ES2569659T3 - Gen que expresa una proteína de fusión presentada en la superficie de bifidobacterium - Google Patents
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Abstract
Un gen para la expresión de una proteína o péptido diana en una superficie de una bifidobacterium, en donde el gen codifica una proteína de fusión de proteína de membrana de unión de sustrato GNB/LNB, de bifidobacterium y la proteína o péptido diana, que están vinculados en este orden desde el terminal-N.
Description
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rigurosas significa un ADN que se puede obtener mediante hibridación de colonias, hibridación en placa, hibridación por transferencia Southern, o similares utilizando el ADN mencionado anteriormente como sonda. Los ejemplos específicos de tales ADN incluyen un ADN que puede ser identificado mediante la realización de la hibridación a aproximadamente 65 ºC en presencia de aproximadamente cloruro de sodio 0.7 a 1.0 M utilizando un filtro en el cual se inmoviliza un ADN derivado de una colonia o una placa y después de lavar el filtro con una solución de SSC que tiene una concentración de aproximadamente 0.1 a 2 veces (una solución SSC con una concentración de 1 vez se compone de cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM) a aproximadamente 65ºC. Los ejemplos específicos del ADN que se puede hibridar mencionado anteriormente incluyen un ADN que tiene una homología de aproximadamente 80% o mayor, preferiblemente un ADN que tiene una homología de aproximadamente 90% o mayor, más preferiblemente un ADN que tiene una homología de aproximadamente 95% o mayor con la secuencia base del gen que codifica cada proteína obtenida basándose en la información conocida de la secuencia de base mencionado anteriormente o la información de la secuencia de aminoácidos.
2. Preparación de un vector para la transformación de bifidobacterium
Se prepara un ADN recombinante que incluye el gen que codifica cada proteína, preparado como se describe en el anterior 1. Un ADN recombinante puede ser un vector de expresión o un vector de incorporación de cromosoma (por ejemplo, un vector recombinante homólogo). Un plásmido utilizado para la preparación de tales vectores no está particularmente limitado siempre que el plásmido puede ser expresado en una bifidobacterium. Ejemplos de plásmidos derivados de bifidobacterias que se pueden utilizar incluyen pTB6, pBL67, pBL78, pNAL8H, pNAL8M, pNAC1, pBC1, pMB1, y pGBL8b. Los plásmidos del compuesto de estos plásmidos y los plásmidos derivados de Escherichia coli también se pueden utilizar, y los ejemplos de los mismos incluyen pBLES100, pKKT427, y pRM2.
Entre los plásmidos mencionados anteriormente, los plásmidos compuestos sintetizados a partir de plásmidos de B. longum y plásmidos de E. coli se prefieren desde el punto de vista de la expresión estable y preparación de ADN fácil para la preparación de una cepa transformante.
Los vectores de expresión tienen preferiblemente un marcador seleccionable tal como resistencia a antibióticos o auxotrofía de aminoácidos desde el punto de vista de la selección de una cepa transformante.
Los vectores de expresión incluyen preferiblemente una secuencia reguladora para la expresión de la proteína de fusión de GL-BP y una proteína o péptido diana, o para los vectores que es ventajoso para la expresión. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, secuencias líder, secuencias de propéptido, secuencias potenciadoras, secuencias señal, y secuencias de terminación. El origen de estas secuencias reguladoras no está particularmente limitado siempre y cuando los vectores se expresen en una bifidobacterium.
Las secuencias promotoras no están particularmente limitadas, siempre y cuando los vectores se expresen en una bifidobacterium. Desde el punto de vista de la eficacia de la expresión, preferiblemente se utilizan la secuencia promotora de una proteína similar a la histona (HU), promotor de la LDH, y similares de B. longum.
Los vectores de expresión tienen preferiblemente una secuencia de terminación desde el punto de vista de la eficiencia de expresión mejorada. La secuencia de terminación del gen HU mencionado anteriormente se usa preferiblemente como una secuencia de terminación.
Además, una secuencia líder, una secuencia de propéptido, una secuencia potenciadora, una secuencia señal, y similares se pueden disponer como sea necesario. Además, un gen que codifica un enlazante que tiene una longitud apropiada puede ser colocado entre el gen que codifica la GL-BP y el gen que codifica una proteína o péptido diana.
