ES2569552T3 - Composiciones de péptido de MNTF y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Un péptido de MNTF que consiste de entre 2 y 5 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, en donde dicho péptido de MNTF exhibe actividad MNTF y dicho péptido de MNTF comprende por lo menos los residuos de aminoácidos 17 y 18 de la SEQ ID NO: 1, y en donde dicho péptido de MNTF es para uso en medicina.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones de peptido de MNTF y metodos de uso Antecedentes

La siguiente incluye informacion que puede ser util en la comprension de la presente descripcion. No es una admision de que cualquier informacion proporcionada aqu es tecnica anterior, o es relevante para la actual descripcion, o que cualquier publicacion o documento al que se hace referencia espedficamente o implfcitamente es tecnica anterior.

Se ha encontrado que la supervivencia de motoneuronas embrionarias es dependiente de sustancias troficas espedficas derivadas de los musculos esqueleticos asociados al desarrollo. Se ha reportado que ciertos musculos esqueleticos producen sustancias que son capaces de mejorar la supervivencia y desarrollo de las motoneuronas al evitar la degeneracion de las motoneuronas embrionarias y posterior muerte celular, natural. Estas sustancias se han descrito en terminos generales como factores neuronotroficos (NTF), que son un grupo especializado de protemas que funcionan para promover la supervivencia, crecimiento, mantenimiento y capacidades funcionales de poblaciones de neuronas seleccionadas (por ejemplo, Chau, RMW, et al., 6 Chin. J neuroanatoirna 129, 1990).

Una variedad de enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas, neuromusculares y neuronales que afectan los sistemas nerviosos central y/o periferico se puede caracterizar en su totalidad o en parte por la perdida aguda o progresiva de los tejidos neuronales funcionales.

Los documentos US6309877, US7183373, US6841531, US6759389 y US20060052299 reportan factores

neuronotroficos espedficos (NTF) denominados factores motoneuronotroficos (MNTF), que poseen la capacidad de ejercer efectos troficos sobre motoneuronas.

Breve Resumen

En un aspecto, la presente invencion proporciona un peptido de MNTF para uso en medicina, que consiste de entre 2 y 5 aminoacidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, y que exhibe actividad MNTF y comprende por lo menos los residuos de aminoacidos 17 y 18 de la SEQ ID NO: 1.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones el peptido de MNTF para uso en medicina se puede seleccionar del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 3-12.

En otras realizaciones, el peptido de MNTF para uso en medicina puede consistir de entre 3 y 5 aminoacidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el peptido de MNTF puede tener una secuencia de aminoacidos de acuerdo con las SEQ ID NOs: 4, 6 o 12. para uso en medicina

En realizaciones adicionales, el peptido de MNTF para uso en medicina se puede modificar por un enlace covalente con un mejorador de penetracion, mejorando de esta manera la capacidad de penetracion de tejido de la composicion.

Por consiguiente, en ciertas realizaciones el peptido de MNTF para uso en medicina se puede modificar terminalmente con N mediante enlace covalente a un mejorador de penetracion. Por ejemplo, el mejorador de penetracion se puede unir de forma covalente al peptido de MNTF mediante derivacion de N-acilo de uno o mas grupos amino libres.

En algunas realizaciones, el mejorador de penetracion puede ser acido alquil carboxflico opcionalmente sustituido hidroxilatado, no saturado y/o sulfurado de 2 a 22 carbonos. Por consiguiente, en ciertas realizaciones el mejorador de penetracion puede ser un acido graso seleccionado de acido cabnlico, acido oleico, acido laurico, acido caprico, acido capnlico, acido hexanoico, acido minstico, acido palmftico, acido valerico, acido estearico, acido linoleico, acido liolenico, acido araquidonico, acido oleico, acido elafdico, acido erucico, y acido nervonico.

En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un peptido de MNTF como se describio anteriormente y un portador farmaceuticamente aceptable, para uso en medicina.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona el uso de la anterior composicion en un metodo para promover el crecimiento o mantenimiento de neuronas, que comprende administrar la composicion a una celula neuronal, y en donde la composicion tiene una o mas actividades biologicas seleccionadas de promover el crecimiento de neuronas in vivo promover el mantenimiento de neuronas, promover crecimiento de neuritas, promover regeneracion axonal de una motoneurona axotomizada, mejorar la funcion motora, reparar la ruta neuronal danada, regenerar una ruta neuronal, y aliviar un defecto neuronal.

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En un aspecto adicional la presente invencion proporciona el uso de la anterior composicion en un metodo para aliviar un trastorno neuronal en un animal afligido con el trastorno, que comprende administrar al animal la composicion en una cantidad suficiente para aliviar el trastorno.

En un aspecto adicional, tambien se proporciona un peptido de MNTF que consiste de la secuencia amino de la SEQ ID NO: 6 o 12.

Secuencias:

LGTFWGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDG PTQ (SEQ ID NO: 1)

FSRYAR (SEQ ID NO: 2)

FS (SEQ ID NO: 3)

FSR (SEQ ID NO: 4)

AFS (SEQ ID NO: 5)

FSRY (SEQ ID NO: 6)

SAFS (SEQ ID NO: 7)

AFSR (SEQ ID NO: 8)

LSAFS (SEQ ID NO: 9)

SAFSR (SEQ ID NO: 10)

AFSRY (SEQ ID NO: 11)

FSRYA (SEQ ID NO: 12)

MLSAFS (SEQ ID NO: 13)

LSAFSR (SEQ ID NO: 14)

SAFSRY (SEQ ID NO: 15)

AFSRYA (SEQ ID NO: 16)

SRYAR (SEQ ID NO: 17)

RYAR (SEQ ID NO: 18)

YAR (SEQ ID NO: 19)

SRYA (SEQ ID NO: 20)

RYA (SEQ ID NO: 21)

SRY (SEQ ID NO: 22)

Descripcion de las figuras

La Figura 1. Ilustra un ensayo de supervivencia de peptidos de MNTF de ejemplo sobre la supervivencia neuronal. Las motoneuronas se cultivan a partir de medulas espinales de rata y se cultivan durante 3 dfas en la presencia de BDNF, GDNF y CNTF. Despues de 3 dfas, las celulas se hacen crecer en la ausencia de los factores troficos convencionales pero con los peptidos de MNTF indicados a 10 microgramo/ml. Despues de 48 horas se determina el numero de celulas vivas. La grafica indica la media +/- SD de cinco muestras (BDNF=Factor neurotrofico derivado de cerebro; GDNF=Factor neurotrofico derivado glial; CNTF=Factor neurotrofico ciliar).

Descripciones detalladas

Se ha encontrado que la supervivencia de motoneuronas embrionarias es dependiente de las sustancias troficas espedficas de musculos esqueleticos derivados asociados al desarrollo. Se ha reportado que los musculos esqueleticos producen sustancias que son capaces de mejorar la supervivencia y desarrollo de motoneuronas al prevenir la 5 degeneracion de las motoneuronas embrionarias y posterior muerte celular natural. (O'Brian, R. J. and Fischbach, G. D., 6 J. Neurosci. 3265 (1986); Hollyday, M. and Hamburger, V., 170 J. Comp. Neurol. 311 (1976). McManaman, J. L., et al., 263 J. Biol. Chem. 5890 (1988): Oppenheim, R. W., et al., 240 Science, 919 (1988); and Smith, R. G., et al., 6 J. Neurosci. 439 (1986).

El Factor Motoneurotrofico humano (MNTF) es un NTF espedfico derivado del tejido de musculo esqueletico que se ha 10 demostrado reduce la inflamacion en el sitio de la lesion de las motoneuronas, mejora la regeneracion de nervios, y promueve la supervivencia de las motoneuronas. El MNTF se ha probado en diversos sistemas nerviosos de rata, que incluyen el nervio periferico ciatico (que controla los musculos de las extremidades inferiores), el nervio musculocutaneo periferico (que controla los musculos de las extremidades superiores), el nervio facial craneal (que controla los musculos faciales y de la cabeza), el nervio hipogloso craneal (que controla la lengua), y la porcion de la medula espinal que 15 controla los musculos en el cuello, pecho y extremidades superiores. En el modelo de medula espinal, el MNTF se aplico sobre el injerto de nervio en una medula espinal de hemi-seccion en la rata; el MNTF reduce la inflamacion, limita la degeneracion y mejora la regeneracion de los nervios injertados. Una serie de estudios ha demostrado la eficacia de los analogos del MNTf sintetizado o analogos de peptido descritos en los mismos en sistemas de modelos de nervio periferico en rata para efectos troficos y tropicos cuando se aplica directamente sobre el nervio. Adicionalmente, se ha 20 demostrado que el MNTF promueve la regeneracion y supervivencia de las motoneuronas.

La muerte celular neuronal ocurre en el sistema nervioso de vertebrados durante ciertos penodos de crecimiento y desarrollo. Por lo tanto, la adicion de factores troficos neuronales solubles de tejidos objetivo asociados puede servir para mitigar este fenomeno de muerte neuronal.

Por consiguiente, los aspectos y realizaciones de la presente descripcion proporcionan metodos y composiciones que 25 comprenden el peptido de MNTF o analogo del mismo para el tratamiento de trastornos neuronales.

Los aspectos y realizaciones de la descripcion se dirigen a un dominio de protema funcional asociado con las acciones de los factores motoneuronotroficos, que se han identificado y mapeado en subsecuencias superpuestas cortas en la molecula de MNTF. Estos dominios de protemas, que incluyen los dominios de las SEQ ID NOS: 2-22, son suficientes para modular la viabilidad y proliferacion de celulas neuronales. Mas aun, los peptidos de MNTF truncados o analogos 30 que abarcan estos dominios son suficientes por sf mismos para demostrar la bioactividad estimuladora en hubridos de celulas motoneuronas/de neuroblastoma.

Definiciones

Se establecen ciertos terminos utilizados en el contexto de la descripcion de la tecnologfa a la que pertenece esta divulgacion. A menos que se indique lo contrario, los siguientes terminos tienen los siguientes significados cuando se 35 utilizan aqrn y en las reivindicaciones adjuntas. Aquellos terminos que no se definen a continuacion o en otra parte en la especificacion tendran su significado reconocido en la tecnica.

Como se utiliza aqrn, un “factor motoneuronotrofico o factor trofico de motoneuronas” incluye aquellos factores involucrados en la nutricion o mantenimiento de las motoneuronas. Los terminos “factor motoneuronotrofico”, “MNTF”, “peptido de MNTF”, “analogo de factor motoneuronotrofico” y “analogo de MNTF” se refieren a peptidos y analogos de 40 los mismos, respectivamente, como se describe aqrn y que tiene las propiedades funcionales definidas aqrn. Estos pueden incluir secuencias y homologos funcionales de secuencia de MNTF de referencia. Los factores motoneuronotroficos adicionalmente pueden promover el desarrollo y diferenciacion de las celulas progenitoras neuronales comprometidas, o pueden inducir o mejorar el crecimiento (por ejemplo, crecimiento de neuritas) y supervivencia celular neuronales diferenciadas. “Actividad MNTF” incluye una o mas de las siguientes actividades: 45 promover el crecimiento de neuronas, promover el mantenimiento de neuronas, promover crecimiento de neuritas, promover regeneracion axonal de una motoneurona axotomizada, mejorar la funcion motora, reparar la ruta neuronal danada, regenerar una ruta neuronal, o aliviar un defecto neuronal. Los factores motoneuronotroficos de la presente descripcion se proporcionan normalmente en cantidades efectivas para producir una celula neuronal completamente diferenciada de pleno del SNC o PNS (por ejemplo, una neurona motora). Se proporciona aqrn orientacion para la 50 cantidad, y se puede determinar facilmente por el experto comun en base a los procedimientos y metodos conocidos descritos aqrn.

Los peptidos de MNTF se han reportado en Chau, R. M. W., et al., Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat Spinal Cord. In: Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, Vol. 5, Peeters Press, Leuven, Belgium, pp. 89-94 (1992), asf como aquellos que se encuentran en, por ejemplo, los documentos US6309877, 55 US7183373, US6841531, US6759389 y US20060052299. En ciertas realizaciones, ejemplos incluyen peptidos de

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MNTF sinteticos y/o purificados o analogos de los mismos que comprenden una porcion de los dominios de las SEQ ID NOS: 2-22 y moleculas que imitan la estructura y/o funcion de los mismos, que incluyen homologos y analogos de secuencia truncada, utiles para inducir o modular la viabilidad y crecimiento de una celula neuronal.

