organica parcial/total, cualquier ribonucleotido modificado puede ser introducido enzimatica u organica in vitro.
La estructura bicatenaria puede estar formada por una cadena sencilla de ARN autocomplementaria o dos cadenas de ARN complementarias. La formacion del duplex de ARN puede ser iniciada ya sea dentro o fuera de la celula. El ARN puede ser introducido en una cantidad que permite el suministro de al menos una copia por celula. Dosis mayores (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por celula) de material bicatenario puede producir una inhibition mas efectiva; tambien pueden ser utiles dosis menores para aplicaciones especlficas. La inhibition es especlfica de la secuencia ya que las secuencias de nucleotidos correspondientes a la region del duplex del ARN estan destinadas a inhibicion genetica. La molecula de ARN puede ser al menos de 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 30 nucleotidos de longitud.
En ciertas realizaciones, el ARN que contiene secuencias de nucleotidos identicas a una portion de un gen de Cbl-b es adecuado para o atenuacion y/o inhibicion de la actividad de Cbl-b. En ciertas realizaciones, la secuencias de ARN con inserciones, supresiones, y mutaciones puntuales unicas con relation a la secuencia objetivo de Cbl-b pueden ser efectivas para inhibicion. Por lo tanto, no se requiere una identidad de secuencia del cien por ciento entre el ARN y la secuencia objetivo de Cbl-b para atenuar y/o inhibir la actividad de Cbl-b. La una identidad de secuencia de aproximadamente 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92% o 91% es contemplada por los metodos de la presente descripcion.
El ARN puede ser sintetizado ya sea in vivo o in vitro. La ARN polimerasa endogena de la celula puede mediar la transcription in vivo, o se puede usar ARN polimerasa clonada para transcription in vivo o in vitro. Para transcription de un transgen in vivo o un constructo de expresion, se puede usar una region reguladora (por ejemplo, promotora, reforzadora, silenciadora, donadora y aceptora de empalme, poliadenilacion) para transcribir la cadena de ARN (o cadenas). La inhibicion puede ser controlada por una transcripcion especlfica en un organo, tejido, o tipo de celula; la estimulacion de una condition ambiental (por ejemplo, infection, estres, temperatura, inductores qulmicos); y/o la transcripcion por ingenierla genetica en una etapa o edad de desarrollo. Las cadenas de ARN pueden o no estar poliadeniladas; las cadenas de ARN pueden o no ser traducidas en un polipeptido por un aparato de traduction de la celula. El ARN puede ser sintetizado qulmicamente o enzimaticamente por reacciones manuales o automatizadas. Los ARN pueden ser sintetizados por una ARN polimerasa celular o una ARN polimerasa de bacteriofago (por ejemplo, T3, T7, SP6). Cualquier metodo adecuado para uso y production de un constructo de expresion que sea conocido en la tecnica es contemplado por la presente descripcion como un metodo para atenuar y/o reducir la actividad de Cbl-b.
En otras realizaciones, la actividad de Cbl-b puede ser atenuada y/o eliminada por desactivacion genica dirigida por mutaciones, incluyendo pero sin limitarse a supresiones de exones, en la copia genomica de Cbl-b. Los metodos para desactivacion genica dirigida son bien conocidos en la tecnica y se contemplan en la presente descripcion.
En ciertas realizaciones, la interruption del gen de Cbl-b puede ser inducida por rompimientos de la cadena doble de ADN especlfica del sitio (DSB) que puede ser creada en la secuencia genomica de Cbl-b. Las nucleasas especlficas del sitio pueden ser modificadas por ingenierla genetica como protelnas de fusion que portan un dominio de enlazamiento de ADN, que reconoce una secuencia especlfica de acido nucleico en el gen de Cbl-b, fusionado a un dominio de nucleasa. Tales nucleasas especlficas del sitio pueden crear DSB en secuencias de nucleotidos especlficas predeterminadas. La reparation de tales DSB mediante rutas de reparation de ADN endogeno generalmente conduce a un error, supresion o sustitucion de nucleotidos, lo que conduce efectivamente a la interrupcion del gen objetivo de Cbl-b.
En otra realization, se puede atenuar y/o reducir la actividad de Cbl-b mediante cualquier agente que maneje la actividad de la protelna Cbl-b, incluyendo pero sin limitarse a la actividad de Ub-ligasa de Cbl-b.
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En otros aspectos, la descripcion proporciona un metodo para elaborar celulas T CD8+ deficientes de Cbl-b'/_ por ablacion de Cbl-b en infiltrados de CTL especifico de tumor. Los tejidos tumorales a menudo contienen grandes cantidades de leucocitos infiltrantes que son enriquecidos por los CTL especificos de tumor. Estas celulas usualmente no pueden responder a los tumores. La descripcion proporciona metodos, que demuestran que la inactivacion de Cbl-b en infiltrados de CTL especificos de tumor restablece su sensibilidad a los tumores, ya que las celulas T de Cbl-b-/- responden a una estimulacion debil del antigeno y no dependen de coestimulacion para activacion. En ciertas realizaciones, los metodos pueden utilizar ARNpi o una forma negativa dominante de Cbl-b para determinar si la inhibicion de la funcion de Cbl-b en CTL infiltrantes de tumor devuelve a estos CTL los caracteres de las celulas T de Cbl-b-/". En otras realizaciones, la descripcion proporciona metodos para determinar si los infiltrados de CTL especificos tumor erradican eficientemente los tumores establecidos.
En ciertos aspectos, la descripcion esta dirigida a metodos para la elaboracion de los CTL "super asesinos" que pueden ser completamente activados y ejercen la funcion efectora independiente de la coestimulacion. Este metodo comprende la subregulacion de la actividad de Cbl-b en las celulas T CD8+. En otros aspectos, la descripcion esta dirigida a metodos para el uso de estos "super asesinos" para obtener una respuesta inmune contra los tumores. En ciertas realizaciones, la descripcion esta dirigida a metodos para el uso de estos "super asesinos" en inmunoterapia para el cancer. Estos metodos permiten dirigir la activacion de los CTL especificos del tumor por celulas tumorales que se caracterizan ya sea con antigenicidad fuerte o debil, y no expresan ligandos coestimuladoras.
En otros aspectos, los metodos para elaborar celulas T CD8+ que no requieren coestimulacion, tambien denominadas como CTL "super asesinos", en donde los CTL se pueden aislar de infiltrados especificos del tumor. Los infiltrados tumorales se enriquecen de CTL contra los antigenos tumorales, y la inmunoterapia usando estos CTL podria restringir la citotoxicidad para las celulas tumorales sin provocar una amplia autoinmunidad. En la actualidad, un gran desafio a lo largo de esta direccion es la identificacion de las rutas moleculares que controlan las senales coestimuladoras. La modulacion de estas rutas debe ser un medio poderoso para eliminar el requisito de coestimulacion de la activacion de celulas T inducida por TCR, permitiendo en consecuencia la funcion efectora y de cebado de los CTL especificos del tumor, en forma independiente de las senales de coestimulacion. La citotoxicidad de los CTL requiere la activacion de los CTL. Sin embargo, los datos proporcionados en este documento indican que la transferencia de los CTL de Cbl-b'/_ no activados tambien puede rechazar tumores, por ejemplo tumores E.G7. Estos resultados demuestran que la ablacion de Cbl-b mejora la activacion de las celulas T.
Metodos para la seleccion de agentes que inhiben la actividad de Cbl-b
En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos de seleccion para identificar agentes, incluyendo, pero no limitado a compuestos quimicos, que pueden atenuar y/o inhibir la actividad de Cbl-b, incluyendo pero no limitado a la actividad de Ub-ligasa de Cbl-b. En una realizacion, el metodo de seleccion puede utilizar un ensayo para medir la actividad de Ub-ligasa de Cbl-b para determinar si un agente afecta la actividad de Cbl-b. En otras realizaciones, los metodos pueden utilizar un ensayo para medir la activacion independiente de CD28 de los CTL, la subregulacion desmejorada de TCR inducida por la estimulacion anti-TCR, o la perdida de supresion de TGF-beta de la proliferacion de CTL, o cualquier combinacion de los mismos. Cualquiera de estos ensayos se puede utilizar para determinar si un agente modula o altera la funcion de Cbl-b.
En ciertas realizaciones, un metodo para identificar un agente que afecta la expresion o actividad de Cbl-b comprende: la estimulacion de una celula con un anticuerpo anti-CD3 en ausencia de coestimulacion con anticuerpo anti-CD28, poner en contacto la celula con un agente candidato, la medicion de los niveles de estimulacion o proliferacion celular, en donde un agente que conduce a la estimulacion o la proliferacion celular es indicativo de un agente que subregula la actividad o expresion de Cbl-b. Los ejemplos no limitantes de celulas adecuadas que se pueden utilizar en los metodos para identificar un agente, que afectan la expresion o actividad de Cbl-b, son celulas T CD4 + y T CD8+. Los ensayos para medir la estimulacion y proliferacion de las celulas T son conocidos en la tecnica, e incluyen, pero son no se limitan a, ensayos que miden el nivel de expresion de citoquinas, por ejemplo, pero no limitado a IL-2, INF-y, e IL-10.
En ciertas realizaciones, la descripcion proporciona metodos para identificar un agente que afecta la actividad de Cbl-b, que comprende: poner en contacto una fuente de Cbl-b con un agente, la determinacion de si el agente disminuye la actividad de Cbl-b. Los ensayos que se puede utilizar para medir la subregulacion de la actividad de Cbl-b incluyen, pero no se limitan a, la determinacion de los niveles de proliferacion de celulas T inducida por TCR, ubiquitinacion de p85, submodulacion de TCR inducida por antigeno, y la supresion de TGF-beta de la proliferacion celular, en donde un agente que mejora la proliferacion de celulas T en presencia o en ausencia de TGF-beta, o disminuye la submodulacion de TCR inducida por antigeno (Naramura M y colaboradores, 2004), o disminuye la ubiquitinacion de p85 (Fang D. y colaboradores, 2001) es indicativo de un agente que disminuye la actividad de Cbl- b. En ciertas realizaciones, los metodos para identificar un agente que afecta la actividad de Cbl-b tambien pueden comprender una etapa de determinacion de si el agente se une a Cbl-b.
En ciertos aspectos, la descripcion establece que las celulas T de Cbl-b'/_ juegan un papel esencial en el rechazo del tumor. En ciertos aspectos, la descripcion establece que ratones Cbl-b'/_, son resistentes a la inoculacion del tumor.
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En ciertas realizaciones el agotamiento o reduccion del numero de celulas T en ratones Cbl-b'A permite un crecimiento vigoroso de los tumores inoculados. En otra aspectos, la descripcion establece que existen infiltrados masivos de T CD8+ en los tejidos tumorales de ratones Cbl-b-/-. En otra aspectos, la descripcion establece que las celulas T CD8+ de ratones Cbl-b-/- son resistentes a la supresion de TGF-beta y producen altos niveles de IL-2 e IFN- Y despues de la activacion de TCR incluso en ausencia de coestimulacion de CD28. En otros aspectos, la descripcion establece que la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de Cbl-b-/" aisladas o purificadas en ratones portadores de tumores es suficiente para erradicar los tumores E.G7 establecidos. En otros aspectos, la descripcion establece que las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ responden a la estimulacion antigenica tumoral y ejercen actividad citotoxica contra las celulas tumorales independiente de las senales coestimuladoras. Los CTL especlficos del tumor se pueden identificar, aislar, y/o enriquecer a partir de tejidos tumorales por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante clasificacion de celulas fluorescentes, o por perlas magneticas. Tales procedimientos generalmente producen una poblacion de celulas que comprende al menos aproximadamente 85% a 89%, 90% a 95% de los CTL. El enriquecimiento por rondas sucesivas de purificacion puede producir una poblacion de celulas que comprende al menos aproximadamente 95%-99% de los CTL. En ciertos aspectos, la invencion proporciona una poblacion de celulas que comprenden alrededor de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% de los CTL. En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para la modulation de la ruta de Cbl-b en celulas T CD8+, en donde en ciertas formas de realization las celulas T CD8+ pueden aislarse de los infiltrados tumorales. Los metodos de la presente descripcion se pueden utilizar para generar CTL "super asesinos" que se pueden utilizar en inmunoterapia del cancer.
Ejemplos y ejemplos hipoteticos
Ratones y celulas. Los ratones con desactivacion de Cbl-b (Cbl-b'/‘) y desactivacion de ATM (ATM'/‘) se generaron como se describio anteriormente (Chiang y colaboradores, 2000; Barlow y colaboradores, 1996). Los ratones Cbl-b'A fueron sometidos a retrocruzamiento con ratones C57BL/6 durante 12 generaciones. Los ratones C57BL/6, Cbl-b'/_, ATM'/_, Cbl-b'/_ ATM'/_ doblemente desactivados se mantuvieron en condiciones especlficas libres de patogenos de conformidad con los lineamientos y protocolos para el cuidado de animales. Se mantuvieron celulas EL4 (ATCC, Rockville, MD) y E.G7 en RPMI 1640 complementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, glutamina, y acido 2-mercaptoetanol.
Proliferation de celulas T in vitro y ensayos de production de citoquina. Se purificaron celulas T totales o celulas T CD8+ a partir del bazo por MACS utilizando una celula T o un kit para el enriquecimiento de celulas T CD8+ (Miltenyi Biotech). Para el ensayo de proliferacion de celulas T, se estimularon las celulas T CD8+ purificadas con diversas concentraciones de anti-CD3e unido a la placa y anti-CD28 soluble (5 pg/ml) durante 72 h. Despues de pulsar las celulas con [3H]-timidina (1 pCi/ml) durante las 12 h, se recolectaron las celulas y se determino la absorcion de [3H]- timidina utilizando un contador p. Para la tincion intracelular con IL-2 e IFN-y, se estimularon las celulas durante 12 horas con anticuerpos anti-CD3 o anti-CD3 + anti-CD28. Despues de una incubation adicional con Brefeldina A (5 pg/ml) durante 6 horas, se tino la superficie de las celulas estimuladas con anticuerpo anti-CD8, se fijaron y permeabilizaron en solution de Cytofix/Cytoperm (BD PharMingen), y luego se tineron intracelularmente con anticuerpos anti-IFN-Y y anti-IL-2. Se analizaron las celulas tenidas en un LSR II (BD Bioscience) utilizando el software FlowJo (TreeStar, Inc.). Los anticuerpos anti-CD3, anti-CD28, anti-CD4, anti CD8, anti-IL-2, anti-IFN-Y, anti- TCRp, anti-CD44, y anti-CD62L conjugados con fluorocromo o purificados eran de BD PharMingen. El analisis ELISA de la produccion de IL-2 se realizo de acuerdo a un protocolo anterior (Chiang y colaboradores, 2000).
Inmunohistoqulmica y analisis de los linfocitos que infiltran el tumor. Siete y diecinueve dlas despues de la inoculation del tumor, se recogieron los tejidos tumorales, se congelaron en medio Tissue-Tek oCt (Sakura Finetech), y se crioseccionaron. Se tineron las secciones ya sea con hematoxilina o con eosina (H/E) o con anticuerpo FITC-anti-CD8. Se registraron los resultados de la tincion por microscopla normal o de fluorescencia. Para analizar los infiltrados tumorales por citometrla de flujo, se prepararon los linfocitos que infiltran el tumor a partir de tejidos tumorales 14 dlas despues de la inoculacion. Se cortaron los tumores de ratones sacrificados, se lavaron en PBS, y se cortaron en piezas de 2-3 mm de tamano. Las piezas de tumor resultantes se digirieron luego a 37°C con colagenasa D (1,5 mg/ml, Sigma) en DMEM complementado con 2% de suero bovino fetal y 50 unidades/ml de ADNasa I (Sigma). Despues de la digestion durante 40 minutos, se pasaron las celulas a traves de un filtro de 70 pm y se lavo la suspension celular recogida con PBS, se tino con una combination diferente de anticuerpos, y se analizaron en un LSR II. Los anticuerpos utilizados para la tincion fueron anti-TCRp, anti-CD8, anti-CD44 y anti- CD62L (BD PharMingen).
Experimentos in vivo. Las celulas tumorales que crecieron en fase logarltmica se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron en PBS. Despues de afeitar el costado derecho, se realizo la inyeccion subcutanea con los numeros indicados de celulas en 100 pl de PBS. Se hizo seguimiento al crecimiento del tumor semanalmente o dos veces por semana usando un calibrador. Para la transferencia adoptiva, el dla 7 despues del establecimiento del tumor en ratones C57BL/6, los ratones fueron inyectados con 3 x 106 celulas T CD8+ purificados aisladas a partir de celulas de ganglios linfaticos de tipo silvestre y ratones Cbl-b'/_ utilizando un kit de enriquecimiento de celulas T CD8+ (Miltenyi Biotech). Luego se hizo seguimiento al crecimiento del tumor cada tres dlas utilizando un calibrador. El crecimiento
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del tumor en ratones Cbl-b'7' ATM'7' se midio semanalmente. Los volumenes tumorales se aproximaron multiplicando la longitud medida por el ancho medido por el promedio calculado de la longitud medida y los valores de anchura, como se describio previamente (Helmich, B. K., y R. W. Dutton. 2001. The role of adoptively transferred CD8 T cells and host cells in the control of the growth of the EG7 thymoma: factors that determine the relative effectiveness and homing properties of Tc1 and Tc2 effectors. J Immunol 166: 6.500 - 6.508).