Por lo tanto, un vector de clonación se prepara mediante la introducción de secuencias reguladoras tales como una secuencia promotora y una secuencia de terminación y un gen marcador seleccionable en el plásmido mencionado anteriormente según sea necesario. Ejemplos del marcador seleccionable incluyen marcadores de resistencia a antibióticos tales como la espectinomicina (SPr), ampicilina (Ampr), tetraciclina (TETr), kanamicina (KMr), estreptomicina (STr), y neomicina (NEOr); marcadores fluorescentes tales como la proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente roja (REP); y enzimas tales como LacZ.
Un vector de clonación tiene preferiblemente, por ejemplo, un enlazante que tiene un sitio de multiclonación en dirección 3’ del promotor. Mediante el uso de dicho enlazante, el gen (ADN) que codifica para la proteína de fusión mencionada anteriormente se incorpora en dirección 3’ del promotor de modo que la proteína de fusión se puede expresar en marco. Ejemplos representativos de un plásmido para un vector de clonación incluyen pBLES100 y pBLEM100 (consultar el Documento de Patente 2).
Un vector que expresa una proteína de fusión en la superficie de una bifidobacterium se puede obtener mediante la incorporación en el marco de la secuencia promotora HU, el gen que codifica GL-BP, y el gen que codifica una proteína
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o péptido diana obtenido como se describe anteriormente en el plásmido pBLES100. Se utiliza un vector de expresión como se obtiene por dicho método para la transformación de una bifidobacterium.
3. Preparación de bifidobacterium transformada que expresa la proteína de fusión
Un ADN recombinante, por ejemplo, un vector de expresión se introduce en una bifidobacterium huésped. Cualquier método de transformación conocido se puede utilizar. Los ejemplos específicos incluyen electroporación, método de fosfato de calcio, lipofección, método de ion de calcio, protoplastos, microinyección, y bombardeo de partículas. Se usa preferiblemente la electroporación. La electroporación se puede realizar a 0.5 a 20 kV/cm durante 0.5 µseg a 10 mseg, más preferiblemente de 2 a 10 kV/cm durante 50 µseg a 5 mseg.
Una cepa transformada se selecciona con un marcador seleccionable contenido en el vector de expresión de proteína de fusión. Un medio para el cultivo de la cepa transformada puede ser cualquier medio apropiado para el microorganismo huésped. Ejemplos del medio incluyen medio de agar de hígado sangre (BL), medio de agar de Man-Rogosa-Sharpe (MRS), medio de agar medio anaerobio Gifu (GAM), medio de agar GAM mejorado (TGAM), medio de agar Briggs, y medio de agar de levadura glucosa peptona (YGP). Para la presión de selección, se pueden adicionar antibióticos al medio, o se pueden eliminar o adicionar aminoácidos al medio, en función del marcador seleccionable.
El cultivo se lleva a cabo preferiblemente bajo condiciones anaerobias en las que las bifidobacterias se pueden cultivar. El crecimiento de bacterias aeróbicas se puede prevenir mediante la realización del cultivo bajo una condición anaeróbica. Un ejemplo de condiciones anaeróbicas es la condición en un recipiente sellado en la que suficiente anaerobicidad se puede mantener para crecer bifidobacterias, por ejemplo, condiciones que se pueden lograr en una cámara anaeróbica o una caja anaeróbica. Es suficiente que la temperatura de cultivo sea una temperatura a la que se pueden cultivar las bifidobacterias. La temperatura de cultivo es generalmente de 4ºC a 45ºC, preferiblemente de 15ºC a 40ºC, más preferiblemente de 24ºC a 37ºC.
Una bifidobacterium transformada se puede preparar en la que no sólo un vector de presentación en la superficie de una proteína de fusión de GL-BP y una proteína o péptido diana, sino también un vector de presentación en la superficie de una proteína de fusión de GL-BP y una proteína que tiene una función de adyuvante se introducen simultáneamente.
La introducción de un gen que codifica una proteína de fusión se puede confirmar mediante la extracción de un plásmido a partir de una bifidobacterium transformada, tratando el plásmido con enzimas de restricción, y luego realizando la electroforesis o secuenciación directa de la secuencia del fragmento tratado con enzimas de restricción.