Adicionalmente, los peptidos de MNTF tambien puede incluir aquellos descritos en Chau, R. M. W., et al., The Effect of a 30 kD Protein from Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons, 34 Science in China, Series B, 908 (1991); Chau, R. M. W., et al., Muscle-Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat Spinal Cord. In: Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, Vol. 5, Peeters Press, Leuven, Belgium, pp. 89-94 (1992); Chau, R. M. W., et al., The Effect of a 30 kD Protein from Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons, 34 Science in China, Series B, 908 (1991); Chau, R. M. W., et al., Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1 (MNTF1) and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes, (abstract) 19 Soc. for Neurosci. part 1,252 (1993), Chau, R. M. W., et al., Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1 (MNTF1) and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes, (abstract) 19 Soc. for Neurosci, parte 1,252 (1993).

En ciertas realizaciones, un peptido de MNTF o analogo del mismo puede incluir secuencias de uno de los sitios activos del dominio de MNTF (por ejemplo un peptido de MNTF de dos aminoacidos, tales como SEQ ID NO: 3).

En ciertas realizaciones, el peptido de MNTF consiste de una secuencia descrita en las SEQ ID NOs: 2-22. En otras realizaciones, el peptido de MNTF incluye derivados funcionales de los peptidos de MNTF representados en las SEQ ID NOs: 2-22.

Los peptidos de MNTF y analogos de los mismos descritos aqrn incluyen peptidos derivados de MNTF (es decir, de la SEQ ID NO: 1), y derivados funcionales de los mismos. Estos compuestos incluyen peptidos que tienen la secuencia de aminoacidos de una de las SEQ ID NOs: 2-22, y derivados funcionales de peptidos que tienen las secuencias de aminoacidos proporcionadas en las SEQ ID NOs: 2-22.

“Analogos” como se utiliza en la presente solicitud incluyen peptidos que se han modificado pero retienen actividad de MNTF (por ejemplo mediante truncamiento, sustitucion, adhesion covalente a otra unidad estructural, etc. relativa a un MNTF de 33 mer, SEQ ID NO: 1). Los analogos de peptido de MNTF incluyen, por ejemplo, esteres, amidas, profarmacos, y formas de sal de peptidos de MNTF. Los analogos de peptido de MNTF incluyen peptidos de MNTF que se han modificado de forma covalente mediante adhesion a otra unidad estructural, tal como por ejemplo un peptido de MNTF ligado de forma covalente a una unidad estructural lipofila (por ejemplo un acido graso), una molecula portadora, o un polipeptido heterologo para producir una protema de fusion. En ciertas realizaciones, los analogos de acuerdo con la presente descripcion incluyen sustituciones “conservadoras” (por ejemplo relacionadas con la SEQ ID NO: 1). Las sustituciones conservadoras de aminoacidos que incluyen reemplazos de aminoacidos con aminoacidos sinonimos dentro del mismo grupo, que tienen propiedades fisicoqmmicas suficientemente similares que la sustitucion entre miembros del grupo preservaran la funcion biologica de la molecula, Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974). Los analogos de MNTF abarcan adicionalmente derivados funcionales de MNTF de los peptidos o analogos descritos aqrn. En algunas realizaciones, los analogos de MNTF puede incluir 20%, 25%, 30%, 35% o hasta 40% de sustituciones conservadoras de aminoacidos en comparacion con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1 o versiones truncadas de la misma, que incluyen las SEQ ID NOs: 2-22.

Como se utiliza aqrn “derivados funcionales” de MNTF se refiere a derivados que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de las unidades estructurales de aminoacidos o en los grupos de terminal N o C de acuerdo con metodos conocidos y estan comprendidos en la descripcion cuando son farmaceuticamente aceptables es decir, cuando no destruyen la actividad de la protema/peptido o no imparten toxicidad inaceptable a la composicion farmaceutica que los contiene. Dichos derivados pueden incluir, por ejemplo, esteres o amidas alifaticas de los grupos carboxilo y derivados N-acilo de grupos amino libres, asf como los derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres y se forman con grupos acilo como por ejemplo grupos alcanoilo o arilo, profarmacos, sales de grupos funcionales, o que tienen una combinacion de los mismos.

Los grupos de aminoacidos sinonimos incluyen aquellos definidos en las Tablas I, II, y III.

Tabla I

Grupos mas amplios de Aminoacidos sinonimos Aminoacido --- grupo sinonimo Arg —Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu —Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro ---Gly, Ala, Thr, Pro

Thr — Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala ---Gly, Thr, Pro, Ala

Val —Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly ---Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile —Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe —Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr ---Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys — Ser, Thr, Cys

His —Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln —Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn —Gln, Asp, Ser, Asn

Lys —Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp —Glu, Asn, Asp

Glu —Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met ---Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp --- Trp

Tabla II

Grupos Intermedios de Aminoacidos sinonimos

Aminoacido — grupo sinonimo

Ser --- Ser

Arg — His, Lys, Arg

Leu —Ile, Phe, Met, Leu

Pro --- Ala, Pro

Thr --- Thr

Ala —Pro, Ala

Val --- Met, Ile, Val

Gly --- Gly

Ile ---Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe —Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr — Phe, Tyr

Cys — Ser, Cys

His — Arg, Gln, His

Gln —Glu, His, Gln

Asn — Asp, Asn

Lys — Arg, Lys

Asp — Asn, Asp

Glu —Gln, Glu

Met ---Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp --- Trp

Tabla III

Grupos mas estrechos de Aminoacidos sinonimos

Aminoacido — grupo sinonimo

Ser --- Ser

Arg --- Arg

Leu —Ile, Met, Leu

Pro --- Pro

Thr --- Thr

Ala --- Ala

Val --- Val

Gly --- Gly

Ile —Ile, Met, Leu

Phe --- Phe

Tyr --- Tyr

Cys ---Ser, Cys

His --- His

Gln --- Gln

Asn —Asn

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Lys — Lys

Asp —Asp

Glu --- Glu

Met —Ile, Leu, Met

Trp — Trp

Los aminoacidos utilizados en los compuestos proporcionados aqrn (por ejemplo, peptidos y protemas) pueden ser aminoacidos codificados geneticamente, aminoacidos no codificados geneticamente de origen natural, o aminoacidos sinteticos. Se pueden utilizar ambos enantiomeros L y D de cualquiera de los anteriores en los compuestos. Se pueden utilizar aqrn las siguientes abreviaturas para los siguientes aminoacidos codificados geneticamente (y residuos de los mismos): alanina (Ala, A); arginina (Arg, R); asparagina (Asn, N); acido aspartico (Asp, D); cistema (Cys, C); glicina (Gly, G); acido glutamico (Glu, E); glutamina (Gln, Q); histidina (His, H); isoleucina (Ile, I); leucina (Leu, L); lisina (Lys, K); metionina (Met, M); fenilalanina (Phe, F); prolina (Pro, P); serina (Ser, S); treonina (Thr, T); triptofano (Trp, W); tirosina (Tyr, Y); y valina (Val, V).

Ciertos aminoacidos comunmente encontrados que no son codificados geneticamente y que pueden estar presentes en los compuestos descritos aqrn incluyen, pero no se limitan a, p-alanina (b-Ala) y otros omega-aminoacidos tales como acido 3- aminopropionico (Dap), acido 2,3-diaminopropionico (Dpr, Z), acido 4-aminobutmco y asf sucesivamente; acido a-aminoisobutmco (Aib); acido £-aminohexanoico (Aha); acido 8-aminovalerico (Ava); metilglicina (MeGly); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); t-butilglicina (t-BuG); N-metilisoleucina (Melle); fenilglicina (Phg); ciclohexilalanina (Cha); norleucina (Nle, J); 2-naftilalanina (2-Nal); 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)); 2-fluorofenilalanina (Phe(2-F)); 3- fluorofenilalanina (Phe(3-F)); 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); acido 1,2,3,4- tetrahidroisoquinolina- 3-carbox^lico (Tic); beta.-2-tienilalanina (Thi); sulfoxido de metionina (MSO); homoarginina (hArg); N-acetil lisina (AcLys); acido 2,3-diaminobutmco (Dab); acido 2,3-diaminobutmco (Dbu); p-aminofenilalanina (Phe(pNH2)); N-metil valina (MeVal); homocistema (hCys); 3-benzotiazol-2-il-alanina (BztAla, B); y homoserina (hSer). Los analogos de aminoacidos adicionales contemplados incluyen fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, acido hipurico, acido octahidroindol -2- carboxflico, estatina, a-metil-alanina, para-benzoil- fenilalanina, propargilglicina, y sarcosina. Los peptidos descritos aqrn pueden tener cualquierta de los siguientes aminoacidos en la configuracion L o D, o cualquier otro aminoacido descrito aqrn o conocido en la tecnica, ya sea actualmente o en el futuro.

Los aminoacidos que son sustituibles entre sf de manera general residen dentro de las clases similares o subclases. Como lo sabe un experto en la tecnica, los aminoacidos se pueden colocar en diferentes clases dependiendo principalmente de las propiedades qrnmicas y ffsicas de la cadena lateral de aminoacido. Por ejemplo, algunos aminoacidos de manera general se consideran aminoacidos hidrofilos o polares y otros se consideran que son aminoacidos hidrofobos o no polares. Los aminoacidos polares incluyen aminoacidos que tienen cadenas laterales acidas, basicas o hidrofilas y los aminoacidos no polares incluyen aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas o hidrofobas. Los aminoacidos no polares adicionalmente se pueden dividir adicionalmente para incluir, entre otros, aminoacidos alifaticos. Las definiciones de las clases de of aminoacidos como se utiliza aqrn son como sigue:

“Aminoacido no polar” se refiere a un aminoacido que tiene una cadena lateral que no esta cargada a pH fisiologico, que no es polar y que de manera general se repele por solucion acuosa. Ejemplos de aminoacidos hidrofobos codificados geneticamente incluyen Ala, Ile, Leu, Met, Trp, Tyr y Val. Ejemplos de aminoacidos no polares no codificados geneticamente incluyen t-BuA, Cha y Nle.

“Aminoacido Aromatico” se refiere a un aminoacido no polar que tiene una cadena lateral que contiene por lo menos un anillo que tiene un sistema de electrones n conjugado (grupo aromatico). El grupo aromatico se puede sustituir adicionalmente con grupos sustituyentes tales como grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, sulfonilo, nitro y aminos, asf como tambien otros. Ejemplos de aminoacidos aromaticos geneticamente codificados incluyen fenilalanina, tirosina y triptofano. Los aminoacidos aromaticos no geneticamente codificados encontrados comunmente fenilglicina, 2- naftilalanina, p-2-tienilalanina, 3-benzotiazol-2-il-alanina, acido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3- carboxflico, 4- clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina y 4-fluorofenilalanina.

“Aminoacido Alifatico” se refiere a un aminoacido no polar que tiene una cadena recta saturada o no saturada, ramificada o cadena lateral de hidrocarburo dclico. Ejemplos de aminoacidos alifaticos geneticamente codificados incluyen Ala, Leu, Val y Ile. Ejemplos de aminoacidos alifaticos no codificados incluyen Nle.

“Aminoacido Polar” se refiere a un aminoacido hidrofilo que tiene una cadena lateral que esta cargada o no cargada a pH fisiologico y que tiene un enlace en el que el par de electrones compartido en comun por dos atomos se mantiene mas cerca por uno de los atomos. Los aminoacidos polares de manera general son hidrofilos, lo que significa que tienen un aminoacido que tiene una cadena lateral que es atrafda por una solucion acuosa. Ejemplos de aminoacidos polares 5 geneticamente modificados incluyen asparagina, cistema, glutamina, lisina y serina. Ejemplos de aminoacidos polares no codificados geneticamente incluyen citrulina, homocistema, N-acetil lisina y sulfoxido de metionina.

“Aminoacido addico” se refiere a un aminoacido hidrofilo que tiene un valor pK de cadena lateral de menos de 7. Los aminoacidos addicos normalmente tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiologico debido a la perdida de un ion de hidrogeno. Ejemplos de aminoacidos addicos codificados geneticamente incluyen acido aspartico 10 (aspartato) y acido glutamico (glutamato).