Secrecion y/o proliferacion de citoquina de celulas T CD8+ purificadas: la secrecion y/o proliferation de citoquina de celulas T CD8+ purificadas de ratones Cbl-b'/- y de tipo silvestre se comparo despues de la estimulacion a traves del TCR solo o coestimulacion a traves del TCR y del receptor coestimulador CD28. Las celulas T CD8+ de tipo silvestre generaron respuestas de IFN-y e IL-2 despues de la estimulacion con anticuerpo anti-CD3 solo (Fig. 1a). Las celulas T CD8+ de tipo silvestre produjeron aproximadamente 6 veces mas IL-2 y 2-3 veces mas IFN-y cuando se proporciono coestimulacion de CD28. La estimulacion de celulas T CD8+ de Cbl-b-/- con anticuerpo anti-CD3 solo, provoco niveles mucho mas altos de IL-2 e IFN-y incluso en comparacion con las respuestas de celulas de tipo silvestre coestimuladas por anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. La adicion de serialization coestimuladora por el anticuerpo anti-CD28 tambien mejoro ligeramente la production de IL-2 por las celulas T CD8+ de Cbl-b^; sin embargo, el nivel de IFN-y no aumento (Fig. 1a).
La inactivation de Cbl-b por cualquier metodo adecuado supero en gran medida el requisito de coestimulacion de CD28 en respuestas de citoquina de las celulas T CD8+. Cuando se estimularon los cultivos que contienen tanto celulas T CD8+ como CD4+, mejoro notoriamente la produccion de IFN-y, pero no la de IL-2 por las celulas T CD8+ de tipo silvestre; sin embargo, la produccion de IFN-y por celulas T CD8+ de Cbl-b-/- fue comparable a la de las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- (Fig. 5), lo que sugiere que la ayuda de las celulas T CD4+ no tiene un efecto aditivo sobre la respuesta de IFN-y de celulas T CD8+ de Cbl-b-/-. En consonancia con los efectos observados sobre las respuestas de IL-2, el anticuerpo anti-CD3 solo indujo una proliferacion significativamente mayor de celulas T CD8+ de Cbl-b-/- purificadas que aquella de las celulas T de tipo silvestre (Fig. 1b). Ademas, aunque la respuesta proliferativa de las celulas T CD8+ de tipo silvestre mejoro notablemente cuando se coestimularon las celulas con anti-CD3 y anti-CD28, alcanzando un nivel equivalente a la respuesta de celulas T CD8+ de Cbl-b-/- estimuladas por anti-CD3 solo, no se elevo dramaticamente la proliferacion de celulas T CD8+ de Cbl-b-/- por coestimulacion de CD28 (Fig. 1b). En otros aspectos, la invention establece que la ablation de la actividad de Cbl-b vuelve a las celulas T CD8+ capaces de responder a la estimulacion de TCR sin el requisito de coestimulacion de CD28 y ayuda de celulas T CD4+. Figura 1c muestra que aunque la presencia de TGF-p suprimio notablemente la proliferacion y produccion de IFN-y de celulas T CD8+ de TS, el mismo TGF-p ejercio poco efecto sobre las celulas T CD8+ Cbl-b-'- (Figura 1C). Este resultado indica que la susceptibilidad a la supresion de TGF p se ve comprometida en celulas T CD8+ de CblV-.
Rechazo de tumores trasplantados en ratones Cbl-b^
La perdida de la dependencia en la senalizacion CD28 para la activation de celulas T CD8+ de Cbl-b^ sugiere que celulas T de Cbl-b^ pueden ser activadas por celulas tumorales en ausencia de ligandos coestimuladoras. Los ratones Cbl-b^ montan una respuesta inmune eficiente contra celulas tumorales que carecen de expresion de moleculas coestimuladoras B7. Los ratones Cbl-b^ son resistentes a los timomas EL4 y E.G7 inoculado de murino. Las celulas EL4 se derivan de un linfoma de linaje T que se desarrollo en un raton negro C57 tratado con 9,10- dimetil-1,2-benzantraceno. Las celulas EL4 representan un modelo tumoral con inmunogenicidad debil (Gorer P.A., 1950. Studies in antibody response of mice to tumor inoculation. Br J Cancer 4: 372-379). Las celulas E.G7 son transfectantes de EL4 que expresan un transgen que codifica ovoalbumina de pollo (OVA) y, por lo tanto, se considera que son tumores altamente inmunogenica en los cuales la OVA sirve como el antlgeno especlfico del tumor (Moore , M.W., F.R. Carbone, y M.J. Bevan, 1988. Introduction of soluble protein into the class I pathway of antigen processing and presentation. Cell 54: 777-785). Ni los linfomas de EL4 ni los de E.G7 expresan B7.1 o B7.2 en la superficie de la celula. Tanto los linfomas de EL4 como de E.G7 crecen progresivamente ratones C57BL/6 despues de inoculation subcutanea, mientras que por el contrario las celulas EL4 transfectadas B7, son rechazadas, demostrando una papel crltico de la coestimulacion en la respuesta antitumoral de ratones de tipo silvestre (Yu y colaboradores, 1998).
Se inyectaron celulas E.G7 (1X 106 celulas/raton) en los costados de ratones C57BL/6 y Cbl-b^ de tipo silvestre y luego se hizo seguimiento al crecimiento del tumor (Fig. 2a). Los tumores crecieron progresivamente en el 83% de los ratones de tipo silvestre (n = 19). Solo el 23% de los ratones Cbl-b^ desarrollaron tumores, mientras que el resto, o bien no desarrollo tumores o exhibio regresion tumoral despues del crecimiento inicial (n = 34). Por lo tanto los ratones Cbl-b^ rechazaron los tumores E.G7.
Se inyecto una dosis baja de celulas EL4 (5 x 104 celulas/raton) en los costados de ratones C57BL / 6 y Cbl-b^ de tipo silvestre, luego se hizo seguimiento al del crecimiento del tumor. Los tumores crecieron rapidamente y mataron al 85% (17/20) de los ratones de tipo silvestre. La misma dosis de tumor fue completamente rechazada en ratones Cbl-b^ (Figura 2b.). La inoculacion de ratones con una alta dosis de celulas EL4 (2,5 x 105 celulas/raton) dio como resultado el crecimiento del tumor en todos los ratones de tipo silvestre (n = 10). La misma dosis alta de celulas EL4 (2,5 x 105 celulas/raton) crecio a una tasa mucho mas lenta en siete ratones Cbl-b^ y no crecieron para nada en 3
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ratones Cbl-b-/- (figura 2c). Por lo tanto, la ablacion de Cbl-b confiere la capacidad de rechazar o atenuar el crecimiento de tumores que expresan ya sea antigenos tumorales fuertes o debiles in vivo. La Figura 2e muestra que el rechazo tumoral fue independiente de CD28 ya que los ratones doble mutantes Cbl-b-/- CD28-/- tambien rechazaron eficientemente los tumores EL4 inoculados (Figura 2e).
Tabla 1. Restablecimiento del desarrollo de timocitos c-Cbl Cb-b dKO por c-Cbl
Timocitos totales CD4+CD8+ CD4+ % CD8+ CD4+/CD8+ Relaciones
Ej. 1
GFP- (35x10) 42% 61 15 12 1,2
GFP+ 38% @ 82 12 3 4,0
Ej. 2*
GFP- (60 x 106) 48% 55 16 18 0,88
GFP+ 21% @ 87 10 3 3,33
GFP- (100 x 106) 58% 51 17 20 0,85
GFP+ 18% @ 80 14 4 3,5
@: Las celulas que expresan un nivel intermedio de GFP no fueron incluidas *: Resultados de dos ratones receptores independientes._______________
Las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- erradicaron eficazmente tumores singenicos. Las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- responden a la estimulacion antigenica en forma independiente de la coestimulacion de CD28 y la ayuda de celulas T CD4+. La resistencia de ratones Cbl-b-/- a los tumores inoculados esta principalmente mediada por celulas T CD8+. En ciertas realizaciones, la infiltracion de celulas T CD8+ en tejidos tumorales se examino mediante inmunohistologia (Fig. 3a). Se inocularon aproximadamente 106 celulas E.G7 en los costados de ratones C57BL/6 y ratones Cbl-b-/- por inyeccion subcutanea. Siete dias despues de la inoculacion, no habia infiltrados detectables de celulas CD8+ en tejidos tumorales ni en ratones de tipo silvestre ni Cbl-b-/-. Dos semanas despues de la inoculacion, se encontro un aumento marcado de infiltrados de leucocitos CD8+ en tumores en ratones Cbl-b-/-, pero no de tipo silvestre. Los infiltrados de CD8+ permanecieron abundantes en los tumores en regresion en ratones Cbl-b-/- 19 dias despues de la inoculacion (Fig. 3a.), en donde, la infiltracion fue minima en tumores en ratones de tipo silvestre. Los analisis de citometria de flujo revelaron que, a diferencia de los infiltrados de CD8+ en tumores en ratones de tipo silvestre, que subregularon la superficie de TCRp, los infiltrados de CD8+ en tumores de ratones Cbl-b-/- expresaron receptores TCRap en un nivel comparable a aquel en las celulas T no modificadas de ganglio linfatico (Fig. 3b). Estas celulas T CD8+ tambien expresaron un alto nivel de CD44 (Fig. 3b), lo que sugiere que eran celulas T CD8+ activadas.
Las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- son responsables de la erradicacion de los tumores. Las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- de tipo silvestre purificadas (3 x 106 celulas/raton) fueron transferidas a ratones portadores de tumor E.G7 por inyeccion intravenosa, y se hizo seguimiento al crecimiento del tumor. Los tumores E.G7 establecidos, que fueron inoculados 8 dias antes de la transferencia de celulas T CD8+, fueron eficientemente erradicados en el lapso de 4-5 semanas en un 65% (20/30) y los tumores crecieron a una tasa mucho mas lenta en el resto de los ratones que recibieron celulas T CD8+ de Cbl-b-/-. Al menos el 90% (23/26) de los ratones que recibieron las celulas T CD8+ de tipo silvestre tuvieron un rapido crecimiento tumoral (Fig.3c). En ciertos aspectos, la invencion establece que las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- son suficientes para montar una respuesta inmune eficiente contra los tumores establecidos. La Figura 3d muestra que los analisis de citometria de flujo revelaron que a diferencia de los infiltrados de CD8+ en los tumores en ratones Ts, que subregularon la superficie de TCRp, los infiltrados de CD8+ en tumores de ratones Cbl-b-/- expresaron receptores TCRap a un nivel comparable a aquel en celulas T no modificadas de ganglios linfaticos (Figura 3d). Estas celulas T CD8+ tambien expresaron un alto nivel de CD44 (Figura 3d), lo que sugiere que se activaron. Ademas de las celulas T CD8+, los tumores tanto en ratones TS como en Cbl-b-/- tambien contenian celulas T CD4+ e infiltrados CD4+ FoxP3+ Treg (Figura 3d). Hubo significativamente mas infiltrados Treg en tumores en ratones Cbl-b-/- que en ratones TS (P <0,005).
Para determinar si celulas T CD8+ de Cbl-b-/- eran responsables por la erradicacion de los tumores, se transfirieron celulas T CD8+ purificadas de TS o Cbl-b-/- (3 x 106 celulas por raton) en ratones portadores de tumor E.G7 inyeccion intravenosa y se hizo seguimiento al crecimiento del tumor. Se observo que los tumores E.G7 establecidos, que fueron inoculados 7 dias antes de la transferencia de celulas T CD8+, fueron de manera eficiente erradicados en un lapso de 4-5 semanas o crecieron a una tasa mucho mas lenta en a ratones que recibieron celulas T CD8+ de Cbl-b- /- en comparacion con los ratones que recibieron celulas T CD8+ de TS (Figura 3e, paneles de la izquierda). En total, 70% de los ratones (n = 13) adoptivamente transferidos con celulas T CD8+ de Cbl-b-/- erradicaron tumores y sobrevivieron. Por el contrario, mas del 90% de los ratones (n = 11) que recibieron celulas T CD8+ de TS tuvieron un rapido crecimiento del tumor y murieron (Figura 3e, panel derecho). Para determinar si el rechazo observado de tumores E.G7 fue medido por celulas T CD8+ especificas del tumor, se cruzaron ratones Cbl-b-/- con ratones transgenicos OT1 TCR, que expresaron un TCR transgenico que reconoce un peptido OVA en el contexto de H-2Kv.
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La mayorla de las celulas T CD8+ desarrolladas en ratones OT1 expresan este transgen TCR y por tanto son capaces de reconocer un peptido OVA expresado por el tumor E.G7. Se encontro que la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ OT1 purificadas de TS (3 x 106 celulas por raton) en ratones portadores de tumores E.G7 (n = 5) no pudieron prevenir ningun crecimiento tumoral. Por el contrario, la transferencia de celulas T CD8+ en OT1 de Cbl-b'/_ en ratones portadores del tumor dio como resultado una regresion completa de los tumores en todos los ratones (n = 5) (Figura 3e). Tomados estos datos en conjunto, indican que las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- pueden producir una respuesta inmune eficiente contra tumores establecidos en un huesped TS que de otra forma es incapaz de rechazar el tumor.
La ablacion de Cbl-b evita la aparicion espontanea de tumores en ratones ATM-/-. El reconocimiento efectivo y la eliminacion de tumores E.G7 y EL4 trasplantados por celulas T CD8+ de Cbl-b-/- indica que la mutacion de Cbl-b-/- facilita la vigilancia eficiente y la proteccion contra tumores espontaneos. En ciertas realizaciones, se cruzaron ratones Cbl-b-/" con ratones aTm-/" ,y se analizo la incidencia de linfomas de celulas T, y la esperanza de vida de los ratones doblemente mutantes resultantes. En forma consistente con los hallazgos anteriores (Barlow C., S. Hirotsune, R. Paylor, M. Liyanage, M. Eckhaus, F. Collins, Y. Shiloh, J.N. Crawley, T. Ried, D. Tagle, y A. Wynshaw- Boris. 1996. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell 86: 159-171), aproximadamente 50% de los ratones ATM'/_ murieron a los 6-7 meses de edad, y la mayorla de estos ratones desarrollaron linfoma de celulas T (Fig. 4). En contraste, no se observaron linfomas en ratones doblemente mutantes Cbl-b'A ATM'/_ (n = 21 ratones) de 6-7/meses de edad, y aparecieron linfomas en menos del 10% (2/21) de los ratones de 9 meses de edad. En ciertos aspectos, la invencion establece que la ablacion de la funcion Cbl-b retrasa y/o evita el inicio de al menos algunos tumores espontaneos.
La erradicacion de los tumores E.G7 por celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ adoptivamente transferidas puede aparecer menos eficiente que la erradicacion de los tumores E.G7 en ratones Cbl-b'A. En ciertos casos, esto puede ser debido a la cantidad relativamente menor de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ en los ratones adoptivamente transferidos que en los ratones Cbl-b'/_ (3 x 106 versus > 1-2 x 107/raton). En otros casos, las celulas T CD4+ de Cbl-b'/_ y/o las celulas presentadoras de antlgeno tales como las celulas dendrlticas, pueden interactuar con celulas T CD8+ de Cbl-b'A en rechazo tumoral. Los experimentos utilizando diferentes combinaciones de celulas T monoclonales CD8+ y CD4+ especlficas del tumor y APC purificadas como celulas donantes, pueden ayudar a aclarar esta cuestion.
La ablacion de llnea germinal de Cbl-b en ratones ATM'/_ dio como resultado una marcada reduccion de tumores espontaneos, y en consecuencia aumento la esperanza de vida. Dada la observacion de que las celulas T CD8+ de Cbl-b'A pueden montar respuestas inmunes eficientes a tumores E.G7 y EL4 trasplantados, la incidencia reducida de linfomagenesis en ratones doblemente mutantes Cbl-b'/_ ATM'/_ pueden resultar de la vigilancia inmunologica mejorada de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ contra los tumores espontaneos que surgen en estos ratones. Debido a que la tumorigenesis es un proceso muy complejo, otra posibilidad es que la mutacion de llnea germinal Cbl-b'/_ disminuye la tumorigenesis en si misma, en vez de mejorar el rechazo de los tumores que surgen en ratones Cbl-b'/_ ATM'/_. La inhibicion sistemica de la funcion de Cbl-b es un enfoque efectivo para reducir la incidencia de tumores.
