ES2568071T3

ES2568071T3 - Dianas novedosas de Acinetobacter baumannii

Info

Publication number: ES2568071T3
Application number: ES12794646.5T
Authority: ES
Inventors: Simon Urwyler; Markus Haake; Michael Rudolf
Original assignee: Aridis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aridis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2032-11-29
Also published as: CA2857423A1; US20170304425A1; US10398767B2; AU2012344293A1; US20180193444A1; US20180193445A1; JP6538777B2; US20200016258A1; US9597387B2; JP2017210479A; US20150023999A1; US10420828B2; US20180214533A1; US10603373B2; US20180214535A1; US10098942B2; CA2857423C; CN106380510B; US10603372B2; JP2015501809A

Abstract

Una composición de vacuna que comprende al menos un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos representada en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15; b) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido codificado por el polinucleótido de (a), en el que dicho fragmento tiene actividad inmunoestimuladora; c) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos representada en una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 y que tiene actividad inmunoestimuladora; d) un polinucleótido que es al menos un 80 % idéntico al polinucleótido de (a), y que codifica un polipéptido que tiene actividad inmunoestimuladora; e) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas al polinucleótido de uno cualquiera de (a) a (d) que codifica un polipéptido que tiene actividad inmunoestimuladora; f) un polinucleótido que es complementario a la longitud completa de un polinucleótido de cualquiera de (a) a (d) que codifica un polipéptido que tiene actividad inmunoestimuladora; y en la que dicho polipéptido deriva del género Acinetobacter.

Description

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se compararon con otros 13 genomas secuenciados. En el caso del antígeno AB031, únicamente se usó el bucle extracelular L1 para la comparación. Tabla 2 Conservación de identidad de aminoácidos por diversas cepas de A. baumannii

Diana: AB307 AB056 AB057 AB058 AB059 SDF AYE ATCC17978 ATCC19606 ACICU AB900 6013113 6013150 6014059

AB023: 100% 100% 100% 100% 100% 99% 100% 99% 99% 100% 99% 100% 99% 100%

AB024: 100% 100% 100% 100% 100% 86% 100% 99% 99% 99% 99% 100% 100% 99%

AB025: 100% 100% 100% 100% 100% 90% 100% 93% 91% 91% 88% 100% 100% 91%

AB030: 100% 100% 100% 100% 100% 99% 100% 99% 99% 99% 99% 100% 100% 99%

AB031 L1*: 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 97% 100% 100% 100%

FimA: 100% 100% 100% 100% 100% - 100% 74% 100% 100% 94% 100% 100% 100%

CsuAB: 100% 100% 100% 100% 100% - 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

OmpA: 100% 100% 100% 100% 100% 89% 100% 93% 94% 93% 93% 99% 99% 93%

* bucle comparado únicamente

- ningún homólogo detectado

El alto grado de identidad de aminoácidos de las proteínas en diversas cepas de A. baumannii muestra la amplia especificidad de las proteínas antigénicas y confirma su alto valor terapéutico. La alta prevalencia de los genes indica que la proteína es importante, posiblemente esencial, durante el ciclo de vida de las bacterias. Por lo tanto, probablemente la proteína se expresa durante la infección. El alto grado de conservación apunta a incrementos en la probabilidad de inducir una respuesta inmunitaria o de identificar un anticuerpo policlonal o monoclonal que se puede unir a la mayoría de o posiblemente a todas las cepas de A. baumannii clínicamente pertinentes. Adicionalmente, el alto grado de conservación de aminoácidos indica que las mutaciones de estos genes son infrecuentes, lo que reduce de esta manera las probabilidades de rescatar mutantes durante el tratamiento terapéutico.

La presente invención proporciona una composición de vacuna como se define en el presente documento en la que dicha composición de vacuna comprende adicionalmente un adyuvante y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El término "adyuvante" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia distinta del antígeno diana que puede incrementar la respuesta antigénica. El adyuvante se puede seleccionar de adyuvantes de Freund (completo e incompleto), adyuvante de Gerbu (GERBU Biotechnik GmbH, Alemania), micobacterias, tales como BCG,

