ES2566778T3 - Anticuerpos anti-IgE de humano de alta afinidad - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento de fijación a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3, y una región variable de la cadena pesada que comprende CDRH1, CDRH2 y CDRH3, en donde CDRL1 consiste de la secuencia aminoacídica presentada en la SEQ ID n.º 5, CDRL2 consiste en la secuencia aminoacídica presentada en la SEQ ID n.º 8, CDRL3 consiste en la secuencia aminoacídica , CDRH1 consiste en la secuencia aminoacídica presentada en la SEQ ID n.º 15, CDRH2 consiste en la secuencia aminoacídica presentada en la SEQ ID n.º 25 y CDRH3 consiste en la secuencia aminoacídica presentada en la SEQ ID n.º 26, en donde el anticuerpo o fragmento de fijación a antígeno del mismo se fija específicamente a IgE.

Description

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La terminología «célula», «línea celular» y «cultivo celular» incluye a la progenie. También se debe saber que toda la progenie no tiene por qué tener exactamente el mismo contenido de ADN debido a que pueden aparecer mutaciones deliberadas o involuntarias. Está incluida la progenie variante que tenga la misma función o la misma propiedad biológica, como la que se busca en la célula originalmente transformada. Las «células hospedadoras» utilizadas en la presente invención son por lo general hospedadores procariotas o eucariotas.

«Transformación» de un organismo celular con ADN significa la introducción del ADN en un organismo, de tal modo que el ADN se puede replicar, bien como un elemento extracromosómico o bien mediante integración cromosómica. «Transfección» de un organismo celular con ADN hace referencia a que la célula o el organismo toma el ADN, p. ej., un vector de expresión, tanto si se expresa de hecho alguna secuencia codificante como si no lo hace. La terminología «célula hospedadora transfectada» y «transformada» hace referencia a una célula en la cual se introduce el ADN. La célula se denomina «célula hospedadora» y puede ser procariota o bien eucariota. Las células hospedadora procariotas típicas incluyen diferentes cepas de E. coli. Las células hospedadoras eucariotas típicas son de mamífero, tales como de ovario de hámster chino, o células de origen humano. La secuencia de ADN introducida puede ser de la misma especie que la célula hospedadora o de una especie diferente a la de la célula hospedadora, o puede ser una secuencia de ADN híbrida que contiene algo de ADN foráneo y algo de ADN homólogo.

El término «vector» hace referencia a una construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN que está unida operativamente a una secuencia de control idónea capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedador idóneo. Tales secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora optativa para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica los sitios idóneos para la fijación del ribosoma al ARNm, y las secuencias que controlan la terminación de la transcripción y de la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un posible inserto genómico. Una vez transformado en un hospedador idóneo, el vector puede replicarse y funcionar de forma independiente al genoma hospedador, o puede, en algunos casos, integrarse por sí solo en el genoma. En la presente especificación, «plásmido» y «vector» a veces se utilizan indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector utilizada con más frecuencia. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores que realizan una función equivalente y que son, o que acaban siendo, conocidas en la técnica.

La expresión «secuencias de control» hace referencia a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo hospedador concreto. Las secuencias de control que son idóneas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, facultativamente una secuencia operadora, y un sitio de fijación de ribosoma. Las células eucariotas se sabe que utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. El ADN para una presecuencia o líder de secreción pueden estar operativamente unidos al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de fijación del ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de fijación del ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si su colocación facilita la traducción. Por lo general, «operativamente unido» significa que las secuencias de ADN que se unen están contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contigua y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos.

«Mamífero», para propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, entre ellos humano, animales domésticos o de granja, primates no humanos y animales de zoo, para deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc.

El término «etiquetado con epítopo», cuando se utiliza en la presente memoria en el contexto de un polipéptido, hace referencia a un polipéptido fusionado a una «etiqueta de epítopo». El epítopo polipeptídico de etiqueta tiene suficientes restos para proporcionar un epítopo contra el cual se puede generar un anticuerpo, y es lo suficientemente corto como para que no interfiera con la actividad del polipéptido. Preferiblemente, la etiqueta de epítopo es también razonablemente única para que el anticuerpo no reaccione sustancialmente de forma cruzada con otros epítopos. Las etiquetas polipeptídicas idóneas tienen por lo general al menos 6 restos aminoacídicos y normalmente tienen entre aproximadamente 8 y 50 restos aminoacídicos (preferiblemente entre aproximadamente 9 y 30 restos). Los ejemplos incluyen el polipéptido de etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); la etiqueta de c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 dirigidos contra ella (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)); y la etiqueta de la glucoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo puede ser un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de incrementar in vivo la semivida en el suero de la molécula de IgG.