“Aminoacido basico” se refiere a un aminoacido hidrofilo que tiene un valor pK de cadena lateral de mas de 7. Los aminoacidos basicos normalmente tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiologico debido a asociacion con ion hidronio. Ejemplos de aminoacidos basicos codificados geneticamente incluyen arginina, lisina y histidina. Ejemplos de aminoacidos basicos no codificados geneticamente incluyen ornitina, acido 2,3-diaminopropionico, acido 15 2,4-diaminobutmco y homoarginina.

“Aminoacido ionizable” se refiere a un aminoacido que se puede cargar a un pH fisiologico. Dichos aminoacidos ionizables incluyen aminoacido acidos y basicos, por ejemplo, D-acido aspartico, D-acido glutamico, D-histidina, D- arginina, D-lisina, D-hidroxilisina, D-ornitina, L-acido aspartico, L-acido glutamico, L-histidina, L-arginina, L-lisina, L- hidroxilisina o L-ornitina.

20 Como se apreciara por aquellos que tienen experticia en la tecnica, las anteriores clasificaciones no son absolutas. Diversos aminoacidos exhiben mas de una propiedad caractenstica, y por lo tanto se pueden incluir en mas de una categona. Por ejemplo, la tirosina tiene tanto un anillo aromatico no polar y un grupo hidroxilo polar. De este modo, la tirosina tiene varias caractensticas que podnan ser descritas como no polares, aromaticas y polares. Sin embargo, el anillo no polar es dominante y de esta manera la tirosina generalmente se considera que es no polar. Del mismo modo, 25 ademas de ser capaz de formar enlaces disulfuro, la cistema tambien tiene caracter no polar. Por lo tanto, mientras que no se clasifica estrictamente como un aminoacido hidrofobo no polar, en muchos casos, la cistema se puede utilizar para conferir hidrofobicidad o no polaridad a un peptido.

En algunas realizaciones, como se contempla aqrn los aminoacidos polares pueden incluir, por ejemplo, arginina, asparagina, acido aspartico, cistema, acido glutamico, glutamina, histidina, homocistema, lisina, hidroxilisina, ornitina, 30 serina, treonina, y aminoacidos estructuralmente relacionados. En una realizacion el amino polar es un aminoacido ionizable tal como arginina, acido aspartico, acido glutamico, histidina, hidroxilisina, lisina, u ornitina.

Ejemplos de residuos de aminoacidos polares o no polares que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, alanina, valina, leucina, metionina, isoleucina, fenilalanina, triptofano, tirosina y similares.

El termino “sales” aqrn se refiere a ambas sales de los grupos carboxilo y a sales de grupos aminos de adicion acida de 35 los peptidos descritos aqrn o analogos de los mismos. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar por medios conocidos en la tecnica e incluyen sales inorganicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, ferricas o de cinc, y similares, y sales con bases organicas como aquellas formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procama y similares. Las sales acidas incluyen, por ejemplo, sales con acidos minerales tales como, por ejemplo, acido clorddrico o acido sulfurico, y sales con acidos organicos tales como, por ejemplo, acido 40 acetico o acido oxalico. Por supuesto, cualquiera de dichas sales debe retener la actividad de los peptidos descrita aqrn o sus analogos.

Los “precursores” son compuestos que se convierten en los peptidos descritos aqrn en el cuerpo humano o animal.

Los peptidos de la presente descripcion se pueden preparar mediante cualquier procedimiento bien conocido en la tecnica, tal como smtesis en fase solida o smtesis en fase lfquida. Como una smtesis en fase solida, por ejemplo, el 45 aminoacido que corresponde al terminal C del peptido que se va a sintetizar se une a un soporte que es insoluble en solventes organicos, y mediante repeticion alterna de reacciones, una en donde los aminoacidos con su grupos a - amino y grupos funcionales de cadena lateral protegidos con grupos protectores adecuados se condensan uno a uno en el orden desde el terminal C hasta el terminal N, y uno donde los aminoacidos unidos a la resina o el grupo protector de los grupos a-amino de los peptidos se liberan, por lo tanto la cadena de peptidos se extiende de esta manera. Los 50 metodos de smtesis en fase solida se clasifican en gran medida por el metodo tBoc y el metodo Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector utilizado.

Normalmente los grupos protectores utilizados incluyen tBoc (t-butoxicarbonilo), Cl-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2- bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4- metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y CI2 Bzl (2,6- diclorobencilo) para

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los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8-pentametilchromane-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (t- butilo) para los hidroxilo).

Despues de smtesis del peptido deseado, este se somete a reaccion de desproteccion y corte del soporte solido. Dichas reacciones de corte de peptido se pueden llevar a cabo con fluoruro de hidrogeno o acido trifluorometanosulfonico para el metodo Boc, y con TFA para el metodo Fmoc.

El peptido crudo obtenido de esta manera se somete luego a purificacion. La purificacion se lleva a cabo por cualquiera de los metodos conocidos para este proposito, es decir, cualquier procedimiento convencional que implique extraccion, precipitacion, cromatograffa, electroforesis, o similares. Por ejemplo, se puede utilizar HPLC (cromatograffa lfquida de alto desempeno). La elucion se puede llevar a cabo utilizando un solvente a base de agua-acetonitrilo comunmente empleado para la purificacion de protemas.

El peptido descrito aqrn se puede proporcionar en forma sustancialmente purificada, con el fin de ser adecuado para uso en composiciones farmaceuticas, como ingrediente activo, en patologfas que requieren de ese modo actividad MNTF y/o modulacion.

Como se utiliza aqrn, los terminos “peptido biologicamente activo” y “fragmento biologicamente activo” se refieren a un peptido o polipeptido de acuerdo con la descripcion anterior de factores de diferenciacion de motoneuronas (MNDF) y/o factores motoneuronotroficos (MNTF) en donde el MNDF diferencia las celulas madre en las motoneuronas y el MNTF en donde este exhibe proteccion neuronal, reparacion y funciones terapeuticas.

Como se utiliza aqrn, los peptidos de MNTF de ejemplo y analogos de los mismos incluyen aquellos demostrados aqrn que son suficientes para diferenciacion de las celulas madre en motoneuronas.

Como se utiliza aqrn, “prevenir” significa prevenir en todo o en parte, o mejorar o controlar.

Como se utiliza aqrn, el termino “tratar” se refiere a ambos tratamiento terapeutico y profilactico o medidas preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno asf como tambien aquellos propensos a tener el trastorno o ser diagnosticados con el trastorno o aquellos en los que se va a prevenir el trastorno.

Como se utiliza aqrn, una “cantidad efectiva” en referencia a los compuestos o composiciones descritos aqrn se refiere a la cantidad suficiente para inducir un resultado biologico, farmaceutico o terapeutico este resultado puede ser el alivio de los signos, smtomas, o causas de una enfermedad o trastorno o afeccion, o cualquier otra alteracion deseada de un sistema biologico.

La frase “porcentaje (%) de identidad” se refiere al porcentaje de similitud de secuencia encontrado en una comparacion de dos o mas secuencias. El porcentaje de identidad se puede determinar electronicamente utilizando cualquier software adecuado. Del mismo modo, la “similitud” entre dos secuencias (o una o mas porciones de cualquiera o ambos de ellas) se determina al comparar la secuencia de una secuencia con una segunda secuencia.

Como se describe aqrn, los terminos “homologfa y homologos” pueden incluir peptidos que contienen homologfas de secuencia de aminoacidos con la secuencia de protemas de interes. Dichos peptidos normalmente tienen por lo menos aproximadamente 70% de homologfa, y pueden tener por lo menos aproximadamente 80%, 90%, 95%, 97% o 99% de homologfa con la secuencia pertinente, por ejemplo sobre una region de por lo menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 100 o mas aminoacidos/ polipeptidos contiguos de la secuencia homologa. Pueden comprender adicionalmente hasta aproximadamente 25%, 30%, 40% o 50% de cambios de aminoacidos conservadores relacionados con una secuencia de referencia (por ejemplo SEQ ID NO: 1), dependiendo de la longitud del peptido y la secuencia de referencia.

Aspectos generales del tratamiento

Se proporcionan metodos para tratar un sujeto con un trastorno neuronal que comprende administrar al sujeto un peptido de factor motoneuronotropico (MNTF) o analogo del mismo.

Como se utiliza aqrn, trastorno neuronal puede incluir enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con o caracterizadas en todo o en parte por perdida aguda, progresiva o gradual de tejido neuronal funcional.

Una “enfermedad neurodegenerativa” se refiere a una afeccion asociada con el sistema nervioso central o periferico caracterizado por perdida progresiva, gradual del tejido neuronal funcional.

Descripcion general

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El aislamiento y caracterizacion de dos factores motoneuronotroficos (MNTF1 y MNTF2) de los tejidos musculares de rata, as^ como posterior clonacion de un gen MNTF1-F6 recombinante derivado de una coleccion de cADN de retinoblastoma humano, se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,309,877, 6,759,389 y 6,841,531. La secuencia del gen MNTF1-F6 codifica polipeptidos de MNTF1 de 33 aminoacidos que se encontro en el mapa dentro de cromosoma humano 22q22, como se describe en el documento WO/2005/047487.

Se identifican dos dominios que se superponen dentro de la molecula de MNTF1-F6 parecen ser suficiente para las actividades biologicas conocidas de MNTF1. Vease el documento WO/2004/065410 o solicitud de Patente Estadounidense No. de Ser. 10/541,343, emitida como Patente Estadounidense No 7,183,373. Cada uno de estos dominios, designados aqrn como los dominios “WMLSAFS” y “FSRYAR”, fueron suficientes para estimular la proliferacion de estirpes celulares derivadas de motoneuronas de una manera similar a la MNTF1-F6 de 33- mer. Del mismo modo, el dominio “FSRYAR” es suficiente para dirigir reenervacion selectiva de objetivos musculares por motoneuronas in vivo de una manera similar a la MNTF1-F6 de 33 mer. Ademas, el dominio “FSRYAR” proporciona un epftopo de antigeno que, cuando se utiliza para provocar una respuesta inmune, es suficiente para generar un anticuerpo que reconoce peptidos de MNTF que contienen la secuencia “FSRYAR”, que incluye el MNTF1-F6 de 33- mer.

Adicionalmente, como se describe aqrn, los peptidos de MNTF que incluyen por lo menos dos residuos consecutivos de la SEQ ID NO: 1 se pueden utilizar como se describe aqrn, dado que los peptidos incluyen por lo menos los residuos de fenilalanina y serina presentes en las posiciones 17 y 18, respectivamente, de la SEQ iD NO: 1.

Los factores motoneuronotrofico (MNTF) se maximizan en la expresion durante la semana 9 en periodo de gestacion del feto humano (Di, X. et al., Acta Anatomica Sinica 29:86-89, 1998). Con base en la expresion de MNTF en el humano en desarrollo, razonamos que el MNTF puede promover la diferenciacion y/o supervivencia de las motoneuronas.

Metodos de uso

El MNTF1 y/o sus analogos de peptido promueven la supervivencia de las motoneuronas de mamffero in vitro. Por consiguiente, la tecnologfa descrita aqrn proporciona el uso de un peptido de MNTF o analogo del mismo como un factor de crecimiento/suplemento para cultivos celulares neuronales, que incluyen un metodo para promover la supervivencia de celulas madre derivada de estirpes celulares neuronales, al cultivar celulas madre derivada de celulas neuronales in vitro con una cantidad efectiva de un peptido de MNTF o analogo del mismo.

Otros peptidos de MNTF han demostrado eficacia en la diferenciacion de las celulas madre como se describe en los documentos US/2009/0117085, WO/2007/058982. Los peptidos de MNTF proporcionados aqrn tienen actividades biologicas similares y por lo tanto modulan la diferenciacion de las celulas madre embrionarias pluripotentes en motoneuronas y mejoran la supervivencia de las motoneuronas derivadas de celulas ES. La exposicion de las celulas ES a acido retinoico (RA) y analogos de MNTF dirige estas celulas para generar neuronas motoras.