M. vaccae o Corynebacterium parvum, toxina colérica o toxoide tetánico, toxina termolábil de E. coli, mezclas de quil-saponina, tales como QS-21 (SmithKline Beecham), MF59 (Chiron) y diversas emulsiones aceite/agua (por ejemplo, IDEC-AF), MALP-2, ISCOM. Otros adyuvantes que se pueden usar incluyen, pero no están limitados a: sales minerales o geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; tensioactivos, tales como Iisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, hemocianinas de lapa californiana y dinitrofenol, moléculas inmunoestimuladoras, tales como saponinas, derivados de tripétidos y muramil dipéptidos, tramos cortos de ácido nucleico, tales como dinucleótidos CpG, oligonucleótidos CpG, monofosforil lípido A, y polifosfacenos, adyuvantes particulados y microparticulados, tales como emulsiones, liposomas, virosomas, partículas similares a virus, cocleatos, o adyuvantes de complejos inmunoestimulantes. Las citocinas también son útiles debido a sus propiedades estimuladoras de linfocitos. Muchas citocinas útiles para dichos propósitos serán conocidas por un experto en la técnica, incluyendo interleucina 2 (IL-2), IL-12, GM-CSF y muchas otras. Además, son adecuados ligandos de la familia de las quimiocinas, tales como RANTES, una lipoproteína, un lipopéptido, un componente de la pared celular de levaduras, un ARN bicatenario, un lipopolisacárido (LPS) de la superficie celular bacteriana, flagelina, un ARN vírico monocatenario rico en U, un ARN interferente pequeño supresor de la señalización de citocinas (ARNip SOCS), un epítopo Pan DR (PADRE) y mezclas de los mismos.

La definición de "excipiente farmacéuticamente aceptable" pretende englobar cualquier excipiente que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no sea tóxico para el huésped al que se administra.

Por consiguiente, se pueden usar uno o más polipéptidos de la invención o fragmentos, análogos y derivados funcionales de los mismos para preparar una vacuna profiláctica o terapéutica para su administración a una persona

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Tabla 3

Análisis Shedome: Proteómica comparativa Identificación de dianas específicas

Números totales de dianas potenciales: > 3500 genes anotados en genomas de A. baumannii

Selección experimental: Determinación del proteoma de hidrolizado tripsínico de A. baumannii viva Determinación del proteoma de preparaciones de membrana externa de 5 cepas de A. baumannii diferentes Comparación de 2DE inmunotransferencias de preparaciones de membrana externa de 2 cepas de A. baumannii diferentes usando sueros de pacientes.

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1.º selección in silico Proteínas identificadas por 5 cepas: N/A 363 N/A

2.º selección in silico Predicción de TI: - Proteínas extracelulares - Proteínas de membrana externa con epítopos localizados en la superficie.: 7 30 5

3.º selección in silico Si están disponibles, datos de la bibliografía: 3 6 4

predicción de TI: -alta prevalencia de genes -alta conservación de secuencias de aminoácidos

Dianas seleccionadas: FimA, CsuAB, OmpA AB023, AB024, AB025, AB030, AB031, OmpA AB023, AB024, AB025, OmpA

Se realizó la predicción de TI como sigue: se realizó la detección de homología entre proteínas y la predicción de

5 estructuras mediante comparación HMM-HMM usando la herramienta informática en línea HHpred (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred), Söding J., p.951-960, (2005) usando la base de datos HMM pdb70_3Sep11, HHblits como procedimiento de generación MSA con 3 iteraciones como máximo y Modo de alineamiento local.

La tabla 4 muestra los homólogos estructurales de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 como se determina mediante 10 análisis del banco de datos.

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Tabla 4

Antígeno SEQ ID NO:: ID de proteína1 Consulta HMM2 Plantilla HMM2 Probabilidad3 [%] Valor de E4 Valor de P5 Descripción de la plantilla1

AB023 SEQ ID NO: 2: 2wjr 2o4v 346-417 52-417 29-95 32-411 93,0 92,4 0,25 6,6 9,9E-06 0,00026 NanC-Porin (E.coli) OprP-Porin (P. aeruginosa)

AB024 SEQ ID NO: 4: 2zfg 2fgq 97-435 100-435 7-340 3-332 99,7 99,5 4E-12 9E-11 1,6E-16 3,5E-15 OmpF-Porin (E. coli) Omp32-Porin (D. acidovorans)

AB025 SEQ ID NO: 6: 2o4v 2qtk 116-439 144-474 60-411 88-389 96,3 90,4 0,79 14 3,1E-05 0,00054 OprP-Porin (P. aeruginosa) Opdk-Porin (P. aeruginosa)

AB030 SEQ ID NO: 8: 2qdz 3efc 269-906 241-543 10-554 79-375 100,0 100,0 1,4E-45 2,5E-31 0 9,9E-36 FahC-Omp85 (P. pertussis) YaeT- Omp85 (E.coli)

