ES2573704T3

ES2573704T3 - Virus de la variolovacuna recombinante que tiene el gen del virus de la hepatitis C

Info

Publication number: ES2573704T3
Application number: ES09717492.4T
Authority: ES
Inventors: Michinori Kohara; Fukashi Murai
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Priority date: 2008-03-07
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2016-06-09
Anticipated expiration: 2029-03-06
Also published as: EP2267120A4; WO2009110644A1; AU2009220401B2; KR20100131480A; KR101607349B1; US9000136B2; JP5584407B2; AU2009220401A1; EP2267120A1; US20110275139A1; JP2009232836A; CN101965396B; CN101965396A; EP2267120B1; CA2717626A1

Abstract

Un virus de la variolovacuna recombinante que comprende un promotor de la expresión y un ADNc del genoma del virus de la hepatitis C, donde el ADNc es: (a) ADN representado por la SEQ ID NO: 2; o (b) ADN que se hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas que tiene 95 % o más de homología con la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 y que codifica la proteína no estructural del virus de la hepatitis C.

Description

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Una composición farmacéutica de la presente invención puede introducirse en un organismo mediante cualquier método conocido tal como inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; inhalación nasal, bucal o pulmonar; o administración oral. Además, un virus recombinante contenido en una composición farmacéutica de la presente invención se puede usar en combinación con un medicamento antiviral existente (por ejemplo, interferón). Una realización de uso combinado no está particularmente limitada y el virus recombinante de la presente invención y el fármaco antiviral existente puede introducirse en un organismo mediante un método donde ambos se administran simultáneamente o mediante método donde uno se administra después del otro a un cierto intervalo.

Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede mezclar con un vehículo conocido farmacéuticamente aceptable tal como un excipiente, un agente de carga, un aglutinante y un lubricante, un tampón, un agente de tonicidad, un agente quelante, un colorante, un conservante, una fragancia, un agente aromatizante, un agente edulcorante o similares.

La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral de acuerdo con su forma, por ejemplo, como un agente administrado por vía oral tal como un comprimido, una cápsula, un agente en polvo, un agente granular, una píldora, una solución, jarabe o similares, o un agente administrado por vía parenteral, como una inyección, un agente tópico, un supositorio, una gota ocular o similares. Preferentemente, es, por ejemplo, una inyección local tal como una inyección intradérmica, intramuscular o intraperitoneal.

Aunque la dosis se selecciona apropiadamente de acuerdo con el tipo del elemento activo, la vía de administración, el objetivo de la administración, la edad, el peso, el sexo y los síntomas del paciente y otras condiciones, la dosis diaria del virus es de aproximadamente 1,000-1.000.000.000 UFP (unidades formadoras de placas) y, preferentemente, de aproximadamente 100.000-100.000.000 UFP en el caso de la administración oral, mientras que es de aproximadamente 100-1.000.000.000 UFP y, preferentemente, de aproximadamente 1.000-100.000.000 UFP en el caso de administración parenteral. El virus puede administrarse una vez o varias veces al día.

El virus recombinante de la presente invención se puede usar como una vacuna para prevenir o tratar la hepatitis C. Además, el desarrollo de una vacuna contra el VHC hasta la fecha se basa en la investigación que se centra en los anticuerpos contra el VCH y las células T citotóxicas (CTL). Por lo tanto, el título de anticuerpos o la actividad de la inmunidad celular como vacuna se miden, preferentemente, de antemano.

Se divulga que, por ejemplo, los títulos de anticuerpos contra los VVR-CN5, VVR-CN2, VVR-N25 preparados o la cepa LC16m8, es decir, la cepa parental, se pueden obtener mediante la vacunación de un conejo con la cepa de virus, la recogida de los sueros con el tiempo y la medición del valor ELISA contra el VHC en el suero. En los sueros de conejos vacunados con VVR-CN5-o VVR-CN2, los títulos de anticuerpos contra el VHC aumentaron tras cuatro semanas desde la vacunación.