Las moleculas de MNTF y MNTF truncado, incluyen, pero no se limitan aquellas que comprende el dominio MLSAFSRYAR, conocido como factor de diferenciacion de neuronas motoras (MDNF), se demuestran en los documentos US/2009/0117085, WO/2007/058982 para inducir diferenciacion de celulas madre celulas neuronales parcialmente diferenciadas en motoneuronas motoras. Dichos agentes proporcionan un nuevo metodo generar y/o aislar una poblacion de motoneuronas motoras de cultivos de celulas madre.

El metodo comprende poner en contacto una celula madre embrionaria con acido retinoico (RA) y un factor de diferenciacion de neurona motora (MNDF). En una realizacion descrita aqrn, la celula madre embrionaria se pone en contacto con RA de forma concomitante con el factor de diferenciacion de neurona motora. Alternativamente, el metodo comprende poner en contacto una celula neuronal parcialmente diferenciada con un factor de diferenciacion de neurona motora. Los factores se proporcionan en cantidades efectivas para producir una celula neuronal diferenciada. Estas cantidades se pueden determinar facilmente por el experto comun en la tecnica, con en base en los procedimientos y metodos conocidos descritos aqrn.

Las motoneuronas diferenciadas se pueden aislar o enriquecer, por ejemplo, mediante clasificacion FACS. Por ejemplo el uso de un metodo de marcado de neuronas motoras con base en GFP permite la caracterizacion de poblaciones puras de las neuronas motoras derivadas de celulas ES. Hemos empleado este protocolo para el aislamiento de la poblacion de celulas de motoneuronas puras a partir de una poblacion mixta de celulas de cuerpos embrioides. Los cuerpos embrioides se desagregan a celulas individuales utilizando colagenasa y dispasa. Estas celulas individuales luego se clasifican FACS por GFP, ya que las celulas que expresan GFP controlado por un promotor HB9 son las verdaderas motoneuronas en la poblacion.

Por consiguiente, otro aspecto de la tecnologfa de la presente descripcion se dirige a un metodo para aislar y/o purificar una poblacion de celulas neuronales diferenciadas al: (a) obtener o generar un cultivo de celulas madre embrionarias que expresan protema fluorescente mejorada verde (eGFP) bajo el control de un promotor espedfico de neurona

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motora; (b) poner en contacto el cultivo de celulas madre embrionarias con una cantidad de un RA y MNTF efectiva para producir celulas neuronales diferenciadas que expresan eGFP; (d) detectar la expresion de eGFP en las celulas neuronales diferenciadas; y (f) aislar las celulas neuronales diferenciadas que expresan eGFP.

Peptidos de MNTF y analogos de los mismos

Como aquellos expertos estan familiarizados con la tecnica y la descripcion apreciara, las secuencias que comprenden el dominio activo de MNTF y los analogos de peptido del mismo pueden conferir proteccion neuronal, reparacion y funciones terapeuticas sobre motoneuronas in vitro e in vivo. Los factores MNTF descritos aqrn pueden ser producidos de forma sintetica o recombinante, o aislados de celulas nativas.

La secuencia de residuos de aminoacidos en una protema o peptido que comprende el peptido de MNTF o analogo del mismo de la presente descripcion se designa aqrn ya sea mediante el uso de sus designaciones de tres letras empleadas comunmente o por sus designaciones de una sola letra. Una lista de estas designaciones de tres letras y de una letra se puede encontrar en los libros de texto tales como Biochemistry, Second Edition, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, N.Y. (1975). Cuando la secuencia de aminoacidos se enumera de forma horizontal, el terminal amino esta destinado a estar en el extremo izquierdo, mientras que el terminal carboxi esta destinado a estar en el extremo derecho.

Se apreciara por aquellos expertos que la estructura qmmica exacta de los peptidos que comprenden los diversos peptidos de MNTF o analogo de los mismos variara dependiendo de una serie de factores. Por ejemplo, un polipeptido dado se puede obtener como una sal acida o basica, o en forma neutra, ya que los grupos carboxilo y amino ionizables se encuentran en la molecula. Para propositos de la descripcion, entonces, cualquier forma de los peptidos que comprenden las secuencias/dominios enumerados en la SEQ ID NOS: 2-22, que conserva una actividad biologica del peptido de MNTF, se pretende que este dentro del alcance de la tecnologfa descrita aqrn. En ciertas realizaciones, la descripcion incluye composiciones de peptidos que consisten esencialmente en las secuencias/dominios enumerados en las SEQ ID NOS: 2-22, que conserva una actividad biologica del peptido de MNTF.

La presente descripcion incluye el uso de analogos de peptidos de MNTF que conservan la capacidad del MNTF para ejercer neuroproteccion, promover supervivencia, mantenimiento y/o reparacion de motoneuronas; o en ciertos casos, diferenciar las celulas madre en neuronas motoras.

Para comparar una secuencia de polipeptidos con el correspondiente fragmento de SEQ ID NO: 1, se puede realizar un alineamiento global de las secuencias utilizando los programas BLAST disponibles al publico a traves del Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologica (en la World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov). Antes de realizar una alineacion global, la SEQ ID NO: 1 se puede someter a GenBank. Los parametros predeterminados proporcionados por el Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologfa se pueden utilizar para un alineamiento global.

Se debe entender que la tecnologfa descrita aqrn incluye el uso de analogos de peptido en los que se puede sustituir uno o mas aminoacidos con otros aminoacidos. En algunas realizaciones, el analogo de peptido del factor motoneuronotrofico contiene una o mas sustituciones conservadoras de aminoacidos en un fragmento de por lo menos 2 residuos de aminoacidos conservadores de la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, los 2 residuos de aminoacidos conservadores son F-S.

El diseno racional de MNTF y otros imitadores del dominio analogo o moleculas de union, basado en la estructura de peptido modelo (o determinado experimentalmente), se puede llevar a cabo por aquellos expertos, utilizando metodos conocidos de diseno racional de farmacos. El objetivo del diseno racional de farmacos es producir analogos estructurales de polipeptidos biologicamente activos o compuestos objetivo. Al crear dichos analogos, es posible formar farmacos, que son mas activos o estables que las moleculas naturales, que tienen diferente susceptibilidad a alteracion o que pueden afectar la funcion de varias otras diversas moleculas. En un metodo, se podna generar una estructura tridimensional de una molecula objetivo, o un fragmento de la misma. Esto se podna lograr mediante cristalograffa de rayos x, modelizacion por ordenador o por una combinacion de ambos metodos.

La molecula de MNTF tridimensional y las estructuras relacionadas descritas aqrn se pueden ser utilizar en metodos de diseno de farmaco racional computarizado (es decir, el modelado molecular y el modelado de interaccion molecula- molecula) para identificar compuestos candidatos que se unen con una parte activa del MNTF. Una variedad de programas de diseno de farmacos computarizados capaces de modelar la interaccion de un compuesto candidato con, por ejemplo, coordenadas atomicas se describe aqrn, son conocidos en la tecnica, y el funcionamiento de dichos programas esta dentro del conocimiento del experto comun en el campo del diseno racional de farmacos.

Metodos de fabricacion

Se entiende que una composicion que comprende un peptido de MNTF o analogo del mismo de la presente descripcion se puede elaborar por un metodo que es bien conocido en la tecnica, que incluye pero no se limita a smtesis qmmica

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mediante smtesis en fase solida y purificacion a distancia de otros productos de las reacciones qmmicas mediante HPLC, o produccion por la expresion de una secuencia de acidos nucleicos (por ejemplo, una secuencia de ADN) que codifica un peptido o polipeptido que comprende un peptido de MNTF o analogo del mismo descrito aqrn en un sistema de traduccion in vitro o en una celula viva. El peptido de MNTF o analogo del mismo de la composicion se puede aislar y dializar ampliamente para eliminar una o mas moleculas pequenas no deseadas de peso molecular y/o liofilizar para formulacion mas facil en un vehmulo deseado. Adicionalmente, se entiende que los aminoacidos adicionales, mutaciones, modificacion qrnmica y tal como, si lo hay, que se realizan en un componente de peptido de MNTF no deben interferir sustancialmente con el reconocimiento del receptor de la secuencia de acoplamiento de MNTF.

Un peptido o polipeptido que corresponde a uno o mas fragmentos de MNTF de manera general debe tener por lo menos dos residuos de aminoacidos en longitud, y puede contener 2, 3, 4, o 5 residuos de aminoacidos. En ciertas realizaciones, el analogo de peptido de MNTF comprende 6 residuos de aminoacidos y una derivacion funcional, por ejemplo una palmitilacion. Una secuencia de peptidos se puede sintetizar mediante metodos conocidos por aquellos por aquellos expertos comunes en la tecnica, tal como, por ejemplo, smtesis de peptido utilizando maquinas de smtesis de peptido automaticas, tales como aquellas disponibles de Applied Biosystems (Foster City, CA). La tecnologfa descrita aqrn incluye smtesis y uso de peptidos cmlicos derivados de las SEQ ID NOs: 1-22.

Se pueden introducir modificaciones covalentes en un peptido al hacer reaccionar los residuos aminoacidos objetivo con un agente de derivacion organico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. La modificacion covalente de polipeptidos utilizando agentes de derivacion organicos es bien conocida por aquellos expertos en la tecnica. Por ejemplo, los residuos de cisteinilo se pueden hacer reaccionar con a- haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como acido cloroacetico o cloroacetamida, para dar carboximetilo o derivados de carboximetilo. Los residuos de histidina se pueden derivar por reaccion con pirocarbonato de dietilo a pH 5.5-7.0, o con bromuro de para-bromofenacilo a pH 6 en de cacodilato de sodio 1 M. El lisinilo y los residuos terminales amino se pueden hacer reaccionar con antndridos de acido succmico u otros acidos carboxflicos. Los residuos de arginilo se pueden modificar por reaccion con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3- butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. Las marcas espectrales se pueden introducir en los residuos tirosilo mediante reaccion con compuestos de diazonio aromaticos o tetranitrometano; se utilizan mas comunmente, N- acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de tirosilo 0-acetilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se pueden modificar selectivamente mediante reaccion con carbodiimidas (R'-NCN-R') tales como 1 -ciclohexil-3- (2-morfolinil- (4-etil) carbodiimida o 1 -etil-3 (4 azonia 4,4- dimetilpentil) carbodiimida. Adicionalmente, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos asparaginilo y glutaminilo mediante reaccion con iones amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se pueden desaminar a residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Otras modificaciones incluyen hidroxilacion de prolina y lisina, fosforilacion de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilacion de grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, y histidina (T. E. Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86), acetilacion de la amina de terminal N, y, en algunos casos, amidacion de los grupos carboxilo de terminal C.

Los peptidos de MNTF o analogos de los mismos descritos aqrn se pueden utilizar en ensayos y equipos para ensayos, ya sea en la forma libre o unidos a una molecula portadora tal como una protema o una partmula solida, asf como peptidos modificados unidos a una marca o trazador por ejemplo, biotina o isotiocianato de fluorescema.

El entrecruzamiento de un peptido de MNTF o analogo del mismo a una matriz de soporte insoluble en agua se puede realizar con agentes bifuncionales bien conocidos en la tecnica que incluyen 1,1 bis (diazoacetil) 2 feniletano, glutaraldehfdo, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con acido 4-azidosalidlico, imidoesteres homobifuncionales, que incluyen esteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes bifuncionales tales como propioimidato de metil-3 - [(p-azidofenil) ditio] producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar entrecruamientos en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua tales como hidratos de carbono activados con bromuro cianogeno se pueden emplear para inmovilizacion de protemas.

El entrecruzamiento de un peptido de MNTF o analogo del mismo a una segunda protema, que incluye un segundo peptido de MNTF o analogo del mismo, se puede realizar utilizando los reactivos bifuncionales descritos aqrn. En algunas realizaciones, se inserta un separador, por ejemplo un grupo ditiol o un grupo diamino, o multiples de residuos de aminoacidos, por ejemplo, glicina. El separador tambien puede ser un agente de entrecruzamiento homo o heterobifuncionales, por ejemplo, el agente de entrecruzamiento heterobifuncional N- (4- carboxi-ciclohexilmetil) maleimida.

Los peptidos o polipeptidos mas largos, por ejemplo una protema de fusion, se pueden producir por tecnicas de ADN recombinante estandar. Por ejemplo, un fragmento de ADN que codifica un fragmento de peptido de MNTF1 se puede clonar en un vector de expresion comercialmente disponible que ya contiene una protema heterologa, el resultado es un armazon interno del fragmento de peptido de MNTF1 fusionado a la protema heterologa.

