ES2569121T3

ES2569121T3 - Uso de una neuregulina para tratar una lesión nerviosa cavernosa

Info

Publication number: ES2569121T3
Application number: ES10768844.2T
Authority: ES
Inventors: Anthony O. Caggiano; Anthony J. Bella; Jennifer F. Iaci
Original assignee: Acorda Therapeutics Inc
Current assignee: Acorda Therapeutics Inc
Priority date: 2009-10-14
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2016-05-06
Anticipated expiration: 2030-10-14
Also published as: RU2657770C1; KR102225480B1; CN104984322B; US20180311312A1; CN104984322A; US9078861B2; CN102596225B; IL219100A0; MX2012004386A; JP5832437B2; PL2488194T3; WO2011047183A2; KR20120084765A; KR20210025704A; JP2016065064A; PL3235504T3; AU2010306777A1; EP2488194B1; US20150216936A1; IL261561B

Abstract

Una neuregulina para uso en un método de prevención o tratamiento de una lesión del nervio cavernoso en un sujeto en riesgo de sufrir dicha lesión de un procedimiento médico o quirúrgico, en donde el método comprende administrar la neuregulina antes del procedimiento médico o quirúrgico.

Description

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(SEQ ID NO: 1) (Número de entrada del GenBank AAB59622)

En ciertos aspectos de la invención, un polipéptido de neuregulina o segmento del mismo es 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% idéntico u homólogo a la secuencia de aminoácidos de GGF2. En ciertos aspectos de la invención, un polipéptido tipo neuregulina es 75, 80, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% idéntico u homólogo a la secuencia de aminoácidos del dominio tipo EGF de GGF2.

Como se usa en el presente documento, una "proteína" o un "polipéptido" se refiere a una molécula que comprende al menos diez residuos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, la proteína comprende la totalidad o parte del polipéptido GGF2. En algunas realizaciones, se emplea una versión tipo salvaje de una proteína o polipéptido, sin embargo, en algunas realizaciones de la invención, se emplea una proteína modificada o polipéptido para tratar la lesión del nervio periférico. Los términos "péptido", "proteína" o "polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento. Por conveniencia, el término péptido se utiliza en el presente documento para referirse a secuencias de aminoácidos de cualquier longitud.

Un "péptido modificado" se refiere a un péptido cuya estructura química, en particular su secuencia de aminoácidos, se altera con respecto al péptido tipo salvaje respectivo. En algunas realizaciones, un péptido modificado tiene al menos un aminoácido modificado. En algunas realizaciones, un péptido modificado tiene al menos un D-aminoácido. En algunas realizaciones, un péptido modificado tiene al menos un aminoácido de origen no natural.

Sin limitación, en ciertas realizaciones, el tamaño de un péptido (de tipo salvaje o modificado) puede comprender cualquiera de (o cualquier intervalo derivable desde): 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 , 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230 , 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 422, moléculas de aminoácidos o más, y cualquier intervalo derivable en el mismo, de una secuencia de amino correspondiente descrita o referida en el presente documento; en una realización tales proteína, polipéptido o rango de tamaño es relativo a GGF2. Se contempla que los polipéptidos pueden mutarse por truncamiento del amino terminal o carboxi terminal, haciéndolos más cortos que su forma tipo salvaje correspondiente, sino que también pueden ser alterados fusionando o conjugando una secuencia de proteínas heterólogas con una función particular (por ejemplo, para la orientación o localización, para propósitos de purificación, etc.).

Como se usa en este documento, una "molécula de ácido amino" se refiere a cualquier aminoácido, derivado de aminoácido o mimético de aminoácido conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, los restos de la molécula de péptido son secuenciales, sin que ninguna molécula no-amino interrumpa la secuencia de restos de amino de la molécula. En otras realizaciones, la secuencia puede comprender uno o más restos de molécula no amino. En realizaciones particulares, la secuencia de restos de la molécula de péptido puede estar interrumpida por uno o más restos de molécula no amino.

Por consiguiente, la expresión "composición de péptido" comprende secuencias de aminoácidos; estos aminoácidos pueden ser cualquiera de los 20 aminoácidos comunes en las proteínas sintetizadas de forma natural o cualquier aminoácido modificado o inusual.

Las composiciones de péptidos se pueden preparar por cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, incluyendo (i) la expresión de péptidos a través de técnicas estándar de biología molecular, (ii) el aislamiento de compuestos peptídicos a partir de fuentes naturales o (iii) la síntesis química. El nucleótido, así como las secuencias de péptidos de determinados genes de neuregulina se han descrito anteriormente, y se pueden encontrar en bases de datos informatizadas reconocidas. Uno de estas bases de datos es la base de datos GenBank y GenPept del Centro Nacional de Información Biotecnológica (en Internet en ncbi.nlm.nih.gov/). Las regiones codificantes de estos genes pueden amplificarse y/o expresarse usando las técnicas descritas en el presente documento o técnicas tales como serían conocidas por los expertos normales en la técnica.

