ES2569513T3

ES2569513T3 - Anticuerpos antimesotelina y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2569513T3
Application number: ES08855189.0T
Authority: ES
Inventors: Antje Kahnert; David Light; Doug SCHNEIDER; Renate Parry; Noboru Satozawa; Tara Renee HEITNER HANSEN; Stefan Steidl; Ulrike Schubert
Original assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Current assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2008-11-19
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2028-11-19
Also published as: KR101559599B1; KR20100097660A; DOP2010000150A; CN101952319A; HK1148541A1; HN2010001062A; DK2215121T3; CY1117437T1; US20110027268A1; ECSP10010191A; JP2014221064A; JP2018102311A; US20180258181A1; IL205681A0; GT201000148A; CA2706529A1; CR11456A; HUE027358T2; US20150259433A1; BRPI0819909B1

Abstract

Un anticuerpo humano aislado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región de unión a antígeno que es específica para la mesotelina de SEC ID N°: 370, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo reconoce un epítopo de mesotelina que no está enmascarado por el antígeno canceroso 125 (CA125) y en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo se internaliza dentro de células que expresan mesotelina y tiene una región de unión a antígeno, en el que la región de unión del anticuerpo incluye una HDCR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en la que: a) HCDR1 es la SEC ID Nº: 5, b) HCDR2 es la SEC ID Nº: 39, c) HCDR3 es la SEC ID Nº: 71, d) LCDR1 es la SEC ID Nº: 103, e) LCDR2 es la SEC ID Nº: 133 y f) LCDR3 es la SEC ID Nº: 169.

Description

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región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 345 (ADN)/SEC ID N°: 259 (proteína). MF-24 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 303 (ADN)/SEC ID N°: 217 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 346 (ADN)/SEC ID N°: 260 (proteína). MF-25 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 304 (ADN)/SEC ID N°: 218 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 347 (ADN)/SEC ID N°: 261 (proteína). MF-27 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 305 (ADN)/SEC ID N°: 219 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 348 (ADN)/SEC ID N°: 262 (proteína). MF-73 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 306 (ADN)/SEC ID N°: 220 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 349 (ADN)/SEC ID N°: 263 (proteína). MF-78 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 307 (ADN)/SEC ID N°: 221 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 350 (ADN)/SEC ID N°: 264 (proteína). MF-84 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 308 (ADN)/SEC ID N°: 222 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 351 (ADN)/SEC ID N°: 265 (proteína). MF-101 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 309 (ADN)/SEC ID N°: 223 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 352 (ADN)/SEC ID N°: 266 (proteína). MF-230 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 310 (ADN)/SEC ID N°: 224 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 353 (ADN)/SEC ID N°: 267 (proteína). MF-236 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 311 (ADN)/SEC ID N°: 225 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 354 (ADN)/SEC ID N°: 268 (proteína). MF-252 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 312 (ADN)/SEC ID N°: 226 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 355 (ADN)/SEC ID N°: 269 (proteína). MF-275 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 313 (ADN)/SEC ID N°: 227 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 356 (ADN)/SEC ID N°: 270 (proteína). MF-423 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 314 (ADN)/SEC ID N°: 228 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 357 (ADN)/SEC ID N°: 271 (proteína). MF-427 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 315 (ADN)/SEC ID N°: 229 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 358 (ADN)/SEC ID N°: 272 (proteína). MF-428 representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 316 (ADN)/SEC ID N°: 230 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 359 (ADN)/SEC ID N°: 273 (proteína). MF-C representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 317 (ADN)/SEC ID N°: 231 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 360 (ADN)/SEC ID N°: 274 (proteína). MF-I representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 318 (ADN)/SEC ID N°: 232 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 361 (ADN)/SEC ID N°: 275 (proteína). MF-M representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 319 (ADN)/SEC ID N°: 233 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 362 (ADN)/SEC ID N°: 276 (proteína). MF-P representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 320 (ADN)/SEC ID N°: 234 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 363 (ADN)/SEC ID N°: 277 (proteína). MF-Q representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 321 (ADN)/SEC ID N°: 235 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 364 (ADN)/SEC ID N°: 278 (proteína). MF-S representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 322 (ADN)/SEC ID N°: 236 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 365 (ADN)/SEC ID N°: 279 (proteína). MF-U representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 323 (ADN)/SEC ID N°: 237 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 366 (ADN)/SEC ID N°: 280 (proteína). MF-V representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 324 (ADN)/SEC ID N°: 238 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 367 (ADN)/SEC ID N°: 281 (proteína). MF-W representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 325 (ADN)/SEC ID N°: 239 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 368 (ADN)/SEC ID N°: 282 (proteína). MF-Y representa un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada correspondiente a la SEC ID N°: 326 (ADN)/SEC ID N°: 240 (proteína) y una región variable de la cadena ligera correspondiente a la SEC ID N°: 369 (ADN)/SEC ID N°: 283 (proteína).