La palabra «marcación», cuando se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un compuesto o composición detectable que se puede conjugar directa o indirectamente a una molécula o proteína, p. ej., un anticuerpo. La

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marcación puede ser detectable por sí sola (p. ej., marcaciones de radioisótopo o marcaciones fluorescentes) o, en el caso de una marcación enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «fase sólida» significa una matriz no acuosa a la cual se puede adherir el anticuerpo de la presente invención. Ejemplo de fases sólidas abarcadas por la presente memoria incluyen las formadas parcial o totalmente por vidrio (p. ej., vidrio con poros controlados), polisacáridos (p. ej., agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol de polivinilo y siliconas. En algunas realizaciones, en función del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (p. ej., una columna de cromatografía de afinidad).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «trastorno mediado por IgE» significa una afección o enfermedad que se caracteriza por la sobreproducción y/o hipersensibilidad a la inmunoglobulina IgE. Específicamente, se debería interpretar que incluye las afecciones asociadas a la hipersensibilidad anafiláctica y a las alergias atópicas, entre ellas, por ejemplo: asma, rinitis alérgica y conjuntivitis (fiebre del heno), eccema, urticaria, dermatitis atópica y alergias alimentarias. La afección fisiológica grave del choque anafiláctico causado por, p. ej., picaduras de avispa, mordeduras de serpiente, alimentos o medicación, también está englobada por el alcance de este término.

Generación de anticuerpos

El anticuerpo de partida u «madre» se puede preparar con los métodos disponibles en la técnica para generar tales anticuerpos. Esto métodos se conocen bien. Los métodos de ejemplo para generar el anticuerpo de partida se describen con más detalle en los apartados que vienen a continuación.

La afinidad de fijación del anticuerpo se determina antes de generar un anticuerpo de alta afinidad de la presente invención. De igual forma, el anticuerpo se puede someter a otros ensayos de actividad biológica, p. ej., para evaluar la eficacia como terapéutico. Tales ensayos se conocen bien en la técnica y dependen de la diana y del uso pretendido para el anticuerpo.

Para el cribado de anticuerpos que se fijan a un epítopo concreto (p. ej., los que bloquean la fijación de la IgE a su receptor de alta afinidad), se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado convencional, tal como el descrito en «Antibodies: A Laboratory Manual» (Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988)). Como alternativa, el mapeo de epítopos se puede realizar para determinar si el anticuerpo se fija a un epítopo de interés. Facultativamente, la afinidad de fijación del anticuerpo por un homólogo de la diana utilizada para generar el anticuerpo (donde el homólogo es de una especie diferente) se puede valorar mediante los métodos conocidos en la técnica. Tal y como se describe en la presente memoria, la otra especie es un mamífero no humano al cual se administrará el anticuerpo en los estudios preclínicos. En consecuencia, la especie puede ser un primate no humano, tal como un macaco Rhesus, macaco cangrejero, mandril, chimpancé y macaco. De forma específica, la especie puede ser un roedor, gato o perro, por ejemplo.

El anticuerpo madre se altera de acuerdo con la presente invención para generar un anticuerpo que tiene una afinidad de fijación más alta o más fuerte por la diana que el anticuerpo original. El anticuerpo de alta afinidad resultante tiene una afinidad de fijación por la diana que es de al menos aproximadamente 10 veces más alta, o al menos aproximadamente 20 veces más alta, o al menos aproximadamente 500 veces más alta, o puede ser 1000 a 5000 veces más alta que la afinidad de fijación del anticuerpo original (madre) por la diana. El grado de realce de la afinidad de fijación necesaria o deseada dependerá de la afinidad de fijación inicial del anticuerpo madre.

En general, el método para fabricar anticuerpos de alta afinidad a partir de un anticuerpo madre implica las siguientes etapas:

1.

Obtener o seleccionar un anticuerpo madre que se fija a la diana de interés, que comprende dominios variables de las cadenas ligera y pesada. Esto se puede realizar mediante técnicas de hibridoma tradicionales, técnicas de exposición de fagos o cualquier otro método con el que se genere un anticuerpo específico de una diana.

2.

Seleccionar una secuencia flanqueante cuya secuencia sea cercana a la de la región flanqueante madre, preferiblemente una secuencia molde de humano. Este molde se puede elegir basándose en, p. ej., su longitud global comparativa, el tamaño de las CDR, los restos aminoacídicos localizados en la unión entre la secuencia flanqueante y las CDR, homología global, etc. El molde elegido puede ser una mezcla de más de una secuencia o puede ser un molde consenso.

3.

Generar una genoteca de clones mediante la realización de sustituciones aminoacídicas al azar en todas y cada una las posibles posiciones de las CDR. También se pueden sustituir aleatoriamente los aminoácidos

en el molde de secuencia flanqueante de humano que están, p. ej., adyacentes a las CDR o que pueden afectar a la fijación o al plegamiento, con todos los posibles aminoácidos, y generar así una genoteca de sustituciones en las secuencias flanqueantes. Estas sustituciones en las secuencias flanqueantes se pueden valorar por su posible efecto sobre la fijación a la diana y el plegamiento del anticuerpo. La

5 sustitución de aminoácidos en la secuencia flanqueante se puede realizar simultáneamente o bien secuencialmente a la sustitución de los aminoácidos en las CDR. Un método para generar la genoteca de variantes es mediante síntesis de oligonucleótidos.

4. Construir un vector de expresión que comprende las variantes de las cadenas pesada y/o ligera generadas en la etapa (3) que podría comprender las fórmulas: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 (I)

10 y FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 (II), en donde FRL1, FRL2, FRL3, FRL4, FRH1, FRH2, FRH3 y FRH4 representan las variantes de las secuencias flanqueantes del molde de las cadenas ligera y pesada elegidas en la etapa 3, y las CDR representan las CDR variantes de las CDR del anticuerpo madre. En la figura 1 se representa un ejemplo de un vector que contiene tales secuencias de las cadenas ligera y pesada.