También se divulga que la actividad de la inmunidad celular se puede medir mediante la vacunación de un ratón con VVR-CN5, VVR-CN2, VVR-N25 o la cepa LC16m8, es decir, la cepa parental, aislando las células de bazo del ratón inmunizado, y determinando si o no los CTL específicos del VHC son inducidos por el ensayo ELISPOT. De acuerdo con la presente divulgación, cuando las células del bazo derivadas de ratones BALB/c vacunados con VVR-CN5 se estimularon con un péptido sintético de una secuencia del epítopo del CRL específico de E1 restringido a H H-2d, se detectaron células productoras de INF-γ casi diez veces las de control. De acuerdo con lo anterior se encontró que la vacunación con VVR-CN5 inducía CTL específicos de E1 en ratones BALB/c.

Por lo tanto, los VVR-VHC preparados por los presentes inventores han confirmado que inducen inmunidad humoral y celular contra el VHC.

La presente invención se describirá más específicamente mediante los ejemplos siguientes. Estos ejemplos son solo ilustrativos y no deben limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Preparación del virus de la variolovacuna recombinante

Las regiones génicas completas (CN5), la región de la proteína de la cápside externa (CN2) y la región génica de la región de la proteína no estructural asociada a la replicación (N25) del virus de la hepatitis C (DDBJ/EMBL/ número de acceso en GenBank; AY045702) se integraron en los sitios SbfI y Sgfl del plásmido pBMSF7C (solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 6-237773) para preparar los vectores plasmídicos pBMSF7C-CN5, pBMSF7C-CN2 y pBMSF7C-N25 que tienen los genes del VHC insertados aguas abajo del promotor híbrido ATI-p7.5 en la región génica de la hemaglutinina (HA) (Figura 1).

Se sembraron células de riñón de cultivo primario en un matraz T175. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, se usó la cepa del virus de la variolovacuna atenuado LC16m8 para la infección a un moi = 10 y a 30 ºC durante 2 horas. En el presente documento, moi (multiplicidad de infección) hace referencia a las UFP por célula.

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Después de la infección, la solución de virus se eliminó mediante aspiración y las células se lavaron con PBS (-). A continuación, después del tratamiento con 0,05 % de tripsina/EDTA 0,5 mM/PBS (-) y lavado con 10 % de FCS/medio MEM, PBS (-) y tampón de HeBS, las células se suspendieron en 600 µl de tampón de HeBS. 40 µg de cada uno de los vectores plasmídicos pBMSF7C-CN5, pBMSF7C-CN2 y pBMSF7C-N25 se diluyeron usando un tampón HeBS para obtener una cantidad total de 200 µl, que se añadió y se mezcló con la suspensión celular y se dejó reposar en hielo durante 10 minutos. La suspensión celular añadida con el vector plasmídico se transfirió a una cubeta de 0,4 cm para realizar la electroporación (0,2 kV, 960 µF) usando un electroporador (Bio-Rad). Después de la electroporación, se añadió inmediatamente 1 ml de 10 % de FCS/medio MEM a la suspensión celular para la dilución. Esta suspensión celular se añadió a las células RK13 o células de riñón de cultivo primario que se habían sembrado en un matraz T175 y se cultivaron a 30 ºC durante 24 horas.