AB031 SEQ ID NO: 10: 1ek9 1yc9 42-485 42-486 2-409 34-440 100,0 100,0 4,2E-45 1,7E-44 0 0 ToIC-canal (E.coli) Vcec-canal (V.cholerae)

FimA SEQ ID NO: 12: 2jmr 2jty 21-177 16-177 2-155 1-159 100,0 99,9 4,2E-30 1,1E-27 1,6E-34 4,3E-32 FimF-tipo I Pili (E.coli) FimA-tipo I Pili (UP-E.coli)

CsuAB SEQ ID NO: 14: 3me0 1ze3 40-180 38-180 8-127 1-121 98,3 97,8 1,4E-05 0,000 43 5,6E-10 1,7E-08 PapD-tipo I Pili (E.coli) FimD-tipo I Pili (E.coli)

OmpA SEQ ID NO: 16: 3nb3 2kg w 1-345 208-335 1-344 1-128 100,0 100,0 0 1,6E-28 0 6,2E-33 OmpA-(E.coli) Ompatb-(M.tuberculosis)

1: ID de proteína de homólogo estructural (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Wang Y, et al., Nucleic Acid Res. 2007 Jan; 35 (ejemplar de base de datos): D298-300.) que incluye una breve descripción (nombre, función, especie) en la última columna. 2: HMM: modelo oculto de Markov. Las secuencias de aminoácidos que producen homología entre la consulta y la plantilla. El número indica las posiciones de la secuencia de aminoácidos en la consulta (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16) o plantilla (ID de proteína) que produce homología. 3: Probabilidad: "probabilidad de la plantilla de ser un verdadero positivo". 4: Valor de E: "Valor esperado. El valor de E y el valor de P se calculan sin tener en cuenta la estructura secundaria. El valor de E da el número promedio de falsos positivos ('resultados incorrectos') con una puntuación mejor que la de la plantilla cuando se realiza un barrido de la base de datos. Es una medida de la fiabilidad: los valores de E cercanos a 0 significan un resultado muy fiable, un valor de E de 10 quiere decir que se espera encontrar aproximadamente 10 resultados incorrectos en la base de datos con una puntuación al menos tan buena como esta". 5: Valor de P: "El Valor P es el valor de E dividido por el número de secuencias en la base de datos. Es la probabilidad de que en una comparación por parejas un resultado erróneo puntúe al menos tan bien como este".

Cualquiera de los polipéptidos con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 tiene actividad inmunoestimuladora.

5 La tabla 5 se refiere a la expresión de los polipéptidos antigénicos de la invención en cepas aisladas clínicas de A. baumannii. Se incluyeron en el estudio un total de 36 cepas aisladas clínicas de sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, pus y aspirados traqueales de pacientes ingresados en el hospital. Dichas cepas aisladas clínicas (ejemplo 1.1.4) se usaron para aislar lisados bacterianos o sobrenadante de cultivo precipitado que se sometieron a prueba después de

10 electroforesis en gel mediante análisis de inmunotransferencia. Para la detección de cada polipéptido antigénico se usó el antisuero de conejo correspondientes (ejemplo 5).

La tabla 5 muestra los porcentajes y el número real de cepas aisladas clínicas de A. baumannii en las que cualquiera de los polipéptidos antigénicos individuales identificados (diana) demostró estar presente o ausente mediante análisis 15 de inmunotransferencia en las preparaciones de sedimentos celulares bacterianos.

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conocidos en la técnica.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se aplican para el tratamiento de enfermedades provocadas por A. baumannii en infecciones, tales como septicemia, neumonía, bronquitis crónica, infecciones locales que incluyen heridas infectadas e infecciones invasivas de articulaciones, principalmente en pacientes inmunodeficientes y/o en pacientes con función respiratoria deteriorada. Las composiciones farmacéuticas están destinadas adicionalmente, pero no limitadas a, la profilaxis y/o tratamiento de infecciones adquiridas en el hospital (nosocomiales). Puesto que las principales víctimas de infecciones por A. baumannii son pacientes intubados, víctimas con quemaduras, pacientes en unidades de cuidados intensivos médicas y/o quirúrgicas, pacientes con sida y cáncer, pacientes inmunodeficientes, pacientes inmunodeprimidos, pacientes diabéticos, personal militar, personal de lucha armada y personal de soporte asociado, así como toxicómanos por vía intravenosa, las composiciones farmacéuticas están destinadas en particular a la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades provocadas por A. baumannii en dicho grupo de pacientes.