15 5. Cribar la genoteca de clones contra la diana específica y los clones que se fijan a la diana se criban para detectar los que tienen mejorada la afinidad de fijación. Se podrían seleccionar los clones que se fijan con mayor afinidad que la molécula madre. El candidato óptimo de alta afinidad tendrá la afinidad de fijación más grande posible en comparación con el anticuerpo madre, preferiblemente de más de 20 veces, 100 veces, 1000 veces o 5000 veces. Si la variante elegida contiene determinados aminoácidos que son

20 indeseables, tal como un sitio de glucosilación que se ha introducido o un sitio inmunógeno en potencia, los aminoácidos se podrían reemplazar con más restos aminoacídicos beneficiosos y se volverá a valorar la afinidad de fijación.

También se puede utilizar este método para generar anticuerpos de alta afinidad a partir de un anticuerpo madre completamente humano mediante la sustitución aleatoria únicamente de las regiones CDR, y dejar intacta las

25 regiones flanqueantes de humano.

Debido a mejora de las técnicas de cribado de alta resolución y de los vectores tales como el descrito en la figura 1, un experto puede cribar con rapidez y eficacia una genoteca muy completa de sustituciones en todos los sitios de una CDR dada y/o de una región flanqueante. Mediante la sustitución aleatoria y simultánea de todos los aminoácidos en todas las posiciones, se pueden cribar las posibles combinaciones que incrementan

30 significativamente la afinidad que no se habría anticipado o identificado mediante la sustitución individual debido a, p. ej., la sinergia.

Preparación del anticuerpo madre

A. Preparación de la diana

Las dianas solubles o los fragmentos de las mismas se pueden utilizar como inmunógenos para generar anticuerpos.

35 El anticuerpo está dirigido contra la diana de interés. Preferiblemente, la diana es un polipéptido importante desde el punto de vista biológico, y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede dar lugar a un beneficio terapéutico en dicho mamífero. Sin embargo, los anticuerpos se pueden dirigir contra dianas no polipeptídicas. Cuando la diana es un polipéptido, puede ser una molécula transmembranaria (p. ej., receptor) o un ligando, tal como un factor de crecimiento. La diana de la presente invención es IgE. Se pueden

40 utilizar células completas como inmunógeno para fabricar los anticuerpos. La diana se puede producir de forma recombinante o se puede fabricar con métodos sintéticos. La diana también se puede aislar de una fuente natural.

Para las moléculas transmembranarias, tales como receptores, se pueden utilizar fragmentos de estos (p. ej., el dominio extracelular de un receptor) a modo de inmunógeno. Como alternativa, las células que expresan la molécula transmembranaria se pueden utilizar a modo de inmunógeno. Tales células se obtienen de una fuente natural (p. ej.,

45 líneas celulares de mastocitos) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para que expresen la molécula transmembranaria. Otras dianas y formas de las mismas y que resultan útiles para la preparación de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.

B. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se suelen generar en mamíferos no humanos mediante varias inyecciones subcutáneas

50 (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) de la diana pertinente en combinación con un adyuvante. Puede ser útil conjugar la diana pertinente a una proteína que es inmunógena en la especie a inmunizar, p. ej., la hemocianina de la lapa gigante. Se conocen bien en la técnica muchos agentes capaces de desencadenar una respuesta inmunógena.

Los animales se inmunizan contra la diana, conjugados inmunógenos o derivados mediante la combinación de la

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proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con el adyuvante completo de Freund y la inyección de la solución por vía intradérmica. Un mes después, a los animales se les da una inyección de refuerzo con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en el adyuvante incompleto de Freund mediante inyección subcutánea en varios sitios. De 7 a 14 días después, se desangran los animales y se les analiza el suero para titular el anticuerpo. A los animales se les da una inyección de refuerzo hasta que la titulación alcanza un valor estable.

El anticuerpo de mamífero seleccionado tendrá normalmente una afinidad de fijación suficientemente fuerte por la diana. Por ejemplo, el anticuerpo se puede fijar la diana anti-IgE de humano con un valor de afinidad de fijación (Kd) de aproximadamente 1 × 10–8 M. La afinidad de los anticuerpos se puede determinar mediante lfijación hasta saturación; inmunoensayo enzimático (ELISA); y ensayos de competición (p. ej., radioinmunoensayos).

Para cribar los anticuerpos que se fijan a la diana de interés, se puede realizar un ensayo de fijación cruzada convencional, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Como alternativa, se puede realizar el mapeo de epítopos, p. ej., como el descrito en Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995), para determinar la fijación.

C. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos que reconocen un único sitio antigénico. Su especificidad uniforme hace que los anticuerpos monoclonales sean mucho más útiles que los anticuerpos policlonales, que normalmente contienen anticuerpos que reconocen muchos sitios antigénicos diferentes. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975),

o se pueden hacer mediante métodos de ADN recombinante.