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En ciertas realizaciones, un acido nucleico que codifica un peptido de MNTF1 y/o un componente descrito aqm se pueden utilizar, por ejemplo, para producir un peptido in vitro o in vivo para las diversas composiciones y metodos descritos aqm. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un acido nucleico que codifica un peptido de MNTFI es un componente de, por ejemplo, un vector en una celula recombinante. El acido nucleico se puede expresar para producir un peptido o polipeptido que comprende una secuencia de peptidos de MNTF1. El peptido o polipeptido puede ser secretado por la celula, o como parte de o dentro de la celula.

Cribado de compuestos

Los compuestos identificados por los procedimientos de cribado descritos aqm se pueden distinguir adicionalmente, y la eficacia del compuesto se puede evaluar, en base a su capacidad para tratar trastornos neuronales en sistemas de modelo de enfermedad y trastorno de cultivo de celulas animales aceptadas en la tecnica. En muchos ensayos de cribado de farmacos en los que prueban colecciones de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alto rendimiento con el fin de maximizar el numero de compuestos estudiados en un determinado periodo de tiempo. Los ensayos que se realizan en sistemas libres de celulas, tales como se pueden derivar con protemas purificadas o parcialmente purificadas, se utilizan a menudo como cribado “primario” que se pueden generar para permitir el rapido desarrollo y deteccion relativamente facil de una alteracion en un objetivo molecular que esta mediado por un compuesto de prueba. Adicionalmente, los efectos de la toxicidad y/o biodisponibilidad del compuesto de prueba celular pueden ser generalmente ignorados en el sistema in vitro, el ensayo en cambio se centra principalmente sobre el efecto del farmaco sobre el objetivo molecular que se puede manifestar en una alteracion de la union de4 afinidad con las protemas receptoras.

Por lo tanto, en otro aspecto, se proporciona un metodo para identificar un compuesto util para promover el crecimiento o supervivencia de las motoneuronas. En una realizacion, el metodo comprende las etapas de i) preparar una muestra que comprende un compuesto candidato, ii) poner en contacto una celula con dicha muestra, iii) determinar si se modula la expresion o actividad de un compuesto implicado en las rutas de transduccion de senal, y iv) determinar si la muestra es capaz de promover el crecimiento o supervivencia de las motoneuronas. En otras realizaciones, el metodo comprende adicionalmente la determinacion de si una muestra que contiene un compuesto candidato se regula por un peptido de MNTF o analogo del mismo, o, alternativamente, regula por un peptido de MNTF o analogo del mismo (por ejemplo, actividad, expresion, etc.). En otro aspecto, la tecnologfa descrita aqm incluye metodos para promover el crecimiento o supervivencia de las motoneuronas o para el tratamiento de un trastorno neuronal al administrar un compuesto identificado por los procedimientos de cribado descritos aqm.

En un ensayo de cribado de ejemplo, el compuesto de interes se pone en contacto con una mezcla que incluye una protema de union de MNTF (por ejemplo, una celula que expresa un receptor del peptido de MNTF) y un peptido de MNTF en condiciones en las que es normalmente capaz de unir un peptido de MNTF. A la mezcla luego se agrega una composicion que contiene un compuesto de prueba. La deteccion y cuantificacion de los complejos de peptido del receptor/MNTF proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto de prueba en la inhibicion (o potenciacion) de la formacion de complejos entre la protema receptora y el peptido de MNTF. Tambien se puede realizar un ensayo de control para proporcionar un valor de referencia para comparacion, en el que se agrega peptido de MNTF purificado y aislado a la protema del receptor y la formacion del complejo de receptor/peptido de MNTF se cuantifica en ausencia del compuesto de prueba.

La formacion de complejos entre la protema de union de peptido de MNTF y un peptido de MNTF se puede detectar por una variedad de tecnicas. Por ejemplo, la modulacion de la formacion de complejos se puede cuantificar utilizando, por ejemplo, protemas marcadas de forma detectable tales como peptidos de MNTF radiomarcados, marcados por fluorescencia, o marcados enzimaticamente, por inmunoensayo o por deteccion cromatografica. Para los ensayos libres de celulas, normalmente sera deseable inmovilizar ya sea el peptido de MNTF o la protema de union de peptido de MNTF para facilitar la separacion de los complejos de receptor /peptido de MNTF a partir de formas sin formacion de complejos de una de las protemas, asf como para acomodar la automatizacion del ensayo. Por ejemplo, una protema de fusion se puede proporcionar lo que agrega un dominio que permite que la protema se una a una matriz. Por ejemplo, las protemas de fusion glutation-S-transferasa/receptor (GST/receptor) se pueden adsorber sobre perlas de Sepharose de glutation (Sigma Chemical, St. Louis; Mo.) o placas de microtitulacion derivadas de glutation 35, que luego se combinan con el peptido de MNTF , por ejemplo, un peptido de MNTF marcado con S, y el compuesto de prueba y se incuban bajo condiciones que conducen a la formacion de complejos, por ejemplo, en condiciones fisiologicas de sal y pH, aunque se pueden desear condiciones ligeramente mas rigurosas. Despues de incubacion, las perlas se lavan para eliminar cualquier peptido de MNTF no unido, y el radiomarcador se determina directamente unido a perla de matriz (por ejemplo, perlas colocadas en escintilante), o en el sobrenadante despues que los complejos se disocian. Alternativamente, los complejos se pueden disociar de la perla, separados por gel de SDS-PAGE, y el nivel de peptido de MNTF encontrado en la fraccion de perlas se cuantifica del gel utilizando tecnicas electroforeticas estandar.

Otras tecnicas para inmovilizar protemas sobre matrices tambien estan disponibles para uso en el ensayo objeto. Por ejemplo, las porciones solubles de la protema de peptido de MNTF se pueden inmovilizar utilizando conjugacion de biotina y estreptavidina. Por ejemplo, las moleculas receptoras biotiniladas se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando tecnicas bien conocidas en el arte (por ejemplo, equipo de biotinilacion, Pierce

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Chemicals, Rockford, III.), e inmovilizarse en los pozos de placas recubiertas con estreptavidina de 96 pozos (Pierce Chemical). Alternativamente, los anticuerpos reactivos con la protema de union de peptido de MNTF pero que no interfieren con la union de ligando se pueden derivar a los pozos de la placa, y el receptor atrapado en los pozos mediante conjugacion de anticuerpos. Como anteriormente, las preparaciones de un peptido de MNTF y un compuesto de prueba se incuban en los pozos que presentan receptores de placa, y se puede cuantificar la cantidad de receptor/ complejo hedgehog atrapado en el pozo. Los metodos de ejemplo para detectar dichos complejos, ademas de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen inmunodeteccion de complejos utilizando anticuerpos reactivos con el peptido de MNTF, o que son reactivos con la protema receptora y compiten por la union con el peptido de MNTF; asf como ensayos unidos a enzimas que dependen de la deteccion de una actividad enzimatica asociada con el peptido de MNTF. En el caso de esto ultimo, la enzima se puede conjugar o proporcionar de forma qmmica como una protema de fusion con el peptido de MNTF. Para ilustrar, el peptido de MNTF se puede entrecruzar qmmicamente o fusionar geneticamente con fosfatasa alcalina, y la cantidad de peptido de MNTF atrapado en el complejo se puede evaluar con un sustrato cromogenico de la enzima, por ejemplo, paranitrofenilfosfato. Del mismo modo, se puede proporcionar una protema de fusion que comprende el peptido de MNTF y glutation-S-transferasa, y la formacion de complejos se cuantifica al detectar la actividad de GST utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (Habig et al., JBiol Chem, 249:7130 (1974)). Para la inmunodeteccion para cuantificar una de las protemas atrapadas en el complejo, se pueden utilizar los anticuerpos contra la protema, tales como los anticuerpos de peptido de anti-MNTF. Alternativamente, la protema que se va a detectar en el complejo puede ser “etiquetada con epftopo” en forma de una protema de fusion que incluye, ademas del peptido de MNTF o secuencia de peptidos de MNTF, un segundo polipeptido para el que los anticuerpos son facilmente asequibles (por ejemplo, desde fuentes comerciales). Por ejemplo, las protemas de fusion GST descritas anteriormente tambien se pueden utilizar para la cuantificacion de la union utilizando anticuerpos contra la unidad estructura de GST. Otros marcadores de epftopo utiles incluyen myc-epftopos (por ejemplo, vease Ellison et al., J Biol Chem. 266: 21150-21157 (1991)), que incluye una secuencia de 10 residuos de c-myc, asf como tambien el sistema pFLAG (International Biotecnologfas, Inc.) o el sistema A de protema pEZZ (Pharmacia, NJ).

Composiciones

Las composiciones farmaceuticas que incluyen uno o mas de los peptidos de MNTF o analogos de los mismos se describen aqrn junto con un diluyente y/o portador farmaceuticamente aceptable. Los portadores /diluyentes adecuados son bien conocidos en la tecnica e incluyen solucion salina u otro medio acuoso esteril, incluyendo opcionalmente componentes adicionales, tales como sales reguladoras y conservantes, o azucares, almidones, sales o mezclas de los mismos.

Las composiciones que contienen peptidos de MNTF se pueden proporcionar para uso en cualquier forma apropiada adecuada para el protocolo de administracion y/o las necesidades de un paciente.

La tecnologfa descrita aqrn incluye los medios de cultivo que son utiles para el establecimiento y propagacion de celulas madre, celulas progenitoras neuronales, celulas neuronales diferenciadas y celulas madre derivadas de neuronas motoras. Los medios son particularmente adecuados para la diferenciacion de celulas madre y el cultivo a largo plazo de celulas madre derivadas de neuronas motoras.

El medio de cultivo celular esta deseablemente suplementado con morfogenos y/o factores de crecimiento, y se optimiza de acuerdo con el tipo de celula individual deseada para ser cultivada. Dicha suplementacion y optimizacion estan dentro de la experiencia comun en la tecnica. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular puede ser suplementado con cualquiera o todos de los siguientes morfogenos y/o factores de crecimiento en los siguientes niveles aproximados (o dentro de un dfgito significativo): RA en 0.001 a 1 pM, Shh o agonista Shh, a 0.001-1 pM, y/o uno o mas peptidos de MNTF o analogos de los mismos en 0.01- 250 pg/ml.

Las formulaciones farmaceuticas descritas aqrn pueden incluir, como ingredientes opcionales, portadores farmaceuticamente aceptables, diluyentes, agentes solubilizantes o emulsionantes, y sales del tipo que esten disponibles en la tecnica. Ejemplos de dichas sustancias incluyen soluciones salinas normales, tales como soluciones salinas reguladas fisiologicamente y agua. Ejemplos espedficos no limitantes de portadores y/o diluyentes que son utiles en las formulaciones farmaceuticas incluyen agua y soluciones salinas reguladas fisiologicamente aceptables tales como soluciones salinas reguladas con fosfato a pH 7.0-8.0. Los portadores farmaceuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a agua esteril, soluciones de sal (por ejemplo, solucion de Ringer), alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidon, estearato de magnesio, talco, acido silfcico, parafina viscosa, esteres de acidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmaceuticas se pueden esterilizar y, se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificadores, sales para influir en la presion osmotica, reguladores, colorantes, y/o sustancias aromaticas y similares que no reaccionan perjudicialmente con los compuestos activos. Tambien se pueden combinar cuando se desee con otras sustancias activas, por ejemplo, inhibidores de enzimas, para reducir la degradacion metabolica.

Los compuestos proporcionados aqrn se pueden formular en una composicion farmaceutica, que puede incluir portadores farmaceuticamente aceptables, espesantes, diluyentes, reguladores, conservantes, agentes de superficie

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activa, Kpidos neutros o cationicos, complejos de Kpidos, liposomas, mejoradores de penetracion, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmaceuticamente aceptables y similares ademas del peptido.