La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente fármacos antibióticos.

Las composiciones farmacéuticas comprenden el polipéptido antigénico o el anticuerpo en un intervalo de concentración de 0,1-30 mg/kg de peso corporal.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera conocida, tal como administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, tópica, intranasal, o como pulverización de inhalación.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende el polipéptido antigénico o el anticuerpo como se define anteriormente para detectar una infección bacteriana en un paciente. La detección de una infección bacteriana, en particular, una infección bacteriana provocada por A. baumannii de acuerdo con la invención, se puede realizar sobre ADN bacteriano aislado, o directamente a partir de muestras clínicas como expectoración, lavado broncoalveolar o aspiración traqueal, normalmente después de la dilución en H2O ultrapura. Son preferentes muestras obtenidas directamente a partir de un lavado pulmonar de un ser humano, tal como un paciente humano con un trastorno pulmonar. Las muestras clínicas también pueden incluir materiales corporales, tal como sangre, suero sanguíneo, orina, tejidos y similares. Típicamente, las muestras se pueden tomar a partir de herida, quemadura, infecciones urinarias y pulmonares de seres humanos o mamíferos. Los polipéptidos antigénicos de la invención se pueden usar para analizar los anticuerpos en sueros sanguíneos. Los anticuerpos son adecuados para la detección del polipéptido antigénico (dianas), por ejemplo, en una muestra clínica. El alto valor como una herramienta de diagnóstico de los polipéptidos antigénicos o el anticuerpo específico para los mismos se demuestra en la tabla 1 y figura 3.

La presente invención proporciona un anticuerpo policlonal o monoclonal para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección bacteriana en un mamífero.

Preferentemente, el mamífero es un ser humano. El anticuerpo se usa preferentemente para el tratamiento y/o prevención en el que la infección bacteriana está provocada por A. baumannii, lo más preferentemente esta infección es adquirida en el hospital.

Las áreas de enfermedad que en la actualidad aceptan especialmente tratamientos basados en anticuerpos incluyen cáncer, regulación errónea del sistema inmunitario e infección. Dependiendo de la enfermedad y la biología de la diana, los anticuerpos usados para el tratamiento -anticuerpos terapéuticos- pueden tener diferentes mecanismos de acción. Un anticuerpo monoclonal terapéutico se puede unir y neutralizar la función normal de una diana. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que bloquea la actividad de la proteína necesaria para la supervivencia de una célula cancerosa provoca la muerte celular. Otro anticuerpo monoclonal terapéutico se puede unir y activar la función normal de una diana. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal se puede unir a una proteína en una célula y desencadenar una señal de apoptosis. Finalmente, si un anticuerpo monoclonal se une a una diana expresada únicamente en un tejido enfermo, la conjugación de una carga útil tóxica (agente eficaz), tal como un agente radiactivo o quimioterápico, al anticuerpo monoclonal puede crear un proyectil guiado para administración específica de la carga útil tóxica al tejido enfermo, lo que reduce el daño al tejido sano.

Los anticuerpos profilácticos protegen de o previenen la propagación o aparición de la enfermedad o infección

Un anticuerpo definido por su estructura/secuencia potencialmente tiene función profiláctica y terapéutica dependiendo del momento de la administración.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un polipéptido para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección bacteriana en un mamífero codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos representada en una cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15;

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Tabla 6

Cepa: Especie Referencia Fuente

ATCC19606: A. baumannii Hugh R., Reese R. Int. J. Syst. Bacteriol. 17:245-254, 1967 Prof. Luis Actis, Miami University, Department of Microbiology, 40 Pearson Hall Oxford, Ohio 45056

OmpA KO: A. baumannii Gaddy, J. A. et al., Infection and Immunity 77 (8), S. 3150-3160. (2009)

CsuE KO: A. baumannii Tomares, Microbiology, 154, 3398 (2008)

AYE: A. baumannii Vallenet et al., PLoS Profs. D. Raoult, M. Drancourt URMITE-CNRS UMR6236, Marsella Francia

SDF: A. baumannii One 3:E1805-E1805(2008))

ACICU: A. baumannii Iacono M., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 52:2616-2625(2008). Prof. Alessandra Carattoli Department for Infectious, Parasitic and Immune-Mediated Diseases, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena 299, 00161 Roma-Italia

Ruh134: A. baumannii Cepa aislada clínica Rotterdam, NL, 1982 Prof. L. Dijkshoorn, Leiden University Medical Centre, Leiden, NL