En el método del hibridoma, un ratón y otro animal hospedador adecuado, tal como un roedor, se inmuniza como está descrito más arriba, para inducir linfocitos que producen, o son capaces de producir, anticuerpos que se fijarán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma mediante el uso de un agente de fusión idóneo, tal como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, págs. 590-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma así preparadas se inoculan y se hacen crecer en un medio de cultivo idóneo que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan con eficacia, soportan la producción estable de anticuerpos en gran cantidad desde las células productoras del anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito las líneas celulares de mieloma de humano y de heteromieloma de humano y ratón (Kozbar, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Mononoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. Nueva York, 1987)).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución límite y se pueden hacer crecer mediante métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, págs. 59-103, Academic Press, 1986)). Están incluidos los medios de cultivo idóneos para este propósito. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan idóneamente del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de la inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla con facilidad y se secuencia con los procedimientos convencionales (p. ej., mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de fijarse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven de fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en los vectores de expresión que, a continuación, se transfieren al interior de células hospedadoras, tales como células de E. coli, células NS0, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, mediante la sustitución de las secuencias murinas por la secuencia codificante homóloga de los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de humanos (patente de los EE. UU. n.º 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851 (1984) o mediante la unión covalente al polipéptido de inmunoglobulina.

D. Anticuerpos humanizados

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La humanización es una técnica para fabricar un anticuerpo quimérico en donde sustancialmente menos que un dominio variable intacto de humano ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. Un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos aminoacídicos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos restos aminoacídicos no humanos a menudo se denominan restos de «importación», que típicamente se toman de un dominio variable de «importación». La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechman et al., Nature,

332: 323-327 (1988); Verhoeyens et al,. Science 239: 1534-1536 (1988)), al sustituir las secuencias de CDR no humanas o las secuencias de CDR por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano (véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.º 4.816.567). Tal y como se pone en práctica en la presente invención, el anticuerpo humanizado podría tener algunos restos de CDR y algunos restos de FR sustituidos por los restos de los sitios análogos en los anticuerpos murinos.

La elección de los dominios variables de humano, tanto de cadena ligera como de la pesada, a utilizar para fabricar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la capacidad antigénica. De acuerdo con el denominado método de «mejor ajuste», la secuencia del dominio variable de un anticuerpo no humano se compara con la colección de las secuencias conocidas de dominios variables de humano. La secuencia de humano que está más cercana a la del anticuerpo madre no humano se acepta a continuación como la región flanqueante de humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Clothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)). Otro método utiliza una región flanqueante concreta procedente de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligera o pesada. La misma región flanqueante se pude utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 (1993)).

E. Fragmentos de anticuerpo

Se han desarrollado diferentes técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenían por la digestión proteolítica de los anticuerpos intactos (véase, p. ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992), y Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se producen ahora directamente mediante células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de una genoteca de anticuerpos en fagos. Como alternativa, los fragmentos F(ab')2-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y se puede conjugar químicamente para formar los fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otra estrategia, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente del cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el experto en la técnica. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena única (scFv) (solicitud de patente PCT WO 93/16185).

Preparación de anticuerpos de alta afinidad

Una vez que el anticuerpo madre se ha identificado y se ha aislado, se alteran uno o más restos aminoacídicos en una o más de las regiones variables del anticuerpo madre. Como alternativa, o además, se pueden introducir una o más sustituciones de restos de las regiones flanqueantes en el anticuerpo madre, que dan lugar a una mejoría de la afinidad de fijación del anticuerpo, por ejemplo, por la IgE de humano. Los ejemplos de restos de la región flanqueante a modificar incluyen los que se fijan no covalentemente, de forma directa, a la diana (Amit et al. Science

233: 747-753 (1986)); interaccionan con/efectúan la conformación de la CDR (Clothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901917 (1987)); y/o participan en la interfaz de VL-VH (patente europea EP 239 400 B1). En determinadas realizaciones, la modificación de uno o más de tales restos de las regiones flanqueantes da lugar a que mejore la afinidad de fijación del anticuerpo por la diana de interés.

Las modificaciones de las propiedades biológicas de los anticuerpos se pueden cumplir mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente por su efecto a la hora de mantener, p. ej., (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal; (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones no conservativas entrañarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de la secuencia aminoacídica se preparan mediante una serie de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o específica de sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de casete de una variante preparada antes o una versión no variante del anticuerpo en función de la especie. El método preferido para generar variantes es una síntesis mediada por oligonucleótidos. Tal y como se describe en la presente memoria, la variante de anticuerpo solo tendrá sustituciones de restos en una única región hipervariable, p. ej., de aproximadamente dos a aproximadamente quince sustituciones en la región hipervariable.

Un método para generar la genoteca de variantes es mediante la síntesis mediada por oligonucleótidos de acuerdo

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aísla con facilidad y se secuencia mediante los procedimientos convencionales (p. ej., con sondas oligonucleotídicas que son capaces de fijarse específicamente a los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de la variante de anticuerpo).

Hay disponibles muchos vectores. Los componentes de vectores incluyen por lo general uno o varios de lo siguiente: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o varios genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

El vector de expresión en fagos descrito en la figura 1 comprende un vector M13 utilizado con frecuencia y una señal de secreción vírica del gen III del propio M13 para la secreción y el cribado rápidos de los Fab variantes según los criterios adecuados de especificidad de fijación y afinidad mínima. Este vector no utiliza la secuencia completa del gen III, por lo que no hay exposición en la superficie de la célula bacteriana, sino que más bien los Fab se secretan al espacio periplásmico. Como alternativa, los Fab se podían expresar en el citoplasma y aislar de él. Las cadenas ligera y pesada tienen su propia señal de secreción vírica, pero su expresión depende de un único promotor fuerte e inducible.