Después de 24 horas de cultivo, se retiró el sobrenadante del cultivo mediante aspiración y las células se lavaron con PBS (-). A continuación, se realizó el tratamiento con 0,05 % de tripsina/EDTA 0,5 mM/PBS (-) y las células se suspendieron en un 10% de FCS/medio MEM. Se recogió la suspensión de células, se sometió a ultrasonidos (30 s x 4 veces) en agua fría y después se centrifugó (2000 rpm, 10 min). El sobrenadante resultante se utilizó como una solución de virus. La solución de virus se diluyó en 10 % de FCS/medio MEM y se usó para infectar la célula de riñón de cultivo primario que se habían sembrado en una placa de 100 mm a 30 ºC durante una hora. La solución de virus se eliminó mediante aspiración y, a continuación, las células se lavaron con PBS (-). Se añadió 10 % de FCS/0,5% de metilcelulosa/medio MEM para el cultivo a 30 ºC durante 72 horas. Después de 72 horas de cultivo, se retiró el sobrenadante mediante aspiración y se lavó con PBS (-). Una solución de eritrocitos de pollo diluida en PBS (+) se añadió a la placa de 100 mm para el cultivo a 37 ºC durante 30 minutos. La solución de eritrocitos se eliminó mediante aspiración y, a continuación, las células se lavaron dos veces con PBS (-). Las placas sobre las que no se adsorbieron los eritrocitos de pollo se recogieron usando un Pipetman. La transferencia de genes del VHC en las placas recogidas se confirmó mediante PCR y secuenciación génica. Las placas confirmadas de la transferencia génica se sometieron a purificación en placa tres veces.

Los virus sometidos a tres veces purificación en placa se sometieron a cultivo a pequeña escala. La colonia obtenida después de la tercera purificación se suspendió en 700 µl 10 % de FCS/medio MEM y se sometió a ultrasonidos en agua fría. Después de la centrifugación (2.000 rpm, 10 min), se añadieron 500 µl de sobrenadante a las células de riñón de cultivo primario sembradas en T25 para la infección a 30 ºC durante 2 horas. Después de la infección, la solución de virus se retiró mediante aspiración y las células se lavaron con 2,5 ml de 10 % de FCS/medio MEM. El medio se retiró mediante aspiración y se añadieron 2,5 ml de 10 % de FCS/medio MEM reciente para el cultivo a 30 ºC durante 72 horas. Después de 72 horas, las células se rasparon del matraz con un raspador para recoger la suspensión de células. La suspensión celular recogida se sometió a ultrasonidos (30 s, 4 veces) en agua fría, seguido de centrifugación, y el sobrenadante se recogió como la solución de virus. La solución de virus recogido se diluyó en serie y después se añadió a las células RK13 o a las células de riñón de cultivos primarios que se habían sembrado en placas de 6 pocillos para la infección a 30 ºC durante una hora. La solución de virus se eliminó mediante aspiración y las células se lavaron dos veces con PBS (-) y se añadió 10 % de FCS/ 0,5 % de metilcelulosa/medio MEM para el cultivo a 30 ºC durante 72 horas. Después de 72 horas, se contó el número de placas formadas en el pocillo para calcular el título.

Sobre la base de este título calculado, se realizó el cultivo a escala masiva. Las células RK13 o las células de riñón de cultivos primarios se sembraron en diez matraces T175. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, se usó la solución de virus de la variolovacuna recombinante para la infección a un moi = 10 y a 30 ºC durante 2 horas. Después de la infección, la solución de virus se retiró mediante aspiración y las células se lavaron con 20 ml de 10 % de FCS/medio MEM. El medio se retiró mediante aspiración y se añadieron 20 ml de 10% de FCS/medio MEM reciente para el cultivo a 30 ºC durante 72 horas. Después de 72 horas, las células se rasparon de los matraces usando un raspador y las suspensiones celulares se recogieron y se congelaron a -8 0 ºC para su conservación, Esta suspensión de células se sometió a tres rondas de congelación y descongelación, seguido de tratamiento con ultrasonidos (30 segundos, 4 veces) en agua fría y centrifugación para recoger el sobrenadante como una solución de virus. La solución de virus recogida se transfirió a un tubo de centrifugación de alta velocidad y se sometió a centrifugación a 18.000 rpm durante 45 minutos para permitir la precipitación del virus. El sobrenadante se retiró mediante aspiración y, a continuación, los sedimentos se resuspendieron en una pequeña cantidad de 10 % de FCS/medio MEM. Mediante este procedimiento se preparó una solución de virus que se concentró diez veces más fuerte que una con el cultivo en matriz T175. Esta solución de virus concentrado se diluyó en serie y se utilizó para infectar las células RK13 o las células de riñón de cultivos primarios que se habían sembrado en una placa de 6 pocillos y los títulos de virus de las soluciones se calcularon de la misma manera que en el método descrito anteriormente. Las soluciones concentradas de virus con títulos calculados se utilizaron en varios experimentos descritos en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 2