Modelos animales portadores de tumores inmunogenicos
En las ultimas decadas, los modelos animales portadores de tumores han sido ampliamente utilizados para analizar los mecanismos moleculares y celulares implicados en las respuestas inmunotumorales. Muchos de estos modelos son generados por transferencia adoptiva de diversas celulas tumorales en animales singenicos con el mismo MHC. Los siguientes tumores son ejemplos no limitantes de modelos animales que pueden ser utilizados en diversas realizaciones de la presente invencion. Otros modelos de tumores tambien pueden ser adecuados para su uso en diversas realizaciones de la invencion.
Celulas tumorales E.G7 y EL4 y ratones transgenicos OT1 TCR (Tg): las celulas EL4 son una llnea tumoral H-2b negativa para B7 derivada de linfoma de linaje T de un raton C57BL/6 tratado con 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno. Estas celulas expresan unicamente antlgenos propios no mutados y quizas algunos mutados, que representan por lo tanto un modelo de tumores con antigenicidad debil. La llnea de celulas tumorales E.G7 es un derivado de EL4 que expresa un transgen de ovoalbumina de pollo (OVA). Muestra al epltopo inmunodominante de Ova en su superficie, identificado como el peptido de ocho residuos Ova 257-264 (SIINFEKL) (41). Debido a que Ova no se expresa en celulas de murino, sirve como un antlgeno especlfico del tumor. Por lo tanto, E.G7 representa un modelo de tumor que refleja tumores antigenicos fuertes tales como celulas transformadas con virus. Tanto las celulas EL4 como E.G7, cuando se inocula en forma subcutanea en ratones C57BL/6, desarrollan de forma progresiva tumores solidos locales de una forma dependiente de la dosis, y eventualmente mata a los ratones receptores despues de 4 semanas (42). En el tejido tumoral E.G7, se pueden detectar CTL especlficos de Ova, sin embargo, son anergicos a la estimulacion del antlgeno tumoral (Ova) (42). Los ratones OT1 son ratones transgenicos TCR en los cuales las celulas T CD8+ que expresan al transgen, expresan un transgen de TCR VI38 y Va2 y especlficamente reconocen al peptido Ova (SIINFKL) en el contexto de MHC clase I Kb (43, 44). La inoculacion de celulas G-7 en ratones Tg OT1 tambien da como resultado crecimiento del tumor, lo que sugiere que la presencia de grandes cantidades de CTL especlficos del tumor no es suficiente para rechazar el tumor. Las celulas E.G7 se pueden utilizar como un modelo
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de tumor de celulas que expresan antlgeno especlfico del tumor, y se pueden utilizar ratones OT1 TCR Tg como la fuente de celulas T CD8+ monoclonales especlficas del tumor.
Celulas tumorales B16 y los ratones transgenicos Pmel-1 TCR: el melanoma B76 es pobremente inmunogenico y altamente agresivo en ratones C57BL/6 (45). Las celulas de melanoma B16 expresan la homologla de raton (pmel- 17) de gp100 humana, una enzima involucrada en la slntesis de pigmento en melanocitos normales (34). En este modelo de tumor gp100 representa antlgenos propios no mutados que se expresan normalmente en la mayorla de las celulas tumorales (34). Los ratones Tg Pmel-1 son ratones transgenicos TCR en los cuales las celulas T CD8+ expresan un TCR que reconoce complejos gp100 (gp10025-33) H-2Db. A pesar del mayor numero de celulas T CD8+ especlficas del antlgeno, los melanomas B16 se desarrollan a la misma velocidad de crecimiento en ratones Tg Pmel-1 que aquella en ratones C57BL/6 de tipo silvestre, ya que esencialmente todas las celulas T CD8+ restringidas en H-2Db especlficas de gp100 son anergicas (34). En el estado anergico de gp100, los CTL restringidos en H-2Db pueden ser reversados por melanomas inoculados que expresan un ligando B7 (35), o por administracion in vivo de altas dosis de IL-2 y vacunacion con una variante del peptido gp100 (34), resultando en una erradicacion completa y duradera de las cargas tumorales. Ya que un vitiligo gradual, limitado causado por autoinmunidad contra melanocitos normales tambien se presenta en la mayorla de los ratones Tg Pmel-1 donde se observa destruction del tumor (34), este sistema permite la investigation de posibles efectos secundarios de la inmunoterapia tumoral, tales como autoinmunidad, causada por una respuesta inmune antitumoral contra antlgenos asociados a tumores que tambien son expresados por el tejido normal.
Celulas T CD8+ de Cbl-b'A pueden ser eficientemente activadas en ausencia de coestimulacion de CD28
Se generaron ratones Cbl-b'/_ por manipulation genica (56). La mutation Cbl-b'/_ no afecta el desarrollo de organos linfoides principales. El desarrollo tanto de linfocitos T como B en ratones Cbl-b'/_ parece ser normal. Los ratones Cbl-b'A pueden ser altamente susceptibles a enfermedades autoinmunes. La mutacion Cbl-b'/_ no afecta la activation de celulas B inducida por antlgeno. Por el contrario, la activacion de celulas T CD4+ de Cbl-b'/_ ya no requiere la coestimulacion de CD28, en llamativo contraste con las celulas T de tipo silvestre para las cuales la coestimulacion de CD28 fue necesaria para inducir una respuesta productiva, tal como la proliferation celular riguroso y production de IL-2. Para determinar si la mutacion Cbl-b_/_ sustituye la coestimulacion de CD28 en la respuesta inmune, se cruzaron ratones Cbl-b'/_ con ratones CD28'/_, y se examinaron la proliferacion de celulas T in vitro y las respuestas de anticuerpos anti-NP que dependen de celulas T in vivo de ratones doblemente mutantes Cbl-b'/_ CD28'/_ (59). Aunque las celulas T de CD28'/_ no pueden montar ninguna proliferacion detectable despues de la estimulacion del anticuerpo anti-CD3, las celulas T de Cbl-b'/_ CD28'/_ proliferan normalmente bajo la misma condition. Aunque los ratones CD28'/_ no pudieron producir ningun anticuerpos anti-NP detectable en suero, los ratones doblemente mutantes Cbl-b'/_ CD28'/_ provocan respuestas normales de anticuerpos anti-NP de diferentes isotipos de Ig. Las respuestas de anticuerpo anti-NP en ratones Cbl-b'/_ no fueron mejoradas en comparacion con la provocadas en ratones de tipo silvestre, lo que sugiere que la mutacion Cbl-b'/_ apenas resulta en la sustitucion de la serialization de CD28 en lugar de una mejora general de las respuestas dependientes de T durante la activacion de celulas T.
Por lo tanto, en ausencia de Cbl-b, la activacion de celulas T CD4+ es independiente CD28. La activacion de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ no depende de CD28. En ciertas realizaciones, la produccion de IL-2 e IL-gamma en celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ estimuladas con anticuerpo anti-CD3 se mide por tincion intracelular seguida de analisis FACS (61). Mientras que la produccion de estas citoquinas por las celulas T CD8+ de tipo silvestre claramente requiere la coestimulacion de CD28, las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ estimuladas por anticuerpo anti-CD3 solamente, produce niveles IL-2 e IL-gamma tan altos como los niveles en celulas T CD8+ de tipo silvestre coestimuladas con anti-CD3 y anti-CD28. Por lo tanto, las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ pueden ser activadas de manera eficiente en ausencia de coestimulacion de CD28.
Ratones Cbl-b'/_ rechazaron eficientemente tumores inoculados con antigenicidad fuerte o debil
La mayorla de los tumores inmunogenicos no expresan ligandos para moleculas coestimuladoras. Esto ha sido considerado como uno de los mecanismos mediante los cuales los tumores rompen la vigilancia inmune y disminuye la efectividad de la inmunoterapia tumoral. Ya que las celulas T de Cbl-b'/_ no requieren la coestimulacion de CD28 para activacion, los ratones Cbl-b'A son resistentes a la implantation de tumores E.G7, EL4, o B16. Las celulas tumorales E.G7 son celulas EL4 que expresan ovoalbumina de pollo (Ova), una llnea celular de timoma derivada de ratones C57BL/6. Esta llnea celular ha se utilizada como modelo de tumores antigenicos fuertes que expresan un antlgeno especlfico del tumor, ya que Ova de pollo no se expresa en ratones normales. Por contraste con celulas E.G7, las celulas de melanoma EL4 y B16 se derivan directamente de tumores primarios, representando as! tumores que expresan ya sea antlgenos debiles especlficos del tumor o solamente antlgenos propios. Para evitar respuestas alogenicas contra los tumores implantados, se hicieron retrocruzamientos de ratones Cbl-b'/_ con ratones C57BL/6 singenicos para estos tumores durante 12 generaciones. La inoculation de celulas E.G7 (106/ raton) en forma subcutanea en el costado de los ratones C57BL/6 de tipo silvestre da como resultado un rapido crecimiento de tumores solidos, lo que indica que estos ratones no pueden montar una respuesta inmune contra el tumor E.G7 inoculado. Por el contrario, la inoculacion de la misma cantidad de celulas E.G7 en ratones Cbl-b'A da como resultado incidencias mucho menores de tumores. En algunos ratones Cbl-b'/_, crecieron inicialmente tumores, y
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luego retrocedieron uno a dos semanas despues. Ya que las celulas B7 no se expresan en celulas E.G7 (36), este resultado indica, por lo tanto, que la ablacion de Cbl-b puede volver al animal resistente a los tumores antigenicos fuertes inoculadas que no expresan las B7.
Para determinar si los ratones Cbl-b-/- montan respuestas inmunes contra tumores que expresan antlgenos debiles o antlgenos propios, se examino la susceptibilidad de ratones Cbl-b-/- a los tumores EL4 y B16 implantados. Aunque los ratones de control de tipo silvestre desarrollaron tumores despues de la inoculacion con numeros bajos de celulas EL4 (2,5 x104) o Bl6 (1,0 x104)/raton, los ratones Cbl-b-/- que recibieron la misma cantidad de celulas tumorales no desarrollaron ningun tumor durante el mismo perlodo. La inoculacion de altas dosis de celulas EL4 (1,25 x 105) o B16 (1,25 x 105) dio como resultado el crecimiento de tumores tanto en ratones de tipo silvestre como en Cbl-b-/". El deterioro de la capacidad de los ratones Cbl-b-/" para rechazar las altas dosis de celulas tumorales puede reflejar el hecho de que la frecuencia de celulas T especlficas del tumor en el repertorio de celulas T naturales es demasiado bajo para anular el crecimiento rapido de las celulas tumorales. Esta posibilidad puede ser cuantitativamente evaluada por ejemplo mediante el uso de celulas T especlficas de tumor de ratones transgenicos TCR. Por lo tanto los ratones Cbl-b-/" producen respuestas inmunes contra tumores que expresan ya sea antlgenos tumorales fuertes o debiles.
El rechazo de tumores E.G7 implantados es mediado por celulas T
Experimentos previos han demostrado que el rechazo de tumores inmunogenicos es principalmente mediado por celulas T. De forma consistente con este resultado, estudios inmunohistologicos y de citometrla de flujo revelaron que tejidos tumorales E.G7 fueron infiltrados por grandes cantidades de celulas CD8+. Para determinar el papel de las celulas T en el rechazo de tumores E.G7 en ratones Cbl-b'/_, se examino la tasa de crecimiento de tumores E.G7 ratones Cbl-b'/_ con cantidades reducidas de celulas T. La reduccion de las celulas T se logro mediante inyeccion intravenosa repetida de anticuerpos anti-CD8 y anti-CD4 (100 pg/raton/inyeccion). Este tratamiento elimino la mayorla de las celulas T CD4+ y CD8+ tanto del bazo como de los ganglios linfaticos de los ratones tratados. Para determinar si los ratones Cbl-b'/_ con cantidades reducidas de celulas T fueron capaces de montar una respuesta antitumoral eficiente, se inocularon 1x106 celulas E.G7 en ratones Cbl-b'/_ y luego se hizo seguimiento semanalmente al crecimiento de los tumores. En forma contraria a los ratones Cbl-b_/_ no tratados, en los cuales fueron rechazados los tumores, los tres ratones Cbl-b'/_ con cantidades reducidas de celulas T portaban tumores mayores a 20 mm de diametro al final de las 5 semanas despues de la inoculacion. Por lo tanto, las celulas T CD8+ son responsables del rechazo l tumoral en ratones Cbl-b'/_.
Infiltracion masiva de celulas T CD8+ en tejido tumoral E.G7
La masa tumoral a menudo contiene grandes cantidades de infiltrados de celulas T CD8+. Estos infiltrados usualmente no son sensibles a la estimulacion del antlgeno tumoral, a pesar del hecho de que los infiltrados estan enriquecidos por CTL especlficos del tumor. Para determinar si los tejidos tumorales E.G7 contienen celulas T CD8+ infiltradas, se inocularon celulas E.G7 en forma subcutanea en el costado de ratones Cbl-b'/_ y C57BL/6. Las celulas T CD8+ que infiltran el tumor en secciones de tejido tumoral fueron identificadas mediante tincion inmunohistologica usando anticuerpo anti-CD8. En tumores recolectados aproximadamente el dla 20 despues de la inoculacion, se detectan las celulas CD8+ (CD8a+) en muestras tumorales tanto de ratones de tipo silvestre como de Cbl-b'A portadores de tumores, con significativamente mas infiltrados de CD8+en tumores de ratones Cbl-b'A.
Para determinar cuantitativamente si las celulas CD8a+ observadas eran celulas T CD8+, se digirieron tejidos tumorales con colagenasa para generar suspensiones celulares individuales. Se analizaron luego las celulas CD8+ en los tejidos tumorales mediante citometrla de flujo despues de tincion de las celulas con anticuerpos anti-TCRp, CD8a+, CD44 y CD62L. Las celulas CD8+ en tejidos tumorales expresaron la cadena de TCR, lo que indica que eran realmente celulas T CD8+. Ademas, de acuerdo con el analisis inmunohistologico, el tejido tumoral de ratones Cbl-b'A contenla en promedio 10 veces mas celulas T CD8+. Estas celulas T de Cbl-b'A tambien exhibio fenotipos de celulas T activadas, incluyendo un alto nivel de CD44 y un bajo nivel de CD62L. Por el contrario, aunque las celulas T CD8+ de tumores de ratones de tipo silvestre tambien expresaron niveles similares de CD44 y CD62L, expresaron un nivel bajo de TCRp, lo que sugiere que estas celulas T CD8+ de ratones de tipo silvestre son celulas anergicas. En ciertos aspectos, la presente invention establece que existe una expansion extensiva de celulas T CD8+ en tumores de ratones Cbl-b'/_. Las celulas T CD8+ tejidos tumorales pueden ser usadas como fuente de CTL CD8+ especlficos del tumor, que pueden ser usados en terapia de transferencia adoptiva.
La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ purificadas en ratones C57BL/6 portadores de tumores E.G7 dio como resultado la regresion de tumores establecidos.
Las respuestas antitumorales en ratones Cbl-b'/_ son mediadas por celulas T CD8+. La respuesta inmune antitumoral contra celulas tumorales puede ser provocada por transferencia adoptiva de celulas T CD8+. El metodo puede comprender proporcionar y/o aislar celulas T cD8+ purificadas a partir de ratones Cbl-b'/_ o de tipo silvestre, en donde en ciertas realizaciones la purification de celulas T CD8+ puede hacerse mediante clasificacion celular magnetica (MACS), transfiriendo las celulas T CD8+ purificadas (3 x 106 celulas/raton) en ratones C57BL/6
portadores de tumores E.G7 por inyeccion intravenosa, y haciendo seguimiento semanal al crecimiento del tumor. La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de tipo silvestre en los ratones portadores de tumores no afecto el crecimiento del tumor. Por el contrario, 5 de los 6 ratones que recibieron celulas T CD8+ de Cbl-b7- exhibieron regresion tumoral cuatro semanas despues de la transferencia. La invencion establece que las celulas T CD8+ de 5 Cbl-b-/- son suficientes para mediar las respuestas antitumorales. En ciertas realizaciones, las celulas T CD8+ de
Cbl-b-/- incluyen celulas T CD8+ en las cuales la actividad de Cbl-b ha sido reducida por cualquier agente o metodo adecuado conocido en la tecnica, incluyendo pero sin limitarse a desactivacion mediante el uso de ARNpi, ARNhp, transfeccion con una forma negativa dominante de Cbl-b, desactivacion de la copia genomica de Cbl-b, son suficientes para mediar las respuestas antitumorales. Un polipeptido, que se espera que funcione como forma 10 negativa dominante contra Cbl-b, es un polipeptido que contiene unicamente el dominio pTb de Cbl-b, posiciones 1377 en la secuencia de aminoacidos de Cbl-b.