El vector de la figura 1 también proporciona una etiqueta de His y una etiqueta myc para facilitar tanto la purificación como la detección. Un experto en la técnica reconocerá que los Fab se pueden expresar de forma independiente a partir de promotores diferentes, o que la señal de secreción necesaria no tiene que ser la secuencia vírica elegida, sino que podría ser una secuencia señal eucariota o procariota idónea para la secreción de los fragmentos de anticuerpo desde la célula hospedadora elegida. También se debe reconocer que las cadenas ligera y pesada pueden residir en diferentes vectores.

A. Componente de secuencia señal

La variante de anticuerpo de esta invención se puede producir de manera recombinante. La variante también se puede expresar como un polipéptido de fusión fusionado con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo amino maduro de la proteína o polipéptido. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferiblemente una que se reconoce y procesa (a saber, que escinde la peptidasa señal) en la célula hospedadora. Para las células hospedadoras procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal del anticuerpo nativo, la secuencia señal puede se puede sustituir por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes termoestables de la enterotoxina II. O en el caso del vector de la figura 1, la secuencia señal elegida era una secuencia señal vírica del gen III. Para la secreción desde la levadura, la secuencia señal nativa se puede sustituir por, p. ej., el líder de la invertasa de la levadura, líder del factor α (que incluye los líderes del factor α de Saccharomyces y de Kluyveromyces) o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en, p. ej., la solicitud de patente internacional WO 90/13646. Para la expresión en las células de mamífero están disponibles las secuencias señal de mamífero, así como los líderes de secreción víricos, por ejemplo, la señal de la gD del herpes simple. El ADN para tal región precursora está ligado en fase al marco de lectura del ADN que codifica la variante del anticuerpo.

B. Componente de origen de replicación

Los vectores normalmente contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una

o varias células hospedadoras seleccionadas. Por lo general, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico hospedador e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias se conocen bien en muchas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es idóneo para la mayoría de bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2μ es idóneo para la levadura y diferentes orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de células de mamífero. Por lo general, el componente del origen de replicación no se necesita para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 típicamente se podría utilizar solo porque contiene el promotor temprano).

C.

Componente del gen para selección

Los vectores pueden contener un gen para selección, también denominado un marcador de selección. Los genes para selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxótrofas, o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles en los medios complejos, p. ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa para los bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Estas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y, así pues, sobreviven al tratamiento de selección. Los ejemplos de selección dominante utilizan los

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fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores de selección idóneos para las células de mamífero son los que permiten la identificación de las células competentes para la toma del ácido nucleico del anticuerpo, tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína I y II, preferiblemente genes de primate de la metalotioneína, de la adenosina desaminasa, de la ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de la DHFR. Una célula hospedadora idónea cuando se emplea la DHFR de tipo silvestre es la línea de células de ovario de hámster chino (CHO) que carece de la actividad de la DHFR.

Como alternativa, las células hospedadoras (en particular las hospedadoras de tipo silvestre que contienen la DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo, proteína DHFR de tipo silvestre y otro marcador de selección, tal como la aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), se pueden seleccionar mediante el crecimiento celular en el medio que contiene un agente de selección para el marcador de selección, tal como un antibiótico aminoglucosídico, p. ej., kanamicina, neomicina o G418 (patente de los EE. UU. n.º 4.965.199).

Un gen para selección idóneo para ser usado en la levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282: 39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa variante de la levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n.º 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics 85: 12 (1977). A continuación, la presencia de la lesión de trp1 en el genoma de la célula hospedadora de la levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De igual forma, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan mediante los plásmidos que se sabe que llevan el gen Leu2.

D. Componente promotor

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está operativamente unido al ácido nucleico del anticuerpo. Los promotores idóneos para ser usados con los hospedadoras procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de la β-lactamasa y la lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son idóneos otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para el uso en los sistemas bacterianos también pueden contener una secuencia de Shine-Dalgamo (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica el anticuerpo.

Se conocen secuencias promotoras para los eucariotas. Virtualmente, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases secuencia arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases secuencia arriba del comienzo de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan idóneamente en los vectores de expresión para eucariotas.

Ejemplos de secuencias promotoras idóneas para ser usadas con los hospedadores de la levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores para la levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de que se transcriben controlados por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas al metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores idóneos para ser usados para la expresión en la levadura se describen con más detalle en la patente europea EP 73 657. Los potenciadores para la levadura también se utilizan ventajosamente con los promotores para la levadura.