Los péptidos modificados pueden incluir variantes de sustitución, inserción o deleción. Las variantes de deleción típicamente carecen de uno o más residuos de la molécula de tipo salvaje o nativa. Los residuos individuales se pueden eliminar o un número de aminoácidos contiguos se pueden eliminar. Un codón de parada se puede introducir (por sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico que codifica para generar una proteína truncada. Los mutantes por inserción implican típicamente la adición de material en un punto no terminal en el

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microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, hasta aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable en el mismo. En los ejemplos no limitativos de un intervalo derivable de los números que aparecen en el presente documento, un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente de 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, etc., se puede administrar, en base a los números descritos anteriormente.

En cualquier caso, la composición puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Además, la prevención de la acción de los microorganismos puede ser provocada por conservantes tales como varios agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo, pero no limitados a los parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

Los productos farmacéuticos se pueden formular en una composición en una forma de base libre, neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición de péptido, o las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. También se pueden derivar de bases inorgánicas las sales formadas con los grupos carboxilo libres tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína.

En realizaciones en las que la composición está en una forma líquida, el vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que comprenda, pero no limitado a, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, etc.), lípidos (por ejemplo, triglicéridos, aceites vegetales, liposomas) y combinaciones de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un revestimiento, tal como lecitina; por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido por dispersión en vehículos tales como, por ejemplo, poliol líquido o lípidos; por el uso de tensioactivos tales como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa; o combinaciones de tales métodos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio o combinaciones de los mismos.

En ciertas realizaciones, las composiciones se preparan para su administración por vías tales como la ingestión oral. En estas realizaciones, la composición sólida puede comprender, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas (por ejemplo, cápsulas de gelatina cubiertas duras o blandas), formulaciones de liberación sostenida, composiciones bucales, trociscos, elixires, suspensiones, jarabes, obleas o combinaciones de los mismos. Las composiciones orales se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Los vehículos preferidos para la administración oral comprenden diluyentes inertes, vehículos comestibles asimilables o combinaciones de los mismos. En otros aspectos de la invención, la composición oral se puede preparar como un jarabe o un elixir. Un jarabe o elixir, y pueden comprender, por ejemplo, al menos un agente activo, un agente edulcorante, un conservante, un agente aromatizante, un colorante, un conservante o combinaciones de los mismos.

En ciertas realizaciones preferidas, la composición oral puede comprender uno o más aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes aromatizantes y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, la composición puede comprender uno o más de los siguientes: un aglutinante, tal como, por ejemplo, goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato dicálcico, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones de los mismos; un agente disgregante, tal como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico o sus combinaciones; un lubricante, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de los mismos; un agente aromatizante, tal como, por ejemplo menta, aceite de gaulteria, aroma de cereza, aroma de naranja, etc.; o combinaciones de los mismos de los anteriores. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, vehículos tales como un vehículo líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como revestimientos o para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, las píldoras o las cápsulas pueden revestirse con goma laca, azúcar o ambos.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando los compuestos activos de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, opcionalmente, con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, cuando se requiera, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, suspensiones o emulsiones, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío o liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a

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m de espesor. Las imágenes fueron tomadas usando un sistema de visualización y una cámara Infinity, seguido del análisis ciego de los recuentos de las células mejoradas con fluoro-oro. Después de esto, se seleccionaron al azar portaobjetos de muestras de GPP (10 por animal) y se llevaron a cabo recuentos de células para determinar el número de neuronas intactas. (Véase, por ejemplo, Dail, WG, Trujillo, D., de la Rosa, D. y Walton, G.: “Autonomic innervation of reproductive organs: analysis of the neurons whose axons project in the main penile nerve in the pelvic plexus of the rat”. Anat Rec, 224: 94, 1989; Laurikainen A, Hiltunen J O, S Vanhatalo, Klinge E, Saarma M: “Glial cell line-derived neurotrophic factor is expressed in penis of adult rat and retrogradely transported in penile parasympathetic and sensory nerves” (Cell Tissue Res 2000, 302: 321-9).

Por lo tanto, se trataba de un protocolo de rastreo retrógrado utilizando fluoro-oro. Los resultados de este protocolo presentaron información que indicaba que el tratamiento con neuregulina ayudaba a la regeneración y a la reproyección de su objetivo (los cuerpos cavernosos del pene) y/o a la neuroprotección de los nervios cavernosos.