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que se unen a epítopos de mesotelina, cuya secuencia de aminoácidos está representada por la SEC ID N°: 370, que son distintos al epítopo de mesotelina reconocido por MabK1

En el presente documento se desvelan anticuerpos que se unen a uno o más aminoácidos de los epítopos de los anticuerpos MF-J o MF-T. En ciertos aspectos, dichos anticuerpos se unen a al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis aminoácidos de los epítopos de los anticuerpos MF-J o MF-T. Los

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Generación de anticuerpos

Para aislar anticuerpos monoclonales humanos específicos de mesotelina y de alta afinidad se usó una biblioteca de despliegue en fagos de anticuerpos sintéticos (Knappik, A., y col., J. Mol. Biol. (2000) 296(1):57), mediante una combinación de inmunofijaciones de células enteras y de detección selectiva de proteínas y a través del desarrollo de herramientas específicas. Estas herramientas y procedimientos incluyen una línea celular recombinante que expresa mesotelina y el desarrollo de procedimientos de inmunofijacion y ensayos de detección selectiva capaces de identificar anticuerpos que se unen, de forma preferencial, a la mesotelina desplegada en la superficie celular y que presentan reactividad cruzada frente a la mesotelina de otras especies.

Mediante una combinación de tres enfoques no convencionales en la tecnología de despliegue en fagos (PDT) se descubrieron anticuerpos frente al marcador de superficie celular del cáncer mesotelial, mesotelina. En primer lugar se construyó una línea celular recombinante que expresa el dominio de 40 kDa unido a la membrana de mesotelina mediante transfección estable de células CHO-K1 con un plásmido que codifica la parte del extremo C terminal anclada a GPI de la proteína (SEC ID: 371) para dar la línea celular CHO-A9. En segundo lugar, con esta última línea celular recombinante y con la línea de células de cáncer escamoso NCI-H226 se realizaron selecciones de superficie celular dobles alternantes. Se incluyó preadsorcion con células CHO-K1 para evitar la selección de fragmentos Fab que se unen a epítopos de las células parentales. Se realizaron selecciones adicionales con mesotelina humana purificada recombinante y soluble (única fuente de "MF-24", "MF-25" y "MF-27") con mesotelina murina recombinante, con mesotelina desglicosilada purificada (única fuente de "MF-5" y "MF-8") y con mesotelina biotinilada en fase soluble. En tercer lugar, se desarrollaron procedimientos de detección selectiva que permitieron la detección selectiva sucesiva de los resultados de los fagos obtenidos en el cribado sobre células NCI-H226 enteras así como con células CHO-A9. La combinación de estos procedimientos específicos permitió el aislamiento de los anticuerpos únicos "MF-J", "MF-226", "MF-A", "MF-T", "MF-1", "MF-5", "MF-8", "MF-24", "MF-25", "MF-27", "MF-73", "MF-78", "MF-84", "MF-101", "MF-230", "MF-236", "MF252", "MF-275", nMF-423", "MF-427", "MF-428", MF-C", "MF-I", "MF-L", "MF-M" "MF-P" "MF-Q" MF-S" "MF-U" "MF-V" "MF-W" y "MF-Y".