Las composiciones farmaceuticas de manera general se formulan para ser administradas para un proposito terapeutico. Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir uno o mas ingredientes activos tales como interferones, agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestesicos, y similares. Las formulaciones para administracion parenteral pueden incluir soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener reguladores, liposomas, diluyentes y otros aditivos adecuados. Las composiciones farmaceuticas que comprenden los peptidos proporcionados aqu pueden incluir mejoradores de penetracion con el fin de mejorar el suministro alimentario de los peptidos. Los mejoradores de penetracion se pueden clasificar como pertenecientes a una de las cinco amplias categonas, es decir, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, surfactantes y no surfactantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 8, 91-192 (1991); Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7, 1-33 (1990)). Se puede incluir o mas mejoradores de penetracion de una o mas de estas amplias categonas.

Los diversos acidos grasos y sus derivados que actuan como mejoradores de penetracion incluyen, por ejemplo, acido cabnlico, acido valerico, acido oleico, acido laurico, acido caprico, acido minstico, acido palmttico, acido estearico, acido linoleico, acido liolenico, dicaprato, tricaprato, recinleato, monoolema (a k.a. 1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, acido capnlico, acido araquidonico, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2- ona, acilcarnitinas, acilcolinas, mono- y di-gliceridos y sales fisiologicamente aceptables de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.). Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92 (1991); Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7, 1 (1990); El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol. 44, 651-654 (1992)).

En ciertas realizaciones, analogos de peptido de MNTF de ejemplo incluyen derivados funcionales de un peptido de MNTF con un mejorador de penetracion, por ejemplo uno o mas acidos grasos adheridos de forma covalente a uno o mas grupos funcionales sobre el peptido. En algunas realizaciones, los analogos de peptido de MNTF incluyen peptidos representados en las SEQ ID NOs:1-22 que adicionalmente tienen una modificacion de terminal N con un mejorador de penetracion, por ejemplo un acido graso y/o alquilcarbonilo (Alqu- C(O)-) desde 2 hasta aproximadamente 22 atomos de carbono, y/o derivados funcionales de un peptido de MNTF con un grupo protector seleccionado del grupo que consiste de benciloxicarbonilo, tert-butiloxicarbonilo, fluorenil-metoxicarbonilo y aliloxicarbonilo, y Y es OH o NH2. En algunas realizaciones, el alquilcarbonilo contiene 10 a 20, 12 a 18, o 2-22 carbonos. En ciertas realizaciones, la modificacion de terminal N adecuada sobre los analogos de peptido de MNTF es mediante palmitilacion (por ejemplo acido palmftico).

Las funciones fisiologicas de la bilis incluyen la facilitacion de la dispersion y absorcion de lfpidos y vitaminas liposolubles (Brunton, Capftulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. McGraw-Hill, New York, N.Y., pages 934-935 (1996)). Las diversas sales biliares naturales y sus derivados sinteticos, actuan como mejoradores de penetracion. Por lo tanto, el termino “sal biliar” incluye cualquiera de los componentes de origen natural de la bilis asf como cualquiera de sus derivados sinteticos.

Se pueden utilizar formulaciones complejas que comprenden uno o mas mejoradores de penetracion. Por ejemplo, las sales biliares se pueden utilizar en combinacion con acidos grasos para hacer formulaciones complejas. Los agentes quelantes incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminotetraacetato disodico (EDTA), acido cftrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, salicilato de 5-metilo y homovanilato), derivados de N-acilo de colageno, laureth-9 y derivados N-amino acilo de beta-dicetonas (enaminas) [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems pagina 92 (1991); Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7, 1-33 (1990); Buur et al., J. Control Rel. 14, 43-51 (1990)). Los agentes quelantes tienen la ventaja agregada de tambien servir como inhibidores de la DNasa.

Los surfactantes incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, eter de polioxietileno-9-laurilo y eter de polioxietilen 20- cetilo (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92 (1991)); y emulsiones de productos qmmicos perfluorados, tales como FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Phamacol. 40, 252-257 (1988)). Los no surfactantes incluyen, por ejemplo, ureas dclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92 (1991)); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco sodico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol. 39, 621-626 (1987)).

Los portadores farmaceuticamente aceptables tfpicos incluyen, pero no se limitan a, agentes de union (por ejemplo, almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa, etc.); rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azucares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sflice, dioxido de silicio coloidal, acido estearico, estearatos metalicos, aceites vegetales hidrogenados, almidon de mafz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidon, glicolato de almidon sodio, etc.); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).

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Las composiciones descritas aqm pueden contener adicionalmente otros componentes adyuvantes encontrados convencionalmente en composiciones farmaceuticas, en sus niveles establecidos por la tecnica de uso. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmaceuticamente activos compatibles adicionales tales como, por ejemplo, antiprunticos, astringentes, anestesicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales utiles para formular ffsicamente diversas formas de dosificacion de la composicion descrita aqm, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, dichos materiales, cuando se agregan, no debenan interferir indebidamente con las actividades biologicas de los componentes de las composiciones proporcionadas aqm.

Independientemente del metodo por el cual los compuestos se introducen en un paciente, se pueden utilizar sistemas de dispersion coloidal como veldculos de administracion para mejorar la estabilidad in vivo de los peptidos y/o para dirigir los peptidos a un tipo de organo, tejido o celula particular. Los sistemas de dispersion coloidal incluyen, pero no se limitan a, complejos de macromoleculas, nanocapsulas, microesferas, perlas y sistemas con base en lfpidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, liposomas y complejos de lfpido: peptido de estructura no caracterizada. Un ejemplo de un sistema de dispersion coloidal es una pluralidad de liposomas. Los liposomas son esferas microscopicas que tienen un nucleo acuoso rodeado por una o mas capas externas hechas de lfpidos dispuestos en una configuracion de bicapa (vease, en general, Chonn et al., Current Op. Biotech. 6, 698-708 (1995)).

En ciertas realizaciones, los peptidos de MNTF y analogos de MNTF se pueden incorporar en o utilizar en conjunto con una biodistribucion que dirige la unidad estructural, que incluye uno o mas polfmeros, para dirigir la biodistribucion del peptido de MNTF o analogo de MNTF u otro compuesto proporcionado aqm a la proximidad de un objetivo deseado o para permitir la liberacion continua del mismo. Los agentes activos incluyen, por ejemplo, compuestos utiles para aumentar la eficacia terapeutica, para optimizar la biodistribucion y biodisponibilidad, para reducir los danos en los tejidos, para promover la curacion, o para aumentar la comodidad del paciente; agentes activos de ejemplo incluyen agentes vasoactivos, anestesicos, agentes terapeuticos para isquemia, factores de crecimiento y citoquinas. Alternativamente, las formas de dosificacion de perlas polimericas de micropartfculas o nanopartfculas se pueden utilizar para las composiciones proporcionadas aqm. Los compuestos proporcionados aqm se pueden utilizar en combinacion con un agente activo y encapsular en una forma de dosificacion de partfculas con una serie de moleculas de ligando o anti-ligando unidas a los mismos.

De esta manera, los peptidos de MNTF y analogos de MNTF, y otros compuestos proporcionados aqm, solos o en combinacion con otros agentes activos, se liberan en ese sitio con el tiempo para proporcionar un beneficio terapeutico sostenido. Las formas de dosificacion de liberacion sostenida tambien son utiles en relacion con otros agentes activos utiles en los metodos descritos aqm, tales como factores de crecimiento, citoquinas, y similares. La liberacion del agente activo a partir de las formas de dosificacion de partfculas puede ocurrir como resultado de la difusion y erosion de la matriz de partfculas. El mdice de biodegradacion impacta directamente la cinetica de liberacion del agente activo.

En ciertas realizaciones, las formulaciones parenterales de liberacion controlada de peptidos de MNTF, analogos de MNTF, y compuestos descritos aqm se pueden hacer como implantes, inyecciones oleosas, o como sistemas de partfculas. Los sistemas de partfculas incluyen microesferas, micropartfculas, microcapsulas, nanocapsulas, nanoesferas y nanopartfculas. Las microcapsulas contienen la protema terapeutica como un nucleo central. En las microesferas el producto terapeutico se dispersa en toda la partfcula. Se pueden utilizar liposomas para liberacion controlada, asf como farmaco que espedfico del farmaco atrapado.

En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica descrita aqm, que incluye peptidos de MNTF y analogos de MNTF, se puede administrar por via local, topica, nasal, oral, gastrointestinal, intrabronquial, intravesical, intravaginal, en el utero, por via subcutanea, intramuscular, periarticular, intraarticular, en el lfquido cefalorraqmdeo (ICFS), en el tejido cerebral (por ejemplo, administracion intracraneal), en la medula espinal, en heridas, intraperitoneal o intrapleural, o de forma sistemica, por ejemplo, por via intravenosa, intraarterial, intraportal o directamente en el organo.

Una variedad de cateteres y rutas de suministro se pueden utilizar para conseguir administracion intracoronaria, como se conoce en la tecnica. Por ejemplo, una variedad de cateteres de uso general, asf como cateteres modificados, adecuados para uso como se describe aqm estan disponibles en proveedores comerciales tales como Advanced Cardiovascular Systems (ACS), Target Therapeutics and Cordis. Tambien, cuando se logra el suministro al miocardio por inyeccion directamente en una arteria coronaria, una serie de metodos se puede utilizar para introducir un cateter en la arteria coronaria, como se conoce en la tecnica. A modo de ilustracion, un cateter se puede introducir convenientemente en una arteria femoral y se enrosca retrogrado a traves de la arteria iliaca y la aorta abdominal y en una arteria coronaria. Alternativamente primero, se puede introducir un cateter en una arteria braquial o carotida y se enrosca retrogrado a una arteria coronaria. Descripciones detalladas de estas y otras tecnicas se pueden encontrar en el arte (vease, por ejemplo, Topol, E J (ed.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2nd Ed. (W.B. Saunders Co. 1994); Rutherford, R B, Vascular Surgery, 3rd Ed. (W.B. Saunders Co. 1989); Wyngaarden J B et al. (eds.), The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (W. B. Saunders, 1992); and Sabiston, D, The Textbook of Surgery, 14th Ed. (W.B. Saunders Co. 1991)).

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Los compuestos proporcionados aqrn se pueden administrar de forma parenteral. Ciertos compuestos se combinan con un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable para producir una composicion farmaceutica. Los portadores y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotonicas, por ejemplo solucion salina regulada con fosfato. La composicion se puede formular para administracion parenteral, intramuscular, intracerebral, intravenosa, subcutanea, o transdermica. La formulacion que se administra puede contener dichos agentes. Ejemplos de estos agentes incluyen agentes cationicos (por ejemplo fosfato de calcio y DEAE-dextrano) y lipofectantes (por ejemplo lipofectamTM y Transfectam TM).

Las formulaciones para administracion topica pueden incluir parches transdermicos, unguentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, lfquidos y polvos. Los portadores farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Tambien pueden ser utiles guantes recubiertos, condones, y similares. Las composiciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, sobres o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de dispersion o aglutinantes. Las composiciones para administracion parenteral pueden incluir soluciones acuosas esteriles que tambien pueden contener reguladores, diluyentes y otros aditivos adecuados. En algunos casos, puede ser mas eficaz tratar a un paciente con un peptido en conjunto con otras modalidades terapeuticas tradicionales con el fin de aumentar la eficacia de un regimen de tratamiento. Como se utiliza aqrn, el termino “regimen de tratamiento” pretende abarcar modalidades terapeuticas, paliativas y profilacticas.

La dosificacion puede depender de una serie de factores, que incluyen gravedad y capacidad de respuesta del estado de enfermedad que se va a tratar, y con el transcurso del tratamiento que dura desde varios dfas hasta varios meses, o hasta que se efectua una cura o se logra una disminucion del estado de enfermedad. La toxicidad y eficacia terapeutica de los compuestos proporcionados aqrn se puede determinar mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o animales experimentales. Por ejemplo, al determinar la LD50 (la dosis letal al 50% de la poblacion) y la ED50 (la dosis terapeuticamente efectiva en el 50% de la poblacion). La relacion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y se puede expresar como la relacion LD50/ED50. Los compuestos que exhiben grandes indices terapeuticos son utiles. Aunque se pueden utilizar compuestos que presentan efectos secundarios toxicos, se debe tener cuidado para disenar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio de los tejidos afectados con el fin de minimizar el dano potencial a las celulas no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.