Las celulas T de Cbl-b7- son resistentes a la supresion de TGF-beta
TGF-beta producido por tumores o celulas reguladoras es uno de los mecanismos que puede evitar la vigilancia inmune antitumoral mediada por celulas T. Un informe previo sugirio que las celulas T CD4+ de Cbl-b7- eran 15 resistentes a la supresion mediada por TGF-beta. Para determinar si las celulas T CD8+ de Cbl-b7- responden a la estimulacion antigenica en presencia de TGF-beta, se examinaron in vitro la proliferacion inducida por anti-CD3 y la produccion de IFN-y de las celulas T CD8+ purificadas de tipo silvestre y ratones Cbl-b7- en presencia o en ausencia de TGF-beta. CD8+ de tipo silvestre exhibio una supresion de la proliferacion dependiente de la dosis TGF-beta, como se evidencia mediante una disminucion reducida de la intensidad de CFSE en presencia de TGF-beta, la 20 proliferacion de celulas T CD8+ de Cbl-b7- no se vio afectada, incluso en presencia de las dosis mas altas (5 pg/ml) de TGF-beta. La presencia de TGF-beta (5 pg/ml) no afecto las celulas T CD8+ de Cbl-b7- con respecto a la produccion de IFN-y. Por el contrario, la produccion de IFN-y fue completamente suprimida en celulas de tipo silvestre por la misma concentration de TGF-beta. En ciertos aspectos, la invencion establece que las celulas T CD8+ deficientes en Cbl-b, que incluyen, pero no se limitan a las celulas T CD8+ de Cbl-b7-, responden a los tumores, 25 incluso en el entorno donde esta presente TGF-beta.
Cuantificacion de la capacidad de los CTL de Cbl-b7' para montar respuestas eficientes contra diversos tumores
Las celulas tumorales pueden escapar de la vigilancia inmune por diversos mecanismos, incluyendo antigenicidad debil, la falta de senales coestimuladoras, y la prevention de respuestas de celulas T por TGF-beta, celulas T reguladoras, y barrera del tumor. Los ratones Cbl-b7- rechazan de manera eficiente al tumor antigenico fuerte (E.G7). 30 Las celulas T CD8+ de Cbl-b7- son responsable del rechazo del tumor. En otra aspectos, la invencion establece que los tumores antigenicos debiles tales como EL4 y B16 son rechazan unicamente cuando estos tumores se inoculan a bajas dosis, sugiriendo que, o bien la activation de celulas T especlficas del tumor por estos tumores es menos eficiente o que existe una frecuencia baja de celulas T CD8+ especlficos del tumor. Ya que las celulas T CD8+ de Cbl-b7- son sin embargo activadas por estos tumores, la transferencia adoptiva de un gran numero de celulas T 35 CD8+ de Cbl-b7- especlficas del tumor pueden aumentar significativamente las respuestas inmunes contra estos tumores.
En ciertos aspectos, la invencion proporciona metodos para determinar cuantitativamente la eficiencia de celulas T CD8+ de Cbl-b7- especlficas del antlgeno tumoral en la eradication de los tumores antigenicos fuertes y debiles utilizando celulas T CD8+ de Cbl-b7- transgenicas del TCR. Para explorar si las celulas T CD8+ de Cbl-b7- pueden 40 responder a los tumor bajo diversas condiciones de supresion, la determination puede incluir si las celulas T CD8+ de Cbl-b7- pueden eliminar tumores que pueden impedir que las n celulas T respondan a traves de la secretion de TGF-beta, reclutamiento de celulas NKT, o barrera del tumor usando diversos modelos tumorales. Los resultados de estos estudios proveen no solamente una medicion cuantitativa acerca de la eficiencia de los CTL de Cbl-b7- especlfico del tumor contra tumores antigenicos fuertes o debiles, sino que tambien demuestra que las celulas T 45 cD8+ de Cbl-b7- pueden ser usadas para tratar tumores con otra regulation negativa contra respuestas inmunes.
Modelos de tumores y ratones transgenicos TCR de CD8+
Las celulas tumorales pueden expresar antlgenos "foraneos", tales como componentes virales o protelnas propias mutadas que no existen en individuos sanos. La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ que reconocen estos antlgenos puede provocar respuestas inmunes especlficamente contra las celulas tumorales. Sin embargo, en 50 muchos casos, las celulas tumorales expresan unicamente antlgenos propios no mutados nativos (1). Las celulas T que reconocen estos antlgenos son usualmente anergicas, y las respuestas inmunes contra estos antlgenos, si son provocadas, tambien podrlan danar los tejidos normales. Los modelos de ratones transgenicos (Tg) TCR de tumores que expresan ya sea un antlgeno tumoral nativo o uno "foraneo" pueden ser usados para recapitular las situaciones de los tumores que portan ya sea un antlgeno "foraneo" especlfico del tumor o un antlgeno "propio" no mutado. Una 55 ventaja de utilizar de celulas T transgenicas TCR para este estudio, es que la cantidad de celulas T especlficas del antlgeno tumoral puede ser facilmente determinada con base en la expresion del TCR transgenico.
Tumor antigenico fuerte y ratones Tg TCR OT1
Los tumores E.G7 (MHC H-2b) son timomas de EL4 que expresan un transgen, ovoalbumina de pollo (OVA). En ratones C57BL/6 ratones (H-2b), se pueden utilizar celulas E.G7 como un modelo de tumor que expresa un antlgeno- Ova "foraneo". Las celulas T CD8+ especlficas de OVA pueden ser obtenidas de ratones Tg TCR OT1 (H-2b), que especlficamente reconocen un peptido Ova en el contexto de H-2Kb. Bajo circunstancias normales, los ratones 5 OTlno inmunizados no rechazan tumores E.G7 inoculados, y la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ OT1 no modificadas no pueden erradicar tumores E.G7 establecidos, lo que sugiere que las celulas T CD8+ OT1 que responde contra celulas E.G7 son suprimidas. Sin embargo, las celulas tumorales E.G7 que expresan un transgen B7 pueden ser eficientemente rechazados por ratones Tg OT1 incluso en ausencia inmunizacion con Ova, lo que sugiere que las senales coestimuladoras son crlticas para el cebado y la funcion efectora de las celulas T Tg OT1. 10 Los ratones Tg OT1 Cbl-b-/" (en un ambiente de C57BL/6) pueden ser usados para elucidar la eficiencia de las celulas T CD8+ de Cbl-b-/" especlficas del tumor en la erradicacion de los tumores E.G7 establecidos.
Melanoma B16 y ratones Tg TCR Pmel-1
El melanoma B16 es un modelo de tumor inmunogenico debil. B16 expresa un antlgeno propio nativo, el antlgeno de diferenciacion de melanocitos gp100. La inoculacion subcutanea de B16 en ratones C57BL/6 resulta en el 15 crecimiento de tumores solidos. Las celulas T CD8+ contra el tumor B16 pueden ser obtenidas de ratones Tg TCR Pmel-1 que expresan un TCR que reconoce al antlgeno gp100, en el contexto de complejos de H-2Db. Se ha encontrado que, en ausencia de inmunizacion, los ratones PmeI-1 no rechazan al melanoma B16 inoculado debido a la tolerancia de las celulas T por el antlgeno propio gp100. Sin embargo, una se puede inducir una respuesta robusta de rechazo tumoral ya sea por la expresion forzada de B7 en las celulas tumorales, o despues de 20 vacunacion con una variante del peptido gp100 y la administracion de una alta dosis de IL-2. Se generaron ratones Tg PmeI-1 Cbl-b'/_ mediante reproduccion.
Las celulas T CD8+ especlficas del tumor de Cbl-b'/_ transferidas adoptivamente pueden erradicar la carga tumoral establecida en ratones huesped
El desarrollo de Ova y celulas T CD8+ especlficas de gp100 en ratones OT1 Cbl-b'A y PmeI-1 Cbl-b'/_ puede ser 25 examinado por citometrla de flujo. Las celulas T de ratones Tg Pmel-1 y OT1 de tipo silvestre pueden ser utilizadas como controles. Las celulas T CD8+ transgenico TCR de PmeI-1 de oT 1 pueden ser identificadas por tincion de las celulas con una combinacion de anticuerpos anti-CD8 y anti-TCR VI38 y Va2 o anti-TCR Vp13 y Va1, respectivamente. El desarrollo de celulas T CD8+ no debe ser alterado en ratones Tg TCR Cbl-b'/_, debido a que la dosis de la mutacion Cbl-b'/_ no tiene ningun impacto medible en el desarrollo de celulas T CD4+ y CD8+ (55, 56).
30 En ciertas realizaciones, se puede determinar si la activacion de las celulas T CD8+ Cbl-b'/_ Tg PmeI-1 Cbl-b'A y OT1 requieren coestimulacion de CD28. Las celulas T CD8+ pueden ser purificadas a partir del bazo y los ganglios linfaticos de ratones PmeI-1 Cbl-b'A y OT1 Cbl-b'/_ usando una columna MACS de acuerdo con el protocolo de purificacion de celulas T CD8+ (Miltenyi Biotec). Las tasas de proliferacion celular y los niveles de citoquinas producidas por las celulas T CD8+ activadas, tales como IL-2 e IFN-y, pueden ser determinados respectivamente, 35 por la incorporacion de 3H-timidina, citometrla de flujo, y ELISA despues de estimulacion de celulas con anticuerpos anti-CD3 o anti-CD3 y anti-CD28. Celulas T CD8+ Tg TCR de Cbl-b_/_ proliferan vigorosamente y producen grandes cantidades de citoquinas, incluyendo IL-2 e IFN-y, en respuesta a la estimulacion de anticuerpos anti-CD3 unicamente. Por el contrario, una fuerte activacion de celulas T CD8+ Tg de Pm-1 y OT1 de tipo silvestre depende estrictamente de la coestimulacion de CD28. Para determinar si celulas T CD8+ especlficas de gp100 y Ova de Cbl- 40 b'/- son resistentes a la supresion TGF-beta, se puede medir la proliferacion y la production de IFN-gamma en las
celulas T CD8+ Tg TCR de Cbl-b'/_ purificadas por marcacion con CFSE y tincion intracelular, despues de que las celulas se activan con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de diversas concentraciones de TGF-beta. Las celulas T CD8+ Tg TCR de Cbl-b_/_ deben exhibir una resistencia similar a la supresion de TGF-beta como celulas T CD8+ de Cbl-b-/- transgenicas no TCR.
45 Las celulas T CD8+ de ratones Tg TCR Cbl-b'A se comportan en forma similar a las celulas T de Cbl-b'/_ Tg no TCR. Los ratones Cbl-b'A Tg TCT rechazan los tumores inoculados mas eficientemente que los ratones Cbl-b'A transgenicos no TCR. Esto se puede determinar por inyeccion subcutanea de diversas cantidades de celulas E.G7 o B16 (1 x104-106)/raton en ratones Tg PmeI-1 Cbl-b'/_ o OT1 Cbl-b'/_, respectivamente. El crecimiento de los tumores inyectados puede ser supervisado como se describe en la presente memoria. Se usaran ratones Tg Pm-1 o OT1 de 50 tipo silvestre, C57BL/6, como controles. Tambien se puede determinar si las celulas T CD8+ estan implicadas en el rechazo de tumores mediante el examen de la frecuencia y el estado de activacion de las celulas T CD8+ que infiltran el tumor en los tejidos tumorales que hacen regresion mediante inmunohistologla y citometrla de flujo.
Para determinar cuantitativamente la eficiencia de celulas T CD8+ TCR de Cbl-b'/_ en la erradicacion de tumores establecidos, se pueden transferir en forma intravenosa celulas T CD8+ Tg TCR PM-1 OT1 Cbl-b'/_ en los 55 correspondientes ratones portadores de tumores y se puede hacer seguimiento a la cinetica de regresion de los tumores establecidos. Para establecer los modelos de raton portadores de tumores, se pueden inocular en forma subcutanea ratones C57BL/6 de tipo silvestre (n = 5-10 ratones/grupo) con 1-3x106 celulas tumorales E.G7 o B16. El crecimiento de los tumores puede ser seguido de cerca hasta que el tamano de los tumores alcanza 5 x 5 mm2 de
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diametro. Para examinar la eficiencia de las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- especlficas del tumor en las respuestas antitumorales, se pueden transferir diversas cantidades (en el intervalo desde aproximadamente 1x103 hasta aproximadamente 1o7) de celulas T CD8+ de ratones Tg Pmel-1 Cbl-b-/- o OT1 Cbl-b-/- en los ratones portadores de tumores. Las celulas T CD8+ de ratones Tg Pmel-1 o OT1 Cbl-b-/-, de tipo silvestre, seran utilizados respectivamente como controles. Las celulas T CD8+ pueden ser purificadas por MACS (Miltenyi Biotec). Despues de transferencia adoptiva de celulas T CD8+, se puede medir el tamano del tumor con un micro calibrador semanalmente se pueden documentar las tasas de crecimiento de los tumores como se describio. Los ratones pueden ser sacrificados una vez que los tumores alcanzan un tamano de 20 x 20 mm2 o superior.
El rechazo efectivo de tumores por celulas T CD8+ de Cbl-b-/- podrla ser el resultado de un cebado mas eficiente o una funcion efectora mejorada, o ambos. Este es un aspecto importante en la elucidation de como las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- rechazan n celulas tumorales, ya que esto puede determinar que tipo de celulas pueden estar en terapia cllnica contra el cancer. Para determinar si las celulas T CD8+ especlficas del tumor son mas eficientemente activadas por tumores in vivo, se puede hacer seguimiento in vivo mediante cebado y activation de celulas T CD8+ de Cbl-b-/- en ratones portadores de tumores mediante un enfoque de marcacion por CFSE (67). En ciertas realizaciones, se pueden marcar celulas T CD8+ Tg TCR de Cbl-b-/- purificadas sin modificar (1x106) con CFSE in vitro y transferidas en los correspondientes ratones Rag2-/- portadores de tumores mediante inyeccion intravenosa. Los ratones Rag2-/- pueden ser adecuados como receptores de tumores, ya que no tienen linfocitos, ya que las celulas T del donante pueden ser facilmente identificadas. Adicionalmente, usando de ratones Rag2-/- como receptores se puede excluir el efecto de cualquier ayuda de las celulas T CD4 + ya que los ratones Rag2'r no tienen celulas T CD4+. Para determinar la activacion y proliferation de las celulas T cD8+ transferidas, se puede preparar una suspension individual de celulas de tejidos tumorales mediante digestion con colagenasa y se puede examinarse la intensidad de CFSE (un parametro para la division celular) en celulas T CD8+ del donante por citometrla de flujo. El estado de activacion de las celulas T CD8+ infiltradas puede ser determinado con base en los marcadores de activacion de la superficie celular tal como CD69, CD44, CD25 y CD62L por citometrla de flujo. El aumento en la division celular, as! como la cantidad total de celulas que expresan los marcadores de activacion de celulas T CD8+ de Cbl-b-/- comparado con los cantidades medidas en celulas de tipo silvestre puede indicar que mutation Cbl-b-/- mejora el cebado de las celulas T CD8+ por las celulas tumorales.
La mutacion Cbl-b-/- aumenta la funcion efectora de los CTL. En ciertos casos, la transferencia adoptiva de las mismas cantidades de celulas T CD8+ Tg TCR de Cbl-b-/- activadas in vitro puede conducir a una erradicacion mas eficiente de los tumores establecidos comparado con la erradicacion de los tumores por las celulas T CD8+ Tg TCR activadas de tipo silvestre. Las celulas T CD8+ activadas in vitro pueden ser obtenidas mediante estimulacion de celulas CD8+ Pmel-1 o OT1 y de tipo silvestre y de Cbl-b-/- purificadas, ya sea con anticuerpo anti-CD3 unido a la placa o las APC mas Ova o el peptido gp100 (100 pM) en presencia de IL-2. Adicionalmente, para medir directamente si las celulas T CD8+ de Cbl-b'7- efectoras son asesinas mas potentes que las celulas T CD8+ de tipo silvestre, se puede comparar la citotoxicidad de celulas T CD8+ Tg de Pmel-1 y OT-1 Cbl-b-/- con aquella de las celulas CD8+ Tg TCR de tipo silvestre correspondientes a las celulas tumorales como objetivos utilizando un ensayo de citotoxicidad in vitro.