Estos anticuerpos únicos se caracterizaron además mediante su afinidad de unión en dos ELISAS celulares, mediante unión BIAcore a mesotelina soluble, mediante su capacidad para reconocer diferentes epítopos sobre mesotelina soluble y mediante su capacidad para la reacción cruzada con la mesotelina murina evaluado mediante FACS e inmunotransferencia, y su capacidad para internalizarse en tres diferentes ensayos basados en células. Dos de los ensayos de internalización midieron de forma cuantitativa la internalización de anticuerpos antimesotelina radiomarcados, bien en ausencia o bien en presencia de un anticuerpo secundario a la IgG humana. Este dato se usó para seleccionar cuatro anticuerpos para la maduración adicional de la afinidad. Con el fin de obtener anticuerpos con una sólida unión invariante a diferentes formas de mesotelina expresadas en diferentes líneas celulares cancerosas, para incrementar la reactividad cruzada de las especies y para incrementar adicionalmente la afinidad y disminuir las tasas de disociación se diseñó una estrategia para la maduración de la afinidad. La maduración de la afinidad se realizó con los anticuerpos 'MF-J', 'MF-226', 'MF-L' y 'MF-A'. La maduración de la afinidad incluyo la generación de nuevos repertorios de anticuerpos mediante el intercambio de H-CDR2, LCDR3, o una combinación de las regiones H-CDR2 y L-CDR3 de los anticuerpos parentales. Se realizaron selecciones alternantes con las dos líneas celulares cancerosas que expresan mesotelina NCI-H226 y OVCAR-3, así como mesotelina humana biotinilada y purificada y murina en solución usando perlas magnéticas. Se obtuvo mayor rigurosidad mediante la reducción gradual del antígeno y la extensión del procedimiento de lavado.

La detección selectiva se realizó, primero ordenando los aciertos por afinidad decreciente, determinada en perlas recubiertas con antígeno en solución, midiendo una serial electroquimioluminiscente en una estación de trabajo M384 (BioVeris). Posteriormente, una selección resultante de aglutinantes de alta afinidad se sometió a detección selectiva con titulación de la solución al equilibrio (SET) (Haenel, C, y col., Anal. Biochem. (2005) 339(1): 182). Los mejores aglutinantes se sometieron a detección selectiva adicional mediante el análisis de la reactividad cruzada a la mesotelina murina, así como para la unión a la mesotelina en células NCI-H226 mediante FACS. La combinación de estos procedimientos específicos permitió el aislamiento de los anticuerpos únicos "MOR07265”, “MOR06631” “MOR 06635", “MOR06669”, “MOR07111”, “MOR06640”, “MOR06642”, “MOR06643”, “MOR06626”, “MOR06638” y “MOR06657”.

Variantes peptídicas

Una variante puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo que tiene al menos una región determinante de la complementariedad (CRD) (hipervariable) y/o dominio/posición estructural (FR) (variable) alterados con respecto a una secuencia peptídica desvelada en el presente documento. Para ilustrar mejor este concepto a continuación se presenta una breve descripción de la estructura del anticuerpo.

Un anticuerpo está compuesto por dos cadenas peptídicas, cada una de las cuales contiene un (cadena ligera) o tres (cadena pesada) dominios constantes y una región variable (VL, VH), la última de las cuales esta, en cada caso, formada por cuatro regiones FR y tres CDR intercaladas. El sitio de unión a antígeno está formado por una o más CDR, aunque las regiones FR proporcionan la región marco conservada estructural de las CDR y, por tanto, desempeñan un papel importante en la unión al antígeno. Alterando uno o más restos de aminoácidos en una región CDR o FR, el experto generará de forma rutinaria secuencias de anticuerpos mutadas o diversificadas, que se

pueden someter a detección selectiva frente al antígeno, para, por ejemplo, nuevas o mejores propiedades.

Las tablas 3 (VH) y 4 (VL) delinean las regiones CDR y FR para ciertos anticuerpos de los descritos en el presente documento y comparan aminoácidos en una posición dada entre sí y con las correspondientes secuencias de consenso o "génicas maestras" (tal como se describe en la patente de EE.UU. N° 6.300.064):

Tabla 3: Secuencias de VH

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Tabla 4: Secuencias VL

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estructural que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para garantizar el mantenimiento del vector y, si se desea, para proporcionar la amplificación dentro del huésped. Entre los huéspedes procariotas adecuados se incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus.

Los vectores bacterianos pueden ser por ejemplo, vectores basados en bacteriófagos, plásmidos o fagémidos. Estos vectores pueden contener un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que normalmente contienen elementos del bien conocido vector de donación pBR322 (ATCC 37017). Tras la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular adecuada, el promotor seleccionado de desreprime/induce mediante medios adecuados (p. ej., cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Normalmente las células se recogen mediante centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante se conserva para su posterior purificación.