La expresión de la proteína de fusión de una bifidobacterium transformada obtenida se puede confirmar, por ejemplo, utilizando la transferencia de Western. En primer lugar, se lisa la bifidobacterium transformada, por ejemplo, utilizando un surfactante no iónico, incluyendo éster de polioxietileno sorbitán (Tween (marca registrada) 20, 40, 60, 65, 80, 85), y éster de sorbitán (Span (marca registrada) 20, 40, 60, 65, 80, 85), y similares; después se diluyó con solución reguladora de fosfato, solución reguladora de citrato, solución reguladora de borato, tris (hidroximetil) aminometano (Tris) solución reguladora -clorhidrato, o similares; después se sometieron a electroforesis con gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE), gel de tris-glicina-poliacrilamida, o similares; después se transfiere a membrana de nitrocelulosa, membrana de fluoruro de polivinilideno (PVF), o similares; y luego se hace reaccionar con un anticuerpo (inmunoglobulina G (IgG)) contra la proteína o péptido diana, y se hace reaccionar adicionalmente con un anticuerpo secundario con un marcador fluorescente. De esta manera, se puede confirmar la expresión de la proteína de fusión.
En particular, la presentación de una proteína o péptido diana en la superficie de la bifidobacterium se puede confirmar fácilmente mediante la realización en la bifidobacterium transformada de un método de inmunoanticuerpo utilizando un anticuerpo contra la proteína o péptido diana y un anticuerpo anti-IgG marcado con FITC. Cuando se expresa una proteína de fusión de GL-BP, una proteína que tiene una función de adyuvante, y una proteína o péptido diana, ya que la proteína que tiene una función de adyuvante y la proteína o péptido diana presentadas en la superficie de bifidobacterium, el anticuerpo utilizado para la confirmación puede ser un anticuerpo contra cualquier proteína (o péptido).
La bifidobacterium transformada en la cual la presentación en superficie de la proteína o péptido diana se ha confirmado se pueden cultivar, recuperar, y utilizar directamente para la producción de una formulación, utilizando cualquiera de los métodos comúnmente utilizados por los expertos en el arte. Alternativamente, la bifidobacterium transformada se puede usar en una forma seca. La bifidobacterium transformada se puede secar por el tratamiento en el cual un tratamiento a baja temperatura, tal como liofilización o secado a baja temperatura se realiza de modo que la bifidobacterium puede crecer cuando se expone a condiciones de crecimiento tales como las de en un entorno intestinal o un medio.
La bifidobacterium transformada se puede someter a un post-tratamiento realizado de acuerdo con un método conocido. Por ejemplo, la purificación en bruto se puede realizar por centrifugación o similares. Además, después de la purificación en bruto, la bifidobacterium transformada se puede disolver o suspender en un solvente utilizado convencionalmente en
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Para la reticulación de la capa externa que contiene una proteína, en primer lugar, se prepara la cápsula sin costuras, y después se lava suficientemente con agua y, a continuación, se adiciona la cápsula sin costuras lavada con agua a una solución acuosa que contiene un agente de reticulación. Por lo tanto, la superficie de la capa externa se somete a un tratamiento de reticulación. Como el agente de reticulación, se pueden utilizar agentes de reticulación conocidos convencionalmente. Ejemplos del agente de reticulación incluyen formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, glioxal, glutaraldehído, cinamaldehído, aldehído vainíllico, acetona, acetato de metil cetona, óxido de etileno, óxido de propileno, alumbre de potasio, y alumbre de amonio. Por lo general, la capa externa es tratada mediante la adición de 1 parte en peso de la cápsula sin costuras para 50 a 100 partes en peso de solución acuosa que contiene 0.1 a 2% p/v, preferiblemente de 0.5 a 2% p/v, de un agente de reticulación, y agitando la mezcla durante 10 a 300 segundos. En este documento, la cantidad de agente de reticulación utilizada y el período de tiempo para la acción varían en función del tipo de agente de reticulación. Después de que la superficie de la membrana externa se somete al tratamiento de reticulación, la membrana externa se lava suficientemente con agua para eliminar la solución acuosa que contiene el agente de reticulación, y el agua en la capa externa se seca.