Confirmación de la transferencia de genes del VHC mediante PCR

La PCR se realizó usando los siguientes cebadores específicos de genes del VHC y el genoma del virus de la variolovacuna recombinante obtenido como molde para confirmar si el gen del VHC se había introducido o no en el

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genoma del virus recombinante mientras que el gen del VHC no se había transferido si no se observaba dicha banda.

Como se muestra en la Figura 3, como resultado de la electroforesis en gel de agarosa al 2 % del producto de la PCR (fragmento amplificado), se encontró que el gen del VHC se había transferido al genoma del virus recombinante.

Ejemplo 3

Confirmación de la expresión de proteínas del VHC mediante el método de transferencia de tipo Western

El virus de la variolovacuna recombinante RVV-S se utilizó para infectar células RK13 que se habían sembrado en una placa de 6 pocillos a moi = 30 y a 30 ºC durante 2 horas. Después de la infección, la solución de virus se eliminó mediante aspiración y las células se lavaron dos veces con PBS (-). A cada pocillo, se añadieron 2 ml de 10% de FCS/medio MEM para el cultivo a 30 ºC durante 24 horas. Después de 24 horas, se retiró el medio por aspiración, y se añadieron 100 µl de tampón de lisis (1 % de SDS, 0,5 % de NP-40, NaCl 0,15 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4)) para lisar las células y la solución resultante se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. La solución recogida se sometió a ultrasonidos en agua fría hasta que la viscosidad llegó a ser cero. La cantidad de proteína en la solución preparada se cuantificó según el método de Lowry.

La electroforesis se llevó a cabo durante 50 µg de proteína con gel de acrilamida al 10%. Al final de la electroforesis, se eliminó el gel y la proteína en el gel se transfirió a una membrana de PVDF con un papel secante semiseco pasando una corriente de 5,5 mA/cm2 durante 60 minutos. Después de lavar la membrana con una solución de TBS-T, la membrana se sumergió en una solución al 5 % de leche descremada-TBS-T para el bloqueo. Después del bloqueo, la membrana se lavó tres veces con una solución de TBS-T. El anticuerpo primario fue un anticuerpo monoclonal de ratón obtenido mediante la purificación de Core-31-2, E1-384, E2-544, NS3-10-1, NS4B-52-1 y 14-5-NS5B clon IgG. La cantidad de proteína del anticuerpo purificado se cuantificó por el método de Lowry y se preparó a 10 µg/ml para su uso. Al final de la reacción con el anticuerpo primario, la membrana se lavó tres veces con una solución de TBS-T. El anticuerpo secundario utilizado fue IgG anti-conejo unida a HRPO (de Donkey, Amersham). Al final de la reacción con el anticuerpo secundario, la membrana se lavó de nuevo tres veces con una solución de TBS-T, y se añadió una solución de ECL a la membrana para el desarrollo de la película.

En consecuencia, como se muestra en la Figura 4, se encontró que la proteína del VHC se expresaba en los genomas de los virus recombinantes RVV-CN2, RVV-N25 y RVV-CN5.

Ejemplo 4

Experimentos de vacunación de conejos y ratones con virus de la variolovacuna recombinantes (Figura 5)

La figura 5 muestra un método para confirmar la capacidad de HCV-RVV para inducir inmunidad humoral/celular.