En los sistemas bacterianos, de forma ventajosa se pueden seleccionar una serie de vectores de expresión en función del uso previsto para la proteína que se exprese. Por ejemplo, cuando se ha de producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de anticuerpos o para la detección selectiva en bibliotecas peptídicas, pueden ser deseables, por ejemplo, vectores que dirijan la expresión de niveles elevados de productos proteicos de fusión que se purifiquen fácilmente.

Procedimientos terapéuticos

Los procedimientos terapéuticos implican administrar a un sujeto que necesite tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contemplado por la invención. En el presente documento, una cantidad "terapéuticamente eficaz" se define como la cantidad de un anticuerpo que es suficiente cantidad para eliminar las células positivas a mesotelina en un área tratada de un sujeto, bien en forma de monodosis o de acuerdo con un régimen de dosis múltiples, solo o en combinación con otros agentes, la cual produce el alivio de una afección adversa, y que, además, dicha cantidad es toxicológicamente tolerable. El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano (p. ej. conejo, rata, ratón, mono u otro primate de orden inferior).

Un anticuerpo de la invención podría administrarse de forma conjunta con medicamentos conocidos y, en algunos casos, el anticuerpo podría estar modificado. Por ejemplo, un anticuerpo podría estar conjugado con una inmunotoxina o radioisótopo para, potencialmente, aumentar adicionalmente la eficacia.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar como herramienta terapéutica o diagnostica en diversas situaciones en las que, de forma no deseada, se expresa o se encuentra mesotelina. Los trastornos y afecciones particularmente adecuados para tratamiento con un anticuerpo de las invenciones son cáncer pancreático, cáncer de ovarios, mesotelioma y cáncer de pulmón.

Para tratar cualquiera de los trastornos anteriores, las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular de un modo convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Un anticuerpo de la invención se puede administrar por cualquier medio adecuado, que puede variar en función del tipo de trastorno que se esté tratando. Las posibles vías de administración incluyen las vías parenteral (p. ej., intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal, o subcutánea), intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento inmunosupresor local, administración intralesional. Además, un anticuerpo de la invención podría administrarse mediante infusión en pulsos con, por ejemplo, dosis decrecientes del anticuerpo. Preferentemente, la dosis se administra mediante inyecciones, más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. La cantidad que se va a administrar dependerá de diversos factores, tales como los síntomas clínicos, el peso del individuo, si se administran otros fármacos. El experto en la técnica reconocerá que la vía de administración variara dependiendo del trastorno o afección que se vaya a tratar.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz del nuevo polipéptido, de acuerdo con esta invención, dependerá en gran medida de las características concretas del paciente, la vía de administración y la naturaleza del trastorno que se esté tratando. Guías generales se pueden encontrar en, por ejemplo, las publicaciones de la Conferencia Internacional sobre Armonización y en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 y 28, pág. 484-528 (18ª ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Más específicamente, la determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz dependerá de factores tales como toxicidad y eficacia del medicamento. La toxicidad se puede determinar usando procedimientos bien conocidos en la técnica y encontrados en las referencias anteriores. La eficacia se puede determinar utilizando las mismas guías junto con los procedimientos descritos más adelante en los ejemplos.

Procedimientos diagnósticos

Los anticuerpos frente a la mesotelina se pueden usar para detectar la presencia de tumores que expresan mesotelina. La presencia de células que contienen mesotelina dentro de diversas muestras biológicas, incluidas

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Kits

La divulgación se relaciona, además con paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más envases llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas en lo que antecede. Asociados con dichos contenedores puede haber una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, que refleje la aprobación por parte de la agencia, de la fabricación, uso o venta del producto para su administración en seres humanos.

En otra forma de realización, los kits pueden contener secuencias de ADN que codifican los anticuerpos. Preferentemente, las secuencias de ADN que codifican estos anticuerpos se proporcionan en un plásmido adecuado para la transfección y expresión en una célula huésped. El plásmido puede contener un promotor (a menudo un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula huésped. El plásmido puede también contener sitios de restricción adecuados para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN en el plásmido para producir diversos anticuerpos. Los plásmidos pueden también contener otros numerosos elementos para facilitar la clonación y la expresión de las proteínas codificadas. Dichos elementos son bien conocidos para el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcadores seleccionables, codones de iniciación, codones de terminación y similares.