Se pueden utilizar los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios animales para formular un rango de dosificacion para uso en humanos. La dosificacion de dichos compuestos debe estar dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada. Para cualquier compuesto utilizado como se describe aqrn, la dosis terapeuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para conseguir un rango de concentracion en plasma circulante que incluye el IC50 (es decir, la concentracion del compuesto de ensayo que logra una inhibicion maxima media de los smtomas) como se determina en el cultivo celular. Dicha informacion se puede utilizar para determinar con mayor precision las dosis utiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento. El programa de dosificacion se puede calcular a partir de mediciones de la acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente. Las dosificaciones pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los compuestos individuales que incluyendo peptidos de MNTF y analogos de MNTF, y generalmente se pueden estimar con base en EC50 encontrado para ser efectivo in vitro y en modelos animales in vivo. Un experto en la tecnica reconocera que las dosificaciones pueden variar dependiendo de como y donde se administra un peptido de MNTF o analogo (por ejemplo, in vitro, in vivo, por via topica, sistemica, etc.).

Por ejemplo, en un aspecto, los peptidos de MNTF y analogos de MNTF se pueden administrar para lograr desde aproximadamente 0.01 microgramos por ml (jg/mL) hasta aproximadamente 1 mg por ml, desde aproximadamente 0.1 |jg/mL hasta aproximadamente 50 jg/mL, desde aproximadamente 0.1jg/mL hasta aproximadamente 150 jg/mL, desde aproximadamente 1jg/mL hasta aproximadamente 200 jg/mL, y desde aproximadamente 0.1jg/mL hasta aproximadamente 500 jg/mL, incluyendo cualquier rengo dentro de estos rangos, las concentraciones finales en un sitio objetivo (por ejemplo en celulas madre de un cultivo celular de ES).

Cantidades de dosificacion alternativas adecuadas pueden, por ejemplo, variar desde aproximadamente 0.1 ug hasta una dosis total de aproximadamente 1 gramo, dependiendo de la ruta de administracion. Se proporciona grna para las dosificaciones y procedimientos de suministro particulares en la bibliograffa y en general disponibles para los practicantes en la tecnica. Aquellos expertos en la tecnica emplearan diferentes formulaciones para nucleotidos que para protemas o sus inhibidores. Del mismo modo, la administracion de polinucleotidos, polipeptidos, y los compuestos proporcionados aqrn se especificara para celulas, condiciones y lugares particulares. En general, la dosificacion generalmente vana 0.01 mg/kg hasta 1000 mg por kg de peso corporal, y mas normalmente, por ejemplo, desde 0.1 mg/kg hasta 300 m g por kg de peso corporal, y se puede administrar una o mas veces al dfa, semanal, mensual o anualmente, o incluso una vez o mas durante un penodo de tiempo de 2 a 20 anos. En ciertas realizaciones, la dosificacion se puede administrar desde inmediatamente despues de cirugfa hasta 24 horas, en otra realizacion; la

dosificacion se desde 2 horas y hasta 24 horas. Las composiciones de accion prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 dfas, cada semana, o cada dos semanas dependiendo del mdice de media vida y de depuracion de la formulacion particular. Las personas de experiencia comun en la tecnica pueden estimar facilmente los indices de repeticion para la dosificacion en base a los tiempos de residencia medidos y concentraciones del farmaco en los fluidos o tejidos 5 corporales. Despues de un tratamiento exitoso, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de enfermedad, en donde se administra un compuesto seleccionado en dosis de mantenimiento, que vanan desde 0.01 mg/kg hasta 100 mg por kg de peso corporal, una vez o mas al dfa, a una vez cada 20 anos. En el tratamiento o prevencion de ciertas afecciones, un nivel de dosificacion apropiado sera generalmente de aproximadamente 0.001 a 100 mg por kg de peso corporal del paciente por dfa que se 10 puede administrar en dosis unicas o multiples. Un nivel de dosificacion adecuado puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/kg por dfa. En ciertas realizaciones, los compuestos proporcionados aqrn, incluyendo peptidos de MNTF y analogos de los mismos, se administran en una cantidad para lograr las concentraciones in vivo desde aproximadamente 1 micromolar hasta aproximadamente 1 milimolar, desde aproximadamente 10 micromolar hasta aproximadamente 500 micromolar, o desde aproximadamente 30 micromolar hasta aproximadamente 300 micromolar, y 15 desde aproximadamente 25 micromolar hasta aproximadamente 300 micromolar de concentracion final sobre el sitio danado, y que incluye, aproximadamente 25 micromolar, o aproximadamente 220 micromolar, o aproximadamente 300 micromolar de concentracion final sobre el sitio danado, y aun mas normalmente entre aproximadamente 1 micromolar hasta aproximadamente 100 micromolar..

En ciertas realizaciones, se puede administrar dosificacion de 1, 5, 10, 20, 50, 100, 150, o 200 mg/kg.

20 Los compuestos descritos aqrn se pueden utilizar en reactivos diagnosticos, terapeuticos, de profilaxis y como reactivos de investigacion y en equipos. La provision de medios para la deteccion de compuestos de interes (por ejemplo, peptidos de MNTF y analogos de MNTF) se puede llevar a cabo de forma rutinaria. Dicha provision puede incluir la conjugacion de la enzima, radiomarcado o cualesquier otros sistemas de deteccion adecuados. Tambien se pueden preparar equipos para deteccion de la presencia o ausencia de compuestos de interes.

25 Como se utiliza aqrn, las lesiones de la medula espinal pueden incluir lesiones derivadas de un tumor, trauma mecanico, y trauma qmmico.

En ciertos aspectos, se proporcionan composiciones y metodos de tratamiento terapeutico comprenden administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de un peptido MNTF o analogo del mismo como se define aqrn, despues de lesion de una ruta neuronal, o en anticipacion de dicha lesion, durante un tiempo y a una concentracion suficiente 30 para mantener la ruta neuronal, que incluye la reparacion de las rutas danadas, o inhibir el dano adicional a las mismas.

En otro aspecto, la tecnologfa descrita aqrn incluye composiciones para uso en metodos de tratamiento terapeuticos para mantener las rutas neuronales. Dichos metodos de tratamiento incluyen administracion al sujeto, despues de lesion de una ruta neuronal o en anticipacion de dicha lesion, un compuesto que estimula una concentracion terapeuticamente eficaz de un MNTF endogeno.

35 Los aspectos y realizaciones descritas aqrn proporcionan metodos para proteger las neuronas de efectos destructivos de tejidos asociados con la respuesta inmunitaria e inflamatoria del cuerpo a la lesion del nervio.

En ciertas realizaciones, se proporcionan metodos, composiciones y dispositivos para estimular la reparacion celular de las neuronas danadas y rutas neuronales, incluyen regeneracion de las dendritas o axones danados.

En un aspecto, los peptidos de MNTF y analogos de los mismos descritos aqrn son utiles en la reparacion de las rutas 40 neuronales danadas del sistema nervioso periferico. En particular, los MNTF son utiles para la reparacion de las rutas neuronales danadas, que incluyen fibras nerviosas seccionadas o de otra forma danadas. Espedficamente, los MNTF descritos aqrn son capaces de estimular una regeneracion completa del nervio axonal, que incluye vascularizacion y reformacion de la vaina de mielina. El MNTF se puede proporcionar al sitio de la lesion en un portador biocompatible, bioabsorbible capaz de mantener el MNTF en el sitio y, donde sea necesario, medios para dirigir el crecimiento axonal 45 desde el extremo proximal hasta el extremo distal de una neurona cortada. Por ejemplo, los medios para dirigir el crecimiento axonal pueden ser requeridos donde la regeneracion del nervio es para ser inducida a traves de una distancia extendida, tal como mayor de 10 mm. Se contemplan muchos portadores capaces de proporcionar estas funciones. Por ejemplo, los portadores utiles incluyen materiales sustancialmente insolubles o soluciones viscosas preparadas como se describe aqrn que comprenden laminina, acido hialuronico o colageno, u otros materiales 50 sinteticoa, polimericos biocompatibles adecuado tales como acidos polibutmco polilactico, o poliglicolico y/o copolfmeros de los mismos.

En ciertas realizaciones, un peptido de MNTF o analogo del mismo se dispone en un canal de grna del nervio que abarca la distancia de la ruta danada. El canal actua como una cubierta protectora y un medio ffsico para guiar el crecimiento de las neuritas. Los canales utiles comprenden una membrana biocompatible, que puede ser tubular en su 55 estructura, que tiene una dimension suficiente para abarcar el espacio en el nervio que se va a reparar, y que tiene

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aberturas adaptadas para recibir extremos de nervio cortado. La membrana puede estar hecha de cualquier material biocompatible, no irritante, tal como silicona o un polfmero biocompatible, tal como polietileno o polietileno de acetato de vinilo. La carcasa tambien se puede componer de polfmeros biocompatibles, bioabsorbibles, que incluyen, por ejemplo, colageno, acido hialuronico, acidos polilactico, polibutmco, y poliglicolico. En una realizacion, la superficie externa del canal es sustancialmente impermeable.

En otro aspecto, los peptidos de MNTF y analogos de los mismos descritos aqrn son utiles para proteger contra el dano asociado con la respuesta inmunitaria/inflamatoria del cuerpo a una lesion inicial en el tejido nervioso. Dicha respuesta puede seguir a un traumatismo en el tejido nervioso, causado, por ejemplo, por una disfuncion autoinmunitaria, lesion neoplasica, infeccion, trauma qmmico o mecanico, enfermedad, por interrupcion del flujo de sangre a las neuronas o celulas gliales, o mediante otro trauma en el nervio o material circundante. Por ejemplo, el dano primario que resulta de hipoxia o isquemia-reperfusion despues de oclusion de un suministro de sangre neuronal, como en una apoplejfa embolica, se considera que es inmunologicamente asociada. Ademas, por lo menos parte del dano asociado con un numero de tumores cerebrales primarios tambien parece estar inmunologicamente relacionado. La aplicacion de un peptido MNTF o analogo del mismo, ya sea directamente o por via sistemica puede aliviar y/o inhibir la respuesta inmunologicamente relacionada con una lesion neuronal.

En otra realizacion, la tecnologfa descrita aqrn abarca el uso de variantes de especies biologicamente activas (filogeneticas) de cualquiera de los factores de MNTF mencionados aqrn, que incluyen variantes de la secuencia de aminoacidos conservadores, protemas codificadas por variantes de secuencia de nucleotidos degeneradas, y factores de MNTF que comparten los dominios de MNTF conservados y codificados por un ADN competente para hibridarse en condiciones de rigurosidad estandar a un ADN que codifica un factor de MNTF descrito aqrn.

Los compuestos descritos aqrn tambien se pueden utilizar para propositos de investigacion. Por lo tanto, la hibridacion espedfica exhibida por los peptidos se puede utilizar para ensayos, purificaciones, preparaciones de productos celulares y en otras metodologfas que pueden ser apreciadas por las personas de experiencia comun en la tecnica.

Los terminos cientfficos y tecnicos utilizados aqrn tienen significados comunmente entendidos por un experto comun en la tecnica a la que pertenece la presente descripcion, a menos que se defina de otra forma. Se hace referencia aqrn a diversas metodologfas conocidas por aquellos expertos en la tecnica. Los trabajos de referencia estandar que establecen los principios generales de la tecnologfa del ADN recombinante incluyen Sambrook, J., et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N.Y. (1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), juntos e individualmente mencionados aqrn como “Sambrook”; McPherson, M. J., Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991); Jones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford( 1992); Austen, B. M. and Westwood, O. M. R., Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford (1991); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, and Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (juntas e individualmente mencionadas aqrn como Harlow and Lane), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); and Agrawal, ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties Humana Press Inc., New Jersey, 1993); Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. (1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press (1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900 (1993); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P.D. Rathjen et al., Reprod. Fertil. Dev., 10:31 (1998)); CNS Regeneration: Basic Science and Clinical Advances, M. H. Tuszynski & J. H. Kordower, eds., Academic Press, (1999).