Ruh875: A. baumannii Cepa aislada clínica Dordrecht, NL, 1984

Berlín-95: A. baumannii Cepa aislada clínica Berlín, GE, 2006 Prof. Seifert, Institute of Medical Microbiology and Hygiene, Universidad de Colonia, Alemania

BMBF65: A. baumannii Cepa aislada clínica Singapur, 2004

AB-M: A. baumannii Eveillard, et al., Journal of Infection 60 (2), 154-161, 2010 Prof. Marie-Laure Joly Guillou, UFR Sciences pharmaceutiques et ingénierie de la santé 16, Bd Daviers, 49045, Angers, Francia

AB-NM: A. baumannii

SAN: A. baumannii

PA O11: P. aeruginosa ATCC 33358, Liu PV, et al. Int. J. Syst. Bacteriol. 33: 256-264, 1983

DH5alfa: E. coli Invitrogen

BL-21 (DE3): E. coli Novagen

NCBI: National Center for Biotechnology Information; ATCC: American Tissue Culture Collection, Virginia, USA1.1.3 Genomas de referencia de A. baumannii.

Se usaron varios genomas publicados para la identificación y caracterización de dianas identificadas, como se resume en la tabla 7.

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Tabla 7: Secuencias genómicas

Genoma de A. baumannii: Secuencia de referencia

ATCC19606: 1NZ_ACQB00000000

AYE: 1NC_010410

ACICU: 1NC_010611

SDF: 1NC_010400

AB307-0294: 1NC_011595

6014059: 1NZ_ACYS00000000

6013113: 1NZ_ACYR00000000

6013150: 1NZ_ACYQ00000000

AB0057: 1NC_011586

ATCC 17978: 1NC_009085

AB059: 1NZ_ADHB00000000

AB058: 1NZ_ADHA00000000

AB056: 1NZ_ADGZ00000000

AB900: 1NZ_ABXK00000000

1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome

1.1.3 Sueros de pacientes

5 Los sueros de paciente se recogieron en diversos hospitales. En estudios previos se describieron sueros de 20 pacientes (Pantophlet, R. et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7 (2), 293-295, (2000)) y se recibieron por parte del Prof. Seifert (Institute of Medical Microbiology and Hygiene, Universidad de Colonia, Alemania).

Adicionalmente se recogieron 57 sueros de pacientes de hospitales en Atenas (Grecia), Sevilla (España), Pittsburgh 10 (PE, EE. UU.) y Jerusalén (Israel). Se aplicaron los siguientes criterios de inclusión:

1. los pacientes tienen confirmada septicemia por A. baumannii, neumonía o herida infectada grave,

2. el estado de salud del paciente permite la extracción sanguínea y 15

3. que el paciente es un adulto de menos de 85 años de edad. Se excluyeron los pacientes con infección vírica confirmada (por ejemplo, hepatitis A, B o C, VIH), anemia o un sistema inmunitario deprimido. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado. Se recogieron sueros de donantes sanos del centro de donación de sangre de la Cruz Roja Suiza en Berna (Suiza).

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1.2 Enfoques para identificar dianas adecuadas

1.2.1 Análisis "Shedome"

25 El concepto de este procedimiento es identificar polipéptidos en la membrana de Acinetobacter, ya que son accesibles a moléculas grandes, tales como anticuerpos. De esta manera, las bacterias A. baumannii vivas se desprendieron con tripsina, una proteasa de 23 kDa, y se analizaron mediante espectrometría de masas (EM). Se asignaron los péptidos identificados a proteínas usando bases de datos públicas disponibles. Se puede esperar que, además de contaminantes de proteínas altamente abundantes y bacterias lisadas, el hidrolizado contenga péptidos derivados de

30 proteínas presentes en el lado extracelular de la membrana bacteriana.

1.2.1.1 Preparación de cultivos bacterianos

Se sembró en estrías la cepa de A. baumannii ATCC19606 en una placa de LBA y se incubó durante la noche

35 (16 h-24 h) a 37 ºC. La placa de LBA con colonias bacterianas visibles se mantuvo a 4 ºC durante hasta 1 mes. Como cultivo de partida, se inocularon 25 ml de LB usando colonias de A. baumannii de la placa de LBA y se incubó durante la noche a 37°C agitando a 200 rotaciones por minuto (rpm). Se midió la densidad óptica a 600 nm (DO600) del cultivo de durante la noche. Se inoculó LB (0,4 I) con cultivo de durante la noche a una DO600 de partida de 0,05 y se incubó a

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