La transcripción del anticuerpo desde los vectores en las células hospedadoras de mamífero está controlada, por ejemplo, por los promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como el virus del polioma, virus de la difteroviruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y lo más preferiblemente el virus 40 del simio (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamíferos, p. ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, de

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promotores de choque térmico, siempre y cuando tales promotores sean compatibles con los sistemas de las células hospedadoras.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen ventajosamente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene ventajosamente como un fragmento de restricción de HindIII E. Un sistema para expresar el ADN en los hospedadores de mamífero que utilizan el virus del papiloma bovino como vector se describe en la patente de los EE. UU. n.º 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de los EE. UU. n.º 4.601.978. Como alternativa, el ADNc del interferón β de humano se ha expresado en las células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Como alternativa, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous se puede utilizar a modo de promotor.

E. Componente del elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo de esta invención en los eucariotas superiores a menudo se incrementa por la introducción de una secuencia potenciadora en el vector. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína α e insulina). Sin embargo, típicamente, se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 del lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma del lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) o elementos potenciadores para la activación de los promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición en 5' o 3' de la secuencia codificante del anticuerpo, pero se localiza preferiblemente del lado 5' del promotor.

F. Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en las células hospedadoras eucariotas (células de levadura, hongos, insecto, vegetales, animales, de humano o nucleadas de otros organismos pluricelulares) puede también contener las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias suelen estar disponibles desde las regiones sin traducir en 5', y de vez en cuando en 3', de los ADN o los ADNc eucariotas

o víricos. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica el anticuerpo. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase, p. ej., la solicitud de patente internacional WO 94/11026.

Selección y transformación de las células hospedadoras

Las células hospedadoras idóneas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente memoria son células procariotas, de levadura o de eucariotas superiores. Los procariotas idóneos para este propósito incluyen organismos tanto gramnegativos como grampositivos, por ejemplo, enterobacterias tales como E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia y Shigella, así como los bacilos, Pseudomonas y Streptomyces. Un hospedador de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son idóneas. Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes.

Además de los procariotas, los microorganismos eucariotas tales como los hongos filamentosos o la levadura son hospedadores idóneos para la clonación o la expresión de los vectores que codifican el anticuerpo. Saccharomyces cerevisiae es el utilizado con más frecuencia como microorganismo hospedador entre los eucariotas inferiores. Sin embargo, muchos otros géneros, especies y cepas están corrientemente disponibles y son útiles en la presente memoria, tales como Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces; Candida; Trichoderma; Neurospora crassa; y hongos filamentosos tales como p. ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y hospedadores de Aspergillus, tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedadoras idóneas para la expresión de los anticuerpos glucosilados proceden de organismos pluricelulares. En principio, se puede trabajar con cualquier cultivo de células eucariotas superiores, tanto si es de cultivo de vertebrados como de invertebrados. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células vegetales y de insectos, Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds. Vol 8, págs. 277-279 (Plenam Publishing 1986); Mseda et al., Nature 315, 592-594 (1985). Se han identificado muchas cepas y variantes baculovíricas y las correspondientes células hospedadoras de insectos permisivas de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Están disponibles públicamente una serie de cepas víricas para la transfección, p. ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus se pueden utilizar como el virus en la presente memoria de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de las

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células de Spodoptera frugiperda. Además, los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también se pueden utilizar como hospedadores.

Las células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados, en cultivo (cultivo de tejidos), se ha convertido en un procedimiento cotidiano. Véase Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, eds. (1973). Ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos útiles son de riñón de mono; línea de riñón embrionario de humano; células de riñón de cría de hámster; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón; células de carcinoma cervical de humano (HELA); células de riñón de perro; células de pulmón de humano; hepatocitos de humano; tumor mamario de ratón; y células NS0.

Las células hospedadoras se transforman con los vectores descritos más arriba para la producción de anticuerpos y se cultivan en un medio de nutrientes convencional modificado como sea adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células hospedadoras utilizadas para producir la variante de anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en muchos medios diferentes. Los medios disponibles en el mercado, tales como F10 de Ham (Sigma), medio mínimo esencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) son idóneos para cultivar las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enzymol.

58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), patentes de los EE. UU. n.os 4.767.704, 4.657.866, 4.560.655, 5.122.469, 5.712.163 o 6.048.728 se pueden utilizar como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede complementar cuando sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruros de X, donde X es sodio, calcio, magnesio y fosfatos), tamponantes (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCINTM), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos que suelen estar presentes en concentraciones finales del intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario se puede incluir en concentraciones adecuadas que deberían conocer los expertos en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares son las utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

Purificación de los anticuerpos

Al utilizar técnicas recombinantes, la variante de anticuerpo se puede producir de forma intracelular, en el espacio periplásmico o se puede secretar directamente al medio. Si la variante de anticuerpo se produce dentro de la célula, como una primera etapa, el residuo particulado, bien de células hospedadoras o de fragmentos de la lisis, se puede retirar, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. En Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) se describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan en el espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF, por su nombre en inglés) durante aproximadamente 30 minutos. El residuo celular se puede retirar por centrifugación. Cuando la variante de anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se suelen concentrar primero con un filtro para concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración de Amicon o de Millipore Pellicon. En cualquiera de las etapas anteriormente dichas se puede incluir un inhibidor de proteasas, tal como el PMSF, para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes inesperados.