Se vacunó a conejos New Zealand hembra blancos por vía transendotelial con los virus de la variolovacuna recombinantes o la cepa parental LC16m8 obtenida en el Ejemplo 1 a 1x108 ufp. Se extrajo sangre de la vena de la oreja después de 1, 2, 3, 4 y 6 semanas desde la vacunación. Además, después de seis semanas tras la vacunación viral inicial, se usó RVV-S de nuevo para la vacunación a 1x108 ufp. De un modo similar, se extrajo sangre de nuevo de la vena de la oreja después de 1, 2, 3, 4 y 6 semanas desde la segunda vacunación. Toda la sangre recogida se introdujo en tubos de vacío de recogida de sangre (TERUMO, nombre comercial: Venoject II Tubos para extracción de sangre al vacío (estériles), 9 ml) y se sometió a centrifugación (3.000 rpm, 20 minutos) para separar y recoger los sueros. Los sueros se congelaron a -20 ºC para su conservación hasta el ensayo ELISA descrito más adelante.

Ejemplo 5

Medición de los títulos de anticuerpos contra la proteína del VHC en sueros de conejos vacunados con HCV-RVV mediante el método ELISA

Una placa de 96 pocillos se recubrió con la proteína del núcleo y la proteína E2, al que se añadió una dilución de 100 veces de la muestra de suero congelado. Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante una hora, la placa de 96 pocillos se lavó con una solución de TBS-T y luego se añadió anti-IgG de conejo ligado a HRPO (de Donkey, Amersham) a la placa de 96 pocillos como anticuerpo secundario. Después de la reacción con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora, la placa de 96 pocillos se lavó de nuevo tres veces con una solución de TBS-T, a la que se añadió una solución de desarrollo de color a 100 µl/pocillo. Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante 10-20 minutos, se midió la absorbancia a 450 nm se con un lector de microplacas.

Como resultado, como se muestra en la Figura 6, los títulos de anticuerpos más altos se indujeron contra la proteína del núcleo y E2 en el suero de conejos vacunados con RW-CN2-y RVV-CN5.

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Ejemplo 6

Confirmación de las capacidades inducción de inmunidad celular de HCV-RW como vacunas mediante ensayo ELISPOT

(Día 1)

El anticuerpo anti-ratón de IFN-γ purificado (R4-6A2) (1µg/ml) (Pharmingen) se sembró en una placa de nitrocelulosa de 96 pocillos a 75-100 µl/pocillo, al tiempo que se ajustó la concentración final a 8 µg/ml (125 veces diluido en PBS estéril) y se dejó reposar a 4 ºC durante la noche.

(Día 2)

Se recogieron las células de bazo de ratón y se dejaron suspender en una cantidad adecuada en el lavado con RPMI. El lavado con RPMI utilizado se suplementó con FCS al 2,5%. Las células se recogieron mediante centrifugación a 1200 rpm a 4 ºC durante 5 minutos. Las células se trataron con ACK, se suspendieron en RPMI de lavado en una cantidad adecuada y de nuevo se centrifugaron a 1200 rpm y a 4 ºC durante 5 minutos para recoger las células. Se forzó a 500 µl de RPMI de lavado seguido de la suspensión celular a pasar a través de un filtro. Después del pase completo, las células se lavaron con 1,5 ml de lavado RPMI. El producto resultante se lavó una vez con medio RPMI suplementado con 10 % de FCS, se suspendieron en medio H-h y se ajustó a 1x107/ml.

1) Medio H-h: Una mezcla de cantidades iguales de medio RPMI suplementado con 10 % de FCS y medio de CLICK suplementado con 10 % de FCS. 2) RPMI suplementado con 10 % de FCS: RPMI-1640 (SIGMA R8758), FCS (final 10 %), 2-mercaptoetanol (concentración final 5 µM), penicilina-estreptomicina (concentración final PC: 100 u/ml, SM: 0,1 mg/ml) y 4 ml de NaHCO3 al 7,5 %. 3) Medio de CLICK suplementado con 10 % de FCS: Medio de CLICK (SIGMA C5572), FCS (concentración final 10 %), 2-mercaptoetanol (concentración final 5µM), penicilina-estreptomicina (concentración final PC: 100 u/ml, SM: 0,1 mg/ml) y 4 ml de NaHCO3 al 7,5 %.