Para determinar si las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- proporcionan una protection a largo plazo, y montar una memoria eficiente de respuesta contra los tumores, se puede hacer seguimiento a la recurrencia de tumores en ratones Cbl-b- /- inoculadas con tumor E.G7 y B16 durante un perlodo de tiempo extendido, por ejemplo, pero sin limitarse a mas de 1,5 anos. En ciertas realizaciones, la presencia de celulas T CD8+ de memoria CD8+ especlficas del tumor en ratones Cbl-b-/- con regresion tumoral, puede ser determinadas retando a los ratones con el mismo tumor y luego comparando la cinetica de crecimiento del tumor. La frecuencia de las celulas T de memoria CD8+ especlficas del tumor en ratones con regresion tumoral puede ser determinada mediante un ensayo de citotoxicidad in vitro usando las correspondientes celulas tumorales como objetivos.
Una vacunacion combinada y administration de IL-2 se ha demostrado que mejora la erradicacion del tumor B16 por ratones Tg TCR PmeI-1 despues de la vacunacion con el peptido pmel-17 (34). Para determinar el efecto de este procedimiento para el rechazo del tumor mediado por celulas T CD8+ Tg de PmeI-1 Cbl-b-/-, se pueden vacunar ratones portadores del tumor B16 y tratarlos con IL-2 (100.000 U/raton, de N.P. Restifo) despues de la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ Tg de Pmel-1 de tipo silvestre y Tg de PmeI-1 Cbl-b-/-, y se puede hacer seguimiento a la regresion del tumor. El resultado de este experimento puede demostrar que un tratamiento combinado de vacuna, IL-2, y Los CTL especlficos del tumor de Cbl-b-/- tienen un efecto aditivo en el rechazo del tumor.
Los ratones Cbl-b-/- montan una respuesta eficiente contra: un tumor antigenico resistente implantado (E.G7), y bajas dosis de tumores antigenicos debiles (EL4 y B16). La transferencia adoptiva celulas T CD8+ de Cbl-b-/- purificadas y/o aisladas es suficiente para erradicar tumores establecidos, por ejemplo un tumor E.G7 establecido. En otros aspectos, las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- son asesinas tumorales potentes. La eficiencia de la erradicacion de tumores puede ser mejorada con proporciones mayores de celulas T CD8+ especlficas del tumor frente a las celulas tumorales objetivo. En ciertos casos, los ratones CD8+ Tg Pmel-1 o OT1 Cbl-b-/- producen respuestas antitumoral mas fuertes debido a que estos ratones poseen significativamente mas celulas T CD8+ especlficas de tumores que los ratones Tg no TCR Cbl-b-/-. Las celulas T CD8+ de Cbl-b-/- son responsables por provocar una respuesta
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antitumoral, y la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ Tg de Pmel-1 Cbl-b'/_ o Tg de OT-1 Cbl-b'/_ en los correspondientes ratones portadores de tumores pueden erradicar eficientemente los tumores establecidos. Se puede determinar el tamano maximo y la cinetica de regresion de la carga tumoral que puede ser erradicada por las celulas T CD8+ Tg de Pmel-1 Cbl-b-/- o Tg de OT-1 Cbl-b-/" adoptivamente transferidos. En otras realizaciones, se pueden determinar las cantidades mlnimas de celulas T CD8+ especlficas del antlgeno adoptivamente transferidas requeridas para la regresion del tumor. Ademas, se puede determinar si el mayor numero de celulas T CD8+ conduce a una regresion mas rapida de la carga tumoral.
Es posible que el rechazo del tumor B16 de baja dosis en ratones Cbl-b'/_ este mediado por celulas T CD8+ que reconocen otro antlgeno tumoral de alta afinidad diferente de gp100 que exhibe una baja afinidad con el TCR de PmeI-1. En ciertas realizaciones, la transferencia adoptiva de las celulas T CD8+ de PmeI-1 Cbl-b'/_ purificadas en ratones portadores del tumor B16 no pueden provocar una respuesta antitumoral fuerte. En este caso, ratones portadores del tumor B16 que reciben, ya sea celulas T CD8+ de PmeI-1 Cbl-b'/_ o de tipo silvestre pueden ser inmunizados con una vacuna que codifica una variante de gp100 en ausencia o presencia de una alta dosis de IL-2. Esta variante de gp100 proporciona un epltopo de mayor afinidad en el contexto de MHC H-2b con el TCR de Pmel- 1, proporcionando as! una mejor oportunidad para activar celulas T de PmeI-1. Si la mutacion Cbl-b'A entrega a las celulas T CD8+ una ventaja de la activacion por las celulas tumorales sobre las celulas T de tipo silvestre, los ratones que reciben celulas T de Cbl-b'/_ pueden rechazar al tumor B16 en forma mas eficientemente, incluso en ausencia de la administracion de IL-2, que los ratones que recibieron las celulas de tipo silvestre.
En ciertos aspectos, la invencion proporciona metodos para evaluar cuantitativamente la eficiencia de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ en la erradicacion tanto de tumores antigenicos debiles como fuertes. La contribucion a las respuestas antitumorales de las celulas T CD4+ de tipo silvestre y las celulas dendrlticas de los ratones receptores, no puede ser excluida. Para evaluar el papel de las celulas T cD4+ y las celulas dendrlticas en el rechazo tumoral mediado por celulas T CD8+ de Cbl-b'/_, se pueden cotransferir diversas cantidades de celulas T CD4+ Cbl-b'/_ o de tipo silvestre con celulas T CD8+ Tg TCR de en ratones Rag2'/_, portadores de tumores y se puede por lo tanto hacer seguimiento al crecimiento de los tumores. Para evaluar el papel de las celulas dendrlticas, se pueden usar ratones con desactivacion genica de celulas dendrlticas condicionales (CD11c-DTR) como huespedes portadores de tumores. Se pueden eliminar las celulas dendrlticas en estos ratones mediante inyeccion de la toxina de la difteria (DT) justo antes de la transferencia adoptiva de celulas T CD8+. Si las celulas dendrlticas de Cbl-b'/_ o CD4+ de Cbl- b'/_ contribuyen a la respuesta antitumoral, ciertas realizaciones de los metodos para provocar una respuesta inmune antitumoral pueden incluir celulas dendrlticas en la transferencia adoptiva terapeutica.
Consecuencia autoinmune: La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ podrla imponer una consecuencia autoinmune al huesped. Se puede reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune severa mediante la escogencia cuidadosa del antlgeno objetivo, o mediante transferencia de celulas T monoclonales u oligoclonales que reconocen especlficamente antlgenos tumorales. Por ejemplo, las celulas T CD8+ de PmeI-1 reconocen al complejo peptido gap100-H-2Db que tambien es expresado por los melanocitos normales de los huespedes. La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ de ratones Pmel-1 puede dar como resultado la autoinmunidad contra melanocitos de huespedes normales, conduciendo al vitiligo de los melanocitos en los ratones receptores, lo que es poco probable que sea peligroso para la vida. Para evaluar la consecuencia autoinmune de la transferencia adoptiva de las celulas T CD8+ de Pmel-1, se pueden determinar la correlation entre el grado de vitiligo y la eficiencia de la erradicacion del tumor mediante el seguimiento simultaneo de la despigmentacion de los ratones receptores y la regresion tumoral.
Los CTL de Cbl-b'/_ pueden erradicar tumores que previenen la respuesta de las celulas T a traves de TGF-beta o la barrera del tumor
En ciertos aspectos, la invencion establece que las celulas T CD8+ Cbl-b'/_ montan respuestas inmunes eficientes contra tumores que carecen de senales coestimuladoras. Ya que las celulas tumorales tambien pueden prevenir la respuestas inmunes a traves de otros mecanismos, tal como la supresion por TGF-beta o la prevention de la infiltration de celulas T por barreras del tumor, se puede determinar si las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ pueden superar estos mecanismos de regulation negativos en la vigilancia del tumor.
La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ puede erradicar tumores que producen un alto nivel de TGF- beta
TGF-beta es una citoquina potente que suprime las respuestas de las celulas T. Se ha reportado de que las celulas tumorales pueden escapar a la vigilancia inmunologica mediante la secretion de TGF-beta directamente o reclutando para el ambiente tumoral celulas inmunes que producen TGF-beta tal como las celulas T reguladoras CD4+ CD25+. Las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ son resistentes a la supresion mediada por TGF-beta. Las celulas T de Cbl-b'A pueden erradicar tumores en presencia de un alto nivel de TGF-beta.
Para determinar si las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ montan una respuesta inmune contra los tumores en el ambiente de TGF-beta tal como el tumor que produce TGF-beta o la presencia de celulas T reguladoras CD4+ CD25+, se pueden
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utilizar celulas TRAMP-C2 como modelo. TRAMP-C2 es una ilnea celular de cancer de prostata de murino de pase temprano derivada de ratones TRAMP que espontaneamente desarrollan cancer de prostata debido a la expresion del antlgeno T grande del virus 40 de simio (SV) especlfico de la prostata. Las celulas TRAMP-C2 producen espontaneamente un tltulo elevado de TGF-beta, tanto en un cultivo in vitro como en ratones trasplantados. Cuando se trasplantan en ratones C57BL/6 mediante inyeccion intravenosa, 21 dlas despues del trasplante los ratones desarrollan cancer metastasico pulmonar microscopico y macroscopico multiple, lo que conduce eventualmente a la muerte. Las celulas TRAMP-C2 son resistentes a las celulas T CD8+ activadas especlficas del tumor en un experimento de transferencia adoptiva; sin embargo, pueden ser eliminadas por celulas T CD8+ especlficas del tumor que expresan una forma negativa dominante del receptor TGF-beta tipo II, lo que indica que las celulas T rechazan al tumor TRAMP-C2 cuando se altera la senalizacion de TGF-beta.
Para determinar si celulas T CD8+ de Cbl-b'/' pueden responder a y erradicar el tumor que produce TGF-beta, se pueden generar celulas T CD8+ de Cbl-b'/' especlficas de TRAMPC2-. La transferencia adoptiva de estas celulas T CD8+ en ratones portadores de TRAMP-C2 puede determinar si estas celulas T CD8+ de Cbl-b'/' especlficas de TRAMP-C2 pueden controlar la metastasis del pulmon de cancer TRAMP-C2. En resumen, para generar celulas T CD8+ especlficas de TRAMP-C2, se pueden inmunizar ratones C57BL/6 de tipo silvestre, siendo ambos CD45.2+ con celulas TRAMP-C2 irradiadas (5 x 106/ raton) mediante inyeccion subcutanea cada 14 dlas para cinco inmunizaciones totales. Aproximadamente dos semanas despues, se pueden purificar las celulas T CD8+ del bazo de ratones inmunizados y se estimulan con las APC, que son celulas esplenicas de raton irradiadas, cargadas con lisados de TRAMP-C2 (1 x 106 celulas/ml). Celulas pueden ser cultivadas en presencia de IL-2 (50 U/ml) y anticuerpo anti-CD3 (30 ng/ml), y se puede cambiar el medio de cultivo cada 3 dlas. Las celulas CD8+ pueden ser expandidas durante 10 dlas antes de otra ronda de estimulacion. Los tltulos de CD8+ especlficos del antlgeno en el cultivo final se pueden determinar por un ensayo de citotoxicidad in vitro utilizando celulas TRAMP-C2 como objetivo. Para evaluar si las celulas T CD8+ activadas especlficas de TRAMP-C2 pueden erradicar las celulas las trasplantadas de TRAMP-C2, se pueden retar ratones SJL (CD45.1+) mediante administracion intravenosa con 5 x 105 celulas de TRAMP-C2. Aproximadamente veinte dlas despues, se pueden transferir adoptivamente diversas cantidades (1-10 x 105) de celulas T CD8+ de tipo silvestre o de Cbl-b'/' especlficas TRAMP-C2 en los ratones portadores de tumores. Cuarenta dlas despues de la transferencia de celulas T CD8+, se pueden sacrificar los ratones y se pueden recolectar los pulmones de estos ratones para un examen histologico y macroscopico. La infiltracion de celulas T CD8+ derivadas del donante (CD45.2+), as! como celulas inmunes de otros receptores (CD45.1+), se pueden identificar mediante analisis inmunohistologico y cuantificar mediante citometrla de flujo. La apoptosis de celulas tumorales se puede determinar por ejemplo mediante el ensayo TUNEL.
Se ha demostrado que la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ insensibles a TGF-beta impide la metastasis pulmonar del cancer de TRAMP-C2. La prevencion del crecimiento del tumor TRAMP-2C es el resultado de la activacion de celulas T CD8+ insensible a TGF-beta que erradican celulas de TRAMP-C2 por apoptosis. Las celulas T CD8+ de Cbl-b'/' son resistentes a la supresion de TGF-beta. En ciertos aspectos, la invencion establece que la transferencia adoptiva de las celulas T CD8+ de Cbl-b'/' especlficas de TRAMP-C2 pueden prevenir la metastasis del cancer TRAMP-C2 en ratones portadores del tumor. El analisis de citometrla de flujo e inmunohistologico puede revelar la infiltracion masiva de celulas T CD8+ de Cbl-b'/', as! como la apoptosis de celulas de TRAMP-C2 en el pulmon. Por el contrario, la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de tipo silvestre no puede afectar el avance del tumor TRAMP-2C. En ciertas realizaciones, la invencion proporciona metodos para determinar si las celulas T CD8+ transferidas de Cbl-b'/', proporcionan proteccion a largo plazo. La recurrencia del tumor TRAMP-2C puede ser controlada en ratones con regresion del tumor durante el resto de su vida.
Es posible que el esquema de inmunizacion para generar los CTL especlficos de TRAMP-C2 puedan producir celulas T CD8+ de Cbl-b'/', con un amplio espectro de especificidad contra antlgenos propios. Como consecuencia, la transferencia adoptiva de estos celulas T CD8+ pueden causar una grave enfermedad autoinmune. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un protocolo modificado para generar celulas T CD8+ de Cbl-b'/' que reconocen solamente antlgeno especlfico de TRAMP-C2, o antlgeno T grande de SV40. Las celulas T CD8 esplenicas de ratones Cbl-b'/' inmunizados con TRAMP-C2 se estimulan y expanden in vitro con las APC cargadas con los peptidos T grande de SV40 o protelna, en vez de los lisados celulares de TRAMP-C2. Este enfoque puede generar una poblacion de CTL CD8+ que reconoce al antlgeno T grande de SV40 en el contexto de MHC H-215. Para garantizar que las celulas T CD8+ obtenidas sean especlficos para las celulas de TRAMP-2C, se puede examinar la citotoxicidad in vitro de estas celulas contra TRAMP-2C y otras celulas objetivo H-2b que no expresan antlgeno T grande de SV40. La muerte especlfica de celulas de TRAMP-2C, pero no de las celulas de control sugiere que los CTL obtenidos son predominantemente especlficas para el antlgeno T grande de SV40 en el contexto de MHC H-2b.
Si los tumores TRAMP-2C no son rechazados por las celulas T CD8+ transferidas de Cbl-b'/', existen dos posibles explicaciones que deben ser consideradas antes de la conclusion de que celulas T CD8+ de Cbl-b'/' no pueden superar la supresion por TGF-beta derivado del tumor. En primer lugar, se puede determinar si el rechazo tumoral fallido es debido a que se utilizan cantidades insuficientes de celulas T CD8+ especlficas del tumor en el experimento de transferencia. En ciertas realizaciones, se pueden transferir hasta 10 veces mas (1-5 x 107) celulas T cD8+ en los ratones portadores de tumores y luego se puede hacer seguimiento a la regresion tumoral. En trabajos previos que muestran que las celulas de TRAMP-2C son rechazadas por celulas T CD8+ insensibles a TGF-beta, las celulas T
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CD8+ insensibles a TGF-beta utilizadas en el experimento son CTL especlficos TRAMP-2C que sobreexpresan una forma negativa dominante del receptor TGF-beta II. Es posible que esta forma negativa dominante de receptor de TGF-beta II pueda ejercer otros efectos desconocidos sobre las celulas T CD8+ en ademas de la insensibilidad a TGF-beta. Para determinar que, este mutante del receptor de TGF-beta pueda ser sobreexpresado en celulas T CD8+ de Cbl-b-/" especlficas de TRAMP-2C, y estas celulas puedan ser examinadas para determinar si ellas pueden rechazar al tumor TRAMP-2C. El rechazo del tumor TRAMP-2C por estos transfectantes es indicativo de que otras alteraciones causadas por la expresion del receptor de TGF-beta, quizas junto con la insensibilidad de TGF-beta, son responsables por la prevencion de la metastasis de TRAMP-2C.