Para la reticulación de la capa externa que contiene proteínas, la reticulación se puede realizar a través de tratamiento enzimático con transglutaminasa. En este caso, la capa externa es tratada mediante la adición de 1 parte en peso de la cápsula sin costuras producida a 50 a 100 partes en peso de solución acuosa que contiene 0.1 a 10% p/v, preferiblemente de 0.5 a 2% p/v, de enzima, y agitando la mezcla durante 1 a 300 minutos. El producto resultante se lava con agua y se seca como se describió anteriormente.
Para el recubrimiento, después la cápsula sin costuras húmeda producida se seca, la cápsula sin costuras convencionalmente se recubre con goma laca, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, celulosa TC-5, copolímero de vinilpirrolidona-acetato de vinilo, zeína, cera de etileno, o similares como el material de base, y aceite de ricino, aceite de semilla de uva, ftalato de dibutilo, polietilenglicol, glicerina, ácido esteárico, éster de ácido graso, palmitato de sorbitán, estearato de polioxietileno, monoglicérido acetilado, o similares como el plastificante.
La membrana de la cápsula puede ser provisto además con entericidad. De este modo, la cápsula está protegida de una solución ácida y similares (tal como el ácido gástrico) en el estómago, y se desintegra en el intestino de manera que la bifidobacterium transformada se libera desde el interior de la cápsula para efectuar suficientemente la producción de antígeno en el intestino. La membrana de la cápsula puede estar provista de entericidad mediante la producción de una cápsula entérica como se practica comúnmente por los expertos en el arte. Una mezcla de gelatina y la pectina se puede utilizar como material de la capa externa de la cápsula sin costuras para hacer que la membrana entérica. La capa externa resistente a los ácidos está provista además de entericidad mediante la preparación mediante la adición de pectina, alginato, goma arábiga, o similares en una cantidad de 0.01 a 20% en peso, preferiblemente de 0.1 a 10% en peso de gelatina, agar, carragenano, o similares, que tiene una capacidad de gelificación.
La formulación de cápsula sin costuras puede estar en la forma de una esfera, debido al método de producción. El tamaño medio de partícula de la cápsula sin costuras es de 0.3 a 10 mm, preferiblemente de 1.5 a 8.0 mm.
La formulación de cápsula sin costuras así obtenida se puede almacenar durante seis meses o más mientras se mantiene la actividad de la bifidobacterium transformada a temperatura ambiente. Si la formulación se almacena a 10ºC
o menos, es posible el almacenaje prolongado por un año o más.
(Formulación de cápsula blanda)
Como en el caso de la formulación en cápsulas sin costuras, una formulación de cápsula blanda puede ser la encapusulación de una suspensión de la bifidobacterium transformada en un solvente no acuoso (como contenido de la cápsula) con una lámina de membrana. El material de la lámina de membrana es como se menciona para la capa externa de la cápsula sin costuras.
Una formulación de cápsula blanda se puede preparar utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, como se describe en la Patente Japonesa No. 2999535. Por ejemplo, utilizando una matriz rotativa, mientras que los contenidos se inyectan y se llenan, la lámina de membrana se calienta a través del molde, con el fin de envolver y encapusular los contenidos, con lo que se consigue la encapsulación. Para la acción de liberar la bifidobacterium transformada en el intestino, un aceite, que es un agente de liberación, se retira de la cápsula blanda resultante a través de lavado con un solvente polar (por ejemplo, metanol, etanol, propanol, o isopropanol). Posteriormente, la cápsula se puede hacer resistente al ácido al realizar el tratamiento de reticulación y el tratamiento de recubrimiento en combinación, o la realización de cualquiera de los tratamientos, como en el caso de la cápsula sin costuras.