Ciertas tecnicas que pueden ser utiles en la practica de la tecnologfa descrita aqrn se describen en diversas patentes y solicitudes de patentes, que incluyen la Patente Estadounidense No. 5,851,832, que reporta celulas madre neuronales multipotentes obtenidas de tejido cerebral, la Patente Estadounidense No. 5,766,948 que reporta neuroblastos productores de hemisferios cerebrales de recien nacidos, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,654,183 y 5,849,553 que reportan el uso de celulas madre de la cresta neuronal de mairnferos, Patente Estadounidense No. 6,040,180 que reporta la generacion in vitro de neuronas diferenciadas a partir de cultivos de celulas madre del SNC de marnfferos multipotenciales, documentos WO 98/50526 y WO 99/01159, que reportan la generacion y aislamiento de las celulas madre neuroepiteliales, precursores de astrositos-oligodendrocitos, y precursores neuronales de linaje restringido, y la Patente Estadounidense No. 5,968,829 que reporta celulas madre neuronales obtenidas de prosencefalo embrionario y cultivado con un medio que comprende glucosa, transferrina, insulina, selenio, progesterona, y varios otros factores de crecimiento.

Cualesquier materiales y/o metodos adecuados conocidos por los expertos se pueden utilizar en la realizacion de la tecnolog^a descrita aqm; sin embargo, se describen aqm ejemplos no limitantes de materiales y/o metodos.

La tecnologfa descrita aqm se puede apreciar en ciertos aspectos con referencia a los siguientes ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustracion, no a modo de limitacion. Los materiales, reactivos y similares a los que se hace 5 referencia en los siguientes ejemplos se pueden obtener de fuentes comerciales, a menos que se indique lo contrario.

Como se utiliza aqm, se contempla que la eficacia de los peptidos de MNTF y la secuencia y/o analogos funcionales de los mismos se puede determinar por protocolos identicos y/o sustancialmente similares como se describe en los siguientes ejemplos. Ademas, se contempla que la eficacia de cualquiera de los peptidos de MNTF como se establece en las SEQ ID NOs: 1-22, y analogos de las mismas, se puede determinar de acuerdo con las condiciones 10 experimentales que se exponen aqm.

Ejemplo 1

Prueba de eficacia de peptido de MNTF o analogo del mismo para atenuar la muerte celular en un modelo de supervivencia celular de neuronas motoras de rata in vitro.

El ejemplo 1 ilustra la capacidad del analogo de 6 aminoacidos (GM6) y varios analogos mas cortos de peptidos del 15 factor motoneuronotrofico (MNTF) para atenuar la muerte celular en un modelo de supervivencia celular de neuronas motoras de rata in vitro. La administracion de GM6 (SEQ ID NO: 2) y otros analogos de (3-mer, 4-mer, 5-mer) a 10 microgramos/ml, demostro una atenuacion de la muerte celular de las neuronas motoras, a las cuales se le especifico el analogo. Los analogos mostraron un patron unico de efectos troficos que los analogos que contienen el terminal de fenilalanina mas eficaz. Estos datos indican que el GM6 y algunos de los analogos son factores troficos efectivos en el 20 modelo de supervivencia celular de las neuronas motoras.

Abreviaturas/Terminologfa para este Ejemplo.

“GM6” y “6mer” significa analogo de peptido de MNTF de 6 aminoacidos de ejemplo.

“Genervon” y “GB” significa mean Genervon Biopharmaceuticals, LLC.

“I.V.” significa por via intravenosa.

25 “NTS” significa Neurological Testing Service, que es una organizacion de investigacion contrato.

El GM6 es un peptido de 6 aminoacidos sintetizado. Se proporciona GM6 como un solido y la formulacion se prepara por NTS (solucion almacenada a 4°C). Los analogos de GM6 incluyen homologos de secuencia de los peptidos de GM6.

“PD” significa enfermedad de Parkinson 30 “BDNF” significa factor neurotrofico derivado del cerebro “GDNF” significa factor neurotrofico derivado del glial “CNTF” significa factor neurotrofico ciliar “Genervon” significa Genervon Biopharmaceuticals “GB” significa Genervon Biopharmaceuticals, LLC 35

Metodos y materiales

Purificacion y cultivo de neuronas motoras. Se prepararon cultivos de neuronas motoras espinales de ratas Sprague- Dawley E14.5 (Charles River Labs). Brevemente, las medulas espinales diseccionadas se digirieron en 0.025% de tripsina (Gibco) durante 8 minutos a 37°C. El tejido se transfirio a una solucion que contema L-15 (Gibco) suplementado 40 con 2% de suero de caballo (Gibco), insulina (5 pg/ml); putrescina (1x10-4 M), conalbumina (100 pg/ml), selenito de sodio (3x10-8 M), progesterona (2x10-8 M), glucosa (3.6 pg/ml), penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (100 pg/ml), ADNasa (100 pg/ml) y albumina de suero bovino (BSA; 0.4%). El tejido luego se trituro utilizando un Pipetman de 1 ml y la suspension se dispuso en capas sobre un colchon de 10.4% de Optiprep (Nycomed Pharma) en L-15 en un tubo

5

10

15

20

25

Falcon de 15 ml. La suspension en capas se centrifugo a 830xg durante 15 min. Las celulas en la interfase se suspendieron en PBS que contema BSA al 0.5% y se separaron por inmunoafinidad utilizando el anticuerpo IgG-192 p75 espedfico seguido por clasificacion de celulas utilizando microperlas magneticas (Miltenyi Biotec) para purificar las neuronas motoras. El medio de neuronas motoras consiste en medio neurobasal (Gibco) complementado con suplemento B27 (Gibco), glutamato (25 jM), 2-mercaptoetanol (25 jmM) y 2% de suero de caballo. Las neuronas motoras se sembraron en cubreobjetos recubiertos con laminina a una densidad de 3000 celulas/cubreobjetos a menos que se establezca lo contrario. Un coctel de factores neurotroficos (NTF: 1 ng/ml de BDNF, 100 pg/ml de GDNF, 10 ng/ml de CNTF) se agrego en el momento de la siembra de celulas. Despues de 24 h en cultivo, las neuronas motoras se trataron mediante adicion de los diferentes analogos diluidos en medio de neuronas motoras que carecen de NTF.

Ensayo de supervivencia. Las neuronas motoras espinales se prepararon de embriones de rata E14.5 como se describe. Las celulas se cultivaron en presencia de NTF durante 24 h y la viabilidad (V1) se estimo al contar el numero de celulas positivas a AM calcema. Para los estudios de viabilidad, las neuronas motoras se cultivaron en ausencia de NTF con adicion de los analogos o GM6. El porcentaje de neuronas motoras viables se calculo al contar el numero de neuronas.

Analisis estadfstico. El numero de neuronas supervivientes de motor para cada tratamiento se expreso como un porcentaje del numero de neuronas motoras que sobrevivieron en presencia de solo NTF (control). Cinco platos se utilizaron para cada condicion. Se analizaron las diferencias entre los tratamientos para determinar su significacion estadfstica mediante ANOVA de una via con la prueba de Tukey post hoc.

Grupos de tratamiento. Todos los grupos se sometieron a GM6, analogos o eran controles.

GM6

2309 2308 2307 2312 2311 2310 3223 3222 3221 No NTF

Resultados

Supervivencia celular. La eficacia trofica del GM6 y analogos se evaluo en un modelo de supervivencia celular de neuronas motoras de rata in vitro. El numero de neuronas supervivientes de motor para cada tratamiento se expreso como un porcentaje del numero de neuronas motoras que sobreviven en presencia de solo NTF (control). Los datos se resumen en la Tabla 1 y Figura 1.

Tabla 1. Resumen de peptidos de MNTF y su eficacia trofica en supervivencia de neuronas motoras.

# de catalogo CS

SEQ ID NO: Supervivencia de MN (%Ctrl) Valor P

GM6(GMP014)

SEQ ID NO: 2 94.02 ± 3.53 <0.0001

2309

SEQ ID NO:12 81.5 ± 4.50 <0.0001

2308

SEQ ID NO: 6 66.38 ± 5.86 0.00012

2307

SEQ ID NO: 4 35.00 ± 5.28 0.017

2312

SEQ ID NO: 17 12.02 ± 2.31 0.69

2311

SEQ ID NO: 18 9.66 ± 2.50 0.39

2310

SEQ ID NO: 19 12.26 ± 1.70 0.70

3223

SEQ ID NO: 20 15.46 ± 1.82 0.73

3222

SEQ ID NO: 21 10.64 ± 1.72 0.46

3221

SEQ ID NO: 22 9.08 ± 2.32 0.33

No NTF

13.92 ± 3.42 N/A

NA = no aplicable

Se utiliza 10 pg/mL de cada solucion.

Los conjuntos de 3, 4, 5 mers se produjeron por smtesis en fase solida para representar los metabolites de 6mer resultantes de la degradacion de la secuencia 6mer Phe-Ser-Arg-Tyr-Ala-Arg que tiene lugar a partir del terminal N y 5 terminal C. La cantidad de peptido en el producto final es generalmente de ~80%, el contenido de agua y iones de acetato generalmente representan ~20%.

La administracion de GM6 (SEQ ID NO: 2) o analogos que contienen una fenilalanina de terminal N a 10 pg/ml de dosis demostro proteccion contra la perdida de celulas neuronales en medio de cultivo que carece de los NTF convencionales. Esto indica que el GM6 y analogos del mismo son efectivos en el mantenimiento de la supervivencia celular en el cultivo 10 celular de neuronas motoras de rata y pueden ser beneficiosos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con las neuronas motoras.

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   Reivindicaciones

   1. Un peptido de MNTF que consiste de entre 2 y 5 aminoacidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, en donde dicho peptido de MNTF exhibe actividad MNTF y dicho peptido de MNTF comprende por lo menos los residuos de aminoacidos 17 y 18 de la SEQ ID NO: 1, y en donde dicho peptido de MNTF es para uso en medicina.
2. 2. El peptido de MNTF de acuerdo con la reivindicacion 1 seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 12 para uso en medicina.
3. 3. El peptido de MNTF de acuerdo con la reivindicacion 1 que consiste de entre 3 y 5 aminoacidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1 para uso en medicina.
4. 4. El peptido de MNTF de acuerdo con la reivindicacion 3 que tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, 6 o 12 para uso en medicina.
5. 5. El peptido de MNTF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso en medicina, en donde dicho peptido de MNTF se modifica mediante enlace covalente con un mejorador de penetracion, por lo cual se mejora la capacidad de penetracion de tejido de la composicion.
6. 6. El peptido de MNTF de acuerdo con la reivindicacion 5 para uso en medicina, en donde dicho peptido de MNTF es se modifica terminalmente con N mediante enlace covalente a dicho mejorador de penetracion.
7. 7. El peptido de MNTF de acuerdo con la reivindicacion 6 para uso en medicina, en donde dicho mejorador de penetracion se adhiere de forma covalente a dicho peptido de MNTF mediante derivacion de N-acilo de uno o mas grupos amino libres.
8. 8. El peptido de MNTF de acuerdo con la reivindicacion 5 para uso en medicina, en donde dicho mejorador de penetracion es un acido alquil carboxflico opcionalmente sustituido de 2 a 22 carbonos, en donde dicho acido alquil carboxflico es opcionalmente hidroxilatado, insaturado, y/o sulfatado.
9. 9. El peptido de MNTF de acuerdo con la reivindicacion 8 para uso en medicina, en donde dicho mejorador de penetracion es un acido graso seleccionado de acido cabnlico, acido oleico, acido laurico, acido caprico, acido capnlico, acido hexanoico, acido minstico, acido palmftico, acido valerico, acido estearico, acido linoleico, acido liolenico, acido araquidonico, acido oleico, acido elafdico, acido erucico, y acido nervonico.
10. 10. Una composicion que comprende un peptido de MNTF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un portador farmaceuticamente aceptable para uso en medicina.
11. 11. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 10 para uso en un metodo para promover el crecimiento o mantenimiento de neuronas in vivo, el metodo comprende administrar dicha composicion a una celula neuronal, en donde la composicion tiene una o mas actividades biologicas seleccionadas del grupo que consiste de promover el crecimiento de neuronas, promover el mantenimiento de neuronas, promover crecimiento de neuritas, promover regeneracion axonal de una motoneurona axotomizada, mejorar la funcion motora, reparar la ruta neuronal danada, regenerar una ruta neuronal, o aliviar un defecto neuronal.
12. 12. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 10 para uso en un metodo para aliviar un trastorno neuronal en un animal afligido con el trastorno, el metodo comprende administrar al animal dicha composicion en una cantidad suficiente para aliviar el trastorno.
13. 13. Un peptido de MNTF que consiste de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6 o 12.