Las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ pueden erradicar tumores protegidos por la barrera del tumor
Los modelos murinos han demostrado que los CTL especlficos de antlgeno tumoral, activados, abundantes, a menudo no logran erradicar grandes tumores solidos, incluso cuando pueden rechazar de manera eficiente injerto de piel o tumores menos establecidos que expresan los mismos antlgenos. Cllnicamente, se ha documentado que la presencia de un alto numero de celulas T CD8+ circulantes especlficas de tumores no se correlaciona con la infiltracion de celulas T en el parenquima de los tumores y la regresion del tumor. Los estudios indican que las barreras del tumor compuestas de estroma infiltrante del huesped pueden ser una de las razones que impide el cebado y expansion eficiente de celulas T tanto en los tejidos linfoides como en los sitios tumorales. La evidencia para apoyar esta idea se deriva del experimento en el que el reclutamiento de celulas T D8+ en los tejidos tumorales por expresion forzada de LIGHT/ TNFSF-14, un miembro de la familia TNF que inducen expresion de quimoquinas tal como CCL21 en la barrera estromal, da como resultado el rechazo del tumor. En ciertos aspectos, la invention establece que celulas T CD8+ de Cbl-b'A rechazan los tumores E.G7 establecidos. En otros aspectos, la invencion establece que las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ pueden rechazar los tumores que estan protegidos por la barrera del tumor. Esto da una idea de los mecanismos por los cuales las celulas T CD8+ de Cbl-b'A montan respuestas antitumorales y muestra que celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ se pueden usar para tratar grandes tumores establecidos.
El fibrosarcoma Ag104 que expresa H-2Ld murino (Ag104Ld) es altamente tumorigenico, con un 100% de excrecencia en ratones C3H xC57BL/6 F1 (C3B6F1) despues de la inyeccion subcutanea de 104 celulas. Los ratones portadores de tumores por lo general mueren en 3-4 semanas despues de la inoculation. La transferencia de celulas T CD8+ Tg TCR 2C que reconocen H-2Ld no puede rechazar un tumor Ag104Ld debido a la falta de infiltracion de celulas T a traves de la barrera del tumor. Para determinar si las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ puede eludir la berrara del tumor Ag104Ld, los ratones Cbl-b'A pueden ser cruzados con los ratones Tg TCR 2C para generar ratones Tg TCR 2C Cbl-b'A. Las celulas T CD8+ pueden purificarse a partir ratones Tg TCR 2C Cbl-b'/_ y Tg TCR 2C de tipo silvestre, respectivamente, y estas celulas pueden ser transferidas a ratones portadores del tumor Ag104Ld mediante inyeccion intravenosa, y hacer seguimiento a la regresion del tumor. Los ratones portadores del tumor Ag104Ld con parenquima tumoral se puede obtener mediante inoculacion subcutanea de 104 celulas de Ag104Ld en ratones C3B6F1 una semana antes de la transferencia de celulas T. Para examinar directamente si las celulas T CD8+ de Cbl-b'A puede infiltrarse y expandirse en el interior del tejido tumoral, se pueden marcar las celulas T CD8+ purificadas mediante CFSE, transferir las celulas marcadas a ratones portadores de tumores Ag104Ld mediante inyeccion intravenosa, y se sacrifican luego los ratones receptores en diferentes puntos de tiempo (12, 24, 48, y 72 horas mas tarde) despues de la transferencia. La infiltracion de celulas T en los tejidos tumorales se puede cuantificar por histologla y citometrla de flujo. El estado de activation de las celulas infiltradas se puede determinar por citometrla de flujo con base en la expresion de los marcadores de activacion de la superficie de la celula, tales como CD44 y CD62L. Para determinar si el estado de activacion de las celulas T se correlaciona con la eficiencia de la infiltracion, se activaran las celulas T CD8+ purificadas in vitro mediante anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 y se cultivaron durante 2-3 dlas en presencia de iL-2 (50 U/ml) antes de ser sometidas a marcacion con CFSE y la transferencia. La apoptosis de las celulas Ag104Ld en tejido tumoral sera determinada por un ensayo TUNEL. Para el control de la especificidad de la infiltracion de celulas T CD8+, se puede examinar la infiltracion de las celulas T CD8+ transferidas en otro tejido, incluyendo tejido de pulmon, rinon e hlgado por analisis inmunohistologico.
Los tumores Ag104Ld estan protegidos del sistema inmune por la barrera del tumor. Si la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ Tg TCR 2C de Cbl-b'/_ erradica el tumor Ag104Ld establecido, esto indica que celulas T CD8+ de Cbl- b'/_ puede eludir la barrera del tumor para provocar la respuesta antitumoral. En ciertas realizaciones, las celulas T CD8+ Tg TCR 2C de Cbl-b'/_ marcadas con CFSE se infiltran y expanden en el tejido tumoral, en donde las celulas T CD8+ estan presentes en niveles mlnimos y no se expanden en el pulmon, el rinon y el hlgado, y las celulas T CD8+ Tg TCR 2C de tipo silvestre estan excluidas del tejido tumoral. El analisis TUNEL puede revelar la apoptosis de celulas Ag104Ld en el tejido tumoral de los ratones que reciben las celulas T CD8+ de Cbl-b'A, pero no en ratones que reciben celulas T CD8+ de tipo silvestre.
Es posible que celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ no puedan rechazar al tumor Ag104Ld establecido. Esto puede ser el resultado o bien del fracaso de penetrar la barrera del tumor o la incapacidad de reaccionar a la estimulacion del tumor. La primera posibilidad puede ser verificada mediante la supervision directa de la infiltracion de celulas T CD8+ marcadas con CFSE en el tejido tumoral despues de la transferencia. Para examinar la segunda posibilidad, se puede analizar el estado de activacion y proliferation de celulas CD8+ que infiltran el tumor por citometrla de flujo. Para evaluar si las celulas T CD8+ infiltrantes son funcionalmente competentes, se pueden aislar las celulas T CD8+
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que infiltran el tumor mediante clasificacion por FACS y despues se analiza la citotoxicidad contra las celulas Ag104Ld mediante un ensayo de citotoxicidad in vitro.
En realizaciones en las que las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ pueden penetrar la barrera del tumor, la invencion proporciona metodos para determinar los mecanismos que permiten que las celulas T Cbl-b-/- puedan eludir la barrera. Dado que la migracion de las celulas T a traves del parenquima del tumor esta regulada por quimoquinas y moleculas de adhesion celular, se puede determinar si la mutacion Cbl-b-/- altera la quimiotaxis y adhesion de las celulas T CD8+.
La ablacion de Cbl-b en los CTL que infiltran el tumor restaura su actividad asesina contra los tumores objetivo
La carga tumoral a menudo contiene un gran numero de infiltrados de CTL. Estos CTL reconocen un amplio espectro de epltopos asociados a tumores. En condiciones normales, estos CTL infiltrantes existen en un estado anergico funcional, ya que estos raramente dan como resultado la erradicacion del tumor. La evidencia sugiere que la falta de senales de coestimulacion de las celula tumorales atenua o incluso anergiza la funcion efectora de los CTL. Las celulas T de Cbl-b-/" son resistentes a la induccion de anergia. La ablacion de la actividad de Cbl-b en los CTL que infiltran el tumor puede convertir las celulas deficientes en Cbl-b en celulas T "super asesinas" que responden a un repertorio de diversos antlgenos asociados a tumores en forma independiente de las senales coestimuladoras. En ciertas realizaciones, la actividad de Cbl-b se reduce o elimina por la ablacion de la expresion de Cbl-b en los CTL que infiltran el tumor. En ciertas realizaciones, la expresion de Cbl-b se reduce mediante el uso de ARN pequeno de interferencia (ARNpi). En otras realizaciones, se reduce la expresion de Cbl-b mediante el uso de una variante de Cbl-b negativa dominante, por la administration de un agente que inhibe la actividad de Cbl-b, o por supresion de Cbl-b en su locus genomico. Las celulas con ablacion de Cbl-b se liberan de su estado de anergia, y son sensibles a los tumores, y a antlgenos tumorales.
La transferencia adoptiva de los CTL que infiltran el tumor que expresan ARN pi de Cbl-b puede dar lugar a la erradicacion de los tumores establecidos. Los CTL que infiltran el tumor son adecuados para uso en los metodos de transferencia adoptiva porque estas celulas se enriquecen por las celulas T CD8+ especlficas del tumor, limitando as! el riesgo de una respuesta autoinmune que pueda asociarse con la transferencia de celulas T con un repertorio diverso de TCR. En ciertos aspectos, la invencion proporciona metodos para modificar por ingenierla genetica los CTL "super asesinos" para la terapia tumoral cllnica.
La ablacion de Cbl-b en los CTL que infiltran el tumor por ARNpi suprime su estado de anergia para la estimulacion del antlgeno
El enfoque de ARNpi se ha utilizado con exito para la desactivacion o el silenciamiento completo de la expresion de genes activamente transcritos en linfocitos primarios en ratones (68; WO2004/099388).
En ciertas realizaciones, la expresion de Cbl-b en los CTL se puede desactivar utilizando el enfoque de ARNpi. Se sintetizaron cuatro oligonucleotidos de ARNpi, incluyendo el ARN inhibidor de la SEQ ID NO: 1 (5'- CAGGAGTATGAGACAGAAG-3'), y se clonaron respectivamente en un vector retroviral que contiene un gen CD2 humano (hCD2) como reportero. En este vector, la expresion de ARNpi es conducida por un promotor de ARN polimerasa III (H1) (69). Para evaluar la eficiencia del bloqueo de la expresion de Cbl-b mediante diferentes ARNpi, se cotransfectaron 10 pg del vector de ADN de expresion de ARNpi que contiene diferentes oligonucleotidos de ARNpi de Cbl-b y 1 pg del ADN del vector que expresa Cbl-b en celulas 293T por precipitation con Ca++. Cuarenta y ocho horas mas tarde, se determinaron los niveles de expresion de Cbl-b en cada una de las muestras de celulas transfectadas mediante un analisis de transferencias tipo Western. La expresion de un oligonucleotido de ARNpi, denominado como ARNpi 1, dio lugar a mas de un 95% de inhibition de la expresion de Cbl-b. Este resultado demostro por lo tanto que la expresion de Cbl-b puede ser sometida a ablacion mediante el enfoque de ARNpi.
Los vectores que expresan ARNpi dirigidos a Cbl-b pueden ser introducidos y expresados en los CTL especlficos del tumor por transferencia genica mediada por retrovirus. Una etapa en este proceso es infectar in vitro los CTL cultivados con una alta eficiencia. En ciertas formas de realization, se pueden generar un gran numero de celulas T infectadas por virus in vitro por estimulacion de las celulas T primarias con anticuerpos anti-CD3 unidos a la placa (5 pg/ml) y anti-CD28 solubles (5 pg/ml) en presencia de IL-2 (50 U/ml) durante 48 horas. Las celulas activadas pueden ser infectadas con un vector retroviral de ARNpi basado en hCD2. Las celulas infectadas por virus pueden ser cultivadas durante 5-10 dlas adicionales en presencia de IL-2. La eficacia de la infection viral se determina por FACS con base en la expresion de hCD2 de la superficie celular. El metodo produce tlpicamente 30-50% de celulas T infectadas por virus (hCD2+), en donde se pueden introducir ARNpi en los CTL cultivados para reducir la expresion de un gen objetivo, tal como Cbl-b.
La ablacion de Cbl-b en los CTL que infiltran el tumor mejora su capacidad de respuesta a la estimulacion con antlgeno tumoral
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Se ha demostrado que tanto los tejidos tumorales E.G7 como B16 contienen cantidades sustanciales de CTL que infiltran el tumor. Estos CTL estan en un estado de anergia porque son incapaces de rechazar los tumores. Para determinar si la ablacion de Cbl-b puede volver a estos CTL que infiltran el tumor sensibles a la estimulacion con antlgeno tumoral, se pueden aislar los CTL de la carga tumoral de E.G7 o B16 (17, 30). Los ratones Tg OT1 o Pmel- 1 pueden ser inoculados en forma subcutanea con tumores E.G7 o B16 (1-3 x 106/raton), respectivamente. Los ratones Tg OT1 y PmeI-1 son adecuados porque pueden tener abundantes celulas T CD8+ especlficas del tumor. El tejido tumoral (cuando los tumores alcanzan el tamano de ~5-10 mm de diametro) se puede extirpar quirurgicamente y cortar en trozos pequenos (2-3 mm de diametro) y tratar con colagenasa a 37°C. Las celulas muertas se pueden remover mediante centrifugacion en gradiente de Ficoll. Los CTL que infiltran el tumor se pueden aislar mediante el protocolo de enriquecimiento MACS usando anticuerpos contra las celulas T de OT1 (Vp8+) o PmeI-1 (Vp13+). Para la ablacion de Cbl-b en los CTL, se pueden activar in vitro las celulas T purificadas por coestimulacion con anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de IL-2 (30 U/ml). Cuarenta y ocho horas despues, se pueden infectar las celulas T activadas con vector retroviral que expresa ARNpi de Cbl-b como se describe en la presente memoria. Las celulas infectadas por virus pueden ser cultivadas durante otros 5-10 dlas en presencia de IL-2. La eficiencia de la infeccion por virus se puede determinar mediante analisis FACS. Para determinar el eficiencia de la ablacion de Cbl-b por el ARNpi en los CTL, se pueden purificar los CTL infectados con ARNpi de Cbl-b (hCD2+) por MACS despues de la tincion de las celulas con anticuerpo anti-CD2 humano. Los niveles de protelna Cbl-b en las celulas hCD2+ se pueden comparar con aquellas en las celulas de tipo silvestre (hCD2-) por analisis de transferencia tipo Western.
Para determinar si los CTL que expresan ARNpi de Cbl-b se asemejan funcionalmente a las celulas T CD8+ de Cbl- b'/_, se pueden estimular los CTL infectados con retrovirus (hCD2+) y no infectados (hCD2-) con diferentes dosis de anticuerpo anti-CD3 unido a la placa o una combinacion de anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 tal como se describe en la presente memoria. Las tasas de proliferacion celular se pueden determinar mediante el analisis de las celulas marcadas con CSFE o el ensayo de incorporacion de 3H-timidina. Los niveles de citoquinas tales como IL-2 e IFN-y producidas por los CTL activados se pueden determinar mediante un ELISA o mediante tincion intracelular seguida por analisis FACS. La resistencia de las celulas T hCD2+ a la supresion de TGF-beta se puede examinar como se describe en la presente memoria. Para determinar cuantitativamente si la ablacion de ARNpi de Cbl-b mejora la actividad asesina de los CTL, se puede realizar un ensayo de citotoxicidad in vitro, utilizando celulas E.G7 y B16 correspondientemente marcadas con 51Cr como los objetivos (71).
Se espera que los CTL infectados con retrovirus de ARNpi de Cbl-b (hCD2+) exhiban una expresion reducida de Cbl- b. Las celulas T CD8+ que expresan ARNpi de Cbl-b proliferen con mas fuerza y produzcan mayores niveles de IL-2 e IFN-gamma despues la estimulacion con anti-CD3 de lo que lo hacen los CTL de tipo silvestre (hCD2-) o infectados con el vector retroviral vaclo, ya que la ablacion de Cbl-b abolira el requisito de la coestimulacion y bajara el umbral de senalizacion de TCR para la activacion. Adicionalmente, la proliferacion y la production de IFN-gamma por las celulas T CD8+ que expresan ARNpi de Cbl-b tambien deben mejorarse significativamente. Un examen adicional puede incluir si estos cTl con ablacion de Cbl-b pueden erradicar eficientemente los tumores establecidos.
Este enfoque se basa en la desactivacion eficiente del Cbl-b endogeno en los CTL especlficos del tumor. Un oligonucleotido de ARNpi de Cbl-b de la SEQ ID NO: 1 permite mas de 95% de inhibition de las protelnas Cbl-b en celulas 293T. La expresion de este ARNpi en los CTL debe realizar la ablacion de manera eficiente del Cbl-b endogeno. Si la eficiencia de la ablacion de Cbl-b es de menos del 30-39%, 40-49%, 50-60% de inhibicion, en los CTL por este ARNpi, se pueden disenar y analizar oligonucleotidos adicionales de ARNpi para identificar los ARNpi que silenciarlan la expresion del gen de Cbl-b de manera mas eficiente en las celulas T. Actualmente, las estadlsticas muestran que en los sistemas de mamlferos aproximadamente 25% de las secuencias objetivo seleccionadas de ARNpi son funcionales (72). Por lo tanto, pueden ser identificadas una o mas secuencias de ARNpi que pueden desactivar eficientemente la expresion de Cbl-b (mas del 90%) cuando se ponen a prueba mas secuencias de ARNpi. Los ensayos funcionales, que incluyen, pero no se limitan a la proliferacion independiente de CD28, la produccion de IL-2 e IFN-y, y la supresion insensible de TGF-beta, se pueden utilizar como marcadores para evaluar si las celulas T CD8+ que expresa un ARNpi particular puede imitar funcionalmente los CTL de Cbl-b'/_. Ya que el enfoque de ARNpi ha sido utilizado para desactivar la expresion de muchos genes en las celulas T y en ratones, la ablacion de la expresion de Cbl-b en los CTL se puede lograr por este enfoque.