La lámina de membrana resistente a los ácidos también se puede preparar basándose en cualquiera de los métodos conocidos tales como mediante la adición de pectina, alginato, goma arábiga, o similares en una cantidad de 0.01 a 20% en peso, preferiblemente de 0.1 a 10% en peso de gelatina, agar, carragenina, o similares, que tiene una
capacidad de gelificación. Alternativamente, la lámina de membrana se puede hacer resistente a los ácidos, al realizar el tratamiento de reticulación y el tratamiento de recubrimiento en combinación, o la realización de una cualquiera de los tratamientos. La lámina de membrana resistente a los ácidos así obtenida se puede utilizar para producir una formulación de cápsula blanda en la que la bifidobacterium transformada se encapsula con la membrana resistente a los ácidos. Por ejemplo, a partir de la lámina de membrana resistente a los ácidos obtenida se forma una cápsula, los contenidos se introducen en la cápsula, y luego se funde una costura de la cápsula y se unieron con el fin de envolver los contenidos, utilizando técnicas conocidas.
La formulación de cápsula blanda que puede estar en la forma de una esfera, una elipse, o un rectángulo. La cápsula blanda tiene preferiblemente un eje mayor de 3 a 16 mm y un eje menor de 2 a 10 mm, y más preferiblemente tiene un eje mayor de 5 a 7 mm y un eje menor de 2 a 3 mm.
La formulación de cápsula blanda obtenida de esta manera se puede almacenar durante seis meses o más mientras se mantiene la actividad de la bifidobacterium transformada a temperatura ambiente. Si la formulación se almacenó a 10ºC
o menos, el almacenaje prolongado por un año o más es posible.
(Formulación de cápsula dura)
Una formulación de cápsula dura se puede producir por moldeo de una membrana de la cápsula en un cuerpo y una tapa de antemano, llenando el cuerpo de la cápsula con el contenido, y la combinación de la resultante con la tapa de la cápsula.
Los ejemplos del material de la membrana de la formulación cápsula dura incluyen gelatina, celulosa, pululano, carragenano, y derivados de celulosa tales como hidroxipropilmetilcelulosa. La cápsula dura se puede moldear utilizando cualquiera de los métodos comúnmente utilizados por los expertos en el arte. La cápsula moldeada puede ser cápsulas disponibles comercialmente. Los contenidos pueden ser abarcados con y envueltas en la membrana.
Los contenidos pueden ser una mezcla obtenida mezclando suficientemente la bifidobacterium transformada con un excipiente (por ejemplo, anhídrido silícico, silicato de aluminio sintético, lactosa, almidón de maíz o celulosa cristalina), o polvos que contienen polvos secos de la bifidobacterium transformada.
Después de que los contenidos están contenidos en la cápsula, la membrana de la cápsula se puede revestir. Para este recubrimiento, los materiales y los métodos que se han mencionado para la capa externa de la cápsula sin costuras se pueden aplicar para proporcionar la membrana con resistencia a los ácidos y preferiblemente desintegrativo en el intestino (entericidad). Este recubrimiento también permite que la membrana de la cápsula para sellar con el fin de encapsular los contenidos.
La lámina de membrana resistente a los ácidos también se puede preparar basándose en cualquiera de los métodos conocidos tales como mediante la adición de pectina, alginato, goma arábiga, o similares en una cantidad de 0.01 a 20% en peso, preferiblemente de 0.1 a 10% en peso gelatina, agar, carragenina, o similares, que tiene una capacidad de gelificación. Alternativamente, la lámina de membrana se puede hacer resistente a los ácidos, al realizar el tratamiento de reticulación y el tratamiento de recubrimiento en combinación, o realizando uno cualquiera de los tratamientos. La lámina de membrana resistente a los ácidos así obtenida se puede utilizar para producir una formulación de cápsula dura en la que la bifidobacterium transformada está encapsulada por la membrana resistente a los ácidos. Por ejemplo, a partir de la lámina de membrana resistente a los ácidos obtenida se forma una cápsula dura, los contenidos se introducen en la cápsula dura formada, y luego se funde una costura de la cápsula y se unen con el fin de envolver los contenidos, utilizando una técnica conocida.
La formulación de cápsula dura obtenida de este modo se puede almacenar durante seis meses o más mientras se mantiene la actividad de la bifidobacterium transformada a temperatura ambiente. Si la formulación se almacena a 10ºC
o menos, es posible el almacenaje prolongado por un año o más.
Ejemplos
En lo sucesivo, la presente invención se describirá ahora más específicamente con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no está limitado a los siguientes Ejemplos.