La composición de anticuerpos preparada a partir de las células se puede purificar con el uso de, por ejemplo, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, en donde la cromatografía de afinidad es la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de aquel dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en la variante de anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar los anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas de IgG1, IgG2 o IgG4 de humano (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para las IgG3 de humano (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es agarosa en la mayoría de los casos, pero están disponibles otras matrices. Las matrices estables desde el punto de vista mecánico, tales como el vidrio de poros controlados o el poli(estirenodivinil)benceno, permiten una velocidad de flujo más rápida y un tiempo de procesamiento más corto que los que se consiguen con la agarosa. Cuando la variante de anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) es útil para la purificación. Según la variante de anticuerpo a recuperar, están también disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía de SEPHAROSETM en una resina de intercambio de aniones o de cationes (tales como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio.

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Después de cualquier etapa o etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende la variante de anticuerpo de interés y los contaminantes se puede someter a una cromatografía de interacción hidrófoba a pH bajo que utiliza un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferiblemente realizada a concentración salina baja (p. ej., una sal a partir de aproximadamente 0 a 0,25 M).

Formulaciones farmacéuticas

Se pueden preparar formulaciones terapéuticas del polipéptido o anticuerpo para la conservación como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mediante la mezcla del polipéptido que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes «farmacéuticamente aceptables» optativos que se emplean típicamente en la técnica (que se denominan en conjunto «excipientes»). Por ejemplo, los tamponantes, estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y otro surtido de aditivos (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.ª edición, A. Osol, Ed. (1980)). Tales aditivos no deben ser tóxicos para los destinatarios en las dosis y concentraciones empleadas.

Los tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Preferiblemente, están presentes a una concentración que oscila de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los tamponantes idóneos para ser usados con la presente invención incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos, tales como tampones de citrato (p. ej., mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (p. ej., mezcla de ácido succínico y succinato monosódico, mezcla de ácido succínico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico y succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (p. ej., mezcla de ácido tartárico y tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico y tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico e hidróxido de sodio, etc.), tampones de fumarato (p. ej., mezcla de ácido fumárico y fumarato monosódico, etc.), tampones de fumarato (p. ej., mezcla de ácido fumárico y fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico y fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico y fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (p. ej., mezcla de ácido glucónico y gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico y gluconato de potasio, etc.), tampón de oxalato (p. ej., mezcla de ácido oxálico y oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico y oxalato de potasio), tampones de lactato (p. ej., mezcla de ácido láctico y lactato de sodio, mezcla de ácido láctico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico y lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (p. ej., mezcla de ácido acético y acetato de sodio, mezcla de ácido acético e hidróxido de sodio, etc.). Adicionalmente, se pueden mencionar tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina, tales como Tris.

Se pueden añadir conservantes para retrasar el crecimiento microbiano, y se pueden añadir en cantidades que oscilan del 0,2% al 1% (p/v). Los conservantes idóneos para ser usados con la presente invención incluyen fenol, alcohol bencílico, metacresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros (p. ej., cloruro, bromuro, yoduro) de benzalconio, cloruro de hexametonio, parabenos de alquilo tales como metil-o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.

Los isotonificantes a veces conocidos como «estabilizantes» se pueden añadir para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente invención e incluyen alcoholes de azúcares polihídricos, preferiblemente alcoholes de azúcares superiores o trihídricos, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.

Los estabilizantes hacen referencia a una categoría amplia de excipientes que pueden oscilar en función de un agente voluminador a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a impedir que se desnaturalice o que se adhiera a la pared del contenedor. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcares polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, entre ellos ciclitoles, tales como el inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglucolato de sodio, tioglicerol, α-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de baja masa molecular (a saber, < 10 restos); proteínas tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como monosacáridos de polivinilpirrolidona, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacáridos tales como rafinosa; polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizantes pueden estar presentes en el margen de 0,1 a 10.000 pesos por parte del peso de la proteína activa.

Los tensioactivos o detergentes no iónicos (también denominados «humectantes») se pueden añadir para ayudar a solubilizar los agentes terapéuticos, así como para proteger la proteína terapéutica frente a la agregación inducida por la agitación, lo que también permite que la formulación se exponga a tensiones superficiales de cizalla sin que se provoque la desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos idóneos incluyen los polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles Pluronic®, monoéteres de polioxietileno y sorbitano (Tween®-20,

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Tween®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en el margen de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Otro surtido de excipientes incluye los voluminadores (p. ej., almidón), quelantes (p. ej., EDTA), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes. La formulación de la presente memoria también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación concreta que se quiere tratar, preferiblemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable dar a conocer adicionalmente un agente inmunosupresor. Tales moléculas están idóneamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para los propósitos para los que se diseñaron. Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante las técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de introducción de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remingon's Pharmaceutical Sciences, 16.ª edición, A. Osal, Ed. (1980).

Las formulaciones para ser usadas para la administración in vivo deben estar estériles. Esto se consigue con facilidad, por ejemplo, mediante la filtración a través de membranas de filtración para esterilidad. Se pueden preparar preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos idóneos de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la variante de anticuerpo, en donde dichas matrices se encuentran en la forma de artículos conformados, p. ej., películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (patente de los EE. UU. n.º 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-Lglutamato, acetato de vinilo-etileno no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glucólico, tales como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico y ácido glucólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(–)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el acetato de etileno y vinilo, y ácido láctico-ácido glucólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante un espacio de tiempo más breve. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo periodo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo que da lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenia. Se pueden concebir estrategias racionales para la estabilización en función del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es por la formación de un enlace S-S intermolecular a través de intercambios tiodisulfuro, la estabilización se puede conseguir por modificación de los restos sulfhidrilo, mediante la liofilización a partir de soluciones ácidas, mediante el control del contenido de humedad, mediante el uso de los aditivos adecuados, y mediante el desarrollo de composiciones matriciales poliméricas específicas.