Fabricación y almacenamiento.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de un modo conocido en la técnica, por ejemplo por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, formación de grageas, trituración, emulsión, encapsulación, inmovilización o liofilización.

La composición farmacéutica puede proporcionarse en forma de una sal y se puede formar con ácidos, incluidos, pero no limitándose a, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que son las correspondientes formas de base libre. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado en histidina 1 mM-50 mM, sacarosa 0,1 %-2 %, manitol 2 %-7 % a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5 que se combina con tampón antes de usar.

Después de que se han preparado las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención en un vehículo aceptable, pueden introducirse en un contenedor adecuado y etiquetarse para el tratamiento de una afección para la que están indicadas. Para la administración de anticuerpos frente a mesotelina, dicho etiquetado incluiría cantidad, frecuencia y procedimiento de administración.

Dosis terapéuticamente eficaz

Composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar el propósito previsto, es decir el tratamiento de un estado de enfermedad concreto que se caracteriza por la expresión de mesotelina. La determinación de una dosis eficaz entra bien en de la capacidad de los expertos en la técnica.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente, bien en ensayos de cultivo celular, por ejemplo células neoplasias, o en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se usa para alcanzar un intervalo de concentración y vía de administración deseados. Tal información se puede usar después para determinar dosis y vías de administración útiles en seres humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de proteína o sus anticuerpos, antagonistas o inhibidores que mejoran los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse en forma del cociente DE50/DL50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que exhiben índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se usan en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano La dosificación de dichos compuestos reside, preferentemente, dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.

El medico individual escoge la dosificación exacta según el paciente que va a tratar. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del resto activo o para mantener el efecto deseado. Entre los factores adicionales que se pueden tener en cuenta se incluyen la gravedad de la enfermedad, por ejemplo el tamaño y la localización del tumor; la edad, el peso y el sexo del paciente, la dieta, la hora y la frecuencia de administración, la(s) combinaciones de fármacos, las sensibilidades de la reacción y la tolerancia/respuesta al tratamiento. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada podrían administrarse cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y el índice de aclaramiento de la formulación concreta.

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Las cantidades de dosificación normales varían de 0,1 a 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, en función de la vía de administración. En la bibliografía se proporcionan guías en cuanto a dosificaciones y procedimientos de liberación. Véanse las patentes de EE.UU. n° 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Los expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para polinucleótidos y para proteínas o sus inhibidores. De forma similar, la liberación de polinucleótidos o polipéptidos será específica de células, afecciones, localización etc. concretas. Actividades específicas preferidas para un anticuerpo radiomarcado pueden variar de 0,1 a 10 mCi/mg de proteína (Riva y col., Clin. Cancer Res. 5:3275s-3280s, 1999; Wong y col., Clin. Cancer Res. 6:3855-3863,2000; Wagner y col., J. Nuclear Med. 43:267-272,2002).

La presente invención se describe adicionalmente mediante los ejemplos siguientes.

Todos los ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas estándares, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la técnica, a menos que se describa con detalle de otro modo. Las técnicas de biología molecular habituales de los ejemplos siguientes se pueden llevar a cabo tal como se describe en los manuales estándares de laboratorio, tales como Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos a partir de bibliotecas HuCAL

Para la generación de anticuerpos terapéuticos contra mesotelina se realizaron selecciones con la biblioteca de presentación en fagos MorphoSys HuCAL GOLD. HuCAL GOLD® es una biblioteca de Fab basada en el concepto HuCAL® (Knappik, A., y col., J. Mol. Biol. (2000) 296(1): 57; Krebs, B., y col., J. Immunol. Methods. (2001) 254(1-2): 67) en el que están diversificadas las seis CDR y que emplea la tecnología CysDisplay™ para ligar fragmentos Fab a la superficie del fago (Lohning, 2001; documento WO 01/05950).