(Ejemplo 1: Preparación de bifidobacterium se presentan GL-BP-FliC en la superficie)
A. Aislamiento del gen de GL-BP
Para amplificar el gen de GL-BP del genoma bifidobacterium longum JCM1217 (ATCC15707) (Número de acceso: EU193949), se realizó la PCR utilizando cebadores glt-f: 5’-ggggtgctgatatattggtttg-3’ (SEQ ID NO: 5) y glt-r: 5’
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resistencia a espectinomicina (SPr), y la región ori del origen de replicación de bifidobacterium. El plásmido recombinante obtenido se designó como vector lanzadera pJW241.
F. Incorporación del gen obtenido mediante la unión de genes GL-BP y gen de FliC en el vector lanzadera pJW241 de Escherichia coli -bifidobacterium
Se realizó la PCR utilizando el vector pJT102 que tiene un gen obtenido mediante la unión del gen GL-BP y como plantilla el gen FliC y como cebadores GL-BP-NdeI-f: 5’-ccatatgaagtacgttgctttgtaaggggag-3’ (SEQ ID NO: 15) y FliCNdeI-r: 5’-ccatatgttaacgcagtaaagagaggacg-3’ (SEQ ID NO: 16). El producto de amplificación PCR se purificó por el método de precipitación con etanol y luego se digirió con una enzima de restricción NdeI. Por separado, el vector lanzadera Escherichia coli:bifidobacterium obtenido en el anterior E, también se digirió con la enzima de restricción NdeI. El fragmento del gen PCR digerido con NdeI y pJW241 se unieron utilizando el Kit de unión de ADN Ver. 2.1, y el plásmido obtenido se introdujo en Escherichia coli DH5 por el procedimiento de choque térmico, y las células bacterianas se diseminaron sobre un medio de agar LB que contiene 70 g/mL de espectinomicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC para obtener Escherichia coli transformada que alberga el plásmido que incluye la región ori del origen de replicación de Escherichia coli, el gen de resistencia a espectinomicina (SPr), la región ori del origen de replicación de bifidobacterium, y un gen de fusión del gen de la GL-BP y el gen FliC. El plásmido se extrajo y se purificó del Escherichia coli transformado mediante Kit Quantum Prep Plasmid Miniprep, y se confirmó la presencia de la secuencia del gen obtenido uniendo el gen de GL-BP y el gen FliC. El plásmido recombinante obtenido se designó como pJW245.
G. Preparación de la solución de bifidobacterium huésped
Bifidobacterium longum 105-A (Matsumura H. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 1997, vol. 61, pp. 1211-1212: donada por Tomotari Mitsuoka, profesor emérito de la Universidad de Tokio) fue inoculada en 50 mL de un medio GAM (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y se cultivó a 37ºC utilizando AnaeroPack Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.). Durante el cultivo, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm, y el cultivo se terminó cuando la absorbancia alcanzó 0.4 a 0.8. Después de la finalización del cultivo, el caldo de cultivo se centrifugó a 6000 X g, durante 10 minutos utilizando una centrífuga de alta velocidad para recoger las células bacterianas. Las células bacterianas recogidas se lavaron 2 o 3 veces por estar suspendidas en 10 mL de solución de glicerol al 10% (v/v) y se centrifugó utilizando una centrífuga de alta velocidad.