La cantidad de polipéptido, anticuerpo o fragmento del mismo terapéutico que será eficaz para el tratamiento de un trastorno o afección en concreto dependerá de la naturaleza del trastorno o de la afección, y se puede determinar mediante las técnicas clínicas estándares. Cuando sea posible, es deseable que se determine la curva de respuesta en función de la dosis y las composiciones farmacéuticas de la invención primero in vitro y luego en sistemas modelo de animales, antes de comprobarlo en los humanos.

Preferiblemente, se administra una solución acuosa del polipéptido, anticuerpo o fragmento del mismo terapéutico por inyección subcutánea. Cada dosis puede oscilar de aproximadamente 0,5 µg a aproximadamente 50 µg por kilogramo de masa corporal, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 µg a aproximadamente 30 µg por kilogramo de masa corporal.

La pauta posológica de la administración subcutánea puede variar desde una vez al mes a diaria, en función de una serie de factores clínicos, entre los que se encuentra el tipo de enfermedad, la intensidad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al fármaco terapéutico.

Usos para la variante de anticuerpo

Las variantes de anticuerpo de la invención se pueden usar como agentes de purificación por afinidad. En este procedimiento, los anticuerpos se inmovilizan sobre una fase sólida, tal como la resina Sephadex™ o un filtro de papel, mediante los métodos bien conocidos en la técnica. La variante de anticuerpo inmovilizada se pone en contacto con una muestra que contiene la diana a purificar y, a partir de entonces, el soporte se lava con un solvente idóneo que retira sustancialmente todo el material de la muestra, salvo la diana a purificar, que está fijada a la variante de anticuerpo inmovilizada. Finalmente, se lava el soporte con otro solvente idóneo, tal como tampón de glicina, que liberará la diana de la variante de anticuerpo.

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La fijación del anticuerpo a la IgE de humano asociada a la subunidad α del FcεRI se determinó mediante la incubación previa con la IgE de humano a 10 μg/ml durante 30 min a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces y después se incubaron durante una hora con diferentes concentraciones de los Acm murinos anti-IgE de humano E10-10 o la variante humanizada de Fab. La fijación de los Fab se detectó con un anticuerpo anti-Fd de humano 5 marcado con biotina seguido de SA-HRP. El Ac murino E10-10 se detectó mediante el Ac de cabra anti-Fc de Ig murina conjugado a HRP.

Ejemplo 10 Caracterización de clones

A cada candidato se le ensayó la afinidad de fijación y se secuenciaron los clones positivos. Las variantes de anticuerpo que tienen mutaciones beneficiosas en las regiones CDR que incrementan la afinidad de fijación se

10 caracterizaron adicionalmente. Los ensayos incluían el análisis por Biacore; la inhibición de la fijación de la IgE a su receptor; y la fijación cruzada de la IgE fijada al receptor.

Se creó una genoteca de variantes. Las secuencias aminoacídicas de las diferentes CDR que mostraban una mejora de la afinidad se describen en la tabla 1. En la figura 7 se presentan los candidatos de alta afinidad que tienen combinaciones de sustituciones.

15 TABLA 1.

CDRL1:

CDRH1:

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SEQ ID n.º 5 imagen15 SEQ ID n.º 15

imagen16

SEQ ID n.º 6 imagen17 SEQ ID n.º 16

imagen18

SEQ ID n.º 7 imagen19 SEQ ID n.º 17

CDRL2:

CDRH2:

imagen20

SEQ ID n.º 8 imagen21 SEQ ID n.º 18

imagen22

SEQ ID n.º 9 imagen23 SEQ ID n.º 19

imagen24

SEQ ID n.º 10 imagen25 SEQ ID n.º 20

imagen26

SEQ ID n.º 11 imagen27 SEQ ID n.º 21

imagen28

SEQ ID n.º 12 imagen29 SEQ ID n.º 22

CDRL3:

imagen30 SEQ ID n.º 23

imagen31

SEQ ID n.º 13 imagen32 SEQ ID n.º 24

#1 QQSWSWPTT

SEQ ID n.º 14 imagen33 SEQ ID n.º 25

CDRH3:

imagen34

SEQ ID n.º 26

imagen35

SEQ ID n.º 27

imagen36

SEQ ID n.º 28

imagen37

SEQ ID n.º 29

P = madre (original) En la figura 9 se presentan 19 variantes de la cadena pesada y en la figura 8 se presentan 35 variantes de la cadena ligera. A 3 candidatos se les caracterizó adicionalmente la afinidad de fijación y se presentan en la tabla 2. 20 TABLA 2: Afinidad de fijación

Acm

Kd Veces que se incrementa la afinidad de fijación

TES-C21

614 ± 200 pM

Acm 1 (CL-5A)

0,158 pM 3886

imagen38

imagen39

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imagen41

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2