A. Rescate en fagémido, amplificación en fago y purificación

La biblioteca de fagémidos HuCAL GOLD® se amplifico en TY 2 x medio que contiene 34 µg/ml de cloranfenicol y 1 % de glucosa (TY-CG 2X). Después de la infección con fagos colaboradores (VCSM13) a una DO600 de 0,5 (30 minutos a 37 °C sin agitación; 30 minutos a 37 °C con agitación a 250 rpm), las células se centrifugaron (4120 g; 5 minutos; 4 °C), se resuspendieron en TY 2X / 34 µg/ml de cloranfenicol/50 µg/ml de kanamicina y se cultivaron durante toda la noche a 22 °C. Los fagos se precipitaron con PEG en el sobrenadante, se resuspendieron en PBS/ glicerol al 20 % y se almacenaron a -80 °C. La amplificación de los fagos entre dos ciclos de detección selectiva se realizó del siguiente modo: Las células TG1 de fase semilogarítmica se infectaron con los fagos eluidos y se sembraron en placas de agar LB suplementado con 1 % de glucosa y 34 [μg/ml de cloranfenicol (LB-CG). Después de incubar durante la noche a 30 °C, se rasparon las colonias, se ajustó a una DO600 de 0,5 y se añadieron fagos colaboradores tal como se ha descrito en lo que antecede.

B. Detección selectiva con HuCAL GOLD®

Para las selecciones HuCAL GOLD® los anticuerpos-fagos se dividieron en tres grupos correspondientes a diferentes genes maestros de VH (grupo 1: VH1/5λΚ, grupo 2: VH3λΚ, grupo 3: VH2/4/6λΚ ). Estos grupos se preabsorbieron individualmente en células CHO-K1 negativas para mesotelina para la eliminación de los fagos con anticuerpos irrelevantes y después se sometieron a 3 ciclos alternantes de detección específica con células enteras en CHO-A9 que expresan mesotelina y células NCI-H226, seguida por elución por pH. Por último, los restantes fagos con anticuerpos se usaron para infectar las células TG1 de E. coli. Tras la centrifugación, el sedimento bacteriano se resuspendió en medio TY 2X, se sembró en placas de agar y se incubo durante la noche a 30 °C. Los clones seleccionados se rasparon de las placas y los fagos se rescataron y amplificaron. El segundo y el tercer ciclo de selecciones se realizaron como el inicial.

Los insertos que codifican Fab de los fagos HuCAL GOLD® seleccionados se subclonaron en el vector de expresión pMORF®x9 Fab FS (Rauchenberger, R., y col., J. Biol. Chem. (2003) 278(40): 38194) para facilitar la expresión rápida de Fab soluble. El ADN de los clones seleccionados se digirió con Xbal y EcoRI, cortando de este modo el inserto que codifica Fab (ompA-VLCL y phoA-Fd) y se clono en el vector cortado con Xbal/EcoRI pMORF®x9_Fab_FS. Los Fab expresados en este vector portan dos marcas en el extremo C terminal(FLAG™ y Strep-tag® II) para detección y purificación.

C. Maduración de la afinidad. Maduración de la afinidad de Fab seleccionados mediante intercambio escalonado de casetes de CDR

Para incrementar la afinidad y la actividad biológica de fragmentos de anticuerpos seleccionados (MF-L, MF-A, MF-J, MF-T y MF-226), las regiones L-CDR3 y H-CDR2 se optimizaron en paralelo mediante mutagénesis con casete usando mutagénesis dirigida por trinucleótido Virnekäs y col., Nucleic Acids Res. 22(25): 5600-7), mientras se mantenían constantes las regiones marco conservadas (documento WO2006122797). Para la selección de fragmentos Fab de alta afinidad presentados en los fagos se realizaron detecciones selectivas, bien con mesotelina recombinante biotinilada purificada (mesotelina humana o murina) o directamente en líneas celulares que expresan

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mesotelina (NCI-H226 u OVCAR-3). Combinaciones de estas diferentes estrategias de inmunofijacion también se aplicaron a lo largo de los tres ciclos de detección selectiva que se realizaron.