H. Preparación de bifidobacterium que presenta GL-BP-FliC en la superficie mediante la transformación de bifidobacterium con plásmido pJW245 recombinante
Una solución de la bifidobacterium huésped obtenida en el anterior G se suspendió en 500 l de solución de glicerol al 10% (v/v). Doscientos l de esta suspensión se vertió en un tubo separado, 5 l de una solución que contiene el plásmido pJW245 recombinante obtenido en la anterior F se añadió y se mezcló, y la mezcla se dejó reposar sobre el hielo durante 5 minutos. Después, la mezcla se colocó en una cubeta de electroporación de 0.2-cm (Bio-Rad) y se sometió a electroporación utilizando el Sistema de electroporación Gene Pulser X Cell (Bio-Rad) bajo condiciones de 2 kV, 2.5 F, y 200 . Inmediatamente después la electroporación, se adicionaron 0.8 mL de un medio GAM caliente de antemano a 37ºC, y las células se cultivaron utilizando AnaeroPack Kenki a 37ºC durante 3 horas. A continuación, el caldo de cultivo, se diseminaron sobre un medio de agar GAM que contiene 70 g/mL de espectinomicina (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), y las células bacterianas se cultivaron a 37ºC utilizando AnaeroPack Kenki para obtener una bifidobacterium transformada. La bifidobacterium transformada obtenida se inoculó en un medio de agar GAM que contiene 70 g/mL de espectinomicina y se cultivaron a 37ºC utilizando AnaeroPack Kenki. Después de la finalización del cultivo, el caldo de cultivo se dividió en tubos de 1.5 mL y se suspendió en una cantidad igual de solución de glicerol al 50% (v/v). La suspensión obtenida se almacenó a -80ºC para preparar un stock bacteriano congelado, que se usó como una célula maestra de la bifidobacterium que presenta GL-BP-FliC en la superficie del mismo (también se puede denominar como bifidobacterium transformada).
(Ejemplo 2: Confirmación de la presentación en superficie de GL-BP-FliC en Bifidobacterium-1 transformada)
El stock congelado de la bifidobacterium transformada obtenida en el anterior Ejemplo 1 se descongeló, y las células bacterianas se cultivaron en un medio GAM que contiene 70 g/mL de espectinomicina. El caldo de cultivo obtenido de la bifidobacterium transformada se centrifugó con una centrífuga de alta velocidad para recoger las células bacterianas. Las células bacterianas recogidas se suspendieron en una solución reguladora de PBS (Nippon Gene Co., Ltd.) y se lavaron 3 veces por centrifugación con una centrífuga de alta velocidad. A continuación, se adicionó un anticuerpo primario anticuerpo de ratón anti-FliC (BioLegend, Inc.) a PBS que contiene 1% de BSA (p/v), la mezcla se suspendió en la solución bifidobacteriana, y la suspensión se dejó en reposo a 37ºC, durante 30 minutos. La suspensión bacteriana se dejó en reposo durante 30 minutos se centrifugó con una centrífuga de alta velocidad para recoger las células bacterianas. Las células bacterianas recogidas se suspendieron en PBS y se lavaron dos veces por centrifugación con una centrífuga de alta velocidad. A continuación, se adicionó un anticuerpo secundario anticuerpo IgG anti-ratón de
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conejo Alexa Fluor™ 488 (Molecular Probes) a PBS que contenía 1% (p/v) de BSA, y la mezcla se suspendió en la solución bifidobacteriana, y la suspensión se dejó en reposo a 37ºC, durante 30 minutos. La suspensión bacteriana se dejó en reposo durante 30 minutos se centrifugó con una centrífuga de alta velocidad para recoger las células bacterianas. Las células bacterianas recogidas se suspendieron en PBS, se lavaron dos veces por centrifugación con una centrífuga de alta velocidad, y luego se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (KEYENCE). Los resultados se muestran en la fig. 2.
La figura 2(a) es una micrografía de fluorescencia que presenta la bifidobacterium transformada (que presenta GL-BP-FliC en la superficie de la misma) obtenida en el anterior Ejemplo 1. La figura 2(b) es una micrografía de fluorescencia de la bifidobacterium huésped (que no muestra GL-BP-FliC en la superficie de la misma). La presencia de FliC en la superficie celular de la bifidobacterium transformada se confirmó a partir de estas micrografías de fluorescencia.