Por consiguiente, se inyectó fluoro-oro en un órgano diana; en este caso, los cuerpos cavernosos del pene. A partir de entonces, se produjo la absorción de los terminales nerviosos del órgano final. Esta captación indica que las fibras nerviosas fueron conservadas y/o se reconvirtieron en el área inyectada. Una vez que hay absorción de fluorooro, el fluoro-oro se transporta de una manera retrógrada al axón del nervio y el marcador acumulado a las neuronas originales del GPP (ganglio pélvico principal).

La figura 3 muestra el marcaje de fluoro-oro representativo de los ganglios pélvicos principales (GPP) a partir de 3 animales por grupo de tratamiento ((grupo A) normal (grupo B) por aplastamiento, (grupo C) por aplastamiento + GGF2). Los animales normales (grupo A) muestran la cantidad de marcado retrógrado observada en ausencia de lesión del nervio. Los animales por aplastamiento (grupo B) muestran una drástica reducción en las fibras nerviosas intactas de la lesión, ya que el marcador de fluoro-oro no es capaz de transportar todo el camino de vuelta al GPP. Los animales por aplastamiento + GGF2 (grupo C) muestran un mayor número de células GPP marcadas con fluorooro, lo que indica que hay más fibras nerviosas conservadas presentes después de una lesión como resultado del tratamiento con GGF2.

La figura 4 proporciona una cuantificación de marcaje con fluoro-oro en el GPP. Los animales normales tienen un gran número de cuerpos celulares marcados en el GPP. Después de una lesión por aplastamiento, el número de células marcadas se reduce drásticamente, como consecuencia de los daños de las fibras nerviosas y la incapacidad resultante de transportar retrógradamente el marcador de nuevo al GPP. El tratamiento con GGF2 mejoró el número de fibras nerviosas intactas disponibles para transportar el fluoro-oro del tejido del pene al GPP de una manera retrógrada, lo que resultaba en un mayor número de células marcadas.

Ejemplo 3: Inmunohistoquímica

Se tiñeron criosecciones longitudinales de la parte proximal de los cuerpos para nNOS, VAChT. Todos los lavados se realizaron con tampón Tris que contenía 1% de Triton-X. Se bloquearon los tejidos 1 h con 5% de suero de cabra normal y después se incubaron durante la noche a 4ºC con, respectivamente:

a) nNOS (Sigma; 1/1000) o

b) VAChT (Abcam; 1/150) o

c) TH (Millipore; 1/5000).

Después de varios lavados, las secciones se incubaron durante 1 h en HRP de cabra anti-conejo y anti-cabra de burro (1/1000) y luego en una solución de DAB que contenía 0,2% de sulfato de amonio y níquel y peróxido de hidrógeno al 0,03% durante 10 min. Después del último lavado, las secciones fueron deshidratadas, despejadas en xileno y tapadas con cubreobjetos en Permount (Fisher Scientific).

Tinción con nNOS:

El óxido nítrico (NO) liberado de las placas terminales axonales de los nervios cavernosos dentro de los cuerpos cavernosos, junto con el NO endotelial, provoca la relajación del músculo liso, iniciando cambios hemodinámicos de la erección del pene, así como contribuyendo a una tumescencia mantenida. Se entiende actualmente que el retorno a la potencia después de la lesión a los nervios cavernosos es dependiente, al menos en parte, de la regeneración axonal en los tejidos neurales restantes y de si es exitosa la re-inervación funcional del órgano objetivo (permitiendo la activación neuronal por NO). Son observados cambios patobiológicos bien definidos en estudios con modelos animales de pene después de un compromiso del nervio cavernoso. Estos cambios patobiológicos pueden variar desde neuropraxia al daño axonal letal y pueden incluir la apoptosis del músculo liso, la apoptosis del endotelio, la reducción de la densidad de los nervios de la óxido nítrico sintasa (NOS), la sobre-regulación de las citoquinas fibroproliferativas tales como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß), la fibrosis del músculo liso o pérdida, o respuestas de señalización patobiológicas tales como la alteración de la proteína Sonic hedgehog.

Además, una ausencia crónica de la erección siguiente a una neuroapraxia nerviosa cavernosa durante la fase de recuperación prolongada se cree que acentúa el potencial de un mayor deterioro estructural del músculo liso

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La figura 6 proporciona una tinción representativa de los niveles de tirosina hidroxilasa (TH). Los resultados incluyen la tinción de tejidos normales (grupo A) y una pérdida significativa de la tinción de TH después de la lesión por aplastamiento del nervio cavernoso (grupo B). El panel C muestra la tinción de TH conservada de las terminaciones nerviosas cavernosos del pene en el corpus mejor corresponde a un aumento general en la conservación de la inervación del pene después de una lesión por aplastamiento con el tratamiento GGF2 (grupo C). La densidad de la tinción muestra tendencias hacia la conservación de la tinción con TH con el tratamiento de GGF2.