Inicio del cultivo

La placa de nitrocelulosa de 96 pocillos se lavó tres veces con PBS (100 µl/pocillo), se añadió RPMI suplementado con 10 % de FCS a 100 µl/pocillo y se introdujo en un incubador con CO2 a 37 ºC durante una hora para el bloqueo. El medio se descartó y las células efectoras se sembraron en dilución en serie de dos veces a partir de 1x106/100 µl/pocillo a 0,125 x 106/100 µl/pocillo.

Una solución de péptido (200 µg/ml) se añadió a 100 µl/pocillo (concentración final 100 µg/ml) para el cultivo en un incubador de CO2 a 37 ºC durante 24 horas.

(Día 3)

Se descartó el medio y el resultante se lavó diez veces con PBS, 0,05 % de Tween 20 (200 µl/pocillo). El IFN-γ biotinilado anti-ratón (XMG1.2) (0,5 mg/ml) (Pharmingen) se ajustó a una concentración final de 2 µg/ml (diluido 250 veces en PBS) y se añadió a 100 µl/pocillo. La mezcla se deja reposar a 4 ºC durante la noche.

(Día 4)

La placa de nitrocelulosa de 96 pocillos se lavó diez veces con PBS, 0,05 % de Tween 20 (200 µl/pocillo). La estreptavidina-fosfatasa alcalina (1 mg/ml) (MABTECH AB) se ajustó a una concentración final de 1 µg/ml (diluido 1000 veces en PBS) y se añadió a 100 µl/pocillo.

La solución turbia resultante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Un tampón de desarrollo de color 25x AP (BIO-RAD) se diluyó 25 veces con AD y se añadieron 1/100 cantidades de los reactivos de color A y B (BIO-RAD) para preparar una mezcla de reacción. La placa de nitrocelulosa de 96 pocillos se lavó diez veces con PBS, 0,05 % de Tween 20 (200 µl/pocillo). La mezcla de reacción se añadió a 100 µl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10-20 minutos. Una vez que se desarrolló el color y apareció un punto oscuro, la mezcla de reacción se descartó y se lavó minuciosamente en agua. Se despegó el fondo de la placa de nitrocelulosa de 96 pocillos y se secó para contar el número de puntos con el lector ELISPOT.

Los recuentos resultantes se muestran en la Figura 7, donde se indujo una fuerte inmunidad celular.

Ejemplo 7

Examen del efecto terapéutico de las VHC-VVR contra la hepatitis C

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Un ratón transgénico (Cre/loxP/HCV-Tg) (en la Figura 8, "loxP-HCV") al que se había transferido con el gen del VHC con un sistema Cre/loxP se apareó con un ratón transgénico que expresaba Cre inducida por IFN (en la Figura 8, "MxCre") para preparar un ratón Tg (Cre/loxP/HCV-MxCre Tg) que expresa como un interruptor el gen del VHC en un momento arbitrario (Figura 8) para analizar la afección patológica de los mismos. Para el análisis de la afección patológica, se usó poli IC, es decir, un agente inductor de interferón con el fin de permitir la expresión génica de la enzima recombinante Cre con interferón.

En el presente documento, en la Figura 8, el panel A muestra la expresión del gen del VHC por el sistema de conmutación Cre/loxP mientras que el panel B muestra el apareamiento entre el ratón transgénico loxP-HCV y el ratón transgénico que expresa el gen de MxCre.