Ejemplo 2: Agrupación de epítopos

Se realizaron experimentos de agrupación de epítopos usando Biacore mediante monitorización de la unión simultánea de pares de anticuerpos antimesotelina con mesotelina inmovilizada. En pocas palabras, el primer anticuerpo se inmovilizo covalentemente sobre el chip sensor a través de acoplamiento con amina primaria usando hidroxisuccinamida (NHC) y N-etil-N'-dimetilaminopropil carbodiimida (EDC). A continuación, los sitios de unión sobre la superficie no ocupados se bloquearon con etanolamida. La mesotelina soluble se capturó sobre la superficie a través del anticuerpo inmovilizado, por tanto, el epítopo del anticuerpo de captura queda bloqueado para todas las moléculas de mesotelina unidas. Inmediatamente se pasó un segundo anticuerpo sobre la superficie para su unión con la mesotelina inmovilizada. Dos anticuerpos que reconocen el mismo epítopo, o epítopos solapantes, no se pueden unir a la mesotelina, mientras que los anticuerpos con distintos epítopos sí se pueden unir. La superficie del anticuerpo se regenero con glicina, pH 2,8, para eliminar las proteínas unidas y, después, se repitió el proceso con otros anticuerpos. Se analizaron todas las combinaciones de siete anticuerpos. En la figura 1A se muestran los resultados representativos usando MF-T y otros varios anticuerpos. El uso de MF-T como segundo anticuerpo sirvió como control positivo y el anti FLAG sirvió como control negativo La figura 1B representa un resumen de los resultados de unión pareada para siete anticuerpos antimesotelina en un diagrama de Venn, el en que los círculos representan epítopos individuales. Los círculos superpuestos representan epítopos solapantes. MF428 compitió por la unión con los demás anticuerpos analizados. MF-J y MF-T se unen a distintos epítopos en comparación de uno con otro y con MF-A, MF-226 y MF-L, que parecen competir por la misma región epitópica. El anticuerpo K1 de ratón disponible comercialmente se une a una región epitópica distinta de la reconocida por MF-J y MF-T, pero parece compartir una región epitópica similar con MF-A, MF-L y MF-226.

Ejemplo 3: Reactividad cruzada con la mesotelina murina

En la tabla 5 se muestran los resultados de estudios con Biacore y ELISA que muestran la reactividad cruzada de los anticuerpos de la invención con la mesotelina murina. Las constantes cinéticas kon y koff se determinaron con diluciones en serie del respectivo fragmento Fab purificado que se une a la mesotelina murina o humana inmovilizada covalentemente usando el equipo Biacore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia). La inmovilización antigénica covalente se alcanzó mediante un procedimiento de acoplamiento EDC-NHS estándar. Las mediciones cinéticas se realizaron en PBS, a pH 7,2, a un caudal de 20 μl/min usando una concentración de Fab que varía de 1,5 a 500 nM. El tiempo de inyección para cada concentración fue 1 minuto, seguido por 3 minutos de fase de disociación. Para la regeneración se usaron 5 μl de tampón glicina 10 mM, a pH 1,8. Todos los sensogramas se ajustaron usando el programa de evaluación BIA 3.1 (Biacore).

Tabla 5: Afinidades monovalentes del anticuerpo antimesotelina por la mesotelina humana y murina (formatos de Fab)

Anticuerpo (Fab): Mesotelina humana Mesotelina murina

KD[M]: Kd [1/s] KD[M] Kd [1/s]

MF-226: 5,8 x10-8 3,8 x10-2 1,28 x10-6 1,4x10-1

MOR 06626: 6,7 x10-10 1,2 x10-3 6,7 x10-9 9,8x10-3

MOR 06638: 1,6 x10-8 6,3 x10-3 3,2 x10-7 4,0x10-2

MF-A: 1,9 x10-8 7,9 x10-2 6,7 x10-7 2,7x10-1

MOR 06657: 9,5 x10-10 5,5 x10-3 3,6 x10-7 1,6x10-1

Ejemplo 4: Unión invariante a la mesotelina en diferentes líneas celulares cancerosas

La figura 2 representa inmunotransferencias de líneas celulares que expresan mesotelina generadas con el anticuerpo antimesotelina MF-J (A) y MOR 06635 (B). En pocas palabras, se generaron extractos celulares mediante un protocolo de lisis estándar sometiendo a las células a ultrasonidos durante 3 minutos en presencia de ADNasa y ARNasa. Las proteínas celulares se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes y reductoras, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con el anticuerpo principal adecuado (MF-J-IgG o MOR 06635-Fab). Para la detección se usó el anticuerpo secundario de anti-IgG antihumana acoplada a peroxidasa, que se realizó con sustrato ECL. Mientras que solo apareció una banda cuando los extractos de células OVCAR-3 se transfirieron con anticuerpos de mesotelina, se observaron múltiples bandas en células CHO-A9 y NCI-H226. Esto

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indica la presencia de diferentes isoformas de mesotelina en líneas celulares OVCAR-3, CHO-A9 y NCI-H226. Dado que OVCAR-3 y CHO-A9 expresan la misma variante transcrita completamente cortada y empalmada (Muminova, Z.E., y col., BMC Cancer (2004) 4: 19) y la SEC ID 371, las bandas múltiples deben estar producidas por modificaciones traduccionales o postraduccionales, las cuales podrían consistir en, pero no limitarse a, por ejemplo, diferencias en los patrones de glucosilación.