(Ejemplo 3: Confirmación de la presentación en superficie de GL-BP-FliC en bifidobacterium-2 transformada)
El stock congelado de la bifidobacterium transformada obtenida en el anterior Ejemplo 1 se descongeló, y las células bacterianas se cultivaron en un medio GAM que contiene 70 g/mL de espectinomicina. La bifidobacterium transformada cultivada se centrifugó con una centrífuga de alta velocidad para recoger las células bacterianas. Las células bacterianas recogidas se suspendieron en PBS y se lavaron 3 veces por centrifugación con una centrífuga de alta velocidad. Se adicionó una solución que contiene PBS, Tris-HCl 1 M (pH 8.0) (Nippon Gene Co., Ltd.), y Triton X100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a las células bacterianas, y la solución se dejó reposar en hielo durante 30 minutos. Se adicionó una cantidad igual de 2 X SDS solución reguladora de electroforesis en gel a esta solución, y la mezcla se dejó en reposo a 95ºC, durante 5 minutos para obtener una muestra para la electroforesis. A continuación, gel de acrilamida al 8% (p/v) se colocó en un aparato de electroforesis (ATTO Corporation), la muestra obtenida se aplicó y se sometió a electroforesis junto con un marcador de peso molecular a una corriente de 20 mA, durante 1.5 horas. Después de la electroforesis, el gel se colocó sobre una membrana de nitrocelulosa (ATTO Corporation) y se cargó en un aparato de transferencia (Bio-Rad) a una corriente de 20 mA para transferencia. Después de la transferencia, la membrana de nitrocelulosa se sumergió en una solución reguladora de TBS (Nippon Gene Co., Ltd.) que contiene 4% (p/v) de leche descremada (BD), durante 1 hora para bloquear. Después del bloqueo, la membrana de nitrocelulosa se lavó dos veces con TBS. La membrana de nitrocelulosa lavada se sumergió en TBS que contiene 0.5% (p/v) de anticuerpo primario (anticuerpo Anti FliC de ratón: BioLegend) durante 1.5 horas y se lavó 3 veces con TBS. A continuación, la membrana de nitrocelulosa se sumergió en TBS que contiene anticuerpo secundario al 0.5% (p/v) (IgG anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina: BioLegend) durante 3 horas. A continuación, la membrana de nitrocelulosa se lavó 3 veces con TBS, se dejó desarrollar un color utilizando Kit -Steptm NBT/BCIP Plus Suppressor (PIERCE), durante 30 minutos con protección de la luz, y se enjuagó con agua pura, y a continuación, la expresión superficial de una proteína de fusión de FliC y GL-BP (GL-BP-FliC) fue confirmada por la coloración. Los resultados de la transferencia Western se muestran en la figura 3.
Como se muestra en la figura 3, la muestra mostró una banda clara en 98 kDa, que corresponde a la suma de los pesos moleculares de FliC y GL-BP FliC, un control positivo, mostró una banda a aproximadamente 50 kD. Por lo tanto, se confirmó que la bifidobacterium transformada expresa GL-BP-FliC.
(Ejemplo 4: Preparación de bifidobacterium transformada para la administración a ratones)
El stock congelado de la bifidobacterium transformada obtenida en el anterior Ejemplo 1, se descongeló y se inocularon las células bacterianas en un medio GAM que contiene 70 g/mL de espectinomicina y se cultivaron durante la noche a 37ºC utilizando AnaeroPack Kenki. El caldo de cultivo se centrifugó con una centrífuga de alta velocidad para recoger las células bacterianas. Las células bacterianas recogidas se suspendieron en PBS y se lavaron dos veces por centrifugación con una centrífuga de alta velocidad. A continuación, se suspendieron las células bacterianas en PBS a una concentración de 2.5 X 107 ufc/100 l para obtener una bifidobacterium transformada para la administración a los ratones.
(Ejemplo 5: Confirmación de la producción de anticuerpos en ratones mediante la administración de bifidobacterium transformada)
Cincuenta l de la bifidobacterium transformada para la administración a ratones preparados en el Ejemplo 4 anterior, se administraron por vía oral a ratones BALB/c, hembras de 8-12 semanas (Japan Charles River Laboratories Japan, Inc.) 3 veces a la semana durante 4 semanas (grupo de ensayo). Una bifidobacterium en la cual se introdujo un vector vacío (vector pJW241) como un control (grupo de control) y 50 l de PBS como un control negativo (grupo de control negativo) se administraron a los ratones de la misma manera que para el grupo de ensayo. El grupo de ensayo, el grupo control y el grupo de control negativo incluyeron 7, 6 y 5 animales, respectivamente.
En los días 0, 14 y 28 después del inicio de la administración, se recogió sangre de la vena caudal de los animales en cada grupo. La sangre recogida se centrifugó a 4ºC a 3000 rpm durante 15 minutos para obtener el suero, que se
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