Un enfoque alternativo que se puede utilizar para reducir la funcion de Cbl-b, es la expresion de una forma dominante negativa de Cbl-b en las celulas T CD8+ por transduction retroviral. Pueden hacerse y probarse una cantidad de diferentes variantes de la protelna Cbl-b, incluyendo mutaciones en el enlazamiento de tirosina, el dedo RING (RF) y el dominio rico en prolina, y varios residuos de tirosina del terminal C, para determinar si estas variantes de la protelna crean mutaciones que bloquean la funcion de Cbl-b en las celulas T. Pueden hacerse y probarse otras variantes de la protelna Cbl-b para identificar otros mutantes negativos dominantes de Cbl-b. Tales mutantes negativos dominantes de Cbl-b se pueden utilizar para realizar la ablacion de la funcion de Cbl-b.
La transferencia adoptiva de los-b CTL que infiltran el tumor que expresan ARNpi de Cbl-b erradica el tumor establecido.
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Las celulas T de Cbl-b'/_ puede provocar una respuesta inmune antitumoral eficiente. Debido a que los infiltrados tumorales aislados de tejido tumoral se enriquecen para los CTL que tienen un amplio espectro de especificidad contra antlgenos tumorales, la inactivacion de Cbl-b en estos CTL por el ARNpi de Cbl-b proporciona un enfoque adecuado para generar CTL in vitro especlficos del tumor de Cbl-b. En ciertas realizaciones, la invencion establece que la transferencia adoptiva de los CTL que infiltran el tumor con ablacion de Cbl-b da como resultado la erradicacion de los tumores establecidos. Un metodo de transferencia adoptiva de los CTL que infiltran el tumor con ablacion de Cbl-b puede ser utilizado como una herramienta terapeutica para tratar canceres en seres humanos.
En ejemplos no limitantes, los CTL que infiltran el tumor pueden aislarse o bien de ratones Tg OT1 o PmeI-1 de acuerdo con los protocolos publicados (17, 30), y se puede hacer ablacion de Cbl-b en estas celulas por ARNpi utilizando un vector retroviral como se describe en la presente memoria. Los ratones Tg TCR son los elegidos porque tienen una alta frecuencia de celulas T CD8+ especlficas del tumor. Para determinar si los CTL especlficos del tumor con ablacion de Cbl-b pueden erradicar los tumores establecidos, se pueden transferir 1-10x106 de los CTL que expresan ARNpi de Cbl-b aislado ya sea de ratones Tg OT1 o Pmel-1, respectivamente, en ratones C57BL/6 que portan los correspondientes tumores establecidos, y luego hacer seguimiento a los tamanos de los tumores. Para determinar si los CTL transferidos se puede expandir in vivo, se puede examinar la proliferacion de las celulas transferidas mediante el ensayo de marcacion con CSFE. La infiltracion de los CTL en el tejido tumoral puede determinarse mediante un ensayo inmunohistologico.
En los ratones no transgenicos, los infiltrados tumorales pueden ser enriquecidos por los CTL especlficos del tumor. Los CTL de esta carga tumoral deben parecerse mucho a aquellos de los tejidos de cancer humano. Para determinar si los CTL aislados a partir de tejidos tumorales de ratones portadores de tumores de tipo silvestre pueden ser convertidos en los CTL "super asesinos" contra los tumores correspondientes, se pueden aislar los CTL a partir de tejidos tumorales de ratones C57BL/6 portadores de tumores E.G7 o B16 por digestion con colagenasa, y clasificacion por FACS. En ciertas realizaciones, estas celulas pueden expandirse in vitro en presencia de IL-2 (50 U/ml), anticuerpo anti-CD3 soluble y APC (celulas esplenicas irradiadas) cargadas con lisado de E.G7 o B16 (106 celulas/ml). Los medios pueden ser cambiados cada 10 dlas. Se ha demostrado que este protocolo produce un alto numero de CTL especlficos antitumorales (Ramarathinam y colaboradores, 1994). Para la ablacion de Cbl-b en estos CTL, por ejemplo por ARNpi, estos CTL pueden ser infectados con retrovirales que expresan ARNpi de Cbl-b. Las celulas infectadas con virus se pueden purificar por MACS despues de la tincion de las celulas con anti-hCD2. Para probar si estas celulas pueden rechazar al tumor establecido, se puede transferir los CTL con ablacion de Cbl-b (1-10 x 106 celulas/raton) en ratones C57BL/6 que portan los correspondientes tumores. Se puede hacer seguimiento al tamano y la regresion de los tumores establecidos como se describe en la presente memoria.
Para determinar si la regresion del tumor tiene memoria duradera, se puede hacer seguimiento a la recurrencia del tumor durante al menos 1,5 anos en los ratones en los que el tumor retrocedio. Para determinar si los CTL transferidos se convierten en celulas T de memoria, se pueden volver a inocular varias dosis de las mismas celulas tumorales en ratones con regresion del tumor en diferentes puntos de tiempo despues de la regresion del tumor, y luego hacer seguimiento al crecimiento del tumor en el raton de tipo silvestre. Los ratones de tipo silvestre pueden ser inoculados con el mismo tumor como controles. Para determinar la frecuencia de los CTL con memoria especlfica del tumor en los ratones con regresion tumoral, se puede realizar un ensayo de citotoxicidad in vitro utilizando celulas E.G7 y Pmel-1 como objetivos, respectivamente.
Diversas llneas de evidencia sugieren que los tumores cllnicos pueden impedir la vigilancia inmune a traves de TGF- beta y de la barrera del tumor. En ciertas realizaciones, la invencion proporciona metodos para determinar si las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_ especlficas del tumor TRAMP-2C y Ag104Ld pueden sortear estos efectos negativos y montar una respuesta antitumoral eficiente. Cllnicamente, las celulas T de Cbl-b'/_ se pueden obtener mediante la manipulacion de celulas T CD8+ maduras. Por lo tanto, se puede determinar si se puede utilizar los CTL que expresan ARNpi de Cbl-b para erradicar tumores TRAMP-2C y Ag104Ld en ratones. Se pueden obtener celulas T cD8+ de tipo silvestre reactivas con TRAMP-2C de ratones de tipo silvestre mediante una inmunizacion repetitiva y un enfoque de estimulacion in vitro como se describe en la presente memoria. Se pueden obtener celulas T CD8+ reactivas con el tumor Ag104Ld a partir de ratones portadores de tumores Ag104Ld de acuerdo con protocolos previamente publicados. En este protocolo, se pueden generar ratones portadores de tumores Ag104Ld mediante inyeccion subcutanea inyeccion de 106 Ag104Ld en ratones C57BL/6. Dos semanas despues, se puede inyectar LIHGT soluble (Yu P. y colaboradores, 2004) en el tumor Ag104Ld. Este tratamiento ha demostrado que induce infiltracion masiva y expansion de celulas T CD8+ especlficas Ag104Ld en el sitio del tumor, que pueden ser purificadas por citometrla de flujo y expandidas in vitro por estimulacion repetitiva y cultivo de lL-2. Cuando se obtienen celulas T CD8+ reactivas con el tumor TRAMP-2C y Ag104Ld, se puede desactivar la actividad de Cbl-b, por ejemplo, pero sin limitarse, por infeccion con el vector retroviral de ARNpi de Cbl-b. La capacidad y la eficiencia de estas celulas para rechazar al tumor que produce TGF-beta o para penetrar la barrera del tumor, se puede determinar de acuerdo con el diseno experimental y los metodos descritos en la presente memoria.
Diferentes CTL que expresan ARNpi de Cbl-b pueden presentar diferentes grados de actividades antitumorales. Como consecuencia, los CTL especlficos del tumor que expresan diferentes ARNpi de Cbl-b pueden erradicar tumores con diferente eficiencia. Esto puede indicar que se puede aplicar el mismo enfoque a la terapia de cancer
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humano, usando ARNpi de Cbl-b que puede realizar la ablacion de la expresion de Cbl b en las celulas T humanas. Ya que los CTL de Cbl-b-/- son resistentes a la supresion de TGF-beta y la transferencia adoptiva de celulas T CD8+ de Cbl-b-/- rechaza al tumor E.G7 establecido, la ablacion de Cbl-b por ARNpi en los CTL que infiltran al tumor de tipo silvestre pueden volver a estas celulas CTL desactivadas en Cbl-b capaces de erradicar al tumor TRAMP-2C y Ag104Ld. Esto tambien puede determinar el perfil de los tumores que pueden ser tratados por los CTL con ablacion de Cbl-b.
Si la expresion de un ARNpi particular en los CTL suprime la dependencia de CD28 para la activacion de celulas T, sin embargo falla en mejorar la erradicacion del tumor, esto puede sugerir que la frecuencia de los CTL especlficos del tumor en las celulas adoptivamente transferidas es importante para una erradicacion eficiente del tumor. Las frecuencias de los CTL especlficos del tumor en celulas que infiltran al tumor de ratones de tipo silvestre pueden ser determinadas mediante un ensayo de dilucion limitante usando celulas tumorales marcadas con 5lCr como el objetivo (71). Si los CTL especlficos del tumor en las celulas T transferidos que infiltran al tumor de ratones de tipo silvestre son realmente mas bajos en comparacion con aquellos de los ratones Tg TCR, se puede probar si la transferencia adoptiva de las cantidades mayores de CTL de ratones de tipo silvestre dan como resultado un rechazo tumoral mas eficiente. Si la transferencia adoptiva de los CTL que expresan ARNpi de Cbl-b derivado de raton Tg TCR tambien falla para erradicar los tumores establecidos, esto puede sugerir que este ARNpi particular tambien puede desactivar la expresion de otra(s) molecula(s), ademas de Cbl-b, que son crlticas para CTL para ejecutar la funcion antitumoral. Se puede usar una secuencia diferente de ARNpi de Cbl-b para desactivar la expresion de Cbl-b, ya que es estadlsticamente improbable que dos secuencias diferentes ARNpi supriman en forma cruzada la expresion del mismo conjunto de moleculas.
La transferencia adoptiva de celulas T CD8+ con ablacion-Cbl-b de infiltrados tumorales de ratones de tipo silvestre puede provocar enfermedad autoinmune si estas celulas T CD8+ expresan un repertorio diverso de TCR. Este problema puede ser superado mediante la expansion selectiva de CTL especlfico del tumor in vitro a traves de la estimulacion repetitiva de los CTL especlficos del tumor con un antlgeno o antlgenos especlficos del tumor tales como gp100 que son compartidos por el tumor y las celulas menos importantes.
La identificacion de una forma(s) negativa(s) dominante(s) de Cbl-b utilizando un enfoque de mutagenesis puede proporcionar un enfoque alternativo para inhibir la funcion de Cbl-b en los CTL.
En ciertos aspectos, se pueden analizar la funcion de ubiquitina ligasa de Cbl-b en la activacion de celulas T que depende de CD28 y el rechazo del tumor. La senal coestimuladora de CD28 esta ligada a las rutas de senalizacion de PI-3 quinasa y Vav (55, 56, 73). Tanto p85 de la PI-3 quinasa y Vav son sometidas a ubiquitinacion por Cbl-b, lo que sugiere que Cbl-b regula la senal coestimuladora de CD28 a traves de la promotion de la ubiquitinacion de p85 y Vav (73, 74). Dado que la funcion de ubiquitina ligasa de Cbl-b depende de su dominio de RF (75), es probable que la interruption de este dominio puede dar como resultado la perdida de la dependencia de cD28 y la sensibilidad hacia la supresion de TGF-beta, y torna la capacidad de respuesta de las celulas T contra los tumores en ausencia de la coestimulacion. En ciertas realizaciones, la invention proporciona metodos para determinar si la expresion de un Cbl-b mutante del dominio de RF en celulas T permite la activacion de las celulas T en forma independiente de la coestimulacion de CD28 y la supresion de TGF-beta. Ciertas realizaciones tambien proporcionan metodos para determinar si los CTL que expresan un Cbl-b mutante del dominio de RF pueden montar respuestas inmunes contra diversos tumores como lo hacen los CTL de Cbl-b'/_. Los resultados de este analisis pueden proporcionar information para disenar y seleccionar un farmaco de un compuesto pequeno que pueda beneficiar la inmunoterapia tumoral. Ya que la introduction la mutation de Cbl-b'A en ratones con ATM'/_ disminuye marcadamente la incidencia de tumores espontaneos, y los ratones Cbl-b'A no desarrollan una enfermedad autoinmune espontanea, es probable que una supresion sistemica de la funcion de Cbl-b usando tal compuesto pueda beneficiar la prevention del tumor.
Determination de si la actividad de ubiquitina ligasa de Cbl-b es requerida para la activacion de celulas T que dependen de CD28
La actividad de ubiquitina ligasa de Cbl-b depende de la asociacion de su dominio RF con una enzima de conjugation de ubiquitina-E2. Para inactivar la funcion de ubiquitinacion de Cbl-b, se pueden generar formas mutantes de Cbl-b en donde los mutantes, o bien se suprime el dominio de RF completo, o se sustituyen los residuos clave en el dominio de RF ya sea solos o en combination para garantizar la elimination de la actividad de ubiquitina ligasa. Dado que la mayor parte de la informacion disponible sobre la estructura y la funcion de la ligasa de las protelnas Cbl provienen de la c-Cbl humana, esta informacion puede servir como gula para la mutagenesis de Cbl-b de murino. Una Cbl-b mutante puede ser creada para que tenga suprimido el dominio completo de RF, desde el aminoacido 273 hasta el aminoacido 312 de Cbl-b de murino (50). Este Cbl-b mutante sera clonado en un vector retroviral bi-cistronico (70), su funcion de ubiquitinacion y la asociacion con las moleculas conocidos que se enlazan con Cbl-b se pondran a prueba en las celulas T cultivadas. Si esta mutacion afecta la asociacion normal de Cbl-b con otras moleculas de senalizacion, se pueden generar mutaciones puntuales, tales como Cbl-b (C376A), Cbl-b (W400A) y Cbl-b (C376A, W400A) mediante mutagenesis asistida por PCR. c-Cbl y Cbl-b comparten 98% de homologla de secuencia en sus dominios de RF. Cbl-b (C376A) contiene una mutacion que reemplaza un residuo
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clave que se enlaza al zinc (cistelna 376) con una alanina. La mutacion equivalente en c-Cbl humana interrumpe la formacion de bucles de quelacion de zinc que acomodan al contacto mas significativo con UbcH7 (75). Para la mutacion de Cbl-b (W400A) (triptofano 400 por alanina), la mutacion equivalente en c-Cbl humana mantiene la capacidad de enlazamiento con el zinc pero interactua pobremente con las enzimas que se conjugan con la ubiquitina E2 (76). Para el mutante (Cbl-b (C376A) y (W400A)), se ha demostrado que un equivalente de c-Cbl humana elimina completamente su actividad de ubiquitina ligasa tanto in vitro como in vivo (77). Tambien se puede anadir una etiqueta FLAG a los terminales C de estos mutantes para permitir una deteccion especlfica. El ADNc mutante puede ser clonado en un vector retroviral bicistronico y su funcion y asociacion de ubiquitinacion con componentes de senalizacion conocidos, tales como Zap70, Vav, y p85 (78), pueden ser probados primero en celulas T cultivadas de Cbl-b-/". Utilizando este enfoque retroviral, se pueden infectar celulas T primarias activadas in vitro con mas de 30 - 50% de eficiencia.
El impacto de cualquiera de estos mutantes de Cbl-b con Ub inhabilitada en la senalizacion co-estimuladora de CD28 y la respuesta de las celulas T a la supresion de TGF-beta puede ser determinado como se describe en la presente memoria. Para excluir la posible interferencia de la Cbl-b endogena de tipo silvestre, se puede introducir al mutante de Cbl-b con Ub inhabilitada en las celulas madre de medula osea (BM) de Cbl-b'A, donde las celulas madre infectadas pueden ser transferidas en ratones RAG2'/_, y se puede analizar la activacion de celulas T inducidas por TCR, la production de IL-2, y la supresion de TGF-beta, en presencia o en ausencia de coestimulacion de CD28, usando celulas T aisladas de estas quimeras. Se puede introducir Cbl-b con Ub inhabilitada en celulas madre c-Cbl Cbl-b dko BM por transduction retroviral usando un vector retroviral bicistronico basado en hCD2 (o GFP). Se puede usar un vector viral que expresa al transgen de Cbl-b de tipo silvestre como control. Ciertas realizaciones utilizan quimeras de BM infectadas con retrovirus para demostrar la funcion de c-Cbl en el desarrollo de timocitos. Los resultados mostrados en la Figura 14 demuestran la factibilidad de usar tal sistema para expresar un transgen en celulas madre hematopoyeticas.