En la tabla 6 se muestra que los valores CE50 obtenidos mediante titulación FACS de anticuerpos representativos con maduración de afinidad en células NCI-H226 y OVCAR-3 no varían significativamente para una subpoblación de IgG (es decir, MOR07265, -6631, -6669, -7111,-6640, -6642) mientras que otras IgG muestran un valor de CE50 más de ocho veces mayor en las células OVCAR-3 que en las células NCI-H226 (es decir, MOR06626, -6638, -6657. 6643). El hecho más notable es que las IgG MOR07265, -6631, -6635, -6669, -7111,-6640, -6642 son derivados con afinidad madurada de la IgG original MF-J, lo que indica que estas IgG se unen a un epítopo relacionado que esta invariablemente presente en células OVCAR-3 además de en células NCI-H226. La titulación FACS se realizó en una placa de microtitulación de 96 pocillos, en la que diluciones en serie del anticuerpo principal en un volumen de 80 μl de tampón de FACS (3 % de SBF, 0,02 % de NaN3 en PBS) se mezclaron con 20 μl de una suspensión celular compuesta por 106 células/ml que se habían desprendido con acutasa o tripsina/EDTA y se resuspendieron en tampón FACS. La incubación se realizó a 4 °C durante 1 hora con agitación. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se resuspendieron en 100 μl/pocillo de solución conjugada con PE antihumana en tampón FACS. La incubación y el lavado se realizaron como antes. El análisis de los anticuerpos unidos a las células se efectuó usando el dispositivo FACS Array. Los valores de CE50 se determinaron a partir de las medianas de fluorescencia de duplicados usando el programa Prims 4.0 (GraphPad) aplicando un ajuste de regresión no lineal.

Tabla 6: Titulación FACS de anticuerpos IgG en células NCI-H226 y OVCAR-3

Anticuerpo (IgG): CE50 (nM) Incrementos de las diferenciasCE50 en OVCAR-3 frente a NCI-226

NCI-H226: OVCAR-3

MOR06626: 0,44 9,68 22,0

MOR06638: 0,19 4,19 22,1

MOR07265: 1,11 1,06 1,0

MOR06631: 2,02 0,96 0,5

MORO 6669: 0,41 1,40 3,4

MOR07111: 0,80 1,35 1,7

MOR06640: 0,63 0,53 0,8

MOR06642: 0,58 0,54 0,9

MOR06657: 0,14 0.53 14

MOR06643: 0,23 1,86 8,1

Ejemplo 5: Unión a mesotelina en presencia del antígeno canceroso 125 (CA125)

La figura 3 muestra que el antígeno canceroso 125 (CA125) se une a mesotelina, que, a su vez, está unida a una subpoblación de anticuerpos frente a mesotelina, incluidos MOR6640 y MF-T, mientras que otros anticuerpos, tales como MF-226, compiten con CA125 por la unión a mesotelina. Los datos mostrados son unidades ligeras relativas (ULR) detectadas mediante SECTOR Light Imager (Meso Scale Discovery). Las placas se revistieron con el anticuerpo frente a mesotelina representado a 15 μg/ml y se lavaron y bloquearon tras cada incubación posterior. La mesotelina se añadió a las concentraciones indicadas y se tituló de forma decreciente desde 10 μg/ml a 0,08 μg/ml. Después, las placas se incubaron con CA125 (Lee Biosolutions, n° de cat. 150-11, 50.000 U/ml diluido a 1:300). La detección se realizó con un anticuerpo de ratón anti CA125 y un anticuerpo Fab antirratón marcado con cola MSD Sulfo tag (Meso Scale Discovery). Un anticuerpo control humano inespecífico se revistió como control. Otros controles adicionales la preparación del ensayo completo) con mesotelina a las concentraciones más elevadas analizadas (10 μg/ml) y la omisión de CA125 o del anticuerpo anti CA125 de ratón, o la preparación del ensayo completo sin mesotelina. Este ejemplo muestra que los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno,

o variantes de los mismos, que invariablemente se unen a mesotelina se pueden identificar mediante pruebas in vitro.

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Claims

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