Ejemplo 4: Realizaciones alternativas

La lesión nerviosa periférica puede ocurrir en casi cualquier contexto quirúrgico. La probabilidad de que la lesión del nervio se correlaciona con la localización y la extensión de la disección de los tejidos en cualquier cirugía. Por ejemplo, la cirugía de mastectomía tiene complicaciones frecuentes que resultan de la lesión del nervio periférico, incluyendo entumecimiento de la axila y el brazo (por ejemplo, el daño de la lesión del nervio intercostobraquial), el aleteo de la escápula (el daño por la lesión del nervio torácico largo), la parálisis del músculo dorsal ancho (lesión a la lesión del nervio toracodorsal). (Véase Watt-Boolsen et al., 1988; Aitken y Minton, 1983).

En consecuencia, la neuregulina se utiliza ya sea antes, después o tanto antes como después de la mastectomía para limitar la lesión a los nervios y/o mejorar la recuperación de la función nerviosa periférica. Los pacientes programados para someterse a la mastectomía se tratan aproximadamente 24 horas antes de la cirugía con una cantidad apropiada de neuregulina. Opcionalmente, los pacientes también son tratados por un período de hasta aproximadamente 6 semanas o más, después de la cirugía, para mejorar la recuperación neural. En realizaciones alternativas, los pacientes sólo se tratan antes o sólo se tratan después de la cirugía. Como se ha señalado en el presente documento, la neuregulina se utiliza para prevenir la lesión de los nervios como consecuencia de cirugías de resección del tumor (prostatectomía, mastectomía, tiroidectomía, etc). Se observa que las neuregulinas han sido implicadas como promotores y como supresores de la formación de células tumorales y su crecimiento (Atlas et al., 2003; Chua et al., 2009). El tratamiento con neuregulina puede o no puede estar contraindicado en pacientes con ciertos tumores. Las neuregulinas se utilizan en pacientes con tumores erbB positivos sólo cuando los estudios de seguridad suficientes demuestren que las neuregulinas no potencian el crecimiento de dicho tumor.

Por otra parte, el tratamiento de la lesión de los nervios a partir de la cirugía no se limita a la mastectomía y la prostatectomía. La lesión del nervio se produce con frecuencia en cualquier cirugía que implique una disección y/o resección significativa. Estas cirugías pueden incluir, pero no están limitadas, a cirugía de las extremidades superiores, cirugía de la mano, cirugía/reemplazo de rodilla, cirugía/reemplazo de cadera, cirugía/reemplazo de codo, la disección del cuello para cirugía arterial y venosa, cirugía de tiroides, amigdalectomía, cirugía del pie y de la mano. La lesión del nervio periférico es común en la cirugía de la pelvis, abdominal y la cirugía colorrectal. La lesión de los nervios también ocurre con las cirugías orales y faciales.

Además de la lesión directa en los nervios a través de la disección y la resección en la cirugía, la lesión del nervio frecuentemente resulta de la compresión o estiramiento de los nervios durante la cirugía debido a la posición del paciente, la compresión en los puntos de contacto o de las cortinas, las restricciones, clips, cinta o cualquier otro objeto que pueda comprimir el tejido. Estos pueden ser inevitables resultados de la cirugía o el resultado de una técnica inadecuada. Independientemente de cuál sea el ajuste o la etiología de la lesión del nervio periférico, se encuentra que las neuregulinas previenen y/o tratan dichas lesiones.

En los seres humanos, los ensayos clínicos muestran la eficacia de NRG para la prevención y el tratamiento de la lesión del nervio periférico con los datos de la evaluación de la función sensorial y/o motora de las regiones nerviosas afectadas con frecuencia en pacientes que son tratados con neuregulina o con un control de placebo. Por ejemplo, el entumecimiento de la axila puede ser probado por métodos neurológicos estándar de la función sensorial incluyendo pruebas de alodinia, hiperalgesia o agudeza umbral sensorial (la discriminación de dos puntos). Estos métodos son estándar en el campo. Los pacientes son seguidos por un período de varios meses después de la cirugía y las comparaciones estadísticas hechas entre los grupos de pacientes tratados con neuregulina y los tratados con un control. De conformidad con estas rutas, se encuentra que el tratamiento con NRG antes y/o después de un evento quirúrgico previene y/o trata la lesión del nervio periférico evaluado.

Ensayos análogos a los anteriores también evalúan en una fuerza motora similar, la amplitud de movimiento y la coordinación. De conformidad con estos ensayos, se encuentra que el tratamiento con NRG antes y/o después de un evento quirúrgico previene y/o trata la lesión del nervio periférico que resulta en el deterioro en una o más de la fuerza motora, la amplitud de movimiento o la coordinación.

Claims

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