Despues de la infection viral, se pueden introducir las celulas madre transducidas del retrovirus en ratones receptores Rag2 mediante inyeccion intravenosa para generar quimeras BM. De seis a ocho semanas despues, se puede analizar el desarrollo de las celulas T que expresan la transgen (hCD2+ o GFP+) en los ratones receptores por FACS, utilizando anticuerpos contra CD4, cD8, y CD3. Ya que los ratones receptores son deficiente en Rag2, las celulas T generadas en estas quimeras BM deben derivarse exclusivamente de las celulas madre del donante.
Para investigar si Cbl-b con Ub inhabilitada afecta la coestimulacion CD28 y la supresion de TGF-beta, se puede determinar la proliferation de celulas T CD8+ inducida por TCR en presencia o en ausencia de diferentes dosis de TGF-beta, y citoquinas (IL-2 e IFN-y) mediante la incorporation de 3H-timidina y ELISA, respectivamente. Se pueden purificar cD8+ de Cbl-b'/_ (hCD2+ o GFP+) y con Ub inhabilitada (hCD2- o GFP-) a partir de las quimeras de BM por FACS o clasificacion por MACS con base en la expresion de GFP o hCD2.
Una protelna Cbl-b con Ub inhabilitada puede ser sobreexpresa en celulas T CD8+ de tipo silvestre como un supresor negativo dominante para la funcion de Cbl-b endogena. Esto puede hacerse mediante la introduction y expresion de una molecula de Cbl-b con Ub inhabilitada en celulas T CD8+ de ratones C57BL/6 por infeccion retroviral de acuerdo con el metodo descrito en la presente memoria. Las celulas infectadas por virus pueden ser purificar por MACS. Para determinar si las celulas T CD8+ que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada imitan funcionalmente a las celulas T CD8+ de Cbl-b'A, se pueden determinar las tasas de proliferacion y la produccion de IL-2 e IFN-y, as! como la resistencia a la supresion de TGF-beta despues de la estimulacion de TCR y CD28. Estas realizaciones pueden demostrar si se puede utilizar Cbl-b con Ub inutilizado como una protelna de forma negativa dominante para permitir la ablation de la funcion de Cbl-b endogena a las celulas T.
Se espera que la expresion de una Cbl-b de tipo silvestre en celulas T de Cbl-b'/_ restablezca completamente la dependencia de las celulas T en la coestimulacion de CD28 para la activacion y sensibilidad de TGF-beta. Si la funcion de ubiquitinacion de Cbl-b es responsable por la dependencia de las celulas T en la coestimulacion CD28 y la sensibilidad TGF-beta, las celulas T cD8+ que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada debe proliferar y secretar IL-2 e IFN-y tan eficientemente como lo hacen las celulas T de Cbl-b'/_. Adicionalmente, la proliferacion de celulas T CD8+ inducidas por anti-CD3 no sera bloqueada por TGF-beta. La restauracion completa de la dependencia de las celulas T en la senal de CD28 para la activacion o la sensibilidad de TGF-beta por la expresion de Cbl-b con Ub inhabilitada sugiere que los otros dominios de Cbl-b y las correspondientes protelnas asociadas son responsables de estos fenotipos de celulas T de Cbl-b'/_. La mutagenesis de otras posiciones puede identificar estos dominios y moleculas.
Para determinar el impacto de la Cbl-b con Ub inhabilitada en la senalizacion de TCR, el estado de ubiquitinacion de Cbl-b regulo los objetivos de senalizacion, por ejemplo, pero sin limitarse a, Vav y p85 PI 3-quinasa, pueden estar en el mutante de Cbl-b con Ub inhabilitada frente a las celulas T de tipo silvestre ya que las rutas de senalizacion que involucran Vav y p85 PI-3-quinasa estan alteradas en las celulas T de Cbl-b'/_ (55, 56, 73). Si la activacion, o fosforilacion de una de estas protelnas de senalizacion en las celulas que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada es similar a aquella en las celulas de tipo silvestre, esto puede sugerir que la actividad de la ubiquitina ligasa de Cbl-b es prescindible para la activacion de esta molecula. Por el contrario, si se requiere la funcion de ubiquitinacion de Cbl-b para la activacion de un componente particular de senalizacion, se puede esperar que el estado de
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fosforilacion de este componente en las celulas que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada sera similar a la encontrada en celulas T Cbl-b-/-. En este caso, se puede determinar si esta molecula particular de senalizacion, puede experimentar ubiquitinacion celulas T de tipo silvestre y en celulas T de Cbl-b-/-. La cinetica de degradation de esta molecula puede ser determinada por hibridacion de transferencia tipo Western.
Una posible complication de esta serie de experimentos es que la Cbl-b con Ub inhabilitada complementa parcialmente los fenotipos de Cbl-b-/". Esto puede sugerir que, o bien el nivel de expresion del transgen es demasiado bajo para compensar completamente la funcion de Cbl-b o que mecanismos distintos a los de la ubiquitinacion tambien estan involucrados en la regulation. Para excluir la anterior posibilidad, se puede analizar la senalizacion coestimuladora en las celulas T de ratones mutantes con activation de Cbl-b con Ub inhabilitada. Tal modelo de raton puede ser generado en donde en ciertas realizaciones, la expresion de la protelna Cbl-b con Ub inhabilitada es conducida por un promotor/ reforzador de Cbl-b endogeno en el locus endogeno. La expresion de la protelna Cbl-b con Ub inhabilitada es conducida por una secuencia de ADN promotora/reforzadora de Cbl-b endogeno localizada en una position diferente del locus endogeno. Si las celulas T de estos ratones muestran una restauracion parcial de la senalizacion de Cbl-b, esto puede sugerir que se Cbl-b puede utilizar otros mecanismos que regulan estas senales. Un analisis adicional de la mutagenesis de las protelnas Cbl puede ayudar a resolver este problema.
La inactivation de la actividad de ubiquitina ligasa de Cbl-b o la sobreexpresion de una Cbl-b con Ub inhabilitada en celulas T CD8+ aumenta el rechazo del tumor.
El papel de la funcion de la ubiquitinacion de Cbl-b en el rechazo del tumor se puede estudiar utilizando celulas T transgenicas que expresan variantes de la protelna Cbl-b con Ub inhabilitada, en vez de o ademas de Cbl-b de tipo silvestre. Las celulas T que expresan unicamente variantes de protelna Cbl-b con Ub inhabilitada pueden imitar la situation en la que la funcion de la ubiquitina ligasa de Cbl-b endogena esta bloquea por un agente, por ejemplo, pero sin limitarse a un farmaco de molecula pequena. La variante de la protelna Cbl-b con Ub inhabilitada puede ser expresada en los CTL de tipo silvestre mediante un enfoque retroviral. En este caso, la Cbl-b mutante con Ub inhabilitada puede ser usada como una forma negativa dominante para suprimir la funcion de Cbl-b endogeno en celulas T. Estas celulas pueden rechazar potencialmente tumores como Las celulas T CD8+ de Cbl-b'/_.
Para determinar si las celulas T CD8+ con rechazan tumores, se pueden generar ratones Tg TCR OT1 Cbl-b'/_ y PmeI-1. Para obtener celulas T CD8+ sin modificar que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada se puede introducir acido nucleico que codifica variantes de protelna Cbl-b con Ub inhabilitada en celulas madre BM de estos ratones y generan una quimera BM como se describe en la presente memoria. Para obtener celulas T CD8+ efectoras con Ub inhabilitada, pueden estimular en forma repetitiva celulas T CD8+ sin modificar con Ub inhabilitada con CD3 y CD28, y se expanden en presencia de IL-2. Las celulas T efectoras o sin modificar que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada pueden ser aisladas de las quimeras de BM anteriores o de las celulas cultivadas in vitro por MACS o FACS utilizando hCD2 o GFP como marcadores de superficie celular. Una vez que se generan celulas t efectoras o sin modificar que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada especlficas del tumor ( Tg TCR OT1 o PmeI-1), estas celulas pueden ser transferidas (1-10x106 celulas/raton) en los correspondientes ratones C57BL/6 portadores de tumores por inyeccion intravenosa. Se pueden utilizar como controles celulas T CD8+ Tg TCR de 0T1 o Pmel-1 Cbl-b'A de tipo silvestre purificadas. Se puede hacer seguimiento a la regresion de los tumores como se describe en la presente memoria. Si la celulas T CD8+ con Ub inhabilitada adoptivamente transferidas pueden generar protection y memoria inmune a largo plazo contra el tumor, tambien puede ser evaluado. Si las celulas T que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada pueden tambien erradicar tumores en presencia de TGF-beta o de una barrera de tumor pueden ser evaluadas mediante el uso de un modelo de tumor TRAMP-2C y Ag104Ld.
Si la funcion de la ubiquitina ligasa de Cbl-b es responsable por la inhibition de la respuesta de las celulas T contra los tumores en ratones normales, se espera que las celulas T que expresan Cbl-b con Ub inhabilitada puedan prevenir el crecimiento de los tumores inoculados en forma similar a las celulas T de a Cbl-b'/_. Esto puede sugerir que la inhibicion in vivo de la actividad de la ubiquitina ligasa de Cbl-b en celulas T es suficiente para provocar una respuesta inmune antitumoral contra los tumores. Los agentes que identifican tales compuestos qulmicos que pueden antagonizar la actividad de la ubiquitina ligasa de Cbl-b y examinan si el tratamiento de ratones con estos agentes mejora las respuestas inmunes antitumorales.
Un bloque sistemico de la funcion ubiquitina ligasa de Cbl-b puede tener un efecto adverso tal como el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Sin embargo, los ratones Cbl-b'/_, no exhiben ninguna anomalla importante en otros tejidos y no desarrollan enfermedades autoinmunes espontaneas. Adicionalmente, los experimentos muestran que los ratones doblemente mutantes Cbl-b'A ATM'/_ exhiben una incidencia notablemente baja de linfomas espontaneos en comparacion con los ratones ATM'/_ propensos a los tumores. Estas observaciones indican que el control de la funcion de Cbl-b por un compuesto qulmico podrla ser beneficiosa tanto para inmunoterapia tumoral como para la prevencion.
Si la interruption de la funcion de la ubiquitina ligasa de Cbl-b no puede conferir la capacidad de respuesta de las celulas T contra los tumores, o simplemente provocar una respuesta antitumoral relativamente mas debil en
comparacion con las celulas T de Cbl-b'/_, esto puede sugerir que otro(s) dominio(s) de Cbl-b y las correspondientes moleculas asociadas son importantes en la inmunidad de las celulas T contra los tumores. Otros estudios de mutagenesis como se describe en la presente memoria pueden identificar los dominios que estan enlazados a la senal coestimuladora de CD28. La capacidad de estos mutantes para confieren inmunidad de celulas T a los 5 tumores sera examinada utilizando el diseno experimental anterior.
Es posible que el nivel de expresion de la Cbl-b con Ub inhabilitada en celulas T usando el enfoque anterior no sea comparable con aquel de la Cbl-b endogena. Los analisis anteriormente descritos tambien pueden ser hechos utilizando ratones con activacion de Cbl-b con Ub inhabilitada.
En ciertas realizaciones, la descripcion proporciona metodos para determinar los mecanismos mediante los cuales 10 los ratones Cbl-b-/" montan una respuesta inmune antitumoral eficiente y metodos para modular la ruta de senalizacion Cbl-b en celulas T para inmunoterapia tumoral. En ciertos aspectos, la descripcion establece que los ratones Cbl-b-/" son resistentes a la inoculacion del tumor E.G7. La resistencia a la inoculacion del tumor depende de las celulas T. La descripcion tambien establece que celulas T de Cbl-b'/_ responden a la estimulacion con antlgeno independiente de la coestimulacion de CD28. En otros aspectos, la descripcion establece que Cbl-b puede controlar 15 la senal coestimuladora de CD28 a traves de su funcion de ubiquitina ligasa.
La descripcion establece ademas que los CTL de Cbl-b'A son necesarios y suficientes para montar respuestas inmunes antitumorales en modelos animales. En cierto aspecto, la descripcion establece que la ablacion de Cbl-b en celulas T que infiltran al tumor, que estan enriquecidas para los CTL especlficos del tumor generados en forma natural, genera celulas T que pueden ser usadas como los "super asesinas" para erradicar los tumores establecidos. 20 En otros aspectos, la descripcion establece que la inactivacion de la actividad de ubiquitina ligasa de Cbl-b puede ser suficiente para volver celulas T sensibles contra los tumores.
En ciertas realizaciones, la descripcion proporciona metodos que determinan los mecanismos subyacentes de la expansion de celulas B T1 deficientes en Cbl en el contexto de la tolerancia de celulas B. El analisis puede incluir la generacion y maduracion de las celulas B T1 in vivo. En otras realizaciones, se puede examinar la susceptibilidad de 25 la muerte inducida por BCR de celulas B T1 Cbl-DKO. El analisis tambien puede incluir la evaluacion del efecto potencial de las celulas T en la maduracion y supervivencia de las celulas B T1 Cbl-DKO.
En otras realizaciones, la descripcion proporciona metodos para determinar si la expansion de las celulas B T1 Cbl- DKO provoca el fracaso de la tolerancia de celulas B. Debido a que las celulas B T1 representan una etapa en el desarrollo de las celulas B cuando son susceptibles a anergia o muerte inducida por autoantlgeno, la maduracion 30 acelerada de las celulas B Cbl-dK0 podrla acortar la ventana de desarrollo durante la cual se puede inducir la tolerancia de las celulas B por autoantlgeno.
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Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una poblacion de celulas aisladas, sustancialmente purificada, que comprende celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b para uso como un medicamento, adecuado para uso en rechazo inmune de tumores.
  2. 2. Una poblacion de celulas aisladas, sustancialmente purificada, que comprende celulas T CD8+ con actividad reducida de Cbl-b para uso en un metodo para el tratamiento del cancer.
  3. 3. La poblacion de celulas para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde las celulas T CD8+ provienen de sangre periferica, organos linfaticos, o infiltrados tumorales.
  4. 4. La poblacion de celulas para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la poblacion de celulas se alsla de un sujeto.
  5. 5. La poblacion de celulas para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde las celulas T CD8+ se alslan de infiltrados tumorales del sujeto.
  6. 6. La poblacion de celulas para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde las celulas T CD8+ son policlonales.
  7. 7. La poblacion de celulas para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde las celulas T CD8+ han sido separadas de la poblacion de celulas y estimuladas para proliferar.
    8 La poblacion de celulas para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde las celulas T CD8+ han sido separadas de la poblacion de celulas y estimuladas con celulas tumorales aisladas de un sujeto, para aumentar el numero de celulas T CD8+ especlficas del tumor.
  8. 9. La poblacion de celulas para uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde las celulas T CD8+ especlficas del tumor han sido puestas en contacto con un anticuerpo anti-CD3 o incubadas con IL-2 o una combinacion de los mismos con el fin de aumentar adicionalmente el numero de las celulas T CD8+ especlficas del tumor.
  9. 10. La poblacion de celulas para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde la actividad reducida Cbl-b ha sido lograda mediante uno o mas de: (i) poner en contacto las celulas T CD8+ con un agente qulmico que inhibe expresion o actividad de Cbl-b, (ii) la introduccion de un ARNi de la SEQ ID NO: 1 (5'- AGGAGTATGAGACAGAAG-3'), que dirige a Cbl-b en las celulas T CD8+, y (iii) desactivar el gen que codifica Cbl-b.
  10. 11. La poblacion de celulas para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4, en donde un sujeto que va a ser tratado padece cualquiera de los siguientes tipos de tumores: melanoma, linfoma, o cualquiera de los tumores solidos que expresan MHC-I con un antlgeno que puede ser reconocidos por los CTL.
  11. 12. Un metodo para identificar un agente que afecta a la expresion o actividad de Cbl-b, comprendiendo el metodo:
    (a) la estimulacion de una celula T CD8+ con un anticuerpo anti-CD3 en ausencia de coestimulacion con un anticuerpo anti-CD28,
    (b) el contacto la celula T CD8+ con un agente candidato,
    (c) la medicion de los niveles de estimulacion o proliferacion de la celula T CD8+,
    en donde un agente que conduce a la estimulacion o proliferacion de la celula T CD8+ es indicativo de un agente que subregula actividad o expresion de Cbl-b.
  12. 13. Un agente que comprende una molecula de ARNi de la SEQ ID NO: 1 (5'-CAGGAGTATGAGACAGAAG-3') para uso como un medicamento.
  13. 14. Un agente que comprende una molecula de ARNi de la SEQ ID NO: 1 (5'-CAGGAGTATGAGACAGAAG-3') para uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto, en donde el agente es capaz de disminuir la actividad de Cbl-b, y en donde el agente es capaz de inducir una respuesta inmune antitumoral.
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