Como VHC-VVR se usaron VVR-CN2 que expresa predominantemente la proteína estructural del VHC, VVR-N25 que expresa la proteína no estructural asociada con la replicación y VVR-CN5 que expresa la proteína completa (Figura 1). Con el fin de evaluar los efectos terapéuticos de estas VHC-VVR, se vacuno a los ratones Cre/IoxP/HCV-MxCre Tg que expresaban de forma persistente la proteína del VHC durante 3 meses por vía intradérmica una vez con las VHC-VVR (1 x 107 UFP), y se obtuvieron muestras de los hígados de los ratones después de cuatro semanas después de la vacunación (Figura 9). Posteriormente, se examinaron los niveles de expresión y la morfología de las proteínas del VHC en los hígados de los ratones.

Los resultados se muestran en la Figura 10. En la Figura 10, el panel A muestra las transiciones de la cantidad de la proteína del núcleo del VHC ("núcleo del VHC") y ALT (alanina aminotransferasa), donde la cantidad de proteína del núcleo del VHC ("núcleo del VHC") y de ALT están representados por un gráfico de barras y una gráfico de líneas, respectivamente. La ALT es un indicador del grado de daño hepático. En el Panel B, " d0", "d90", "d180" y "d480" indican alteración del tejido en el hígado antes de la expresión de genes del VHC y después de 90 días, 180 días y 480 días después de la expresión de genes del VHC, respectivamente.

La proteína del VHC en el hígado del ratón Cre/loxP/HCV-MxCre Tg (en la Figura 10, "núcleo del VHC") no se eliminó por completo y se confirmó la expresión persistente durante más de un año, lo que indica una afección patológica de hepatitis crónica, tal como inflamación o degeneración adiposa, fibrosis y similares en el hígado (Figura 10).

Adicionalmente, en los hígados de los ratones Cre/loxP/HCV-MxCre Tg después de cuatro semanas tras la vacunación con VHC-VVR, el nivel de expresión de la proteína del núcleo se redujo para el grupo de vacunación con VRR-N25 (Figura 11). Además, para el grupo de VVR-N25, la anomalía morfológica en el hígado (estructura similar a un cordón del hígado, condiciones de las células hepáticas o similares) volvió a la normalidad (Figura 11).

En la Figura 11, "m8", "CN2", "CN5" y "N25" representan la cepa LC16m8, VVR-CN2, VVR-CN5 y VVR-N25, respectivamente. El panel A muestra las cantidades de proteínas del núcleo del VHC en el hígado, mientras que el panel B muestra imágenes de los tejidos del hígado después de cuatro semanas tras la vacunación con VHC-VVR. En el Panel B, "a" muestra la imagen del tejido hepático antes de la expresión de genes del VHC, mientras que "b" muestra las imágenes de los tejidos hepáticos tras cuatro semanas después de la vacunación con VHC-VVR. Como se puede apreciar en la figura 11, el hígado del ratón al que se ha administrado VVR-N25 volvió a la normalidad. Por tanto, se ha demostrado que el virus de la variolovacuna de la presente invención tiene un efecto terapéutico sobre la hepatitis C.

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención se proporciona un nuevo virus de la variolovacuna recombinante que es eficaz y muy seguro en la prevención o tratamiento de la hepatitis C y un agente profiláctico o terapéutico para la hepatitis C (una vacuna para prevenir o tratar la hepatitis C) que comprende el nuevo virus.

[Listado de secuencias]

SEQ ID NO: 5: ADN sintético

SEQ ID NO: 6: ADN sintético

SEQ ID NO: 7: ADN sintético

SEQ ID NO: 8: ADN sintético

SEQ ID NO: 9: ADN sintético

SEQ ID NO: 10: ADN sintético

SEQ ID NO: 11: ADN sintético

SEQ ID NO: 12: ADN sintético

SEQ ID NO: 13: ADN sintético

SEQ ID NO: 14: ADN sintético

SEQ ID NO: 15: ADN sintético

SEQ ID NO: 16: ADN sintético

SEQ ID NO: 17: Péptido sintético

Claims

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